JP2023080085A - Dna抗体構築物およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】対象内での合成抗体の生成方法を提供すること。【解決手段】合成抗体をin vivo発現させるために、抗体およびその機能性断片をコードする最適化された核酸配列を含む組成物、および対象内での合成抗体の生成方法を開示する。本開示は、前記組成物および方法を用いる対象内の疾患の予防および/または治療方法についても提供する。【選択図】なし
Description
(関連出願の相互参照)
本願は、2012年12月13日出願の米国仮特許出願第61/737,094号、2013年9月23日出願の米国仮特許出願第61/881,376号、および2013年10月28日出願の米国仮特許出願第61/896,646号に対する優先権を主張するものである。この全ての出願は、参照することで本明細書に組み入れられる。
本願は、2012年12月13日出願の米国仮特許出願第61/737,094号、2013年9月23日出願の米国仮特許出願第61/881,376号、および2013年10月28日出願の米国仮特許出願第61/896,646号に対する優先権を主張するものである。この全ての出願は、参照することで本明細書に組み入れられる。
(米国政府利益の記載)
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた契約番号HHSN272200800063Cおよび5-P30-AI-045008-13の下での政府支援に基づいて達成されたものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有するものである。
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられた契約番号HHSN272200800063Cおよび5-P30-AI-045008-13の下での政府支援に基づいて達成されたものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有するものである。
本発明は、合成抗体またはその断片をin vivo生成する組み換え核酸配列を含む組成物、および該組成物を投与することによる対象内の疾患の予防および/または治療方法に関する。
免疫グロブリン分子は、システイン残基間のジスルフィド結合(S-Sとして示す)によって共有結合された軽(L)鎖および重(H)鎖を2つずつ含む。重鎖(VH)および軽鎖(VL)の可変ドメインは、抗体分子の結合部位に寄与する。重鎖定常領域は、3つの定常ドメイン(CH1、CH2、およびCH3)と、(柔軟な)ヒンジ領域とからなる。軽鎖も、定常ドメイン(CL)を有する。重鎖および軽鎖の可変領域は、4つのフレームワーク領域(FRs;FR1、FR2、FR3、およびFR4)と、3つの相補性決定領域(CDR:CDR1、CDR2、およびCDR3)とを含む。従って、これらは非常に複雑な遺伝系であり、in vivo組み立てが困難となっている。
標的モノクローナル抗体(mAb)は、過去25年間で最も重要な医療用治療の進歩の1つである。この種の免疫療法は今や、多数の自己免疫疾患、癌および感染症の治療に対して日常的に用いられている。悪性腫瘍に対して、現在用いられている免疫グロブリン(Ig)療法の多くは、腫瘍に向けた細胞毒性化学療法レジメンを併用する。この併用法により全体的な生存率が著しく改善されている。特定の癌に対して用いるmAb製剤が多数認可されており、例えば、非ホジキンリンパ腫治療のためのCD20を標的とするキメラmAbであるリツキサン(リツキシマブ)、ならびにCTLA-4を阻害し、黒色腫および他の悪性腫瘍の治療に用いられているヒトmAbであるイピリムマブ(エルボイ)が挙げられる。さらに、ベバシズマブ(アバスチン)は、VEGFおよび腫瘍新血管形成を標的とし、大腸癌の治療に用いられているもう一つの代表的なヒト化mAbである。悪性腫瘍の治療に最も注目されているmAbは、恐らくHer2/neuを標的とするヒト化製剤であるトラスツズマブ(ハーセプチン)であり、患者の一部の乳癌に対して大きな有効性を持つことが実証されている。さらに、多数のmAbが、自己免疫および特定の血液疾患の治療に用いられている。
癌治療に加えて、ジフテリア、A型およびB型肝炎、狂犬病、破傷風、水痘、および呼吸器合胞体ウイルス(RSV)などの多くの感染症に対する防御効力をポリクローナルIgsの受動伝達により調節する。実際、いくつかのポリクローナルIg製剤は、積極的なワクチン接種を介して防御Igsを生成するのに十分な時間がない状況下の疾患流行地を旅行している個人において特定の感染性因子に対する一時的な防御をもたらす。さらに、免疫不全の子供において、RSV感染を標的とするmAbであるパリビズマブ(シナジス)は、RSVに対して防御することが臨床的に実証されている。
mAb療法の臨床効力は素晴らしいものがある。しかしながら、この治療アプローチの使用および普及を制限する問題が残っている。これらの問題のいくつかには、これらの複雑な生物製剤の製造コストが高いことが挙げられ、より広範な人口、とりわけ、大きな影響をもたらし得る発展途上国における使用を限定してしまう。さらに、有効性を達成し維持するためにmAbsを反復投与する必要性がしばしばあることもロジスティクスおよび患者のコンプライアンスという点で障害になり得る。また、これらの抗体製剤の長期安定性は短いことが多く最適ではない。したがって、当該技術分野では、安全かつコスト効率のよい方法で対象に送達することができる合成抗体分子が必要とされている。さらに、合成抗体の同定および発現方法についても論じられているが、タンパク質の製造についてはいまだ問題がありかつ高価である。
免疫療法および免疫修飾は、対象の免疫系と連動または対象の免疫系を調節もしくは刺激することで疾患を治療し、病原体を撃退もしくは異常細胞を殺すことができる、治療モードを提供する。ワクチンは、細胞性および体液性免疫応答双方を刺激して、疾患の予防、場合によっては、疾患の治療をすることができる、1つのクラスの薬剤を提供する。例えば、インフルエンザ用ワクチンは、インフルエンザウイルスに対する記憶応答を対象が生成するのを助け、将来の感染を予防するのを助けることができる。しかしながら、急速な発症を引き起こす病原体に対する懸念があり、例えば、チクングンヤ熱、デング熱、またはエボラ熱などの熱帯性ウイルスには迅速な中和抗体反応が有益であり得る。かかる状況下で、確立された有効な記憶応答を対象が有しない場合、宿主体液性反応の遅れは致命的になり得る。さらに、中和抗体を直ちに産生することは、HIVなどの問題のあるウイルスが完全に感染し宿主に住み着く前に感染を未然に防ぐのに有益であろう。記憶応答もしくはさらに好ましくは中和抗体反応を直ちにもたらし得るワクチンが必要であり、必要に応じて、併用療法における宿主免疫応答を刺激するワクチンと対をなすことができる。
本発明は、対象内での合成抗体の生成方法に関する。本方法は、抗体またはその断片をコードする組み換え核酸配列を含む組成物を対象に投与することを含む。組み換え核酸配列は、対象内で発現されて合成抗体を生成する。
抗体は、重鎖ポリペプチドまたはその断片および軽鎖ポリペプチドまたはその断片を含むことができる。重鎖ポリペプチドまたはその断片は第1の核酸配列によってコードされ、軽鎖ポリペプチドまたはその断片が第2の核酸配列によってコードされ得る。組み換え核酸配列は、第1の核酸配列および第2の核酸配列を含むことがきる。組み換え核酸配列は、第1の核酸配列および第2の核酸配列を単一転写産物として対象内で発現するプロモーターをさらに含むことができる。プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターであり得る。
組み換え核酸配列は、プロテアーゼ切断部位をコードする第3の核酸配列をさらに含むことができる。第3の核酸配列は、第1の核酸配列および第2の核酸配列間に位置することができる。対象のプロテアーゼは、プロテアーゼ切断部位を認識し、切断することができる。
組み換え核酸配列は、対象内で発現されて抗体ポリペプチド配列を生成することができる。抗体ポリペプチド配列は、重鎖ポリペプチドまたはその断片、プロテアーゼ切断部位、および軽鎖ポリペプチドまたはその断片を含むことができる。対象によって産生されたプロテアーゼは、抗体ポリペプチド配列のプロテアーゼ切断部位を認識することができ、切断することで、開裂重鎖ポリペプチドおよび開裂軽鎖ポリペプチドを生成する。合成抗体は、開裂重鎖ポリペプチドおよび開裂軽鎖ポリペプチドによって生成され得る。
組み換え核酸配列は、第1の転写産物として第1の核酸配列を発現する第1のプロモーターと、第2の転写産物として第2の核酸配列を発現する第2のプロモーターとを含むことができる。第1の転写産物は第1のポリペプチドに翻訳され、第2の転写産物は第2のポリペプチドに翻訳され得る。合成抗体は、第1および第2のポリペプチドによって生成され得る。第1のプロモーターと第2のプロモーターは同一であり得る。プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターであり得る。
重鎖ポリペプチドは、可変重領域および定常重領域1を含むことができる。重鎖ポリペプチドは、可変重領域、定常重領域1、ヒンジ領域、定常重領域2、および定常重領域3を含むことができる。軽鎖ポリペプチドは、可変軽領域および定常軽領域を含むことができる。
組み換え核酸配列は、Kozak配列をさらに含むことができる。組み換え核酸配列は、免疫グロブリン(Ig)シグナルペプチドをさらに含むことができる。Igシグナルペプチドは、IgEまたはIgGシグナルペプチドを含むことができる。
組み換え核酸配列は、配列番号1、2、5、41、43、45、46、47、48、49、51、53、55、57、59、および61の少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、配列番号3、4、6、7、40、42、44、50、52、54、56、58、60、62、および63の少なくとも1つの核酸配列を含むことができる。
本発明はまた、対象内での合成抗体の生成方法に関する。本方法は、重鎖ポリペプチドまたはその断片をコードする第1の組み換え核酸配列および軽鎖ポリペプチドまたはその断片をコードする第2の組み換え核酸配列を含む組成物を対象に投与することを含むことができる。第1の組み換え核酸配列は、対象内で発現されて第1のポリペプチドを生成し、第2の組み換え核酸配列は、対象内で発現されて第2のポリペプチドを生成することができる。合成抗体は、第1および第2のポリペプチドによって生成され得る。
第1の組み換え核酸配列は、第1のポリペプチドを対象内で発現する第1のプロモーターをさらに含むことができる。第2の組み換え核酸配列は、第2のポリペプチドを対象内で発現する第2のプロモーターをさらに含むことができる。第1のプロモーターと第2のプロモーターは同一であり得る。プロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターであり得る。
重鎖ポリペプチドは、可変重領域および定常重領域1を含むことができる。重鎖ポリペプチドは、可変重領域、定常重領域1、ヒンジ領域、定常重領域2、および定常重領域3を含むことができる。軽鎖ポリペプチドは、可変軽領域および定常軽領域を含むことができる。
第1の組み換え核酸配列および第2の組み換え核酸配列は、Kozak配列をさらに含むことができる。第1の組み換え核酸配列および第2の組み換え核酸配列は、免疫グロブリン(Ig)シグナルペプチドをさらに含むことができる。Igシグナルペプチドは、IgEまたはIgGシグナルペプチドを含むことができる。
本発明はさらに、対象内の疾患の予防または治療方法に関する。本方法は、上記の方法の1つによって対象内での合成抗体を生成することを含むことができる。合成抗体は、外来抗原に特異的であり得る。外来抗原はウイルス由来であり得る。ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、チクングニヤウイルス(CHIKV)、またはデングウイルスであり得る。
ウイルスはHIVであり得る。組み換え核酸配列は、配列番号1、2、5、46、47、48、49、51、53、55、および57の少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、配列番号3、4、6、7、50、52、55、56、62、63、および64の少なくとも1つの核酸配列を含むことができる。
ウイルスはCHIKVであり得る。組み換え核酸配列は、配列番号59および61の少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、配列番号58および60の少なくとも1つの核酸配列を含むことができる。
ウイルスはデングウイルスであり得る。組み換え核酸配列は、配列番号45の少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、配列番号44の少なくとも1つの核酸配列を含む。
合成抗体は自己抗原に特異的であり得る。自己抗原はHer2であり得る。組み換え核酸配列は、配列番号41および43の少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。組み換え核酸配列は、配列番号40および42の少なくとも1つの核酸配列を含む。
本発明の一態様は、本明細書に記載のヌクレオチド産物を含む。ヌクレオチド産物は、場合によっては、1つのヌクレオチド構築物からなり、場合によっては、2つの異なるヌクレオチド構築物からなる。
本発明の一態様は、病原体に特異的な合成抗体をコードするヌクレオチド配列を投与することを含む、病原体による感染からの対象の治療方法に関し、場合によっては、病原体の抗原を投与して対象内で免疫応答を生成することも含む。
本発明は、抗体、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする組み換え核酸配列を含む組成物に関する。組成物を、それを必要とする対象に投与し、合成抗体のin vivo発現および形成し易くすることができる。
特に、組み換え核酸配列から発現した重鎖および軽鎖ポリペプチドは、合成抗体に組み立てることができる。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、抗原に結合することができ、本明細書に記載のように組み立てられていない抗体に比べてより免疫原性が強く、かつ、抗原に対して免疫応答を引き起こすかもしくは誘導することが可能な合成抗体をアセンブリがもたらすように、互いに相互作用することができる。
また、これらの合成抗体は、抗原誘導の免疫応答に応じて産生される抗体よりもさらに速やかに対象内で生成される。合成抗体は、広範な抗原に効率的に結合し、中和することができる。合成抗体は、疾患に対して効率的に防御し、および/または、疾患生存率を促進することもできる。
1.定義
特に定義していない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書が優先となる。本発明の実施または試験において、本明細書中に記載されたものと同様または同等の方法および材料を用いることはできるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の引用文献は、引用によりそれらの全体が組み入れられる。尚、本明細書で開示した材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図していない。
特に定義していない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合には、定義を含めて本明細書が優先となる。本発明の実施または試験において、本明細書中に記載されたものと同様または同等の方法および材料を用いることはできるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の引用文献は、引用によりそれらの全体が組み入れられる。尚、本明細書で開示した材料、方法、及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図していない。
本明細書で使用する「を含む(comprise(s))」、「を含む(include(s))」、「を有する(having)」、「を有する(has)」、「できる(can)」、「を含む(contain(s))」という用語、およびその変形は、付加的な行為あるいは構造の可能性を妨げない、制限しない移行句、用語、または単語であることを意図している。単数形である「a」、「and」、および「the」は、文脈上例外が明記されていない限り、複数形の意味を持つこともある。本開示は、明示的に記載されているかどうかに関わらず、本明細書に示される実施形態または要素「を含む(comprising)」、「からなる(consisting of)」、および「から実質的になる(consisting essentially of)」他の実施形態も企図する。
「抗体」は、クラスIgG、IgM、IgA、IgD、もしくはIgEの抗体、またはその断片もしくは誘導体(Fab、F(ab’)2、Fdを含む)、ならびにその一本鎖抗体、および誘導体を意味し得る。抗体は、哺乳動物の血清サンプルから単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、またはこれらの混合物のうち、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対する十分な結合特異性を示すものであり得る。
本明細書で互換的に使用する、「抗体断片」または「抗体の断片」は、抗原結合部位または可変領域を含む完全抗体の一部分を指す。この部分は、完全抗体のFc領域のある特定の重鎖領域(すなわち、抗体アイソタイプに応じてCH2、CH3またはCH4)を含まない。抗体断片の例としては、Fab断片、Fab’断片、Fab’-SH断片、F(ab’)2断片、Fd断片、Fv断片、ダイアボディ、一本鎖Fv(scFv)分子、1つの軽鎖可変領域のみを含有する一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変領域の3つのCDRを含有する一本鎖ポリペプチド、1つの重鎖可変領域のみを含有する一本鎖ポリペプチドおよび重鎖可変領域の3つのCDRを含有する一本鎖ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
「抗原」は、宿主内で免疫応答を引き起こすことが可能なタンパク質を指す。抗原は抗体により認識され結合される。抗原は体内または外部環境から生じる。
本明細書で使用する、「コード配列」または「コード化核酸」は、本明細書に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸(RNAまたはDNA分子)を意味し得る。コード配列は、核酸の投与先である個体または哺乳動物の細胞中の発現を誘導できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始および終了シグナルをさらに含むことができる。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含むことができる。
本明細書で使用する、「相補体」または「相補的」は、ある核酸が、ヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間にワトソン・クリック(例えば、A-T/UおよびC-G)またはフーグスティーン塩基対を表わすことを意味し得る。
本明細書で使用する、「定電流」は、組織、または該組織を規定する細胞が、同組織に送達される電気パルスの持続期間中に受容するまたは経験する電流を定義する。電気パルスは、本明細書に記載の電気穿孔装置から送達される。この電流は、電気パルスの寿命期間中、該組織に定電流量で留まるが、それは、本明細書で提供される電気穿孔装置が、好ましくは瞬間的フィードバックを有する、フィードバック素子を有するからである。フィードバック素子は、パルスの持続期間中の組織(または細胞)の抵抗を測定し、電気穿孔装置に自身の電気エネルギー出力を変化させる(例えば、電圧を上げる)ようにすることができるので、同組織中の電流は、電気パルスの間ずっと(約マイクロ秒)、およびパルス間において、一定であり続ける。いくつかの実施形態において、フィードバック素子は、制御器を含む。
本明細書で使用する、「電流フィードバック」または「フィードバック」は互換的に使用されており、提供される電気穿孔装置の活発な応答を意味し得るが、これは、電極間の組織の電流を測定することと、電流を一定レベルで維持するために、EP装置が送達するエネルギー出力を適宜変化させることとを含む。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気処理を開始する前に、ユーザが予め設定する。電気穿孔装置の中の電気回路が、電極間の組織の電流を連続的にモニターし、そのモニターされた電流(または組織中の電流)を予め設定された電流と比較し、連続的にエネルギー出力の調整を行なって、モニターされた電流を予め設定されたレベルで維持することができるように、フィードバックは、電気穿孔装置の電気穿孔構成要素、例えば、制御器によって達成され得る。フィードバックループは瞬時のものであり得、それは、フィードバックループがアナログ閉ループフィードバックであるからである。
本明細書で使用する、「分散電流」は、本明細書に記載の電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得、これらのパターンは、電気穿孔される任意の組織領域に対する電気穿孔関連の熱ストレスの発生を最小限に抑えるか、または好ましくは消失させる。
本明細書で互換的に使用する、「電気穿孔」、「電気透過処理」、「界面動電増強」(「EP」)は、生体膜に微細経路(細孔)を生じさせるための膜貫通電場パルスの使用を意味し得る。こうした微細経路の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、siRNA、薬剤、イオン、および水などの生体分子が、細胞膜の片側から他方の側に通過することが可能になる。
本明細書で使用する、「内因性抗体」は、体液性免疫応答を誘導するのに有効な量の抗原を投与されている対象内で生成される抗体を指し得る。
本明細書で使用する、「フィードバック機構」は、ソフトウェアまたはハードウェア(もしくはファームウェア)のいずれかによって実行されるプロセスであって、(エネルギーパルスの送達前、送達中、および/または送達後の)所望の組織のインピーダンスを受容し、それを現在値、好ましくは電流と比較し、送達されるエネルギーパルスを調整して、予め設定された値を達成するプロセスを指し得る。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路により実施され得る。
「断片」は、機能、すなわち、所望の標的に結合でき、かつ、全長抗体と同じ意図した効果を有する抗体のポリペプチド断片を意味し得る。抗体の断片は、シグナルペプチドおよび/または1位のメチオニンを備えているかまたは備えていないかのいずれの場合にも、Nおよび/またはC末端から少なくとも1つのアミノ酸が欠けている以外は全長と100%同一であってもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除き、特定の全長抗体の長さの20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上を含んでいてもよい。断片は、抗体に95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上同一で、かつ、同一率を計算する際に含まれないN末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをさらに含むポリペプチドの断片を含んでいてもよい。断片はさらに、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、IgEまたはIgGシグナルペプチドなどのN末端メチオニンおよび/またはシグナルペプチドをさらに含んでいてもよい。N末端メチオニンおよび/またはシグナルペプチドは、抗体の断片に結合し得る。
抗体をコードする核酸配列の断片は、シグナルペプチドおよび/または1位のメチオニンをコードする配列を備えているかまたは備えていないかのいずれの場合にも、5’および/または3’末端から少なくとも1つのヌクレオチドが欠けている以外は全長と100%同一であってもよい。断片は、付加された任意の異種シグナルペプチドを除く特定の全長コード配列の長さの20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上を含んでいてもよい。断片は、抗体に95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上同一で、かつ、同一率を計算する際に含まれないN末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列をさらに必要に応じて含むポリペプチドをコードする断片を含んでいてもよい。断片はさらに、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、IgEまたはIgGシグナルペプチドなどのN末端メチオニンおよび/またはシグナルペプチドに対するコード配列をさらに含んでいてもよい。N末端メチオニンおよび/またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に結合し得る。
本明細書で使用する、「遺伝子構築物」は、抗体などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むDNA分子またはRNA分子を指す。コード配列は、核酸分子の投与先である個体の細胞中の発現を誘導できるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントと機能的に連結した、開始および終了シグナルを含む。本明細書で使用する「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞中に存在しているときにコード配列が発現するように、タンパク質をコードするコード配列に機能的に連結している必要な調節要素を含んでいる遺伝子構築物を指す。
本明細書において2つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈で使用する「同一」または「同一性」は、当該配列が指定領域に渡って指定の割合の同一残基を有することを意味し得る。この割合を計算するには、2つの配列を最適に整列させ、指定領域に渡って2つの配列を比較し、両配列の同一残基が発生する位置の数を確定して一致位置の数を得て、一致位置の数を指定領域の総位置数で割り、計算結果に100を掛けることにより、配列同一性のパーセント値が得られる。2つの配列の長さが異なるか、アライメントにより1つ以上の付着末端が生じ、指定の比較領域に単一配列のみが含まれる場合には、単一配列の残基を計算の分母に含めるが、分子には含めない。DNAとRNAを比較する場合には、チミン(T)とウラシル(U)を同等とみなすことができる。同一性の計算は、手動で行っても、BLAST、BLAST 2.0等のコンピューター配列アルゴリズムを使用して行ってもよい。
本明細書で使用する、「インピーダンス」は、フィードバック機構を論ずる際に用いられ、かつ、オームの法則に従って電流値に変換することができるため、予め設定された電流と比較することができる。
本明細書で使用する、「免疫応答」は、1つ以上の核酸および/またはペプチドの導入に応答して、宿主の免疫系、例えば哺乳動物の免疫系が活性化することを意味し得る。この免疫応答は、細胞性もしくは体液性の形態、またはその両方であり得る。
本明細書で使用する、「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合している少なくとも2つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖を表現することにより、相補鎖の配列も定義される。したがって、核酸は、表現される一本鎖の相補鎖も包含する。ある核酸の多くの変異体を、所与の核酸として同一目的で使用できる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズできるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
核酸は、一本鎖または二本鎖であってもよく、二本鎖と一本鎖の両方の配列の一部分を含むこともできる。核酸は、DNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、またはハイブリッドであってもよく、核酸はデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組み合わせを含むことができ、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含むことができる。核酸は、化学合成法または組み換え法により取得できる。
本明細書で使用する、「機能的に連結」は、遺伝子と空間的に接続しているプロモーターの制御下で遺伝子が発現することを意味し得る。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の5’(上流)または3’(下流)に位置できる。プロモーターと遺伝子の間の距離は、プロモーターの派生元遺伝子において当該プロモーターが制御する遺伝子とプロモーターの間の距離とほぼ同一であってもよい。当技術分野で知られているように、プロモーター機能を失うことなく、この距離の変化に適応することができる。
本明細書で使用する、「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の結合配列を意味することができ、天然、合成、または、天然および合成の修飾あるいはその組み合わせであってもよい。
本明細書で使用する、「プロモーター」は、核酸の細胞中発現を授与、活性化、または増強することのできる合成分子または天然由来分子を意味し得る。プロモーターは、発現をさらに増強し、かつ/または空間的発現および/またはその一時的発現を改変する目的で、1つ以上の特定の転写調節配列を含むことができる。プロモーターは遠位のエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントを含むこともでき、このエンハンサーエレメントまたは抑制エレメントは、転写開始部位から数千塩基対も離れた場所に位置できる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来してよい。プロモーターは、発現が発生する細胞、組織、もしくは臓器に関して、もしくは発現が生じる発生段階に関して、恒常的もしくは差次的に遺伝子成分の発現を調節でき、または、例えば生理的ストレス、病原体、金属イオン、誘発剤等の外部刺激に応答して遺伝子成分の発現を調節できる。プロモーターの代表例として、バクテリオファージT7プロモーター、バクテリオファージT3プロモーター、SP6プロモーター、lacオペレータープロモーター、tacプロモーター、SV40後期プロモーター、SV40初期プロモーター、RSV-LTRプロモーター、CMVIEプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、およびCMV IEプロモーターが挙げられる。
「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載のタンパク質のアミノ末端に結合することができるアミノ酸配列を指す。一般に、シグナルペプチド/リーダー配列は、タンパク質の局在化を指示する。本明細書で使用するシグナルペプチド/リーダー配列は、タンパク質を産生する細胞からタンパク質を分泌し易くすることが好ましい。シグナルペプチド/リーダー配列は、細胞からの分泌時に、タンパク質(しばしば成熟タンパク質と呼ばれる)の残余から切断されることが多い。シグナルペプチド/リーダー配列は、タンパク質のN末端に結合する。
本明細書で使用する、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、例えば核酸の複合混合物において、第1の核酸配列(例えばプローブ)が第2の核酸配列(例えばターゲット)とハイブリダイズする際の条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は配列に依存するため、状況によって異なる。ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度pHにおける特定の配列に対する融点(Tm)より約5~10℃低くなるように選択される。Tmは、(規定のイオン強度、pH、および核酸濃度下で)標的に相補的なプローブの50%が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である(標的配列は過剰に存在するので、Tmにおいて、プローブの50%が平衡状態で占有される)。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、pH7.0~8.3において約1.0M未満のナトリウムイオン、例えば約0.01~1.0Mのナトリウムイオン濃度(または他の塩)であり、温度が、短いプローブ(例えば10~50ヌクレオチド)では最低約30℃、長いプローブ(例えば約50ヌクレオチド超)では最低約60℃であり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミド等の不安定化剤の添加によって達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションの場合、陽性シグナルはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも2~10倍であり得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件例には、以下の条件が含まれる:50%ホルムアミド、5倍SSC、および1%SDS、42℃でのインキュベート。または、5倍SSC、1%SDS、65℃でのインキュベート、0.2倍SSC、0.1%SDS中65℃での洗浄。
本明細書で互換的に使用する、「対象」および「患者」は、任意の脊椎動物を指し、哺乳動物(例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス)、非ヒト霊長類(例えば、カニクイザルもしくはアカゲザル、チンパンジーなどのサル)、およびヒトが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトあるいは非ヒトであってもよい。対象あるいは患者は、他の形態の治療を受けていてもよい。
本明細書で使用する、「実質的に相補的」は、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第1の配列が第2の配列の相補体と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であること、あるいは、2つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
本明細書で使用する、「実質的に同一」は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100個またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域に渡って、第1の配列と第2の配列が少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%同一であること、あるいは、核酸に関して、第1の配列が第2の配列の相補体と実質的に相補的である場合を意味し得る。
本明細書で使用する、「合成抗体」は、本明細書に記載の組み換え核酸配列によってコードされ、対象内で生成される抗体を指す。
本明細書で使用する、「治療」または「治療する」は、疾患を予防するか、抑制するか、抑圧するかまたは完全に除去することで対象を疾患から防御することを意味することができる。疾患を予防することは、その疾患の発症前に対象に本発明のワクチンを投与することを含む。疾患を抑制することは、その疾患の誘導後でその疾患の臨床的出現前に、対象に本発明のワクチンを投与することを含む。疾患を抑圧することは、その疾患の臨床的出現後に、対象に本発明のワクチンを投与することを含む。
核酸に関して本明細書で使用する、「変異体」は、(i)基準ヌクレオチド配列の一部分もしくは断片;(ii)基準ヌクレオチド配列もしくはその一部分の相補体;(iii)基準核酸もしくはその相補体と実質的に同一の核酸;または(iv)ストリンジェントな条件下で、基準核酸、その相補体、もしくはその実質的に同一の配列とハイブリダイズする核酸を意味し得る。
ペプチドまたはポリペプチドに関して使用する、「変異体」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なっているが、少なくとも1つの生物活性を保持しているものである。また、変異体は、基準タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、少なくとも1つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を類似特性(例えば、荷電領域の親水性、程度、および分布)の別のアミノ酸に置換することは、当技術分野では、通常は軽微な変化を伴うものと認識されている。こうした軽微な変化は、当技術分野で理解されているように、アミノ酸の疎水性親水性指標(hydropathic index)を検討することにより部分的に特定できる。Kyteら,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性と電荷の考察に基づく。類似の疎水性親水性指標を有するアミノ酸は置換可能であり、その後もタンパク質機能を維持することが当技術分野において公知である。一態様において、±2の疎水性親水性指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性を用いて、生物機能を保持したタンパク質となる置換を明らかにすることもできる。ペプチドに関連してアミノ酸の親水性を検討することにより、そのペプチドの局所的な最大平均親水性を計算でき、抗原性および免疫原性と良く相関すると報告されている有用な尺度となる。米国特許第4,554,101号(この文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる)。当技術分野で理解されているように、類似の親水性値を有するアミノ酸を置換すると、例えば免疫原性等の生物活性を保持したペプチドが得られる。親水性値が互いに±2以内のアミノ酸を用いて、置換を実施できる。アミノ酸の疎水性指標と親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖の影響を受ける。こうした知見と一致して、生物機能に適合するアミノ酸置換とは、アミノ酸の相対的類似性、特に当該アミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存するものと理解されており、この相対的類似性は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、その他の特性により明らかになる。
変異体は、完全遺伝子配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一な核酸配列であってもよい。核酸配列は、遺伝子配列またはその断片の全長にわたって80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であってもよい。変異体は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一なアミノ酸配列であってもよい。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であってもよい。
本明細書で使用する、「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってもよい。ベクターは、DNAベクターまたはRNAベクターであってもよい。ベクターは、自己複製過剰染色体ベクターまたは宿主ゲノムに組み込むベクターのいずれかであってもよい。
本明細書中の数値範囲の記述について、同程度の精度でその間に入る各数が明示的に企図される。例えば、6~9という範囲の場合、6および9に加えて7および8という数が企図され、6.0~7.0という範囲の場合、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、および7.0という数が明示的に企図される。
2.組成物
本発明は、抗体、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする組み換え核酸配列を含む組成物に関する。組成物は、それを必要とする対象に投与された場合、対象内で合成抗体の生成をもたらし得る。合成抗体は、対象内に存在するターゲット分子(すなわち、抗原)に結合することができる。かかる結合は、抗原を中和し、別の分子、例えば、タンパク質または核酸によって抗原の認識をブロックし、抗原に免疫応答を引き起こすかまたは誘発することができる。
本発明は、抗体、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする組み換え核酸配列を含む組成物に関する。組成物は、それを必要とする対象に投与された場合、対象内で合成抗体の生成をもたらし得る。合成抗体は、対象内に存在するターゲット分子(すなわち、抗原)に結合することができる。かかる結合は、抗原を中和し、別の分子、例えば、タンパク質または核酸によって抗原の認識をブロックし、抗原に免疫応答を引き起こすかまたは誘発することができる。
合成抗体は、組成物を投与された対象内の疾患を治療する、予防する、および/または防御することができる。抗原に結合することで合成抗体は、組成物を投与された対象内の疾患を治療する、予防する、および/または防御することができる。合成抗体は、組成物を投与された対象内の疾患生存率を促進することができる。合成抗体は、組成物を投与された対象内の疾患生存率を少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または100%もたらすことができる。他の実施形態において、合成抗体は、組成物を投与された対象内の疾患生存率を少なくとも約65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、または80%もたらすことができる。
組成物は、対象に組成物を投与後少なくとも約1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、20時間、25時間、30時間、35時間、40時間、45時間、50時間、または60時間以内にその対象内で合成抗体の生成をもたらし得る。組成物は、対象に組成物を投与後少なくとも約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、または10日以内にその対象内で合成抗体の生成をもたらし得る。組成物は、対象に組成物を投与後約1時間~約6日、約1時間~約5日、約1時間~約4日、約1時間~約3日、約1時間~約2日、約1時間~約1日、約1時間~約72時間、約1時間~約60時間、約1時間~約48時間、約1時間~約36時間、約1時間~約24時間、約1時間~約12時間、または約1時間~約6時間以内にその対象内で合成抗体の生成をもたらし得る。
組成物は、それを必要とする対象に投与された場合、抗原を投与された対象内で内因性抗体を生成するよりも迅速に対象内で合成抗体の生成をもたらし、体液性免疫応答を誘発することができる。組成物は、抗原を投与された対象内で内因性抗体を生成する少なくとも約1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、または10日前に合成抗体の生成をもたらし、体液性免疫応答を誘発することができる。
本発明の組成物は、安全であることなど、有効な組成物に必要な特徴を有しているため、組成物は、病気または死を引き起こさず、病気に対して防御し、投与し易く、副作用もほとんどなく、生物学的安定性や投与量当たりの低コスト化をもたらすことができる。
3.組み換え核酸配列
上述したように、組成物は、組み換え核酸配列を含んでいてもよい。組み換え核酸配列は、抗体、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードし得る。以下により詳細に抗体について記載する。
上述したように、組成物は、組み換え核酸配列を含んでいてもよい。組み換え核酸配列は、抗体、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードし得る。以下により詳細に抗体について記載する。
組み換え核酸配列は、異種核酸配列であってもよい。組み換え核酸配列は、少なくとも1つの異種核酸配列または1つ以上の異種核酸配列を含んでいてもよい。
組み換え核酸配列は、最適化核酸配列であってもよい。かかる最適化により抗体の免疫原性を増大あるいは変化させることができる。最適化により転写および/または翻訳も改善することができる。最適化とは、以下の1つ以上を含んでいてもよい:低GC含量リーダー配列により転写を増大させる;mRNA安定性およびコドン最適化;kozak配列(例えば、GCC ACC)を追加して翻訳を増大させる;シグナルペプチドをコードする免疫グロブリン(Ig)リーダー配列を追加;シス作用配列モチーフ(すなわち、内部TATAボックス)を可能な限り取り除く。
a.組み換え核酸配列構築物
組み換え核酸配列は、1つ以上の組み換え核酸配列構築物を含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の構成要素を含んでいてもよい。以下により詳細に記載する。
組み換え核酸配列は、1つ以上の組み換え核酸配列構築物を含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の構成要素を含んでいてもよい。以下により詳細に記載する。
組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物は、プロテアーゼまたはペプチダーゼ切断部位をコードする異種核酸配列も含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のリーダー配列を含んでいてもよく、各リーダー配列は、シグナルペプチドをコードする。組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のプロモーター、1つ以上のイントロン、1つ以上の転写終結領域、1つ以上の開始コドン、1つ以上の終結または終止コドン、および/または1つ以上のポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のリンカーまたはタグ配列も含んでいてもよい。タグ配列は、ヘマグルチニン(HA)タグをコードすることができる。
(1)重鎖ポリペプチド
組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする異種核酸を含んでいてもよい。重鎖ポリペプチドは、可変重鎖(VH)領域および/または少なくとも1つの定常重鎖(CH)領域を含んでいてもよい。少なくとも1つの定常重鎖領域は、定常重鎖領域1(CH1)、定常重鎖領域2(CH2)、定常重鎖領域3(CH3)、および/またはヒンジ領域を含んでいてもよい。
組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする異種核酸を含んでいてもよい。重鎖ポリペプチドは、可変重鎖(VH)領域および/または少なくとも1つの定常重鎖(CH)領域を含んでいてもよい。少なくとも1つの定常重鎖領域は、定常重鎖領域1(CH1)、定常重鎖領域2(CH2)、定常重鎖領域3(CH3)、および/またはヒンジ領域を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチドは、VH領域およびCH1領域を含んでいてもよい。他の実施形態において、重鎖ポリペプチドは、VH領域、CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域を含んでいてもよい。
重鎖ポリペプチドは、相補性決定領域(「CDR」)セットを含んでいてもよい。CDRセットは、VH領域の3つの超可変領域を含んでいてもよい。重鎖ポリペプチドのN-末端から開始して、これらのCDRは、それぞれ、「CDR1」、「CDR2」、および「CDR3」と称せられる。重鎖ポリペプチドのCDR1、CDR2、およびCDR3は、抗原への結合または抗原の認識に寄与することができる。
(2)軽鎖ポリペプチド
組み換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖(VL)領域および/または定常軽鎖(CL)領域を含んでいてもよい。
組み換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖(VL)領域および/または定常軽鎖(CL)領域を含んでいてもよい。
軽鎖ポリペプチドは、相補性決定領域(「CDR」)セットを含んでいてもよい。CDRセットは、VL領域の3つの超可変領域を含んでいてもよい。軽鎖ポリペプチドのN-末端から開始して、これらのCDRは、それぞれ、「CDR1」、「CDR2」、および「CDR3」と称せられる。軽鎖ポリペプチドのCDR1、CDR2、およびCDR3は、抗原への結合または抗原の認識に寄与することができる。
(3)プロテアーゼ切断部位
組み換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼまたはペプチダーゼによって認識することができる。プロテアーゼは、エンドペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼであってもよく、フリン、エラスターゼ、HtrA、カルパイン、トリプシン、キモトリプシン、トリプシンおよびペプシンが挙げられるが、これらに限定されない。プロテアーゼは、フリンであってもよい。他の実施形態において、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、または内部ペプチド結合を切断する(すなわち、N-末端またはC-末端ペプチド結合を切断しない)任意のプロテアーゼであってもよい。
組み換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼまたはペプチダーゼによって認識することができる。プロテアーゼは、エンドペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼであってもよく、フリン、エラスターゼ、HtrA、カルパイン、トリプシン、キモトリプシン、トリプシンおよびペプシンが挙げられるが、これらに限定されない。プロテアーゼは、フリンであってもよい。他の実施形態において、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、または内部ペプチド結合を切断する(すなわち、N-末端またはC-末端ペプチド結合を切断しない)任意のプロテアーゼであってもよい。
プロテアーゼ切断部位は、切断効率を促進するかまたは増大させる1つ以上のアミノ酸配列を含んでいてもよい。1つ以上のアミノ酸配列は、別々のポリペプチドの形成または生成効率を促進するかまたは増大させることができる。1つ以上のアミノ酸配列は、2Aペプチド配列を含んでいてもよい。
(4)リンカー配列
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のリンカー配列を含んでいてもよい。リンカー配列は、本明細書に記載の1つ以上の構成要素を空間的に分離もしくは連結することができる。他の実施形態において、リンカー配列は、2つ以上のポリペプチドを空間的に分離もしくは連結するアミノ酸配列をコードすることができる。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のリンカー配列を含んでいてもよい。リンカー配列は、本明細書に記載の1つ以上の構成要素を空間的に分離もしくは連結することができる。他の実施形態において、リンカー配列は、2つ以上のポリペプチドを空間的に分離もしくは連結するアミノ酸配列をコードすることができる。
(5)プロモーター
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のプロモーターを含んでいてもよい。1つ以上のプロモーターは、遺伝子発現を推進し、かつ、調節することが可能な任意のプロモーターであってもよい。かかるプロモーターは、DNA依存RNAポリメラーゼ経由の転写に要するシス作用配列要素である。遺伝子発現の指示に用いられるプロモーターは、特定の用途に依って選択される。プロモーターは、組み換え核酸配列構築物の転写開始部から、これがその天然の設定における転写開始部位からの距離であるのとほぼ同じ距離に配置される。しかしながら、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失を伴うことなく、適合されることができる。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のプロモーターを含んでいてもよい。1つ以上のプロモーターは、遺伝子発現を推進し、かつ、調節することが可能な任意のプロモーターであってもよい。かかるプロモーターは、DNA依存RNAポリメラーゼ経由の転写に要するシス作用配列要素である。遺伝子発現の指示に用いられるプロモーターは、特定の用途に依って選択される。プロモーターは、組み換え核酸配列構築物の転写開始部から、これがその天然の設定における転写開始部位からの距離であるのとほぼ同じ距離に配置される。しかしながら、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失を伴うことなく、適合されることができる。
プロモーターは、重鎖ポリペプチドおよび/または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列に機能的に連結していてもよい。プロモーターは、真核細胞中での発現に対して有効であることを示すプロモーターであってもよい。コード配列に機能的に連結したプロモーターは、CMVプロモーター、SV40 初期プロモーターおよびSV40後期プロモーターなどのシミアンウイルス40(SV40)由来のプロモーター、マウス乳腺癌ウイルス(MMTV)プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス(BIV)長末端反復(LTR)プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス(HIV)プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス(ALV)プロモーター、CMV前初期プロモーター、エプステインバーウイルス(EBV)プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーターなどのサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターでよい。プロモーターは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトポリヘドリン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。
プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターであってもよく、後者は、宿主細胞がいくつか特定の外的刺激にさらされた場合にのみ転写を開始する。多細胞生物の場合、プロモーターは、特定の組織または臓器もしくは特定の発生段階に特異的であってもよい。プロモーターは、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターでよく、天然もしくは合成であってもよい。かかるプロモーターの例は、米国特許公開公報US20040175727に記載され、その内容は全体として本明細書に組み入れられる。
プロモーターは、エンハンサーと関連していてもよい。エンハンサーは、コード配列の上流に位置してもよい。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、または、CMV、FMDV、RSV、またはEBVなどのウイルスエンハンサーであってもよい。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第5,593,972号、同第5,962,428号、およびW094/016737に記載されており、それぞれの内容は参照により全体が組み入れられる。
(6)イントロン
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のイントロンを含んでいてもよい。各イントロンは、機能的スプライスドナー部位および機能的スプライスアクセプター部位を含んでいてもよい。イントロンは、スプライシングのエンハンサーを含んでいてもよい。イントロンは、効率のよいスプライシングに必要な1つ以上のシグナルを含んでいてもよい。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のイントロンを含んでいてもよい。各イントロンは、機能的スプライスドナー部位および機能的スプライスアクセプター部位を含んでいてもよい。イントロンは、スプライシングのエンハンサーを含んでいてもよい。イントロンは、効率のよいスプライシングに必要な1つ以上のシグナルを含んでいてもよい。
(7)転写終結領域
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の転写終結領域を含んでいてもよい。転写終結領域は、効率よい終結を提供するためにコード配列の下流であってもよい。転写終結領域は、上述のプロモーターと同じ遺伝子から得てもよいし、あるいは、1つ以上の異なる遺伝子から得てもよい。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の転写終結領域を含んでいてもよい。転写終結領域は、効率よい終結を提供するためにコード配列の下流であってもよい。転写終結領域は、上述のプロモーターと同じ遺伝子から得てもよいし、あるいは、1つ以上の異なる遺伝子から得てもよい。
(8)開始コドン
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の開始コドンを含んでいてもよい。開始コドンは、コード配列の上流に位置してもよい。開始コドンは、コード配列と共にインフレームであってもよい。開始コドンは、効率のよい翻訳開始に必要な1つ以上のシグナルと関連していてもよく、例えば、リボソーム結合部位と関連していてもよいが、これに限定されない。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の開始コドンを含んでいてもよい。開始コドンは、コード配列の上流に位置してもよい。開始コドンは、コード配列と共にインフレームであってもよい。開始コドンは、効率のよい翻訳開始に必要な1つ以上のシグナルと関連していてもよく、例えば、リボソーム結合部位と関連していてもよいが、これに限定されない。
(9)終結コドン
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の終結または終止コドンを含んでいてもよい。終結コドンは、コード配列の下流であってもよい。終結コドンは、コード配列と共にインフレームであってもよい。終結コドンは、効率のよい翻訳終結に必要な1つ以上のシグナルと関連していてもよい。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の終結または終止コドンを含んでいてもよい。終結コドンは、コード配列の下流であってもよい。終結コドンは、コード配列と共にインフレームであってもよい。終結コドンは、効率のよい翻訳終結に必要な1つ以上のシグナルと関連していてもよい。
(10)ポリアデニル化シグナル
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。ポリアデニル化シグナルは、効率のよい転写産物のポリアデニル化に必要な1つ以上のシグナルを含んでいてもよい。ポリアデニル化シグナルは、コード配列の下流に位置してもよい。ポリアデニル化シグナルは、SV40ポリアデニル化シグナル、LTRポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン(hGH)ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ-グロビンポリアデニル化シグナルであってもよい。SV40ポリアデニル化シグナルは、pCEP4プラスミド(インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州)からのポリアデニル化シグナルであってもよい。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のポリアデニル化シグナルを含んでいてもよい。ポリアデニル化シグナルは、効率のよい転写産物のポリアデニル化に必要な1つ以上のシグナルを含んでいてもよい。ポリアデニル化シグナルは、コード配列の下流に位置してもよい。ポリアデニル化シグナルは、SV40ポリアデニル化シグナル、LTRポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン(bGH)ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン(hGH)ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ-グロビンポリアデニル化シグナルであってもよい。SV40ポリアデニル化シグナルは、pCEP4プラスミド(インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州)からのポリアデニル化シグナルであってもよい。
(11)リーダー配列
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のリーダー配列を含んでいてもよい。リーダー配列は、シグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリン(Ig)シグナルペプチドであってもよく、例えば、IgGシグナルペプチドおよびIgEシグナルペプチドであるが、これらに限定されない。いくつかの実施例では、リーダー配列は、IgEリーダー配列であり、配列番号65のatggactgga cttggattct gttcctggtc gccgccgcaa ctcgcgtgca tagcである。これは、タンパク質の配列番号66のMet Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val His Serをコードする。
組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のリーダー配列を含んでいてもよい。リーダー配列は、シグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリン(Ig)シグナルペプチドであってもよく、例えば、IgGシグナルペプチドおよびIgEシグナルペプチドであるが、これらに限定されない。いくつかの実施例では、リーダー配列は、IgEリーダー配列であり、配列番号65のatggactgga cttggattct gttcctggtc gccgccgcaa ctcgcgtgca tagcである。これは、タンパク質の配列番号66のMet Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val His Serをコードする。
b.組み換え核酸配列構築物の配置構成
上述したように、組み換え核酸配列は、1つ以上の組み換え核酸配列構築物を含んでいてもよく、各々の組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の構成要素を含んでいてもよい。1つ以上の構成要素は、先に詳しく説明した通りである。1つ以上の構成要素は、組み換え核酸配列構築物に含まれる場合、互いに任意の順序で配置してもよい。いくつかの実施形態において、1つ以上の構成要素は、後述の組み換え核酸配列構築物に配置される。
上述したように、組み換え核酸配列は、1つ以上の組み換え核酸配列構築物を含んでいてもよく、各々の組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の構成要素を含んでいてもよい。1つ以上の構成要素は、先に詳しく説明した通りである。1つ以上の構成要素は、組み換え核酸配列構築物に含まれる場合、互いに任意の順序で配置してもよい。いくつかの実施形態において、1つ以上の構成要素は、後述の組み換え核酸配列構築物に配置される。
(1)配置構成1
一つの配置構成において、第1の組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでいてもよく、第2の組み換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。
一つの配置構成において、第1の組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでいてもよく、第2の組み換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。
第1の組み換え核酸配列構築物は、ベクターに配置してもよい。第2の組み換え核酸配列構築物は、第2もしくは別々のベクターに配置してもよい。組み換え核酸配列構築物をベクターに配置することは、以下により詳細に記載する。
第1の組み換え核酸配列構築物は、プロモーター、イントロン、転写終結領域、開始コドン、終結コドン、および/またはポリアデニル化シグナルも含んでいてもよい。第1の組み換え核酸配列構築物は、リーダー配列をさらに含んでもよく、該リーダー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流(または5’)に位置する。従って、リーダー配列よってコードされるシグナルペプチドは、ペプチド結合によって重鎖ポリペプチドに連結する。
第2の組み換え核酸配列構築物は、プロモーター、開始コドン、終結コドン、およびポリアデニル化シグナルも含んでいてもよい。第2の組み換え核酸配列構築物は、リーダー配列をさらに含んでもよく、該リーダー配列は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流(または5’)に位置する。従って、リーダー配列よってコードされるシグナルペプチドは、ペプチド結合によって軽鎖ポリペプチドに連結する。
従って、配置構成1の一例としては、VHおよびCH1を含む重鎖ポリペプチドをコードする第1のベクター(従って、第1の組み換え核酸配列構築物)と、VLおよびCLを含む軽鎖ポリペプチドをコードする第2のベクター(従って、第2の組み換え核酸配列構築物)とが挙げられる。配置構成1の第2例としては、VH、CH1、ヒンジ領域、CH2、およびCH3を含む重鎖ポリペプチドをコードする第1のベクター(従って、第1の組み換え核酸配列構築物)と、VLおよびCLを含む軽鎖ポリペプチドをコードする第2のベクター(従って、第2の組み換え核酸配列構築物)とが挙げられる。
(2)配置構成2
第2の配置構成において、前記組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列および軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流(または5’)に位置してもよい。あるいは、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流(または5’)に位置してもよい。
第2の配置構成において、前記組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列および軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流(または5’)に位置してもよい。あるいは、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流(または5’)に位置してもよい。
組み換え核酸配列構築物は、ベクターに配置してもよく、以下により詳細に記載する。
組み換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ切断部位および/またはリンカー配列をコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物に含まれる場合、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列および軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列間に位置してもよい。従って、プロテアーゼ切断部位により発現時に重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを別々のポリペプチドに分離することができる。他の実施形態において、リンカー配列が組み換え核酸配列構築物に含まれる場合、リンカー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置してもよい。
組み換え核酸配列構築物は、プロモーター、イントロン、転写終結領域、開始コドン、終結コドン、および/またはポリアデニル化シグナルも含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のプロモーターを含んでいてもよい。組み換え核酸配列構築物は、1つのプロモーターが、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と関連し、かつ、第2のプロモーターが、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と関連するように2つのプロモーターを含んでいてもよい。さらに別の実施形態において、組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列および軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と関連する1つのプロモーターを含んでいてもよい。
組み換え核酸配列構築物は、2つのリーダー配列をさらに含んでもよく、このうち、第1のリーダー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流(または5’)に位置し、第2のリーダー配列は、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列の上流(または5’)に位置する。従って、第1のリーダー配列によってコードされる第1のシグナルペプチドは、ペプチド結合によって重鎖ポリペプチドに連結し、第2のリーダー配列によってコードされる第2のシグナルペプチドは、ペプチド結合によって軽鎖ポリペプチドに連結する。
従って、配置構成2の一例としては、VHおよびCH1を含む重鎖ポリペプチドと、VLおよびCLを含む軽鎖ポリペプチドとをコードするベクター(従って、組み換え核酸配列構築物)が挙げられ、ここで、リンカー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置する。
配置構成2の第2例としては、VHおよびCH1を含む重鎖ポリペプチドと、VLおよびCLを含む軽鎖ポリペプチドとをコードするベクター(従って、組み換え核酸配列構築物)が挙げられ、ここで、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置する。
配置構成2の第3例としては、VH、CH1、ヒンジ領域、CH2、およびCH3を含む重鎖ポリペプチドと、VLおよびCLを含む軽鎖ポリペプチドとをコードするベクター(従って、組み換え核酸配列構築物)が挙げられ、ここで、リンカー配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置する。
配置構成2の第4例としては、VH、CH1、ヒンジ領域、CH2、およびCH3を含む重鎖ポリペプチドと、VLおよびCLを含む軽鎖ポリペプチドとをコードするベクター(従って、組み換え核酸配列構築物)が挙げられ、ここで、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列は、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列と、軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列との間に位置する。
c.組み換え核酸配列構築物からの発現
上述したように、組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の構成要素の中で、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列および/または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。従って、組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドおよび/または軽鎖ポリペプチドを発現し易くすることができる。
上述したように、組み換え核酸配列構築物は、1つ以上の構成要素の中で、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列および/または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。従って、組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドおよび/または軽鎖ポリペプチドを発現し易くすることができる。
上述の配置構成1を用いた場合、第1の組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドを発現し易くすることができ、第2の組み換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチドを発現し易くすることができる。上述の配置構成2を用いた場合、組み換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを発現し易くすることができる。
発現時、例えば、限定されないが、細胞、生物、または哺乳動物内において、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを合成抗体に組み立てることができる。特に、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、抗原に結合することが可能な合成抗体をアセンブリがもたらすように、互いに相互作用することができる。他の実施形態において、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、本明細書に記載のように組み立てられていない抗体に比べてより免疫原性が強い合成抗体をアセンブリがもたらすように、互いに相互作用することができる。さらに別の実施形態において、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、抗原に対して免疫応答を引き起こすかもしくは誘導することが可能な合成抗体をアセンブリがもたらすように、互いに相互作用することができる。
d.ベクター
上述の組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のベクターに配置し得る。1つ以上のベクターは、複製起点を含んでいてもよい。1つ以上のベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってもよい。1つ以上のベクターは、自己複製過剰染色体ベクターまたは宿主ゲノムに組み込むベクターのいずれかであってもよい。
上述の組み換え核酸配列構築物は、1つ以上のベクターに配置し得る。1つ以上のベクターは、複製起点を含んでいてもよい。1つ以上のベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってもよい。1つ以上のベクターは、自己複製過剰染色体ベクターまたは宿主ゲノムに組み込むベクターのいずれかであってもよい。
1つ以上のベクターは、異種発現構築物であってもよく、これは、一般に、特定の遺伝子をターゲット細胞を導入するのに使用されるプラスミドである。発現ベクターがいったん細胞中に入ると、組み換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび/または軽鎖ポリペプチドは、細胞性-転写および翻訳機械であるリボソーム複合体によって産生される。1つ以上のベクターは、大量の安定したメッセンジャーRNA、従って、大量のタンパク質を発現することができる。
(1)発現ベクター
1つ以上のベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であってもよい。環状プラスミドおよび線状核酸は、適切な対象細胞中で特定のヌクレオチド配列の発現を誘導することができる。組み換え核酸配列構築物を含む1つ以上のベクターは、キメラであってもよい。これは、その構成要素のうちの少なくとも1つが、他の構成要素のうちの少なくとも1つに対して異種であることを意味する。
1つ以上のベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であってもよい。環状プラスミドおよび線状核酸は、適切な対象細胞中で特定のヌクレオチド配列の発現を誘導することができる。組み換え核酸配列構築物を含む1つ以上のベクターは、キメラであってもよい。これは、その構成要素のうちの少なくとも1つが、他の構成要素のうちの少なくとも1つに対して異種であることを意味する。
(2)プラスミド
1つ以上のベクターは、プラスミドであってもよい。プラスミドは、組み換え核酸配列構築物を備えた細胞をトランスフェクトするのに有用であり得る。プラスミドは、組み換え核酸配列構築物を対象に導入するのに有用であり得る。プラスミドは、調節配列も含んでもよく、これは、プラスミドを投与された細胞中での遺伝子発現に十分に適していてもよい。
1つ以上のベクターは、プラスミドであってもよい。プラスミドは、組み換え核酸配列構築物を備えた細胞をトランスフェクトするのに有用であり得る。プラスミドは、組み換え核酸配列構築物を対象に導入するのに有用であり得る。プラスミドは、調節配列も含んでもよく、これは、プラスミドを投与された細胞中での遺伝子発現に十分に適していてもよい。
プラスミドは、プラスミドを染色体外に維持し、かつ、細胞中でプラスミドの複数のコピーを産生するために哺乳類の複製起点も含んでいてもよい。プラスミドは、インビトロジェン(サンディエゴ、カリフォルニア州)からのpVAXI、pCEP4、またはpREP4であって、これらは、エプステイン・バー・ウイルスの複製起点と、核抗原EBNA-1のコード領域とを含んでいてもよく、統合しないで高いコピーのエピソーム複製を生じる。プラスミドのバックボーンは、pAV0242であってもよい。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス5型(Ad5)プラスミドであってもよい。
プラスミドは、pSE420(インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州)であってもよく、それを大腸菌(E.Coli)中でのタンパク質産生のために用いてもよい。プラスミドは、pYES2(インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州)であってもよく、それを酵母のサッカロマイセス・セレビシエ株でのタンパク質産生に用いてもよい。プラスミドは、MAXBAC(商標)完全バキュロウイルス発現系(インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州)のものであってもよく、それを昆虫細胞中でのタンパク質産生に用いてもよい。プラスミドは、pcDNA IまたはpcDNA3(インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州)であってもよく、それを哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中でのタンパク質産生に用いてもよい。
(3)環状および線状ベクター
1つ以上のベクターは、環状プラスミドであってもよく、これは、標的細胞を統合によって細胞性ゲノムに形質転換してもよく、あるいは、染色体外に存在してもよい(例えば、複製起点をもつ自律複製プラスミド)。ベクターは、pVAX、pcDNA3.0、provax、または、組み換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび/または軽鎖ポリペプチドを発現可能な任意の他の発現ベクターであってもよい。
1つ以上のベクターは、環状プラスミドであってもよく、これは、標的細胞を統合によって細胞性ゲノムに形質転換してもよく、あるいは、染色体外に存在してもよい(例えば、複製起点をもつ自律複製プラスミド)。ベクターは、pVAX、pcDNA3.0、provax、または、組み換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび/または軽鎖ポリペプチドを発現可能な任意の他の発現ベクターであってもよい。
また、本明細書で提供されるのは、線状核酸または線状発現カセット(「LEC」)であり、これは、電気穿孔を介して対象に効率よく送達され、かつ、組み換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび/または軽鎖ポリペプチドを発現することができる。LECは、任意のリン酸バックボーンを欠いた任意の線状DNAであってもよい。LECは、任意の抗生物質抵抗性遺伝子および/またはリン酸バックボーンをを含んでいなくてもよい。LECは、所望の遺伝子発現に関連しない他の核酸配列を含んでいなくてもよい。
LECは、線状にすることが可能な任意のプラスミド由来であってもよい。プラスミドは、組み換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび/または軽鎖ポリペプチドを発現可能であってもよい。プラスミドは、pNP(プエルトリコ/34)またはpM2(ニューカレドニア/99)であってもよい。プラスミドは、WLV009、pVAX、pcDNA3.0、provax、または、組み換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび/または軽鎖ポリペプチドを発現可能な任意の他の発現ベクターであってもよい。
LECは、pcrM2であってもよい。LECは、pcrNPであってもよい。pcrNPおよびpcrMRは、それぞれpNP(プエルトリコ/34)およびpM2(ニューカレドニア/99)由来であってもよい。
(4)ベクターを調製する方法
本明細書で提供されるのは、組み換え核酸配列構築物が配置されている1つ以上のベクターを調製する方法である。最終的なサブクローニングステップの後、ベクターを、当該技術分野で公知の方法を用いて、大規模発酵タンクで細胞培養物に接種するのに用いることができる。
本明細書で提供されるのは、組み換え核酸配列構築物が配置されている1つ以上のベクターを調製する方法である。最終的なサブクローニングステップの後、ベクターを、当該技術分野で公知の方法を用いて、大規模発酵タンクで細胞培養物に接種するのに用いることができる。
他の実施形態において、最終的なサブクローニングステップの後、ベクターを1つ以上の電気穿孔(EP)装置で用いることができる。EP装置を以下により詳細に記載する。
1つ以上のベクターは、公知の装置および技術の組み合わせを利用して配合または製造することができるが、好ましくはそれらは、2007年3月23日に出願された許諾対象である同時係属中の米国特許仮出願第60/939,792号に記載されたプラスミド製造技術を用いて製造される。幾つかの例において、本明細書に記載のDNAプラスミドは、10mg/mL以上の濃度で配合させることができる。その製造技術は、米国特許出願第60/939792号に記載されたものに加えて、2007年7月3日発行の許諾対象特許である米国特許第7,238,522号に記載されたものをはじめとする、当業者に概ね公知の様々な装置およびプロトコルも含み、組み入れている。先に参照された出願および特許である、米国特許出願第60/939,792号および米国特許第7,238,522号は、それぞれ全体が本明細書に組み入れられる。
4.抗体
上述したように、組み換え核酸配列は、抗体、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードすることができる。抗体は、抗原に結合できるかあるいは抗原と反応することができ、これは、以下により詳細に記載する。
上述したように、組み換え核酸配列は、抗体、その断片、その変異体、またはその組み合わせをコードすることができる。抗体は、抗原に結合できるかあるいは抗原と反応することができ、これは、以下により詳細に記載する。
抗体は、重鎖および軽鎖相補性決定領域(「CDR」)セットを含んでいてもよく、それぞれは、CDRに対する支持体をもたらし、互いにCDRの空間関係を規定する、重鎖および軽鎖フレームワーク(「FR」)セットの間に介在する。CDRセットは、重鎖または軽鎖V領域の3つの超可変領域を含んでいてもよい。重鎖または軽鎖のN-末端から開始して、これらの領域は、それぞれ、「CDR1」、「CDR2」、および「CDR3」と称せられる。従って、抗原結合部位は、各々が重鎖および軽鎖V領域からなるCDRセットを含む6つのCDRを含んでいてもよい。
タンパク質分解酵素パパインは、IgG分子を優先的に切断して、いくつかの断片を生じさせ、そのうちの2つ(F(ab)断片)は、各々無傷抗原結合部位を含む共有結合ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、IgG分子を切断して、双方の抗原結合部位を含むF(ab’)2断片を含めたいくつかの断片を供することができる。従って、抗体は、FabまたはF(ab’)2であってもよい。Fabは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含んでいてもよい。Fabの重鎖ポリペプチドは、VH領域およびCH1領域を含んでいてもよい。Fabの軽鎖は、VL領域およびCL領域を含んでいてもよい。
抗体は、免疫グロブリン(Ig)であってもよい。Igは、例えば、IgA、IgM、IgD、IgE、およびIgGであってもよい。免疫グロブリンは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含んでいてもよい。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、VH領域、CH1領域、ヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域を含んでいてもよい。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、VL領域およびCL領域を含んでいてもよい。
抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であってもよい。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の1つ以上の相補性決定領域(CDR)およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種由来の抗体であってもよい。
5.抗原
合成抗体は、抗原またはその断片あるいはその変異体に向けられるものである。抗原は、核酸配列、アミノ酸配列、またはその組み合わせであってもよい。核酸配列は、DNA、RNA、cDNA、その変異体、その断片、またはその組み合わせであってもよい。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、その変異体、その断片、またはその組み合わせであってもよい。
合成抗体は、抗原またはその断片あるいはその変異体に向けられるものである。抗原は、核酸配列、アミノ酸配列、またはその組み合わせであってもよい。核酸配列は、DNA、RNA、cDNA、その変異体、その断片、またはその組み合わせであってもよい。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、その変異体、その断片、またはその組み合わせであってもよい。
抗原は、任意の数の生物、例えば、ウイルス、寄生虫、細菌、真菌、または哺乳動物由来であってもよい。抗原は、自己免疫疾患、アレルギー、または喘息と関連し得る。他の実施形態において、抗原は、癌、ヘルペス、インフルエンザ、B型肝炎、C型肝炎、ヒト・パピローマウイルス(HPV)、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)と関連し得る。
いくつかの実施形態において、抗原は外来である。いくつかの実施形態において、抗原は自己抗原である。
a.外来抗原
いくつかの実施形態において、抗原は外来である。外来抗原は、体内に導入された場合、免疫応答を刺激することが可能な任意の非自己物質(すなわち、対象の外部由来)である。
いくつかの実施形態において、抗原は外来である。外来抗原は、体内に導入された場合、免疫応答を刺激することが可能な任意の非自己物質(すなわち、対象の外部由来)である。
(1)ウイルス抗原
外来抗原は、ウイルス抗原、またはその断片、またはその変異体であってもよい。ウイルス抗原は、以下の科:アデノウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、またはトガウイルス科の一つからであってもよい。ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、チクングニヤウイルス(CHIKV)、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス(HPV)、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、例えば、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス(HDV)、E型肝炎ウイルス(HEV)、天然痘ウイルス(大痘瘡および小痘瘡)、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、ノーウォークウイルス、A型肝炎ウイルス、ヒトT-細胞白血病ウイルス(HTLV-I)、毛様細胞白血病ウイルス(HTLV-II)、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス(出血熱)、狂犬病ウイルス、エボラ出血熱ウイルス、マールブルグ・ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、1型単純ヘルペスウイルス(口腔ヘルペス)、2型単純ヘルペスウイルス(陰部ヘルペス)、帯状疱疹(水痘帯状疱疹、a.k.a.、水痘)、サイトメガロウイルス(CMV)(例えば、ヒトCMV)、エプステイン・バー・ウイルス(EBV)、フラビウイルス、口蹄疫ウイルス、ラッサ熱ウイルス、アレナウイルス、または発がん性ウイルス由来であってもよい。
外来抗原は、ウイルス抗原、またはその断片、またはその変異体であってもよい。ウイルス抗原は、以下の科:アデノウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、またはトガウイルス科の一つからであってもよい。ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、チクングニヤウイルス(CHIKV)、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス(HPV)、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、例えば、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス(HDV)、E型肝炎ウイルス(HEV)、天然痘ウイルス(大痘瘡および小痘瘡)、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、ノーウォークウイルス、A型肝炎ウイルス、ヒトT-細胞白血病ウイルス(HTLV-I)、毛様細胞白血病ウイルス(HTLV-II)、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス(出血熱)、狂犬病ウイルス、エボラ出血熱ウイルス、マールブルグ・ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、1型単純ヘルペスウイルス(口腔ヘルペス)、2型単純ヘルペスウイルス(陰部ヘルペス)、帯状疱疹(水痘帯状疱疹、a.k.a.、水痘)、サイトメガロウイルス(CMV)(例えば、ヒトCMV)、エプステイン・バー・ウイルス(EBV)、フラビウイルス、口蹄疫ウイルス、ラッサ熱ウイルス、アレナウイルス、または発がん性ウイルス由来であってもよい。
(a)ヒト免疫不全ウイルス(HIV)抗原
ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ウイルス由来であってもよい。いくつかの実施形態において、HIV抗原は、サブタイプAエンベロープタンパク質、サブタイプBエンベロープタンパク質、サブタイプCエンベロープタンパク質、サブタイプDエンベロープタンパク質、サブタイプB Nef-Revタンパク質、GagサブタイプA、B、C、またはDタンパク質、MPolタンパク質、核酸、またはEnv A、Env B、Env C、Env D、B Nef-Rev、Gag、またはその任意の組み合わせのアミノ酸配列であってもよい。
ウイルス抗原は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)ウイルス由来であってもよい。いくつかの実施形態において、HIV抗原は、サブタイプAエンベロープタンパク質、サブタイプBエンベロープタンパク質、サブタイプCエンベロープタンパク質、サブタイプDエンベロープタンパク質、サブタイプB Nef-Revタンパク質、GagサブタイプA、B、C、またはDタンパク質、MPolタンパク質、核酸、またはEnv A、Env B、Env C、Env D、B Nef-Rev、Gag、またはその任意の組み合わせのアミノ酸配列であってもよい。
HIVに特異的な合成抗体は、配列番号3の核酸配列によってコードされる配列番号48のアミノ酸配列と配列番号4の核酸配列によってコードされる配列番号49のアミノ酸配列とを含むFab断片を含んでいてもよい。合成抗体は、配列番号6の核酸配列によってコードされる配列番号46のアミノ酸配列および配列番号7の核酸配列によってコードされる配列番号47のアミノ酸配列を含んでいてもよい。Fab断片は、配列番号50の核酸配列によってコードされる配列番号51のアミノ酸配列を含む。Fabは、配列番号52の核酸配列によってコードされる配列番号53のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
HIVに特異的な合成抗体は、配列番号5のアミノ酸配列を含むIgを含んでいてもよい。Igは、配列番号62の核酸配列によってコードされる配列番号1のアミノ酸配列を含んでいてもよい。Igは、配列番号63の核酸配列によってコードされる配列番号2のアミノ酸配列を含んでいてもよい。Igは、配列番号54の核酸配列によってコードされる配列番号55のアミノ酸配列および配列番号56の核酸配列によってコードされる配列番号57のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
(b)チクングンヤ熱ウイルス
ウイルス抗原は、チクングニヤウイルス由来であってもよい。チクングニヤウイルスは、トガウイルス科のアルファウイルス属に属する。チクングニヤウイルスは、ヤブカ属などの感染蚊の刺咬によってヒトに伝染する。
ウイルス抗原は、チクングニヤウイルス由来であってもよい。チクングニヤウイルスは、トガウイルス科のアルファウイルス属に属する。チクングニヤウイルスは、ヤブカ属などの感染蚊の刺咬によってヒトに伝染する。
CHIKVに特異的な合成抗体は、配列番号58の核酸配列によってコードされる配列番号59のアミノ酸配列と配列番号60の核酸配列によってコードされる配列番号61のアミノ酸配列とを含むFab断片を含んでいてもよい。
(c)デングウイルス
ウイルス抗原は、デングウイルス由来であってもよい。デングウイルス抗原は、ウイルス粒子を形成する3つのタンパク質またはポリペプチド(C、prM、およびE)の1つであってもよい。デングウイルス抗原は、ウイルスの複製に関わる7つの他のタンパク質またはポリペプチド(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)の1つであってもよい。デングウイルスは、DENV-1、DENV-2、DENV-3、およびDENV-4を含む、ウイルスの5つの株または血清型の1つであってもよい。抗原は、複数のデングウイルス抗原の任意の組み合わせであってもよい。
ウイルス抗原は、デングウイルス由来であってもよい。デングウイルス抗原は、ウイルス粒子を形成する3つのタンパク質またはポリペプチド(C、prM、およびE)の1つであってもよい。デングウイルス抗原は、ウイルスの複製に関わる7つの他のタンパク質またはポリペプチド(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)の1つであってもよい。デングウイルスは、DENV-1、DENV-2、DENV-3、およびDENV-4を含む、ウイルスの5つの株または血清型の1つであってもよい。抗原は、複数のデングウイルス抗原の任意の組み合わせであってもよい。
デングウイルスに特異的な合成抗体は、配列番号44の核酸配列によってコードされる配列番号45のアミノ酸配列を含むIgを含んでいてもよい。
(d)肝炎抗原
ウイルス抗原は、肝炎ウイルス抗原(すなわち、肝炎抗原)、またはその断片、またはその変異体を含んでいてもよい。肝炎抗原は、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス(HDV)、および/またはE型肝炎ウイルス(HEV)の1つ以上由来の抗原または免疫原であってもよい。
ウイルス抗原は、肝炎ウイルス抗原(すなわち、肝炎抗原)、またはその断片、またはその変異体を含んでいてもよい。肝炎抗原は、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス(HDV)、および/またはE型肝炎ウイルス(HEV)の1つ以上由来の抗原または免疫原であってもよい。
肝炎抗原は、HAV由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、HAVカプシドタンパク質、HAV非構造タンパク質、その断片、その変異体、またはその組み合わせであってもよい。
肝炎抗原は、HCV由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、HCVヌクレオカプシドタンパク質(すなわち、コアタンパク質)、HCVエンベロープタンパク質(例えば、E1およびE2)、HCV非構造タンパク質(例えば、NS1、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、およびNS5b)、その断片、その変異体、またはその組み合わせであってもよい。
肝炎抗原は、HDV由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、HDVデルタ抗原、その断片、またはその変異体であってもよい。
肝炎抗原は、HEV由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、HEVカプシドタンパク質、その断片、またはその変異体であってもよい。
肝炎抗原は、HBV由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、HBVコアタンパク質、HBV表面タンパク質、HBV DNAポリメラーゼ、X遺伝子によってコードされるHBVタンパク質、その断片、その変異体、またはその組み合わせであってもよい。肝炎抗原は、HBV遺伝子A型コアタンパク質、HBV遺伝子B型コアタンパク質、HBV遺伝子C型コアタンパク質、HBV遺伝子D型コアタンパク質、HBV遺伝子E型コアタンパク質、HBV遺伝子F型コアタンパク質、HBV遺伝子G型コアタンパク質、HBV遺伝子H型コアタンパク質、HBV遺伝子A型表面タンパク質、HBV遺伝子B型表面タンパク質、HBV遺伝子C型表面タンパク質、HBV遺伝子D型表面タンパク質、HBV遺伝子E型表面タンパク質、HBV遺伝子F型表面タンパク質、HBV遺伝子G型表面タンパク質、HBV遺伝子H型表面タンパク質、その断片、その変異体、またはその組み合わせであってもよい。
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、HBV遺伝子A型、HBV遺伝子B型、HBV遺伝子C型、HBV遺伝子D型、HBV遺伝子E型、HBV遺伝子F型、HBV遺伝子G型、またはHBV遺伝子H型由来の抗原であってもよい。
(e)ヒト・パピローマウイルス(HPV)抗原
ウイルス抗原は、HPV由来の抗原を含んでいてもよい。HPV抗原は、子宮頸癌、直腸癌、および/またはその他の癌を引き起こすHPV型16、18、31、33、35、45、52、および58由来であってもよい。HPV抗原は、性器疣贅を引き起こし、かつ、頭部癌および頸部癌の原因としても知られるHPV型6および11由来であってもよい。
ウイルス抗原は、HPV由来の抗原を含んでいてもよい。HPV抗原は、子宮頸癌、直腸癌、および/またはその他の癌を引き起こすHPV型16、18、31、33、35、45、52、および58由来であってもよい。HPV抗原は、性器疣贅を引き起こし、かつ、頭部癌および頸部癌の原因としても知られるHPV型6および11由来であってもよい。
HPV抗原は、各HPV型からのHPV E6またはE7領域であってもよい。例えば、HPV型16(HPV16)において、HPV16抗原は、HPV16 E6抗原、HPV16 E7抗原、断片、変異体、またはその組み合わせを含んでいてもよい。同様に、HPV抗原は、HPV6 E6および/またはE7、HPV11 E6および/またはE7、HPV18 E6および/またはE7、HPV31 E6および/またはE7、HPV33 E6および/またはE7、HPV52 E6および/またはE7、HPV58 E6および/またはE7、断片、変異体、またはその組み合わせであってもよい。
(f)RSV抗原
ウイルス抗原は、RSV抗原を含んでいてもよい。RSV抗原は、ヒトRSV融合タンパク質(本明細書では、「RSV F」、「RSV Fタンパク質」、および「Fタンパク質」と称することもある)、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。ヒトRSV融合タンパク質は、RSVサブタイプAおよびBの間で保存されてもよい。RSV抗原は、RSV長株(ジェンバンク(GenBank)AAX23994.1)由来のRSV Fタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。RSV抗原は、RSV A2株(ジェンバンクAAB59858.1)由来のRSV Fタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。RSV抗原は、RSV Fタンパク質の単量体、二量体、三量体、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。
ウイルス抗原は、RSV抗原を含んでいてもよい。RSV抗原は、ヒトRSV融合タンパク質(本明細書では、「RSV F」、「RSV Fタンパク質」、および「Fタンパク質」と称することもある)、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。ヒトRSV融合タンパク質は、RSVサブタイプAおよびBの間で保存されてもよい。RSV抗原は、RSV長株(ジェンバンク(GenBank)AAX23994.1)由来のRSV Fタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。RSV抗原は、RSV A2株(ジェンバンクAAB59858.1)由来のRSV Fタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。RSV抗原は、RSV Fタンパク質の単量体、二量体、三量体、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。
RSV Fタンパク質は、前融合形態または後融合形態であってもよい。RSV Fの後融合形態は、免疫動物中で高い中和抗体力価を引き起こし、該動物をRSV抗原投与から防御する。
RSV抗原は、ヒトRSV付着糖タンパク質(本明細書では、「RSV G」、「RSV Gタンパク質」、および「Gタンパク質」と称することもある)、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。ヒトRSV Gタンパク質は、RSVサブタイプAおよびB間で異なる。抗原は、RSV長株(ジェンバンクAAX23993)由来のRSV Gタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。RSV抗原は、RSVサブタイプB単離体H5601、RSVサブタイプB単離体H1068、RSVサブタイプB単離体H5598、RSVサブタイプB単離体H1123由来のRSV Gタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。
他の実施形態において、RSV抗原は、ヒトRSV非構造タンパク質1(「NS1タンパク質」)、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、RSV抗原は、RSV長株(ジェンバンクAAX23987.1)由来のRSV NS1タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。RSV抗原は、RSV非構造タンパク質2(「NS2タンパク質」)、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、RSV抗原は、RSV長株(ジェンバンクAAX23988.1)由来のRSV NS2タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。さらに、RSV抗原は、ヒトRSVヌクレオカプシド(「N」)タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、RSV抗原は、RSV長株(ジェンバンクAAX23989.1)由来のRSV Nタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。RSV抗原は、ヒトRSVリン(「P」)タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、RSV抗原は、RSV長株(ジェンバンクAAX23990.1)由来のRSV Pタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。RSV抗原は、ヒトRSV基質(「M」)タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、RSV抗原は、RSV長株(ジェンバンクAAX23991.1)由来のRSV Mタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。
さらに別の実施形態において、RSV抗原は、ヒトRSV疎水性低分子(「SH」)タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、RSV抗原は、RSV長株(ジェンバンクAAX23992.1)由来のRSV SHタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。RSV抗原は、ヒトRSV基質2-1(「M2-1」)タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、RSV抗原は、RSV長株(ジェンバンクAAX23995.1)由来のRSV M2-1タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。さらに、RSV抗原は、ヒトRSV基質2-2(「M2-2」)タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、RSV抗原は、RSV長株(ジェンバンクAAX23997.1)由来のRSV M2-2タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。RSV抗原は、ヒトRSVポリメラーゼL(「L」)タンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。例えば、RSV抗原は、RSV長株(ジェンバンクAAX23996.1)由来のRSV Lタンパク質、またはその断片あるいはその変異体であってもよい。
別の実施形態において、RSV抗原は、NS1、NS2、N、P、M、SH、M2-1、M2-2、またはLタンパク質の最適化アミノ酸配列を有し得る。RSV抗原は、ヒトRSVタンパク質または組み換え抗原であってもよく、これは、ヒトRSVゲノムによってコードされるタンパク質のいずれか一つである。
他の実施形態において、RSV抗原は、RSV長株由来のRSV Fタンパク質、RSV長株由来のRSV Gタンパク質、最適化アミノ酸RSV Gアミノ酸配列、RSV長株のヒトRSVゲノム、最適化アミノ酸RSV Fアミノ酸配列、RSV長株由来のRSV NS1タンパク質、RSV長株由来のRSV NS2タンパク質、RSV長株由来のRSV Nタンパク質、RSV長株由来のRSV Pタンパク質、RSV長株由来のRSV Mタンパク質、RSV長株由来のRSV SHタンパク質、RSV長株由来のRSV M2-1タンパク質、RSV長株由来のRSV M2-2タンパク質、RSV長株由来のRSV Lタンパク質、RSVサブタイプB単離体H5601由来のRSV Gタンパク質、RSVサブタイプB単離体H1068由来のRSV Gタンパク質、RSVサブタイプB単離体H5598由来のRSV Gタンパク質、RSVサブタイプB単離体H1123由来のRSV Gタンパク質、またはその断片、またはその変異体であってもよいが、これらに限定されない。
(g)インフルエンザ抗原
ウイルス抗原は、インフルエンザウイルス由来の抗原を含んでいてもよい。インフルエンザ抗原は、1つ以上のインフルエンザ血清型に対して哺乳動物中で免疫応答を引き起こすことができるものである。抗原は、全長翻訳産物HA0、サブユニットHA1、サブユニットHA2、その変異体、その断片、またはその組み合わせを含んでいてもよい。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、複数株のA型インフルエンザ血清型H1、複数株のA型インフルエンザ血清型H2由来であっても、異なる複数株セットのA型インフルエンザ血清型H1由来のハイブリッド配列であっても、あるいは、複数株のB型インフルエンザ由来であってもよい。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、B型インフルエンザ由来であってもよい。
ウイルス抗原は、インフルエンザウイルス由来の抗原を含んでいてもよい。インフルエンザ抗原は、1つ以上のインフルエンザ血清型に対して哺乳動物中で免疫応答を引き起こすことができるものである。抗原は、全長翻訳産物HA0、サブユニットHA1、サブユニットHA2、その変異体、その断片、またはその組み合わせを含んでいてもよい。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、複数株のA型インフルエンザ血清型H1、複数株のA型インフルエンザ血清型H2由来であっても、異なる複数株セットのA型インフルエンザ血清型H1由来のハイブリッド配列であっても、あるいは、複数株のB型インフルエンザ由来であってもよい。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、B型インフルエンザ由来であってもよい。
インフルエンザ抗原は、免疫応答が誘発される特定のインフルエンザ免疫原に対して効果的な少なくとも1つの抗原エピトープを含んでいてもよい。抗原は、無傷インフルエンザウイルス内に存在する免疫原性部位およびエピトープの全てのレパートリーを供し得る。抗原は、血清型H1または血清型H2の複数のA型インフルエンザウイルス株など、1つの血清型の複数のA型インフルエンザウイルス株からのヘマグルチニン抗原配列由来であってもよい。抗原は、2つの異なるヘマグルチニン抗原配列またはその一部分の組み合わせ由来であるハイブリッドヘマグルチニン抗原配列であってもよい。2つの異なるヘマグルチニン抗原配列の各々は、血清型H1の複数のA型インフルエンザウイルス株など、1つの血清型の複数のA型インフルエンザウイルス株の異なるセット由来であってもよい。抗原は、複数のB型インフルエンザウイルス株からのヘマグルチニン抗原配列由来であるヘマグルチニン抗原配列であってもよい。
いくつかの実施形態において、インフルエンザ抗原は、H1 HA、H2 HA、H3 HA、H5 HA、またはBHA抗原であってもよい。
(h)エボラウイルス
ウイルス抗原は、エボラウイルス由来であってもよい。エボラウイルス疾患(EVD)またはエボラ出血熱(EHF)としては、5つの公知のエボラウイルス、ブンディブギョウイルス(BDBV)、エボラウイルス(EBOV)、スーダンウイルス(SUDV)、およびタイフォレストウイルス(TAFV、コートジボワールエボラウイルス(象牙海岸エボラウイルス、CIEBOV)とも呼ばれる)の任意の4つが挙げられる。
ウイルス抗原は、エボラウイルス由来であってもよい。エボラウイルス疾患(EVD)またはエボラ出血熱(EHF)としては、5つの公知のエボラウイルス、ブンディブギョウイルス(BDBV)、エボラウイルス(EBOV)、スーダンウイルス(SUDV)、およびタイフォレストウイルス(TAFV、コートジボワールエボラウイルス(象牙海岸エボラウイルス、CIEBOV)とも呼ばれる)の任意の4つが挙げられる。
(2)細菌性抗原
外来抗原は、細菌性抗原またはその断片あるいはその変異体であってもよい。細菌は、以下の門:アシドバクテリウム門、アクチノバクテリア門、アクウィフェクス門、バクテロイデス門、カルディセリクム門、クラミジア門、クロロビウム門、クロロフレクサス門、クリシオゲネス門、シアノバクテリア門、デフェリバクター門、デイノコックス・テルムス門、ディクチオグロムス門、エルシミクロビウム門、フィブロバクター門、フィルミクテス門、フソバクテリウム門、ゲマティモナス門、レンティスファエラ門、ニトロスピラ門、プランクトミケス門、プロテオバクテリア門、スピロヘータ門、シネルギステス門、テネリクテス門、サーモデスルフォバクテリア門、テルモトガ門、およびウェルコミクロビウム門の任意の1つ由来であってもよい。
外来抗原は、細菌性抗原またはその断片あるいはその変異体であってもよい。細菌は、以下の門:アシドバクテリウム門、アクチノバクテリア門、アクウィフェクス門、バクテロイデス門、カルディセリクム門、クラミジア門、クロロビウム門、クロロフレクサス門、クリシオゲネス門、シアノバクテリア門、デフェリバクター門、デイノコックス・テルムス門、ディクチオグロムス門、エルシミクロビウム門、フィブロバクター門、フィルミクテス門、フソバクテリウム門、ゲマティモナス門、レンティスファエラ門、ニトロスピラ門、プランクトミケス門、プロテオバクテリア門、スピロヘータ門、シネルギステス門、テネリクテス門、サーモデスルフォバクテリア門、テルモトガ門、およびウェルコミクロビウム門の任意の1つ由来であってもよい。
細菌は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌であってもよい。細菌は、好気性細菌または嫌気性細菌であってもよい。細菌は、独立栄養細菌または従属栄養細菌であってもよい。細菌は、中温菌、好中菌、好極限菌、好酸菌、好アルカリ菌、好熱菌、低温菌、好塩菌、または好濃菌であってもよい。
細菌は、炭疽菌、抗生物質耐性菌、病原菌、食中毒菌、感染性菌、サルモネラ菌、ブドウ球菌、連鎖球菌属細菌、または破傷風菌であってもよい。細菌は、抗酸菌、破傷風菌、ペスト菌、炭疽菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、またはクロストリジウム-ディフィシレ菌であってもよい。細菌は、結核菌であってもよい。
(a)結核菌抗原
細菌性抗原は、結核菌抗原(すなわち、TB抗原またはTB免疫原)、またはその断片、またはその変異体であってもよい。TB抗原は、TB抗原のAg85科、例えば、Ag85AおよびAg85B由来であってもよい。TB抗原は、TB抗原のEsx科、例えば、EsxA、EsxB、EsxC、EsxD、EsxE、EsxF、EsxH、EsxO、EsxQ、EsxR、EsxS、EsxT、EsxU、EsxV、およびEsxW由来であってもよい。
細菌性抗原は、結核菌抗原(すなわち、TB抗原またはTB免疫原)、またはその断片、またはその変異体であってもよい。TB抗原は、TB抗原のAg85科、例えば、Ag85AおよびAg85B由来であってもよい。TB抗原は、TB抗原のEsx科、例えば、EsxA、EsxB、EsxC、EsxD、EsxE、EsxF、EsxH、EsxO、EsxQ、EsxR、EsxS、EsxT、EsxU、EsxV、およびEsxW由来であってもよい。
(3)寄生虫抗原
外来抗原は、寄生虫抗原またはその断片あるいはその変異体であってもよい。寄生虫は、原虫、寄生蠕虫、または外部寄生虫であってもよい。寄生蠕虫(すなわち、蠕虫)は、扁虫(例えば、吸虫および条虫)、鉤頭虫、または回虫(例えば、蟯虫)であってもよい。外部寄生虫は、シラミ、ノミ、マダニ、およびダニであってもよい。
外来抗原は、寄生虫抗原またはその断片あるいはその変異体であってもよい。寄生虫は、原虫、寄生蠕虫、または外部寄生虫であってもよい。寄生蠕虫(すなわち、蠕虫)は、扁虫(例えば、吸虫および条虫)、鉤頭虫、または回虫(例えば、蟯虫)であってもよい。外部寄生虫は、シラミ、ノミ、マダニ、およびダニであってもよい。
寄生虫は、以下の疾患のうちの任意の1つの原因となる任意の寄生虫であってもよい:アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、回虫症(Baylisascariasis)、シャーガス病、肝吸虫症、コクリオミイヤ症、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮病、蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ランブル鞭毛虫症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、メタゴニムス症、ハエ蛆症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫病、および鞭虫症。
寄生虫は、アカントアメーバ、アニサキス、回虫(Ascaris lumbricoides)、ウマバエ、大腸バランチジウム、トコジラミ、条虫綱(条虫)、ツツガムシ、ラセンウジバエ、赤痢アメーバ、肝蛭、ランブル鞭毛虫、鉤虫、リーシュマニア、鼻腔舌虫、肝吸虫、ロア糸状虫、肺吸虫(肺吸虫)、蟯虫、熱帯熱マラリア原虫、住血吸虫、糞線虫、ダニ、条虫、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ、鞭虫、またはバンクロフト糸状虫であってもよい。
(a)マラリア抗原
外来抗原は、マラリア抗原(すなわち、PF抗原またはPF免疫原)、またはその断片、またはその変異体であってもよい。抗原は、マラリアの原因となる寄生虫由来であってもよい。マラリア病原性の寄生虫は、熱帯熱マラリア原虫であってもよい。熱帯熱マラリア原虫抗原は、スポロゾイト周囲(CS)抗原を含んでいてもよい。
外来抗原は、マラリア抗原(すなわち、PF抗原またはPF免疫原)、またはその断片、またはその変異体であってもよい。抗原は、マラリアの原因となる寄生虫由来であってもよい。マラリア病原性の寄生虫は、熱帯熱マラリア原虫であってもよい。熱帯熱マラリア原虫抗原は、スポロゾイト周囲(CS)抗原を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、マラリア抗原は、熱帯熱マラリア原虫免疫原CS;LSA1;TRAP;CelTOS;およびAma1の1つであってもよい。免疫原は、全長タンパク質またはその免疫原性断片であってもよい。
他の実施形態において、マラリア抗原は、SSP2とも呼ばれるTRAPであってもよい。さらに別の実施形態において、マラリア抗原は、Ag2とも呼ばれ、かつ、高度に保存されたプラスモジウム抗原であるCelTOSであってもよい。別の実施形態において、マラリア抗原は、高度に保存されたプラスモジウム抗原であるAma1であってもよい。いくつかの実施形態において、マラリア抗原は、CS抗原であってもよい。
他の実施形態において、マラリア抗原は、本明細書に記載のPFタンパク質の2つ以上の組み合わせを含む融合タンパク質であってもよい。例えば、融合タンパク質は、互いに隣接して直接結合しているか、スペーサーと結合しているか、あるいは、1つ以上のアミノ酸の間で結合しているCS免疫原、ConLSA1免疫原、ConTRAP免疫原、ConCelTOS免疫原、およびConAma1免疫原の2つ以上を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、2つのPF免疫原を含み、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、3つのPF免疫原を含み、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、4つのPF免疫原を含み、いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、5つのPF免疫原を含む。2つのPF免疫原を持つ融合タンパク質は、CSおよびLSA1;CSおよびTRAP;CSおよびCelTOS;CSおよびAma1;LSA1およびTRAP;LSA1およびCelTOS;LSA1およびAma1;TRAPおよびCelTOS;TRAPおよびAma1;または、CelTOSおよびAma1を含んでいてもよい。3つのPF免疫原を持つ融合タンパク質は、CS、LSA1、およびTRAP;CS、LSA1、およびCelTOS;CS、LSA1、およびAma1;LSA1、TRAP、およびCelTOS;LSA1、TRAP、およびAma1;または、TRAP、CelTOS、およびAma1を含んでいてもよい。4つのPF免疫原を持つ融合タンパク質は、CS、LSA1、TRAP、およびCelTOS;CS、LSA1、TRAP、およびAma1;CS、LSA1、CelTOS、およびAma1;CS、TRAP、CelTOS、およびAma1;または、LSA1、TRAP、CelTOS、およびAma1を含んでいてもよい。5つのPF免疫原を持つ融合タンパク質は、CSまたはCS-alt、LSA1、TRAP、CelTOS、およびAma1を含んでいてもよい。
(4)真菌抗原
外来抗原は、真菌抗原またはその断片あるいはその変異体であってもよい。真菌は、アスペルギルス種、ブラストミセス・デルマチチジス、カンジダ属酵母(例えば、カンジダ・アルビカンス)、コクシジオイデス、クリプトコックス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・ガッティ、皮膚糸状菌、フザリウム属種、ヒストプラスマ‐カプスラーツム、ケカビ亜門、ニューモシスチス・イロベチ、スポロトリックス‐シェンキィ、エクセロヒルム、またはクラドスポリウムであってもよい。
外来抗原は、真菌抗原またはその断片あるいはその変異体であってもよい。真菌は、アスペルギルス種、ブラストミセス・デルマチチジス、カンジダ属酵母(例えば、カンジダ・アルビカンス)、コクシジオイデス、クリプトコックス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・ガッティ、皮膚糸状菌、フザリウム属種、ヒストプラスマ‐カプスラーツム、ケカビ亜門、ニューモシスチス・イロベチ、スポロトリックス‐シェンキィ、エクセロヒルム、またはクラドスポリウムであってもよい。
b.自己抗原
いくつかの実施形態において、抗原は、自己抗原である。自己抗原は、免疫応答を刺激することが可能な対象自身の体の構成要素であってもよい。いくつかの実施形態において、自己抗原は、対象が疾患状態、例えば、自己免疫疾患でなければ、免疫応答を誘発しない。
いくつかの実施形態において、抗原は、自己抗原である。自己抗原は、免疫応答を刺激することが可能な対象自身の体の構成要素であってもよい。いくつかの実施形態において、自己抗原は、対象が疾患状態、例えば、自己免疫疾患でなければ、免疫応答を誘発しない。
自己抗原としては、サイトカイン、HIVおよびデング熱を含む上に列挙したウイルスに対する抗体、癌の進行または発生に影響を及ぼす抗原、細胞表面受容体、または膜貫通タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
(1)WT-1
自己抗原は、ウィルムス腫瘍抑制遺伝子1(WT1)、その断片、その変異体、またはその組み合わせであってもよい。WT1は、プロリン/グルタミンリッチDNA-結合領域をN-末端に、かつ、4つの亜鉛フィンガーモチーフをC-末端に含む転写因子である。WT1は、泌尿生殖器系の正常な発達に関与しており、多くの因子、例えば、腫瘍抑制因子として知られるp53、および細胞毒性薬による治療後に多数の部位でWT1を切断するセリンプロテアーゼHtrA2と相互作用する。WT1の突然変異により、腫瘍または癌形成、例えば、WT1を発現するウィルムス腫瘍または腫瘍がもたらされる。
自己抗原は、ウィルムス腫瘍抑制遺伝子1(WT1)、その断片、その変異体、またはその組み合わせであってもよい。WT1は、プロリン/グルタミンリッチDNA-結合領域をN-末端に、かつ、4つの亜鉛フィンガーモチーフをC-末端に含む転写因子である。WT1は、泌尿生殖器系の正常な発達に関与しており、多くの因子、例えば、腫瘍抑制因子として知られるp53、および細胞毒性薬による治療後に多数の部位でWT1を切断するセリンプロテアーゼHtrA2と相互作用する。WT1の突然変異により、腫瘍または癌形成、例えば、WT1を発現するウィルムス腫瘍または腫瘍がもたらされる。
(2)EGFR
自己抗原は、上皮成長増殖因子受容体(EGFR)、またはその断片あるいはその変異体を含んでいてもよい。EGFR(ErbB-1およびHER1とも呼ばれる)は、細胞外タンパク質リガンドの上皮細胞増殖因子ファミリー(EGFファミリー)メンバーの細胞表面受容体である。EGFRは、受容体のErbBファミリーメンバーであり、4つの密接に関連した受容体チロシン・キナーゼであるEGFR(ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、およびHer4(ErbB-4)を含む。EGFR発現または活性に影響を及ぼす突然変異は癌になり得る。
自己抗原は、上皮成長増殖因子受容体(EGFR)、またはその断片あるいはその変異体を含んでいてもよい。EGFR(ErbB-1およびHER1とも呼ばれる)は、細胞外タンパク質リガンドの上皮細胞増殖因子ファミリー(EGFファミリー)メンバーの細胞表面受容体である。EGFRは、受容体のErbBファミリーメンバーであり、4つの密接に関連した受容体チロシン・キナーゼであるEGFR(ErbB-1)、HER2/c-neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、およびHer4(ErbB-4)を含む。EGFR発現または活性に影響を及ぼす突然変異は癌になり得る。
抗原は、ErbB-2抗原を含んでいてもよい。Erb-2(ヒト上皮成長増殖因子受容体2)は、Neu、HER2、CD340(分化340のクラスター)、またはp185としても知られ、ERBB2遺伝子によってコードされる。この遺伝子の増幅または過剰発現が、ある侵攻性の乳癌の発生および進行に役割を果たすことが実証されている。乳癌の女性の約25~30%において、ERBB2遺伝子で遺伝子変化が起きており、腫瘍細胞の表面上でHER2の産生量が増している。HER2の過剰発現により急速な細胞分裂が促進されるため、HER2は腫瘍細胞をマークする。
HER2に特異的な合成抗体は、配列番号40の核酸配列によってコードされる配列番号41のアミノ酸配列および配列番号42の核酸配列によってコードされる配列番号43のアミノ酸配列を含むFab断片を含んでいてもよい。
(3)コカイン
自己抗原は、コカイン受容体抗原であってもよい。コカイン受容体は、ドーパミン輸送体を含む。
自己抗原は、コカイン受容体抗原であってもよい。コカイン受容体は、ドーパミン輸送体を含む。
(4)PD-1
自己抗原は、プログラム死1(PD-1)を含んでいてもよい。プログラム死1(PD-1)およびそのリガンドであるPD-L1およびPD-L2は、T細胞活性化、耐性、および免疫病理学間のバランスを調節する抑制シグナルを送達する。PD-1は、膜貫通領域および細胞内尾部に続く細胞外IgV領域を含む288アミノ酸細胞表面タンパク質分子である。
自己抗原は、プログラム死1(PD-1)を含んでいてもよい。プログラム死1(PD-1)およびそのリガンドであるPD-L1およびPD-L2は、T細胞活性化、耐性、および免疫病理学間のバランスを調節する抑制シグナルを送達する。PD-1は、膜貫通領域および細胞内尾部に続く細胞外IgV領域を含む288アミノ酸細胞表面タンパク質分子である。
(5)4-1BB
自己抗原は、4-1BBリガンドを含んでいてもよい。4-1BBリガンドは、TNF上科に属する2型の膜貫通糖タンパク質である。4-1BBリガンドは、活性化Tリンパ球上で発現されてもよい。4-1BBは、活性化誘発性T細胞共刺激分子である。4-1BB経由のシグナル伝達により、生存遺伝子が上方制御され、細胞分裂が高められ、サイトカイン産生が誘発され、T細胞の活性化誘発性細胞死が防止される。
自己抗原は、4-1BBリガンドを含んでいてもよい。4-1BBリガンドは、TNF上科に属する2型の膜貫通糖タンパク質である。4-1BBリガンドは、活性化Tリンパ球上で発現されてもよい。4-1BBは、活性化誘発性T細胞共刺激分子である。4-1BB経由のシグナル伝達により、生存遺伝子が上方制御され、細胞分裂が高められ、サイトカイン産生が誘発され、T細胞の活性化誘発性細胞死が防止される。
(6)CTLA4
自己抗原は、CD152(分化152のクラスター)としても知られるCTLA-4(細胞毒性Tリンパ球抗原4)を含んでいてもよい。CTLA-4は、T細胞の表面上に見られるタンパク質受容体であり、抗原への細胞性免疫攻撃をもたらす。抗原は、細胞外V領域、膜貫通領域、細胞質尾部、またはその組み合わせなどのCTLA-4の断片であってもよい。
自己抗原は、CD152(分化152のクラスター)としても知られるCTLA-4(細胞毒性Tリンパ球抗原4)を含んでいてもよい。CTLA-4は、T細胞の表面上に見られるタンパク質受容体であり、抗原への細胞性免疫攻撃をもたらす。抗原は、細胞外V領域、膜貫通領域、細胞質尾部、またはその組み合わせなどのCTLA-4の断片であってもよい。
(7)IL-6
自己抗原は、インターロイキン6(IL-6)を含んでいてもよい。IL-6は、限定されないが、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、鬱病、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、多発性骨髄腫、癌、ベーチェット病、および関節リウマチを含む多くの疾患において炎症および自己免疫プロセスを刺激する。
自己抗原は、インターロイキン6(IL-6)を含んでいてもよい。IL-6は、限定されないが、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、鬱病、アルツハイマー病、全身性エリテマトーデス、多発性骨髄腫、癌、ベーチェット病、および関節リウマチを含む多くの疾患において炎症および自己免疫プロセスを刺激する。
(8)MCP-1
自己抗原は、単球走化性タンパク質-1(MCP-1)を含んでいてもよい。MCP-1は、ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド2(CCL2)または小誘導性サイトカインA2とも呼ばれる。MCP-1は、CCケモカインファミリーに属するサイトカインである。MCP-1は、組織傷害または感染のいずれかによって産生された炎症部位に、単球、記憶T細胞、および樹枝状細胞を補充する。
自己抗原は、単球走化性タンパク質-1(MCP-1)を含んでいてもよい。MCP-1は、ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド2(CCL2)または小誘導性サイトカインA2とも呼ばれる。MCP-1は、CCケモカインファミリーに属するサイトカインである。MCP-1は、組織傷害または感染のいずれかによって産生された炎症部位に、単球、記憶T細胞、および樹枝状細胞を補充する。
(9)アミロイドベータ
自己抗原は、アミロイドベータ(Aβ)またはその断片あるいはその変異体を含んでいてもよい。Aβ抗原は、Aβ(X-Y)ペプチドを含み、XおよびY両方を含むヒト配列Aβタンパク質のアミノ酸位置Xからアミノ酸位置Yのアミノ酸配列であり、特に、アミノ酸配列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVI(アミノ酸位置1~47に対応;ヒトクエリ配列)のアミノ酸位置Xからアミノ酸位置Yのアミノ酸配列またはその変異体である。Aβ抗原は、Aβ(X-Y)ポリペプチドのAβポリペプチドを含んでいてもよく、Xは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、または32であってもよく、Yは、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、または15であってもよい。Aβポリペプチドは、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、少なくとも40、少なくとも41、少なくとも42、少なくとも43、少なくとも44、少なくとも45、または少なくとも46アミノ酸である断片を含んでいてもよい。
自己抗原は、アミロイドベータ(Aβ)またはその断片あるいはその変異体を含んでいてもよい。Aβ抗原は、Aβ(X-Y)ペプチドを含み、XおよびY両方を含むヒト配列Aβタンパク質のアミノ酸位置Xからアミノ酸位置Yのアミノ酸配列であり、特に、アミノ酸配列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVI(アミノ酸位置1~47に対応;ヒトクエリ配列)のアミノ酸位置Xからアミノ酸位置Yのアミノ酸配列またはその変異体である。Aβ抗原は、Aβ(X-Y)ポリペプチドのAβポリペプチドを含んでいてもよく、Xは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、または32であってもよく、Yは、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、または15であってもよい。Aβポリペプチドは、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも35、少なくとも36、少なくとも37、少なくとも38、少なくとも39、少なくとも40、少なくとも41、少なくとも42、少なくとも43、少なくとも44、少なくとも45、または少なくとも46アミノ酸である断片を含んでいてもよい。
(10)IP-10
自己抗原は、インターフェロン(IFN)ガンマ誘発タンパク質10(IP-10)を含んでいてもよい。IP-10は、小誘導性サイトカインB10またはC-X-Cモチーフケモカイン10(CXCL10)としても知られる。CXCL10は、IFN-γに応答して、単球、内皮細胞、および線維芽細胞などのいくつかの細胞型から分泌される。
自己抗原は、インターフェロン(IFN)ガンマ誘発タンパク質10(IP-10)を含んでいてもよい。IP-10は、小誘導性サイトカインB10またはC-X-Cモチーフケモカイン10(CXCL10)としても知られる。CXCL10は、IFN-γに応答して、単球、内皮細胞、および線維芽細胞などのいくつかの細胞型から分泌される。
(11)PSMA
自己抗原は、前立腺特異的膜抗原(PSMA)を含んでいてもよい。PSMAは、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII(GCPII)、N-アセチル-L-アスパルチル-L-グルタミン酸ペプチダーゼI(NAALADase I)、NAAGペプチダーゼ、または葉酸加水分解酵素(FOLH)としても知られる。PMSAは、前立腺癌細胞によって高発現される内在性膜タンパク質である。
自己抗原は、前立腺特異的膜抗原(PSMA)を含んでいてもよい。PSMAは、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼII(GCPII)、N-アセチル-L-アスパルチル-L-グルタミン酸ペプチダーゼI(NAALADase I)、NAAGペプチダーゼ、または葉酸加水分解酵素(FOLH)としても知られる。PMSAは、前立腺癌細胞によって高発現される内在性膜タンパク質である。
c.他の抗原
いくつかの実施形態において、抗原は、外来抗原および/または自己抗原以外の抗原である。
いくつかの実施形態において、抗原は、外来抗原および/または自己抗原以外の抗原である。
(a)HIV-1 VRC01
他の抗原は、HIV-1 VRC01であってもよい。HIV-1 VCR01は、HIVの中和CD4結合部位抗体である。HIV-1 VCR01は、HIV-1のgp120ループD、CD4結合ループ、およびV5領域内をはじめとするHIV-1の一部分と接触する。
他の抗原は、HIV-1 VRC01であってもよい。HIV-1 VCR01は、HIVの中和CD4結合部位抗体である。HIV-1 VCR01は、HIV-1のgp120ループD、CD4結合ループ、およびV5領域内をはじめとするHIV-1の一部分と接触する。
(b)HIV-1 PG9
他の抗原は、HIV-1 PG9であってもよい。HIV-1 PG9は、HIV(HIV-1)エンベロープ(Env)糖タンパク質(gp)三量体に優先的に結合し、かつ、ウイルスを広く中和するグリカン依存ヒト抗体の拡大ファミリーの創立メンバーである。
他の抗原は、HIV-1 PG9であってもよい。HIV-1 PG9は、HIV(HIV-1)エンベロープ(Env)糖タンパク質(gp)三量体に優先的に結合し、かつ、ウイルスを広く中和するグリカン依存ヒト抗体の拡大ファミリーの創立メンバーである。
(c)HIV-1 4E10
他の抗原は、HIV-1 4E10であってもよい。HIV-1 4E10は、中和抗HIV抗体である。HIV-1 4E10は、HIV-1の膜近接外部領域(MPER)にマップした線状エピトープに対するものであり、gp41細胞外ドメインのC末端に位置する。
他の抗原は、HIV-1 4E10であってもよい。HIV-1 4E10は、中和抗HIV抗体である。HIV-1 4E10は、HIV-1の膜近接外部領域(MPER)にマップした線状エピトープに対するものであり、gp41細胞外ドメインのC末端に位置する。
(d)DV-SF1
他の抗原は、DV-SF1であってもよい。DV-SF1は、4つのデングウイルス血清型のエンベロープタンパク質に結合する中和抗体である。
他の抗原は、DV-SF1であってもよい。DV-SF1は、4つのデングウイルス血清型のエンベロープタンパク質に結合する中和抗体である。
(e)DV-SF2
他の抗原は、DV-SF2であってもよい。DV-SF2は、デングウイルスのエピトープに結合する中和抗体である。DV-SF2は、DENV4血清型に特異的であり得る。
他の抗原は、DV-SF2であってもよい。DV-SF2は、デングウイルスのエピトープに結合する中和抗体である。DV-SF2は、DENV4血清型に特異的であり得る。
(f)DV-SF3
他の抗原は、DV-SF3であってもよい。DV-SF3は、デングウイルスエンベロープタンパク質のEDIII A鎖に結合する中和抗体である。
他の抗原は、DV-SF3であってもよい。DV-SF3は、デングウイルスエンベロープタンパク質のEDIII A鎖に結合する中和抗体である。
6.組成物の賦形剤および他の成分
組成物は、薬学的に許容しうる賦形剤をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容しうる賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤としての機能的分子であり得る。薬学的に許容しうる賦形剤は、界面活性剤を含みうるトランスフェクション促進剤、例えば免疫刺激複合体(ISCOMS)、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質AをはじめとするLPS類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤であり得る。
組成物は、薬学的に許容しうる賦形剤をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容しうる賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤としての機能的分子であり得る。薬学的に許容しうる賦形剤は、界面活性剤を含みうるトランスフェクション促進剤、例えば免疫刺激複合体(ISCOMS)、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質AをはじめとするLPS類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤であり得る。
トランスフェクション促進剤は、ポリ-L-グルタマート(LGS)をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ-L-グルタマートであり、ポリ-L-グルタマートは、6mg/ml未満の濃度で組成物中に存在してもよい。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体(ISCOMS)、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質AをはじめとするLPS類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞を含んでいてもよく、ヒアルロン酸を用いて、組成物と一体化させて投与してもよい。組成物は、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームまたはDNAリポソーム混合物(例えば、WO09324640参照)などの当該技術分野で公知の他のリポソームをはじめとするリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知トランスフェクション促進剤を含んでいてもよい。トランスフェクション促進剤は、ポリ-L-グルタマート(LGS)をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、4mg/ml未満、2mg/ml未満、1mg/ml未満、0.750mg/ml未満、0.500mg/ml未満、0.250mg/ml未満、0.100mg/ml未満、0.050mg/ml未満、または0.010mg/ml未満である。
組成物は、1994年4月1日出願の米国特許出願第021,579号に記載された遺伝子促進剤をさらに含んでいてもよく、参照により完全に組み入れられる。
組成物は、DNAを約1ナノグラム~約100ミリグラム;約1マイクログラム~約10ミリグラム;好ましくは約0.1マイクログラム~約10ミリグラム;さらに好ましくは約1ミリグラム~約2ミリグラムの量で含んでいてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、本発明による組成物は、DNAを約5ナノグラム~約1000マイクログラム含む。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、DNAを約10ナノグラム~約800マイクログラム含んでいてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、DNAを約0.1~約500マイクログラム含んでいてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、DNAを約1~約350マイクログラム含んでいてもよい。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、DNAを約25~約250マイクログラム、約100~約200マイクログラム、約1ナノグラム~100ミリグラム;約1マイクログラム~約10ミリグラム;約0.1マイクログラム~約10ミリグラム;約1ミリグラム~約2ミリグラム、約5ナノグラム~約1000マイクログラム、約10ナノグラム~約800マイクログラム、約0.1~約500マイクログラム、約1~約350マイクログラム、約25~約250マイクログラム、約100~約200マイクログラム含んでいてもよい。
組成物は、用いられる投与様式に従って配合してもよい。注射可能な医薬組成物は、滅菌されたパイロジェンフリーおよび微粒子フリーであってもよい。等張性配合剤または溶液が用いられてもよい。等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。組成物は、血管収縮剤を含んでいてもよい。等張性溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含んでいてもよい。組成物は、ゼラチンおよびアルブミンをはじめとする安定化剤をさらに含んでいてもよい。LGSまたはポリカチオンまたはポリアニオンなどの安定剤により、配合剤を室温または周囲温度で長時間安定にさせることができる。
7.合成抗体の生成方法
また、本発明は、合成抗体の生成方法に関する。本方法は、組成物を、以下により詳細に記載の送達方法を用いてそれを必要とする対象に投与することを含んでいてもよい。従って、合成抗体は、組成物を対象に投与した際に、対象内もしくはin vivoで生成される。
また、本発明は、合成抗体の生成方法に関する。本方法は、組成物を、以下により詳細に記載の送達方法を用いてそれを必要とする対象に投与することを含んでいてもよい。従って、合成抗体は、組成物を対象に投与した際に、対象内もしくはin vivoで生成される。
本方法は、組成物を1つ以上の細胞中に導入することも含んでいてもよい。従って、合成抗体は、1つ以上の細胞中で生成もしくは産生されてもよい。本方法は、組成物を、1つ以上の組織、例えば、限定されないが、皮膚および筋肉中に導入することをさらに含んでもよい。従って、合成抗体は、1つ以上の組織中で生成もしくは産生されてもよい。
8.抗体の特定方法またはスクリーニング方法
さらに、本発明は、上述の抗原に反応するかもしくは結合する上述の抗体の特定方法またはスクリーニング方法に関する。抗体を特定またはスクリーニングする本方法を当業者に公知の方法論で抗原に用いて、抗体を特定またはスクリーニングすることができる。かかる手法としては、ライブラリ(例えば、ファージディスプレイ)からの抗体の選択、動物の免疫化、続いて、抗体の単離および/または精製が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Rajan,S.とSidhu,S.、酵素学における方法(Methods in Enzymology)、502巻、1章「簡易化された合成抗体ライブラリ(Simplified Synthetic Antibody Libraries)(2012)」に記載の方法を参照されたい。その内容は、全体として本明細書に組み入れられる。
さらに、本発明は、上述の抗原に反応するかもしくは結合する上述の抗体の特定方法またはスクリーニング方法に関する。抗体を特定またはスクリーニングする本方法を当業者に公知の方法論で抗原に用いて、抗体を特定またはスクリーニングすることができる。かかる手法としては、ライブラリ(例えば、ファージディスプレイ)からの抗体の選択、動物の免疫化、続いて、抗体の単離および/または精製が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Rajan,S.とSidhu,S.、酵素学における方法(Methods in Enzymology)、502巻、1章「簡易化された合成抗体ライブラリ(Simplified Synthetic Antibody Libraries)(2012)」に記載の方法を参照されたい。その内容は、全体として本明細書に組み入れられる。
9.組成物の送達方法
また、本発明は、組成物をそれを必要とする対象に送達する方法に関する。送達方法は、組成物を対象に投与することを含んでいてもよい。投与としては、in vivo電気穿孔付きおよび無しのDNA注射、リポソーム介在送達、およびナノ粒子促進送達が挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明は、組成物をそれを必要とする対象に送達する方法に関する。送達方法は、組成物を対象に投与することを含んでいてもよい。投与としては、in vivo電気穿孔付きおよび無しのDNA注射、リポソーム介在送達、およびナノ粒子促進送達が挙げられるが、これらに限定されない。
組成物の送達を受ける哺乳動物は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、ウシ、畜牛、ヒツジ、ヤギ、レイヨウ、バイソン、水牛、バイソン、ウシ属、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、およびニワトリであってもよい。
組成物を、経口、非経口、舌下、経皮、経直腸、経粘膜、局所、吸入、口腔投与、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻内、髄腔内、および関節内、またはそれらの組み合わせをはじめとする異なる経路で投与してもよい。獣医学的使用では、通常の獣医学的実践に従い、組成物を適切に許容しうる配合剤として投与してもよい。獣医は、特定の動物に最も適した投与レジメンおよび投与経路を、容易に決定することができる。組成物を、伝統的なシリンジ、針なし注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または他の物理的方法、例えば電気穿孔法(EP)、「水力学的方法」、または超音波により投与してもよい。
a.電気穿孔
電気穿孔による組成物の投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成させるのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することができる電気穿孔装置を用いて達成され得、好ましくは、エネルギーパルスは、ユーザーにより入力されたプリセット電流に近い定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含んでいてもよい。電気穿孔構成要素は、制御器、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、ステータス報告要素、コミュニケーションポート、メモリー成分、電源、および電源スイッチをはじめとする電気穿孔装置の1種以上の様々な要素を含み、それらを組み込んでいてもよい。電気穿孔は、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易化するin vivo電気穿孔装置、例えばCELLECTRA(登録商標) EPシステム(VGXファーマシューティカルズ社製、ペンシルベニア州ブルーベル)またはElgenエレクトロポレーター(ジェネトロニクス社(Genetronics)製、カリフォルニア州サンディエゴ)を用いて達成され得る。
電気穿孔による組成物の投与は、細胞膜に可逆的な孔を形成させるのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することができる電気穿孔装置を用いて達成され得、好ましくは、エネルギーパルスは、ユーザーにより入力されたプリセット電流に近い定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含んでいてもよい。電気穿孔構成要素は、制御器、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、ステータス報告要素、コミュニケーションポート、メモリー成分、電源、および電源スイッチをはじめとする電気穿孔装置の1種以上の様々な要素を含み、それらを組み込んでいてもよい。電気穿孔は、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易化するin vivo電気穿孔装置、例えばCELLECTRA(登録商標) EPシステム(VGXファーマシューティカルズ社製、ペンシルベニア州ブルーベル)またはElgenエレクトロポレーター(ジェネトロニクス社(Genetronics)製、カリフォルニア州サンディエゴ)を用いて達成され得る。
電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の一要素として機能してもよく、他の要素は、電気穿孔構成要素と連通する別々の要素(または構成要素)である。電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の1つを超える要素として機能してもよく、それが電気穿孔構成要素とは別々の電気穿孔装置の他の要素とも連通していてもよい。1つの電気機械的または機械的装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素は、その要素が1つの装置として、または互いに連通する別々の要素として機能しうるように限定しなくてもよい。電気穿孔構成要素は、所望の組織内で定電流を生成するエネルギーパルスを送達することができてもよく、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、空間的配置内に複数の電極を有する電極アレイを含んでいてもよく、電極アセンブリは、電気穿孔構成要素からエネルギーパルスを受け、電極を介して所望の組織にそれを送達する。複数の電極のうちの少なくとも1つは、エネルギーパルスの送達時にはニュートラルであり、所望の組織中のインピーダンスを測定して、そのインピーダンスを電気穿孔構成要素に連通する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受けてもよく、電気穿孔構成要素により送達されたエネルギーパルスを調整して定電流を維持することができる。
複数の電極が、分散パターンでエネルギーパルスを送達してもよい。複数の電極は、プログラムされたシーケンス下の電極制御を介して、分散パターンでエネルギーパルスを送達してもよく、プログラムされたシーケンスは、ユーザーにより電気穿孔構成要素に入力される。プログラムされたシーケンスは、順に送達された複数のパルスを含んでいてもよく、複数のパルスの各パルスが、インピーダンスを測定する1つのニュートラル電極を含む少なくとも2つの活性電極により送達され、複数のパルスの次のパルスが、インピーダンスを測定する1つのニュートラル電極を含む少なくとも2つの活性電極の異なる1つにより送達される。
フィードバック機構は、ハードウエアまたはソフトウエアのいずれかにより実施してもよい。フィードバック機構は、アナログ閉回路により実施してもよい。フィードバックは、50μs、20μs、10μsまたは1μsごとに起こるが、好ましくは実時間フィードバックまたは瞬時(すなわち、応答時間を決定するための入手可能な技術により決定すると実質的に瞬時)である。ニュートラル電極で所望の組織中のインピーダンスを測定してもよく、そのインピーダンスをフィードバック機構に連通し、フィードバック機構がインピーダンスに応答してエネルギーパルスを調整し、プリセット電流と類似の値の定電流を維持する。フィードバック機構は、エネルギーパルスの送達時に定電流を連続および瞬時的に維持してもよい。
本発明の組成物の送達を促進しうる電気穿孔装置および電気穿孔法の例としては、内容が全体として参照により本明細書に組み入れられた、Draghia-Akliらによる米国特許第7,245,963号、Smithらにより提出された米国特許公開第2005/0052630号に記載されたそれらのものが挙げられる。組成物の送達を促進するのに用いられうる他の電気穿孔装置および電気穿孔法としては、その全てが全体として参照により本明細書に組み入れられた、2006年10月17日出願の米国特許仮出願第60/852,149号および2007年10月10日出願の同第60/978,982号に対して35USC 119(e)による利益を主張する、2007年10月17日出願の同時係属中および共有の米国特許出願第11/874072号に提供されたものが挙げられる。
Draghia-Akliらによる米国特許第7,245,963号には、体内または植物内の選択された組織の細胞中への生体分子の導入を促進するためのモジュラー電極システムおよびその使用が記載されている。モジュラー電極システムは、複数の針電極;皮下注射針;プログラム可能な定電流パルス制御器から複数の針電極への導電的連結を提供する電気コネクター;および電源を含んでいてもよい。オペレータが、支持構造上に搭載された複数の針電極を掴み、体内または植物内の選択された組織にそれらをしっかりと挿入することができる。その後、皮下注射針を介して、生体分子を選択された組織へ送達する。プログラム可能な定電流パルス制御器を活性化して、定電流の電気パルスを複数の針電極に印加する。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間での細胞への生体分子導入を促進する。米国特許第7,245,963号の全体的内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
Smithらにより提出された米国特許公開第2005/0052630号には、体内または植物内の選択された組織の細胞中への生体分子導入を効果的に促進するために用いられうる電気穿孔装置が記載されている。該電気穿孔装置は、操作がソフトウエアまたはファームウエアに特定される電気運動装置(「EKD装置」)を含む。EKD装置は、ユーザ制御に基づく一列の電極とパルスパラメータ入力との間で一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存および取得を可能にする。電気穿孔装置は、針電極、注射針用の中央注入チャネル、および取り外し可能なガイドディスクのアレイを有する交換可能な電極ディスクも含む。米国特許公開第2005/0052630号の全体的内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
米国特許第7,245,963号および米国特許公開第2005/0052630号に記載された電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく、他の組織または臓器にも深く浸透させるように適合され得る。電極アレイの形態によって、注射針(選択された生体分子を送達する)が、ターゲット臓器にも完全に挿入され、電極によってあらかじめ描かれた領域のターゲット組織に垂直に注射投与される。米国特許第7,245,963号および米国特許公開第2005/005263号に記載された電極は、好ましくは20mm長および21ゲージである。
加えて、電気穿孔装置およびその使用を組み込んだいくつかの実施形態で予期される通り、以下の特許:1993年12月28日発行の米国特許第5,273,525号、2000年8月29日発行の米国特許第6,110,161号、2001年7月17日発行の同第6,261,281号、2005年10月25日発行の同第6,958,060号、および2005年9月6日発行の米国特許第6,939,862号に記載された電気穿孔装置が存在する。さらに、様々な装置のいずれかを用いたDNAの送達に関係する2004年2月24日発行の米国特許第6,697,669号、およびDNA注入の方法が注目された2008年2月5日発行の米国特許第7,328,064号に提供された主題を含む特許が、本明細書で企図される。先の特許は、全体として参照により組み入れられる。
10.治療方法
また、本明細書で提供されるのは、合成抗体を対象内で生成することで、疾患に対する治療、防御、および/または予防を、それを必要とする対象において行う方法である。本方法は、組成物を対象に投与することを含んでいてもよい。対象への組成物の投与は、上述の送達方法を用いて行うことができる。
また、本明細書で提供されるのは、合成抗体を対象内で生成することで、疾患に対する治療、防御、および/または予防を、それを必要とする対象において行う方法である。本方法は、組成物を対象に投与することを含んでいてもよい。対象への組成物の投与は、上述の送達方法を用いて行うことができる。
対象内で合成抗体を生成する際、合成抗体は、抗原に結合するかもしくは抗原と反応することができる。かかる結合により、抗原を中和し、別の分子、例えば、タンパク質または核酸による抗原の認識をブロックし、抗原への免疫応答を引き起こすかまたは誘発することにより、対象内の抗原と関連する疾患を治療、防御、および/または予防することができる。
組成物の用量は、1μg~10mg有効成分/kg体重/時間であってもよく、20μg~10mg有効成分/kg体重/時間であってもよい。組成物は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、または31日おきに投与することができる。効果的な治療のための組成物の投与回数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であってもよい。
治療の一方法において、合成抗体またはその機能的断片を、ウイルスまたは細菌の感染、あるいは癌性細胞に対して治療を必要としている対象に投与することができる。本明細書に記載の合成抗体を投与することにより、in vivo発現時に、体の罹患部位に機能的抗体が急速に存在することができ、かつ、標的に中和反応を起こすことができる機能的抗体をもたらすことができる(結合するように設計されており、中和することが好ましい)。急速に存在することは、かなり急速に進む疾患病状および/または既存の記憶免疫を持たない個体において重要である。感染している対象に対して急速な中和が重要となるいくつかの特定のケースは、デング熱、チクングンヤ熱、およびエボラなどの熱帯病においてである。かかる感染においては、ウイルスに感染した瞬間から急速な中和を要する。実施例5、図6Aおよび図6Bは、上記方法で生成された発現構築物を用いた抗体の急速な生成を示す。図6Aは、プラスミドDNA構築物の投与後1日内に抗体が発現されることを示し;図6Bは、タンパク質/抗原の投与から抗体発現までに約8日要したことを示す。
この治療方法は、単独でもよいし、標的に対する宿主免疫応答を対象に生成させ得る抗原の通常のワクチン接種と組み合わせてもよい。ワクチンを組み合わせることにより、意図した標的に対して2段階の免疫応答がもたらされる利益がある:1)合成抗体をコードするヌクレオチド配列およびその機能的断片によってもたらされる第1の急速な応答と、2)従来のワクチン(DNAワクチンまたは合成免疫原を含んでいてもよい)によって引き起こされ、宿主が標的に対して自身の免疫応答を起こすことができるまで遅れ時間がある第2の宿主免疫応答とである。
本発明は、以下の非限定的な実施例によって示される多くの態様を有する。
以下に実施例を用いて本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、説明のためだけに記載されるものと理解されるべきである。上記の説明及びこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の必須の特徴を確認することができ、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の用途及び条件に適合させるために本発明の種々の変更例及び改変例を作ることができる。したがって、本明細書中に示され説明されているものに加え、本発明の種々の改変例が上記の説明から当業者には明らかであろう。そのような改変例も特許請求の範囲に含まれることが意図される。
実施例1
in vivo免疫グロブリン(Ig)生成の高発現システムを構築した。具体的には、完全に組み立てられたIg分子のin vivo発現を改善するために、2つの重鎖ポリペプチドおよび2つの軽鎖ポリペプチドを含むIg重鎖および軽鎖配列を修飾した。gp120IgG-重鎖分子および軽鎖分子の構築物を作成し、pVAX1ベクター(ライフテクノロジーズ社、カリフォルニア州カールズバッド)に別々に挿入した。この抗体は、後述の特徴付け研究に用いることが可能な規定の特性を持つ。Ig発現を最適化する構築物を作成する際にいくつかの修飾を含んだ。最適化には、コドン最適化およびkozak配列(GCCACC)の導入を含んでいた。Igの重鎖および軽鎖について最適化された構築物の核酸配列は、配列番号6および配列番号7にそれぞれ記載されている(それぞれ図1および図2)。図1および図2において、下線および二重下線は、構築物をpVAX1ベクターにクローニングするのに用いたBamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGAG)制限酵素部位を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGATAA)コドンを示す。配列番号6は、配列番号46に記載のアミノ酸配列、すなわち、IgG重鎖のアミノ酸配列(図42)をコードする。配列番号7は、配列番号47に記載のアミノ酸配列、すなわち、IgG軽鎖のアミノ酸配列(図43)をコードする。
in vivo免疫グロブリン(Ig)生成の高発現システムを構築した。具体的には、完全に組み立てられたIg分子のin vivo発現を改善するために、2つの重鎖ポリペプチドおよび2つの軽鎖ポリペプチドを含むIg重鎖および軽鎖配列を修飾した。gp120IgG-重鎖分子および軽鎖分子の構築物を作成し、pVAX1ベクター(ライフテクノロジーズ社、カリフォルニア州カールズバッド)に別々に挿入した。この抗体は、後述の特徴付け研究に用いることが可能な規定の特性を持つ。Ig発現を最適化する構築物を作成する際にいくつかの修飾を含んだ。最適化には、コドン最適化およびkozak配列(GCCACC)の導入を含んでいた。Igの重鎖および軽鎖について最適化された構築物の核酸配列は、配列番号6および配列番号7にそれぞれ記載されている(それぞれ図1および図2)。図1および図2において、下線および二重下線は、構築物をpVAX1ベクターにクローニングするのに用いたBamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGAG)制限酵素部位を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGATAA)コドンを示す。配列番号6は、配列番号46に記載のアミノ酸配列、すなわち、IgG重鎖のアミノ酸配列(図42)をコードする。配列番号7は、配列番号47に記載のアミノ酸配列、すなわち、IgG軽鎖のアミノ酸配列(図43)をコードする。
天然Ig構築物(すなわち、非最適化)または配列番号6および7を含む構築物(すなわち、最適化)のいずれかで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後、トランスフェクト細胞からIgG分泌を測定した。IgG合成の動態を図3に示す。図3に示すように、非最適化構築物および最適化構築物の両方ともIgの重鎖および軽鎖を発現して、IgGを形成したが、最適化構築物の方がIgG抗体の蓄積をより早くもたらした。配列番号6および7(すなわち、最適化Ig配列)を含むプラスミドでトランスフェクトした細胞は、非最適化Ig配列を含むプラスミドでトランスフェクトした細胞よりも、完全に組み立てられたIg分子のより多い産生を示した。従って、構築物の最適化または修飾によりIg発現は実質的に増した。換言すれば、配列番号6および7を含む構築物は、配列番号6および7の作成に用いた最適化または修飾により、天然構築物と比較して顕著により高いIg発現をもたらした。Igの重鎖および軽鎖がプラスミドシステムからin vivoで効率よく組み立てられることもこれらのデータにより実証された。
配列番号6および7を含む構築物をさらに調べるため、配列番号6および7に記載の配列を含むプラスミドをマウスに投与した。特に、電気穿孔を用いてプラスミドを投与した。投与後、免疫化マウスで免疫応答(すなわち、IgGレベル)の誘導をウエスタンブロット法(すなわち、マウスの血清を用いてgp120抗原を検出した)により評価した。図4に示すように、配列番号6および7を含むプラスミドを投与されたマウスは、抗体の結合がウエスタンブロット分析で観察されたため、強い抗体産生を示した。この抗体産生を観察するために要した投与はたった1回であった。
要するに、Ig重鎖および軽鎖をコードする核酸配列が、pVAX1などの発現ベクターに含まれる場合、トランスフェクト細胞および発現ベクターを投与されたマウスで、組み立てられたIgG(すなわち、重鎖および軽鎖がまとまって、抗原に結合する抗体を形成する)の発現をもたらすことがこれらのデータにより示された。さらに、Ig重鎖および軽鎖をコードする核酸配列を最適化または修飾することでIg産生が著しく増大したこともこれらのデータにより示された。
実施例2
実施例3~7の材料および方法
細胞および試薬。293T細胞およびTZM-Bl細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)および抗生物質を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM;Gibco:インビトロジェン社製、カリフォルニア州)中で維持し、コンフルエンス時に継代させた。組み換えHIV-1 p24およびgp120 Env(rgp120)タンパク質をプロテインサイエンス社(Protein Science Inc.)から取得し、ペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジンをジャクソン研究所(Jackson Laboratory)から取得した。記載されている細胞株および他の試薬は、AIDS研究および参照用試薬プログラム(AIDS Research and Reference Reagent Program)、Division of AIDS、NIAID、NIHから入手した。
実施例3~7の材料および方法
細胞および試薬。293T細胞およびTZM-Bl細胞を、10%ウシ胎仔血清(FBS)および抗生物質を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM;Gibco:インビトロジェン社製、カリフォルニア州)中で維持し、コンフルエンス時に継代させた。組み換えHIV-1 p24およびgp120 Env(rgp120)タンパク質をプロテインサイエンス社(Protein Science Inc.)から取得し、ペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジンをジャクソン研究所(Jackson Laboratory)から取得した。記載されている細胞株および他の試薬は、AIDS研究および参照用試薬プログラム(AIDS Research and Reference Reagent Program)、Division of AIDS、NIAID、NIHから入手した。
動物、タンパク質、ならびにプラスミドの投与および送達。雌BALB/cマウス(8週齢)を、タコニックファームズ(Taconic Farms)(ニューヨーク州ジャーマンタウン)から購入した。これらの投与には、体積50μl(pVax1またはpHIV-1Env-Fab)中のプラスミドDNA25μgを筋肉内注射(IM)した後、MID-EPシステム(CELLECTRA(登録商標);イノビオ・ファーマシューティカルズ、ペンシルベニア州ブルーベル)によってEP介在の送達を増強した。送達用パルスパラメータは、0.5アンペア定電流の3パルスで、1秒おきで52ミリ秒の長さであった。各動物は、実験用プラスミド製剤または対照プラスミド製剤のいずれかの単回投与を受けた。JRFL株(Immune Technology Corp社から購入、ニューヨーク州)由来のHIV-1組み換えgp120(rgp120)をタンパク質免疫分析に用いた。タンパク質免疫研究では、rgp120の単回用量25μgをTiterMaxアジュバントと混合し、皮下注射した。pHIV-1 Env Fabまたはrgp120を投与されたマウスの血清を特定の分析に応じて異なる時点で回収した。
HIV-1Env-FabプラスミドDNAの構築。抗Env VRC01ヒトmAbからのHIV-1 Env-Fab配列(VHおよびVL)を、いくつかの修飾を持つ合成オリゴヌクレオチドを用いて生成した。重鎖(VH-CH1)は、配列番号3に記載の核酸配列によってコードされ、軽鎖(VL-CL)は、配列番号4に記載の核酸配列によってコードされる(それぞれ図9および図10)。図9および図10において、下線および二重下線は、コード化核酸配列をpVAX1にクローニングするのに用いたHindIII(AAGCTT)およびXhoI(CTCGAG)制限酵素部位を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGAまたはTAA)コドンを示す。配列番号3は、配列番号48に記載のアミノ酸配列、すなわち、HIV-1 Env-FabのVH-CH1のアミノ酸配列(図44)をコードする。配列番号4は、配列番号49に記載のアミノ酸配列、すなわち、HIV-1 Env-FabのVL-CLのアミノ酸配列(図45)をコードする。
発現を向上させるために、効率的なIgEリーダー配列(配列番号66タンパク質をコードする配列番号65ヌクレオチド)をEnv抗原遺伝子配列に組み込んだ。得られた修飾および強化されたHIV-1Env-Fab DNA免疫原は、コドンおよびRNA最適化され、GenScript(ニュージャージー州ピスカッタウェイ)によってpVax1発現ベクターにクローニングした後、これらの構築物を大規模に産生した。VHおよびVL遺伝子(それぞれ配列番号3および4)をBamH1およびXho1制限部位の間に挿入した。精製プラスミドDNAに水を配合した後、マウスに投与した。陰性対照プラスミドとして、「無関係な」対照Igを生成するpIgG-E1M2を用いた。
HIV-1Env-Fab発現および免疫ブロット分析。製造者によって推奨された方法によって、非リポソームFuGENE6トランスフェクション試薬(プロメガ、ウィスコンシン州)を用いた発現分析に293T細胞株を利用した。簡単に言えば、細胞を50~70%のコンフルエンス(35mm培養皿のウエル2mLあたり1~3x105細胞)で24時間播種した後、5μgのpVax1対照またはpHIV-1Env-Fabでトランスフェクションした。70時間までの様々な時点で上清を回収し、標準的なELISA法によって特異的Fab分子のレベルを評価した。pVax1トランスフェクト細胞からの上清を陰性対照として用いた。さらに、293T細胞をHIV gp160 Envタンパク質遺伝子でトランスフェクトした。
さらに、生成されたFabによる天然HIV-1 Envタンパク質の認識確認を免疫ブロット分析でを行った。この研究では、上述のrgp120を12%SDS-PAGE上で電気泳動を行った。ニトロセルロース膜(マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア)上でゲルをブロットし、PBS-T(0.05%)中で5%w/vの脱脂粉乳でブロックした。その後、ニトロセルロースを別々のストリップに切断して、分析した。pHIV-1 Env Fab投与されたマウスの血清を、投与から48時間後に回収し、PBS中で1:100に希釈し、個々のニトロセルロースストリップと1時間反応させた。その後、ストリップをトリス緩衝生理食塩水-0.2%ツイーンで4時間洗浄し、マウスIgG(ジャクソン研究所、メイン州)に対するペルオキシダーゼ結合抗血清と反応させ、ジアミノベンジジン基質(シグマ社、ミズーリ州セントルイス)とともに培養し、生成されたHIV-1 Env Fabのgp120への適正な結合を視覚化させた。
Ig結合分析-ELISA。Fabまたは抗rgp120抗体を生成したDNAプラスミドのrgp120への結合をELISAで評価した。pHIV-1 Env Fab、pVax1、またはrgp120タンパク質のいずれかを投与された個体動物の血清でIg結合アッセイを行った。ここでも、基本的なIg免疫測定分析において、DNAプラスミド単回投与から48時間後に血清サンプルを回収した。簡単に言えば、96ウェル高結合ポリスチレンプレート(ニューヨーク州コーニング)をクレードB HIV MN rgp120(2μg/mL)で一晩4℃でコーティングし、PBSで希釈した。翌日、プレートをPBS-T(PBS、0.05%ツイーン20)で洗浄し、PBS-T中の3%BSAで1時間ブロックし、免疫化マウスおよびナイーブマウスの血清の1:100希釈物とともに1時間37℃で培養した。1:5,000に希釈したヤギ抗マウスIgG-HRP(リサーチ・ダイアグノスティックス社、ニュージャージー州)を用いて結合IgGを検出した。色原体基質溶液TMB(R&D Systems)を添加して結合酵素を検出し、Biotek製EL312e Bio-Kinetics reader上で450nmで読んだ。全ての血清サンプルを2度重複して試験した。追加の免疫測定分析を行い、市販のIgG1定量ELISAキットを用いてpHIV-1 Env Fab投与されたマウスの血清中のFab濃度を定量化した。この分析は、製造者仕様に従って行った。
フローサイトメトリー分析(FACS)。フローサイトメトリー分析(FACS)では、コンセンサスクレードA Envプラスミド(pCon-Env-A)、または、一次ウイルス単離体(Q23Env17)からEnvを発現する最適化クレードAプラスミド(pOpt-Env-A)のいずれかで293T細胞をトランスフェクトした。標準的な方法によってトランスフェクションを行った。トランスフェクションを確認後、細胞を氷冷した緩衝液A(PBS/0.1%BSA/0.01%NaN3)で洗浄し、一次Ig(精製VRC01、または、pHIV-1 Env Fabまたは対照pIgG-E1M2プラスミドのいずれかを投与されたマウスの血清のいずれか、プラスミド投与から48時間後に回収)の1:100希釈物とともに20分間4℃で培養した。次いで、これを洗浄し、フィコエリトリン(PE)に共役した蛍光標識二次Igの1:100希釈物の50μlとともにさらに20分間培養した。その後、細胞を洗浄し、フローサイトメーター(FACS:ベクトン・ディッキンソン社製)で直ちに分析した。培養および洗浄は全て氷冷した緩衝液Aで4℃で行った。細胞をシングレットおよび生細胞にゲートした。GFPを評価するため、GFP陽性細胞の発現をCellQuestソフトウェア(BD Bioscience)を用いたFACS-LSR計器で行った。FlowJoソフトウェアでデータを分析した。
シングルサイクルHIV-1中和アッセイ。Fab介在HIV-1中和分析をTZM-BI(HeLa細胞由来)ベースアッセイで測定し、ここで、ルシフェラーゼ遺伝子発現の減少を中和の終点として用い、次いで実験用血清または対照血清の存在下または非存在下でEnv偽型ウイルスに1ラウンド感染させた。TZM-Bl細胞を操作して、CD4およびCCR5を発現させ、蛍ルシフェラーゼのレポーター遺伝子を含有させた。このアッセイでは、pVax1のみまたはpHIV-1Env Fab投与されたマウスの血清をウエルで1:50に希釈後、0.01の感染多重度(MOI)で、偽型HIV-1 Bal26、Q23Env17、SF162S、またはZM53M無細胞ウイルスを添加した。Bal26およびSF162Sは両方ともクレードB Tier1ウイルスであり、Tier1ステータスは、ウイルスの中和感度が高かったもしくは平均以上であったことを示す。Q23Env17およびZM53Mは、それぞれ、クレードAのTier1ウイルスおよびクレードCのTier2ウイルスである。Tier2ステータスは、ウイルスの中和感度が平均的もしくは中程度であったことを示す。次いで、このアッセイでは、104TZM-BL細胞を各ウエルに添加し、48時間培養し、溶解させ、Bright-Glo基質(ルシフェラーゼアッセイシステム、プロメガ、ウィスコンシン州)を100μl添加した後、ルミノメータを用いてルシフェラーゼを定量化した。このアッセイはRLU(相対発光量)で読み取った。RLU減少率は、(1-(実験用サンプルの平均RLU-対照)/対照からの平均RLU-非添加対照ウエル))x100として算出した。HIV-1中和はRLUの減少率(%)で表わし、これは、感染阻害率を示すものであった。
実施例3
抗HIV-1 Env-Fab発現構築物の生成
ヒトmAb VRC01を広く中和する抗HIV-1エンベロープのVHおよびVL-Ig(免疫グロブリン)鎖コード配列の両方のcDNAを、NIH AIDS Research and Reference Reagent Program経由でVRC(ワクチンリサーチセンター、NIH)から入手し、pVax1ベクターにクローニングした。上記の実施例2に示すように、生物活性のあるIg分子の産生を最大化および最適化するために、いくつかの修飾を発現ベクターに組み込んだ。すなわち、これらの修飾により、コドンおよびRNAの最適化および安定化がもたらされ、リーダー配列の活用が増強され、プラスミドが高濃度で産生され、EP経由でin vivoプラスミド送達が促進された。生成された構築物をヒトサイトメガロウイルス(CMV)由来の前初期プロモーターの制御下に置いた。これは、哺乳類細胞および組織中で適切かつ効率のよい発現に重要である。この研究に用いた構築物の模式的なマップを図5Aおよび図5Bに示す。
抗HIV-1 Env-Fab発現構築物の生成
ヒトmAb VRC01を広く中和する抗HIV-1エンベロープのVHおよびVL-Ig(免疫グロブリン)鎖コード配列の両方のcDNAを、NIH AIDS Research and Reference Reagent Program経由でVRC(ワクチンリサーチセンター、NIH)から入手し、pVax1ベクターにクローニングした。上記の実施例2に示すように、生物活性のあるIg分子の産生を最大化および最適化するために、いくつかの修飾を発現ベクターに組み込んだ。すなわち、これらの修飾により、コドンおよびRNAの最適化および安定化がもたらされ、リーダー配列の活用が増強され、プラスミドが高濃度で産生され、EP経由でin vivoプラスミド送達が促進された。生成された構築物をヒトサイトメガロウイルス(CMV)由来の前初期プロモーターの制御下に置いた。これは、哺乳類細胞および組織中で適切かつ効率のよい発現に重要である。この研究に用いた構築物の模式的なマップを図5Aおよび図5Bに示す。
さらに、抗HIV-1 Env FabをpHIV-Env-Fabから調製し、これを用いて、HIV Envをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞を染色した。pVAX1を対照として用いた。図11に示すように、抗HIV-1 Env Fabが、HIV Envをコードするプラスミドでトランスフェクトした細胞を染色したため、ベクターpHIV-Env-Fabにより抗HIV-1 Env Fabを調製できることが免疫蛍光染色により実証された。従って、抗HIV-1 Env Fabは、HIV Env糖タンパク質への結合に特異的であった。
実施例4
トランスフェクト細胞によるIg産生
pHIV-1Env-Fabの発現を評価するため、構築物を293T細胞にトランスフェクトした。コンセンサスHIV-1クレードB gp120タンパク質を用いたELISA免疫測定により、トランスフェクション後早ければ24時間でトランスフェクト293T細胞由来の上清中に抗HIV-1 Env-Fabの存在が確認された(図5C)。トランスフェクション後24~72時間で高OD450nm値(すなわち、約0.5~0.8の範囲)が細胞抽出物中で検出され、48時間でピークおよび平坦域に到達した。HIV Env糖タンパク質に対する抗HIV-1 Env Fabの特異性が、これらの結果により確認された。図5Cに示したデータの統計解析は以下の通りであった:pHIV-1 Env-Fab投与されたマウスの血清のOD450nm値は、22~72時間の時点における測定において、pVax1対照と比較して有意(p<0.05、スチューデントt検定)であった。
トランスフェクト細胞によるIg産生
pHIV-1Env-Fabの発現を評価するため、構築物を293T細胞にトランスフェクトした。コンセンサスHIV-1クレードB gp120タンパク質を用いたELISA免疫測定により、トランスフェクション後早ければ24時間でトランスフェクト293T細胞由来の上清中に抗HIV-1 Env-Fabの存在が確認された(図5C)。トランスフェクション後24~72時間で高OD450nm値(すなわち、約0.5~0.8の範囲)が細胞抽出物中で検出され、48時間でピークおよび平坦域に到達した。HIV Env糖タンパク質に対する抗HIV-1 Env Fabの特異性が、これらの結果により確認された。図5Cに示したデータの統計解析は以下の通りであった:pHIV-1 Env-Fab投与されたマウスの血清のOD450nm値は、22~72時間の時点における測定において、pVax1対照と比較して有意(p<0.05、スチューデントt検定)であった。
実施例5
HIV-1 Env Fabのin vivo特性
DNAプラスミドからのin vivo Fab産生を実証するため、マウスにpHIV-1 Env Fabを筋肉内経路で投与し、次いでEPを介して送達を増強させた。DNAプラスミドを単回注入で送達し、投与してから12時間、1日、2日、3日、4日、7日、および10日後に血清を回収した。その後、図6Aに示すように、ELISA分析により血清(1:100の希釈)のIg/Fabレベルを評価した。図6Aのデータ(pVax1およびHIV-1 Env-Fab両方の群からの個体マウスから)は、OD450nmとして示され、Ig/Fabレベルに比例していた。pHIV-1Env-Fabの単回投与後のFabの相対レベルは、1日目に検出可能となり、その後、経時的に増大したことが、これらのデータにより実証された。比較の目的で、実施例2に記載されているようにrgp120の単回投与/免疫化をBalb/Cマウスに施した後、血清を回収し、特定の抗gp120抗体レベルの程度および寿命を判断するために、ELISAで経時的な分析(1:100希釈物)を行った。その結果を図6Bに示す。
HIV-1 Env Fabのin vivo特性
DNAプラスミドからのin vivo Fab産生を実証するため、マウスにpHIV-1 Env Fabを筋肉内経路で投与し、次いでEPを介して送達を増強させた。DNAプラスミドを単回注入で送達し、投与してから12時間、1日、2日、3日、4日、7日、および10日後に血清を回収した。その後、図6Aに示すように、ELISA分析により血清(1:100の希釈)のIg/Fabレベルを評価した。図6Aのデータ(pVax1およびHIV-1 Env-Fab両方の群からの個体マウスから)は、OD450nmとして示され、Ig/Fabレベルに比例していた。pHIV-1Env-Fabの単回投与後のFabの相対レベルは、1日目に検出可能となり、その後、経時的に増大したことが、これらのデータにより実証された。比較の目的で、実施例2に記載されているようにrgp120の単回投与/免疫化をBalb/Cマウスに施した後、血清を回収し、特定の抗gp120抗体レベルの程度および寿命を判断するために、ELISAで経時的な分析(1:100希釈物)を行った。その結果を図6Bに示す。
このタンパク質送達研究では、バックグラウンド上で抗原特異的なIgレベルは、免疫化した後10日目になってやっと検出可能となった。これは、OD450nm値が、投与後1日目で少なくとも0.1OD450nmユニットに達し、10日目で0.28~0.35ODユニット間のレベルで平坦域となったpHIV-1 Env Fab投与(図6A)により引き起こされたFabレベルと対照的であった。従って、pHIV-1 Env Fabの送達により、従来のタンパク質免疫よりも特定のFabのより急速な生成がもたらされた。この発見は、生物活性のあるIgの生成によるDNAプラスミドの送達方法の潜在的な臨床的有用性を強調するものであった。
DNA送達技術によって産生された組み換えFabの質と量を確保するためにさらなる分析を行った。すなわち、電気泳動された後ブロットされた組み換えHIV-1 gp120タンパク質を用いて免疫ブロット分析を行い、投与してから48時間後にpHIV-1Env-Fabマウスの血清でプローブした(図6C)。このブロットにより、gp120タンパク質の分子量に適したバンドであることが示され、機能的でありかつgp120に結合可能であることが確認された。同様に、ヒトFab定量をELISAによって行い、プラスミド投与後の時間(すなわち、日数)の関数として示した(図6D)。結果は、生成されたFabレベルが2~3μg/mlでピークに達したことを示す。生成されたVRC01ベースのFabのVH鎖およびVL鎖のポリペプチドアセンブリが、正確であり、なおかつ、HIV-1 Envタンパク質を認識し、それに特異的に結合する能力を有することが、これらの結果により実証された。
図6に示したデータの統計解析は以下の通りである。図6Aにまとめたデータでは、pHIV-1 Env-Fab投与されたマウスの血清のOD450nm値は、1日目~10日目の時点の測定において、pVax1投与されたマウスの血清と比較して統計的(p<0.05、スチューデントt検定)に増大した。図6Bにまとめたデータでは、rpg120群からのOD450nm値は、10日目~14日目の時点の測定において、PBS対照と比較して有意(p<0.05、スチューデントt検定)に増大した。図6Dにまとめたデータでは、pHIV-1 Env-Fab投与されたマウスからのOD450nm値は、2日目~10日目の時点の測定において有意(p<0.05、スチューデントt検定)に増大した。
実施例6
異なるHIV-1 Envタンパク質を発現する細胞へのFab/Igsの結合:FACSベース分析
pHIV-1Env-Fab投与されたマウスの血清を用いて、生成されたFabの、293T細胞によって一時的に発現された異なるHIV- Envタンパク質への結合について試験した。天然型のVRC01-mAbを陽性対照として用いて、細胞の表面上にEnvタンパク質を適切に発現させ、確実に検出した。先に示した通り、「無関係な/無関連な」Ig(Ig-E1M2)を陰性対照として用いた。図7Aおよび図7Bに示した通り、基本的に、異なるIgs/FabsでpVax1(すなわち、Envインサートを欠いた)トランスフェクト細胞に背景染色しただけであった。しかしながら、精製VRC01 mAbと、pHIV-1Env-Fab投与されたマウスの血清との両方において、コンセンサスクレードA Envプラスミド(pCon-Env-A)、または、一次HIV-1単離体であるpQ23Env17からEnvを発現する最適化クレードCプラスミド(pOpt-Env-A)のいずれかを発現するトランスフェクト細胞で著しい正の染色があった。さらに、pIg-E1M2投与されたマウスの血清では、HIV1 Envトランスフェクト細胞のいずれにおいてもバックグラウンドレベルを上回る染色が示されなかった。これらの結果を示すFACS分析を図7Aに示す。この実験のFACS分析(すなわち、図7A)からのデータを示す代表的なグラフを図7Bに示した。
異なるHIV-1 Envタンパク質を発現する細胞へのFab/Igsの結合:FACSベース分析
pHIV-1Env-Fab投与されたマウスの血清を用いて、生成されたFabの、293T細胞によって一時的に発現された異なるHIV- Envタンパク質への結合について試験した。天然型のVRC01-mAbを陽性対照として用いて、細胞の表面上にEnvタンパク質を適切に発現させ、確実に検出した。先に示した通り、「無関係な/無関連な」Ig(Ig-E1M2)を陰性対照として用いた。図7Aおよび図7Bに示した通り、基本的に、異なるIgs/FabsでpVax1(すなわち、Envインサートを欠いた)トランスフェクト細胞に背景染色しただけであった。しかしながら、精製VRC01 mAbと、pHIV-1Env-Fab投与されたマウスの血清との両方において、コンセンサスクレードA Envプラスミド(pCon-Env-A)、または、一次HIV-1単離体であるpQ23Env17からEnvを発現する最適化クレードCプラスミド(pOpt-Env-A)のいずれかを発現するトランスフェクト細胞で著しい正の染色があった。さらに、pIg-E1M2投与されたマウスの血清では、HIV1 Envトランスフェクト細胞のいずれにおいてもバックグラウンドレベルを上回る染色が示されなかった。これらの結果を示すFACS分析を図7Aに示す。この実験のFACS分析(すなわち、図7A)からのデータを示す代表的なグラフを図7Bに示した。
図7Bに示したデータの統計解析は以下の通りである。天然VRC01抗体と、pHIV-1 Env-Fab投与されたマウスの血清間で、pCon-Env-Aによって生成されたエンベロープ糖タンパク質への特異結合における有意差(p<0.05、スチューデントt検定)はなかった。しかしながら、pOpt-Env-Aによって生成されたエンベロープ糖タンパク質へのVRC01抗体の結合は、pHIV-1 Env-Fab投与されたマウスの血清による結合よりも有意に高かった(p<0.05、スチューデントt検定)。
実施例7
pHIV-1 Env Fabによって産生されたIgのHIV中和活性
pHIV-1Env-Fab投与されたマウスの血清を用いて、HIV-Env Fabの、トランスフェクト293T細胞によって一時的に発現されるHIV-1 Envタンパク質への結合について試験した。pHIV-1Env-Fabの投与6日後のマウスの血清を入手した。具体的に、クレードA、B、またはC株由来のHIV-1 Envを発現するプラスミドで細胞をトランスフェクトした。クレードA、B、およびC株は、92RW020、SF162、およびZM197であった。図12に示すように、pHIV-1Env-Fab投与されたマウスの血清が、クレードA、B、およびC HIV-1株由来のHIV-1 Envに結合したことで、HIV-1の多数のサブタイプ由来のHIV-1 Envと交差反応した抗体(すなわち、HIV-Env Fab)を血清が含んでいたことが示された。
pHIV-1 Env Fabによって産生されたIgのHIV中和活性
pHIV-1Env-Fab投与されたマウスの血清を用いて、HIV-Env Fabの、トランスフェクト293T細胞によって一時的に発現されるHIV-1 Envタンパク質への結合について試験した。pHIV-1Env-Fabの投与6日後のマウスの血清を入手した。具体的に、クレードA、B、またはC株由来のHIV-1 Envを発現するプラスミドで細胞をトランスフェクトした。クレードA、B、およびC株は、92RW020、SF162、およびZM197であった。図12に示すように、pHIV-1Env-Fab投与されたマウスの血清が、クレードA、B、およびC HIV-1株由来のHIV-1 Envに結合したことで、HIV-1の多数のサブタイプ由来のHIV-1 Envと交差反応した抗体(すなわち、HIV-Env Fab)を血清が含んでいたことが示された。
この研究で製造されたHIV-Env Fabの潜在的なHIV-1中和活性を評価するために、TZM-Bl標的細胞を用いて蛍光ベース中和アッセイを行った。TZM-Bl標的細胞を、実施例2に記載されているように、実験用血清または対照血清の存在下または非存在下で4つの異なる偽型HIVウイルス単離体に感染させた。
図8は、pHIV-1 Env Fab投与されたマウスの血清のHIV偽型ウイルスに対する中和曲線を示す。具体的には、HIV-1 Tier1ウイルスであるBal26およびSF162S(両方ともクレードB)ならびにQ23Env(クレードA)について試験した。さらに、HIV-1クレードC Tier2ウイルスであるZM53Mに対しても血清を試験した。HIV感染の中和率/阻害率としてデータを示した。グラフの水平斜線は、アッセイにおいて50%の中和/阻害レベルを示した。この研究では、中和の陽性対照mAb(データ不図示)を利用して、この分析法の有用性および信頼性について確認した。簡単に言えば、mAbを中和する陽性対照は、4つ全てのウイルス偽型の感染を少なくとも50%阻害することができた。
プラスミド投与してから経時的にHIV中和活性が増大し、Bal25、Q23Env17、およびSF162Sに対する中和率が2日目で50%に達したことが、pHIV-1 Env Fab投与されたマウスの血清により実証された。これら3つのウイルスに対する平坦域での中和率は、それぞれ、約62、60、および70%であった。ZM53Mに対しては、3日目まで50%の中和閾値には到達せず、平坦域での中和率も50%を超えなかった。試験した他の3つと比べたこのロバスト性の低い中和プロファイルは、ZM53Mが中和可能性の低いTier2ウイルスであったことを反映しているようであった。要するに、この研究で生成されたFabは、広範なHIV単離体を効果的に中和することができた。図8に示したデータの統計解析は以下の通りである。クラスカル・ワリスノンパラメトリック解析に基づいて、pHIV-1 Env-Fab投与されたマウスの血清によって誘発されたZM53MクレードCウイルス(図8D)のHIV中和レベルのみ、試験した他のウイルス(図8A、図8B、および図8C)と著しく異なっていた。この差は、50%中和の達成に要する時間(日数)のみならず、達した最大の中和レベルでもあった。
実施例3~7をまとめると、pHIV-1 Env Fab投与されたマウス中のVRC01 Fabの血清濃度は、注入してから12日後に2~3μg/mLでピークに達した。この範囲は、FDAによって現在認可されている多くのモノクローナル抗体に匹敵するものであり、我々の抗体アプローチによって、有意かつ生物学的に関連したレベルの抗体が小動物モデル中で産生されたことが示された。特に、尋常性乾癬および関節炎などの自己免疫疾患に対して使用される、ウステキヌマブ(商品名:Stelara)およびゴリムマブ(Simponi)の2つの抗体は、それぞれ、0.31±0.33μg/mLおよび1.8±1.1μg/mLの平均値±標準偏差の血清濃度を有する。さらに、TNFインヒビターであるアダリムマブ(Humira)は、およそ6μg/mLの平均血清濃度を有する。これに関し、抗体をコードするDNAを生物に送達することで、有意かつ生物学的に関連したレベルの抗体が生物中に存在するように、in vivo組み立てがもたらされたことが、実施例4~8に記載のデータにより実証された。
従来のタンパク質投与によって産生されたIgs(図6Aおよび図6B)と比べて、pHIV-1Env FabのEP増強単回投与後、Fabsをin vivoでさらに速やかに産生する能力がこれらのデータにより実証された。さらに、難しいワクチン標的に対しても機能性防御Ig様分子を生成する能力が示された。今日まで、積極的なワクチン接種後にHIV-1中和抗体を誘導することは非常に困難であり、一次感染中、伝染してから何年も後になるまで中和抗体は作り出されない。このDNAプラスミドアプローチでは、送達後1~2日内で中和力価が観察され、ピークの中和Fab血清濃度(3.31±0.13μg/mL)は、投与後1週間で起こった(図6D)。このレベルのIgは、近年の研究において感染から完全に防御することが実証されている8.3μg/mL濃度と比較的同様であった。生物活性のあるIg断片が急速に誘導されることがこれらのデータにより実証された。
中和抗体力価およびHIV-1一次単離体に対する反応がHIV-1Env-Fab DNA投与によって引き起こされたこともこれらのデータにより示された。クレードA、B、およびCの例を表わす、異なるウイルスTier1およびTier2ウイルス単離体のパネルに対して血清を試験した。これらのウイルスに対する潜在的な中和活性を生成する結果が示された(図8)。
従って、このDNAプラスミドベースの方法により、特異的かつ生物活性のあるFabまたはIg分子をin vivo生成し、抗体生成において従来の抗原ベースのワクチン接種を用いる必要性を避けて、Igsをin vitroで生成し精製する必要性を除去した。
実施例8
ヒトIg抗体をコードするプラスミドの構築
上述したように、Fabは、VRC01抗体、すなわち、HIV-Env Fabから生成され、これは、コード化核酸を対象に投与した際にin vivo生成された。これらの研究をさらに拡張するため、VRC01抗体由来のIgG1抗体をコードする核酸配列を作成した。図13の模式図に示すように、IgG重鎖および軽鎖をコードする核酸配列を、フリン切断部位とP2Aペプチド配列をコードする核酸配列とで分離した。P2Aペプチド配列は、プロテアーゼによって切断効率が増すため、別々のポリペプチドが切断後にもたらされた。
ヒトIg抗体をコードするプラスミドの構築
上述したように、Fabは、VRC01抗体、すなわち、HIV-Env Fabから生成され、これは、コード化核酸を対象に投与した際にin vivo生成された。これらの研究をさらに拡張するため、VRC01抗体由来のIgG1抗体をコードする核酸配列を作成した。図13の模式図に示すように、IgG重鎖および軽鎖をコードする核酸配列を、フリン切断部位とP2Aペプチド配列をコードする核酸配列とで分離した。P2Aペプチド配列は、プロテアーゼによって切断効率が増すため、別々のポリペプチドが切断後にもたらされた。
IgG重鎖は、可変重(VH)領域、定常重1(CH1)領域、ヒンジ領域、定常重2(CH2)領域、および定常重3(CH3)領域を含んでいた。IgG軽鎖は、可変軽(VL)領域および定常軽(CL)領域を含んでいた。この構築物をサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、例えば、発現ベクターpVAX1の制御下に置いた。この構築物により、gp120(すなわち、VRC01抗体によって認識された抗原)に反応性があった完全に組み立てられたIgG抗体(図14示すように)の産生がもたらされた。本明細書では、この完全に組み立てられたIgGのことを「VRC01 IgG」と呼ぶ。VRC01 IgG(フリンによる切断前の)のアミノ酸配列は、配列番号5(図15を参照)に記載されており、これは、配列番号64(図62を参照)をコードする核酸配列によってコードされる。
特に、VRC01 IgG(フリンによる切断前;配列番号5および図15、これは、配列番号64のヌクレオチド配列によってコードされる)のアミノ酸配列は、以下の構造を有する:免疫グロブリンE1(IgE1)シグナルペプチド、可変重領域(VH)、定常重領域1(CH1)、ヒンジ領域、定常重領域2(CH2)、定常重領域3(CH3)、フリン切断部位、GSGリンカー、P2Aペプチド、IgE1シグナルペプチド、可変軽領域(VL)、および定常軽領域(CL、特にカッパ)である。構造(その全ては、上述の順序かつ図13に示すように配列番号15内に含まれる)の各部分の配列を以下に示す。
VRC-1 IgGのIgE1シグナルペプチド-MDWTWILFLVAAATRVHS(配列番号8)。
VRC01 IgGの可変重領域-QVQLVQSGGQMKKPGESMRISCRASGYEFIDCTLNWIRLAPGKRPEWMGWLKPRGGAVNYARPLQGRVTMTRDVYSDTAFLELRSLTVDDTAVYFCTRGKNCDYNWDFEHWGRGTPVIVSSPSTKG(配列番号9)。
VRC01 IgGの定常重領域1(CH1)-PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSC(配列番号10)。
VRC01 IgGのヒンジ領域-EPKSCDKTHTCPPCP(配列番号11)。
VRC01 IgGの定常重領域2(CH2)-APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(配列番号12)。
VRC01 IgGの定常重領域3(CH3)-GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号13)。
VRC01 IgGのフリン切断部位-RGRKRRS(配列番号14)。
VRC01 IgGのGSGリンカーおよびP2Aペプチド-GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(配列番号15)。
VRC01 IgGのIgE1シグナルペプチド-MDWTWILFLVAAATRVHS(配列番号8)。
VRC01 IgGの可変軽領域(VL)-EIVLTQSPGTLSLSPGETAIISCRTSQYGSLAWYQQRPGQAPRLVIYSGSTRAAGIPDRFSGSRWGPDYNLTISNLESGDFGVYYCQQYEFFGQGTKVQVDIKR(配列番号16)。
VRC01 IgGの定常軽領域(CL、カッパ)-TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLRSPVTKSFNRGEC(配列番号17)。
実施例9
2つのプラスミドによってコードされたHIV-1 VRC01 IgG
上記の実施例2~8に記載したように、Fab(各鎖は別々のプラスミドから発現)は、VRC01抗体、すなわち、HIV-Env Fabから生成され、IgG(単一プラスミドから発現)は、VRC01抗体、すなわち、VRC01 IgGから生成された。これらの研究をさらに拡張するため、IgGは、VRC01抗体から生成され、ここで、重鎖(すなわち、可変重領域(VH)、定常重領域1(CH1)、ヒンジ領域、定常重領域2(CH2)、および定常重領域3(CH3))および軽鎖(すなわち、可変軽領域(VL)および定常軽領域(CL))は、別々の構築物によってコードされた(図50および図51)。本明細書では、このIgGのことを「HIV-1 VRC01 IgG」と呼ぶ。
2つのプラスミドによってコードされたHIV-1 VRC01 IgG
上記の実施例2~8に記載したように、Fab(各鎖は別々のプラスミドから発現)は、VRC01抗体、すなわち、HIV-Env Fabから生成され、IgG(単一プラスミドから発現)は、VRC01抗体、すなわち、VRC01 IgGから生成された。これらの研究をさらに拡張するため、IgGは、VRC01抗体から生成され、ここで、重鎖(すなわち、可変重領域(VH)、定常重領域1(CH1)、ヒンジ領域、定常重領域2(CH2)、および定常重領域3(CH3))および軽鎖(すなわち、可変軽領域(VL)および定常軽領域(CL))は、別々の構築物によってコードされた(図50および図51)。本明細書では、このIgGのことを「HIV-1 VRC01 IgG」と呼ぶ。
各構築物は、in vivoでいったん生成された抗体の分泌を最適化するリーダー配列も含んでいた。各構築物をpVAX1ベクターのBamHIおよびXhoI部位でクローニングすることで、構築物をサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの制御下に置いた(図50および図51)。従って、VRC01 IgGをin vivo形成または生成するため、プラスミドの混合物、すなわち、重鎖をコードする構築物を含むプラスミドと軽鎖をコードする構築物を含むプラスミドとを対象に投与しなければならない。
また、各構築物をさらに最適化した。最適化には、kozak配列(GCCACC)の添加およびコドン最適化を含んでいた。HIV-1 VRC01 IgGのIgG1重鎖をコードする核酸配列は、配列番号54および図52に記載されている。図52において、下線および二重下線は、核酸配列をpVAX1ベクターにクローニングするのに用いたBamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGAG)制限酵素部位を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGATAA)コドンを示す。配列番号54は、配列番号55および図53に記載のアミノ酸配列、すなわち、HIV-1 VRC01 IgGのIgG1重鎖のアミノ酸配列をコードする。
HIV-1 VRC01 IgGのIgG軽鎖をコードする核酸配列は、配列番号56および図54に記載されている。図54において、下線および二重下線は、核酸配列をpVAX1ベクターにクローニングするのに用いたBamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGAG)制限酵素部位を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGATAA)コドンを示す。配列番号56は、配列番号57および図55に記載のアミノ酸配列、すなわち、HIV-1 VRC01 IgGのIgG軽鎖のアミノ酸配列をコードする。
実施例10
HIV-1 Env-PG9 Ig
VRC01 IgGに加えて、HIV-1 Envに反応性のあるIgGをコードする別の構築物を作成した。この構築物はHIV-1 Env-PG9であり、これを最適化し、発現ベクター内でクローニングした(図16Aおよび図16B)。最適化には、kozak配列(例えば、GCCACC)、リーダー配列の導入およびコドン最適化を含んでいた。HIV-1 Env-PG9 Igをコードする核酸配列を含む発現ベクターが作成されたことが、図16Cに示すような制限酵素消化によって確認された。図16Cにおいて、レーン1は未消化の発現ベクターであり、レーン2はBamHIおよびXho1で消化された発現ベクターであり、レーンMはマーカーであった。
HIV-1 Env-PG9 Ig
VRC01 IgGに加えて、HIV-1 Envに反応性のあるIgGをコードする別の構築物を作成した。この構築物はHIV-1 Env-PG9であり、これを最適化し、発現ベクター内でクローニングした(図16Aおよび図16B)。最適化には、kozak配列(例えば、GCCACC)、リーダー配列の導入およびコドン最適化を含んでいた。HIV-1 Env-PG9 Igをコードする核酸配列を含む発現ベクターが作成されたことが、図16Cに示すような制限酵素消化によって確認された。図16Cにおいて、レーン1は未消化の発現ベクターであり、レーン2はBamHIおよびXho1で消化された発現ベクターであり、レーンMはマーカーであった。
HIV-1 Env-PG9 Igをコードする核酸配列は、配列番号63および図61に記載されている。図61において、下線および二重下線は、核酸配列をpVAX1ベクターにクローニングするのに用いたBamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGAG)制限酵素部位を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGATAA)コドンを示す。配列番号63は、配列番号2および図18に記載のアミノ酸配列、すなわち、HIV-1 ENv-PG9 Ig(フリンによる切断前)のアミノ酸配列をコードする。
このアミノ酸配列では、シグナルペプチドが、重鎖および軽鎖の各々にペプチド結合で結合されることで、in vivo生成された抗体の分泌が向上する。また、P2Aペプチドをコードする核酸配列が、重鎖および軽鎖をコードする核酸配列間に位置するので、翻訳されたポリペプチドを、重鎖または軽鎖を含む別々のポリペプチドにより効率的に切断することができる。
特に、HIV-1 Env-PG9 Ig(フリンによる切断前;配列番号2および図18)のアミノ酸配列は、以下の構造を有する:ヒトIgG重鎖シグナルペプチド、可変重領域(VH)、定常重領域1(CH1)、ヒンジ領域、定常重領域2(CH2)、定常重領域3(CH3)、フリン切断部位、GSGリンカー、P2Aペプチド、ヒトラムダ軽鎖シグナルペプチド、可変軽領域(VL)、および定常軽領域(CL、特にラムダ)である。構造(その全ては、上述の順序で配列番号2内に含まれる)の各部分の配列を以下に示す。
HIV-1 Env-PG9 IgのヒトIgG重鎖シグナルペプチド-MDWTWRILFLVAAATGTHA(配列番号18)。
HIV-1 Env-PG9 Igの可変重領域-EFGLSWVFLVAFLRGVQCQRLVESGGGVVQPGSSLRLSCAASGFDFSRQGMHWVRQAPGQGLEWVAFIKYDGSEKYHADSVWGRLSISRDNSKDTLYLQMNSLRVEDTATYFCVREAGGPDYRNGYNYYDFYDGYYNYHYMDVWGKGTTVTVSS(配列番号19)。
HIV-1 Env-PG9 Igの定常重領域1(CH1)-ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV(配列番号20)。
HIV-1 Env-PG9 Igのヒンジ領域-EPKSCDKTHTCPPCP(配列番号21)。
HIV-1 Env-PG9 Igの定常重領域2(CH2)-APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(配列番号22)。
HIV-1 Env-PG9 Igの定常重領域3(CH3)-GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号23)。
HIV-1 Env-PG9 Igのフリン切断部位-RGRKRRS(配列番号24)。
HIV-1 Env-PG9 IgのGSGリンカーおよびP2Aペプチド-GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(配列番号25)。
HIV-1 Env-PG9 Igのヒトラムダ軽鎖シグナルペプチド-MAWTPLFLFLLTCCPGGSNS(配列番号26)。
HIV-1 Env-PG9 Igの可変軽領域(VL)-QSALTQPASVSGSPGQSITISCNGTSNDVGGYESVSWYQQHPGKAPKVVIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEGDYYCKSLTSTRRRVFGTGTKLTVL(配列番号27)。
HIV-1 Env-PG9 Igの定常軽領域(CL、ラムダ)-GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(配列番号28)。
実施例11
HIV-1 PG9一本鎖Fab(scFab)
上述のHIV-1 Env-PG9 Igに加えて、一本鎖Fab(すなわち、単一転写産物に転写され、単一ポリペプチドに翻訳される核酸配列によってコードされたVH/CH1およびVL/CL)をPG9抗体(本明細書では、「HIV-1 PG9 scFab」と呼ぶ)に基づいて作成した。HIV-1 PG9 scFabをコードする核酸配列は、配列番号50および図46に記載されている。図46において、下線および二重下線は、この核酸配列をpVAX1ベクターにクローニングするのに用いたBamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGAG)を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGATAA)コドンを示す。配列番号50に記載の核酸配列は、kozak配列(GCCACC)、コドン最適化、およびリーダー配列を含む最適化核酸配列であった。リーダー配列は、構築物の5’末端、すなわち、一本鎖Fabの前に位置していたため、リンカー配列によってコードされたシグナルペプチドは、一本鎖Fabのアミノ末端にペプチド結合で結合された。配列番号50に記載の核酸配列は、VH/CH1をコードする核酸配列と、VL/CLをコードする核酸配列との間に位置するリンカー配列も含んでいた。従って、配列番号50によってコードされるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列は、VH/CH1およびVL/CLを一緒にするリンカー配列によってコードされた。配列番号50は、配列番号51および図47に記載のアミノ酸配列、すなわち、HIV-1 PG9 scFabのアミノ酸配列をコードする。
HIV-1 PG9一本鎖Fab(scFab)
上述のHIV-1 Env-PG9 Igに加えて、一本鎖Fab(すなわち、単一転写産物に転写され、単一ポリペプチドに翻訳される核酸配列によってコードされたVH/CH1およびVL/CL)をPG9抗体(本明細書では、「HIV-1 PG9 scFab」と呼ぶ)に基づいて作成した。HIV-1 PG9 scFabをコードする核酸配列は、配列番号50および図46に記載されている。図46において、下線および二重下線は、この核酸配列をpVAX1ベクターにクローニングするのに用いたBamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGAG)を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGATAA)コドンを示す。配列番号50に記載の核酸配列は、kozak配列(GCCACC)、コドン最適化、およびリーダー配列を含む最適化核酸配列であった。リーダー配列は、構築物の5’末端、すなわち、一本鎖Fabの前に位置していたため、リンカー配列によってコードされたシグナルペプチドは、一本鎖Fabのアミノ末端にペプチド結合で結合された。配列番号50に記載の核酸配列は、VH/CH1をコードする核酸配列と、VL/CLをコードする核酸配列との間に位置するリンカー配列も含んでいた。従って、配列番号50によってコードされるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列は、VH/CH1およびVL/CLを一緒にするリンカー配列によってコードされた。配列番号50は、配列番号51および図47に記載のアミノ酸配列、すなわち、HIV-1 PG9 scFabのアミノ酸配列をコードする。
実施例12
HIV-1 Env-4E10 Ig
VRC01 IgGおよびHIV-1 Env-PG9 Igに加えて、HIV-1 Envに反応性のあるIgGをコードする別の構築物を作成した。この構築物はHIV-1 Env-4E10であり、これを最適化し、発現ベクター内でクローニングした(図17Aおよび図17B)。最適化には、kozak配列(例えば、GCCACC)、リーダー配列の導入およびコドン最適化を含んでいた。HIV-1 Env-4E10 Igをコードする核酸配列を含む発現ベクターが作成されたことが、図17Cに示すような制限酵素消化によって確認された。図17Cにおいて、レーン1は未消化の発現ベクターであり、レーン2はBamHIおよびXho1で消化された発現ベクターであり、レーンMはマーカーであった。
HIV-1 Env-4E10 Ig
VRC01 IgGおよびHIV-1 Env-PG9 Igに加えて、HIV-1 Envに反応性のあるIgGをコードする別の構築物を作成した。この構築物はHIV-1 Env-4E10であり、これを最適化し、発現ベクター内でクローニングした(図17Aおよび図17B)。最適化には、kozak配列(例えば、GCCACC)、リーダー配列の導入およびコドン最適化を含んでいた。HIV-1 Env-4E10 Igをコードする核酸配列を含む発現ベクターが作成されたことが、図17Cに示すような制限酵素消化によって確認された。図17Cにおいて、レーン1は未消化の発現ベクターであり、レーン2はBamHIおよびXho1で消化された発現ベクターであり、レーンMはマーカーであった。
HIV-1 Env-4E10 Igをコードする核酸配列は、配列番号62および図60に記載されている。図60において、下線および二重下線は、核酸配列をpVAX1ベクターにクローニングするのに用いたBamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGAG)制限酵素部位を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGATAA)コドンを示す。配列番号62は、配列番号1および図19に記載のアミノ酸配列、すなわち、HIV-1 ENv-4E10 Ig(フリンによる切断前)のアミノ酸配列をコードする。
このアミノ酸配列では、シグナルペプチドが、重鎖および軽鎖の各々にペプチド結合で結合されることで、in vivo生成された抗体の分泌が向上する。また、P2Aペプチドをコードする核酸配列は、重鎖および軽鎖をコードする核酸配列間に位置するので、翻訳されたポリペプチドを、重鎖または軽鎖を含む別々のポリペプチドにより効率的に切断することができる。
特に、HIV-1 Env-4E10 Ig(フリンによる切断前;配列番号1および図19)のアミノ酸配列は、以下の構造を有する:ヒトIgG重鎖シグナルペプチド、可変重領域(VH)、定常重領域1(CH1)、ヒンジ領域、定常重領域2(CH2)、定常重領域3(CH3)、フリン切断部位、GSGリンカー、P2Aペプチド、ヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド、可変軽領域(VL)、および定常軽領域(CL、特にカッパ)である。構造(その全ては、上述の順序で配列番号1内に含まれる)の各部分の配列を以下に示す。
HIV-1 Env-4E10 IgのヒトIgG重鎖シグナルペプチド-MDWTWRILFLVAAATGTHA(配列番号29)。
HIV-1 Env-4E10 Igの可変重領域-QVQLVQSGAEVKRPGSSVTVSCKASGGSFSTYALSWVRQAPGRGLEWMGGVIPLLTITNYAPRFQGRITITADRSTSTAYLELNSLRPEDTAVYYCAREGTTGWGWLGKPIGAFAHWGQGTLVTVSS(配列番号30)。
HIV-1 Env-4E10 Igの定常重領域1(CH1)-ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV(配列番号31)。
HIV-1 Env-4E10 Igのヒンジ領域-EPKSCDKTHTCPPCP(配列番号32)。
HIV-1 Env-4E10 Igの定常重領域2(CH2)-APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(配列番号33)。
HIV-1 Env-4E10 Igの定常重領域3(CH3)-GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号34)。
HIV-1 Env-4E10 Igのフリン切断部位-RGRKRRS(配列番号35)。
HIV-1 Env-4E10 IgのGSGリンカーおよびP2Aペプチド-GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(配列番号36)。
HIV-1 Env-4E10 Igのヒトカッパ軽鎖シグナルペプチド-MVLQTQVFISLLLWISGAYG(配列番号37)。
HIV-1 Env-4E10 Igの可変軽領域(VL)-EIVLTQSPGTQSLSPGERATLSCRASQSVGNNKLAWYQQRPGQAPRLLIYGASSRPSGVADRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGQSLSTFGQGTKVE(配列番号38)。
HIV-1 Env-4E10 Igの定常軽領域(CL、カッパ)-KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE(配列番号39)。
実施例13
HIV-1 4E10 ScFab
上述のHIV-1 Env-PG9 Igに加えて、一本鎖Fab(すなわち、単一転写産物に転写され、単一ポリペプチドに翻訳される核酸配列によってコードされたVH/CH1およびVL/CL)を4E10抗体(本明細書では、「HIV-1 4E10 scFab」と呼ぶ)に基づいて作成した。HIV-1 4E10 scFabをコードする核酸配列は、配列番号52および図48に記載されている。図48において、下線および二重下線は、この核酸配列をpVAX1ベクターにクローニングするのに用いたBamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGAG)を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGATAA)コドンを示す。配列番号52に記載の核酸配列は、kozak配列(GCC ACC)、コドン最適化、およびリーダー配列を含む最適化核酸配列であった。リーダー配列は、構築物の5’末端、すなわち、一本鎖Fabの前に位置していたため、リンカー配列によってコードされたシグナルペプチドは、一本鎖Fabのアミノ末端にペプチド結合で結合された。配列番号52に記載の核酸配列は、VH/CH1をコードする核酸配列と、VL/CLをコードする核酸配列との間に位置するリンカー配列も含んでいた。従って、配列番号52によってコードされるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列は、VH/CH1およびVL/CLを一緒にするリンカー配列によってコードされた。配列番号52は、配列番号53および図49に記載のアミノ酸配列、すなわち、HIV-1 4E10 scFabのアミノ酸配列をコードした。
HIV-1 4E10 ScFab
上述のHIV-1 Env-PG9 Igに加えて、一本鎖Fab(すなわち、単一転写産物に転写され、単一ポリペプチドに翻訳される核酸配列によってコードされたVH/CH1およびVL/CL)を4E10抗体(本明細書では、「HIV-1 4E10 scFab」と呼ぶ)に基づいて作成した。HIV-1 4E10 scFabをコードする核酸配列は、配列番号52および図48に記載されている。図48において、下線および二重下線は、この核酸配列をpVAX1ベクターにクローニングするのに用いたBamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGAG)を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGATAA)コドンを示す。配列番号52に記載の核酸配列は、kozak配列(GCC ACC)、コドン最適化、およびリーダー配列を含む最適化核酸配列であった。リーダー配列は、構築物の5’末端、すなわち、一本鎖Fabの前に位置していたため、リンカー配列によってコードされたシグナルペプチドは、一本鎖Fabのアミノ末端にペプチド結合で結合された。配列番号52に記載の核酸配列は、VH/CH1をコードする核酸配列と、VL/CLをコードする核酸配列との間に位置するリンカー配列も含んでいた。従って、配列番号52によってコードされるポリペプチドにおいて、アミノ酸配列は、VH/CH1およびVL/CLを一緒にするリンカー配列によってコードされた。配列番号52は、配列番号53および図49に記載のアミノ酸配列、すなわち、HIV-1 4E10 scFabのアミノ酸配列をコードした。
実施例14
CHIKV-Env-Fab
上述したように、HIV-1Env Fabの重(VH-CH1)鎖および軽(VL-CL)鎖をコードする核酸配列を細胞またはマウスに送達する際に、HIV-1 Envに反応性のあるFabをin vivoで組み立てたかもしくは生成した。コード化核酸配列を細胞または対象に送達する際に、他の抗原に反応性のあるFabs をin vivo生成することができるか判定するため、チクングニヤウイルス(CHIKV)のエンベロープタンパク質(Env)に反応性のある抗体の重(VH-CH1)鎖および軽(VL-CL、ラムダ型)鎖をコードする構築物を作成した。各構築物は、図20A、図20B、および図21に示すようにリーダー配列およびkozak配列を含んでいた。VH-CH1およびVL-CLをコードする構築物を発現ベクター内でクローニングしたことで、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(図21)の制御下に置いた。VH-CH1およびVL-CLをコードする構築物を含む発現ベクターは、それぞれ、CHIKV-HおよびCHIV-Lとして知られている。CHIKV-HおよびCHIKV-Lベクターの混合物は、pCHIKV-Env-Fabとして知られており、これは、in vivo(すなわち、細胞または対象内に導入時)生成されたCHIKV-Env-Fabである。換言すれば、以下により詳細に記載のCHIKV-Env-Fabをin vivo生成するには両方のベクターが必要であった。
CHIKV-Env-Fab
上述したように、HIV-1Env Fabの重(VH-CH1)鎖および軽(VL-CL)鎖をコードする核酸配列を細胞またはマウスに送達する際に、HIV-1 Envに反応性のあるFabをin vivoで組み立てたかもしくは生成した。コード化核酸配列を細胞または対象に送達する際に、他の抗原に反応性のあるFabs をin vivo生成することができるか判定するため、チクングニヤウイルス(CHIKV)のエンベロープタンパク質(Env)に反応性のある抗体の重(VH-CH1)鎖および軽(VL-CL、ラムダ型)鎖をコードする構築物を作成した。各構築物は、図20A、図20B、および図21に示すようにリーダー配列およびkozak配列を含んでいた。VH-CH1およびVL-CLをコードする構築物を発現ベクター内でクローニングしたことで、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(図21)の制御下に置いた。VH-CH1およびVL-CLをコードする構築物を含む発現ベクターは、それぞれ、CHIKV-HおよびCHIV-Lとして知られている。CHIKV-HおよびCHIKV-Lベクターの混合物は、pCHIKV-Env-Fabとして知られており、これは、in vivo(すなわち、細胞または対象内に導入時)生成されたCHIKV-Env-Fabである。換言すれば、以下により詳細に記載のCHIKV-Env-Fabをin vivo生成するには両方のベクターが必要であった。
構築物を発現のために最適化も行った。具体的に、CHIKV-Env-Fabのin vivo生成時にCHIKV-Env-Fabの分泌効率を増大させるため、各構築物にはリーダー配列が含まれた。各構築物をコドン最適化し、kozak配列(GCCACC)を含んだ。CHIKV-Env-Fabの重鎖(VH-CH1)をコードする核酸配列は、配列番号58および図56に記載されている。図56において、下線および二重下線は、核酸配列をpVAX1ベクターにクローニングするのに用いたBamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGAG)制限酵素部位を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGATAA)コドンを示す。配列番号58は、配列番号59および図57に記載のアミノ酸配列、すなわち、CHIKV-Env-Fabの重鎖(VH-CH1)のアミノ酸配列をコードする。
CHIKV-Env-Fabの軽鎖(VL-CL)をコードする核酸配列は、配列番号60および図58に記載されている。図58において、下線および二重下線は、核酸配列をpVAX1ベクターにクローニングするのに用いたBamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGAG)制限酵素部位を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGATAA)コドンを示す。配列番号60は、配列番号61および図59に記載のアミノ酸配列、すなわち、CHIKV-Env-Fabの軽鎖(VL-CL)のアミノ酸配列をコードする。
CHIKV-Env-Fabのin vivo生成の時間的動態を測定するため、pVAX1、CHIKV-H、CHIKV-L、またはpCHIKV-Env-Fabで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後、ELISAを用いて、CHIKV-Env-Fabの経時的な生成レベルを測定した。図22に示すように、pVAX1、CHIKV-H、またはCHIKV-Lでトランスフェクトした細胞は、CHIKV Env抗原に反応性のある抗体を産生しなかった。これに対し、pCHIKV-Env-Fabでトランスフェクトした細胞は、CHIKV Env抗原に反応性のある抗体(すなわち、CHIKV-Env-Fab、CHIKV-Fabとしても知られる)を産生した。従って、CHIKV-Env-Fabの重(VH-CH1)鎖および軽(VL-CL)鎖をコードする核酸配列を送達することでCHIKV-Env抗原に結合するかまたは該抗原に反応性のあるFabが生成されたことが、これらのデータにより示された。
また、pCHIKV-Envでトランスフェクトした細胞から得た溶解物のウエスタンブロットにCHIKV-Env-Fabを用いた。これは、CHIKV-Env抗原をコードするプラスミドである。図23に示すように、CHIKV-Env抗原がCHIKV-Env-Fabを介して検出され、これは、このFabが抗原に結合したことを示唆するものである。
CHIKV-Env-Fabのin vivo生成またはin vivo組み立てをさらに調べるため、pCHIKV-Env-Fab(すなわち、12.5μgのCHIKV-Hと12.5μgのCHIKV-L)をマウスに投与した。さらに、25μgのpVAX1、CHIKV-H、およびCHIKV-Lを、対照としての第2群、第3群、および第4群のマウスにそれぞれ投与した。具体的には、事前採血のサンプルを得た後、それぞれのマウス群に0日目にプラスミドを投与した。1日目、2日目、3日目、5日目、7日目、および10日目に血液を採取した(図24)。これらの血液にELISA測定を行い、CHIKV-Env抗原に反応性のある抗体のレベルを測定した。図25に示すように、pCHIKV-Env-Fabを投与されたマウスは、CHIKV-Env抗原に反応性のある抗体(すなわち、CHIKV-Env-Fab)を生成した。pVAX1、CHIKV-H、またはCHIKV-Lを投与されたマウスは、CHIKV-Env抗原に著しい反応性を持つ抗体を生成しなかった。従って、CHIKV-Env-Fabの重(VH-CH1)鎖および軽(VL-CL)鎖をコードする核酸配列の送達時に、このFabはin vivo(すなわち、マウス内)生成され、その抗原(すなわち、CHIKV-Env)に反応性のあることがこれらのデータにより実証された。これにより、Fabがin vivoで正しく組み立てられたことが実証された。
CHIKV-Env-FabがCHIKV感染に対して防御することができるかどうか判断するため、C57BL/6マウス(2~3週齢;約20~25グラム量)にpCHIKV-Env-Fab(50μg)またはpVAX1を0日目に投与した。pCHIKV-Env-Fabを投与してから6時間後、各マウスに全容量25μl中の7ログ10PFUを鼻腔内経路により接種した。その後毎日、各マウスの体重を測定し、体重減少30%以上のマウスは犠牲にした。
図26に示すように、pCHIKV-Env-Fabを投与されたマウスのうち約75%が、本研究14日目の時点でCHIKV感染から生き残ったが、pVAX1を投与されたマウスは全て14日目までに死んだ。さらに、pCHIKV-Env-Fabを投与されたマウスは、pVAX1を投与されたマウスと比較して、低レベルのサイトカインTNF-αおよびIL-6を伴った(図27および図28)。TNF-αおよびIL-6のレベルを、マウスから得た血清で測定した。これらの生き残ったマウスは、病気や体重減少の兆候を示さず、サイトカインTNF-αおよびIL-6は低レベルであった。従って、pCHIKV-Env-Fabの投与により、CHIKV感染からマウスを防御し、CHIKV感染からの生存が促進されたことが、これらのデータにより示された。換言すれば、マウス内におけるCHIKV-Env-Fabのin vivo生成により、CHIKV感染に対して防御し、CHIKV感染からの生存が促進された。
実施例15
抗Her-2 Fab
上述したように、HIV-1Env FabまたはCHIKV Env-Fabの重(VH-CH1)鎖および軽(VL-CL)鎖をコードする核酸配列を細胞またはマウスに送達する際に、HIV-1 EnvまたはCHIKV Envに反応性のあるFab(すなわち、VH/CH1およびVL/CL)をin vivo組み立てまたはin vivo生成した。コード化核酸配列を細胞または対象に送達する際に、自己抗原(すなわち、Fabをコードする核酸配列を投与された対象における内因性の抗原)に反応性のあるFabs をin vivo生成することができるか判断するため、ヒト上皮成長増殖因子受容体2(Her-2;Erb2としても知られる)に反応性のある抗体の重(VH-CH1)鎖および軽(VL-CL、カッパ型)鎖をコードする構築物を作成した。各構築物は、リーダー配列およびkozak配列(GCCACC)を含み、これらは、図28、図30、および図31示すように抗Her-2FabのVH-CH1またはVL-CLをコードする核酸配列の前に来た。従って、これらの構築物は、リーダー配列およびkozak配列の導入により最適化され、コドン使用にさらに最適化された。
抗Her-2 Fab
上述したように、HIV-1Env FabまたはCHIKV Env-Fabの重(VH-CH1)鎖および軽(VL-CL)鎖をコードする核酸配列を細胞またはマウスに送達する際に、HIV-1 EnvまたはCHIKV Envに反応性のあるFab(すなわち、VH/CH1およびVL/CL)をin vivo組み立てまたはin vivo生成した。コード化核酸配列を細胞または対象に送達する際に、自己抗原(すなわち、Fabをコードする核酸配列を投与された対象における内因性の抗原)に反応性のあるFabs をin vivo生成することができるか判断するため、ヒト上皮成長増殖因子受容体2(Her-2;Erb2としても知られる)に反応性のある抗体の重(VH-CH1)鎖および軽(VL-CL、カッパ型)鎖をコードする構築物を作成した。各構築物は、リーダー配列およびkozak配列(GCCACC)を含み、これらは、図28、図30、および図31示すように抗Her-2FabのVH-CH1またはVL-CLをコードする核酸配列の前に来た。従って、これらの構築物は、リーダー配列およびkozak配列の導入により最適化され、コドン使用にさらに最適化された。
VH-CH1およびVL-CLをコードする構築物をpVAX1発現ベクター内、すなわち、BamHIおよびXhoI制限部位間でクローニングしたことで、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターの制御下に置いた。具体的に、VH-CH1およびVL-CLをコードする構築物を2つの別々のpVAX1ベクターにクローニングしたことで、得られた2つのプラスミドは、抗Her-2 Fabをin vivo生成するのに必要とされた。
抗Her-2 FabのVH-CH1をコードする核酸配列が、配列番号40および図32に記載されている。図32において、下線および二重下線は、核酸配列をpVAX1ベクターにクローニングするのに用いたBamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGAG)制限酵素部位を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGATAA)コドンを示す。配列番号40は、配列番号41に記載のアミノ酸配列、すなわち、抗Her-2 FabのVH-CH1のアミノ酸配列(図32および図33)をコードする。
抗Her-2 FabのVL-CLをコードする核酸配列が、配列番号42および図34に記載されている。図34において、下線および二重下線は、核酸配列をpVAX1ベクターにクローニングするのに用いたBamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGAG)制限酵素部位を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGATAA)コドンを示す。配列番号42は、配列番号43に記載のアミノ酸配列、すなわち、抗Her-2 FabのVL-CLのアミノ酸配列(図34および図35)をコードする。
抗Her-2 FabのVH-CH1およびVL-CLをコードするプラスミドの混合物が抗Her-2 Fabをin vivo生成したかどうか判断するため、抗Her-2 FabまたはpVAX1の重(VH-CH1)鎖および軽(VLおよびCL)鎖をコードするプラスミドの混合物で293T細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後、図36に示すように全IgG濃度を測定した。図36において、エラーバーは標準偏差を表わす。抗Her-2 FabのVH-CH1またはVL-CLをそれぞれコードする2つのプラスミドを導入した際に、抗Her-2 Fabがin vivo生成されたことが、これらのデータにより示された。
実施例16
抗デングウイルスヒトIgG
単一プラスミド系を作成して、抗デングウイルス(DENV)ヒトIgG抗体をin vivo生成した。具体的には、図37に模式的に示すように構築物を生成した。すなわち、リーダー配列を、IgG重鎖(すなわち、可変重領域(VH)、定常重領域1(CH1)、ヒンジ領域、定常重領域2(CH2)、および定常重領域3(CH3))をコードする核酸配列の上流に位置づけた。次に、プロテアーゼ切断部位をコードする配列を、IgG重鎖をコードする核酸配列の下流に位置づけた。IgG軽鎖(すなわち、可変軽領域(VL)および定常軽領域(CL))をコードする核酸配列を、プロテアーゼ切断部位(すなわち、フリン切断部位)をコードする配列の後に置いた。この構築物によってコードされるシグナルペプチドは、同種のシグナルペプチドであるため、発現時に抗体の適切な分泌をもたらした。さらに、発現時に、単一転写産物は単一ポリペプチドに翻訳され、これは、プロテアーゼによって、抗DENVヒトIgGの重鎖および軽鎖に対応するポリペプチドに処理される。これらの重鎖および軽鎖ポリペプチドを、その後、機能性抗DENVヒトIgG、すなわち、その同種抗原に結合する抗体に組み立てる。
抗デングウイルスヒトIgG
単一プラスミド系を作成して、抗デングウイルス(DENV)ヒトIgG抗体をin vivo生成した。具体的には、図37に模式的に示すように構築物を生成した。すなわち、リーダー配列を、IgG重鎖(すなわち、可変重領域(VH)、定常重領域1(CH1)、ヒンジ領域、定常重領域2(CH2)、および定常重領域3(CH3))をコードする核酸配列の上流に位置づけた。次に、プロテアーゼ切断部位をコードする配列を、IgG重鎖をコードする核酸配列の下流に位置づけた。IgG軽鎖(すなわち、可変軽領域(VL)および定常軽領域(CL))をコードする核酸配列を、プロテアーゼ切断部位(すなわち、フリン切断部位)をコードする配列の後に置いた。この構築物によってコードされるシグナルペプチドは、同種のシグナルペプチドであるため、発現時に抗体の適切な分泌をもたらした。さらに、発現時に、単一転写産物は単一ポリペプチドに翻訳され、これは、プロテアーゼによって、抗DENVヒトIgGの重鎖および軽鎖に対応するポリペプチドに処理される。これらの重鎖および軽鎖ポリペプチドを、その後、機能性抗DENVヒトIgG、すなわち、その同種抗原に結合する抗体に組み立てる。
この構築物を発現ベクターpVAX1(すなわち、BamHIおよびXhoI部位)にクローニングすることで、プロモーターの制御下に置いた。抗デングウイルスヒトIgGをコードする構築物は、配列番号44(図38)に記載の核酸配列を持ち、これは、発現用に最適化されている。図38において、下線および二重下線は、構築物をpVAX1ベクターにクローニングするのに用いたBamHI(GGATCC)およびXhoI(CTCGAG)制限酵素部位を示し、太字は、開始(ATG)および終止(TGATAA)コドンを示す。最適化には、kozak配列(GCC ACC)の包含とコドン最適化とが含まれていた。配列番号44は、配列番号45および図39に記載のアミノ酸配列、すなわち、重鎖および軽鎖をプロテアーゼによって2つの別々のポリペプチドに分離する前の抗DENVヒトIgGのアミノ酸配列をコードする。
抗デングウイルスヒトIgGをコードする核酸配列を含むプラスミドをマウスに投与し、抗デングウイルスヒトIgGがin vivo(すなわち、マウス内)生成されたかどうか判断した。プラスミドの投与後、マウスから血清を得て、ELISAによって分析し、4つのデングウイルス血清型、すなわち、DENV-1、DENV-2、DENV-3、およびDENV-4由来のデング熱Eタンパク質に反応性のある抗体を血清が含んでいたかどうか判定した。図40に示すように、抗DENVヒトIgGをコードする核酸配列を含むプラスミドを投与されたマウスの血清は、血清型DENV-1、-2、-3、および-4由来のDENV Eタンパク質に反応性があった。同形抗体を陽性対照として用いた。従って、プラスミドをマウス内に導入した際に、抗DENVヒトIgGをコードする核酸配列を転写し、ポリペプチドに翻訳され、処理されることで、抗DENVヒトIgGの重鎖および軽鎖を含むポリペプチドを生成することが、これらのデータにより示された。これらのポリペプチドを抗DENVヒトIgGに組み立てることで、DENV Eタンパク質に結合するかまたは該タンパク質に反応性のある機能性抗体がもたらされた。
単一プラスミドの投与による抗DENVヒトIgGのin vivo生成をさらに調べるため、抗DENVヒトIgGをコードする核酸配列を含むプラスミドをマウスに注射投与した。具体的には、50μgまたは100μgのプラスミドをマウスに投与した。各群はマウス5匹であった。注射してから3日目および6日目に、マウスの血清反応反転を調べた。図41に示すように、両群のマウスは、抗DENV IgG抗体に対する血清反応が陽性であった。具体的には、50μgのプラスミドを投与されたマウスは、約110ng/mLのヒトIgGがあり、100μgのプラスミドを投与されたマウスは、約170ng/mLのヒトIgGがあった。従って、抗DENVヒトIgGをコードするプラスミドの投与後、抗DENVヒトIgGがin vivo生成されることが、これらのデータによりさらに実証された。また、抗DENVヒトIgG抗体産生が1週間以内に起こったことで、抗DENVヒトIgGを急速に産生できることが、これらのデータにより実証された。
前述の詳細な説明および添付の実施例は単に例証であり、添付された特許請求の範囲およびそれらの等価物によってのみ定義される本発明の範囲の限定としてみなすべきではないことが理解される。
開示された実施形態に対する、様々な変更および修正は当業者に明白であろう。そのような変更および修正は、本発明の化学構造、代替物、派生物、中間体、合成物、製剤および/または使用の方法に関するものを限定することなく含み、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。
Claims (52)
- 対象内での合成抗体の生成方法であって、
抗体またはその断片をコードする組み換え核酸配列を含む組成物を前記対象に投与することを含み、
前記組み換え核酸配列は前記対象内で発現されて前記合成抗体を生成する方法。 - 前記抗体が重鎖ポリペプチドまたはその断片、および軽鎖ポリペプチドまたはその断片を含む請求項1に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチドまたはその断片が第1の核酸配列によってコードされ、かつ、前記軽鎖ポリペプチドまたはその断片が第2の核酸配列によってコードされる請求項2に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列を含む請求項3に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が、前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列を単一転写産物として前記対象内で発現するプロモーターをさらに含む請求項4に記載の方法。
- 前記プロモーターがサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである請求項5に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が、プロテアーゼ切断部位をコードする第3の核酸配列をさらに含み、前記第3の核酸配列が前記第1の核酸配列および前記第2の核酸配列間に位置する請求項5に記載の方法。
- 前記対象のプロテアーゼが前記プロテアーゼ切断部位を認識し、切断する請求項7に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が前記対象内で発現されて抗体ポリペプチド配列を生成し、前記抗体ポリペプチド配列が、前記重鎖ポリペプチドまたはその断片、前記プロテアーゼ切断部位、および前記軽鎖ポリペプチドまたはその断片を含み、前記対象によって産生されたプロテアーゼが前記抗体ポリペプチド配列のプロテアーゼ切断部位を認識し、切断することで、開裂重鎖ポリペプチドおよび開裂軽鎖ポリペプチドを生成し、前記合成抗体が該開裂重鎖ポリペプチドおよび該開裂軽鎖ポリペプチドによって生成される請求項8に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が、第1の転写産物として前記第1の核酸配列を発現する第1のプロモーターと、第2の転写産物として前記第2の核酸配列を発現する第2のプロモーターとを含み、前記第1の転写産物が第1のポリペプチドに翻訳され、前記第2の転写産物が第2のポリペプチドに翻訳され、前記合成抗体が前記第1および第2のポリペプチドによって生成される請求項4に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターと前記第2のプロモーターが同一である請求項10に記載の方法。
- 前記プロモーターがサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである請求項11に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチドが可変重領域および定常重領域1を含む請求項2に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチドが、可変重領域、定常重領域1、ヒンジ領域、定常重領域2、および定常重領域3を含む請求項2に記載の方法。
- 前記軽鎖ポリペプチドが可変軽領域および定常軽領域を含む請求項2に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列がKozak配列をさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が免疫グロブリン(Ig)シグナルペプチドをさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記IgシグナルペプチドがIgEまたはIgGシグナルペプチドを含む請求項17に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が、配列番号1、2、5、41、43、45、46、47、48、49、51、53、55、57、59、および61の少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む請求項1に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が、配列番号3、4、6、7、40、42、44、50、52、54、56、58、60、62、および63の少なくとも1つの核酸配列を含む請求項1に記載の方法。
- 対象内での合成抗体の生成方法であって、
重鎖ポリペプチドまたはその断片をコードする第1の組み換え核酸配列および軽鎖ポリペプチドまたはその断片をコードする第2の組み換え核酸配列を含む組成物を前記対象に投与することを含み、
前記第1の組み換え核酸配列が前記対象内で発現されて第1のポリペプチドを生成し、前記第2の組み換え核酸配列が前記対象内で発現されて第2のポリペプチドを生成し、前記合成抗体が前記第1および第2のポリペプチドによって生成される方法。 - 前記第1の組み換え核酸配列が、前記第1のポリペプチドを前記対象内で発現する第1のプロモーターをさらに含み、前記第2の組み換え核酸配列が、前記第2のポリペプチドを前記対象内で発現する第2のプロモーターをさらに含む請求項21に記載の方法。
- 前記第1のプロモーターと第2のプロモーターが同一である請求項22に記載の方法。
- 前記プロモーターがサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである請求項23に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチドが可変重領域および定常重領域1を含む請求項21に記載の方法。
- 前記重鎖ポリペプチドが可変重領域、定常重領域1、ヒンジ領域、定常重領域2、および定常重領域3を含む請求項21に記載の方法。
- 前記軽鎖ポリペプチドが可変軽領域および定常軽領域を含む請求項21に記載の方法。
- 前記第1の組み換え核酸配列および前記第2の組み換え核酸配列がKozak配列をさらに含む請求項21に記載の方法。
- 前記第1の組み換え核酸配列および前記第2の組み換え核酸配列が免疫グロブリン(Ig)シグナルペプチドをさらに含む請求項21に記載の方法。
- 前記IgシグナルペプチドがIgEまたはIgGシグナルペプチドを含む請求項29に記載の方法。
- 対象内の疾患の予防または治療方法であって、
請求項1または21に記載の方法によって対象内での合成抗体を生成することを含む方法。 - 前記合成抗体が外来抗原に特異的である請求項31に記載の方法。
- 前記外来抗原がウイルス由来である請求項32に記載の方法。
- 前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルス(HIV)、チクングニヤウイルス(CHIKV)、またはデングウイルスである請求項33に記載の方法。
- 前記ウイルスがHIVである請求項34に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が、配列番号1、2、5、46、47、48、49、51、53、55、および57の少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む請求項35に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が、配列番号3、4、6、7、50、52、55、56、62、63、および64の少なくとも1つの核酸配列を含む請求項35に記載の方法。
- 前記ウイルスがCHIKVである請求項34に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が、配列番号59および61の少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む請求項38に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が、配列番号58および60の少なくとも1つの核酸配列を含む請求項38に記載の方法。
- 前記ウイルスがデングウイルスである請求項34に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が、配列番号45の少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む請求項41に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が、配列番号44の少なくとも1つの核酸配列を含む請求項41に記載の方法。
- 前記合成抗体が自己抗原に特異的である請求項31に記載の方法。
- 前記自己抗原がHer2である請求項44に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が、配列番号41および43の少なくとも1つのアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む請求項45に記載の方法。
- 前記組み換え核酸配列が、配列番号40および42の少なくとも1つの核酸配列を含む請求項45に記載の方法。
- 請求項1~47に記載の方法のいずれか1つによって産生された産物。
- 前記産物が、機能性抗体を発現可能な単一DNAプラスミドである請求項48に記載の産物。
- 前記産物が、in vivo結合して機能性抗体を形成する機能性抗体の構成要素を発現可能な2つの異なるDNAプラスミドからなる請求項48に記載の産物。
- 病原体による感染からの対象の治療方法であって、
前記病原体に特異的な合成抗体をコードするヌクレオチド配列を投与することを含む方法。 - 前記病原体の抗原を投与して前記対象内で免疫応答を生成することをさらに含む請求項51に記載の方法。
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