BR112016013493B1 - Molécula de ácido nucleico, composição, e, uso da molécula de ácido nucleico - Google Patents

Molécula de ácido nucleico, composição, e, uso da molécula de ácido nucleico Download PDF

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Abstract

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, COMPOSIÇÃO, VACINA, E, USO DA MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO. É divulgada neste documento uma composição incluindo uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica um anticorpo. Também é divulgado neste documento um método para gerar um anticorpo sintético em um sujeito ao administrar a composição ao sujeito. A divulgação também fornece um método para prevenir e/ou tratar a doença em um sujeito usando dita composição e método de geração.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Internacional No. PCT/US2013/75137, depositado em 13 de dezembro de 2013, que é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
CAMPO TÉCNICO
[002] A presente invenção se relaciona a uma composição compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos recombinante para gerar um anticorpo sintético, ou fragmentos deste, IN VIVO, e um método para prevenir e/ou tratar doença em um sujeito ao se administrar dita composição.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[003] A molécula de imunoglobulina compreende por dois de cada tipo cadeia leve (L) e pesada (H), que são ligadas de forma covalente por ligações de bissulfeto (mostradas como S-S) entre resíduos de cisteína. Os domínios variáveis da cadeia pesada (VH) e da cadeia leve (VL) contribuem para o local de ligação da molécula de anticorpo. A região constante da cadeia pesada é feita de três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3) e a região de dobradiça (flexível). A cadeia leve também tem um domínio constante (CL). As regiões variáveis das cadeias pesada e leve compreendem quatro regiões de estrutura (FRs; FR1, FR2, FR3 e FR4) e três regiões determinantes de complementaridade (CDRs; CDR1, CDR2 e CDR3). Por conseguinte, há sistemas genéticos muito complexos que têm sido difíceis de agregar IN VIVO.
[004] Anticorpos monoclonais alvo (mAbs) representam um dos mais importantes avanços terapêuticos medicinais dos últimos 25 anos. Este tipo de terapia com base imune é agora usado de forma rotineira contra um hospedeiro de doenças autoimunes, tratamento de câncer, assim como doenças infecciosas. Para malignidades, muitas das terapias com base em imunoglobulinas (Ig) usadas atualmente são em combinação com regimes de quimioterapia citotóxica contra tumores. Esta abordagem de combinação melhorou significativamente a sobrevivência total. Múltiplas preparações de mAb são licenciadas para uso contra cânceres específicos, incluindo Rituxan (Rituximab), um mAb quimérico tendo como alvo CD20 para o tratamento do linfoma não-Hodgkin e Ipilimumab (Yervoy), um mAb humano que bloqueia CTLA-4 e que foi usado para o tratamento do melanoma e outras malignidades. Adicionalmente, o Bevacizumab (Avastin) é outro mAb humanizado proeminente que tem como alvo VEGF e neovascularização de tumor e tem sido usado para o tratamento de câncer colorretal. Talvez o perfil mais alto de mAb para o tratamento de um tumor maligno seja Trastuzumab (Herceptin), uma preparação humanizada tendo como alvo Her2/neu que demonstrou-se ter considerável eficácia contra câncer de mama em um subconjunto de pacientes. Além do mais, um hospedeiro de mAbs está em uso para o tratamento de doenças auto-imunes e de sangue específicas.
[005] Além de tratamentos contra câncer, transferência passiva de Igs policlonais media a eficácia protetora contra um número de doenças infecciosas incluindo difteria, hepatite A e B, raiva, tétano, catapora e vírus sincicial respiratório (RSV). Na verdade, várias preparações policlonais de Ig proveem proteção temporária contra agentes infecciosos específicos em indivíduos que viajam para áreas endêmicas de doença em circunstâncias quando há tempo insuficiente para Igs protetoras serem geradas através de vacinação ativa. Além do mais, em crianças com imunodeficiência, o Palivizumab (Synagis), um mAb que tem como alvo infecção pelo RSV, tem demonstrado proteger clinicamente contra RSV.
[006] Tratamentos à base de anticorpos não são imunes a riscos. Um risco desse tipo é a potencialização dependente de anticorpos (ADE), que ocorre quando proteínas antivirais não neutralizantes facilitam a entrada de vírus nas células hospedeiras, levando a uma infecciosidade aumentada das células. Algumas células não têm os receptores habituais em suas superfícies que os vírus usam para conseguir a entrada. As proteínas antivirais (isto é, os anticorpos) se ligam aos receptores de Fc de anticorpos que algumas dessas células têm na membrana do plasma. Os vírus se ligam ao local de ligação de antígeno na outra extremidade do anticorpo. Este vírus pode usar este mecanismo para infectar macrófagos humanos, causando uma infecção viral normalmente ligeira a tornar-se com risco de vida. O exemplo mais amplamente conhecido de ADE ocorre no estabelecimento de infecção com o vírus da dengue (DENV). É observado quando alguém anteriormente infectado com um sorotipo de DENV fica infectado por vários meses ou anos mais tarde com um sorotipo diferente. Em tais casos, o curso clínico da doença é mais grave, e essas pessoas têm viremia maior em comparação àquelas em que o ADE não ocorreu. Isso explica a observação de que, enquanto as infecções primárias (primeiras causam a maioria das doenças menores (DF) em crianças, a infecção secundária (reinfecção em uma data posterior) é mais propensa a estar associada com a doença grave (DHF e/ou DSS) em crianças e adultos. Existem quatro serotipos antigenicamente diferentes de DENV (DENV-1 - DENV-4). A infecção com DENV induz a produção de anticorpos neutralizantes de imunoglobulina homotípica G (IgG) que proporcionam imunidade vitalícia contra o serotipo infectante. A infecção com DENV também produz certo grau de imunidade de proteção cruzada contra os outros três sorotipos. Além da indução de anticorpos neutralizantes heterotípicos, a infecção com DENV também podem induzir anticorpos heterotípicos que neutralizam o vírus apenas parcialmente ou não. A produção desses anticorpos de reação cruzada, mas não-neutralizantes pode ser a causa de mais infecções secundárias graves. Uma vez dentro nos glóbulos brancos, o vírus replica sem ser detectado e, por fim, gera títulos de vírus bastante elevados, causando a doença grave.
[007] O impacto clínico da terapia de mAb é impressionante. Entretanto, permanecem questões que limitam o uso e disseminação desta abordagem terapêutica. Alguns destes incluem o alto custo de produção destes complexos biológicos que podem limitar a sua utilização na população mais ampla, particularmente nos países em desenvolvimento, onde eles podem ter um grande impacto. Além do mais, a exigência freqüente para repetir as administrações dos mAbs para obter e manter a eficácia pode ser um impedimento em termos de logística e adesão do paciente. Novos anticorpos capazes de reduzir ou eliminar a baixa eficácia in vivo de anticorpos terapêuticos devido à competição com IgG de soro são necessários. Novos anticorpos que possam eliminar a potencialização dependente de anticorpos em vírus como dengue, HIV, RSV e outros são necessários. Anticorpos biespecíficos, anticorpos bifuncionais e cocktails de anticorpos são necessários para executar várias funções que poderiam se mostrar terapêuticas ou profiláticas. Adicionalmente, a estabilidade em longo prazo destas formulações de anticorpo é frequentemente curta e menos do que ideal. Deste modo, ainda há uma necessidade na técnica de uma molécula de anticorpo sintético que pode ser entregue a um sujeito de maneira segura e rentável. SUMÁRIO
[008] A presente invenção é voltada a uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo sintético que compreende uma sequência de ácidos nucleicos tendo pelo menos cerca de 95% de identidade ao longo de todo um comprimento da sequência de ácidos nucleicos selecionado a partir do grupo consistindo em: (a) uma sequência de ácidos nucleicos tal como estabelecida em SEQ ID NO: 44; (b) uma sequência de ácidos nucleicos tal como estabelecida em SEQ ID NO: 67; (c) uma sequência de ácidos nucleicos tal como estabelecida em SEQ ID NO: 69; (d) uma sequência de ácidos nucleicos tal como estabelecida em SEQ ID NO: 71; (e) uma sequência de ácidos nucleicos tal como estabelecida em SEQ ID NO: 73; (f) uma sequência de ácidos nucleicos tal como estabelecida em SEQ ID NO: 75; (g) uma sequência de ácidos nucleicos tal como estabelecida em SEQ ID NO: 77; (h) uma sequência de ácidos nucleicos tal como estabelecida em SEQ ID NO: 58; (i) uma sequência de ácidos nucleicos tal como estabelecida em SEQ ID NO: 60; e (j) uma sequência de ácidos nucleicos tal como estabelecida em SEQ ID NO: 65. A presente invenção se dirige ainda a um método de prevenção de uma doença num sujeito com necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração da molécula de ácido nucleico acima ao indivíduo. A presente invenção se dirige ainda a um método de tratamento de uma doença num sujeito com necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração da molécula de ácido nucleico acima ao indivíduo.
[009] A presente invenção também é voltada a uma molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo sintético que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína com pelo menos cerca de 95% de identidade ao longo de todo um comprimento da sequência de ácidos nucleicos selecionado a partir do grupo consistindo em: (a) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 45; (b) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 68; (c) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 70; (d) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 72; (e) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 74; (f) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 76; (g) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 78; (h) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 59; (i) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 61; e (j) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 66. A presente invenção também é voltada para uma composição que compreende a molécula de ácido nucleico acima. A presente invenção se dirige ainda a um método de prevenção de uma doença num sujeito com necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração da molécula de ácido nucleico acima ao indivíduo. A presente invenção se dirige ainda a um método de tratamento de uma doença num sujeito com necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração da molécula de ácido nucleico acima ao indivíduo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0010] A FIG. 1 mostra a sequência de ácidos nucleicos codificando uma cadeia pesada de IgG conforme descrito no Exemplo 1.
[0011] A FIG. 2 mostra a sequência de ácidos nucleicos codificando uma cadeia leve de IgG conforme descrito no Exemplo 1.
[0012] A FIG. 3 mostra um gráfico que representa o tempo (horas) vs. OD de 450 nm (1:100 de diluição do sobrenadante da cultura de tecido).
[0013] A FIG. 4 mostra uma imagem de um Western blot.
[0014] A FIG. 5 mostra a geração e a confirmação da expressão de pHIV-1Env-Fab. (A & B) Mapa de plasmídeo circular de construção de expressão de pHIV-1 Env Fab anti-gp120 Fab foi projetado usando genes de Ig de cadeia variável pesada (H) e leve (L) VRC01. Várias modificações foram incluídas ao construir os plasmídeos Fab a fim de aumentar o nível de expressão. O Fab VL e genes de fragmento de VH, conforme mostrado, foram clonados separadamente entre os locais de restrição BamH1 e Xho1 do vetor pVax1. (C)Expressão in vitro de pHIV-1 Env Fab. O gráfico indicou a cinética temporal da expressão do pHIV-1 Env Fab após transfecção de células 293T. Os valores indicados, indicativo de expressão, são médios de OD450nm ± SD de poços triplicados. Como um controle, células 293T também foram transfectadas com a cadeia principal de pVax1.
[0015] A FIG. 6 mostra a medição de geração temporal de anti-HIV Env Fab específico por pHIV-1 Env Fab. (A) Curso de tempo de geração de anti-HIV1 Fab. Após administração de pHIV-1 Env Fab, a produção do Fab específico foi medida ao longo de 10 dias nos soros em uma diluição final de 1:100 por ELISA e apresentada como OD450nm. Os soros de camundongos administrados com pVax1 foram usados como um controle negativo. (B) Medição comparativa de respostas de anticorpo anti-gp120 após a imunização com gp120 recombinante (rgp120). Conforme descrito no Exemplo 2, os camundongos foram imunizados com uma única injeção de rgp120 seguido por medição de produção de anticorpos anti-gp120 até 10 dias e apresentaram como valores OD450nm. PBS foi usado como uma injeção de controle negativo para este estudo. (C) Confirmação de ligação de HIV1Env-Fab por análise de imunoblot. Conforme indicado no Exemplo, ou 5 ou 10μg de gp120 foram sujeitos a SDS-PAGE e borramento de nitrocelulose seguido por incubação dos borrões com soros de pHIV-1 Env Fab administrado a camundongos. O imunoblot indicou que os soros experimentais reconheceram rgp120 ligado, confirmando a especificidade do Fab gerado. (D) Quantificação temporal de IgG1Fab humano, medido como IgG1 em soros de camundongo após a administração de pHIV-1Env-Fab. IgG1 foi medido por um kit de ELISA padrão, nos momentos indicados e expresso como Fab (μg/mL) ± SD. Os soros de camundongos administrados com pVax-1 foram usados como um controle negativo. As amostras de soros foram analisadas nos momentos indicados no eixo x. A seta mostrada nos gráficos exibidos em (A), (B) e (D) indicam o ponto de administração de plasmídeo de DNA.
[0016] A FIG. 7 mostra a análise de ligação de FACS HIV1 Env Fab a glicoproteína de HIV Env subtipo A. (A) FACS faz a varredura indicando ligação de anti-HIV1Env-Fab a glicoproteína de HIV-1 subtipo A Env. DNA expressando ou um envelope de HIV-1 de subtipo A consensual (pCon-Env- A) ou "otimizado" (pOpt-Env-A) foi transfectado em células 293T. Dois dias pós-transfecção, células estavam manchadas ou com qualquer Ig de VRC01 nativo purificado, soros gerados a partir de pHIV-1 Env Fab (coletado 48 horas após a administração um plasmídeo único) ou Ig de controle gerado a partir de administração de pIgG-E1M2. Soros e anticorpo VRC01 foram diluídos 1:4 ou 1:100, respectivamente, em 50μl de PBS e incubados a temperatura ambiente por 30 minutos. As células foram então coradas com as Igs conjugadas de ficoeritrina secundária apropriada (PE) e posteriormente fechadas para análise de FACS como células únicas e vivas. A ligação percentual de células positivas foi indicada em cada uma das varreduras. (B) Representação gráfica dos dados de ligação de FACS. O número de células coradas (isto é, indicativo de níveis de expressão) em cada um dos grupos testados de Ig/soros foi dividido pelos valores de coloração de fundo e apresentado como percentual de ligação específica no eixo y, como uma função das diferentes preparações de HIV subtipo A Env testado.
[0017] A FIG. 8 mostra o curso de tempo de neutralização de HIV-1 por soros de camundongos administrados com pHIV-1Env-Fab. Soros usados para a análise de soros de atividade de neutralização foram coletados nos momentos indicados nos gráficos. A análise de neutralização foi conduzida em células TZM-BL usando um painel de vírus de pseudotipo HIV-1: Bal26 (painel A; subtipo B, nível 1), Q23Env17 (painel B; subtipo A, nível 1), SF162S (painel C; subtipo B, nível 1) e ZM53M (painel D; subtipo C, nível 2). As células foram infectadas em um MOI de 0,01 como delineado no Exemplo 2 e incubadas na presença de soros (diluição final de 1:50) contendo Fab gerado a partir de administração de pHIV-1 Env Fab. Valores de neutralização percentual são mostrados, cujo cálculo foi descrito no Exemplo 2. Em adição, linhas horizontais são providas em cada um dos gráficos indicando os momentos aproximados em que os soros experimentais mediaram 50% de neutralização viral.
[0018] A FIG. 9 mostra a sequência de ácidos nucleicos codificando a cadeia pesada (VH-CH1) do HIV-1 Env Fab descrita nos Exemplos 2 a 7.
[0019] A FIG. 10 mostra a sequência de ácidos nucleicos codificando a cadeia leve (VL-CL) do HIV-1 Env Fab descrita nos Exemplos 2 a 7.
[0020] A FIG. 11 mostra a imunofluorescência de células transfectadas com um plasmídeo codificando HIV Env. As células foram coradas com preparações de pVAX1 (painel esquerdo) ou pHIV-Env-Fab (painel direito).
[0021] A FIG. 12 mostra um tipo de plotagem do gráfico de antígeno versus concentração de soros (ng/mL).
[0022] A FIG. 13 mostra um esquema de uma construção codificando um anticorpo IgG1 humano sintético.
[0023] A FIG. 14 mostra um esquema do anticorpo agregado (mediante expressão) que é codificado pela construção da FIGURA 13.
[0024] A FIG. 15 mostra a sequência de aminoácido do VRC01 IgG.
[0025] A FIG. 16 mostra (A) um esquema da construção codificando HIV-1 Env-PG9 Ig; (B) um esquema do vetor contendo a construção de (A); e (C) uma imagem de um gel corado.
[0026] A FIG. 17 mostra (A) um esquema da construção codificando HIV-1 Env-4E10 Ig; (B) um esquema do vetor contendo a construção de (A); e (C) uma imagem de um gel corado.
[0027] A FIG. 18 mostra a sequência de aminoácido de HIV-1 Env- PG9 Ig antes de clivagem por furina.
[0028] A FIG. 19 mostra a sequência de aminoácido de HIV-1 Env- 4E10 Ig antes de clivagem por furina.
[0029] A FIG. 20 mostra (A) um esquema de uma construção codificando a cadeia pesada (VH-CH1) de CHIKV-Env-Fab; e (B) um esquema de uma construção codificando a cadeia pesada (VL-CL) de CHIKV-Env-Fab.
[0030] A FIG. 21 mostra um esquema de um vetor de expressão contendo a construção codificando a cadeia pesada (VH-CH1) ou leve (VLCL) de CHIKV-Env-Fab.
[0031] A FIG. 22 mostra um gráfico traçando tempo em horas (h) vs OD450 nm.
[0032] A FIG. 23 mostra uma imagem de um imunoblot.
[0033] A FIG. 24 mostra um esquema do horário de administração de DNA e obtenção do pré-sangramento e sangramentos.
[0034] A FIG. 25 mostra um gráfico traçando o tempo em dias vs OD450 nm.
[0035] A FIG. 26 mostra um gráfico traçando os dias após desafio versus sobrevivência percentual.
[0036] A FIG. 27 mostra um gráfico traçando o grupo de camundongo versus pg/ml de TNF-α.
[0037] A FIG. 28 mostra um gráfico traçando o grupo de camundongo versus pg/ml de IL-6.
[0038] A FIG. 29 mostra um esquema ilustrando uma construção codificando um VH-CH1 e sob o controle de um promotor.
[0039] A FIG. 30 mostra um esquema ilustrando uma construção codificando um VL-CL e sob o controle de um promotor.
[0040] A FIG. 31 mostra um esquema ilustrando a construção codificando um VH-CH1 ou VL-CL do anti-Her-2 Fab clonado em um vetor de expressão.
[0041] A FIG. 32 mostra a sequência de ácidos nucleicos codificando o VH-CH1 do anti-Her-2 Fab.
[0042] A FIG. 33 mostra a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ácidos nucleicos da FIGURA 32 (isto é, a sequência de aminoácido do VH-CH1 do anti-Her-2 Fab).
[0043] A FIG. 34 mostra a sequência de ácidos nucleicos codificando o VL-CL do anti-Her-2 Fab.
[0044] A FIG. 35 mostra a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ácidos nucleicos da FIGURA 34 (isto é, a sequência de aminoácidos de VL-CL do Fab anti-Her-2).
[0045] A FIG. 36 mostra um tipo de gráfico representando células transfectadas vs A concentração de IgG (μg/mL).
[0046] A FIG. 37 mostra um esquema ilustrando uma construção codificando a região pesada variável (VH), região constante pesada variável 1 (CH1), região de dobradiça, região constante pesada variável 2 (CH2), constante pesada variável 3 (CH3) de uma cadeia pesada de imunoglobulina G (IgG) e codificando a região leve variável (VL) e a região constante leve variável (CL) de uma cadeia leve de IgG. As cadeias pesadas e leves de IgG são separadas por um local de clivagem de protease e cada uma é precedida por um peptídeo sinal (codificado por sequência principal).
[0047] A FIG. 38 mostra uma sequência de ácidos nucleicos codificando a IgG humana de vírus Anti-Dengue (DENV).
[0048] A FIG. 39 mostra a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ácidos nucleicos da FIGURA 39 (isto é, a sequência de aminoácido da IgG humana anti-DENV). Nesta sequência de aminoácidos, a clivagem de protease ainda não ocorreu para separar as cadeias pesadas e leves em dois polipeptídeos separados.
[0049] A FIG. 40 mostra um gráfico representando o grupo camundongo vs OD de 450 nm.
[0050] A FIG. 41 mostra um gráfico representando os dias pós- injeção versus concentração de IgG humana (ng/mL).
[0051] A FIG. 42 mostra a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ácidos nucleicos da FIGURA 1 (isto é, SEQ ID NO:6). Esta sequência de aminoácido é a sequência de aminoácido da cadeia pesada de IgG descrita no Exemplo 1 abaixo.
[0052] A FIG. 43 mostra a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ácidos nucleicos da FIGURA 2 (isto é, SEQ ID NO:7). Esta sequência de aminoácidos é a sequência de aminoácido da cadeia leve de IgG descrita no Exemplo 1 abaixo.
[0053] A FIG. 44 mostra a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ácidos nucleicos da FIGURA 9 (isto é, SEQ ID NO:3). Esta sequência de aminoácido é a sequência de aminoácido da cadeia pesada (VH- CH1) de HIV-1 Env-Fab descrita nos Exemplos 2 a 7.
[0054] A FIG. 45 mostra a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ácidos nucleicos da FIGURA 10 (isto é, SEQ ID NO:4). Esta sequência de aminoácido é a sequência de aminoácido da cadeia leve (VLCL) de HIV-1 Env-Fab descrita nos Exemplos 2 a 7.
[0055] A FIG. 46 mostra a sequência de ácidos nucleicos codificando a cadeia única de HIV-1 PG9 Fab (scFab), descrita no Exemplo 11 abaixo.
[0056] A FIG. 47 mostra a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ácidos nucleicos da FIGURA 46 (isto é, SEQ ID NO:50). Esta sequência de aminoácido é a sequência de aminoácido do HIV-1 PG9 scFab descrita no Exemplo 11 abaixo.
[0057] A FIG. 48 mostra a sequência de ácidos nucleicos codificando a cadeia única de HIV-1 4E10 Fab (scFab), descrita no Exemplo 13 abaixo.
[0058] A FIG. 49 mostra a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ácidos nucleicos da FIGURA 48 (isto é, SEQ ID NO: 52 Esta sequência de aminoácido é a sequência de aminoácido do HIV-1 4E10 scFab descrita no Exemplo 13 abaixo.
[0059] A FIG. 50 mostra um esquema ilustrando uma construção codificando a região pesada variável (VH), região constante pesada variável 1 (CH1), região de dobradiça, região constante pesada variável 2 (CH2), constante pesada variável 3 (CH3) de uma cadeia pesada de imunoglobulina G (IgG). A sequência de ácidos nucleicos codificando a cadeia pesada de IgG é precedida por uma sequência principal.
[0060] A FIG. 51 mostra um esquema ilustrando uma construção codificando a região leve variável (VL) e a região constante leve variável (CL) de uma cadeia leve de IgG. A sequência de ácidos nucleicos codificando a cadeia leve de IgG é precedida por uma sequência principal.
[0061] A FIG. 52 mostra a sequência de ácidos nucleicos codificando a cadeia pesada de IgG1 de HIV-1 VRC01 descrita no Exemplo 9 abaixo.
[0062] A FIG. 53 mostra a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ácidos nucleicos da FIGURA 52 (isto é, SEQ ID NO:54). Esta sequência de aminoácido é a sequência de aminoácido da cadeia pesada de IgG1 de HIV-1 VRC01 descrita no Exemplo 9 abaixo.
[0063] A FIG. 54 mostra a sequência de ácidos nucleicos codificando a cadeia leve de IgG de HIV-1 VRC01 descrita no Exemplo 9 abaixo.
[0064] A FIG. 55 mostra a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ácidos nucleicos da FIGURA 54 (isto é, SEQ ID NO:56). Esta sequência de aminoácido é a sequência de aminoácido da cadeia leve de IgG1 de HIV-1 VRC01 descrita abaixo no Exemplo 9.
[0065] A FIG. 56 mostra a sequência de ácidos nucleicos codificando a cadeia pesada (VH-CH1) do CHIKV-Env-Fab descrita abaixo no Exemplo 14.
[0066] A FIG. 57 mostra a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ácidos nucleicos da FIGURA 56 (isto é, SEQ ID NO:58). Esta sequência de aminoácido é a sequência de aminoácido da cadeia pesada (VH- CH1) de CHIKV-Env-Fab descrita no Exemplo 14 abaixo.
[0067] A FIG. 58 mostra a sequência de ácidos nucleicos codificando a cadeia leve (VL-CL) do CHIKV-Env-Fab descrita no Exemplo 14.
[0068] A FIG. 59 mostra a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ácidos nucleicos da FIGURA 58 (isto é, SEQ ID NO:60). Esta sequência de aminoácido é a sequência de aminoácido da cadeia leve (VLCL) de CHIKV-Env-Fab descrita no Exemplo 14 abaixo.
[0069] A FIG. 60 mostra a sequência de ácidos nucleicos codificando Ig de HIV-1 Env-4E10 descrita no Exemplo 12 abaixo.
[0070] A FIG. 61 mostra a sequência de ácidos nucleicos codificando Ig de HIV-1 Env-PG9 descrita no Exemplo 10 abaixo.
[0071] A FIG. 62 mostra a sequência de ácidos nucleicos codificando IgG de VRC01 (SEQ ID NO: 4).
[0072] A FIG. 63 mostra a estrutura esquemática de plasmídeos de expressão de anticorpos e a confirmação da expressão e da cinética de anticorpos que se ligam após uma única injeção EP mediada do plasmídeo de expressão de CHIKV-Fab. (A) Os genes de fragmento IgG variáveis leve e pesado (VL e VH) de um anticorpo monoclonal humano anti-CHIKV selecionado foram clonados separadamente para CHIKV-Fab e CHIKV-IgG em vectores plasmídicos de DNA otimizado. (B) Os plasmídeos de DNA que codificam os genes anti-CHIKV VL e VH-Fab ou CHIKV-IgG foram transfectadas em células 293T em conjunto a fim de determinar a respectiva expressão in vitro por meio de ELISA. As células transfectadas com um plasmídeo de controle pVAX1 vazio serviram como controle negativo. (C) A expressão in vivo de anticorpos anti-IgG CHIKV após a distribuição mediada por EP. Os camundongos (B6.Cg-Foxn1nu/J) receberam injeções intramusculares únicas de plasmídeos CHIKV-IgG (100 ug total), seguido de EP (n = 5 camundongos por grupo). A injeção de um vector pVAX1 vazio foi utilizada como controle negativo. (D) A ligação específica ao antígeno CHIKV-Env foi medida através de ensaios de ELISA com soros coletados a partir de camundongos CHIKV-IgG e CHIKV-env recombinante imunizados e apresentados como valores de OD de 450nm para camundongos individuais em diferentes pontos de tempo. (E) Os níveis de sotos de concentração de IgG humano foram medidos em vários pontos de tempo em camundongos injetados por via intramuscular com CHIKV-IgG, como descrito no Exemplo 17. (F) Avaliação da especificidade e afinidade de ligação a anticorpos. A funcionalidade de afinidade de ligação dos soros dos camundongos injetados com CHIKV-IgG (dia 14) para proteínas alvo foi testada por Western blot utilizando lisados celulares de células infectados com CHIKV, como descrito nos Exemplos abaixo.
[0073] A FIG. 64 mostra a expressão e a cinética de ligação de IgG após uma injeção única mediada por eletroporação do plasmídeo de expressão de CHIKV-IgG. (A) Os soros dos camundongos que receberam CHIKV-Fab eram específicos para o antígeno CHIKV-Env. As placas de ELISA foram revestidas com proteína CHIKV-Env ou HIV-1 Env recombinante (subtipo B; MN) e soros de ratos injetados com CHIKV-IgG ou pVAX1 foram obtidos, como indicado após a primeira injeção. A ligação específica ao antígeno CHIKV-Env foi medida através de ensaios de ELISA com soros coletados e apresentados como valores de OD de 450nm para camundongos individuais em diferentes pontos de tempo. (B) Os resultados do ensaio de imunofluorescência (IFA) demonstraram que o CHIKV-Fab gerados a partir de camundongos que receberam CHIKV-Fab foi capaz de se ligar à glicoproteína de CHIKV-Env. As células Vero infectadas com CHIKV foram fixadas 24 horas após a infecção e foram seguidas de um ensaio de imunofluorescência para detectar a expressão do antígeno de CHIKV-Env. Os núcleos das células foram manchadas com DAPI. Quantidades moderadas de expressão da proteína de CHIKV-Env foram observadas em células Vero com anticorpo CHIKV-Fab. Soros de camundongos imunizados com pVAX1 foram usados como controle negativo. (C) Análise FACS da ligação de soros de camundongos injetados com plasmídeos quanto a células infectadas. O eixo X indicou a coloração de GFP utilizando o pseudovírus GFP lentiviral complementado com CHIKV-Env. O eixo y apresentou coloração de IgG humano testado produzido em camundongos. As células duplo-positivas foram um indicativo/uma medida dos soros que se ligam às células infectadas com CHIKV.
[0074] A FIG. 65 mostra que os soros de camundongos injetados com CHIKV-IgG mais EP apresentaram uma atividade neutralizante contra cepas de CHIKV múltiplas. (A-F) Mostram a atividade neutralizante dos soros de camundongos administrados com CHIKV-IgG com EP que foi medida em relação a seis diferentes cepas virais de CHIKV: Ross, LR2006-OPY1, IND- 63-WB1, PC-08, B448-China e Bianchi. Títulos de anticorpos neutralizantes (nAb) foram representados graficamente como a mais alta diluição de soro que resulto em pelo menos 50% de inibição de CPE nas células Vero. Resultados semelhantes foram observados em 2 experiências independentes, com pelo menos 10 camundongos para cada experimento. Os valores de IC50 foram realizados com o software GraphPad Prism.
[0075] A FIG. 66 mostra a durabilidade de anticorpos de IgG anti- CHIKV-Env e soro e respostas de IgG mucosal após a imunização com CHIKV-Fab, bem como a expressão de IgG e estudos de desafio. (A) Representação esquemática das imunizações de plasmídeos de IgG e desafio de CHIKV. (BC) Os camundongos BALB/c foram injetados com pVAX1, CHIKV-IgG ou CHIKV-Fab no dia 0 e desafiados no dia 2 (B) ou no dia 30 (C) com a cepa CHIKV-Del-03 (JN578247) de CHIKV (1x107 PFU em um volume total de 25 μl). Os camundongos foram monitorados diariamente e as taxas de sobrevivência foram registradas durante 20 dias após o desafio viral. (DE) Proteção de camundongos a partir de uma via diferente da infecção viral de CHIKV. Dois grupos de camundongos foram imunizados com 100 μg de CHIKV-IgG por injeção intramuscular (IM) e foram desafiados no dia 2 com injeção subcutânea (s.c.) (D) e um outro grupo de camundongos foi desafiado por via intranasal (i.n.). (E) Inoculação com CHIKV. Os camundongos foram monitorados diariamente e as taxas de sobrevivência foram registradas durante 20 dias após o desafio viral. $ indicou administração de DNA; O indicou desafio de vírus. Cada grupo consistia em 10 camundongos e os resultados foram representativos de 2 experimentos independentes.
[0076] A FIG. 67 apresenta uma proteção imediata e persistente através de estudos de desafio de CHIKV. (A) Representação esquemática da vacinação com CHIKV-IgG e estudos de desafio. Desafio do grupo I: Os camundongos BALB/c foram injetados com CHIKV-IgG, CHIKV-Env ou pVax1 no dia 0 e desafiados no dia 2 ou no dia 30 com a cepa viral CHIKV- Del-03 (JN578247) (1x107 PFU em um volume total de 25 μl). Desafio do grupo II: Os camundongos BALB/c receberam imunização simples de CHIKV-IgG no dia 0 ou múltiplas imunizações com CHIKV-Env nos dias indicados e em seguida desafiados no dia 35 sob as mesmas condições do desafio do grupo I. $ indicou administração de DNA; O indicou desafio de vírus. Para cada estudo, os camundongos foram monitorados por 20 dias e as taxas de sobrevivência foram registradas. (B) Curva de sobrevivência do estudo de desafio do grupo I. Observe-se que houve um registro de 100% de sobrevivência nos camundongos imunizados com CHIKV-IgG. (C) A curva de sobrevivência dos camundongos do estudo de desafio do grupo II. (D) As concentrações dos níveis de IgG humano anti-CHIKV foram medidos em pontos de tempo indicados após imunização com CHIKV-IgG mais EP. (E) Indução de anticorpos anti-CHIKV-Env persistentes e sistêmicos após imunização com CHIKV-IgG e CHIKV-Env em camundongos.
[0077] A FIG. 68 mostra a produção ex vivo de citocinas em resposta á infecção com CHIKV. (A) Títulos virais em camundongos administrados com CHIKV-IgG e CHIKV-Env do estudo de desafio do grupo II no dia 45 (ou seja, 10 dias após o desafio). Cada ponto de dados representou os títulos virais médios de 10 camundongos. Um grupo de camundongos imunizados com pVAX1 serviu como controle. As cargas virais foram significativamente reduzidas em CHIKV-IgG (p = 0,0244) e CHIKV-env (p = 0,0221) em comparação com os camundongos pVAX1. (B e C) Caracterização dos níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias (TNF-a e IL-6) a partir de camundongos infectados com CHIKV. Os níveis de citocinas foram medidos nos camundongos no dia 45 (15 dias após o desafio) por ensaios ELISA específicos. Os camundongos injetados com CHIKV-IgG ou CHIKV-Env tiveram níveis de soro semelhantes e significativamente mais baixos de TNF- α e IL-6 do que o grupo de controle (p <0,0001). Os dados representaram a média de 3 poços por camundongo (n = 10 por grupo). (D) Respostas de células T em esplenócitos de camundongos imunizados com CHIKV-IgG ou a imunização com CHIKV-Env dos camundongos e em seguida estimulados com peptídeos específicos de CHIKV. Os dados mostrados foram representativos de pelo menos 2 experimentos separados.
[0078] A FIG. 69 mostra a expressão in vitro de anticorpos humanos anti-DENV que neutralizam os mAbs administrados por um construto de DNA que codifica o anticorpo. (A) Ilustração esquemática do plasmídeo de DNA usado para a distribuição; sequências de cadeia leve e pesada de anticorpos são separadas por uma combinação de locais de clivagem 2A e furina. (B) Análise de quantificação por ELISA de IgG humano em sobrenadantes de células 293T transfectadas com LALA ou pDVSF-3-WT. (C) Análise Western blot de sobrenadas 293T transfectados com pDVSF-3- WT contendo DVSF-3 WT. Os anticorpos foram purificados por colunas de giro de proteína A e separadas por SDS-PAGE sob condições redutoras (à esquerda) e não redutoras (à direita). (d) As células Vero permaneceram sem infecção (Mock) ou foram infectadaspor por DENV1, 2, 3 ou 4 e em seguida fixadas, permeabilizadas e coradas com sobrenadantes de células 293T transfectadas com LALA ou pDVSF-3-WT.
[0079] A FIG. 70 mostra os resultados em uma expressão de longo prazo de anticorpos de DENV neutralizantes em soro de camundongo. (A) Os níveis totais detectáveis por soro de IgG humano foram medidos por ELISA após uma única injeção intramuscular de plasmídeo de DNA que codifica o anticorpo de IgG humano anti-DENV DVSF-1 em camundongos imunodeficientes Foxn1/NuJ. níveis de IgG humano entre as semanas 0-4 (à esquerda) e na semana 19 (à direita). Cada linha (esquerda) ou ponto (direita) representa um camundongo individual (n = 5). (B) IgG humano total em soro foi medido por ELISA após a injeção intramuscular de plasmídeos pDVSF 3- WT ou pDVSF-3 LALA em camundongos 129/Sv (n = 4-5 por grupo). (C) As células Vero permaneceram desinfectadas (Mock) ou infectadas por DENV1, 2, 3 ou 4, e em seguida foram fixadas, permeabilizadas e coradas com soro de camundongo 192/Sv colhidos nos dias 0 ou 7 pós-injeção de DNA de pDVSF- 3 WT ou pDVSF-3 LALA (n = 5 por grupo). (D) A neutralização foi avaliada por incubação de DENV1, 2, 3, ou 4, com diluições em série de 129 de soro de ratinho / Sv tomadas no dia 7 pós-injecção de ADN de qualquer uma das pDVSF-3 WT ou pDVSF-3 LALA (n = 5 por grupo ) antes da adição às células Vero. A porcentagem de células infectadas é mostrada.
[0080] A FIG. 71 mostra que a distribuição do construto de DNA que codifica o anticorpo protegeu contra a doença apenas com vírus e reforçada com anticorpos. (A) Desafio apenas com o vírus: Os camundongos AG129 receberam injeção intramuscular de um vetor vazio de pDVSF 3-WT, pDVSF-3 LALA ou pVax cinco dias antes do desafio com uma dose subletal de DENV2 S221 (n = 5-6 por grupo; p < 0,0084 para comparação entre pDVSF -3 LALA e pDVSF-3 WT). (B) Desafio de reforço dependente de anticorpos: Os camundongos AG129 receberam uma injeção intramuscular de um vetor vazio de pDVSF-3 WT, pDVSF-3 LALA ou pVax cinco dias antes da administração de uma dose de reforço de 2H2 mAb anti-DENV não- neutralizante. Trinta minutos mais tarde, os camundongos foram infectados com uma dose subletal de DENV2 S221 (n = 5-6 por grupo; p < 0,0072 por comparação entre pDVSF-3 LALA e pDVSF-3 WT). Uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meier é mostrada em (a-b).
[0081] A FIG. 72 mostra a análise funcional in vitro de anticorpos codificados por LALA e pDVSF-3 WT. (A) Análise de ligação por ELISA de IgG humano em sobrenadantes de células 293T transfectadas com LALA ou pDVSF 3-WT contra proteínas DENV E recombinantes purificadas. (B) O reforço dependente de anticorpo foi avaliado pela incubação de DENV1, 2, 3, 4 ou com diluições em série dos sobrenadantes de células 293T transfectadas com LALA ou pDVSF 3-WT antes da adição às células K562. A porcentagem de células infectadas é mostrada.
[0082] A FIG. 73 mostra os níveis pré-desafio dos níveis de IgG humanos de anti-DENV em camundongos AG129 após a distribuição do construto de DNA que codifica o anticorpo. (A) A IgG humana total de DVSF 3-WT ou DVSF-3 LALA em soro foi medida por ELISA 4 dias após a injeção intramuscular de DNA (um dia antes do desafio de DENV2) e EP dos respectivos plasmídeos em camundongos AG129 (n = 5-6 por grupo; p < 0,0005 para comparação entre pDVSF-3 WT e pVax; p < 0,0001 para comparação entre pDVSF-3 LALA e pVax).
[0083] A FIG. 74 mostra que a distribuição de múltiplos plasmídeos de codificação de anticorpo DENV em camundongos produziu mais antisoros DENV1-4. (A) A IgG humana total de DVSF-3 WT, DVSF-1 WT ou DVSF-3 WT e DVSF-1 WT em soro foi medida por ELISA, 7 dias depois da injeção intramuscular de DNA e EP dos respectivos plasmídeos em camundongos 129/Sv ( n = 5 por grupo; p < 0,0088 para comparação entre pDVSF-1 WT e pDVSF-1 3; p < 0,0240 para comparação entre pDVSF-3 WT e pDVSF-1+3).
[0084] A FIG. 75 mostra no painel superior que DVSF-3 WT se ligou ao FcyR1a humano, enquanto que DVSF-3 LALA não se ligou ao FcyR1a. Os painéis de fundo 4 mostram os resultados do ensaio de reforço dependente de anticorpos: a incubação de DENV-1, -2, -3 ou -4 com DVSF-3 LALA não resultou na infecção do monócito humano (linha celular K562), ao passo que DVSF-3 WT fez aumentar a infecção por DENV-1, -2 e -3.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0085] A presente invenção se relaciona a composições compreendendo uma sequência de ácido nucleico recombinante codificando um anticorpo, um fragmento deste, uma variante deste ou uma combinação deste. A composição pode ser administrada a um sujeito que necessite desta para facilitar expressão in vivo e formação de um anticorpo sintético.
[0086] Em particular, os polipeptídeos de cadeia pesada e cadeia leve expressos a partir das sequências de ácido nucleico recombinante podem agregar no anticorpo sintético. O polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve podem interagir entre si de tal modo que a agregação resulta no anticorpo sintético sendo capaz de se ligar ao antígeno, sendo mais imunogênico em comparação a um anticorpo não agregado conforme descrito neste documento e sendo capaz de suscitar ou induzir uma resposta imune contra o antígeno.
[0087] Adicionalmente, estes anticorpos sintéticos são gerados mais rapidamente no sujeito do que os anticorpos que são produzidos em resposta à resposta imune induzida por antígeno. Os anticorpos sintéticos são capazes de efetivamente ligar e neutralizar um intervalo de antígenos. Os anticorpos sintéticos também são capazes de efetivamente proteger contra e/ou promover a sobrevivência da doença.
1. Definições
[0088] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa ordinariamente versada na técnica. Em caso de conflito, o presente documento, incluindo as definições, irá prevalecer. Métodos e materiais exemplares são descritos abaixo, embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento podem ser usados na prática ou no teste da presente invenção. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas por referência em suas totalidades. Os materiais, métodos e exemplos divulgados neste documento são ilustrativos apenas e não se destinam a ser um fator limitante.
[0089] Os termos "compreende(m)", "inclui(em)", "ter", "tem", "pode", "contém(êm)", e as variantes destes, conforme usado neste documento, destinam-se a ser frases de transição em aberto, termos ou palavras que não excluem a possibilidade de atos ou estruturas adicionais. As formas singulares "uma", "um" e "a/o" incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente dite de outra forma. A presente divulgação também contempla outras modalidades "compreendendo", "consistindo nas" e "consistindo essencialmente nas" modalidades ou elementos apresentados neste documento, se explicitamente estabelecido ou não.
[0090] "Anticorpo" pode significar um anticorpo de classes IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE ou fragmentos, fragmentos ou derivativos destes, includindo Fab, F(ab')2, Fd, e anticorpos de cadeia única e derivativos destes. O anticorpo pode ser um anticorpo isolado da amostra de soro de mamífero, um anticorpo policlonal, anticorpo purificado por afinidade ou misturas destes que exibe especificidade de ligação suficiente a um epítopo desejado ou a uma sequência derivada daí. O anticorpo pode ser um anticorpo sintético, tal como aqui descrito.
[0091] "Fragmento de anticorpo" ou "fragmento de um anticorpo", conforme usado de forma permutável neste documento, se refere a uma porção de um anticorpo intacto compreendendo o local de ligação de antígeno ou região variável. A porção não inclui os domínios constantes de cadeia pesada (isto é, CH2, CH3, ou CH4, dependendo do isotipo do anticorpo) da região Fc do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não limitados a, fragmentos de Fab, fragmentos de Fab', fragmentos de Fab'-SH, fragmentos de F(ab') 2 , fragmentos de Fd, fragmentos de Fv, diabodies, moléculas de Fv (scFv) de cadeia única, polipeptídeos de cadeia única contendo apenas um domínio variável de cadeia leve, polipeptídeos de cadeia única contendo os três CDRs do domínio variável de cadeia leve, polipeptídeos de cadeia única contendo apenas uma região variável de cadeia pesada e polipeptídeos de cadeia única contendo os três CDRs da região variável de cadeia pesada.
[0092] "Antígeno" se refere às proteínas que têm a capacidade de gerar uma resposta imune em um hospedeiro. Um antígeno pode ser reconhecido e ligado por um anticorpo. Um antígeno pode se originar de dentro do corpo ou do ambiente externo.
[0093] "Sequência de codificação" ou "ácido nucleico de codificação", conforme usado neste documento, pode se referir ao ácido nucleico (molécula de RNA ou DNA) que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica um anticorpo conforme estabelecido neste documento. A sequência de codificação pode incluir, adicionalmente, os sinais de iniciação e terminação ligados de forma operável a elementos regulatórios incluindo um promotor e sinal de poliadenilação capaz de direcionar a expressão nas células de um indivíduo ou mamífero a quem o ácido nucleico é administrado. A sequência de codificação pode, adicionalmente, incluir sequências que codificam peptídeos sinal.
[0094] "Complementar", tal como aqui utilizado, pode significar um ácido nucleico, que pode significar Watson-Crick (por exemplo, EM / L e CG) ou um pareamento de base de Hoogsteen entre os nucleotídeos ou análogos de nucleótidos de moléculas de ácido nucleico.
[0095] "Corrente constante" conforme usado neste documento para definir uma corrente que é recebida ou experimentada por um tecido, ou células definindo dito tecido, ao longo da duração de um pulso elétrico entregue ao mesmo tecido. O pulso elétrico é entregue a partir dos dispositivos de eletroporação descritos neste documento. Esta corrente permanece em uma amperagem constante em dito tecido ao longo da vida de um pulso elétrico em função de o dispositivo de eletroporação provido neste documento ter um elemento de resposta, preferivelmente tendo resposta instantânea. O elemento de feedback pode medir a resistência do tecido (ou células) durante todo a duração do pulso e fazer com que o dispositivo de eletroporação altere sua saída de energia elétrica (por exemplo, aumento de voltagem) de modo que a corrente no mesmo tecido permaneça constante durante todo o pulso elétrico (na ordem dos microssegundos), e do pulso ao pulso. Em algumas modalidades, o elemento de resposta compreende um controlador.
[0096] "Resposta de corrente" ou "resposta", conforme usado neste documento, pode ser usado de forma permutável e pode significar a resposta ativa dos dispositivos de eletroporação providos, que compreendem medir a corrente no tecido entre os eletrodos e alterar a saída da energia entregue pelo dispositivo de EP, por conseguinte, a fim de manter a corrente em um nível constante. Este nível constante é predeterminado por um usuário antes da iniciação de uma sequência de pulso ou de um tratamento elétrico. O feedback pode ser realizado pelo componente de eletroporação, por exemplo, o controlador, do dispositivo de eletroporação, enquanto circuito elétrico pode continuamente monitorar a corrente no tecido entre os eletrodos e comparar a corrente monitorada (ou a corrente dentro do tecido) a uma corrente predeterminada e continuamente fazer ajustes de saída de energia para manter a corrente monitorada em níveis predeterminados. O circuito de resposta pode ser instantâneo, conforme é uma resposta de circuito fechado análogo.
[0097] "Corrente descentralizada", conforme usado neste documento, pode significar o padrão de correntes elétricas entregues a partir das várias matrizes de eletrodo de agulha dos dispositivos de eletroporação descritos neste documento, em que os padrões minimizam, ou preferencialmente eliminam, a ocorrência do estresse calórico relacionado à eletroporação em qualquer área de tecido sendo eletroporado.
[0098] "Eletroporação", "eletropermeabilização" ou "potenciamento eletrocinético" ("EP"), conforme usado de forma permutável neste documento, pode se referir ao uso de um pulso de campo elétrico de transmembrana para induzir caminhos microscópicos (poros) em uma biomembrana; sua presença permite que biomoléculas, tais como plasmídeos, oligonucleotídeos, siRNA, medicamentos, íons e água passem de um lado da membrana celular para o outro.
[0099] "Anticorpo endógeno", conforme usado neste documento, pode se referir a um anticorpo que é gerado em um sujeito que é administrado com uma dose eficaz de um antígeno para a indução de uma resposta imune humoral.
[00100] "Mecanismo de resposta", conforme usado neste documento, pode se referir a um processo executado ou pelo software ou pelo hardware (ou firmware), que o processo recebe e compara a impedância do tecido desejado (antes, durante, e/ou após a entrega do pulso de energia) com um valor atual, preferencialmente corrente, e ajusta o pulso de energia entregue para conseguir o valor predeterminado. Um mecanismo de resposta pode ser executado por um circuito fechado análogo.
[00101] "Fragmento" pode significar um fragmento de polipeptídeo de um anticorpo que é função, isto é, pode se ligar ao alvo desejado e tem o mesmo efeito pretendido como um anticorpo de comprimento total. Um fragmento de um anticorpo pode ser 100% idêntico ao comprimento total exceto por faltar pelo menos um aminoácido do N e/ou C-terminal, em cada caso, com ou sem peptídeos sinal e/ou uma metionina na posição 1. Fragmentos podem compreender 20% ou mais, 25% ou mais, 30% ou mais, 35% ou mais, 40% ou mais, 45% ou mais, 50% ou mais, 55% ou mais, 60% ou mais, 65% ou mais, 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais do comprimento do anticorpo de comprimento total particular, excluindo qualquer peptídeo sinal heterólogo adicionado. O fragmento pode compreender um fragmento de um polipeptídeo que é 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais idêntico ao anticorpo e adicionalmente compreende uma metionina N terminal ou peptídeo sinal heterólogo que não está incluído ao calcular identidade percentual. Os fragmentos podem compreender, adicionalmente, uma metionina N terminal e/ou um peptídeo sinal, tal como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, um peptídeo sinal de IgE ou de IgG. A metionina N terminal e/ou peptídeo sinal podem estar ligados a um fragmento de um anticorpo.
[00102] Um fragmento de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um anticorpo pode ser 100% idêntico ao comprimento total exceto por faltar pelo menos um nucleotídeo da extremidade 5' e/ou 3', em cada caso, com ou sem sequências codificando peptídeos sinal e/ou uma metionina na posição 1. Fragmentos podem compreender 20% ou mais, 25% ou mais, 30% ou mais, 35% ou mais, 40% ou mais, 45% ou mais, 50% ou mais, 55% ou mais, 60% ou mais, 65% ou mais, 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, 90% ou mais, 91% ou mais, 92% ou mais, 93% ou mais, 94% ou mais, 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais, 99% ou mais do comprimento da sequência de codificação de comprimento total particular, excluindo qualquer peptídeo sinal heterólogo adicionado. O fragmento pode compreender um fragmento que codifica um polipeptídeo que é 95% ou mais, 96% ou mais, 97% ou mais, 98% ou mais ou 99% ou mais idêntico ao anticorpo e adicionalmente compreende, opcionalmente, uma metionina N terminal ou peptídeo sinal heterólogo que não está incluído ao calcular identidade percentual. Os fragmentos podem compreender, adicionalmente, sequências de codificação para uma metionina N terminal e/ou um peptídeo sinal, tal como um peptídeo sinal de imunoglobulina, por exemplo, um peptídeo sinal de IgE ou de IgG. A sequência de codificação codificando a metionina N terminal e/ou peptídeo sinal podem estar ligados a um fragmento de sequência de codificação.
[00103] "Construto genético", conforme usado neste documento, se refere às moléculas de DNA ou RNA que compreendem uma sequência de nucleotídeo que codificam uma proteína, tal como um anticorpo. A sequência de codificação inclui sinais de iniciação e de terminação ligados de forma operável a elementos regulatórios, incluindo um promotor e um sinal de poliadenilação capaz de direcionar a expressão nas células do indivíduo ao qual a molécula de ácido nucleico é administrada. Conforme usado neste documento, o termo "forma exprimível" se refere aos construtos de gene que contêm os elementos regulatórios necessários operáveis ligados a uma sequência de codificação que codifica uma proteína, de modo que quando presente na célula do indivíduo, a sequência de codificação será expressa.
[00104] "Idêntico" ou "identidade", conforme usado neste documento no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeo, podem significar que as sequências têm uma porcentagem especificada de resíduos que são as mesmas ao longo de uma região especificada. A porcentagem pode ser calculada ao alinhar, opcionalmente, as duas sequências, comparando as duas sequências ao longo da região especificada, determinar o número de posições em que os resíduos idênticos ocorrem em ambas as sequências para produzir o número de posições compensadas, dividir o número de posições compensadas pelo número total de posições na região especificada e multiplicar o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de sequência. Em casos onde as duas sequências são de comprimentos diferentes ou o alinhamento produz uma ou mais extremidades escalonadas e a região especificada de comparação inclui apenas uma sequência única, os resíduos da sequência única são incluídos no denominador, mas não no numerador do cálculo. Ao comparar DNA e RNA, timina (T) e uracila (U) podem ser consideradas equivalentes. A identidade pode ser executada manualmente ou ao se usar um algoritmo de sequência de computador, tal como BLAST ou BLAST 2.0.
[00105] "Impedância", conforme usado neste documento, pode ser usada ao discutir o mecanismo de resposta e pode ser convertida a um valor de corrente, de acordo com a lei de Ohm permitindo, desse modo, com a corrente predeterminada.
[00106] A "resposta imune", conforme usado neste documento, pode significar a ativação de um sistema imunológico do hospedeiro, por exemplo, aquele de um mamífero, em resposta à introdução de um ou mais ácidos nucleicos e/ou peptídeos. A resposta imune pode estar na forma de uma resposta celular ou humoral, ou ambas.
[00107] "Ácido nucleico" ou "oligonucleotídeo" ou "polinucleotídeo", conforme usado neste documento, pode significar pelo menos dois nucleotídeos ligados juntos de forma covalente. A representação de uma fita única também define a sequência da fita complementar. Deste modo, um ácido nucleico também engloba a fita complementar de uma fita única representada. Muitas variantes de um ácido nucleico podem ser usadas para o mesmo propósito como um dado ácido nucleico. Deste modo, um ácido nucleico também engloba substancialmente ácidos nucleicos idênticos e complementos destes. Um filamento único provê uma sonda que pode hibridizar uma sequência alvo sob condições de hibridização estritas. Deste modo, um ácido nucleico também engloba uma sonda que hibridiza sob condições de hibridização estritas.
[00108] Os ácidos nucleicos podem ser de filamento único ou filamento duplo, ou podem conter porções tanto de sequência de filamento duplo quanto filamento único. O ácido nucleico pode ser DNA, tanto genômico quanto cDNA, RNA ou um híbrido, onde o ácido nucleico pode conter combinações de desoxirribo e ribonucleotídeos, e combinações das bases incluindo uracila, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xantina hipoxantina, isocitosina e isoguanina. Os ácidos nucleicos podem ser obtidos por métodos de síntese química ou por métodos recombinantes.
[00109] "Ligado de forma operável", conforme usado neste documento, pode significar que a expressão de um gene está sob o controle de um promotor com o qual é espacialmente conectado. Um promotor pode ser posicionado 5' (a montante) ou 3' (a jusante) de um gene sob seu controle. A distância entre o promotor e um gene pode ser aproximadamente a mesma que a distância entre esse promotor e o gene ele que controla no gene a partir do qual o promotor é derivado. Conforme é conhecido na técnica, a variação nesta distância pode ser acomodada sem perda da função de promotor.
[00110] Um "peptídeo", uma "proteína" ou um "polipeptídeo", conforme usado neste documento, pode significar uma sequência de aminoácidos ligados e pode ser natural, sintética ou uma modificação ou combinação de natural e sintética.
[00111] "Promotor", conforme usado neste documento, pode significar uma molécula sintética ou naturalmente derivada que é capaz de conferir, ativar ou intensificar a expressão de um ácido nucleico em uma célula. Um promotor pode compreender uma ou mais sequências regulatórias transcricionais específicas para realçar, adicionalmente, a expressão e/ou alterar a expressão espacial e/ou a expressão temporal do mesmo. Um promotor também pode compreender os elementos intensificadores ou repressores distais, que podem ser localizados tanto como vários milhares de pares de base a partir do local de início de transcrição. Um promotor pode ser derivado de fontes incluindo viral, bacteriana, fúngica, de plantas, de insetos e animais. Um promotor pode regular a expressão de um componente de gene constitutivamente, ou diferencialmente com relação à célula, ao tecido ou ao órgão em que a expressão ocorre ou, com relação ao estágio de desenvolvimento em que a expressão ocorre, ou em resposta aos estímulos externos, tais como estresses fisiológicos, patogênicos, íons de metal, ou agentes de indução. Os exemplos representativos dos promotores incluem o promotor bacteriófago T7, promotor bacteriófago T3, promotor SP6, promotor operador lac, promotor tac, promotor tardio SV40, promotor precoce SV40, promotor RSV-LTR, promotor CMV IE, promotor precoce SV40 ou promotor tardio SV40 e o promotor CMV IE,
[00112] "Peptídeo sinal" e "sequência principal" são usados de forma permutável neste documento e se referem a uma sequência de aminoácido que pode ser ligada no amino terminal de uma proteína estabelecida neste documento. Peptídeos sinal/sequências principais normalmente direcionam a localização de uma proteína. Peptídeos sinal/sequências principais usados neste documento preferencialmente facilitam a secreção da proteína a partir da célula em que são produzidos. Peptídeos sinal/sequências principais são frequentemente clivados a partir do restante da proteína, frequentemente referidos como a proteína madura, mediante a secreção da célula. Peptídeos sinal/sequências principais são ligados no N terminal da proteína.
[00113] "Condições estritas de hibridização", como usado aqui, significa que as condições sob as quais uma primeira sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, sonda) irá hibridizar para uma segunda sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, alvo), tal como em uma mistura complexa de ácidos nucleicos. Condições estritas são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. As condições estritas podem ser selecionadas para ser cerca de 5-10°C menor do que o ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência específica a uma força iônica definida de pH. O Tm pode ser a temperatura (sob força iônica definida, pH, e concentração nucleica) em que 50% das sondas complementares ao alvo hibridizam à sequência do alvo em equilíbrio (conforme as sequências alvo estão presentes em excesso, em Tm, 50% das sondas são ocupadas em equilíbrio). As condições rigorosas podem ser aquelas em que a concentração de sal é menos do que o 1,0 M de íon de sódio, tal como aproximadamente 0,01-1,0 M de concentração de íon de sódio (ou outros sais) em um pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, aproximadamente 10-50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maior do que cerca de 50 nucleotídeos). As condições rigorosas também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores, tais como formamida. Para a hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo pode ser de pelo menos 2 a 10 vezes a hibridização de fundo (background). Exemplos de condições de hibridização estritas incluem o seguinte: 50% de formamida, 5x SSC, e 1% de SDS incubando em 42°C ou 5x SSC, 1% de SDS incubando em 65°C, com lavagem em 0.2x SSC e 0.1% de SDS em 65°C.
[00114] "Indivíduo" e "paciente", conforme usado neste documento de forma permutável, se refere a qualquer vertebrado incluindo, mas não limitado a, um mamífero (por exemplo, vaca, porco, camelo, lhama, cavalo, cabra, coelho, ovelha, hamsters, porquinho-da-índia, gato, cão, rato e camundongo, um primata não humano (por exemplo, um macaco, tal como um macaco-cinomolgo ou rhesus, chimpanzé, etc) e um ser humano). Em algumas modalidades, o sujeito pode ser um humano ou um não humano. O indivíduo ou o paciente pode estar se submetendo por outras formas de tratamento.
[00115] "Substancialmente complementar", conforme usado neste documento, pode significar que a primeira sequência é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao complemento de uma segunda sequência ao longo de uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou que as duas sequências hibridizam sob condições de hibridação estritas.
[00116] "Substancialmente idêntico(a)", conforme usado neste documento, significa que uma primeira e uma segunda sequências são pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas a uma região de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,1000, 1100 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, ou com relação a ácidos nucleicos, se a primeira sequência for substancialmente complementar ao complemento da segunda sequência.
[00117] "Anticorpo sintético", conforme usado neste documento, se refere a um anticorpo que é codificado pela sequência de ácidos nucleicos recombinante descrita neste documento ou uma variante sua e é gerada em um indivíduo. O anticorpo sintético pode ser manipulado para se ligar a uma molécula alvo desejada, provocando um efeito biológico. A molécula alvo desejada pode ser um antígeno, um ligante receptor, um receptor, incluindo um local de ligação a ligante no receptor, um complexo ligante-receptor, um marcador, incluindo um marcador para câncer e qualquer outra molécula ou alvo que possam estar ligados por um anticorpo. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos recombinantes podem ter a sequência de ácidos nucleicos conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 3, 4, 6, 7, 40, 42, 44, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 63, 64, 65, 67, 69, 71, 73, 75 ou 77. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos recombinante pode codificar a sequência de aminoácidos conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 41, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 53, 55, 57 , 59, 61, 66, 68, 70, 72, 74, 76 ou 78.
[00118] "Tratamento" ou "tratar", conforme usado neste documento, pode significar proteger um sujeito de uma doença através de meios de prevenir, suprimir, reprimir ou eliminar completamente a doença. Prevenir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um sujeito antes da aparição da doença. Suprimir a doença implica administrar uma vacina da presente invenção a um sujeito após a indução da doença, mas antes de seu aparecimento clínico. Reprimir a doença envolve administrar uma vacina da presente invenção a um sujeito após aparecimento clínico da doença.
[00119] "Variante", usado neste documento com relação a um ácido nucleico, pode significar (i) uma porção ou um fragmento de uma sequência de nucleotídeo referenciada; (ii) o complemento de uma sequência de nucleotídeo referenciada ou uma porção desta; (iii) um ácido nucleico que é substancialmente idêntico a um ácido nucleico referenciado ou o complemento deste; ou (iv) um ácido nucleico que hibridiza sob condições estritas ao ácido nucleico referenciado, complemento deste ou sequências substancialmente idênticas deste.
[00120] "Variante" com relação a um peptídeo ou polipeptídio que difere na sequência de aminoácido pela inserção, deleção ou substituição conservativa de aminoácidos, mas retém pelo menos uma atividade biológica. Variante também pode significar uma proteína com uma sequência de aminoácido que é substancialmente idêntica a uma proteína referenciada com uma sequência de aminoácido que retem pelo menos uma atividade biológica. Uma substituição conservativa de um aminoácido, ou seja, a substituição de um aminoácido por um aminoácido diferente de propriedades semelhantes (por exemplo, hidrofilicidade, grau e distribuição das regiões carregadas) é reconhecida na técnica como tipicamente envolvendo uma pequena alteração. Estas pequenas mudanças podem ser identificadas, em parte, ao se considerar o índice hidropático de aminoácidos, conforme compreendido na técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). O índice hidropático de um aminoácido é baseado em uma consideração de sua hidrofobicidade e carga. É conhecido na técnica que os aminoácidos de índices hidropáticos similares podem ser substituídos e ainda manter a função de proteína. Em um aspecto, aminoácidos tendo índices hidropáticos de ±2 são substituídos. A hidrofilicidade de aminoácidos também pode ser usada para revelar substituições que resultariam em proteínas mantendo a função biológica. Uma consideração da hidrofilicidade de aminoácidos no contexto de um peptídeo permite o cálculo da maior hidrofilicidade média local daquele peptídeo, uma medida útil que foi relatada para correlacionar bem com a antigenicidade e a imunogenicidade. Patente U.S. No. , incorporada em sua totalidade neste documento por referência. Substituição de aminoácidos tendo valores de hidrofilicidade similares podem resultar em peptídeos mantendo a atividade biológica, por exemplo, a imunogenicidade, como é conhecido na técnica. Substituições podem ser executadas com aminoácidos tendo valores de hidrofilicidade dentro de ±2 entre si. Tanto o índice do hidrofobicidade e o valor de hidrofilicidade de aminoácidos são influenciados pela cadeia lateral particular desse aminoácido. Consistente com essa observação, substituições de aminoácidos que são compatíveis com a função biológica são entendidas como dependentes da semelhança relativa dos aminoácidos e, particularmente, das cadeias laterais de tais aminoácidos, conforme revelado pela hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e outras propriedades.
[00121] Uma variante pode ser uma sequência de ácidos nucleicos que é substancialmente idêntica ao longo do comprimento total da sequência de gene total ou um fragmento desta. A sequência de ácidos nucleicos pode ser de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao longo do comprimento total da sequência de gene ou um fragmento desta. Por exemplo, a sequência de ácidos nucleicos pode ser de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao longo de todo o comprimento da sequência de ácidos nucleicos tal como apresentada na SEQ ID NO.: 3, 4, 6, 7, 40, 42, 44, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 63, 64, 65, 67, 69, 71, 73, 75 ou 77 ou um fragmento seu. Uma variante pode ser uma sequência de aminoácido que é substancialmente idêntica ao longo do comprimento total da sequência de aminoácidos ou um fragmento desta. A sequência de ácidos nucleicos pode ser de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao longo do comprimento total da sequência de aminoácido ou um fragmento desta. Por exemplo, a sequência de aminoácidos pode ser 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao longo de todo o comprimento da sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, 2, 5, 41, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 66, 68, 70, 72, 74, 76 ou 78 ou em um fragmento seu.
[00122] "Vetor", conforme usado neste documento, pode significar uma seqüência de ácido nucleico contendo uma origem de replicação. Um vetor pode ser um plasmídeo, um bacteriófago, um cromossomo artificial bacteriano ou um cromossomo artificial de levedura. Um vetor pode ser um vetor de DNA ou de RNA. Um vetor pode ser ou um vetor extracromossômico auto replicante ou um vetor que se integre em um genoma de hospedeiro.
[00123] Para a recitação de intervalos numéricos neste documento, cada número de intervenção entre o mesmo grau de precisão é contemplado explicitamente. Por exemplo, para o intervalo de 6 a 9, os números 7 e 8 são contemplados além de 6 e 9, e para o intervalo de 6,0 a 7,0, os números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 e 7,0 são contemplados explicitamente. 2. Composição
[00124] A presente invenção se relaciona a uma composição compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos recombinante codificando um anticorpo, um fragmento deste, uma variante deste ou uma combinação deste. A composição, quando administrada em um indivíduo que necessite delaa, pode resultar na geração de um anticorpo sintético no indivíduo. O anticorpo sintético pode se ligar uma molécula alvo (por exemplo, um antígeno, que é discutido em mais detalhes a seguir), um ligante, incluindo um ligante para um receptor, um receptor, incluindo um local de ligação ao ligante no receptor, um complexo ligante-receptor e um marcador, incluindo um marcador de câncer, presentes no indivíduo. Tal ligação pode neutralizar o antígeno, bloquear o reconhecimento do antígeno por outra molécula, por exemplo, uma proteína ou ácido nucleico e elicitar ou induzir uma resposta imune ao antígeno.
[00125] O anticorpo sintético pode tratar, prevenir e/ou proteger contra a doença no indvíduo administrado com a composição. O anticorpo sintético ao se ligar ao antígeno pode tratar, prevenir e/ou proteger contra a doença no sujeito administrado com a composição. O anticorpo sintético pode promover a sobrevivência da doença no sujeito administrado com a composição. O anticorpo sintético pode prover pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% de sobrevivência da doença no sujeito administrado com a composição. Em outras modalidades, o anticorpo sintético pode prover pelo menos cerca de 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% ou 80% de sobrevivência da doença no sujeito administrado com a composição.
[00126] A composição pode resultar na geração do anticorpo sintético no sujeito dentro de pelo menos cerca de 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 20 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, 45 horas, 50 horas ou 60 horas de administração da composição ao sujeito. A composição pode resultar na geração do anticorpo sintético no sujeito dentro de pelo menos cerca de 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias ou 10 dias de administração da composição para o sujeito. A composição pode resultar na geração do anticorpo sintético no sujeito dentro de cerca de 1 hora a cerca de 6 dias, cerca de 1 hora a cerca de 5 dias, cerca de 1 hora a cerca de 4 dias, cerca de 1 hora a cerca de 3 dias, cerca de 1 hora a cerca de 2 dias, cerca de 1 hora a cerca de 1 dia, cerca de 1 hora a cerca de 72 horas , cerca de 1 hora a cerca de 60 horas, cerca de 1 hora a cerca de 48 horas, cerca de 1 hora a cerca de 36 horas, cerca de 1 hora a cerca de 24 horas, cerca de 1 hora a cerca de 12 horas ou cerca de 1 hora a cerca de 6 horas de administração da composição ao indivíduo.
[00127] A composição, quando administrada ao indivíduo que necessite dela, pode resultar na geração persistente do anticorpo sintético no indivíduo. A composição pode resultar na geração do anticorpo sintético no indivíduo durante pelo menos cerca de 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias , 12 dias, 13 dias, 14 dias, 15 dias, 16 dias, 17 dias, 18 dias, 19 dias, 20 dias, 21 dias, 22 dias, 23 dias, 24 dias, 25 dias, 26 dias, 27 dias, 28 dias, 29 dias, 30 dias, 31 dias, 32 dias, 33 dias, 34 dias, 35 dias, 36 dias, 37 dias, 38 dias, 39 dias, 40 dias, 41 dias, 42 dias, 43 dias, 44 dias, 45 dias, 46 dias, 47 dias, 48 dias, 49 dias, 50 dias, 51 dias, 52 dias, 53 dias, 54 dias, 55 dias, 56 dias, 57 dias, 58 dias, 59 dias ou 60 dias.
[00128] A composição, quando administrada ao sujeito que necessite desta, pode resultar na geração do anticorpo sintético no sujeito mais rapidamente do que a geração de um anticorpo endógeno em um sujeito que é administrado com um antígeno para induzir uma resposta imune humoral. A composição pode resultar na geração do anticorpo sintético pelo menos cerca de 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias ou 10 dias antes da geração do anticorpo endógeno no sujeito que foi administrado com um antígeno para induzir uma resposta imune humoral.
[00129] A composição da presente invenção pode ter recursos exigidos de composições eficazes, tais como sendo seguros de modo que a composição não causa doença ou morte; sendo protetora contra doenças; e provendo facilidade de administração, alguns efeitos colaterais, estabilidade biológica e baixo custo por dose. 3. Sequência de Ácido Nucleico Recombinante
[00130] Conforme descrito acima, a composição pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos recombinante. A sequência de ácidos nucleicos recombinante pode codificar o anticorpo, um fragmento deste, uma variante deste ou uma combinação deste. O anticorpo é descrito em mais detalhes abaixo.
[00131] A sequência de ácidos nucleicos recombinante pode ser uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga. A sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga ou uma ou mais sequências de ácido nucleico heteróloga.
[00132] A sequência de ácidos nucleicos recombinante pode ser uma sequência de ácidos nucleicos otimizada. Tal otimização pode aumentar ou alterar a ligação, e, em particular, o efeito biológico (incluindo o efeito de neutralização) do anticorpo. A otimização também pode melhorar a transcrição e/ou tradução. A otimização pode incluir um ou mais dentre: Sequência principal de baixo conteúdo de GC para aumentar a transcrição; otimização de códon e estabilidade do mRNA; adição de uma sequência de Kozak (por exemplo, GCC ACC) para o aumento da tradução; adição de uma sequência de imunoglobulina (Ig) líder que codifica um péptido de sinal; e eliminar na medida do possível (ou seja, caixas TATA internas) que actuam em cis motivos de sequência.
a. Construto de Sequência de Ácido Nucleico Recombinante
[00133] A sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um ou mais construtos de sequência de ácido nucleico recombinante. O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um ou mais componentes, que são descritos mais detalhadamente abaixo.
[00134] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir uma sequência de ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada, um fragmento deste, uma variante deste ou uma combinação deste. O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir uma sequência de ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo de cadeia leve, um fragmento deste, uma variante deste ou uma combinação deste. O construto de sequência de ácido nucleico recombinante também pode incluir uma sequência de ácido nucleico heterólogo que codifica um local de clivagem de protease ou peptidase. O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir uma ou mais sequências principais, em que cada sequência principal codifica um peptídeo sinal. O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um ou mais promotores, um ou mais íntrons, uma ou mais regiões de término de transcrição, um ou mais códons de iniciação, um ou mais códons de terminação ou de parada, e/ou um ou mais sinais de poliadenilação. O construto de sequência de ácido nucleico recombinante também pode incluir uma ou mais sequências de ligante ou marcador. A sequência de marcador pode codificar um marcador de hemaglutinina (HA).
(1) Polipeptídeo de Cadeia Pesada
[00135] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir a sequência de ácido nucleico heterólogo que codifica o polipeptídeo de cadeia pesada, um fragmento deste, uma variante deste ou uma combinação deste. O polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região de cadeia pesada variável (VH) e/ou pelo menos uma região de cadeia pesada constante (CH). Pelo menos uma região de cadeia pesada constante pode incluir uma região de cadeia pesada constante 1 (CH1), uma região de cadeia pesada constante 2 (CH2) e uma região de cadeia pesada constante 3 (CH3) e/ou uma região de dobradiça.
[00136] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região VH e uma região CH1. Em outras modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região VH, uma região CH1, uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma região CH3.
[00137] O polipeptídeo de cadeia pesada pode incluir uma região de determinação de complementaridade ("CDR") ajustada. O ajuste de CDR pode conter três regiões hipervariáveis da região VH. Proveniente de N- terminal do polipeptídeo de cadeia pesada, estas CDRs são denotadas "CDR1", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. CDR1, CDR2 e CDR3 do polipeptídeo de cadeia pesada podem contribuir para a ligação ou o reconhecimento do antígeno.
(2) Polipeptídeo de Cadeia Leve
[00138] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir a sequência de ácido nucleico heterólogo codificando o polipeptídeo de cadeia leve, um fragmento deste, uma variante deste ou uma combinação deste. O polipeptídeo de cadeia leve pode incluir uma região de cadeia leve variável (VL) e/ou uma região de cadeia leve constantes (CL).
[00139] O polipeptídeo de cadeia leve pode incluir uma região de determinação de complementaridade ("CDR") ajustada. O ajuste de CDR pode conter três regiões hipervariáveis da região VL. Proveniente de N- terminal do polipeptídeo de cadeia leve, estas CDRs são denotadas "CDR1", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. CDR1, CDR2 e CDR3 do polipeptídeo de cadeia leve podem contribuir para a ligação ou o reconhecimento do antígeno.
(3) Local de Clivagem de Protease
[00140] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante também pode incluir a sequência de ácido nucleico heterólogo codificando o local de clivagem de protease. O local de clivagem de protease pode ser reconhecido por uma protease ou peptidase. A protease pode ser uma endopeptidase ou endoprotease, por exemplo, mas não limitado a, furina, elastase, HtrA, Calpaína, tripsina, quimotripsina, tripsina e pepsina. A protease pode ser furina. Em outras modalidades, a protease pode ser um serino-protease, uma treonina protease, cisteína protease, aspartato protease , metaloprotease, protease de ácido glutâmico ou qualquer protease que cliva uma ligação peptídica interna (isto é, não cliva a ligação peptídica N-terminal ou C-terminal).
[00141] O local de clivagem de protease pode incluir uma ou mais sequências de aminoácido que promovem ou aumentam a eficiência de clivagem. A uma ou mais sequências de aminoácido podem promover ou aumentar a eficiência de formar ou gerar polipeptídeos discretos. A uma ou mais sequências de aminoácido podem incluir uma sequência de peptídeo 2A. A sequência de peptídeos 2A é um peptídeo de auto-processamento derivado do vírus de doença no pé e na boca (FMDV).
[00142] Em algumas modalidades o local de clivagem da protease pode incluir uma combinação (por exemplo, por fusão) do local de clivagem de furina seguido da sequência de peptídeos 2A. Um exemplo de tal combinação pode ser incluído no arranjo 2, que é descrito em mais detalhes abaixo e pode ser visto, por exemplo, na FIG. 69A. Como discutido abaixo em mais detalhes, essa combinação do local de clivagem da furina seguido da sequência de peptídeos 2A pode ser posicionado entre o polipeptídeo de cadeia pesada a sequência de ácidos nucleicos heteróloga que codifica o polipeptídeo de cadeia leve. Por conseguinte, tal combinação permite a separação do polipeptídeo de cadeia pesada e do polipeptídeo de cadeia leve em polipeptídeos distintos a partir da expressão e pode facilitar a expressão equimolar dos polipeptídeos de cadeia pesada e leve.
(4) Sequência de Ligante
[00143] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir uma ou mais sequências de ligante. A sequência de ligante pode espacialmente separar ou ligar o um ou mais componentes descritos neste documento. Em outras modalidades, a sequência de ligante pode codificar uma sequência de aminoácido que separa ou liga espacialmente dois ou mais polipeptídeos.
(5) Promotor
[00144] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir um ou mais promotores. O um ou mais promotores podem ser qualquer promotor que é capaz de acionar a expressão de gene e regular a expressão de gene. Tal promotor é um elemento de sequência de atuação de cis exigido para transcrição por meio de uma polimerase de RNA dependente de DNA. A seleção do promotor usado para direcionar a expressão de gene depende da aplicação específica. O promotor pode ser posicionado sobre a mesma distância a partir do início de transcrição no construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante, conforme é a partir do local de início de transcrição em seu ajsute natural. Entretanto, a variação nesta distância pode ser acomodada sem perda da função de promotor.
[00145] O promotor pode ser ligado de forma operável à sequência de ácidos nucleicos heterólogo codificando o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve. O promotor pode ser um promotor mostrado eficaz para expressão em células eucarióticas. O promotor ligado de forma operável à sequência de codificação pode ser um promotor de CMV, um promotor do vírus símio 40 (SV40), tal como promotor precoce SV40 e promotor tardio SV40, um promotor do vírus do tumor mamário murino (MMTV), um promotor do vírus da imunodeficiência humana (HIV), tais como o promotor de longas repetições terminais (LTR) do vírus da imunodeficiência bovina (BIV), um promotor de vírus Moloney, um promotor do vírus da leucose aviária (ALV), um promotor de citomegalovírus (CMV), tal como o promotor precoce imediato de CMV, promotor do vírus Epstein- Barr (EBV), ou um promotor de vírus do sarcoma de Rous (RSV). O promotor pode ser um promotor de um gene humano, tal como a actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humano ou metalotioneína humana.
[00146] O promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor induzível, que inicia a transcrição apenas quando a célula hospedeira é exposta a algum estímulo externo particular. No caso de um organismo multicelular, o promotor também pode ser específico para um tecido ou órgão ou estágio de desenvolvimento particular. O promotor também pode ser um promotor específico de tecido, tal como um promotor específico de músculo ou pele natural ou sintético. Exemplos de tais promotores são descritos na publicação de pedido de patente U.S. No. US20040175727, cujos conteúdos são incorporados neste documento em sua totalidade.
[00147] O promotor pode ser associado com um intensificador. O potencializador pode ser localizado a montante da sequência de codificação. O potencializador pode ser actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humano ou um potencializador viral, tal como um de CMV, FMDV, RSV ou EBV. As intensificações da função do polinucleotídeo são descritas nas patentes U.S. Nos. Acentuações da função polinucleotídica são descritas nas Patentes U.S. Nos. 5.593.972, 5.962.428 e WO94/016737, o conteúdo de cada uma estando totalmente incorporado por referência.
(6) Íntron
[00148] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir um ou mais íntrons. Cada íntron pode incluir locais funcionais de doador e receptor de splice. O íntron pode incluir um potencializador de splicing. O íntron pode incluir um ou mais sinais exigidos para splicing eficiente.
(7) Região de Terminação de Transcrição
[00149] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir uma ou mais regiões de terminação de transcrição. A região de terminação de transcrição pode ser a jusante da sequência de codificação para prover terminação eficiente. A região de terminação de transcrição pode ser obtida a partir do mesmo gene como o promotor descrito acima ou pode ser obtida de um ou mais genes diferentes.
(8) Códon de Iniciação
[00150] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir um ou mais códons de iniciação. O códon de iniciação pode ser localizado a montante da sequência de codificação. O códon de iniciação e terminação pode estar in frame com a sequência de codificação. O códon de iniciação pode ser associado com um ou mais sinais exigidos para a iniciação da tradução eficiente, por exemplo, mas não limitado a, um local de ligação de ribossomo.
(9) Códon de Terminação
[00151] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir um ou mais códons de terminação ou de parada. O códon de terminação pode estar a jusante da sequência de codificação. O códon de terminação pode estar in frame com a sequência de codificação. O códon de terminação pode ser associado a um ou mais sinais exigidos para a terminação de tradução eficiente.
(10) Sinal de Poliadenilação
[00152] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir um ou mais sinais de poliadenilação. O sinal de poliadenilação pode incluir um ou mais sinais exigidos para poliadenilação eficiente da transcrição. O sinal de poliadenilação pode ser posicionado a jusante da sequência de codificação. O sinal de poliadenilação pode ser um sinal de poliadenilação de SV40, sinal de poliadenilação de LTR, sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento de bovinos (bGH), sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento humano (hGH) ou sinal de poliadenilação de β-globin humano(hgH). O sinal de poliadenilação de SV40 pode ser um sinal de poliadenilação de um plasmídeo pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA).
(11) Sequência Principal
[00153] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir uma ou mais sequências principais. A sequência principal pode codificar um peptídeo de sinal. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina (Ig), por exemplo, mas não limitado a, um peptídeo de sinal de IgG e um peptídeo de sinal de IgE.
b. Arranjo do Construto de Sequência de Ácido Nucleico Recombinante
[00154] Conforme descrito acima, a sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir um ou mais construtos de sequência de ácidos nucleicos recombinante, em que cada construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir um ou mais componentes. Um ou mais componentes são descritos em detalhes acima. Um ou mais componentes, quando incluídos no construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante, podem ser arranjados em qualquer ordem relativa entre si. Em algumas modalidades, um ou mais componentes podem ser arranjados no construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante conforme descrito abaixo.
(1) Arranjo 1
[00155] Em um arranjo, um primeiro construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir a sequência heteróloga de ácidos nucleicos codificando o polipeptídeo de cadeia pesada e um segundo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir a sequência heteróloga de ácidos nucleicos codificando o polipeptídeo de cadeia leve.
[00156] O primeiro construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode ser colocado em um vetor. O segundo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode ser colocado em um segundo vetor ou separadamente. Colocação do construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante no vetor é descrita em mais detalhes abaixo.
[00157] 1O primeiro construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante também pode incluir o promotor, íntron, região de terminação de transcrição, códon de iniciação, códon de terminação e/ou sinal de poliadenilação. O primeiro construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir, adicionalmente, a sequência principal, em que a sequência principal está localizada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia pesada. Por conseguinte, o peptídeo sinal codificado pela sequência principal pode ser ligado por uma ligação peptídica ao polipeptídeo de cadeia pesada.
[00158] O segundo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante também pode incluir o promotor, códon de iniciação, códon de terminação e sinal de poliadenilação. O segundo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir, adicionalmente, a sequência principal, em que a sequência principal está localizada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia leve. Por conseguinte, o peptídeo sinal codificado pela sequência principal pode ser ligado por uma ligação peptídica ao polipeptídeo de cadeia leve.
[00159] Por conseguinte, um exemplo de arranjo 1 pode incluir o primeiro vetor (e, deste modo, o primeiro construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante) codificando o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH e CH1, e o segundo vetor (e, deste modo, segundo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante) codificando o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL. Um segundo exemplo de arranjo 1 pode incluir o primeiro vetor (e, deste modo, o primeiro construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante) codificando o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH, CH1, região de dobradiça, CH2 e CH3, e o segundo vetor (e, deste modo, segundo construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante) codificando o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL.
(2) Arranjo 2
[00160] Em um segundo arranjo, o construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia leve. A sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia pesada pode ser posicionada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia leve. Alternativamente, a sequência heteróloga de ácido nucleico heterólogo codificando o polipeptídeo de cadeia leve pode ser posicionada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia pesada.
[00161] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode ser colocado no vetor conforme descrito em mais detalhes abaixo.
[00162] O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir a sequência de ácidos nucleicos heterólogo codificando o local de clivagem de protease e/ou a sequência de ligante. Conforme discutido acima em maiores detalhes, em algumas modalidades o local de clivagem da protease pode incluir uma combinação (por exemplo, por fusão) do local de clivagem de furina seguido da sequência de peptídeos 2A, por exemplo, conforme mostrado na FIG. 69A.
[00163] Se incluído no construto de sequência de ácido nucleico recombinante, a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o local de clivagem de protease pode ser posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácidos nucleicos codificando o polipeptídeo de cadeia leve. Por conseguinte, o local de clivagem de protease permite a separação do polipeptídeo de cadeia pesada e do polipeptídeo de cadeia leve em polipeptídeos distintos a partir da expressão e pode facilitar a expressão equimolar dos polipeptídeos de cadeia pesada e leve.
[00164] Em outras modalidades, se a sequência de ligante for incluída no construto de sequência de ácido nucleico recombinante, então a sequência de ligante pode ser posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia leve.
[00165] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante também pode incluir o promotor, íntron, região de terminação de transcrição, códon de iniciação, códon de terminação e/ou sinal de poliadenilação. O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir um ou mais promotores. O construto de sequência de ácidos nucleicos recombinante pode incluir dois promotores, de tal modo que um promotor pode ser associado à sequência heteróloga de ácidos nucleicos codificando o polipeptídeo de cadeia pesada e o segundo promotor pode ser associado à sequência heteróloga de ácidos nucleicos codificando o polipeptídeo de cadeia leve. Ainda em outras modalidades, o construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir um promotor que é associado à sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia leve.
[00166] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir, adicionalmente, duas sequências principais, em que uma primeira sequência principal está localizada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia pesada e uma segunda sequência principal está localizada a montante (ou 5') da sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia leve. Por conseguinte, um primeiro peptídeo sinal codificado pela primeira sequência principal pode ser ligado por uma ligação peptídica ao polipeptídeo de cadeia pesada e um segundo peptídeo sinal codificado pela segunda sequência principal pode ser ligado por uma ligação peptídica ao polipeptídeo de cadeia leve.
[00167] Por conseguinte, um exemplo de arranjo 2 pode incluir o vetor (e, deste modo, construto de sequência de ácido nucleico recombinante) codificando o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH e CH1 e o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL, em que a sequência de ligante é posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia leve.
[00168] Um segundo exemplo de arranjo 2 inclui o vetor (e, deste modo, construto de sequência de ácido nucleico recombinante) codificando o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH e CH1 e o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL, em que a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o local de clivagem de protease é posicionado entre a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia leve.
[00169] Um terceiro exemplo de arranjo 2 pode incluir o vetor (e, deste modo, construto de sequência de ácido nucleico recombinante) codificando o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH, CH1, região de dobradiça, CH2 e CH3 e o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL, em que a sequência de ligante é posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia leve.
[00170] Um quarto exemplo de arranjo 2 pode incluir o vetor (e, deste modo, construto de sequência de ácido nucleico recombinante) codificando o polipeptídeo de cadeia pesada que inclui VH, CH1, região de dobradiça, CH2 e CH3 e o polipeptídeo de cadeia leve que inclui VL e CL, em que a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o local de clivagem de protease é posicionada entre a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia pesada e a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia leve.
c. Expressão do Construto de Sequência de Ácido Nucleico Recombinante
[00171] Conforme descrito acima, o construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode incluir, entre um ou mais componentes, a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou a sequência heteróloga de ácido nucleico codificando o polipeptídeo de cadeia leve. Por conseguinte, o construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode facilitar a expressão do polipeptídeo de cadeia pesada e/ou o polipeptídeo de cadeia leve.
[00172] Quando o arranjo 1 conforme descrito acima é utilizado, o primeiro construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode facilitar a expressão do polipeptídeo de cadeia pesada e o segundo construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode facilitar a expressão do polipeptídeo de cadeia leve. Quando o arranjo 2 conforme descrito acima é utilizado, o construto de sequência de ácido nucleico recombinante pode facilitar a expressão do polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve.
[00173] Mediante expressão, por exemplo, mas não limitado a, em uma célula, organismo ou mamífero, o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve podem se agregar no anticorpo sintético. Em particular, o polipeptídeo de cadeia pesada e de cadeia leve pode interagir entre si, de modo que o agregado resulte no anticorpo sintético capaz de se ligar à molécula alvo desejada, por exemplo: o antígeno, que é discutido com mais detalhes abaixo, um ligante, incluindo um ligante para um receptor, um receptor, incluindo um local de ligação a ligante no receptor, um complexo ligante-receptor, e um marcador, incluindo um marcador de câncer. Em outras modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve podem interagir entre si de tal modo que a agregação resulta no anticorpo sintético sendo mais eficaz na ligação à sua molécula alvo em comparação a um anticorpo não agregado conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada e de cadeia leve podem interagir entre si, de modo que o agregado resulte em um anticorpo sintético com um efeito biológico almejado, por exemplo, neutralização, inibição de um ligante que se liga a um receptor e o recrutamento de células imunológicas para uma célula alvejada pelo anticorpo sintético. Ainda em outras modalidades, o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve podem interagir entre si de tal modo que a agregação resulta no anticorpo sintético sendo capaz de suscitar ou induzir uma resposta imune contra o antígeno.
d. Vetor
[00174] O construto de sequência de ácido nucleico recombinante descrito acima pode ser colocado em um ou mais vetores. O um ou mais vetores podem conter uma origem de replicação. O um ou mais vetores podem ser um plasmídeo, bacteriófago, cromossomo artificial bacteriano ou cromossomo artificial de levedura. O um ou mais vetores podem ser ou um vetor extracromossômico de auto-replicação ou um vetor que se integra em um genoma hospedeiro.
[00175] O um ou mais vetores podem ser um construto de expressão heteróloga, que é geralmente um plasmídeo que é usado para introduzir um gene específico em uma célula-alvo. Uma vez que o vetor de expressão está no interior da célula, o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve que são codificados pelo construto de sequência de ácido nucleico recombinante são produzidos pelo equipamento de transcrição e traduçãocelular de complexos ribossômicos. O um ou mais vetores podem expressar grandes quantias de RNA mensageiroestável e, consequentemente, as proteínas.
(1) Vetores de Expressão
[00176] O um ou mais vetores podem ser um plasmídeo circular ou um ácido nucléico linear. O plasmídeo circular e ácido nucleico linear são capazes de direcionar a expressão de uma sequência de nucleotídeo particular em uma célula de sujeito apropriado. O um ou mais vetores compreendendo o construto de sequência de ácido nucleico recombinante podem ser quiméricos, significando que pelo menos um de seus componentes é heterólogo com relação a pelo menos um de seus outros componentes.
(2) Plasmídeo
[00177] O um ou mais vetores podem ser um plasmídeo. O plasmídeo pode ser útil para transfectar células com o construto de sequência de ácido nucleico recombinante. O plasmídeo pode ser útil para introduzir o construto de sequência de ácido nucleico recombinante no sujeito. O plasmídeo também pode compreender uma sequência regulatória, que pode ser bem adequada para a expressão de gene em uma célula em que o plasmídeo é administrado.
[00178] O plasmídeo também pode compreender uma origem mamífera de replicação a fim de manter o plasmídeo de forma extracromossômica e produzir cópias múltiplas do plasmídeo em uma célula. O plasmídeo pode ser pVAXI, pCEP4 ou pREP4 da Invitrogen (San Diego, CA), que pode compreender a origem de replicação do vírus Epstein-Barr e da região de codificação EBNA-1 do antígeno nuclear, que pode produzir replicação epissomal de alta cópia sem integração. A cadeia principal do plasmídeo pode ser pAV0242. O plasmídeo pode ser um plasmídeo de adenovírus defeituoso de replicação de tipo 5 (Ad5).
[00179] O plasmídeo pode ser pSE420 (Invitrogen, São Diego, Calif.), o qual pode ser usado para a produção de proteína em Escherichia coli (E.coli). O plasmídeo também pode ser pYES2 (Invitrogen, São Diego, Calif.), o qual pode ser usado para a produção de proteína em cepas de Saccharomyces cerevisiae de levedura. O plasmídeo também pode ser do sistema de expressão de baculovírus completo de MAXBAC™ (Invitrogen, São Diego, Calif.), o qual pode ser usado para a produção de proteína em células de inseto. O plasmídeo também pode ser pcDNAI ou o pcDNA3 (Invitrogen, São Diego, Calif.), o qual podem ser usado para a produção de proteína em células mamíferas, tais como as células de ovário de hamster chinês (CHO).
(3) Vetor Circular e Linear
[00180] O um ou mais vetores podem ser plasmídeo circular, que pode transformar uma célula-alvo por integração no genoma celular ou existir de forma extracromossômica (por exemplo, plasmídeo replicação autônoma com uma origem de replicação). O vetor pode ser pVAX, pcDNA3.0, ou provax ou qualquer outro vetor de expressão capaz de expressar o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve codificado pelo construto de sequência de ácido nucleico recombinante.
[00181] Também é provido neste documento um ácido nucleico linear ou cassete de expressão linear ("LEC"), que é capaz de ser entregue de forma eficaz a um sujeito por meio de eletroporação e expressando o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve codificado pelo construto de sequência de ácido nucleico recombinante. O LEC pode ser qualquer DNA linear desprovido de qualquer cadeia principal de fosfato. O LEC pode não conter quaisquer genes de resistência ao antibiótico e/ou uma cadeia principal de fosfato. O LEC pode não conter outras sequências de ácido nucleico não relacionadas à expressão de gene desejado.
[00182] O LEC pode ser derivado a partir de qualquer plasmídeo capaz de ser linearizado. O plasmídeo pode ser capaz de expressar o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve codificado pelo construto de sequência de ácido nucleico recombinante. O plasmídeo pode ser pNP (Porto Rico/34) ou pM2 (Nova Caledônia/99). O plasmídeo pode ser WLV009, pVAX, pcDNA3.0, ou provax ou qualquer outro vetor de expressão capaz de expressar o polipeptídeo de cadeia pesada e/ou polipeptídeo de cadeia leve codificado pelo construto de sequência de ácido nucleico recombinante.
[00183] O LEC pode ser pcrM2. O LEC pode ser pcrNP. pcrNP e pcrMR podem ser derivados de pNP (Porto Rico/34) e pM2 (Nova Caledônia/99), respectivamente.
(4) Método para Preparar o Vetor
[00184] É provido neste documento um método para preparar o um ou mais vetores em que o construto de sequência de ácido nucleico recombinante foi colocado. Após a etapa de subclonagem final, o vetor pode ser usado para inocular uma cultura de células em um tanque de fermentação em larga escala usando métodos conhecidos na técnica.
[00185] Em outras modalidades, após a etapa de subclonagem final, o vetor pode ser usado com um ou mais dispositivos de eletroporação (EP). Os dispositivos de EP são descritos abaixo em mais detalhes.
[00186] O um ou mais vetores podem ser formulados ou fabricados usando uma combinação de dispositivos e técnicas conhecidos, mas preferencialmente são fabricados usando uma técnica de fabricação de plasmídeo que é descrita em um pedido provisório licenciado e co-pendente U.S. com o no. de série 60/939.792, que foi depositado em 23 de maio de 2007. Em alguns exemplos, os plasmídeos de DNA descritos neste documento podem ser formulados em concentrações maiores ou iguais a 10 mg/mL. As técnicas de fabricação incluem ou incorporam também vários dispositivos e protocolos que geralmente são conhecidos por aqueles versados na técnica, além daqueles descritos no pedido U.S. com o no. de série 60/939792, incluindo os descritos em uma patente licenciada, a patente US No. 7.238.522, publicada em 03 de julho de 2007. O pedido e a patente referenciados acima, a patente U.S. com no. de série 60/939.792 e a patente US No. 7.238.522, respectivamente, são aqui incorporadas na sua totalidade.
4. Anticorpo
[00187] Conforme descrito acima, a sequência de ácido nucleico recombinante pode codificar o anticorpo, um fragmento deste, uma variante deste ou uma combinação deste. O anticorpo sintético pode se ligar a ou reagir com uma molécula alvo desejada, que pode ser o antígeno, discutido em mais detalhes a seguir, um ligante, incluindo um ligante para um receptor, um receptor, incluindo um local de ligação ao ligante no receptor, um complexo ligante-receptor e um marcador, incluindo um marcador de câncer.
[00188] O anticorpo pode compreender uma região de determinação de complementaridade ("CDR") de cadeia pesada e uma de cadeia leve ajustada, respectivamente, interposta entre uma estrutura de cadeia pesada e uma estrutura de cadeia leve ("FR") ajustada, que provê suporte para as CDRs e definir a relação espacial das CDRs em relação entre si. A CDR ajustada pode conter três regiões hipervariáveis de uma região V de cadeia pesada ou leve. Proveniente do N-terminal de uma cadeia pesada ou leve, estas regiões são denotadas conforme "CDR1", "CDR2" e "CDR3", respectivamente. Um local de ligação de antígeno, portanto, pode incluir seis CDRs, compreendendo a CDR ajustada a partir de cada uma dentre uma região V de cadeia pesada e uma leve.
[00189] A papaína de enzima proteolítica preferencialmente cliva moléculas de IgG para produzir vários fragmentos, cujos dois (os fragmentos F(ab)) de cada um compreende um heterodímero covalente que inclui um local de ligação de antígeno intacto. A enzima pepsina é capaz de clivar as moléculas de IgG para prover vários fragmentos, incluindo o fragmento F(ab')2 , que compreende ambos os locais de ligação de antígeno. Por conseguinte, o anticorpo pode ser o Fab ou F(ab')2. O Fab pode incluir o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada do Fab pode incluir a região VH e a região de CH1. A cadeia leve do Fab pode incluir a região VL e a região CL.
[00190] O anticorpo pode ser uma imunoglobulina (Ig). A Ig pode ser, por exemplo, IgA, IgM, IgD, IgE e IgG. A imunoglobulina pode incluir o polipeptídeo de cadeia pesada e o polipeptídeo de cadeia leve. O polipeptídeo de cadeia pesada da imunoglobulina pode incluir uma região VH, uma região CH1, uma região de dobradiça, uma região CH2 e uma região CH3. O polipeptídeo de cadeia leve da imunoglobulina pode incluir uma região VL e uma região CL.
[00191] O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal ou monoclonal. O anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, um anticorpo de cadeia única, um anticorpo de maturação de afinidade, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano. O anticorpo humanizado pode ser um anticorpo a partir de uma espécie de não humana que se liga ao antígeno desejado tendo uma ou mais regiões de determinação de complementaridade (CDRs) a partir das espécies não humanas e regiões de estrutura a partir de uma molécula de imunoglobulina humana.
[00192] O anticorpo pode ser um anticorpo biespecífico, tal como descrito abaixo em mais detalhes. O anticorpo pode ser um anticorpo bifuncional, como também é descrito abaixo em mais detalhes.
[00193] Como descrito acima, o anticorpo pode ser gerado no indivíduo por administração da composição ao indivíduo. O anticorpo pode ter uma meia-vida no interior do indivíduo. Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser modificado para estender ou abreviar sua meia-vida no indivíduo. Tais modificações são descritas abaixo em mais detalhes.
a. Anticorpo biespecífico
[00194] A sequência de ácido nucleico recombinante pode codificar um anticorpo biespecífico, um fragmento deste, uma variante deste ou uma combinação deste. O anticorpo biespecífico pode se ligar ou reagir com dois antígenos, por exemplo, dois dos antígenos descritos abaixo em mais detalhes. O anticorpo biespecífico pode ser composto de fragmentos de dois dos anticorpos aqui descritos, permitindo assim que o anticorpo biespecífico se ligue ou reaja com duas moléculas alvo desejadas, que podem incluir o antígeno, descrito abaixo em mais detalhes, um ligante, incluindo um ligante para um receptor, um receptor, incluindo um local de ligação a ligante no receptor, um complexo ligante-receptor, e um marcador, incluindo um marcador de câncer.
b. Anticorpos bifuncionais
[00195] A sequência de ácido nucleico recombinante pode codificar um anticorpo bifuncional, um fragmento deste, uma variante deste ou uma combinação deste. O anticorpo bifuncional pode se ligar ou reagir com o antígeno que é descrito abaixo. O anticorpo bifuncional também pode ser modificado para conferir uma funcionalidade adicional ao anticorpo, além do reconhecimento de uma ligação ao antígeno. Tal modificação pode incluir, mas não está limitada ao, acoplamento ao fator H ou um fragmento deste. O fator H é um regulador solúvel de ativação do complemento e, assim, pode contribuir para uma resposta imunológica através de lise mediada por complemento (CML).
c. Extensão da meia-vida do anticorpo
[00196] Como descrito acima, o anticorpo pode ser modificado para prolongar ou encurtar a meia-vida do anticorpo no indivíduo. A modificação pode prolongar ou encurtar a meia-vida do anticorpo no soro do indivíduo.
[00197] A modificação pode estar presente em uma região constante do anticorpo. A modificação pode ser uma ou mais substituições de aminoácidos de uma região constante do anticorpo que prolongam a meia-vida do anticorpo em comparação com uma meia-vida de um anticorpo que não contém uma ou mais substituições de aminoácidos. A modificação pode ser uma ou mais substituições de aminoácidos no domínio CH2 do anticorpo que prolongam a meia-vida do anticorpo em comparação com uma meia-vida de um anticorpo que não contém uma ou mais substituições de aminoácidos.
[00198] Em algumas modalidades, a uma ou mais substituições de aminoácidos na região constante pode incluir a substituição do resíduo de metionina na regão constante por um resíduo de tirosina, um resíduo de serina na região constante por um resíduo de treonina, um resíduo de treonina na região constante por um resíduo de glutamato ou qualquer combinação destes, estendendo a meia-vida do anticorpo.
[00199] Em outras modalidades, a uma ou mais substituições de aminoácidos na região constante pode incluir a substituição do resíduo de metionina no domínio CH2 por um resíduo de tirosina, um resíduo de serina no domínio CH2 por um resíduo de treonina, um resíduo de treonina no domínio CH2 por um resíduo de glutamato ou qualquer combinação destes, estendendo a meia-vida do anticorpo.
5. Antígeno
[00200] O anticorpo sintético é direcionado ao antígeno ou fragmento ou a uma variante deste. O antígeno pode ser uma sequência de ácido nucleico, uma sequência de aminoácido ou uma combinação destas. A sequência de ácido nucleico pode ser DNA, RNA, cDNA, uma variante destes, um fragmento destes ou uma combinação destes. A sequência de aminoácidos pode ser uma proteína, um peptídeo, uma variante destes, um fragmento destes ou uma combinação destes.
[00201] O antígeno pode ser de qualquer número de organismos, por exemplo, um vírus, um parasita, uma bactéria, um fungo ou um mamífero. O antígeno pode ser associado com uma doença auto-imune, alergia ou asma. Em outras modalidades, o antígeno pode ser associado com câncer, herpes, gripe, hepatite B, hepatite C, vírus do papiloma humano (HPV), ou vírus da imunodeficiência humana (HIV).
[00202] Em algumas modalidades, o antígeno é estranho. Em algumas modalidades, o antígeno é um auto-antígeno.
a. Antígenos Estranhos
[00203] Em algumas modalidades, o antígeno é estranho. Um antígeno estranho é qualquer substância que não seja própria (ou seja, tem origem externa ao sujeito) que, quando introduzida no corpo, é capaz de estimular uma resposta imune.
(1) Antígenos Virais
[00204] O antígeno estranho pode ser um antígeno viral, ou fragmento deste ou variante deste. O antígeno viral pode ser de um vírus de uma das seguintes famílias: Adenoviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Coronaviridae, Filoviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Orthomyxoviridae, Papovaviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae, Reoviridae, Retroviridae, Rhabdoviridae ou Togaviridae. O antígeno viral pode ser do vírus de imunodeficiência humana (HIV), vírus Chikungunya (CHIKV), febre do vírus da dengue, vírus do papiloma , por exemplo, vírus do papiloma humano (HPV),vírus da poliomielite, vírus da hepatite, por exemplo, vírus da hepatite A (HAV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da hepatite D (HDV) e vírus da hepatite E (HEV), vírus da varíola (varíola maior e menor), vírus vaccinia, vírus da gripe, rinovírus, vírus da encefalite equina, vírus da rubéola, vírus da febre amarela, vírus Norwalk, vírus da hepatite A, vírus de leucemia de células T humanas (HTLV-i), vírus da leucemia de células pilosas (HTLV- II), vírus da encefalite da Califórnia, Hanta vírus (febre hemorrágica), vírus da raiva, vírus de febre de ebola, vírus de Marburg, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus sincicial respiratório (VSR), herpes simplex 1 (herpes oral), herpes simplex 2 (herpes genital), herpes zoster (varicela-zoster, também conhecido como varicela) , citomegalovírus (CMV), por exemplo CMV humano, vírus de Epstein - Barr (EBV), flavivirus, vírus da doença de febre aftosa, vírus de lassa, arenavírus ou vírus causador de câncer.
(a) Antígeno do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)
[00205] O antígeno viral pode ser do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). Em algumas modalidades, o antígeno do HIV pode ser uma proteína do envelope de subtipo A, proteína do envelope de subtipo B, proteína do envelope de subtipo C, proteína do envelope de subtipo D, proteína Nef-Rev subtipo B, proteína Gag subtipo A, B, C, ou D, proteína MPol, um ácido nucléico ou sequências de aminoácido de Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, Gag ou qualquer combinação destes.
[00206] Um anticorpo sintético específico para o HIV pode incluir um fragmento Fab compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO.: 48, que é codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO.: 3, e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO.: 49, que é codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO.: 4. O anticorpo sintético pode compreender a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:46, que é codificada pela sequência do ácido nucleico da SEQ ID NO:6, e a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:47, que é codificada pela sequência do ácido nucleico da SEQ ID NO:7. O fragmento Fab compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO.: 51, que é codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO.: 50. O Fab pode compreender a sequência de aminoácido de SEQ ID NO.: 53, que é codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO.: 52.
[00207] Um anticorpo sintético específico para o HIV pode incluir uma Ig compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO.: 5. A Ig pode compreender a sequência de aminoácido de SEQ ID NO.: 1, que é codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO.: 62. A Ig pode compreender a sequência de aminoácido de SEQ ID NO.: 2, que é codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO.: 63. A Ig pode compreender a sequência de aminoácido de SEQ ID NO.: 55, que é codificada pela sequência do ácido nucleico de SEQ ID NO.: 54, e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO.: 57, que é codificada pela sequência do ácido nucleico de SEQ ID NO.: 56.
(b) Vírus Chikungunya
[00208] O antígeno viral pode ser do vírus Chikungunya. O vírus Chikungunya pertence ao gênero alphavirus da família Togaviridae. O vírus Chikungunya é transmitido aos seres humanos pela picada de mosquitos infectados, tal como o gênero Aedes.
[00209] Em uma modalidade, um anticorpo sintético específico para CHIKV pode ser codificado pela sequência de ácidos nucleicos recombinante que inclui o primeiro e segundo construto de ácidos nucleicos recombinante no arranjo 1, conforme descrito em mais detalhes acima. Um anticorpo sintético específico para o CHIKV pode incluir um fragmento Fab compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO.: 59, que é codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO.: 58, e a sequência de aminoácido de SEQ ID NO.: 61, que é codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO.: 60.
[00210] Em outra modalidade, um anticorpo sintético específico para CHIKV pode ser codificado pela sequência de ácidos nucleicos recombinante que inclui o construto de ácidos nucleicos recombinante no arranjo 2, conforme descrito em mais detalhes acima. Um anticorpo sintético específico para o CHIKV pode incluir uma imunoglobulina (Ig) compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO.: 66, que é codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO.: 65.
[00211] O anticorpo sintético específico para CHIKV pode proporcionar proteção contra exposições precoces e tardias ao CHIKV. O anticorpo sintético específico para CHIKV pode proporcionar proteção contra diferentes vias de exposição a CHIKV, por exemplo, mas não limitado a, via subcutânea ou intranasal. O anticorpo sintético específico para CHIKV pode proporcionar proteção contra a infecção por CHIKV, resultando assim na sobrevivência da infecção.
(c) Vírus da Dengue
[00212] O antígeno viral pode ser do vírus da Dengue. O antígeno do vírus da Dengue pode ser um dentre três proteínas ou polipeptídeos (C, prM e E) que formam a partícula de vírus. O antígeno de vírus da Dengue pode ser um dentre sete outras proteínas ou polipeptídeos (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5) que estão envolvidos na replicação do vírus. O vírus da Dengue pode ser um dentre cinco cepas ou sorotipos do vírus, incluindo DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. O antígeno pode ser qualquer combinação de uma pluralidade de antígenos de vírus da Dengue.
[00213] Em uma modalidade, um anticorpo sintético para CHIKV pode ser codificado pela sequência de ácidos nucleicos recombinante que inclui o construto de ácidos nucleicos recombinante no arranjo 2, conforme descrito em mais detalhes acima. Um anticorpo sintético específico para o vírus da Dengue pode incluir uma Ig compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 45, que é codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 44. Um anticorpo sintético específico para o vírus da Dengue pode incluir uma Ig compreendendo a sequência de aminoácido de Identificação de Sequência N°: 45, que é codificada pela sequência de ácido nucleico de Identificação de Sequência N°: 44. Um anticorpo sintético específico para o vírus da Dengue pode incluir uma Ig compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:72, que é codificada pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:71. Ainda em outra modalidade, um anticorpo sintético específico para o vírus da Dengue pode incluir uma Ig compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:76, que é codificada pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:75.
[00214] Em algumas modalidades, o anticorpo sintético específico para o vírus da Dengue pode incluir uma ou mais substituições de aminoácido que reduzem ou previnem a ligação do anticorpo ao FcyR1a. As substituições de um ou mais aminoácidos pode se dar na região constante do anticorpo. A uma ou mais substituições de aminoácidos pode incluir a substituição de um resíduo de leucina por um resíduo de alanina na região constante do anticorpo, também referida aqui como LA, mutação de LA ou substituição de LA. A uma ou mais substituições de aminoácidos pode incluir a substituição de dois resíduos de leucina por um resíduo de alanina na região constante do anticorpo, também referida aqui como LALA, mutação de LALA ou substituição de LALA. A presença da substituição de LALA pode impedir ou bloquear o anticorpo de se ligar ao FcyR1a e, assim, o anticorpo não reforça ou causa ADE, mas ainda assim neutraliza DENV.
[00215] Em algumas modalidades, um anticorpo sintético específico para o vírus da Dengue e contendo a substituição de LALA pode incluir uma Ig compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:70, que é codificada pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:69. Em outras modalidades, um anticorpo sintético específico para o vírus da Dengue e contendo a substituição de LALA pode incluir uma Ig compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:74, que é codificada pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:73. Em outras modalidades, ainda, um anticorpo sintético específico para o vírus da Dengue e contendo a substituição de LALA pode incluir uma Ig compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO:78, que é codificada pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:77.
[00216] Em algumas modalidades, o anticorpo sintético específico para o vírus da Dengue pode ser uma combinação de anticorpos anti-Dengue, por exemplo: dois ou mais, três ou mais ou quatro ou mais anticorpos. Tal combinação pode proporcionar a neutralização de vérios serotipos de DENV.
(d) Antígeno da Hepatite
[00217] O antígeno viral pode incluir um antígeno de vírus da hepatite (isto é, antígeno da hepatite), ou um fragmento deste ou uma variante deste. O antígeno da hepatite pode ser um antígeno ou imunógeno de um ou mais dentre os vírus da hepatite A (HAV), vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C (HCV), vírus da Hepatite D (HDV), e/ou vírus da hepatite E (HEV).
[00218] O antígeno da hepatite pode ser um antígeno de HAV. O antígeno de hepatite pode ser uma proteína de capsídeo HAV, uma proteína não estrutural de HAV, um fragmento desta, uma variante desta ou uma combinação destas.
[00219] O antígeno da hepatite pode ser um antígeno de HCV. O antígeno de hepatite pode ser uma proteína nucleocápside de HCV (isto é, proteína nuclear), uma proteína de envelope de HCV (por exemplo, E1 e E2), uma proteína não estrutural de HCV (por exemplo, NS1, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a e NS5B), um fragmento seu, uma variante sua ou uma combinação sua.
[00220] O antígeno da hepatite pode ser um antígeno de HDV. O antígeno de hepatite pode ser um antígeno delta de HDV, fragmento deste ou variante deste.
[00221] O antígeno da hepatite pode ser um antígeno de HEV. O antígeno da hepatite pode ser uma proteína de capsídeo de HEV, fragmento desta ou variante desta.
[00222] O antígeno da hepatite pode ser um antígeno de HBV. O antígeno da hepatite pode ser uma proteína de núcleo de HBV, uma proteína de superfície de HBV, uma polimerase de DNA de HBV, uma proteína de HBV codificada pelo gene X, fragmento destas, variante destas ou combinação destas. O antígeno da hepatite pode ser uma proteína de núcleo do genótipo A de HBV, uma proteína de núcleo de genótipo B de HBV, uma proteína de núcleo de genótipo C de HBV, uma proteína de núcleo de genótipo D de HBV, uma proteína de núcleo de genótipo E de HBV, uma proteína de núcleo de genótipo F de HBV, uma proteína de núcleo de genótipo G de HBV, uma proteína de núcleo de genótipo H de HBV, uma proteína de superfície de genótipo A de HBV, uma proteína de superfície de genótipo B de HBV, uma proteína de superfície de genótipo C de HBV, uma proteína de superfície de genótipo D de HBV, uma proteína de superfície de genótipo E de HBV, uma proteína de superfície de genótipo F de HBV, uma proteína de superfície de genótipo G de HBV, uma proteína de superfície de genótipo H de HBV, fragmento destas, variante destas ou combinação destas.
[00223] Em algumas modalidades, o antígeno da hepatite pode ser um antígeno de HBV de genótipo A, HBV de genótipo B, HBV de genótipo C, HBV de genótipo D, HBV de genótipo E, HBV de genótipo F, HBV de genótipo G ou HBV de genótipo H.
(e) Antígeno de Vírus do Papiloma Humano (HPV)
[00224] O antígeno viral pode compreender um antígeno de HPV. O antígeno de HPV pode ser de HPV tipos 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 e 58 que causam câncer cervical, câncer de reto e/ou outros tipos de câncer. O antígeno de HPV pode ser de HPV tipos 6 e 11, que causam verrugas genitais e são conhecidos por serem causas de câncer de cabeça e pescoço.
[00225] Os antígenos de HPV podem ser os domínios E6 ou E7 de HPV de cada tipo de HPV. Por exemplo, para HPV tipo 16 (HPV16), o antígeno de HPV16 pode incluir o antígeno de HPV16 E6, o antígeno de HPV16 E7, fragmentos, variantes ou combinações destes. Similarmente, o antígeno de HPV pode ser HPV 6 E6 e/ou E7, HPV 11 E6 e/ou E7, HPV 18 E6 e/ou E7, HPV 31 E6 e/ou E7, HPV 33 E6 e/ou E7, HPV 52 E6 e/ou E7 ou HPV 58 E6 e/ou E7, fragmentos, variantes ou combinações destes.
(f) Antígeno de VRS
[00226] O antígeno viral pode compreender um antígeno de VRS. O antígeno de VRS pode ser uma proteína de fusão de RSV humano (também referida como "RSV F", "proteína de RSV F" e "Proteína F"), ou fragmento ou variante destas. A proteína de fusão de RSV humana pode ser conservada entre os subtipos RSV A e B. PO antígeno de RSV pode ser uma proteína RSV F ou um fragmento ou variante desta, da cepa longa de RSV (GenBank AAX23994.1). O antígeno de VRS pode ser uma proteína de RSV F da cepa A2 de RSV (GenBank AAB59858.1), ou um fragmento ou variante desta. O antígeno de RSV pode ser um monômero, um dímero ou trímero de proteína de RSV F, ou um fragmento ou variante desta.
[00227] A proteína RSV F pode ser em uma forma de pré-fusão ou uma forma pós-fusão. A forma pós-fusão de RSV F suscita anticorpos de neutralização de título elevado em animais imunizados e protege os animais de desafio de RSV.
[00228] O antígeno de RSV também pode ser glicoproteína de ligação de RSV humana (também referida neste documento como "RSV G", "proteína RSV G" e "Proteína G"), ou fragmento ou variante destas. A proteína de RSV G humana diferente entre os subtipos A e B de RSV. O antígeno pode ser uma proteína RSV G, ou um fragmento ou variante sua, de uma cepa longa de RSV (GenBank AAX23993). O antígeno de RSV pode ser proteína RSV G de subtipo B H5601 isolado, o RSV de subtipo B H1068 isolado, o RSV de subtipo B H5598 isolado, o RSV de subtipo B H1123 isolado, ou um fragmento ou variante destes.
[00229] Em outras modalidades, o antígeno de RSV pode ser proteína não estrutural de RSV humano 1 ("proteína NS1"), ou fragmento ou variante desta. Por exemplo, o antígeno de RSV pode ser proteína NS1 de RSV, ou fragmento ou variante desta, da cepa longa de RSV (GenBank AAX23987.1). O antígeno de RSV humano também pode ser proteína não estrutural de RSV humano 2 ("proteína NS2"), ou fragmento ou variante desta. Por exemplo, o antígeno de RSV pode ser proteína NS2 de RSV, ou fragmento ou variante desta, da cepa longa de RSV (GenBank AAX23988.1). O antígeno de VRS pode ser, adicionalmente, proteína do nucleocapsídeo ("N") de RSV humano, ou fragmento ou variante desta. Por exemplo, o antígeno de RSV pode ser proteína N de RSV, ou fragmento ou variante desta, da cepa longa de RSV (GenBank AAX23989.1). O antígeno de RSV pode ser proteína de fosfoproteína ("P") de RSV humano, ou fragmento ou variante desta. Por exemplo, o antígeno de RSV pode ser proteína P de RSV, ou fragmento ou variante desta, da cepa longa de RSV (GenBank AAX23990.1). O antígeno de RSV também pode ser proteína de matriz ("M") de RSV humano, ou fragmento ou variante desta. Por exemplo, o antígeno de RSV pode ser proteína M de RSV, ou fragmento ou variante desta, da cepa longa de RSV (GenBank AAX23991.1).
[00230] Ainda em outras modalidades, o antígeno de RSV pode ser proteína hidrofóbica pequena ("SH") de RSV humano, ou fragmento ou variante desta. Por exemplo, o antígeno de RSV pode ser proteína SH de RSV, ou fragmento ou variante desta, da cepa longa de RSV (GenBank AAX23992.1). O antígeno de RSV também pode ser proteína de matriz 2-1 ("M2-1") de RSV humano, ou fragmento ou variante desta. Por exemplo, o antígeno de RSV pode ser proteína M2-1 de RSV, ou fragmento ou variante desta, da cepa longa de RSV (GenBank AAX23995.1). O antígeno de RSV também pode ser, adicionalmente, proteína de matriz 2-2 ("M2-2") de RSV humano, ou fragmento ou variante desta. Por exemplo, o antígeno de RSV pode ser proteína M2-2 de RSV, ou fragmento ou variante desta, da cepa longa de RSV (GenBank AAX23997.1). O antígeno de RSV humano pode ser proteína de polimerase L ("L") de RSV, ou fragmento ou variante desta. Por exemplo, o antígeno de RSV pode ser proteína L de RSV, ou fragmento ou variante desta, da cepa longa de RSV (GenBank AAX23996.1).
[00231] Em modalidades adicionais, o antígeno de RSV pode ter uma sequência de aminoácidos otimizada de proteína NS1, NS2, N, P, M, SH, M21, M2-2 ou L. O antígeno de RSV pode ser uma proteína de RSV humano ou antígeno recombinante, tal como qualquer uma das proteínas codificadas pelo genoma de RSV humano.
[00232] Em outras modalidades, o antígeno de RSV pode ser, mas não está limitado a, a proteína F de RSV da cepa longa de RSV, a proteína G de RSV da cepa longa de RSV, o aminoácido otimizado de sequência de aminoácido G de RSV, o genoma de RSV humano da cepa longa de RSV, o aminoácido otimizado de sequência de aminoácido F de RSV, a proteína NS1 de RSV da cepa longa de RSV, a proteína NS2 de RSV da cepa longa de RSV, a proteína N de RSV da cepa longa de RSV, a proteína P de RSV da cepa longa de RSV, a proteína M de RSV da cepa longa de RSV, a proteína SH de RSV da cepa longa de RSV, a proteína M2-1 de RSV da cepa longa de RSV, a proteína M2-2 de RSV da cepa longa de RSV, a proteína L de RSV da cepa longa de RSV, a proteína G de RSV do RSV subtipo B H5601 isolado, a proteína G de RSV do RSV subtipo B H1068 isolado, a proteína G de RSV do RSV subtipo B H5598 isolado, a proteína G de RSV do RSV subtipo B H1123 isolado, ou fragmento ou variante destas.
(g) Antígeno da Influenza
[00233] O antígeno viral pode compreender um antígeno do vírus da gripe. Os antígenos da gripe são aqueles capazes de suscitar uma resposta imune em um mamífero contra um ou mais sorotipos de gripe. O antígeno pode compreender o produto de translação de comprimento total HA0, subunidade HA1, subunidade HA2, uma variante deste, um fragmento deste ou uma combinação deste. O antígeno de hemaglutinina da influenza pode ser derivado de múltiplas cepas de sorotipo da influenza A sorotipo H1, sorotipo H2, uma sequência de híbrido derivada de diferentes conjuntos de múltiplas cepas da influenza A sorotipo H1, ou derivadas de múltiplas cepas de influenza B. O antígeno de hemaglutinina da influenza pode ser de influenza B.
[00234] O antígeno da gripe também pode conter pelo menos um epítopo antigênico que pode ser eficaz contra imunógenos de influenza particular contra o qual uma resposta imune pode ser induzida. O antígeno pode prover um repertório completo de locais imunogênicos e epítopos presentes em um vírus de influenza intacto. O antígeno pode ser derivado de sequências de antígeno de hemaglutinina de uma pluralidade de cepas de vírus de influenza A de um serotipo, tal como uma pluralidade de cepas de vírus de influenza A de serotipo H1 ou do serotipo H2. O antígeno pode ser uma sequência de antígeno de hemaglutinina híbrida derivada da combinação de duas sequências de antígeno de hemaglutinina diferentes ou porções destas. Cada uma das duas sequências de antígeno de hemaglutinina diferentes pode ser derivada de um conjunto diferente de uma pluralidade de cepas de vírus de influenza A de um serotipo, tal como uma pluralidade de cepas de vírus de influenza A de serotipo H1. O antígeno pode ser uma sequência de antígeno de hemaglutinina derivada de sequências de antígeno de hemaglutinina de uma pluralidade de cepas de vírus influenza B.
[00235] Em algumas modalidades, o antígeno de influenza pode ser H1 HA, H2 HA, H3 HA, H5 HA ou um antígeno de BHA.
(h) Vírus Ebola
[00236] O antígeno viral pode ser do vírus Ebola. O vírus Ebola (EVD) ou de febre hemorrágica pelo Ebola (EHF) inclui qualquer um dos quatro dos cinco vírus ebola conhecidos incluindo vírus Bundibugyo (BDBV), vírus Ebola (EBOV), vírus Sudão (SUDV) e vírus da floresta Tai (Tai Forest) (TAFV, também conhecido como vírus Ebola de d'Ivoire Côte (Vírus Ebola da Costa do Marfim, CIEBOV).
(2) Antígenos Bacterianos
[00237] O antígeno estranho pode ser um antígeno bacteriano, ou fragmento ou variante deste. A bactéria pode ser de qualquer um dos seguintes filos: Acidobacteria, Actinobacteria, Aquificae, Bacteroidetes, Caldiserica, Chlamydiae, Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Cyanobacteria, Deferribacteres, Deinococcus-Thermus, Dictyoglomi, Elusimicrobia, Fibrobacteres, Firmicutes, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Nitrospira, Planctomycetes, Proteobacteria, Spirochaetes, Synergistetes, Tenericutes, Thermodesulfobacteria, Thermotogae e Verrucomicrobia.
[00238] A bactéria pode ser uma bactéria gram positiva ou uma bactéria gram negativa. A bactéria pode ser uma bactéria aeróbica ou uma bactéria anaeróbica. A bactéria pode ser uma bactéria autotrófica ou uma bactéria heterotrófica. A bactéria pode ser um mesófilo, um neutrófilo, um extremófilo, um acidófilo, um alcalifílico, um termófilo, um psicrófilo, um halófilo ou um osmófilo.
[00239] A bactéria pode ser uma bactéria de antraz, uma bactéria resistente a antibiótico, uma bactéria causadora de doença, uma bactéria de intoxicação alimentar, uma bactéria infecciosa, bactéria Salmonella, bactéria Staphylococcus, bactéria Streptococcus ou bactéria do tétano. A bactéria pode ser uma micobacteria, Clostridium tetani, Yersinia pestis, Bacillus anthracis, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ou Clostridium difficile. A bactéria pode ser Mycobacterium tuberculosis.
(a) Antígenos de Mycobacterium tuberculosis
[00240] O antígeno bacteriano pode ser um antígeno de Mycobacterium tuberculosis (isto é, antígeno TB ou imunógeno TB) ou um fragmento ou uma variante sua. O antígeno TB pode ser da família Ag85 de antígenos TB, por exemplo, Ag85A e Ag85B. O antígeno TB pode ser da família Esx de antígenos TB, por exemplo, EsxA, EsxB, EsxC, EsxD, EsxE, EsxF, EsxH, EsxO, EsxQ, EsxR, EsxS, EsxT, EsxU, EsxV e EsxW.
(3) Antígenos Parasitários
[00241] O antígeno estranho pode ser um antígeno parasitário, ou fragmento ou variante deste. O parasita pode ser um protozoário, helminto ou ectoparasita. O helminto (isto é, verme) pode ser um platelminto (por exemplo, fascíolas e tênias), um verme de cabeça espinhosa ou um verme cilíndrico (por exemplo, oxiúros). O ectoparasita pode ser piolhos, pulgas, carrapatos e ácaros.
[00242] O parasita pode ser qualquer parasita causando qualquer uma das seguintes doenças: Ceratite por Acanthamoeba, amebíase, ascaridíase, babesiose, balantidíase, Baylisascariasis, doença de Chagas, Clonorchiasis, Cochliomyia, criptosporidíase, difilobotríase, dracunculíase, equinococose, elefantíase, enterobíase, fasciolíase, fasciolopsíase, filariose, giardíase, gnatostomíase, himenolepíase, isosporíase, febre Katayama, leishmaniose, doença de Lyme, malária, metagonimíase, miíase, oncocercose, pediculose, escabiose, esquistossomose, doença do sono, estrongiloidíase, teníase, toxocaríase, toxoplasmose, triquinose e tricuríase.
[00243] O parasita pode ser Acanthamoeba, Anisakis, Ascaris lumbricoides, Botfly, Balantidium coli, Bedbug, Cestoda (tapeworm), Chiggers, Cochliomyia hominivorax, Entamoeba histolytica, Fasciola hepatica, Giardia lamblia, Hookworm, Leishmania, Linguatula serrata, Liver fluke, Loa loa, Paragonimus - lung fluke, Pinworm, Plasmodium falciparum, Schistosoma, Strongyloides stercoralis, Mite, Tapeworm, Toxoplasma gondii, Trypanosoma, Whipworm ou Wuchereria bancrofti.
(a) Antígeno da Malária
[00244] O antígeno estranho pode ser um antígeno de malária (isto é, antígeno PF ou imunógeno PF) ou um fragmento ou uma variante sua. O antígeno pode ser de um parasita causador de malária. O parasita causador de malária pode ser Plasmodium falciparum. O antígeno de Plasmodium falciparum pode incluir o antígeno de circunsporozoíta (CS).
[00245] Em algumas modalidades, o antígeno de malária pode ser uma dentre imunógenos de P. falciparum CS; LSA1; TRAP; CelTOS; e Ama1. Os imunógenos podem ser de comprimento total ou fragmentos imunogênicos de proteínas de comprimento total.
[00246] Em outras modalidades, o antígeno de malária pode ser TRAP, que também é referido como SSP2. Ainda em outras modalidades, o antígeno de malária pode ser CelTOS, que também é referido como Ag2 e é um antígeno de Plasmodium altamente conservado. Em modalidades adicionais, o antígeno de malária pode ser Ama1, que é um antígeno de Plasmodium altamente conservado. Em algumas modalidades, o antígeno de malária pode ser um antígeno de CS.
[00247] Em outras modalidades, o antígeno de malária pode ser uma proteína de fusão compreendendo uma combinação de duas ou mais proteínas PF estabelecidas neste documento. Por exemplo, proteínas de fusão podem compreender dois ou mais dentre imunógeno de CS, imunógeno de ConLSA1, imunógeno de ConTRAP, imunógeno de ConCelTOS e imunógeno de ConAma1 ligados diretamente adjacentes entre si ou ligados com um espaçador ou um ou mais aminoácidos no meio. Em algumas modalidades, a proteína de fusão compreende dois imunógenos de PF; em algumas modalidades a proteína de fusão compreende três imunógenos de PF, em algumas modalidades a proteína de fusão compreende quatro imunógenos de PF e em algumas modalidades a proteína de fusão compreende cinco imunógenos de PF. Proteínas de fusão com dois imunógenos de PF podem compreender: CS e LSA1; CS e TRAP; CS e CelTOS; CS e Ama1; LSA1 e TRAP; LSA1 e CelTOS; LSA1 e Ama1; TRAP e CelTOS; TRAP e Ama1; ou CelTOS e Ama1. Proteínas de fusão com três imunógenos de PF podem compreender: CS, LSA1 e TRAP; CS, LSA1 e CelTOS; CS, LSA1 e Ama1; LSA1, TRAP e CelTOS; LSA1, TRAP e Ama1; ou TRAP, CelTOS e Ama1. Proteínas de fusão com quatro imunógenos de PF podem compreender: CS, LSA1, TRAP e CelTOS; CS, LSA1, TRAP e Ama1; CS, LSA1, CelTOS e Ama1; CS, TRAP, CelTOS e Ama1; ou LSA1, TRAP, CelTOS e Ama1. Proteínas de fusão com cinco imunógenos de PF podem incluir CS ou CS-alt, LSA1, TRAP, CelTOS e Ama1.
(4) Antígenos Fúngicos
[00248] O antígeno estranho pode ser um antígeno fúngico, ou fragmento ou variante deste. O fungo pode ser da espécie Aspergillus, Blastomyces dermatitidis, leveduras de Candida (por exemplo, Candida albicans), Coccidioides, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, dermatófito, Fusarium species, Histoplasma capsulatum, Mucoromycotina, Pneumocystis jirovecii, Sporothrix schenckii, Exserohilum ou Cladosporium.
b. Auto-antígenos
[00249] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno próprio. Um antígeno próprio pode ser um constituinte do corpo do próprio sujeito que é capaz de estimular uma resposta imune. Em algumas modalidades, um antígeno próprio não provoca uma resposta imune a menos que o sujeito esteja em um estado de doença, por exemplo, uma doença auto-imune.
[00250] Antígenos próprios podem incluir, mas não estão limitados a, citocinas, anticorpos contra o vírus, tais como aqueles listados acima incluindo HIV e Dengue, antígenos afetando a progressão ou desenvolvimento de câncer e receptores de superfície celular ou proteínas transmembrana.
(1) WT-1
[00251] O antígeno de antígeno próprio pode ser gene 1 de supressor de tumor de Wilm (WT1), um fragmento deste, uma variante deste ou uma combinação deste. WT1 é um fator de transcrição contendo no N-terminal, um domínio de ligação a DNA rico em prolina/glutamina e o C-terminal, quatro motivos de dedo de zinco. WT1 desempenha um papel no desenvolvimento normal do sistema urogenital e interage com inúmeros fatores, por exemplo, p53, um supressor de tumor conhecido e a serino-protease HtrA2, que cliva WT1 em múltiplos locais após o tratamento com um medicamento citotóxico. Mutação de WT1 pode levar à formação de tumor ou câncer, por exemplo, tumor de Wilm ou tumores expressando WT1.
(2) EGFR
[00252] O antígeno próprio pode incluir um receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) ou um fragmento ou variação deste. EGFR (também referido como ErbB-1 e HER1) é o receptor de superfície celular para membros da família de fator de crescimento epidérmico (família EGF) dos ligantes de proteínas extracelulares. EGFR é um membro da família de receptores ErbB, que inclui quatro receptores estreitamente relacionados à tirosina quinase: EGFR (ErbB-1), HER2/c-neu (ErbB-2), Her 3 (ErbB-3) e Her 4 (ErbB-4). Mutações afetando a expressão ou atividade de EGFR podem resultar em câncer.
[00253] O antígeno podem incluir um antígeno ErbB-2. Erb-2 (receptor 2 de fator de crescimento epidérmico humano) também é conhecido como Neu, HER2, CD340 (agrupamento de diferenciação 340), ou p185, e é codificado pelo gene ERBB2. Mostrou-se que que a amplificação ou superexpressão deste gene desempenha um papel no desenvolvimento e progressão de certos tipos agressivos de câncer de mama. Em aproximadamente 25 a 30% das mulheres com câncer de mama, uma alteração genética ocorre no gene ERBB2, resultando na produção de uma quantia aumentada de HER2 na superfície de células tumorais. Esta superexpressão de HER2 promove rápida divisão celular e, deste modo, HER2 marca células tumorais.
[00254] Um anticorpo sintético específico para HER2 pode incluir um fragmento Fab compreendendo a sequência de aminoácido de Identificação de Sequência N°: 41, que é codificada pela sequência de ácido nucleico de Identificação de Sequência N°: 40, e uma sequência de aminoácido de Identificação de Sequência N°: 43, que é codificada pela sequência de ácido nucleico de Identificação de Sequência N°: 42.
(3) Cocaína
[00255] O antígeno próprio pode ser um antígeno de receptor de cocaína. Receptores de cocaína incluem transportadores de dopamina.
(4) PD-1
[00256] O antígeno próprio pode incluir morte programada 1 (PD-1). Morte programada 1 (PD-1) e seus ligantes, PD-L1 e PD-L2, entregam sinais inibitórios que regulam o equilíbrio entre a ativação, tolerância e imunopatologia de célula T. PD-1 é uma molécula de proteína de superfície de célula de aminoácido 288 incluindo um domínio de IgV extracelular seguido por uma região de transmembrana e uma cauda intracelular.
(5) 4-1BB
[00257] O antígeno próprio pode incluir ligante 4-1BB. Ligante 4-1BB é uma glicoproteína transmembrana tipo 2 pertencente à superfamília TNF. Ligante 4-1BB pode ser expresso em linfócitos T ativados. 4-1BB é uma molécula co-estimulatória de células T de ativação induzida. Sinalização por meio de 4-1BB aumenta genes de sobrevivência, intensifica a divisão celular, induz a produção de citocina e previne a morte celular induzida por ativação de células T.
(6) CTLA4
[00258] O antígeno próprio pode incluir CTLA-4 (antígeno 4 de linfócitos T citotóxicos), também conhecido como CD152 (agrupamento de diferenciação 152). CTLA-4 é um receptor de proteína encontrado na superfície de células T, que lidera o ataque imune celular em antígenos. O antígeno pode ser um fragmento de CTLA-4, tal como um domínio V extracelular, um domínio transmembrana e uma cauda citoplasmática ou combinação destes.
(7) IL-6
[00259] O antígeno próprio pode incluir interleucina 6 (IL-6). IL-6 estimula os processos inflamatórios e auto-imunes em muitas doenças, incluindo, mas não limitado a, diabetes, aterosclerose, depressão, doença de Alzheimer, Lúpus eritematoso sistêmico, mieloma múltiplo, câncer, doença de Behçet e artrite reumatoide.
(8) MCP-1
[00260] O antígeno próprio pode incluir proteína-1 quimiotática de monócitos (MCP-1). MCP-1 também é referido como quimiocinas (motivo C-C) ligante 2 (CCL2) ou pequenas citocinas induzíveis A2. MCP-1 é uma citocina que pertence à família de quimiocina CC. MCP-1 recruta monócitos, células T de memória e células dendríticas para os locais de inflamação produzida por lesão ou infecção de tecido.
(9) Beta-amiloide
[00261] O antígeno próprio pode incluir beta-amiloide (A) ou um fragmento ou uma variante deste. O antígeno de Aβ pode compreender um peptídeo de Aβ(X-Y), em que a sequência de aminoácido de posição X de aminoácido para Y de aminoácido da proteína A sequência humana incluindo tanto X quanto Y, em particular para a sequência de aminoácido da posição X de aminoácido para posição Y de aminoácido da sequência de aminoácido DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIATVIVI (correspondente às posições 1 a 47 de aminoácido; a sequência de consulta humana) ou variantes destas. O antígeno de Aβ pode compreender um polipeptídeo de Aβ de um polipeptídeo de Aβ(X-Y), em que X pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 e Y pode ser 47, 46, 45, 44, 43 , 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16 ou 15. O polipeptídeo de Aβ pode compreender um fragmento que tem pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 36, pelo menos 37, pelo menos 38, pelo menos 39, pelo menos 40, pelo menos 41, pelo menos 42, pelo menos 43, pelo menos 44, pelo menos 45 ou pelo menos 46 aminoácidos.
(10) IP-10
[00262] O antígeno próprio pode incluir proteína 10 (IP-10) induzida por interferon gama (IFN). IP-10 também é conhecida como citocina pequeno induzível B10 ou quimiocina 10 de motivo C-X-C (CXCL10). CXCL10 é secretada por vários tipos de células, tais como monócitos, células endoteliais e fibroblastos, em resposta ao IFN-Y.
(11) PSMA
[00263] O antígeno próprio pode incluir o antígeno de membrana específico da próstata (PSMA). PSMA também é conhecido como glutamato carboxipeptidase II (GCPII), N-acetil-L-aspartil-L-glutamato peptidase I (NAALADase I), NAAG peptidase ou folato hidrolase (FOLH). PMSA é uma proteína de membrana integral altamente expressa por células de câncer de próstata.
c. Outros Antígenos
[00264] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno que não seja o antígeno estranho e/ou antígeno próprio.
(a) HIV-1 VRC01
[00265] O outro antígeno pode ser HIV-1 VRC01. HIV-1 VCR01 é um anticorpo de local de ligação neutralizante de CD4 para HIV. HIV-1 VCR01 entra em contato com porções do HIV-1 incluindo dentro do circuito D de gp120, o circuito de ligação de CD4 e região V5 de HIV-1.
(b) HIV-1 PG9
[00266] O outro antígeno pode ser HIV-1 PG9. HIV-1 PG9 é o membro fundador de uma família em expansão de anticorpos humanos dependentes de glicano que se ligam preferencialmente ao trímero de glicoproteína (gp) de envelope (Env) de HIV (HIV-1) e amplamente neutraliza o vírus.
(c) HIV-1 4E10
[00267] O outro antígeno pode ser HIV-1 4E10. HIV-1 4E10 é um anticorpo anti-HIV neutralizante. HIV-1 4E10 é direcionado contra epítopos lineares mapeados para a região externa proximal da membrana (MPER) de HIV-1, que está localizado no C-terminal do ectodomínio gp41.
(d) DV-SF1
[00268] O outro antígeno pode ser DV-SF1. DV-SF1 é um anticorpo neutralizante que se liga à proteína de envelope dos quatro sorotipos de vírus da Dengue.
(e) DV-SF2
[00269] O outro antígeno pode ser DV-SF2. DV-SF2 é um anticorpo neutralizante que se liga a um epítopo do vírus da Dengue. DV-SF2 pode ser específico para o sorotipo DENV4.
(f) DV-SF3
[00270] O outro antígeno pode ser DV-SF3. DV-SF3 é um anticorpo neutralizante que se liga ao filamento EDIII A da proteína de envelope de vírus da Dengue.
6. Excipientes e Outros Componentes da Composição
[00271] A composição pode compreender, adicionalmente, um excipiente farmaceuticamente aceitável. O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser moléculas funcionais, tais como veículos, transportadores ou diluentes. O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser um agente facilitador de transfecção, que pode incluir agentes ativos de superfície, tais como complexos imunoestimulantes (ISCOMS), adjuvante incompleto de Freund, análogo de LPS incluindo lipídio monofosforila A, peptídeos muramila, análogos de quinona, vesículas, tais como esqualeno e esqualeno, ácido hialurônico, lipídios, lipossomas, íons de cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions, ou nanopartículas ou outros agentes facilitadores de transfecção conhecidos.
[00272] O agente facilitador de transfecção é um poliânion, policátion, incluindo poli-L-glutamato (LGS) ou lipídio. O agente facilitador de transfecção é poli-L-glutamato, e o poli-L-glutamato está presente na composição em uma concentração menor do que 6 mg/ml. O agente facilitador de transfecção também pode incluir agentes ativos de superfície, tais como complexos imunoestimulantes (ISCOMS), adjuvante incompleto de Freund, análogo do LPS incluindo lipídio monofosforila A, peptídeos muramila, análogos de quinona e vesículas, tais como esqualeno e esqualeno e ácido hialurônico também pode ser usado administrado em conjunto com a composição. A composição também pode incluir um agente facilitador de transfecção, tal como lipídios, lipossomas, incluindo lipossomas de lecitina ou outros lipossomas conhecidos na técnica, como uma mistura de lipossoma de DNA (vide, por exemplo, W09324640), íons de cálcio, proteínas virais, poliânions, policátions, ou nanopartículas, ou outros agentes facilitadores de transfecção conhecidos. O agente facilitador de transfecção é um poliânion, policátion, incluindo poli-L-glutamato (LGS) ou lipídio. A concentração do agente de transfecção na vacina é de menos de 4 mg/ml, menos de 2 mg/ml, menos de 1 mg/ml, menos de 0,750 mg/ml, menos de 0,500 mg/ml, menos de 0,250 mg/ml, menos de 0,100 mg/ml, menos de 0,050 mg/ml ou menos de 0,010 mg/ml.
[00273] A composição pode compreender ainda um agente facilitador genético, como descrito na patente U.S. com o No. de série 021.579, depositado em 1° de abril de 1994, que é incorporado integralmente por referência.
[00274] A composição pode compreender DNA em quantidades de cerca de 1 nanograma a 100 miligramas; cerca de 1 micrograma a cerca de 10 miligramas; ou preferencialmente cerca de 0,1 micrograma a cerca de 10 miligramas; ou mais preferencialmente cerca de 1 miligrama a cerca de 2 miligramas. Em algumas modalidades preferenciais, a composição de acordo com a presente invenção compreende cerca de 5 nanogramas a cerca de 1000 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferenciais, a composição pode conter cerca de 10 nanogramas a cerca de 800 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferenciais, a composição pode conter cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferenciais, a composição pode conter cerca de 1 a cerca de 350 microgramas de DNA. Em algumas modalidades preferenciais, a composição pode conter cerca de 25 a cerca de 250 microgramas, de cerca de 100 a cerca de 200 microgramas, de cerca de 1 nanograma a 100 miligramas; de cerca de 1 micrograma a cerca de 10 miligramas; de cerca de 0,1 microgramas a cerca de 10 miligramas; de cerca de 1 miligrama a cerca de 2 miligramas, de cerca de 5 nanogramas a cerca de 1000 microgramas, de cerca de 10 nanogramas a cerca de 800 microgramas, de cerca de 0,1 a cerca de 500 microgramas, de cerca de 1 a cerca de 350 microgramas, de cerca de 25 a cerca de 250 microgramas, de cerca de 100 a cerca de 200 microgramas de DNA.
[00275] A composição pode ser formulada de acordo com o modo de administração a ser usado. Uma composição farmacêutica injetável pode ser estéril, livre de pirógeno e livre de partículas. Uma formulação ou solução isotônica pode ser usada. Os aditivos para isotonicidade podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose. A composição pode compreender um agente vasoconstritor. As soluções isotônicas podem incluir tampão fosfato-salino. A composição pode compreender, adicionalmente, estabilizadores incluindo gelatina e albumina. Os estabilizadores podem permitir que a formulação seja estável em temperatura ambiente ou por períodos de tempo prolongados, incluindo LGS ou policátions ou poliânions.
7. Método para Gerar o Anticorpo Sintético
[00276] A presente invenção também se relaciona a um método para gerar o anticorpo sintético. O método pode incluir administrar a composição ao sujeito que necessite desta ao se usar o método de entrega descrito com mais detalhes abaixo. Por conseguinte, o anticorpo sintético é gerado no sujeito ou in vivo mediante administração da composição ao sujeito.
[00277] O método também pode incluir introduzir a composição em uma ou mais células e, portanto, o anticorpo sintético pode ser gerado ou produzido em uma ou mais células. O método pode incluir, adicionalmente, introduzir a composição em um ou mais tecidos, por exemplo, mas não limitado a, pele e músculo e, portanto, o anticorpo sintético pode ser gerado ou produzido no um ou mais tecidos.
8. Método para Identificar ou Triar o Anticorpo
[00278] A presente invenção se relaciona, adicionalmente, a um método para identificar ou triar o anticorpo descrito acima, que é reativo ao ou se liga ao antígeno descrito acima. O método para identificação ou triar o anticorpo pode usar o antígeno em metodologias conhecidas por aqueles versados na técnica para identificar ou triar o anticorpo. Tais metodologias podem incluir, mas não estão limitadas a, seleção do anticorpo de uma biblioteca (por exemplo, exposição de fago) e imunização de um animal seguido pelo isolamento e/ou purificação do anticorpo.
9. Método de distribuição da composição
[00279] A presente invenção também se relaciona a um método para entregar a composição para o sujeito que necessite desta. O método de entrega pode incluir administrar a composição ao sujeito. Administração pode incluir, mas não está limitada a, injeção de DNA com e sem eletroporação in vivo, entrega de lipossomas mediada e entrega facilitada de nanopartículas.
[00280] O mamífero recebendo entrega da composição pode ser humano, primata, primata não humano, vaca, gado, carneiro, cabra, antílope, bisão, búfalo de água, bisonte, bovídeos, cervo, porcos-espinhos, elefantes, lhama, alpaca, camundongos, ratos e galinha.
[00281] A composição pode ser administrada por vias diferentes, incluindo de forma oral, parenteral, sublingual, transdérmica, retal, transmucosa, tópica, por meio de inalação, por meio de administração oral, intrapleural, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intranasal, intratecal e intra-articular ou combinações destas. Para uso veterinário, a composição pode ser administrada como uma formulação adequadamente aceitável de acordo com a prática veterinária normal. O veterinário pode prontamente determinar o regime de dosagem e a via de administração que é a mais apropriada para um animal particular. A composição pode ser administrada por seringas tradicionais, dispositivos de injeção sem agulha, "biobalística de bombardeamento de microprojéteis" ou outros métodos físicos, tal como eletroporação ("EP"), "método hidrodinâmico" ou ultrassom.
a. Eletroporação
[00282] A administração da composição por meio de eletroporação pode ser realizada usando dispositivos de eletroporação que podem ser configurados para entregar a um tecido desejado de um mamífero um pulso de energia eficaz para fazer que poros reversíveis se formem em membranas de célula, e preferencial o pulso de energia é uma corrente constante similar a uma entrada de corrente predeterminada por um usuário. O dispositivo de eletroporação pode compreender um componente de eletroporação e um conjunto de eletrodo ou conjunto de manuseio. O componente de eletroporação pode incluir e incorporar um ou mais dos vários elementos dos dispositivos de eletroporação, incluindo: controlador, gerador de forma de onda de corrente, testador de impedância, registrador de forma de onda, elemento de relatório de status, porta de comunicação, componente de memória, fonte de alimentação e interruptor de alimentação. A eletroporação pode ser realizada utilizando um dispositivo de eletroporação in vivo, por exemplo, um sistema CELLECTRA PE (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA) ou um eletroporador Elgen (Inovio Pharmaceuticals, Plymouth Meeting, PA) para facilitar a transfecção de células pelo plasmídeo.
[00283] O componente de eletroporação pode funcionar como um elemento dos dispositivos de eletroporação, e os outros elementos são elementos separados (ou componentes) em comunicação com o componente de eletroporação. O componente de eletroporação pode funcionar como mais de um elemento dos dispositivos de eletroporação, os quais podem estar em comunicação com ainda outros elementos dos dispositivos de eletroporação separados do componente de eletroporação. Os elementos dos dispositivos de eletroporação existentes como partes de um dispositivo eletromecânico ou mecânico podem não ser limitados conforme os elementos podem funcionar como um dispositivo ou como elementos separados em comunicação entre si. O componente de eletroporação pode ser capaz de entregar o pulso de energia que produz a corrente constante no tecido desejado, e inclui um mecanismo de resposta. O conjunto do eletrodo pode incluir uma disposição de eletrodo tendo uma pluralidade de eletrodos em um arranjo espacial, em que o conjunto de eletrodo recebe o pulso de energia do componente de eletroporação e entrega o mesmo ao tecido desejado através dos eletrodos. Pelo menos uma das pluralidades de elétrodos é neutra durante a entrega do pulso de energia e mede a impedância no tecido desejado e comunica a impedância ao componente de eletroporação. O mecanismo de resposta pode receber a impedância medida e pode ajustar o pulso de energia entregue pelo componente de eletroporação para manter a corrente constante.
[00284] A pluralidade de elétrodos pode entregar o pulso de energia em um padrão descentralizado. A pluralidade de eletrodos pode entregar o pulso de energia no padrão descentralizado através do controle dos eletrodos sob uma sequência programada, e a sequência programada é introduzida por um usuário ao componente de eletroporação. A sequência programada pode compreender uma pluralidade de pulsos entregues em sequência, em que cada pulso da pluralidade de pulsos é entregue por pelo menos dois eletrodos ativos com um eletrodo neutro que mede a impedância, e em que um pulso subsequente da pluralidade de pulsos é entregue por um diferente de pelo menos dois eletrodos ativos com um eletrodo neutro que mede a impedância.
[00285] O mecanismo de resposta pode ser executado por ou hardware ou software. Um mecanismo de resposta pode ser executado por um circuito análogo de circuito fechado. A resposta ocorre a cada 50 μs, 20 μs, 10 μs ou 1 μs, mas é preferencialmente uma resposta em tempo real ou instantâneo (isto é, substancialmente instantânea conforme determinado por técnicas disponíveis para determinar o tempo de resposta). O elétrodo neutro pode medir a impedância no tecido desejado e comunicar a impedância ao mecanismo de resposta, e o mecanismo de resposta responde à impedância e ajusta o pulso de energia para manter a corrente constante em um valor similar à corrente predeterminada. O mecanismo de resposta pode manter a corrente constante de forma contínua e instantânea durante a entrega do pulso da energia.
[00286] Exemplos de dispositivos de eletroporação e métodos de eletroporação que podem facilitar a entrega da composição da presente invenção, incluem aqueles descritos na Patente U.S. No. 7.245.963 por Draghia-Akli, et al., Patente U.S. Pub. de patente 2005/0052630 submetida por Smith, et al., cujos conteúdos são incorporados por meio deste documento por referência em sua totalidade. Outros dispositivos e métodos de eletroporação que podem ser utilizados para facilitar a administração da composição incluem aqueles proporcionados no pedido co-pendente e de co- propriedade US de Patente N° de Série 11/874072, apresentado a 17 de outubro de 2007, que reivindica o benefício sob 35 USC 119 (e) para US Os pedidos provisórios Ser. Nos. 60/852,149, depositado em 17 de Outubro de 2006 e 60/978,982, depositado em 10 de Outubro de 2007, todos os quais são incorporados por meio deste documento em sua totalidade.
[00287] Patentes U.S. No. 7.245.963, por Draghia-Akli, et al., descreve sistemas de eletrodo modulares e seu uso para facilitar a introdução de uma biomolécula em células de um tecido selecionado em um corpo ou uma planta. Os sistemas modulares de eletrodo podem compreender uma pluralidade de eletrodos de agulha; uma agulha hipodérmica; um conector elétrico que provê uma ligação condutora de um controlador de pulso de corrente constante programável para a pluralidade de eletrodos de agulha; e uma fonte de energia. Um operador pode segurar a pluralidade de eletrodos de agulha que são montados em uma estrutura de suporte e firmemente inseri-los no tecido selecionado em um corpo ou uma planta. Em seguida, as biomoléculas são entregues por meio de agulha hipodérmica no tecido selecionado. O controlador de pulso de corrente constante programável é ativado e pulso elétrico de corrente constante é aplicada à pluralidade de eletrodos de agulha. O pulso elétrico de corrente constante aplicado facilita a introdução da biomolécula na célula, entre a pluralidade de eletrodos. Todo o conteúdo de US No. 7,245,963 é aqui incorporada por referência.
[00288] Patentes U.S. Patente Pub. 2005/0052630 submetido por Smith, et al., descreve um dispositivo de eletroporação que pode ser usado para efetivamente facilitar a introdução de uma biomolécula em células de um tecido selecionado em um corpo ou uma planta. O aparelho de eletroporação compreende um dispositivo eletro-cinético ("dispositivo EKD"), cuja operação é especificada pelo software ou firmware. O dispositivo EKD produz uma série de padrões de pulso de corrente constante programáveis entre eletrodos em uma disposição com base no controle de usuário e na entrada dos parâmetros de pulso e permite o armazenamento e a aquisição de dados de forma de onda corrente. O aparelho de eletroporação também compreende um disco de eletrodo substituível tendo uma disposição de eletrodos de agulha, um canal de injeção central para uma agulha de injeção e um disco de guia removível. Todo o conteúdo de US Patente Pub. 2005/0052630 é incorporado por meio deste documento por referência.
[00289] Os conjuntos de eletrodos e os métodos descritos em US No. 7245963 e US Patente Pub. 2005/0052630 pode ser adaptada para penetração profunda não apenas em tecidos, tais como músculos, mas também outros tecidos ou órgãos. Por causa da configuração da matriz de eletrodo, a agulha de injeção (para distribuição à biomolécula de escolha) é também inserida completamente no órgão-alvo e a injeção é administrada perpendicular ao fator alvo, na área que é previamente delineada por eletrodos. Os eletrodos descritos na US No. 7245963 e US Patente Pub. 2005/005263 são preferencialmente de 20 mm de comprimento e calibre 21.
[00290] Adicionalmente, contemplado em algumas modalidades que incorporam dispositivos de eletroporação e usos deste, há dispositivos de eletroporação que são descritos nas seguintes patentes: Patente U.S. 5,273,525 emitida em 28 de dezembro de 1993, Patentes U.S. 6,110,161 emitida em 29 de agosto de 2000, 6,261,281 emitida em 17 de julho de 2001 e 6,958,060 emitida em 25 de outubro de 2005 e Patente U.S. 6,939,862 emitida em 6 de setembro de 2005. Adicionalmente, patentes cobrindo assuntos providos na Patente U.S. 6,697,669 emitida em 24 de fevereiro de 2004, a qual diz respeito à distribuição de DNA usando qualquer um dentre uma variedade de dispositivos e Patente U.S. 7,328,064, emitida em 5 de fevereiro de 2008, desenhados para o método de injetar DNA são contempladas neste documento. As patentes acima são incorporadas por referência em sua totalidade.
10. Método de Tratamento
[00291] Também é provido neste documento um método para tratar, proteger contra, e/ou prevenir doença em um sujeito que necessite deste gerando o anticorpo sintético no sujeito. O método de distribuição pode incluir administrar a composição ao sujeito. Administração da composição ao sujeito pode ser feita usando o método de distribuição descrito acima.
[00292] Mediante geração do anticorpo sintético no sujeito, o anticorpo sintético pode se ligar ao ou reagir com o antígeno. Tal ligação pode neutralizar o antígeno, bloquear o reconhecimento do antígeno por outra molécula, por exemplo, uma proteína ou ácido nucleico e suscitar ou induzir uma resposta imune ao antígeno, desse modo, tratando, protegendo contra e/ou prevenindo a doença associada com o antígeno no sujeito.
[00293] A dose da composição pode estar entre 1 μg a 10 mg do componente ativo/kg peso corporal/tempo, e pode estar entre 20 μg a 10 mg do componente/kg peso corporal/tempo. A composição pode ser administrada a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 31 dias. O número de doses de composição para tratamento eficaz pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
[00294] A presente invenção tem múltiplos aspectos, ilustrados pelos seguintes exemplos não limitantes.
11. Exemplos
[00295] A presente invenção é ilustrada, adicionalmente, pelos seguintes Exemplos. Deve ser entendido que estes Exemplos, ao indicar modalidades preferenciais da invenção, são dados a título de ilustração apenas. A partir da discussão acima e destes Exemplos, um versado na técnica pode determinar as características essenciais desta invenção e sem se afastar do espírito e escopo desta, pode fazer várias mudanças e modificações da invenção para adaptá-la para vários usos e condições. Deste modo, as várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas aqui, serão aparentes para àqueles versados na técnica a partir da descrição citada acima. Tais modificações destinam-se também a estar no escopo das reivindicações em anexo.
Exemplo 1
[00296] Um sistema de expressão elevada para geração de imunoglobulina (Ig) in vivo foi construído. Em particular, sequências de Ig de cadeia pesada e leve foram modificadas a fim de melhorar expressão in vivo da molécula de Ig totalmente agregada, que incluiu 2 polipeptídeos de cadeia pesada e 2 de cadeia leve. Construtos de moléculas de gp120IgG de cadeia pesada e leve foram criados e inseridos separadamente no vetor pVAX1 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Este anticorpo definiu propriedades que permitem que ele seja usado para estudos de caracterização conforme descrito abaixo. Várias modificações foram incluídas ao criar os construtos para otimizar a expressão da Ig in vivo. Otimização incluiu a otimização de códon e a introdução de uma sequência de kozak (GCC ACC). As sequências de ácido nucleico dos construtos otimizados para as cadeias pesadas e leves da Ig são estabelecidas na Identificação de Sequência N°: 6 e Identificação de Sequência N°: 7, respectivamente (FIGURAS 1 e 2, respectivamente). Nas FIGS. 1 e 2, sublinhado e sublinhado duplo marcam os locais de enzimas de restrição BamHI (GGA TCC) e XhoI (CTC GAG) usados para clonar os construtos no vetor pVAX1 enquanto negrito marca os códons de início (ATG) e de parada (TGA TAA). Identificação de Sequência N°: 6 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 46, isto é, a sequência de aminoácido da cadeia pesada de IgG (FIGURA 42). Identificação de Sequência N°: 7 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 47, isto é, a sequência de aminoácido da cadeia leve de IgG (FIGURA 43).
[00297] Células foram transfectadas ou com construtos de Ig nativos (isto é, não otimizado) ou construtos contendo Identificação de Sequência N°: 6 e 7 (ou seja, otimizado). Após transfecção, secreção de IgG foi medida a partir das células transfectadas e cinética de síntese de IgG são mostradas na FIGURA 3. Como mostrado na FIG. 3, tanto os construtos não otimizados quanto otimizados expressaram as cadeias pesadas e leves da Ig para formar IgG, mas as construções otimizadas resultaram em acumulação mais rápida de anticorpos IgG. Células transfectadas com o plasmídeo contendo Identificação de Sequência N°: 6 e 7 (isto é, sequências de Ig otimizadas) mostraram maior produção de moléculas de Ig totalmente agregadas do que mostraram células transfectadas com o plasmídeo contendo sequências de Ig não otimizadas. Por conseguinte, a otimização ou modificação dos construtos aumentou substancialmente expressão de Ig. Em outras palavras, os construtos contendo Identificação de Sequência N°: 6 e 7 proveram substancialmente maior expressão de Ig conforme comparado aos construtos nativos em função da otimização ou modificação usada para criar a Identificação de Sequência N°: 6 e 7. Estes dados também demonstraram que as cadeias pesadas e leves de uma Ig podem ser eficientemente agregadas in vivo de um sistema de plasmídeo.
[00298] Para examinar, adicionalmente, os construtos contendo Identificação de Sequência N°: 6 e 7, camundongos foram administrados com plasmídeo contendo as sequências estabelecidas na Identificação de Sequência N°: 6 e 7. Em particular, o plasmídeo foi administrado usando eletroporação. Após a administração, a indução de resposta imunitária (isto é, nível de IgG) em camundongos imunizados foi avaliada por Western Blot (isto é, os soros dos camundongos foram usados para detectar o antígeno gp120). Como mostrado na FIG. 4, camundongos administrados com o plasmídeo contendo Identificação de Sequência N°: 6 e 7 resultou em forte produção de anticorpo em função da ligação do anticorpo foi observada na análise de Western blot. Apenas uma administração foi exigida para observar esta produção de anticorpo.
[00299] Em resumo, estes dados indicaram que sequências de ácido nucleico codificando Ig de cadeias pesadas e leves, quando incluídas em um vetor de expressão, tal como pVAX1, resultou na expressão de IgG agregada (isto é, cadeias pesadas e leves reuniram-se para formar a um anticorpo que liga seu antígeno) em células transfectadas e camundongos administrados com o vetor de expressão. Estes dados adicionais indicaram que otimização ou modificação das sequências de ácido nucleico codificando as cadeias pesadas e leves de Ig significativamente aumentaram a produção de Ig.
Exemplo 2 Materiais e Métodos para Exemplos 3 a 7
[00300] Células e Reagentes. Células 293T e TZM-Bl foram mantidas em meio Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM; Gibco-Invitrogen, CA) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e antibióticos e passadas mediante confluência. Proteínas HIV-1 p24 e gp120 Env (rgp120) recombinantes foram adquiridas a partir de Protein Science Inc. e estreptavidina conjugada com peroxidase a partir de Jackson Laboratory. Linhas celulares e outros reagentes listados foram obtidos a partir do Programa de Pesquisa de AIDS e Reagente de Referência (AIDS Research and Reference Reagent Program), Divisão de AIDS (Division of AIDS),NIAID, NIH.
[00301] Administração e distribuição de animais, proteínas e plasmídeo. Camundongos BALB/c fêmeas (8 semanas de idade) foram comprados a partir de Taconic Farms (Germantown, NY). Para estas administrações, 25 μg de DNA de plasmídeo em 50 μl de volume (pVaxl ou pHIV-1Env-Fab) foi injetada de forma intramuscular (IM) seguido por distribuição potencializada mediada por EP pelo sistema de MID-EP (CELLECTRA®; Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA). Parâmetros de pulsação para distribuição foram: 3 pulsos de corrente constante de 0,5 Amp, 1 segundo distante e 52 ms de comprimento. Cada animal recebeu uma administração única ou de formulações de plasmídeo experimental ou de controle. Para a análise de imunização de proteína, HIV-1 gp120 recombinante (rgp120) a partir de cepa JRFL (comprada a partir de Immune Technology Corp, NY) foi usada. No estudo de imunização de proteína, uma dose única de 25 g do rgp120 foi misturada com adjuvante TiterMax e injetada de forma subcutânea. Soros a partir de pHIV-1 Env Fab ou camundongos administrados com rgp120 foram coletados em momentos diferentes dependendo da análise particular.
[00302] Construção de DNA de plasmídeo de HIV-1Env-Fab plasmídeo. As sequências de HIV-1 Env-Fab (VH e VL) do anti-Env VRC01 mAb humano foram geradas pelo uso de oligonucleotídeos sintéticos com várias modificações. A cadeia pesada (VH-CH1) é codificada pela sequência de ácido nucleico estabelecida na Identificação de Sequência N°: 3, e a cadeia leve (VL-CL) é codificada pela sequência nucleica estabelecida na Identificação de Sequência N°: 4 (FIGURAS 9 e 10, respectivamente). Nas FIGS. 9 e 10, sublinhado e sublinhado duplo marcam os locais de enzimas de restrição HindIII (AAG CTT) e XhoI (CTC GAG) usados para clonar as sequências de ácido nucleico de codificação em pVAX1 enquanto negrito marca códons de início (ATG) e de parada (TGA ou TAA). Identificação de Sequência N°: 3 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 48, isto é, a sequência de aminoácido da VH- CH1 de HIV-1 Env-Fab (FIGURA 44). Identificação de Sequência N°: 4 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 49, isto é, a sequência de aminoácido da VL-CL de HIV-1 Env-Fab (FIGURA 45).
[00303] Uma sequência principal eficiente IgE foi incorporada nas sequências do gene de antígeno de Env, a fim de melhorar a expressão. Os imunógenos de DNA de HIV-1Env-Fab modificados e potencializados resultantes foram códon e RNA otimizados, seguido por clonagem no vetor de expressão de pVax1 por GenScript (Piscataway, NJ), com produção em larga escala subsequente destes construtos. Os genes de VH e VL (Identificação de Sequência: 3 e 4, respectivamente) foram inseridos entre os locais de restrição BamH1 e Xho1. DNA de plasmídeo purificado foi então formulado em água para administração subsequente em camundongos. Como um plasmídeo de controle negativo, pIgG-E1M2, que gera uma Ig "irrelevante"/de controle, foi usado.
[00304] Expressão de HIV-1Env-Fab e Análise de Imunoblot. A linha celular 293T foi utilizada para análise de expressão usando o reagente de transfecção não lipossomal FuGENE6 (Promega, WI), por métodos conforme recomendado pelo fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas em confluência de 50 a 70% (1-3x105 células/2 ml por poço na placa de cultura de 35 mm) 24 horas antes da transfecção subsequente com 5 μg do controle de pVax1 ou pHIV-1Env-Fab. Sobrenadantes foram coletados em vários momentos até 70 horas e avaliados para níveis de moléculas Fab específicas pelos métodos ELISA padrão. Sobrenadantes de células pVax1 transfectadas foram usados como um controle negativo. Além disso, células 293T foram transfectadas com um gene para a proteína de HIV Env gp160.
[00305] Confirmação adicional de reconhecimento da proteína de HIV- 1 Env nativa pelo Fab gerado foi executada por análise de imunoblot. Para este estudo, rgp120, descrito acima, se submeteu a eletroforese em 12% de SDS-PAGE. O gel foi borrado sobre uma membrana de nitrocelulose (Millipore, Bedford, MA) e bloqueado com 5% w/v de leite em pó desnatado em PBS-T (0,05%). A nitrocelulose foi então posteriormente cortada em faixas individuais para análise. Os soros de camundongos administrados com pHIV-1 Env Fab, coletados 48 horas após a administração, foram diluídos 1:100 em PBS e reagiram com faixas de nitrocelulose individuais por 1 hora. Posteriormente, as faixas foram lavadas 4 vezes com tampão Tris salino-0,2% de Tween, reagidas com um anti-soro acoplado por peroxidase contra IgG de camundongo (Jackson Laboratories, ME) e incubadas com substrato diaminobenzidina (Sigma, St Louis, MO), permitindo a visualização de ligação apropriada do HIV-1 Env Fab gerado para gp120.
[00306] Análise de Ligação Ig - ELISA. Avaliou-se que confirmação de ligação de plasmídeo de DNA gerou Fab ou anticorpo anti-rgp120 para rgp120 por ELISA. Ensaios de ligação de Ig foram realizados com soros de animais individuais administrados ou com pHIV-1 Env Fab, pVax1 ou proteína de rgp120. Novamente, para esta análise básica de imunoensaio de Ig, amostras de soros foram coletadas 48 horas após a administração única de plasmídeo de DNA. Brevemente, placas de poliestireno de ligação elevada de 96 poços (Corning, NY) foram revestidas durante a noite em 4°C com HIV MN rgp120 subtipo B (2μg/mL), diluído em PBS. No dia seguinte, as placas foram lavadas com PBS-T (PBS, 0,05% de Tween 20), bloqueadas por 1 hora com 3% de BSA em PBS-T e incubadas com diluições de 1:100 de soro de camundongos imunizados e naive por 1 hora a 37°C. IgG ligada foi detectada usando IgG-HRP anti-camundongo de cabra (Research Diagnostics, NJ) em uma diluição de 1:5.000. Enzima ligada foi detectada pela adição da solução de substrato cromogênico TMB (R&D Systems) e lida em 450 nm em um leitor Biotek EL312e Bio-Kinetics. Todas as amostras de soro foram testadas em duplicata. Uma análise de imunoensaio adicional foi executada o que quantificou as concentrações de Fab em soros de camundongos administrados com pHIV-1 Env Fab usando um kit ELISA de quantificação de IgG1 comercial. Esta análise foi executada por especificações do fabricante.
[00307] Análise de Citometria de Fluxo (FACS). Para análises de citometria de fluxo (FACS), células 293T foram transfectadas ou com um plasmídeo de Env consenso subtipo A (pCon-Env-A) ou um plasmídeo otimizado subtipo A (pOpt-Env-A) expressando um Env de um viral primário isolado (Q23Env17). Transfecção foi executada por métodos padrão. Após a confirmação de transfecção, células foram lavadas com tampão A gelado (PBS/0,1% de BSA/0,01% de NaN3) e incubadas por 20 min a 4°C com uma diluição de 1:100 de Ig primária (ou VRC01 purificado ou soros de camundongos injetados ou com pHIV-1 Env Fab ou plasmídeo pIgG-E1M2 de controle, coletado 48 horas após a administração de plasmídeo). Isto foi seguido por lavagem e incubação por outros 20 min com 50 μl de Igs secundárias etiquetadas com fluorescência diluídas a 1:100 conjugadas a ficoeritrina (PE). As células foram então lavadas e imediatamente analisadas sobre um citômetro de fluxo (Becton Dickinson FACS). Todas as incubações e lavagens foram realizadas a 4°C com tampão arrefecido com gelo A. As células foram fechadas em singletos e células vivas. Para avaliar células de GFP positiva de expressão de GFP foi executada com um instrumento de FACS-LSR usando o software CellQuest (BD Bioscience). Os dados foram analisados com o software Flow Jo.
[00308] Ensaio de Neutralização de HIV-1 de Ciclo Único. Análise de neutralização de HIV-1 mediado por Fab foi medida com um ensaio baseado em TZM-BI (derivado de célula HeLa) em que uma redução na expressão de gene de luciferase conforme usado como um ponto final para neutralização, seguindo uma única rodada de infecção com vírus pseudotipo Env na presença ou ausência de soros experimentais ou de controle. As células TZM- Bl foram manipuladas para expressar CD4 e CCR5 e continham genes repórter para luciferase de vaga-lume. Neste ensaio, soros de camundongos administrados apenas com pVax1 ou pHIV-1Env Fab foram diluídos a 1:50 em poços, seguido pela adição de pseudotipo de HIV-1 Bal26, Q23Env17, SF162S ou ZM53M livre de vírus celular, em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01. Tanto Bal26 quanto SF162S são vírus de subtipo B camada 1, com este estado de camada indicando que os vírus tinham sensibilidade elevada ou acima da média à neutralização. Q23Env17 e ZM53M são vírus subtipo A camada 1 e subtipo C, camada 2, respectivamente. O estado de camada 2 indicou que o vírus teve sensibilidade média ou moderada à neutralização. Posteriormente neste ensaio, 104 de células TZM-BL foram adicionadas a cada poço, incubadas por 48 horas, lisadas e seguido por adição subsequente de 100 l de substrato Bright-Glo (Luciferase Assay System, Promega, WI), seguido por quantificação de luciferase usando um luminômetro. A leitura deste ensaio foi RLU (unidades relativas de luz). As porcentagens de redução de RLU foram calculadas como (1-(RLU médio de amostras-controles experimentais)/RLU médio de poços de controle-nenhuma adição de controle)) x 100. A neutralização de HIV-1 foi então expressa como diminuição percentual em RLU, que foi indicativo de inibição percentual de infecção.
Exemplo 3 Geração de anti-HIV-1 Env-Fab Expressando Construtos
[00309] Os cDNAs tanto para VH quanto VL-sequências de codificação de cadeia de Ig (imunoglobulinas) para o anti-HIV-1 Envelope amplamente neutralizando VRC01 mAb humano foram obtidos a partir de VRC (Vaccine Research Center, NIH) através do Programa de Pesquisa de AIDS e Reagente de Referência NIH e posteriormente clonados em um vetor pVax1. Várias modificações, conforme indicado no Exemplo 2 acima, foram incorporadas nos vetores de expressão a fim de maximizar e otimizar a produção de moléculas de Ig biologicamente ativas. Especificamente, essas modificações incluíram otimização e estabilização códon e RNA, utilização de sequência principal potencializada, produção de plasmídeo em concentrações elevadas e facilitaram distribuição de plasmídeo in vivo através de EP. Os construtos gerados foram colocados sob o controle de um promotor prematuro imediato do citomegalovírus humano (CMV), que é importante para expressão apropriada e eficiente em células e tecidos de mamíferos. Os mapas esquemáticos do construto usados neste estudo são indicados nas FIGURAS 5A e 5B.
[00310] Adicionalmente, anti-HIV-1 Env Fab foi preparado a partir de pHIV-Env-Fab e usado para corar células transfectadas com um plasmídeo codificando HIV Env. pVAX1 foi usado como um controle. Como mostrado na FIG. 11, coloração de imunofluorescência demonstrou que o vetor pHIV- Env-Fab permitiu a preparação de anti-HIV-1 Env Fab em função do anti- HIV-1 Env Fab corou as células transfectadas com o plasmídeo codificando HIV Env. Por conseguinte, o anti-HIV-1 Env Fab foi específico para se ligar com a glicoproteína de HIV Env.
Exemplo 4 Produção de Ig por Células Transfectadas
[00311] Para avaliar a expressão de pHIV-1Env-Fab, os construtos foram transfectados em células 293T. Um imunoensaio ELISA, usando uma proteína gp120 de HIV-1 subtipo B consenso, confirmou a presença do anti- HIV-1 Env-Fab no sobrenadante das células 293 T transfectadas tão cedo quanto 24 horas pós-transfecção (FIGURA 5C). Valores de OD450nm elevados (isto é, variando de aproximadamente 0,5 a 0,8) foram detectados em extratos celulares de 24 a 72 horas pós-transfecção e posteriormente atingiram um pico e platô em 48 horas. Estes resultados confirmaram a especificidade do anti-HIV-1 Env Fab para a glicoproteína de HIV Env. Análise estatística dos dados apresentados na FIGURA 5C foi a seguinte: Valores OD450nm para os soros de camundongos injetados com pHIV-1 Env-Fab foram significativos (p<0,05, teste t de Student) comparado com controle de pVax1 das 22 medições de momentos por 72 horas.
Exemplo 5 Caracterização in vivo do HIV-1 Env Fab
[00312] Para demonstrar a produção de Fab in vivo dos plasmídeos de DNA, camundongos foram administrados com o pHIV-1 Env Fab pela via intramuscular, seguido por distribuição potencializada através de EP. Uma injeção única dos plasmídeos de DNA foi entregue e soros foram coletados em 12 horas e nos dias 1, 2, 3, 4, 7 e 10 após a administração. Soros (em uma diluição de 1:100 de diluição) foram então posteriormente avaliados para níveis de Ig/Fab por análise de ELISA, conforme mostrado na FIGURA 6A. Dados na FIGURA 6A são apresentados (a partir de camundongos individuais tanto nos grupos pVax1 quanto nos HIV-1 Env-Fab) como OD450nm, que foi proporcional ao nível de Ig/Fab. Estes dados demonstraram que os níveis relativos de Fab após administração única de pHIV-1Env-Fab se tornaram detectáveis no dia 1 e posteriormente aumentaram ao longo do tempo. Para fins de comparação, uma única administração/imunização de rgp120, conforme descrito acima no Exemplo 2, foi feita em camundongos Balb/C com coleta e análise de soros subsequentes (em diluição de 1:100) ao longo do tempo por ELISA a fim de determinar a extensão e a longevidade dos níveis de anticorpo anti-gp120 específico. A FIG. 6B mostra os resultados.
[00313] Neste estudo de distribuição de proteína, níveis de Ig específicos de antígeno sobre o fundo foram apenas detectáveis 10 dias após a imunização. Isto foi em contraste aos níveis Fab suscitados pela administração de pHIV-1 Env Fab (FIGURA 6A) onde valores de OD450nm atingiram pelo menos 0,1 unidades de OD450nm no dia 1 pós-administração e se estabilizou no dia 10 em níveis entre 0,28 e 0,35 unidades de OD. Portanto, a distribuição de pHIV-1 Env Fab resultou em uma geração mais rápida de Fab específica do que imunização de proteína convencional. Esta descoberta destacou a utilidade clínica potencial deste método de distribuição de plasmídeo de DNA para a geração de Ig biologicamente ativa.
[00314] Análises adicionais foram realizadas para garantir a qualidade, assim como a quantidade do Fab recombinante produzido pela tecnologia de distribuição de DNA. Especificamente, análise de imunoblot foi executada usando proteína gp120 de HIV-1 recombinante que sofreu eletroforese e corada e sondada com soros de camundongos de pHIV-1Env-Fab 48 horas pós-administração (FIGURA 6C). O borrão indicou uma banda apropriada para o peso molecular da proteína gp120 confirmando que era funcional e capaz de se ligar à gp120. Da mesma forma, quantificação de Fab humano, por ELISA, foi executada e apresentada como uma função do tempo (isto é, dias) após a administração de plasmídeo (FIGURA 6D). Os resultados indicam que os níveis de Fab gerado atingiram um pico de 2 a 3 μg/ml. Estes resultados demonstraram que a correta agregação de polipeptídeo das cadeias VH e VL do VRC01 gerado baseado em Fab, assim como a capacidade de reconhecer e se ligar especificamente à proteína de HIV-1 Env.
[00315] Análises estatísticas dos dados apresentados na FIGURA 6 são os seguintes. Para dados resumidos na FIGURA 6A, valores de OD450nm para os soros dos camundongos injetados com pHIV-1 Env-Fab foram estatisticamente elevados (p<0,05, teste t de Student) comparado aos soros de camundongos injetados com pVax1 a partir das medições de momento do dia 1 até 10. Para dados resumidos na FIGURA 6B, valores de OD450nm do grupo rpg120 foram significativamente elevados (p<0,05, teste t de Student) comparado ao controle de PBS a partir das medições de momento do dia 10 até 14. Para dados resumidos na FIGURA 6D, valores de OD450nm valores de camundongos injetados com pHIV-1 Env-Fab foram significativamente elevados (p<0,05, teste t de Student) a partir das medições de momento do dia 2 até 10.
Exemplo 6 Ligação da Fab/Igs à Células Expressando Diferentes Proteínas de HIV-1 Env: Análise Baseada em FACS
[00316] Soros dos camundongos administrados com pHIV-1Env-Fab também foram usados para testar a ligação do Fab gerado às diferentes proteínas de HIV-Env expressas de forma transitória pelas células 293T. A forma nativa do VRC01-mAb foi usada como um controle positivo, para assegurar a expressão e detecção apropriada de proteínas de Env na superfície das células. Conforme indicado anteriormente, a Ig "irrelevante/não relacionada" (Ig-E1M2) foi usada como um controle negativo. Conforme demonstrado nas FIGURAS 7A e 7B, havia essencialmente apenas coloração de fundo por diferentes Igs/Fabs para células pVax1 transfectadas (isto é, carência de inserção de Env). Entretanto, tanto para o VRC01 mAb purificado quanto os soros de camundongos administrados com pHIV-1Env-Fab houve coloração positiva significativa de células transfectadas expressando ou o plasmídeo consenso Env subtipo A (pCon-Env-A), assim como expressando um plasmídeo subtipo C otimizado (pOpt-Env-A) e Env do HIV-1 primário isolado pQ23Env17. Além disso, soros de camundongos administrados com pIg-E1M2 falharam em demonstrar a coloração de qualquer uma das células de HIV1 Env transfectadas acima dos níveis de fundo. Análise de FACS indicando estes resultados é provida na FIGURA 7A. Um gráfico representativo mostrando os dados a partir da análise de FACS (isto é, FIG A FIG. 7A) para este experimento foi provida na FIGURA 7B.
[00317] Análise estatística dos dados apresentados na FIGURA 7B são os seguintes. Não houve diferença significativa (p <0,05, teste t de Student) em ligação específica entre o anticorpo nativo VRC01 e soros de ratos injetados com pHIV-1 Env-Fab à glicoproteína do envelope gerada por PCON-Env-A. No entanto, a ligação do anticorpo VRC01 à glicoproteína de envelope gerada pela pOpt-Env-A foi significativamente maior (p <0,05, teste t de Student) do que a ligação em soro de camundongos injetados com pHIV- 1 env-Fab.
Exemplo 7 Atividade Neutralizante de HIV de Ig Produzida por pHIV-1 Env Fab
[00318] Soros de camundongos administrados com pHIV-1Env-Fab também foram usados para testar a ligação do HIV-Env Fab às proteínas de HIV-1 Env expressas de forma transitória transfectadas pelas células 293T. Soros foram obtidos dos camundongos 6 dias após a administração de pHIV- 1Env-Fab. Especificamente, as células foram transfectadas com um plasmídeo do qual HIV-1 Env de uma cepa de subtipo A B ou C foi expressa. As cepas de subtipo A B e C foram 92RW020, SF162 e ZM197. Como mostrado na FIG. 12, soros de camundongos administrados com pHIV-1Env-Fab ligados ao HIV-1 Env das cepas de subtipo A B e C de HIV-1, desse modo, indicando que os soros continham um anticorpo (isto é, HIV-Env Fab) que era de reatividade cruzada com HIV-1 Env de múltiplos subtipos de HIV-1.
[00319] A fim de avaliar a atividade neutralizante potencial de HIV-1 do HIV-Env Fab produzido neste estudo, um ensaio de neutralização baseado em luminescência com base no uso de células alvo TZM-Bl foi executado. As células alvo TZM-Bl foram infectadas com 4 pseudotipos de isolados virais de HIV na ausência ou presença dos soros experimentais e de controle, conforme descrito no Exemplo 2 acima.
[00320] A FIG. 8 ilustra as curvas de neutralização para soros de camundongos injetados com pHIV-1 Env Fab contra os pseudotipos de vírus HIV. Especificamente, foram testados os vírus de HIV-1 camada 1 Bal26 e SF162S (ambos subtipo B), assim como Q23Env (subtipo A). Além disso, os soros foram também testados contra o vírus HIV-1 camada 2 subtipo C ZM53M. Os dados são apresentados como a percentagem de neutralização/inibição da infecção por HIV. As linhas horizontais tracejadas nos gráficos indicaram o nível de neutralização/inibição de 50% no ensaio. Um mAb de controle de neutralização positivo (dados não mostrados) foi utilizado neste estudo para confirmar a utilidade e a validade deste método de ensaio. Brevemente, o mAb de neutralização de controle positivo foi capaz de inibir a infecção de todos os quatro pseudotipos virais por pelo menos 50%.
[00321] Soros dos camundongos administrados com pHIV-1 Env Fab demonstraram um aumento em atividade neutralizante de HIV ao longo do tempo após a administração de plasmídeo, com neutralização percentual atingindo em 50% no Dia 2 para Bal25, Q23Env17 e SF162S. Bem como neutralização percentual de platô para estes 3 vírus foi aproximadamente 62, 60 e 70%, respectivamente. Para o ZM53M, o limiar de neutralização de 50% não foi atingido até 3 dias e neutralização de platô não excedeu 50%. Este perfil de neutralização menos robusto, comparado aos outros 3 testados, foi provavelmente reflexivo de ser um vírus camada 2 menos neutralizável. Em suma, o Fab gerado neste estudo foi capaz de efetivamente neutralizar um intervalo de isolados de HIV. Análise estatística dos dados apresentados na FIGURA 8 são os seguintes. Com base na análise não paramétrica de Kruskal-Wallis, apenas níveis de neutralização de HIV para o vírus subtipo C ZM53M (FIGURA 8D), induzidos por soros de camundongos injetados com pHIV-1 Env-Fab, foi significativamente diferente dos outros vírus testados (FIGURAS 8A, 8B e 8C). Esta diferença foi no tempo (dias) exigidos para alcançar a neutralização de 50%, assim como no nível de neutralização máximo obtido.
[00322] No resumo dos Exemplos 3 a 7, a concentração de soros de Fab de VRC01 em camundongos administrados com pHIV-1 Env Fab atingiu um pico de 2 a 3 μg/mL no dia 12 pós-injeção. Este intervalo foi comparável a um número de anticorpos monoclonais atualmente licenciados pelo FDA, indicando que a nossa abordagem de anticorpo produziu níveis significantes e biologicamente relevantes de anticorpos neste modelo animal pequeno. Em particular, o Ustekinumab (nome comercial: Stelara) e Golimumabe (Simponi), dois anticorpos indicados para uso contra doenças auto-imunes, tais como psoríase em placas e artrite, têm concentrações de soro média de ± SD de 0,31±0,33 μg/mL e 1,8±1,1 μg/mL, respectivamente. Além do mais, o inibidor de TNF Adalimumabe (Humira) tem uma concentração de soro bruto média de cerca de 6 μg/mL. A este respeito, os dados descritos nos Exemplos 4 a 8 demonstraram que a distribuição de DNA codificando o anticorpo ao organismo resultou na montagem in vivo, de tal modo que níveis significativos e biologicamente relevantes do anticorpo estavam presentes no organismo.
[00323] Estes dados também demonstraram a capacidade de produzir mais rapidamente Fabs in vivo, após uma administração única potencializada de EP do pHIV-1Env Fab, comparada às Igs produzidas pela administração de proteína convencional (FIGURAS 6A e 6B). Além disso, a capacidade de gerar moléculas de tipo Ig protetoras funcionais contra alvos difíceis de vacina foi abordada. Até à data, indução de anticorpos neutralizantes de HIV- 1 após vacinação ativa tem sido incrivelmente difícil, e durante a infecção primária, anticorpos neutralizantes não se desenvolvem até anos após a transmissão. Com esta abordagem de plasmídeo de DNA, títulos de neutralização foram observados dentro de 1 a 2 dias pós-distribuição com pico de concentrações de soros Fab neutralizantes (3,31±0,13 μg/mL) ocorrendo uma semana pós-administração (FIGURA 6D). Este nível de Ig foi relativamente similar a 8,3 μg/mL de concentração que foi demonstrado para prover proteção completa contra a infecção em um estudo recente. Estes dados demonstraram a indução rápida de fragmentos biologicamente ativos de Ig.
[00324] Estes dados também mostraram o título de anticorpo neutralizante e as respostas contra HIV-1 primário isolado que foram suscitadas pela administração de DNA de HIV-1Env-Fab. Os soros foram testados contra um painel de diferentes isolados virais de camadas virais 1, e 2 que representam exemplos dos subtipos A B e C. Os resultados indicaram geração de atividade neutralizante potente contra estes vírus (Fig. 8).
[00325] Por conseguinte, este método baseado em plasmídeo de DNA gerou Fab específico e biologicamente ativo ou moléculas de Ig in vivo, ignorou a necessidade de usar vacinação baseada em antígeno convencional para a geração de anticorpo e evitou a necessidade de gerar e purificar Igs feitas in vitro.
Exemplo 8 Construção de um Plasmídeo Codificando um Anticorpo de Ig Humano
[00326] Conforme descrito acima, a Fab foi gerada do anticorpo VRC01, a saber HIV-Env Fab, que foi gerado in vivo pela administração do ácido nucleico codificador no sujeito. Para maior abrangência dos estudos, foi criada uma sequência de ácido nucleico que codificou um anticorpo IgG1 derivado do anticorpo VRC01. Como mostrado no esquema na FIG. 13, esta sequência de ácido nucleico codificou cadeias pesadas e leves de IgG separadas por um local de clivagem de furina e uma sequência de ácido nucleico codificando sequência de peptídeo P2A. A sequência de peptídeo P2A aumenta a eficiência de clivagem pela protease resultando, desse modo, em polipeptídeos discretos após clivagem.
[00327] A cadeia pesada de IgG incluiu as regiões variável pesada (VH), pesada constante 1 (CH1), de dobradiça, pesada constante 2 (CH2) e pesada constante 3 (CH3). A cadeia leve de IgG incluiu as regiões leve variável (VL) e leve constante (CL). Este construto foi colocado sob o controle de um promotor de citomegalovírus (CMV), por exemplo, no vetor de expressão de pVAX1. Este construto resultou na produção de anticorpo de IgG totalmente agregado (conforme mostrado na FIGURA 14) que foi reativo a gp120 (isto é, o antígeno reconhecido pelo anticorpo VRC01). Esta IgG totalmente agregada é referida neste documento como IgG de VRC01. A sequência de aminoácido da IgG de VRC01 (antes de clivagem por furina) é mostrada na FIGURA 15 e é apresentada na SEQ ID NO: 5.
[00328] Em particular, a sequência de aminoácido da IgG de VRC01 (antes de clivagem por furina; Identificação de Sequência N°: 5 e FIGURA 15) tem a seguinte estrutura: um peptídeo sinal de imunoglobulina E1 (IgE1), região pesada variável (VH), região pesada constante 1 (CH1), região de dobradiça, região pesada constante 2 (CH2), região pesada constante 3 (CH3), local de clivagem de furina, ligante GSG, peptídeo de P2A, peptídeo sinal de IgE1, região leve variável (VL) e região leve constante (CL, especificamente capa). A sequência de cada porção da estrutura (todos que estão contidos dentro de Identificação de Sequência N°: 15, na ordem descrita acima e mostrada na FIGURA 13) é provida abaixo.
[00329] Peptídeo Sinal de IgE1 de IgG de VRC-1 - MDWTWILFLVAAATRVHS (Identificação de Sequência N°: 8).
[00330] Região pesada variável de IgG de VRC01 - QVQLVQSGGQMKKPGESMRISCRASGYEFIDCTLNWIRLAPGKRPEW MGWLKPRGGAVNYARPLQGRVTMTRDVYSDTAFLELRSLTVDDTA VYFCTRGKNCDYNWDFEHWGRGTPVIVSSPSTKG (Identificação de Sequência N°: 9).
[00331] Região pesada constante 1 (CH1) de IgG de VRC01 - PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPK SC (Identificação de Sequência N°: 10).
[00332] Região de dobradiça de IgG de VRC01 EPKSCDKT HTCPPCP (Identificação de Sequência N°: 11).
[00333] Região pesada constante 2 (CH2) de IgG de VRC01 - APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAK (Identificação de Sequência N°: 12).
[00334] Região pesada constante 3 (CH3) de IgG de VRC01 - GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK (Identificação de Sequência N°: 13)
[00335] Local de clivagem de furina de IgG de VRC01 - RGRKRRS (Identificação de Sequência N°: 14).
[00336] Ligante GSG e peptídeo P2A de IgG de VRC01 - GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (Identificação de Sequência N°: 15).
[00337] Peptídeo Sinal de IgE1 de IgG de VRC01 - MDWTWILFLVAAATRVHS (Identificação de Sequência N°: 8).
[00338] Região leve variável (VL) de IgG de VRC01 - EIVLTQSPGTLSLSPGETAIISCRTSQYGSLAWYQQRPGQAPRLVIYSGS TRAAGIPDRFSGSRWGPDYNLTISNLESGDFGVYYCQQYEFFGQGTK VQVDIKR (Identificação de Sequência N°: 16).
[00339] Constante Região Light (CL, kappa) de VRC01 IgG - TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLR SPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 17).
Exemplo 9 IgG de HIV-1 VRC01 Codificada por Dois Plasmídeos
[00340] Conforme descrito acima nos Exemplos 2 a 8, um Fab (cada cadeia expressada de um plasmídeo separado) foi gerado a partir do anticorpo VRC01, ou seja, o HIV-Env Fab, e uma IgG (expressa de um plasmídeo único) foi gerado a partir do anticorpo VRC01, ou seja, IgG de VRC01. Para adicionalmente ampliar estes estudos, uma IgG foi gerada a partir do anticorpo VRC01, em que a cadeia pesada (isto é, região pesada variável (VH), região pesada constante 1 (CH1), região de dobradiça, região pesada constante 2 (CH2) e região pesada constante 3 (CH3)) e a cadeia leve (isto é, região leve variável (VL) e região leve constante (CL)) foram codificadas por construtos separados (FIGURAS 50 e 51). Esta IgG é referida neste documento como IgG de HIV-1 VRC01.
[00341] Cada construto também incluiu uma sequência principal para otimizar a secreção do anticorpo uma vez gerado in vivo. Cada construto foi clonado nos locais de BamHI e XhoI do vetor pVAX1 colocando, desse modo, o construto sob o controle de um promotor de citomegalovírus (CMV) (FIGURAS 50 e 51). Por conseguinte, para formar ou gerar a IgG de VRC01 in vivo uma mistura de plasmídeos tem de ser administrada ao sujeito, ou seja, um plasmídeo contendo o construto codificando a cadeia pesada e um plasmídeo contendo o construto codificando a cadeia leve.
[00342] Adicionalmente, cada construto foi adicionalmente otimizado. Otimização incluiu a adição de uma sequência de kozak (GCC ACC) e otimização de códon. A sequência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de IgG1 da IgG de HIV-1 VRC01 é estabelecida na Identificação de Sequência N°: 54 e FIGURA 52. Na FIG. 52, sublinhado e sublinhado duplo marcam os locais de enzimas de restrição BamHI (GGA TCC) e XhoI (CTC GAG) usados para clonar a sequência de ácido nucleico no vetor pVAX1 enquanto negrito marca os códons de início (ATG) e de parada (TGA TAA). Identificação de Sequência N°: 54 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 55 e FIGURA 53, isto é, a sequência de aminoácido da cadeia pesada de IgG1 da IgG de HIV-1 VRC01.
[00343] A sequência de ácido nucleico codificando a cadeia leve de IgG da IgG de HIV-1 VRC01 é estabelecida na Identificação de Sequência N°: 56 e FIGURA 54. Na FIG. 54, sublinhado e sublinhado duplo marcam os locais de enzimas de restrição BamHI (GGA TCC) e XhoI (CTC GAG) usados para clonar a sequência de ácido nucleico no vetor pVAX1 enquanto negrito marca os códons de início (ATG) e de parada (TGA TAA). Identificação de Sequência N°: 56 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 57 e FIGURA 55, isto é, a sequência de aminoácido da cadeia leve de IgG da IgG de HIV-1 VRC01.
Exemplo 10 Ig de HIV-1 Env-PG9
[00344] Além da IgG de VRC01, outro construto foi criado que codificou IgG que foi reativo ao HIV-1 Env. Este construto foi HIV-1 Env- PG9, que foi otimizado e clonado em um vetor de expressão (FIGURAS 16A e 16B). Otimização incluiu a introdução de uma sequência de Kozak (por exemplo, GCC ACC), uma sequência principal, e otimização de códon. Criação do vetor de expressão contendo a sequência de ácido nucleico codificando Ig de HIV-1 Env-PG9 foi confirmada por digestão de enzima de restrição conforme mostrado na FIGURA 16C. Na FIG. 16C, a faixa 1 foi o vetor de expressão não digerido, faixa 2 foi o vetor de expressão digerido com BamHI e Xho1 e faixa M foi o Marcador.
[00345] A sequência de ácido nucleico codificador Ig de HIV-1 Env- PG9 é estabelecida na Identificação de Sequência N°: 63 e FIGURA 61. Na FIG. 61, sublinhado e sublinhado duplo marcam os locais de enzimas de restrição BamHI (GGA TCC) e XhoI (CTC GAG) usados para clonar a sequência de ácido nucleico no vetor pVAX1 enquanto negrito marca os códons de início (ATG) e de parada (TGA TAA). Identificação de Sequência N°: 63 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 2 e FIGURA 18, isto é, a sequência de aminoácido de Ig de HIV-1 ENv-PG9 (antes de clivagem por furina).
[00346] Nesta sequência de aminoácido, um peptídeo sinal é ligado por ligação peptídica a cada uma das cadeias pesadas e leves para melhorar a secreção do anticorpo gerado in vivo. Adicionalmente, uma sequência do ácido nucleico codificando o peptídeo P2A é localizada entre as sequências de ácido nucleico codificando as cadeias pesadas e leves para permitir clivagem mais eficiente do polipeptídeo traduzido em polipeptídeos separados contendo a cadeia pesada ou leve.
[00347] Em particular, a sequência de aminoácido da Ig de HIV-1 Env- PG9 (antes de clivagem por furina; Identificação de Sequência N°: 2 e FIGURA 18) tem a seguinte estrutura: Peptídeo sinal de cadeia pesada de IgG humana, região pesada variável (VH), região pesada constante 1 (CH1), região de dobradiça, região pesada constante 2 (CH2), região pesada constante 3 (CH3), local de clivagem de furina, ligante GSG, peptídeo de P2A, peptídeo sinal de cadeia leve de lambda humano, região leve variável (VL) e região leve constante (CL, especificamente lambda). A sequência de cada porção da estrutura (todas que estão contidas dentro de Identificação de Sequência N°: 2, na ordem descrita acima) é provida abaixo.
[00348] Peptídeo Sinal de Cadeia Pesada de IgG humana de Ig de HIV- 1 Env-PG9 - MDWTWRILFLVAAATGTHA (Identificação de Sequência N°: 18).
[00349] Região pesada variável de Ig de HIV-1 Env-PG9 - EFGLSWVFLVAFLRGVQCQRLVESGGGVVQPGSSLRLSCAASGFDFS RQGMHWVRQAPGQGLEWVAFIKYDGSEKYHADSVWGRLSISRDNS KDTLYLQMNSLRVEDTATYFCVREAGGPDYRNGYNYYDFYDGYYN YHYMDVWGKGTTVTVSS (Identificação de Sequência N°: 19).
[00350] Região pesada constante 1 (CH1) de Ig de HIV-1 Env-PG9 - ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK RV (Identificação de Sequência N°: 20).
[00351] Região de dobradiça de Ig de HIV-1 Env-PG9 - EPKSCDKTHTCPPCP (Identificação de Sequência N°: 21).
[00352] Região pesada constante 2 (CH2) de Ig de HIV-1 Env-PG9 - APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAK (Identificação de Sequência N°: 22).
[00353] Região pesada constante 3 (CH3) de Ig de HIV-1 Env-PG9 - GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK (Identificação de Sequência N°: 23).
[00354] Local de clivagem de furina de Ig de HIV-1 Env-PG9 - RGRKRRS (Identificação de Sequência N°: 24).
[00355] Ligante GSG e peptídeo P2A de Ig de HIV-1 Env-PG9 - GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (Identificação de Sequência N°: 25).
[00356] Sinal peptídeo de Cadeia Leve de Lamba Humano de Ig de HIV-1 Env-PG9 - MAWTPLFLFLLTCCPGGSNS (Identificação de Sequência N°: 26).
[00357] Região Leve Variável (VL) de Ig de HIV-1 Env-PG9 - QSALTQPASVSGSPGQSITISCNGTSNDVGGYESVSWYQQHPGKAPKV VIYDVSKRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEGDYYCKSLTST RRRVFGTGTKLTVL (Identificação de Sequência N°: 27).
[00358] Região Leve Constante (CL, lambda) de Ig de HIV-1 Env- PG9- GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSP VKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGST VEKTVAPTECS (Identificação de Sequência N°: 28).
Exemplo 11 Fab de cadeia única de HIV-1 PG9 (scFab)
[00359] Além do HIV-1 Env-PG9 Ig descritas acima, uma única cadeia Fab (isto é, VH/CH1 e VL/CL codificadas por uma sequência nucleica que é transcrita em uma transcrição única e traduzida em um polipeptídeo único) foi criado com base nos anticorpos PG9 (referido neste documento como scFab de PG9 HIV-1). A sequência de ácido nucleico codificando scFab de HIV-1 PG9 é estabelecida na Identificação de Sequência N°: 50 e FIGURA 46. Na FIG. 46, sublinhado e sublinhado duplo marcam os locais de enzimas de restrição BamHI (GGA TCC) e XhoI (CTC GAG) que foram usados para clonar esta sequência de ácido nucleico no vetor pVAX1 enquanto negrito marca os códons de início (ATG) e de parada (TGA TAA). A sequência de ácido nucleico estabelecida na Identificação de Sequência N°: 50 foi uma sequência de ácido nucleico otimizada, isto é, a inclusão de uma sequência de kozak (GCC ACC), otimização de códon e sequência principal. A sequência principal foi localizada na extremidade 5' do construto, isto é, anterior ao Fab de cadeia única e, deste modo, o peptídeo sinal codificado pela sequência de ligante foi ligado por uma ligação peptídica para o terminal amino do Fab de cadeia única. A sequência de ácido nucleico estabelecida na Identificação de Sequência N°: 50 também incluiu uma sequência de ligante que foi posicionada entre a sequência de ácido nucleico codificando a VH/CH1 e a sequência de ácido nucleico codificando a VL/CL. Por conseguinte, no polipeptídeo codificado pela Identificação de Sequência N°: 50, a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ligante manteve a VH/CH1 e a VL/CL juntas. Identificação de Sequência N°: 50 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 51 e FIGURA 47, isto é, a sequência de aminoácido do scFab de HIV-1 PG9.
Exemplo 12 Ig de HIV-1 Env-4E10
[00360] Além da IgG de VRC01 e Ig de HIV-1 Env-PG9, outro construto foi criado que codificou IgG que foi reativa ao HIV-1 Env. Este construto foi HIV-1 Env-4E10, que foi otimizado e clonado em um vetor de expressão (FIGURAS 17A e 17B). Otimização incluiu a introdução de uma sequência de Kozak (por exemplo, GCC ACC), uma sequência principal, e otimização de códon. Criação do vetor de expressão contendo a sequência de ácido nucleico codificando Ig de HIV-1 Env-4E10 foi confirmada por digestão de enzima de restrição conforme mostrado na FIGURA 17C. Na FIG. 17C, a faixa 1 foi o vetor de expressão não digerido, faixa 2 foi o vetor de expressão digerido com BamHI e Xho1 e faixa M foi o Marcador.
[00361] A sequência de ácido nucleico codificando Ig de HIV-1 Env- 4E10 é estabelecida na Identificação de Sequência N°: 62 e FIGURA 60. Na FIG. 60, sublinhado e sublinhado duplo marcam os locais de enzimas de restrição BamHI (GGA TCC) e XhoI (CTC GAG) usados para clonar a sequência de ácido nucleico no vetor pVAX1 enquanto negrito marca os códons de início (ATG) e de parada (TGA TAA). Identificação de Sequência N°: 62 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 1 e FIGURA 19, isto é, a sequência de aminoácido de Ig de HIV-1 ENv-4E10 (antes de clivagem por furina).
[00362] Nesta sequência de aminoácido, um peptídeo sinal é ligado por ligação peptídica a cada uma das cadeias pesadas e leves para melhorar a secreção do anticorpo gerado in vivo. Adicionalmente, uma sequência do ácido nucleico codificando o peptídeo P2A é localizada entre as sequências de ácido nucleico codificando as cadeias pesadas e leves para permitir clivagem mais eficiente do polipeptídeo traduzido em polipeptídeos separados contendo a cadeia pesada ou leve.
[00363] Em particular, a sequência de aminoácido da Ig de HIV-1 Env- 4E10 (antes de clivagem por furina; Identificação de Sequência N°: 1 e FIGURA 19) tem a seguinte estrutura: peptídeo sinal de cadeia pesada de IgG humana, região pesada variável (VH), região pesada constante 1 (CH1), região de dobradiça, região pesada constante 2 (CH2), região pesada constante 3 (CH3), local de clivagem de furina, ligante GSG, peptídeo de P2A, peptídeo sinal de cadeia leve de kappa humano, região leve variável (VL) e região leve constante (CL, especificamente kappa). A sequência de cada porção da estrutura (todas que estão contidas dentro de Identificação de Sequência N°: 1, na ordem descrita acima) é provida abaixo.
[00364] Peptídeo Sinal de Cadeia Pesada de IgG humana de Ig de HIV- 1 Env-4E10 - MDWTWRILFLVAAATGTHA (Identificação de Sequência N°: 29).
[00365] Região pesada variável de Ig de HIV-1 Env-4E10 - QVQLVQSGAEVKRPGSSVTVSCKASGGSFSTYALSWVRQAPGRGLE WMGGVIPLLTITNYAPRFQGRITITADRSTSTAYLELNSLRPEDTAVYY CAREGTTGWGWLGKPIGAFAHWGQGTLVTVSS (Identificação de Sequência N°: 30).
[00366] Região Pesada Constante 1 (CH1) de Ig de HIV-1 Env-4E10 - ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDK KV (Identificação de Sequência N°: 31).
[00367] Região de Dobradiça de Ig de HIV-1 Env-4E10 - EPKSCDKTHTCPPCP (Identificação de Sequência N°: 32).
[00368] Região Pesada Constante 2 (CH2) de Ig de HIV-1 Env-4E10 - APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAK (Identificação de Sequência N°: 33).
[00369] Região Pesada Constante 3 (CH3) de Ig de HIV-1 Env-4E10 - GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK (Identificação de Sequência N°: 34).
[00370] Local de Clivagem de Furina de Ig de HIV-1 Env-4E10 - RGRKRRS (Identificação de Sequência N°: 35).
[00371] Ligante GSG e Peptídeo P2A de Ig de HIV-1 Env-4E10 - GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (Identificação de Sequência N°: 36).
[00372] Peptídeo Sinal de Cadeia Leve de Kappa Humano de Ig de HIV-1 Env-4E10 - MVLQTQVFISLLLWISGAYG (Identificação de Sequência N°: 37).
[00373] Região Leve Variável (VL) de Ig de HIV-1 Env-4E10 - EIVLTQSPGTQSLSPGERATLSCRASQSVGNNKLAWYQQRPGQAPRLL IYGASSRPSGVADRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGQSLS TFGQGTKVE (Identificação de Sequência N°: 38).
[00374] Região Leve Constante (CL, kappa) de Ig de HIV-1 Env- 4E10- KRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGE (Identificação de Sequência N°: 39).
Exemplo 13 ScFab de HIV-1 4E10
[00375] Além do HIV-1 Env-PG9 Ig descritas acima, uma única cadeia Fab (isto é, VH/CH1 e VL/CL codificadas por uma sequência nucleica que é transcrita em uma transcrição única e traduzida em um polipeptídeo único) foi criado com base nos anticorpos 4E10 (referido neste documento como scFab de 4E10 HIV-1). A sequência de ácido nucleico codificando scFab de HIV-1 4E10 é estabelecida na Identificação de Sequência N°: 52 e FIGURA 48. Na FIG. 48, sublinhado e sublinhado duplo marcam os locais de enzimas de restrição BamHI (GGA TCC) e XhoI (CTC GAG) que foram usados para clonar esta sequência de ácido nucleico no vetor pVAX1 enquanto negrito marca os códons de início (ATG) e de parada (TGA TAA). A sequência de ácido nucleico estabelecida na Identificação de Sequência N°: 52 foi uma sequência de ácido nucleico otimizada, isto é, a inclusão de uma sequência de kozak (GCC ACC), otimização de códon e sequência principal. A sequência principal foi localizada na extremidade 5' do construto, isto é, anterior ao Fab de cadeia única e, deste modo, o peptídeo sinal codificado pela sequência de ligante foi ligado por uma ligação peptídica para o terminal amino do Fab de cadeia única. A sequência de ácido nucleico estabelecida na Identificação de Sequência N°: 52 também incluiu uma sequência de ligante que foi posicionada entre a sequência de ácido nucleico codificando a VH/CH1 e a sequência de ácido nucleico codificando a VL/CL. Por conseguinte, no polipeptídeo codificado pela Identificação de Sequência N°: 52, a sequência de aminoácido codificada pela sequência de ligante manteve a VH/CH1 e a VL/CL juntas. Identificação de Sequência N°: 52 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 53 e FIGURA 49, isto é, a sequência de aminoácido do scFab de HIV-1 4E10.
Exemplo 14 CHIKV-Env-Fab
[00376] Conforme descrito acima, um Fab reativo ao HIV-1 Env foi agregado ou gerado in vivo mediante distribuição das sequências de ácido nucleico codificando as cadeias pesada (VH-CH1) e leve (VL-CL) de HIV- 1Env Fab para a célula ou o camundongo. Para determinar se Fabs reativos a outros antígenos poderiam ser gerados in vivo mediante distribuição de sequências de ácido nucleico de codificação para a célula ou sujeito, construtos foram criados que codificaram as cadeias pesada (VH-CH1) e leve (VL-CL, tipo lambda) de um anticorpo reativo a uma proteína de envelope (Env) do vírus Chikungunya (CHIKV). Geração desses construtos são descritos aqui no Exemplo 14 e também abaixo nos Exemplos 17 e 18
[00377] Cada construto incluiu uma sequência principal e uma sequência de kozak conforme mostrado nas FIGURAS 20A, 20B e 21. Os construtos codificando a VH-CH1 e a VL-CL foram clonados em um vetor de expressão e, deste modo, colocados sob o controle do promotor de citomegalovírus (CMV) (FIGURA 21). Os vetores de expressão contendo os construtos de codificação da VH-CH1 e VL-CL eram conhecidos como CHIKV-H e CHIV-L, respectivamente. Juntos, uma mistura dos vetores CHIKV-H e CHIKV-L eram conhecidos como pCHIKV-Env-Fab e isto gerou CHIKV-Env-Fab in vivo (isto é, mediante a introdução em uma célula ou sujeito). Em outras palavras, ambos os vetores foram exigidos para gerar o CHIKV-Env-Fab in vivo, conforme descrito com mais detalhes abaixo.
[00378] Os construtos também foram otimizados para expressão. Em particular, uma sequência principal foi incluída em cada construto para aumentar a eficiência de secreção do CHIKV-Env-Fab mediante geração do CHIKV-Env-Fab in vivo. Cada construto também era códon otimizado e incluiu uma sequência de kozak (GCC ACC). A sequência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada (VH-CH1) do CHIKV-Env-Fab é estabelecida na Identificação de Sequência N°: 58 e FIGURA 56. Na FIG. 56, sublinhado e sublinhado duplo marcam os locais de enzimas de restrição BamHI (GGA TCC) e XhoI (CTC GAG) usados para clonar a sequência de ácido nucleico no vetor pVAX1 enquanto negrito marca os códons de início (ATG) e de parada (TGA TAA). Identificação de Sequência N°: 58 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 59 e FIGURA 57, isto é, a sequência de aminoácido da cadeia pesada (VH-CH1) do CHIKV-Env-Fab.
[00379] A sequência de ácido nucleico codificando a cadeia leve (VLCL) do CHIKV-Env-Fab é apresentada na SEQ ID NO: 60 e a FIG. 58. Na FIG. 58, sublinhado e sublinhado duplo marcam os locais de enzimas de restrição BamHI (GGA TCC) e XhoI (CTC GAG) usados para clonar a sequência de ácido nucleico no vetor pVAX1 enquanto negrito marca os códons de início (ATG) e de parada (TGA TAA). Identificação de Sequência N°: 60 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 61 e FIGURA 59, isto é, a sequência de aminoácido da cadeia leve (VL-CL) do CHIKV-Env-Fab.
[00380] Para medir a cinética temporal de geração de CHIKV-Env-Fab in vivo, as células foram transfectadas com pVAX1, CHIKV-H, CHIKV-L ou pCHIKV-Env-Fab. Depois da transfecção, ELISA foi usada para medir o nível de geração de CHIKV-Env-Fab ao longo do tempo. Como mostrado na FIG. 22, células transfectadas com pVAX1, CHIKV-H ou CHIKV-L não produziram anticorpo que fosse reativo com o antígeno de CHIKV Env. Em contraste, as células transfectadas com pCHIKV-Env-Fab produziram anticorpo (ou seja, CHIKV-Env-Fab, também conhecido como CHIKV-Fab) que foi reativo com o antígeno CHIKV Env. Por conseguinte, estes dados indicaram que distribuição de sequências de ácido nucleico codificando a pesada (VH-CH1) e a leve (VL-CL) do CHIKV-Env-Fab resultaram na geração de um Fab que se ligou ou foi reativo ao antígeno de CHIKV-Env.
[00381] Adicionalmente, CHIKV-Env-Fab foi usado em um Western blot de lisados obtidos de células transfectadas com pCHIKV-Env, que é um plasmídeo que codifica o antígeno de CHIKV-Env. Conforme mostrado na FIGURA 23, o antígeno de CHIKV-Env foi detectado por meio do CHIKV- Env-Fab, indicando que este Fab se ligou ao antígeno.
[00382] Para examinar, adicionalmente, a geração ou a agregação de CHIKV-Env-Fab in vivo, camundongos foram administrados com pCHIKV- Env-Fab (isto é, 12,5 μg CHIKV-H e 12,5 μg CHIKV-L). Adicionalmente, um segundo, terceiro e quarto grupo de camundongos foram administrados com 25 μg de pVAX1, CHIKV-H e CHIKV-L, respectivamente, e serviram como controles. Especificamente, os plasmídeos foram administrados aos respectivos grupos de camundongos no dia 0 depois de obter uma amostra de pré-sangramento. Sangue foi tirado no dia 1, dia 2, dia 3, dia 5, dia 7 e dia 10 (FIGURA 24). Medições de ELISA foram executadas nestes sangramentos para determinar os níveis de anticorpo reativo ao antígeno de CHIKV-Env. Como mostrado na FIG. 25, pCHIKV-Env-Fab administrada aos camundongos resultou na geração de anticorpos (isto é, CHIKV-Env-Fab) que foi reativo com o antígeno CHIKV-Env. pVAX1, CHIKV-H ou CHIKV-L administrados aos camundongos não geraram anticorpos tendo significativa reatividade com o antígeno de CHIKV-Env. Por conseguinte, estes dados demonstraram, adicionalmente, que mediante distribuição de sequências de ácido nucleico codificando as cadeias pesada (VH-CH1) e leve (VL-CL) do CHIKV-Env-Fab, este Fab foi gerado in vivo (isto é, nos camundongos) e foi reativo a seu antígeno (isto é, CHIKV-Env) mostrando, desse modo, que o Fab foi corretamente agregado in vivo.
[00383] Para determinar se o CHIKV-Env-Fab poderia proteger contra a infecção de CHIKV, camundongos C57BL/6 (2 a 3 semanas de idade; cerca de 20 a 25 gramas de peso) foram administrados no dia 0 pCHIKV-Env-Fab (50 μg) ou pVAX1. 6 horas após a administração de pCHIKV-Env-Fab, cada camundongo foi inoculado com 7 log 10 PFU em um volume total de 25 μl por uma via intranasal. Cada dia subsequente, o peso corporal foi determinado para cada camundongo e um camundongo era sacrificado se a perda de peso fosse de mais do que 30%.
[00384] Como mostrado na FIG. 26, cerca de 75% dos camundongos administrados com pCHIKV-Env-Fab sobreviveram à infecção de CHIKV a partir do dia 14 de estudo, enquanto no dia 14, todos os camundongos que foram administrados com pVAX1 estavam mortos. Adicionalmente, os camundongos administrados com pCHIKV-Env-Fab foram associados a níveis menores das citocinas TNF-α e IL-6 conforme comparado aos camundongos administrados com pVAX1 (FIGURAS 27 e 28). Níveis de TNF-α e IL-6 foram medidos em soros obtidos dos camundongos. Estes camundongos sobreviventes não exibiram nenhum sinal de patologia, perda de peso corporal e tinham menores níveis das citocinas TNF-α e IL-6. Por conseguinte, estes dados indicaram que a administração de pCHIKV-Env-Fab protegeu os camundongos da infecção de CHIKV e promoveram a sobrevivência de infecção de CHIKV. Em outras palavras, geração de CHIKV-Env-Fab in vivo nos camundongos protegeu contra e promoveu a sobrevivência de infecção de CHIKV.
Exemplo 15 Fab de Anti-Her-2
[00385] Como descrito acima, um Fab (isto é, VH/CH1 e VL/CL) reativo ao HIV-1 Env ou CHIKV Env foi agregado ou gerado in vivo mediante distribuição das sequências de ácido nucleico codificando as cadeias pesada (VH-CH1) e leve (VL-CL) do HIV-1Env Fab ou CHIKV Env-Fab para a célula ou o camundongo. Para determinar se Fabs reativos a um antígeno próprio (isto é, um antígeno endógeno ao sujeito sendo administrado com as sequências de ácido nucleico codificando o Fab) poderia ser gerado in vivo mediante distribuição de sequências de ácido nucleico de codificação para a célula ou sujeito, construtos foram criados que codificaram as cadeias pesada (VH-CH1) e leve (VL-CL, tipo kappa) de um anticorpo reativo ao receptor de fator de crescimento epidérmico humano 2 (Her-2, também conhecido como Erb2). Cada construto incluiu uma sequência principal e uma sequência de kozak (GCC ACC), que precedeu a sequência de ácido nucleico codificando a VH-CH1 ou a VL-CL do Fab de anti-Her-2, conforme mostrado nas FIGURAS 28, 30 e 31. Por conseguinte, estes construtos foram otimizados devido à introdução da sequência principal e sequência de kozak e foram, adicionalmente, otimizados para uso de códon.
[00386] Os construtos codificando a VH-CH1 e a VL-CL foram clonados no vetor de expressão de pVAX1, ou seja, entre os locais de restrição BamHI e XhoI e, deste modo, foram colocados sob o controle do promotor de citomegalovírus (CMV). Em particular, os construtos codificando o VH-CH1 e VL-CL foram clonados em dois vetores pVAX1 separados e, deste modo, os dois plasmídeos resultantes foram exigidos para gerar o Fab de anti-Her-2 in vivo.
[00387] A sequência de ácido nucleico codificando a VH-CH1 do Fab de anti-Her-2 é estabelecida na Identificação de Sequência N°: 40 e FIGURA 32. Na FIG. 32, sublinhado e sublinhado duplo marcam os locais de enzimas de restrição BamHI (GGA TCC) e XhoI (CTC GAG), respectivamente, usados para clonar a sequência de ácido nucleico no vetor pVAX1 enquanto negrito marca os códons de início (ATG) e de parada (TGA TAA). Identificação de Sequência N°: 40 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 41, isto é, a sequência de aminoácido da VH-CH1 do Fab de anti-Her-2 (FIGURAS 32 e 33).
[00388] A sequência de ácido nucleico codificando a VL-CL do Fab de anti-Her-2 é estabelecida na Identificação de Sequência N°: 42 e FIGURA 34. Na FIG. 34, sublinhado e sublinhado duplo marcam os locais de enzimas de restrição BamHI (GGA TCC) e XhoI (CTC GAG), respectivamente, usados para clonar a sequência de ácido nucleico no vetor pVAX1 enquanto negrito marca os códons de início (ATG) e de parada (TGA TAA). Identificação de Sequência N°: 42 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 43, isto é, a sequência de aminoácido da VLCL do Fab de anti-Her-2 (FIGURAS 34 e 35).
[00389] Para determinar se uma mistura dos plasmídeos codificando a VH-CH1 e a VL-CL do Fab de anti-Her-2 gerou o Fab de Her-2 in vivo, células 293T foram transfectadas com uma mistura dos plasmídeos codificando a pesada (VH-CH1) e a leve (VL e CL) de Fab de anti-Her-2 ou pVAX1. Depois da transfecção, concentração de IgG total foi medida conforme mostrado na FIGURA 36. Na FIG. 36, barras de erro representaram o desvio padrão. Estes dados indicaram que o Fab de Her-2 foi gerado in vivo após introdução dos dois plasmídeos, cada um codificando a VH-CH1 ou a VL-CL de Fab de anti-Her-2.
Exemplo 16 IgG de Vírus Anti-Dengue Humano
[00390] Um sistema de plasmídeo único foi criado para gerar um anticorpo de IgG humana de vírus anti-Dengue (DENV) in vivo. Especificamente, um construto foi gerado conforme mostrado no esquema da FIGURA 37. Especificamente, uma sequência principal foi colocada a montante da sequência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de IgG (isto é, região pesada variável (VH), região pesada constante 1 (CH1), região de dobradiça, região pesada constante 2 (CH2) e região pesada constante 3 (CH3)). Por sua vez, uma sequência codificando um local de clivagem de protease foi colocada a jusante da sequência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de IgG. Uma sequência de ácido nucleico codificando a cadeia leve de IgG (isto é, região leve variável (VL) e região leve constante (CL)) foi localizada após a sequência codificando o local de clivagem de protease (isto é, local de clivagem furina). Os peptídeos sinal codificados por este construto foram peptídeos sinal cognatos proporcionando, desse modo, secreção apropriada do anticorpo mediante expressão. Adicionalmente, mediante expressão uma transcrição única é traduzida em um único polipeptídeo, que é então processado pela protease nos polipeptídeos correspondentes às cadeias pesadas e leves da IgG humana de anti-DENV. Estes polipeptídeos de cadeia pesada e leve então agregam em uma IgG humana de anti-DENV funcional, isto é, um anticorpo que se liga a seu antígeno cognato.
[00391] Este construto foi clonado no vetor de expressão de pVAX1 (ou seja, os locais BamHI e XhoI), desse modo, colocando-o sob o controle de um promotor. Este construto codificando a IgG humana de vírus anti-Dengue tem a sequência de ácido nucleico estabelecida na Identificação de Sequência N°: 44 (FIGURA 38), que foi otimizado para expressão. Na FIG. 38, sublinhado e sublinhado duplo marcam os locais de enzimas de restrição BamHI (GGA TCC) e XhoI (CTC GAG) usados para clonar o construto no vetor pVAX1 enquanto negrito marca os códons de início (ATG) e de parada (TGA TAA). Otimização incluiu a inclusão de uma sequência de kozak (GCC ACC) e otimização de códon. Identificação de Sequência N°: 44 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 45 e FIGURA 39, isto é, a sequência de aminoácido da IgG humana de anti-DENV antes de clivagem pela protease para separar as cadeias pesadas e leves em dois polipeptídeos separados.
[00392] O plasmídeo contendo a sequência de ácido nucleico codificando a IgG humana de vírus Anti-Dengue foi administrado a camundongos para determinar se a IgG humana de vírus anti-Dengue foi gerada in vivo (isto é, nos camundongos). Após a administração do plasmídeo, soros foram obtidos dos camundongos e analisados por meio de ELISA para determinar se os soros continham anticorpo que era reativo à proteína E da Dengue de quatro sorotipos de vírus da Dengue, ou seja, DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4. Como mostrado na FIG. 40, os soros de camundongos administrados com o plasmídeo contendo a sequência de ácido nucleico codificando a IgG humana de anti-DENV foram reativos à proteína E de DENV de sorotipos DENV-1, -2, -3 e -4. Um anticorpo isotípico foi usado como um controle positivo. Por conseguinte, estes dados indicaram que, mediante a introdução do plasmídeo em camundongos, a sequência de ácido nucleico codificando IgG humana de anti DENV foi transcrita e traduzida em um polipeptídeo que foi processado para produzir polipeptídeos contendo as cadeias pesadas e leves da IgG humana de anti- DENV. Estes polipeptídeos agregaram na IgG humana de anti-DENV provendo, desse modo, um anticorpo funcional que se liga ou foi reativo à proteína E de DENV.
[00393] Para adicionalmente examinar a geração de IgG humana de anti-DENV in vivo pela administração de um plasmídeo único, camundongos foram administrados por meio de injeção com o plasmídeo contendo a sequência de ácido nucleico codificando a IgG humana de anti-DENV. Especificamente, os camundongos foram administrados com 50 μg ou 100 μg do plasmídeo e 5 camundongos estavam em cada grupo. No dia 3 e dia 6 pós- injeção, os camundongos foram examinados para seroconversão. Como mostrado na FIG. 41, camundongos de ambos os grupos eram seropositivos para anticorpos de IgG de anti-DENV. Em particular, os camundongos administrados com 50 μg do plasmídeo tinham cerca de 110 ng/mL de IgG humana e os camundongos administrados com 100 μg do plasmídeo tinham cerca de 170 ng/mL de IgG humana. Por conseguinte, estes dados demonstraram, adicionalmente, a geração de IgG humana anti-DENV in vivo após a administração de um plasmídeo codificando a mesma. Estes dados também demonstraram que produção de anticorpo de IgG humana anti-DENV ocorreu em menos do que 1 semana permitindo, desse modo, a rápida produção de IgG humana anti-DENV.
Exemplo 17 Materiais e Métodos para os Exemplos 18-25
[00394] O plasmídeo de DNA optimizado (s) que codifica um fragmento Fab (CHIKV-Fab) ou um anticorpo de comprimento completo (CHIKV-IgG) visando a segmentação do envelope CHIKV (Env) de proteínas foram concebidos e comparados. Distribuição intramuscular de qualquer construto de DNA em camundongos resultou na produção rápida de seus anticorpos codificados, bem como a eficácia protetora de exposições prematuras e tardias à CHIKV. Os soros de camundongos imunizados CHIKV-IgG também neutralizaram múltiplos CHIKV isolados clínicos ex vivo. Imunizações individuais com CHIKV-IgG demonstraram proteção significativamente melhor contra a exposição viral prematura do que plasmídeos de DNA de indução de antígenos, bem como níveis comparáveis de proteção contra a exposição tardia à CHIKV. Estes estudos são descritos em mais detalhe abaixo.
[00395] Células Rim embrionário humano (HEK) células 293T e células Vero foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco-Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 UI de penicilina por ml, 100 ug de estreptomicina por mL e 2 mM de L- glutamina.
[00396] Construção do CHIKV-Fab e CHIKV-IgG. Para construir o anticorpo anti-Env CHIKV expressando plasmídeo,os segmentos da cadeia do anticorpo da variável pesada (VH) e da variável leve (VL) foram gerados através da utilização de oligonucleotídeos sintéticos, com várias modificações. Para a clonagem do fragmento Fab ou um anticorpo de comprimento completo, um único quadro de leitura aberta foi montado contendo as cadeias pesada e leve, um local de clivagem de furina inserido e um local de auto processamento de peptídeo P2A entre cadeia pesada e leve. Este foi incorporado, a fim de expressar um anticorpo de comprimento completo a partir de uma única estrutura de leitura aberta. Em ambos os plasmídeos, uma sequência principal foi incorporada em cada gene a fim de potencializar a expressão. As sequências resultantes foram modificadas e potencializadas com códon de otimização de RNA e foram clonados no vetor de expressão pVax1 e as construções resultantes foram produzidas em larga escala para este estudo (GenScript, NJ). O DNA de plasmídeo purificado foi formulado em água para administração subsequente em camundongos. Um vetor de expressão de controle pVAX1 vazio foi utilizado como um controle negativo. Especificamente, o DNA para a luz variável (VL) e variável pesada (VH) (isto é. Fab) cadeias ou imunoglobulina completa (Ig) usadas neste estudo foram geradas a partir de um CHIKV específico anti-Env neutralizando o anticorpo monoclonal/hibridoma humano.
[00397] Construção do CHIKV Fab também é descrita acima no Exemplo 14 abaixo e no Exemplo 18.
[00398] Construção do CHIKV Ig também é descrito abaixo no Exemplo 18. A sequência de ácido nucleico codificando o CHIKV Ig está descrita em SEQ ID NO: 65. Identificação de Sequência N°: 65 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°: 66.
[00399] Medição da expressão de anticorpo anti-CHIKV Env do CHIKV Fab ou CHIKV-IgG por análise de Western blot. A linha celular 293T humana foi utilizada para a análise de expressão utilizando o reagente de transfecção TurboFectin 8,0 (OriGene). Estas células foram semeadas a 5070% de confluência (1-3x105 células por poço em 2 ml de volume total do meio) em uma placa de cultura de 35 milímetros por 24 horas. Após 24 horas, as células foram transfectadas com 10μg de vetor de controle pVAX1, CHIKV-Fab (5 μg de VH e 5 μg de VL de DNA) ou CHIKV-IgG (10 μg). O sobrenadante foi recolhido às 48 horas pós-transfecção e avaliado para determinar níveis de anticorpo anti-CHIKV por ELISA utilizando proteína recombinante CHIKV-Env como o antígeno de revestimento. O sobrenadante a partir da amostra pVAX1 foi utilizado como um controle negativo.
[00400] A análise Western blot foi realizada para confirmar a ligação específica do anticorpo produzido por transfecção com CHIKV-Fab ou CHIKV-IgG. Para gerar uma fonte de proteína de envelope CHIKV, células 293T foram transfectadas com 10 μg de DNA de plasmídeos expressando a CHIKV-Env. Dois dias após a transfecção as células foram lisadas e submetidas a eletroforese num gel de SDS-PAGE a 12%. O gel foi transferido para uma membrana de nitrocelulose usando iBlot2 (Life Technologies). As amostras foram separadas num gel de poli-acrilamida (12% NuPAGE da Novex, Invitrogen) e transferidas para uma membrana de PDF (Invitrogen). As membranas foram bloqueadas utilizando um tampão comercial (tampão de bloqueio Odyssey, LiCor Biosciences) e incubadas durante a noite a 4°C com anticorpos primários específicos criados em camundongos, bem como □ - actina (Santa Cruz). Anticorpos secundários de cabra anti-coelho ou anti- camundongo IRD700 e IRDye800 foram usados para detecção (Licor Biosciences).
[00401] Ensaio de ligação específica de vírus: Análise por imunofluorescência. Lâminas de câmara (Nalgene Nunc, Naperville, Ill.) foram semeadas com células Vero (1x104) à partir de culturas. As células foram cultivadas até atingirem uma confluência de aproximadamente 80%, após o que as células foram infectadas durante 2 horas com CHIKV a uma multiplicidade de infecção (moi) de 1. Após adsorção durante 2 h a 37°C, o inóculo de vírus foi aspirado e as folhas de células foram lavadas três vezes com meio de Iscove-FBS a 10%. Vinte e quatro horas após a infecção, as células foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas com metanol frio durante 20 minutos à temperatura ambiente e depois deixou-se secar ao ar. A ligação do anticorpo foi detectada pela adição de soro imune (diluição 1: 100) a partir dos camundongos administrados com CHIKV-Fab durante 90 min a 37°C numa câmara umidificada. Após lavagem três vezes com PBS, as células foram incubadas durante 60 min a 37°C com IgG de cabra anti-humana conjugada à FITC (Santa Cruz Biotechnology Inc.,). A coloração nuclear adicional com 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI) à temperatura ambiente durante 20 minutos. Lavagens de 1 PBS foram realizadas depois de cada passo de incubação. As amostras foram subsequentemente montadas sobre lâminas de vidro utilizando DABCO e foram visualizadas com um microscópio confocal (LSM710; Carl Zeiss). As imagens resultantes foram analisadas utilizando o software Zen (Carl Zeiss). Além disso, a reatividade imunológica de soros CHIK-IgG imunizados foram testadas em HIV-1 GFP pseudotipado com células Vero infectadas com vírus CHIKV-Env para testar a atividade de ligação por citometria de fluxo.
[00402] Análise quantificação de anticorpos por ELISA. Os ensaios de ELISA foram realizados com soros de camundongos administrados com CHIKV-Fab, CHIKV-IgG ou pVAX1, a fim de medir a cinética da expressão do construto de anticorpos e capacidade para se ligarem ao seu antígeno alvo, CHIKV-Env. As amostras de soro foram colhidas a partir de camundongos injetados com plasmídeo em vários pontos de tempo. Para a quantificação de Fab humana total nas amostras de soro colhidas, placas de 96 poços de poliestireno de alta ligação (Corning) foram revestidas com ^g/poço anticorpo com fragmento Fab de IgG de cabra anti-humana (Bethyl Laboratories) durante a noite a 4°C. Para medir a capacidade do construto de anticorpo se ligar ao seu antígeno alvo, a proteína Env CHIKV, placas de ELISA foram revestidas com a proteína recombinante Env CHIKV durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as placas foram lavadas com PBS-T (PBS, 0,05% de Tween 20) e bloqueadas com BSA a 3% em PBS-T durante 1 hora à temperatura ambiente. Após outra lavagem, as amostras foram diluídas a 1:100 em 1% de FBS em PBS-T, adicionado à placa e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas, e cadeia leve kappa de cabra anti-humano conjugado à HRP (Bethyl Laboratories) foi adicionado durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram, em seguida, lidas a 450 nm utilizando um leitor Biotek EL312e Bio-Kinetics. As amostras foram detectadas com SIGMAFAST OPD (Sigma-Aldrich). Para a quantificação, uma curva padrão gerada usando IgG/kappa humana purificada (Bethyl Laboratories). Todas as amostras de soro foram testadas em duplicata.
[00403] Produção de pseudotipo CHIKV-Env e análise FACS. pseudotipos CHIKV-Env GFP foram produzidas usando 5μg de pNL4-3env- GFP e 10μg de envelope viral que codifica plasmídeo CHIKV. VSVs Pseudotipados foram produzidos. Pseudoviriões foram concentrados por ultracentrifugação a concentração de 28.000 rpm numa centrífuga de super velocidade Sorvall Lynx 400 (Thermo Scientific) através de uma almofada de sacarose a 20% durante 1,5 h a 4°C. Os sedimentos foram ressuspensos em HBSS durante a noite a 4°C. Após a análise de ELISA de p24, pseudoviriões lentivirais foram normalizados para conter um número igual de partículas virais. As células foram semeadas a 2,5 x 104 em placas de 48 poços 24h antes da infecção. As células foram destacadas 18 horas após a infecção, fixadas com PFA a 1% em PBS durante 10 minutos, e permeabilizadas com 0,1% (w/v) de solução de detergente de saponina. Células infectadas CHIKV foram incubadas com soros de camundongos administrados pCHIKV-IgG e anticorpo secundário IgG de cabra anti-humana conjugada à Alexa 594 (Life Technologies). A infecção foi avaliada com citometria de fluxo (Becton- Dickinson) e analisadas utilizando o software FlowJo.
[00404] Administração de IgG em camundongos e estudo de desafio CHIKV. B6.Cg-Foxn1nu/ J (The Jackson Laboratory) camundongos foram usados para o Fab e geração de IgG de comprimento completo, quantificação e caracterização funcional. Os camundongos foram injetados com um volume total de 50 ul de quer DNA pVAX1 (100μg), DNA CHIKV-Fab (50μg de VH e 50μg de VL) ou CHIKV-IgG (100μg) no músculo quadríceps. A administração dos plasmídeos de DNA foi seguida imediatamente por EP- distribuição mediada optimizada (CELLECTRA®; Inovio Pharmaceuticals, Inc.,). Os parâmetros pulsantes para distribuição de EP foram 3 pulsos de 0,5 Amp corrente constante, 1 segundo de diferença e 52 milissegundos de duração.
[00405] Para estudo de desafio CHIKV, camudongos BALB/c foram injetados por via intramuscular com volume total de 100 ul de plasmídeos pVAX1 controle vazios ou CHIKV-Fab ou CHIKV-IgG (100μg), imediatamente seguido com distribuição mediada Opt-EP. Dois dias após a distribuição de DNA, os camundongos foram desafiados com um total de 1x107 UFP (25 μl) de CHIKV-Del-03 (JN578247) (41) por via subcutânea no lado dorsal de cada pata traseira. Inchaço do pé (altura por largura) foi medido utilizando um paquímetro digital diariamente de 0 a 14 dpi. Os camundongos foram monitorizados diariamente para sobrevivência e sinais de infecção (isto é, o peso corporal e a letargia) ao longo de um período de observação pós- desafio de três semanas. Os animais que perderam mais de 30% de massa corporal foram sacrificados e as amostras de soro foram recolhidas para quantificação de citocinas e outras análises imunológicas. Amostras de sangue foram coletadas nos dias de 7 a 14 do pós-desafio de sangramentos de cauda e viremia foi analisada pelo ensaio de placa (PFU/ml). Foram realizados dois experimentos independentes.
[00406] Análise Imunológica de Citocinas. Os soros foram coletados de camundongos injetados com CHIKV-Fab ou CHIKV-Ig e viralmente desafiados (no dia 10 após o desafio). Os níveis de citocinas de TNF-α, IL-1β, IP-10 e IL-6 no soro foram medidos utilizando kits de ELISA de acordo com as instruções do fabricante (R&D Systems).
[00407] CHIKV Neutralização de Ensaio. Foram determinados os títulos de anticorpos neutralizantes do vírus no soro de camundongos administrados com CHIKV-Fab ou CHIKV-IgG. Resumidamente, células Vero (American Type Culture Collection) foram colocadas em placas a 15.000 células por poço numa placa de 96 poços (Nunc). Diluições de duas vezes em série de soros de camundongos inativados pelo calor foram preparadas em triplicado numa placa de 96-poços e 100 TCID50 de suspensão de isolados virais CHIKV foi adicionado a cada poço. Após uma hora de incubação a 37°C, as amostras foram adicionadas a monocamadas de células Vero e incubadas durante 3 dias. As monocamadas de células Vero foram subsequentemente fixadas e coradas com violeta cristal a 0,05%, metanol a 20% (Sigma-Aldrich). Títulos de neutralização foram determinados tomando o inverso da última diluição em que a monocamada de células Vero permaneceu completamente intacta e expressa como o recíproco da diluição do soro mais elevada que dá ainda a supressão de 100% de efeito citopático. Gráficos e estatísticas foram geradas com o pacote de software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Regressão não linear com o encaixe de dose- resposta sigmoidal (declive variável) foi utilizada para determinar a IC50.
[00408] As análises estatísticas, utilizando um teste t de Student ou o teste de correlação não paramétrico de Spearman, foram realizadas utilizando software Graph Pad Prism (Prism Inc.). As correlações entre as variáveis nos grupos de controle e experimentais foram avaliados estatisticamente por meio do teste de correlação de Spearman. Para todos os testes, valores de p inferiores a 0,05 foram considerados significativos.
Exemplo 18 Construto e Funcionalidade de Anticorpos Monoclonais CHIKV
[00409] Os CHIKV-FAB e construtos de IgG completos otimizados para o aumento da expressão. A FIG. 63A ilustra o desenho dos plasmídeos anti-CHIKV-Fab e CHIKV-IgG. Para CHIKV-Fab, os genes de VH e VL foram depois clonados separadamente em vetores de plasmídeo pVAX1 como descrito acima nos Exemplos 14 e 17.
[00410] Para examinar a expressão e a funcionalidade de CHIKV-Fab e IgG, estes anticorpos foram produzidos in vitro. Especificamente, as células 293T humanas foram transfectadas com quantidades iguais de ambos os plasmídeos da cadeia pesada e leve do CHIKV-Fab ou o plasmídeo da CHIKV-IgG e sobrenadante a partir de células transfectadas foram colhidas às 48 horas pós-transfecção. Conforme indicado na FIG. 63B, apenas as células transfectadas com plasmídeos CHIKV-Fab ou plasmídeos CHIKV-IgG produziram níveis mensuráveis de anticorpos anti-CHIKV como medido por ELISA de ligação utilizando proteína recombinante de envelope de proteína CHIKV e que indica que o desenho dos dois plasmídeos de CHIKV-Fab ou anticorpos CHIKV montados e funcionais de IgG de comprimento único completo gerados corretamente in vitro.
Exemplo 19 Expressão e Quantificação Cinética Potencializada In Vivo de CHIKV-IgG após a distribuição mediada por EP
[00411] Para caracterizar esta abordagem de distribuição de DNA para a distribuição de anticorpos monoclonais, o efeito da habilidade de CHIKV- IgG para produzir anticorpos CHIKV funcionais in vivo foi testado. Este teste usou o construto de IgG de comprimento total acima descrito nos Exemplos 17 e 18. B6.Cg-Foxn1nu/camundongos J foram administrados com o plasmídeo IgG ou vetor pVAX1 por injeção IM, seguido imediatamente por EP como indicado na FIG. 63C. Além do CHIKV-IgG para os fins de comparação, uma única administração de proteína recombinante CHIKV-Env também foi imunizada em camundongos. Os soros de todos os camundongos foram recolhidos em vários pontos de tempo durante a experiência, tal como indicado, e o antígeno alvo de ligação para a proteína de envelope CHIKV foi medida por ELISA. Os camundongos administrados com o plasmídeo CHIKV-IgG produziram níveis detectáveis de anticorpos capazes de se ligarem à proteína envelope de CHIKV e provocada nos dias 1 a 3 pós- administração, onde camundongos imunizados com CHIKV-Env recombinante mostrados no dia 8 após a administração (FIG. 63D), e este resultado indicou a rápida geração de IgG através deste plasmídeo de distribuição, em comparação com a administração de proteínas.
[00412] Além disso, uma única administração de plasmídeo CHIKV- IgG com EP em camundongos resultou na rápida geração de CHIKV-Abs humano detectável no soro. Os níveis séricos de CHIKV-Abs atingiram 600- 800ng/mL no dia 5, atingiu um pico de 1300-1600ng/mL no dia 14 e foram mantidos em níveis> 800 ng/mL através do dia 35 (Fig. 63E). Para examinar a expressão de CHIKV-IgG produzida pelo plasmídeo in vivo, a especificidade de ligação dos anticorpos anti-CHIKV produzidos a partir de camundongos imunizados foi confirmada por análise de Western blot utilizando proteína recombinante CHIKV, indicando que o desenho de IgG-plasmídeo de CHIKV-IgG gerou anticorpos CHIKV-IgG funcionais adequadamente clivados e montados in vivo (FIG. 63F). Esses experimentos forneceram evidências de que os anticorpos CHIKV-monoclonais de distribuição de DNA eram estáveis não só in vitro mas também sobre cursos de tempo de vários dias em animais.
Exemplo 20 Caracterização da especificidade de ligação e imuno-histoquímica de células infectadas com CHIKV
[00413] O estudo acima no Exemplo 19, foi ampliado e infecção foi usada para caracterizar o potencial terapêutico dos anticorpos monoclonais anti-CHIKV de distribuição de DNA. CHIKV-abs se liga especificamente à CHIKV-Env e não à outras proteínas. As propriedades de especificidade e de ligação alvo da CHIKV-Abs foram avaliadas por ligação de ELISA, análise de FACS e imuno-histoquímica utilizando as células infectadas CHIKV. Testes de diluições em série de soros a partir do dia 14 os camundongos injetados com plasmídeo (s) que codifica anticorpos CHIKV-IgG ou CHIKV- Fab demonstraram que os anticorpos detectados poderiam ligar-se especificamente ao seu antígeno alvo, ou seja proteína CHIKV-Env, e não uma outra proteína viral, isto é, proteína recombinante do envelope de HIV-1 (FIG. 64A). Para analisar ainda mais a especificidade de ligação do anticorpo anti-CHIKV-IgG produzido in vivo, os soros de camundongos foram incubados com células Vero fixas que tinham sido infectadas com vírus CHIKV. Imagiologia por imunofluorescência destacou a presença de anti- CHIKV-IgG ligados às células que expressam a proteína do envelope CHIKV mas não em soro de camundongo a partir do construto pVAX1 apenas camundongos (Fig. 64B). Além, especificidade de ligação de anticorpos produzidos in vivo para as células infectadas foi analisada por FACS (FIG. 64C). Amostras de soros experimentais, de camundongos administrados com CHIKV-IgG ligou o antígeno alvo CHIKV-Env.
Exemplo 21 Soros de Camundongos Injetados com CHIKV-IgG Demonstraram Grande Atividade Neutralizante Contra Isolados Clínicos CHIKV
[00414] Para avaliar o potencial de atividade anti-CHIKV de soros coletados de camundongos administrados com CHIKV-Ig, a atividade neutralizante foi medida contra vários isolados CHIKV, especificamente cepas CHIKV Ross, LR2006-OPY1, IND-63WB1, Ross, PC08, Bianchi e DRDE-06. IC50 valores (a maior diluição de soro que resultou numa inibição de pelo menos 50%) foram determinados para cada isolado viral (FIG. 65A- 65F). Os soros de camundongos injetados com CHIKV-IgG neutralizaram eficazmente todos os seis isolados virais testados, demonstrando que uma única injeção de DNA que codifica o CHIKV-IgG produziu títulos neutralizantes da anti-CHIKV Ig humana em camundongos. Os resultados indicaram que o anticorpo gerado a partir da administração da CHIKV-IgG exibiu atividade biológica relevante depois de distribuição in vivo .
Exemplo 22 CHIKV-IgG Contribuiu Altos Níveis de Atividade de Anticorpos Vírus- Específicos e Protegeu Camundongos de CHIKV Desafiada
[00415] Para determinar se o construto de CHIKV-IgG forneceu proteção contra a exposição prematura à CHIKV, grupos de camundongos foram injetados quer com plasmídeos CHIKV-IgG ou CHIKV-Fab no dia 0, e em seguida, desafiados com vírus no dia 2. Um terceiro grupo de camundongos recebeu plasmídeo pVAX1 vazio para servir como um controle negativo. Mudanças de sobrevivência e peso foram registradas por 20 dias. Todos os camundongos injetados com plasmídeo pVAX1 morreram no prazo de uma semana de desafio viral (FIG. 66A). Em camundongos desafiados, 100% de sobrevivência foi observada em camundongos administrados quer com CHIKV-IgG ou CHIKV-Fab durante o período de observação pós- desafio de 20 dias. Isto indica que ambos os construtos CHIKV conferiram imunidade protetora contra CHIKV tão cedo quanto pós-distribuição (FIG. 66B).
[00416] Em seguida, se CHIKV-IgG e CHIKV-Fab produziram imunidade protetora de longa duração foi avaliado. Grupos de camundongos foram desafiados com vírus CHIKV 30 dias após injeções únicas com o plasmídeo CHIKV-IgG, plasmídeos CHIKV-Fab ou o plasmídeo pVAX1. Os camundongos foram então monitorizados durante a sobrevivência durante um período de 20 dias. Os ratos injetados com CHIKV-Fab tiveram uma sobrevida de 50%, enquanto 90% de sobrevida foi observada em camundongos injetados com CHIKV-IgG durante o período de observação após o desafio. Estes resultados indicaram que tanto os construtos CHIKV- IgG e CHIKV-Fab forneceram duradoura imunidade protetora in vivo, embora a proteção conferida por CHIKV-IgG pode ser mais persistente e de longa duração do que o observado com injeção CHIKV-FAB (P = 0,0075 ) (FIG. 66 C).
[00417] Vírus transmitido por mosquitos, como CHIKV pode causar encefalite grave em humanos. Diferentes modos de desafio viral, tais como intranasal, subcutâneo e infeção da almofada da pata de camundongos com o CHIKV resultaram em mortalidade elevada dentro de 6-9 dias de infecção. Além disso, CHIKV provoca uma elevada mortalidade dentro de 6-9 dias após a infecção dos camundongos com diferentes graus de patogenia. Assim, foi realizado um experimento para comparar a eficácia da terapia de anticorpos CHIKV contra a infecção viral com desafio viral intranasal e subcutâneo. Vinte camundongos em cada grupo, isto é, um grupo com pVAX1 e um grupo com plasmídeo CHIKV-IgG, recebeu a imunização única e metade dos camundongos em cada um dos grupos foram desafiados através da administração intranasal de CHIKV (em 25μl de PBS) e o resto dos camundongos foram desafiados por injeção subcutânea com CHIKV no dia 2. A eficácia protetora de CHIKV-IgG foi medida por determinação da perda de peso, fraqueza dos membros posteriores e letargia. Quer desafiados por via subcutânea (FIG. 66D) (p <0,0024) ou intranasalmente (FIG. 66E) (P <0,0073), CHIKV-IgG proporcionou proteção significativa contra a infecção CHIKV em comparação com camundongos de controle. Os camundongos que receberam o desafio por via subcutânea tiveram um atraso significativo na perda de peso em relação ao desafio intranasal. Tomados em conjunto com os dados acima, os resultados indicaram que o DNA distribuiu CHIKV-IgG gerou respostas de anticorpos neutralizantes amplamente reativas que protegeram contra tradicional (subcutânea), bem como desafio CHIKV de mucosa.
Exemplo 23 Avaliação de CHIKV IgG Específica Imediata e Persistente sobre Desafio Viral
[00418] Depois de demonstrar que CHIKV-IgG gerou uma resposta imune protetora igualmente rápida, e ainda mais persistente, do que o construto CHIKV-Fab in vivo, a eficácia de proteção gerada por CHIKV-IgG foi comparada com o plasmídeo CHIKV-Env, uma vacina de DNA de plasmídeo que expressa uma proteína de envelope CHIKV de comprimento completo. Considerando que essas estratégias de vacina de DNA contam com o sistema imunológico do hospedeiro para reconhecer e responder a um antígeno alvo, o construto CHIKV-IgG conferiu imunidade protetora independente da resposta imunológica do hospedeiro. Tendo em conta esta diferença, determinou-se se o construto CHIKV-IgG forneceu uma fonte mais imediata da imunidade humoral protetora da exposição prematura ao CHIKV.
[00419] Portanto, os grupos de camundongos receberam uma única administração de CHIKV-IgG, CHIKV-Env, ou pVAX1, e depois desafiados com CHIKV dois dias após a imunização por plasmídeo (Fig. 67A). Todos os camundongos administrados com CHIKV-Env ou pVAX1 morreram no prazo de seis dias de desafio viral, ao passo que 100% de sobrevivência foi observada em camundongos imunizados com CHIKV-IgG (Fig. 67B). Isto ilustrou que a imunidade protetora foi conferida muito antes pós- administração por CHIKV-IgG do que de CHIKV-Env, uma vacina de DNA de geração de antígeno.
[00420] A duração das respostas anti-CHIKV geradas por CHIKV-IgG e CHIKV-Env foi avaliada posteriormente. Diferentes esquemas de imunização foram utilizados para garantir a indução de uma resposta imunológica forte por CHIKV-Env. Assim, os camundongos receberam uma única imunização de CHIKV-IgG no dia 0, ou de múltiplas imunizações com CHIKV-Env (dias 0, 14, e 28) antes do desafio viral no dia 35. Um terceiro grupo de camundongos recebeu uma única imunização de pVAX1 no dia 0 e desafio viral no dia 35 (FIG. 67A, grupo II). 100% de sobrevivência foi registado para os camundongos que receberam o regime de imunização de reforço com multi-CHIKV-Env (FIG. 67C), o que contrasta marcadamente a taxa de sobrevivência de camundongos previamente imunizados com uma única injeção da mesma vacina de DNA (Fig. 67B). Estes resultados foram consistentes com a cinética de uma resposta imunológica adaptativa, o que leva aproximadamente duas semanas a desenvolver-se após a exposição ao antígeno e frequentemente requerem múltiplos ciclos de exposição a antígeno para gerar imunidade protetora.
[00421] Além disso, 90% de sobrevivência foi observada em camundongos inoculados com CHIKV-IgG durante o período de observação de 20 dias (p = 0,0005) (Fig. 67C); a figura mostra <80% de sobrevivência em camundongos imunizados com CHIKV-IgG no dia 43. No entanto, como os diferentes níveis de IgG humana detectados no soro de camundongo em pontos de tempo prematuros e tardios após a administração de plasmídeo/vacina poderiam influenciar os resultados de desafio acima foram avaliados. Anti-CHIKV Env humana específica foi detectável dentro de 48 horas após a injeção única de construto CHIKV-IgG, e níveis de pico foram medidos aos 14 dias pós-injeção (~ 1400ng/mL). A IgG humana ainda era detectável 45 dias após a injeção em níveis acima dos valores inicialmente medidos no dia 2. Esta diminuição da proteção correspondeu a níveis de soro medidos de anti-CHIKV IgG (FIG. 67D). Níveis de anticorpos protetores diminuindo eram provavelmente devido à depuração normal do anticorpo, indicando que o nível de CHIKV-IgG pode diminuir para níveis abaixo da proteção depois de longos períodos de tempo se não for re-administrado. Em resumo, estes resultados indicam que uma única injeção de CHIKV-IgG gerou uma resposta protetora que era semelhante em termos de qualidade e persistência de respostas imunitárias induzidas pela vacina de DNA que exigem várias imunizações de reforço.
Exemplo 24 Indução de Anticorpos Anti-CHIKV-Env Persistentes e Sistêmicos Após Imunização com CHIKV-IgG e CHIKV-Env
[00422] Dado que tanto respostas protetoras CHIKV-IgG e CHIKV- Env foram vistas em camundongos imunizados com construtos CHIKV-IgG e CHIKV-Env, um estudo adicional foi realizado para avaliar os níveis de anticorpos. Camundongos BALB/c foram imunizados com DNA CHIKV-IgG no dia 0 ou com DNA CHIKV-Env, a 0, 14 e 21 dias. A FIG. 67E mostra os níveis de anti-CHIKV IgG nos pontos de tempo indicados de camundongos imunizados quer com DNA de CHIKV-IgG ou DNA CHIKV-Env. A IgG humana anti-CHIKV foi medida em camundongos CHIKV-IgG-imunizados e IgG anti-CHIKV de camundongos foi medida em camundongos CHIKV-Env- imunizados. Os resultados mostraram uma detecção prematura e rápido aumento de IgG humana em camundongos CHIKV-IgG-imunizados. Os títulos de IgG de camundongo induzida por CHIKV-Env atingiram níveis de pico semelhantes dentro de duas semanas de imunização, mas exibiram um nível de produção de anticorpos mais lento.
Exemplo 25 Redução na Carga Viral de CHIKV e Níveis de Citocina Resultando no Controle da Infecção
[00423] Carga viral de CHIKV e citocinas pró-inflamatórias podem estar correlacionadas com a gravidade da doença associada a CHIKV. Assim, a capacidade de CHIKV-IgG para suprimir esses marcadores de doenças associadas (isto é, a carga viral e citocinas pró-inflamatórias) em pontos de tempo prematuros e tardios de pós-desafio viral foi avaliada. Os soros de camundongos imunizados com qualquer DNA de CHIKV-IgG ou DNA de CHIKV-Env exibiram cargas virais significativamente reduzidas em comparação com os animais de controle com pVAX1 (p = 0,0244 e 0,0221, respectivamente) (Fig. 68A). Camundongos CHIKV-IgG-imunizados apresentaram níveis comparáveis de redução da carga viral com camundongos CHIKV-Env. Citocinas pró-inflamatórias selecionadas foram também medidas (TNF-α e IL-6) a partir de camundongos CHIKV-IgG-imunizados e em camundongos imunizados com CHIKV-Env no 5° desafio pós-viral. Em comparação com os animais imunizados com pVAX1, animais imunizados com CHIKV-IgG e CHIKV-Env exibiram níveis de soro reduzidos de citocinas para níveis semelhantes em pontos de tempo tanto prematuros quanto tardios (FIGS. 68B e 68C). Como os níveis de soro de vírus CHIKV, TNF-α, e IL-6 tem correlação com a gravidade da doença, estes resultados indicaram que as imunizações únicas com DNA de CHIKV-IgG proporcionaram um nível de proteção durável à patologias associadas a CHIKV em níveis comparáveis a vacinas de DNA, tais como CHIKV-Env.
[00424] Como CTL pode ser importante na eliminação de células infectadas por vírus, análises posteriores foram realizadas para avaliar as respostas de células T induzidas por CHIKV-Env e CHIKV-IgG. Células produtoras de IFN-y foram detectadas em todos os camundongos imunizados. A FIG. 68D foi uma medida das respostas de células T de camundongos previamente imunizados com DNA de CHIKV-IgG ou DNA de CHIKV-Env. Os resultados mostraram que CHIKV-Env eliciou respostas de células T fortes como medido pelos níveis de IFN-y, enquanto CHIKV-IgG não.
[00425] Em resumo, os estudos dos Exemplos 14 e 17-25 demonstraram rápida produção do anticorpo codificado dentro de 48 horas após a injeção in vivo. O anticorpo produzido também foi mantido durante várias semanas dentro do animal receptor. Camundongos injetados com DNA de CHIKV-IgG foram totalmente protegidos do desafio CHIKV letal (100% de proteção). Viremia e os níveis de citocinas pró-inflamatórias foram também reduzidos nestes camundongos protegidos e patologias de doenças associadas a CHIKV foram suprimidas.
[00426] Em particular, nestes estudos CHIKV-Fab e CHIKV-IgG, rápida produção de IgG de comprimento completo foi observada durante as primeiras 48 a 72 horas após a administração. A cinética e nível de produção foram semelhantes entre as versões Fab e IgG do anticorpo em pontos de tempo prematuros, que foi fundamental para a prevenção de doenças infecciosas. Ambas as formas de modalidades de anticorpos protegeram camundongos contra um desafio letal CHIKV dois dias pós-vacinação. No entanto, diferenças de proteção eram aparentes quando os camundongos foram desafiados em um ponto de tempo tardio (30 dias após a imunização), após a distribuição da vacina: 90% dos camundongos imunizados com CHIKV-IgG sobreviveu, enquanto que sobrevida de 50% foi registrada em camundongos imunizados com CHIKV-Fab. Assim, apesar de ambos os construtos de anticorpos tenham especificidade idêntica para o antígeno e expressão rápida após a distribuição, a IgG de comprimento completo demonstrou uma semi-vida mais longa do que o construto de Fab, que se revelou indispensável para a manutenção de imunidade protetora.
[00427] Uma vacina base de DNA para a infecção CHIKV, denominada CHIKV-Env, também foi comparada com os anticorpos codificados. Quando os camundongos foram injetados com uma única dose de qualquer CHIKV-IgG ou CHIKV-Env e desafiados com vírus de dois dias mais tarde, todos os camundongos no grupo de injeção de CHIKV-IgG sobreviveram, o que contrasta com o grupo CHIKV-Env, onde nenhum dos camundongos sobreviveu à infecção. No entanto, proteção completa foi observada com CHIKV-Env após um regime de imunização completa (três inoculações ao longo de um período de três semanas). Um nível semelhante de proteção foi observado em camundongos administrados com uma dose única de CHIKV-IgG, embora esta proteção tenha diminuído para 75% de sobrevivência ao longo de um período de tempo prolongado.
Exemplo 26 Distribuição de Anticorpos Neutralizantes de Reação Cruzada contra DENV
[00428] Plasmídeos de DNA otimizados que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo anti-DENV DV87.1, uma IgG1 mAb humana que tem a capacidade de neutralizar DENV1-3, foram concebidos e construídos. Especificamente, dois plasmídeos otimizados foram construídos: pDVSF 3- WT, que codificava as cadeias pesada e leve de DV87.1, e pDVSF-3 LALA, que codificava para uma versão de região modificada Fc de DV87.1 com ligação FcyR anulada por meio de duas mutações leucina para alanina (LALA) na região de CH2. Isto foi feito para eliminar a melhoria dependente de anticorpos. Os genes das cadeias pesada e leve em cada construto foram separados por um local de clivagem de furina e um peptídeo de auto- processamento de P2A. Cada transgene foi geneticamente otimizado, sintetizado e subclonado num vetor de expressão de mamífero pVAX1 modificado (FIG. 69A).
[00429] O anticorpo DVSF-3 WT foi codificado pela sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO:75. Identificação de Sequência N°:75 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°:76. A sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 75 foi contida no plasmídeo pDVSF-3 WT.
[00430] O anticorpo DVSF-3 LALA foi codificado pela sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO:77. Identificação de Sequência N°:77 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°:78. A sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:77 foi contida no plasmídeo pDVSF-3 LALA.
[00431] Os plasmídeos foram transfectados para células 293T de rim embrionário humano (HEK), e os níveis de anticorpos secretados no sobrenadante foram quantificados após 48 horas por ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) (FIG. 69B). Ambos pDVSF-3 WT e pDVSF-3 LALA resultaram em 600ng/mL de IgG humana, confirmando que os plasmídeos expressam a IgG humana, e que a mutação LALA não teve efeito sobre os níveis de expressão de anticorpo in vitro. Para confirmar a montagem de anticorpo adequada, os anticorpos DVSF-3 LALA e DVSF-3 foram recolhidos de sobrenadantes a partir de células HEK293T transfectadas e separados por gel de SDS-PAGE para análise de Western blot (FIG. 69C). As proteínas da cadeia pesada e leve estavam em seus pesos moleculares previstos, indicando clivagem da proteína adequada e montagem de anticorpos.
[00432] Para avaliar a atividade biológica dos anticorpos, um ensaio de ligação ELISA que mediu se o sobrenadante contendo o anticorpo ligado a proteínas recombinantes DENV1-3 E foi realizado. Os sobrenadantes de células HEK293T que secretaram quer anticorpos DVSF 3-WT ou DVSF-3 LALA foram capazes de reconhecer as proteínas DENV1-3 E, enquanto DENV4 não foi reconhecida, como esperado (FIG. 72). Além disso, DVSF-3 WT e DVSF-3 contendo sobrenadantes LALA foram capazes de corar as células Vero infectadas com DENV1-3, enquanto que as células Vero infectadas com DENV4 não foram coradas pelos sobrenadantes (FIG. 69D). Cada construto mostrou in vitro neutralização da DENV1-3 (dados não mostrados), mas DVSF-3 WT infecção potencializada de DENV de células K562 humanas portadoras de FcyR, ao passo que DVSF-3 LALA não tinham tal atividade ADE in vitro (FIGS. 72B e 75 (painel inferior)). Além disso, DVSF-3 ligado a FcyR1a humano, enquanto DVSF-3 LALA não ligou FcyR1a (FIG. 75 (painel superior)).
[00433] A fim de investigar a cinética de produção de anticorpo in vivo, a duração da expressão de DNA da IgG humana plasmídeo codificadora em camundongos pelados, o que seria modelo de expressão de anticorpos num hospedeiro imuneadaptativo, foi determinada. Os camundongos foram injetados por via intramuscular com 100 ug de um plasmídeo de DNA que codifica outra IgG1 humana anticorpo anti-DENV, DVSF-1 WT, seguido imediatamente por EP. DVSF-1 de anticorpo foi codificado pela sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO:67. Identificação de Sequência N°:67 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°:68.
[00434] As concentrações de IgG humana no soro foram detectáveis no prazo de 5 dias após a injeção, com níveis de pico de cerca de 1000ng/ml em duas semanas pós-injeção (FIG. 70A, painel esquerdo). Duração de expressão de IgG humana durou, pelo menos, 19 semanas (FIG. 70A, painel da direita), ilustrando assim os níveis de expressão sustentada atingíveis com os plasmídeos de DNA.
[00435] Dado que o modelo de desafio DENV de camundongos usou camundongos a partir do 129/Sv de fundo, os construtos de plasmídeos de DNA que codifica o anticorpo foram estudados para determinar a produção de níveis séricos detectáveis de DVSF 3-WT ou LALA nesta cepa de fundo. O soro de camundongos 129/SV recebendo tanto pDVSF-3 WT ou pDVSF-3 LALA apresentaram níveis de IgG humana comparáveis (FIG. 70B) e células Vero infectadas coradas com DENV1-3 (FIG. 70C). Além disso, tanto a WT e LALA contendo soro foram capazes de neutralizar DENV1-3 (FIG. 70D).
[00436] Para avaliar se os camundongos que expressam DNA plasmídeo codificados mAbs neutralizantes anti-DENV estariam protegidos do desafio DENV, foi utilizado o modelo de camundongo AG129. Este modelo de camundongo faltava receptores tipo I e II interferon (IFN) e, após a infecção DENV, recapitulou muitos aspectos da doença humana. Estes camundongos também exibiram ADE, com doses baixas de serotipo específico assim como anticorpos com reatividade cruzada, ambos reforçadores de infecção. Para estes estudos, camundongos foram infectados com a cepa S221 adaptada à camundongo DENV2, o qual, na presença de quantidades sub-neutralizantes do anti-DENV mAb 2H2, causou doença severa de anticorpos potencializados e letalidade aguda (4-6 dias pós- infecção) em camundongos AG129 em doses subletais.
[00437] Para determinar se os camundongos AG129 expressando pDVSF-3 LALA seriam protegidos contra a infecção apenas de vírus e doença potencializada dependente de anticorpo (ADE), camundongos AG129 receberam uma única injeção intramuscular de pDVSF-3 WT ou pDVSF-3 LALA seguido imediatamente por EP. Os controles negativos receberam uma única injeção intramuscular de vetor vazio pVAX1 seguido de EP. Cinco dias mais tarde, os camundongos foram desafiados com uma dose sub-letal (1x109 GE) de DENV2 S221 na presença de (ADE) ou ausência (infecção apenas por vírus) de anti-DENV Acm 2H2 exógeno. Os camundongos nos coortes pDVSF-3 WT, pDVSF-3 LALA, e pVAX1 tinham concentrações de IgG humana média de 750 ng/ml, 1,139 ng/mL, e níveis indetectáveis, respectivamente, um dia antes do desafio (FIG. 73; p < 0,0930 para comparação entre pDVSF-3 WT e pDVSF-3 LALA).
[00438] Sob condições de infecção apenas com vírus, camundongos tratados com pDVSF-3-WT eram esperados para experimentar ADE e letalidade aguda, como complexos imunes formados por DVSF-3 WT anticorpos com DENV devem levar ao aumento da infecção. Por outro lado, camundongos tratados com pVax1 e pDVSF-3 LALA eram esperados para serem protegidos contra a doença grave. Com efeito, cinco dos seis camundongos tratados com pDVSF-3 LALA e todos os cinco camundongos pVAX1 foram protegidos contra a doença grave; todos os camundongos tratados com pDVSF-3 WT sucumbiram à doença no dia 5 (FIG. 71A; p < 0,0084 para comparação entre pDVSF-3 LALA e pDVSF 3-WT), demonstrando a capacidade protetora de pDVSF-3 LALA contra a infecção apenas pelo vírus.
[00439] Sob condições de ADE, ambos camundongos tratados com pDVSF-3 WT e pVax1 eram esperados a experimentar letalidade aguda devido a infecção potencializada, enquanto que os camundongos tratados com pDVSF-3 LALA devem ser protegidos contra a doença grave. Todos os cinco camundongos que receberam pDVSF-3 LALA sobreviveram em condições de ADE, enquanto que aqueles que receberam quer pDVSF-3 WT ou vetor pVAX1 vazio sucumbiram à doença aguda potencializada por anticorpos dentro de 4-5 dias (FIG. 71B; p < 0,0072 para comparação entre pDVSF-3 LALA e pDVSF-3 WT). Tomados em conjunto, estes dados demonstraram que a injeção de 3-pDVSF LALA protegeu contra doença severa em ambas as condições de apenas por vírus e ADE.
[00440] Em resumo, uma injeção única por via intramuscular de um plasmídeo de DNA que codifica um anticorpo neutralizante anti-DENV1-3 humano modificado foi capaz de proteger camundongos contra doenças apenas por vírus e doença DENV de anticorpo potencializado. A proteção conferida pela neutralização de mAbs anti-DENV expressas por este método de distribuição de DNA foi rápida, com sobrevivência completa em camundongos desafiados menos de uma semana após a administração de pDVSF-3 LALA. Além disso, a distribuição de anticorpos mediada por plasmídeos forneceu proteção no prazo de 5 dias após a distribuição, que foi significativamente mais rápida do que a proteção acionada por vacina.
Exemplo 27 Formulação com construtos DVSF-1 e DVSF-3
[00441] Sorotipos DENV podem escapar de neutralização. Assim, foi realizado um estudo para examinar um coquetel de anticorpos visando múltiplos epitopos no virion DENV para a profilaxia. Camundongos 129/SV foram injetados com pDVSF-3 WT (anti-DENV1-3) em uma perna e um pDVSF-1 WT (anti-DENV1-4) na outra. Os camundongos injetados com ambos os plasmídeos tinham níveis de soro de anticorpos humano significativamente mais elevados no dia 7 em comparação com os camundongos que receberam um único plasmídeo (FIG. 74; p < 0,0088 para comparação entre pDVSF-1 WT e pDVSF-1+3; p < 0,0240 para comparação entre pDVSF-3 WT e pDVSF-1+3). Além disso, os soros de camundongos injetados com ambas as células Vero de plasmídeos coradas infectadas com todos os quatro serotipos DENV (dados não mostrados).
Exemplo 28 Os Anticorpos Anti-DENV
[00442] Tal como descrito acima, foram gerados construtos que produziram DVSF-1 (isto é, WT), DVSF-3 WT e DVSF-3 LALA. Construtos adicionais foram gerados que produziram DVSF-1 LALA, DVSF 2-WT, e DVSF-2 LALA.
[00443] Como descrito acima, DVSF-3 WT foi codificado pela sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO:75. Identificação de Sequência N°:75 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°:76. Anticorpo DVSF-3 WT neutralizou DENV1-3 (dados não mostrados).
[00444] Como também descrito acima, DVSF-3 LALA foi codificado pela sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO:77. Identificação de Sequência N°:77 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°:78.
[00445] DVSF-1 WT foi codificado pela sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO:67. Identificação de Sequência N°:67 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°:68. Anticorpo DVSF-3 WT neutralizou DENV1-4 (dados não mostrados).
[00446] DVSF-1 LALA foi codificado pela sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO:69. Identificação de Sequência N°:69 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°:70.
[00447] DVSF-2 WT foi codificado pela sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO:71. Identificação de Sequência N°:71 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°:72. Anticorpo DVSF 2-WT neutralizou DENV4 (dados não mostrados).
[00448] DVSF-2 LALA foi codificado pela sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO:73. Identificação de Sequência N°:73 codifica a sequência de aminoácido estabelecida na Identificação de Sequência N°:74.
12. Cláusulas
[00449] Por motivos de integralidade, vários aspectos da invenção são definidos nas seguintes cláusulas numeradas: Cláusula 1. Método para gerar um anticorpo sintético em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma sequência de ácido nucleico recombinante codificando um anticorpo ou fragmento deste, em que a sequência de ácido nucleico recombinante é expressa no sujeito para gerar o anticorpo sintético. Cláusula 2. Método, da cláusula 1, em que o anticorpo compreende um polipeptídeo de cadeia pesada, ou fragmento deste, e um polipeptídeo de cadeia leve, ou fragmento deste. Cláusula 3. Método, da cláusula 2, em que o polipeptídeo de cadeia pesada, ou fragmento deste, é codificado por uma primeira sequência de ácido nucleico e o polipeptídeo de cadeia leve, ou fragmento deste, é codificado por uma segunda sequência de ácido nucleico. Cláusula 4. Método, da cláusula 3, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende a primeira sequência de ácido nucleico e a segunda sequência de ácido nucleico. Cláusula 5. Método, da cláusula 4, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende, adicionalmente, um promotor para expressar a primeira sequência de ácido nucleico e a segunda sequência de ácido nucleico como uma única transcrição no sujeito. Cláusula 6. Método, da cláusula 5, em que o promotor é um promotor de citomegalovírus (CMV). Cláusula 7. Método, da cláusula 5, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende, adicionalmente, uma terceira sequência de ácido nucleico codificando um local de clivagem de protease, em que a terceira sequência de ácido nucleico é localizada entre a primeira sequência de ácido nucleico e segunda sequência de ácido nucleico. Cláusula 8. Método, da cláusula 7, em que a protease do sujeito reconhece e cliva o local de clivagem de protease. Cláusula 9. Método, da cláusula 8, em que a sequência de ácido nucleico recombinante é expressa no sujeito para gerar uma sequência de polipeptídeo de anticorpo, em que a sequência de polipeptídeo de anticorpo compreende o polipeptídeo de cadeia pesada, ou fragmento deste, o local de clivagem de protease e o polipeptídeo de cadeia leve, ou fragmento deste, em que a protease produzida pelo sujeito reconhece e cliva o local de clivagem de protease da sequência de polipeptídeo de anticorpo gerando, desse modo, um polipeptídeo de cadeia pesada clivado e um polipeptídeo de cadeia leve clivado, em que o anticorpo sintético é gerado pelo polipeptídeo de cadeia pesada clivado e o polipeptídeo de cadeia leve clivado. Cláusula 10. Método, da cláusula 4, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende um primeiro promotor para expressar a primeira sequência de ácido nucleico como uma primeira transcrição e um segundo promotor para expressar a segunda sequência de ácido nucleico como uma segunda transcrição, em que a primeira transcrição é traduzida para um primeiro polipeptídeo e a segunda transcrição é traduzida em um segundo polipeptídeo, em que o anticorpo sintético é gerado pelo primeiro e pelo segundo polipeptídeo. Cláusula 11 Método, da cláusula 10, em que o primeiro promotor e o segundo promotor são os mesmos. Cláusula 12. Método, da cláusula 11, em que o promotor é um promotor de citomegalovírus (CMV). Cláusula 13. Método, da cláusula 2, em que o polipeptídeo de cadeia pesada compreende uma região pesada variável e uma região pesada constante 1. Cláusula 14. Método, da cláusula 2, em que o polipeptídeo de cadeia pesada compreende uma região pesada variável, uma região pesada constante 1, uma região de dobradiça, uma região pesada constante 2 e uma região pesada constante 3. Cláusula 15. Método, da cláusula 2, em que o polipeptídeo de cadeia leve compreende uma região leve variável e uma região leve constante. Cláusula 16. Método, da cláusula 1, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende, adicionalmente, uma sequência de Kozak. Cláusula 17. Método, da cláusula 1, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende, adicionalmente, um peptídeo sinal de imunoglobulina (Ig). Cláusula 18. Método, da cláusula 17, em que o peptídeo sinal de Ig compreende um peptídeo de sinal de IgE ou IgG. Cláusula 19. Método, da cláusula 1, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos uma sequência de aminoácido de Identificação de Sequência N°: 1, 2, 5, 41, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 66, 68, 70, 72, 74, 76 e 78. Cláusula 20. Método, da cláusula 1, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico de Identificação de Sequência N°: 3, 4, 6, 7, 40, 42, 44, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 e 63, 64, 65, 67, 69, 71, 73, 75 e 77. Cláusula 21. Método para gerar um anticorpo sintético em um sujeito, o método compreendendo administrar ao sujeito uma composição compreendendo uma primeira sequência de ácido nucleico recombinante codificando um polipeptídeo de cadeia pesada, ou fragmento deste, e uma segunda sequência de ácido nucleico recombinante codificando um polipeptídeo de cadeia leve, ou fragmento deste, em que a primeira sequência de ácido nucleico recombinante é expressa no sujeito para gerar um primeiro polipeptídeo e o segundo ácido nucleico recombinante é expresso no sujeito para gerar um segundo polipeptídeo, em que o anticorpo sintético é gerado pelos primeiros e segundos polipeptídeos. Cláusula 22. Método, da cláusula 21, em que a primeira sequência de ácido nucleico recombinante compreende, adicionalmente, um primeiro promotor para expressar o primeiro polipeptídeo no sujeito e em que a segunda sequência de ácido nucleico recombinante compreende, adicionalmente, um segundo promotor para expressar o segundo polipeptídeo no sujeito. Cláusula 23. Método, da cláusula 22, em que o primeiro promotor e o segundo promotor são os mesmos. Cláusula 24. Método, da cláusula 23, em que o promotor é um promotor de citomegalovírus (CMV). Cláusula 25. Método, da cláusula 21, em que o polipeptídeo de cadeia pesada compreende uma região pesada variável e uma região pesada constante 1. Cláusula 26. Método, da cláusula 21, em que o polipeptídeo de cadeia pesada compreende uma região pesada variável, uma região pesada constante 1, uma região de dobradiça, uma região pesada constante 2 e uma região pesada constante 3. Cláusula 27. Método, da cláusula 21, em que o polipeptídeo de cadeia leve compreende uma região leve variável e uma região leve constante. Cláusula 28. Método, da cláusula 21, em que a primeira sequência de ácido nucleico recombinante e a segunda sequência de ácido nucleico recombinante compreendem, adicionalmente, uma sequência de Kozak. Cláusula 29. Método, da cláusula 21, em que a primeira sequência de ácido nucleico recombinante e a segunda sequência de ácido nucleico recombinante compreendem, adicionalmente, um peptídeo sinal de imunoglobulina (Ig). Cláusula 30. Método, da cláusula 29, em que o peptídeo sinal de Ig compreende um peptídeo sinal de IgE ou IgG. Cláusula 31. Método para prevenir ou tratar uma doença em um sujeito, o método compreendendo gerar um anticorpo sintético em um sujeito conforme o método da cláusula 1 ou 21. Cláusula 32. Método, da cláusula 31, em que o anticorpo sintético é específico para um antígeno estranho. Cláusula 33. Método, da cláusula 32, em que o antígeno estranho é derivado de um vírus. Cláusula 34. Método, da cláusula 33, em que o vírus é o vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus Chikungunya (CHIKV) ou vírus da Dengue. Cláusula 35. Método, da cláusula 34, em que o vírus é HIV. Cláusula 36. Método, da cláusula 35, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos uma sequência de aminoácido de Identificação de Sequência N°: 1, 2, 5, 46, 47, 48, 49, 51, 53, 55 e 57. Cláusula 37. Método, da cláusula 35, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico de Identificação de Sequência N°: 3, 4, 6, 7, 50, 52, 55, 56, 62, 63 e 64. Cláusula 38. Método, da cláusula 34, em que o vírus é HIV. Cláusula 39. Método, da cláusula 38, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos uma sequência de aminoácido de Identificação de Sequência N°: 59, 61 e 66. Cláusula 40. Método, da cláusula 38, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico de Identificação de Sequência N°: 58, 60 e 65. Cláusula 41. Método, da cláusula 34, em que o vírus é o vírus da Dengue. Cláusula 42. Método, da cláusula 41, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos uma sequência de aminoácido de Identificação de Sequência N°:45, 68, 70, 72, 74, 76 e 78. Cláusula 43. O método da cláusula 41, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende, pelo menos, uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NOs: 44, 67, 69, 71, 73, 75, e 77. Cláusula 44. Método, da cláusula 31, em que o anticorpo sintético é específico para um auto antígeno. Cláusula 45. Método, da cláusula 44, em que o auto antígeno é Her2. Cláusula 46. Método, da cláusula 45, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos uma sequência de aminoácido de Identificação de Sequência N°: 41 e 43. Cláusula 47. Método, da cláusula 45, em que a sequência de ácido nucleico recombinante compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico de Identificação de Sequência N°: 40 e 42. Cláusula 48. Produto, produzido por qualquer um dos métodos conforme as cláusulas 1 a 47. Cláusula 49. Produto, da cláusula 48, em que o produto é plasmídeo de DNA único capaz de expressar um anticorpo funcional. Cláusula 50. Produto, da cláusula 48, em que o produto é composto de dois plasmídeos de DNA distintos capazes de expressar componentes de um anticorpo funcional que combinam in vivo para formar um anticorpo funcional. Cláusula 51. Método para tratar um sujeito de infecção por um patógeno, em que compreende: administrar uma sequência nucleotídica codificando um anticorpo sintético específico para o patógeno. Cláusula 52. O método da cláusula 51, que compreende ainda: administrar um antígeno do patógeno para gerar uma resposta imune no sujeito. Cláusula 53. Molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo sintético caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 95% de identidade ao longo de todo um comprimento da sequência de ácido nucleico selecionado a partir do grupo consistindo em: (a) uma sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 44; (b) uma sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 67; (c) uma sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 69; (d) uma sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 71; (e) uma sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 73; (f) uma sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 75; (g) uma sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 77; (h) uma sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 58; (i) uma sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 60; e (j) uma sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 65. Cláusula 54. A molécula de ácido nucleico da cláusula 53, em que a sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 44; (b) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 67; (c) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 69; (d) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 71; (e) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 73; (f) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 75; (g) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 77; (h) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 58; (I) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 60; e (j) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO: 65. Cláusula 55. Molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo sintético caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína tendo pelo menos cerca de 95% de identidade ao longo de todo um comprimento da sequência de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em: (a) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 45; (b) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 68; (c) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 70; (d) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 72; (e) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 74; (f) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 76; (g) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 78; (h) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 59; (i) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 61; e (j) uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 66. Cláusula 56. A molécula de ácido nucleico da cláusula 55, em que o ácido nucleico codifica uma proteína tendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 45; (b) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 68; (c) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 70; (d) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 72; (e) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 74; (f) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 76; (g) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 78; (h) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 59; (i) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 61; e (j) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 66. Cláusula 57. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das cláusulas 53-56, em que a sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de cadeia leve, um polipeptídeo de cadeia pesada, tanto um polipeptídeo de cadeia leve e um polipeptídeo de cadeia pesada, ou seus fragmentos. Cláusula 58. A molécula de ácido nucleico da cláusula 57, em que, quando a sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de cadeia leve e um polipeptídeo de cadeia pesada, a sequência de ácido nucleico também codifica um sítio de clivagem de protease. Cláusula 59. A molécula de ácido nucleico da cláusula 58, em que o local de clivagem da protease está localizado entre o polipeptídeo da cadeia leve e o polipeptídeo da cadeia pesada e em que o local de clivagem de protease inclui uma sequência do local de clivagem de furina e peptídeo 2A. Cláusula 60. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das cláusulas 53-56, em que a molécula de ácido nucleico que codifica adicionalmente um peptídeo de sinal de imunoglobulina (Ig). Cláusula 61. A molécula de ácido nucleico da cláusula 60, em que o peptídeo sinal de Ig compreende um peptídeo sinal de IgE. Cláusula 62. A molécula de ácido nucleico de qualquer uma das cláusulas 53-56, em que a molécula de ácido nucleico compreende um vetor de expressão. Cláusula 63. Uma composição que compreende a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das cláusulas 53-56. Cláusula 64. A composição da cláusula 63 compreendendo ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável. Cláusula 65. Um método de prevenção de uma doença num sujeito com necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração da molécula de ácido nucleico de qualquer uma das cláusulas 53-56 para o sujeito. Cláusula 66. O método de cláusula 65, em que a doença é uma infecção por vírus Chikagunya (CHIKV) ou vírus da Dengue (DENV). Cláusula 67. O método de cláusula 66, em que, quando a doença é uma infecção por CHIKV, a sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:58; (b) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:60; e (c) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:65. Cláusula 68. O método da cláusula 66, em que, quando a doença é uma infecção por DENV, a sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:44; (b) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:67; (c) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:69; (d) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:71; (e) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:73; (f) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:75; e (g) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:77. Cláusula 69. O método de cláusula 66, em que, quando a doença é uma infecção por CHIKV, a sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:59; (b) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:61; e (c) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:66. Cláusula 70. O método de cláusula 66, em que, quando a doença é uma infecção por DENV, a sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:45; (b) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:68; (c) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:70; (d) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:72; (e) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:74; (f) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:76; e (g) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:78. Cláusula 71. O método de cláusula 65, em que a administração inclui, pelo menos, um de eletroporação e injeção. Cláusula 72. Um método de tratamento de uma doença num sujeito com necessidade do mesmo, o método compreendendo a administração da molécula de ácido nucleico de qualquer uma das cláusulas 53-56 para o sujeito. Cláusula 73. O método de cláusula 72, em que a doença é uma infecção por vírus Chikagunya (CHIKV) ou vírus da Dengue (DENV). Cláusula 74. O método de cláusula 73, em que, quando a doença é uma infecção por CHIKV, a sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:58; (b) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:60; e (c) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:65. Cláusula 75. O método da cláusula 73, em que, quando a doença é uma infecção por DENV, a sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:44; (b) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:67; (c) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:69; (d) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:71; (e) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:73; (f) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:75; e (g) a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:77. Cláusula 76. O método de cláusula 73, em que, quando a doença é uma infecção por CHIKV, a sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:59; (b) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:61; e (c) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:66. Cláusula 77. O método de cláusula 73, em que, quando a doença é uma infecção por DENV, a sequência de aminoácido é selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:45; (b) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:68; (c) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:70; (d) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:72; (e) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:74; (f) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:76; e (g) a sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO:78. Cláusula 78. O método de cláusula 72, em que a administração inclui, pelo menos, um de eletroporação e injeção.
[00450] Entende-se que a descrição detalhada citada acima e exemplos anexos são meramente ilustrativos e não devem ser considerados como limitações sobre o escopo da invenção, que é exclusivamente definida pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.
[00451] Várias alterações e modificações nas modalidades divulgadas serão aparentes para os versados na técnica. Tais mudanças e modificações, incluindo sem limitação aquelas relativas às estruturas químicas, substituintes, derivativos, intermediários, sínteses, composições, formulações ou métodos de uso da invenção, podem ser feitas sem se afastar do espírito e escopo desta.

Claims (17)

1. Molécula de ácido nucleico que codifica um anticorpo sintético, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico da molécula é selecionada a partir do grupo consistindo em: (a) uma sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:67; (b) uma sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:65.
2. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de cadeia leve, um polipeptídeo de cadeia pesada, tanto um polipeptídeo de cadeia leve e um polipeptídeo de cadeia pesada, ou seus fragmentos.
3. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que, quando a sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de cadeia leve e um polipeptídeo de cadeia pesada, a sequência de ácido nucleico também codifica um sítio de clivagem de protease.
4. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que, o local de clivagem da protease está localizado entre o polipeptídeo da cadeia leve e o polipeptídeo da cadeia pesada e em que o local de clivagem de protease inclui uma sequência do local de clivagem de furina e peptídeo 2A.
5. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico codifica adicionalmente um peptídeo de sinal de imunoglobulina (Ig).
6. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o peptídeo sinal de Ig compreende um peptídeo sinal de IgE.
7. Molécula de ácido nucleico de acordo a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico compreende um vetor de expressão, em que o vetor de expressão é um plasmídeo.
8. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definido na reivindicação 1 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
9. Uso da molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação de 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para prevenção de uma doença em um indivíduo com necessidade da mesma, em que a doença é infecção pelo vírus Chikungunya (CHIKV) ou vírus Dengue (DENV).
10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que, quando a doença é uma infecção por CHIKV, e a sequência de ácido nucleico é uma sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:65.
11. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que, quando a doença é uma infecção por DENV, e a sequência de ácido nucleico é a sequência de ácido nucleico como definida na SEQ ID NO: 67.
12. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que, a administração inclui, pelo menos, um de eletroporação e injeção.
13. Uso da molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença em um indivíduo com necessidade do mesmo.
14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que, a doença é uma infecção por vírus Chikungunya (CHIKV) ou vírus da Dengue (DENV).
15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que, quando a doença é uma infecção por CHIKV, e a sequência de ácido nucleico é uma sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:65.
16. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que, quando a doença é uma infecção por DENV, e a sequência de ácido nucleico é a sequência de ácido nucleico tal como estabelecida em SEQ ID NO:67.
17. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que, a administração inclui, pelo menos, um de eletroporação e injeção.
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