CN111032077A - 抗-登革热病毒抗体、包含该抗体的药学组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明内容是关于一种抗‑DENV抗体、包含该抗体的药学组合物及其用途。依据本发明内容实施方式，该抗‑DENV抗体包含一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包含SEQ ID No.：1‑3的氨基酸序列，且该轻链可变区包含SEQ ID No.：5‑7的氨基酸序列。

Description

抗-登革热病毒抗体、包含该抗体的药学组合物及其用途

本发明内容主张2017年5月22申请的美国临时申请案号62/509,205的优先权，该优先权文件在此一并纳入本文作为参照。

技术领域

本发明内容是关于治疗病毒感染的领域。更具体来说，本发明内容是关于一种抗体及其在治疗登革热病毒(dengue virus,DENV)感染中的应用。

背景技术

DENV是一种由蚊虫传播的正单股RNA病毒，属于黄热病毒科(Flaviviridae)之黄热病毒属(Flavivirus)，具有5种血清型(serotype；即DENV血清型1-5，于2013年发现第5型)，基因遗传上与诸如黄热病毒(yellow fever virus)及蜱传脑炎病毒(tick-borneencephalitis virus)等黄病毒相关。除了疲劳、恶心、呕吐、发烧、头痛及关节与肌肉酸痛外，DENV感染也可能引发会危及生命的出血性登革热(dengue hemorrhagic fever,DHF)及登革热休克症候群(dengue shock syndrome,DSS)。临床试验上已有数种候选疫苗，包含由Sanofi Pasteur公司研发的已核准上巿的四价登革热疫苗。然而，在登革热疫苗普及之前，相关领域仍亟需可治愈急性登革热疾病的治疗药物。

抗-DENV药剂及宿主调控剂仍为目前治疗DENV感染的主要治疗方法。直接目标DENV分子的抗-DENV药剂包含核苷类似物(nucleoside analogue，例如R1479)、蛋白酶抑制剂(protease inhibitor，例如α-酮酰胺(α-ketoamide)、BP13944及防御素1(retrocyclin1))、壳体抑制剂(capsid inhibitor，例如ST-148)及病毒肽抑制剂(viral peptideinhibitor，例如DN59)。宿主调控剂则着重于宿主因子，藉以阻断病毒于宿主细胞内的复制及感染。该种药剂包含鸟苷类似物(guanosine analogue，例如利巴韦林(ribavirin))、IMP去氢酶抑制剂(IMP dehydrogenase inhibitor，例如霉酚酸(mycophenolic acid))、α-葡萄糖苷酶抑制剂(α-glucosidase inhibitor，例如粟精胺(castanospermine)、脱氧野尻霉素(deoxynojirimycin)及环孢素(cyclosporine))、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A,HMG-CoA)还原酶抑制剂(例如洛伐他汀(lovastatin))，以及宿主激酶抑制剂(例如AZD0530及类淀粉蛋白(dasatinib))。然而，该些治疗方法皆有其限制，例如高价位、低功效及/或产生副作用。

推测DENV的非结构蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)可作为增强血管通透性及干扰凝血系统的病毒毒素。此外，其亦会影响DENV的病毒复制、致病性及免疫逃脱反应。在过去数十年间，相关领域已提出数种利用抗-NS1抗体来抑制NS1的策略。但是，由NS1分子拟态引发对宿主蛋白的自体抗体往往局限了以NS1为基础的抗体药物的发展。依据先前报导，除了NS1蛋白，抗-NS1抗体也会与宿主细胞(例如内皮细胞、肝细胞、血小板及凝血细胞)及凝血因子(例如纤维蛋白溶酶原(plasminogen)及凝血酶(thrombin))反应，进而活化该些细胞/因子，并通过细胞凋亡或补体媒介的细胞溶解反应造成细胞死亡。

有鉴于此，相关领域亟需一种新颖的治疗药剂，可安全且有效地保护个体及/或治疗个体的急性DENV感染。

发明内容

发明内容旨在提供本发明的简化摘要，以使阅读者对本发明具备基本的理解。此发明内容并非本发明的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组成或界定本发明的范围。

本发明内容的第一方面是关于一种抗体或其片段。本发明抗体包含一重链可变区及一轻链可变区，其中该重链可变区包含SEQ ID No.：1-3的氨基酸序列，且该轻链可变区包含SEQ ID No.：5-7的氨基酸序列。

依据本发明内容某些实施方式，该重链可变区具有一至少85％相似于SEQ IDNo.：4的序列的氨基酸序列，且该轻链可变区具有一至少85％相似于SEQ ID No.：8的序列的氨基酸序列。依据本发明内容一具体实施例，该重链可变区具有SEQ ID No.：4的氨基酸序列，且该轻链可变区具有SEQ ID No.：8的氨基酸序列。

本发明内容的第二方面是关于一种用以治疗DENV感染的药学组合物。本发明药学组合物包含本发明抗体，以及一药学上可接受的载体。

本发明内容的另一方面是关于一种用以治疗一个体的DENV感染的方法。依据本发明内容实施方式，该方法包含对该个体给予一有效量的本发明抗体。

依据本发明内容某些实施方式，该个体为一人类。在该些实施方式中，有效量约为每公斤1微克到每公斤100毫克。优选地，有效量约为每公斤10微克到每公斤10毫克。更优选地，有效量约为每公斤0.1毫克到每公斤1毫克。

一般来说，DENV是DENV血清型1、2、3或4。

在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有普通技术知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方面。

附图说明

为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，附图的说明如下：

图1为依据本发明内容一实施方式所绘示的线性图，其阐述本发明抗-DENV抗体33D2与NS1蛋白之间的结合亲和力。

图2为依据本发明内容另一实施方式所绘示的流式细胞分析结果，其阐述本发明抗-DENV抗体33D2与经DENV血清型1、2、3或4感染的细胞所表现的NS1蛋白间的结合亲和力。

图3A-3C为依据本发明内容另一实施方式所绘示的流式细胞分析及ELISA分析结果，其阐述本发明抗-DENV抗体33D2不会与人类内皮细胞(HUVEC，第3A；以流式细胞仪进行分析)、血小板(第3B图；以流式细胞仪进行分析)及凝血因子(第3C图；以ELISA进行分析)产生交叉反应(cross reaction)。

图4A及4B分别为依据本发明内容一实施方式所绘示的柱状图及线性图，其阐述本发明抗-DENV抗体33D2会通过引发DENV感染细胞中由补体媒介的溶解反应来限制病毒增殖，其中是利用乳酸去氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放试验(图4A中，图A：DENV 1感染，图B：DENV 2感染，图C：DENV 3感染，图D：DENV 4感染)或斑点形成单位试验(focus-forming units assay,FFA,图4B)来检测细胞溶解状况。

图5A-5C为依据本发明内容另一实施方式所绘示的柱状图，其分别阐述本发明抗-DENV抗体33D2可以补体相关的方式来减少四种血清型的登革热病毒的效价(titer)；图5A：本发明抗-DENV抗体33D2可减少DENV血清型2的效价；图5B：本发明抗-DENV抗体33D2可以剂量相关的方式减少DENV血清型2的效价；图5C：本发明抗-DENV抗体33D2可以剂量相关的方式减少DENV血清型1(图A)、血清型2(图B)、血清型3(图C)及血清型4(图D)的效价。

图6A-6E为依据本发明内容一实施方式所绘示的结果，其分别阐述经DENV感染后小鼠的出血时间(bleeding time，图6A，其中图A-D分别代表经DENV 1-4感染)、局部性出血(local hemorrhage，图6B及6C，其中图6C中的图A-D分别代表经DENV1-4感染)、RBC外渗(RBC extravasation，图6D；箭头指出皮肤出血位置)及NS3表现量(图6E)；比例尺代表10微米。

具体实施方式

为了使本发明内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方面与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，也可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

1.定义

除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有普通技术知识者所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。

虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过「约」的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请权利要求书所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一端点或介于二端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。

除非另有所指，否则“抗原”(antigen)一词在本发明内容是指当导入一免疫健全的人类或动物体内后，可刺激一荷尔蒙性及/或细胞性免疫反应的物质。抗原可以是一纯物质、一包含不同物质的混合物，或是特定材料(包含细胞、细胞片段或源自细胞之片段)或一活的有机体或病毒(通常为减毒形式)。例示性的适当的抗原包含，但不限于，蛋白、醣蛋白、脂蛋白、多肽、肽、碳水化合物/多糖、脂多糖、毒素、病毒、细菌、真菌及寄生虫。

“抗体”(antibody)一词在本发明内容是指一免疫球蛋白分子，其可专一结合至一抗原的特定表位(epitope)。抗体可以是天然或重组的完整免疫球蛋白，或是完整免疫球蛋白的免疫活性片段。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚合物。本发明内容的抗体可以不同的形式存在，举例来说，多克隆抗体(polyclonal antibodies,pAb)、单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAb)、Fv、Fab、F(ab)2、单链抗体及人源化抗体等形式。

“抗体片段”(antibody fragment)仅包含一完整抗体的部分，其中该部分保留一完整抗体的部分、多数或全部功能。在一实施方式中，一抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，据以保留结合抗原的能力。在另一实施方式中，抗体片段(例如包含Fc区域的抗体片段)保留该Fc区域存在于完整抗体时，至少一与该Fc区域相关的生物功能，例如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一实施方式中，抗体片段为一单价抗体，其具有大致与完整抗体相似的活体内半衰期。举例来说，该抗体片段可包含一个抗原结合臂，其与可赋予该片段活体内稳定性的Fc序列连结。本发明之抗体片段可以不同形式存在，举例来说，变异片段(variable fragment,Fv)、单链变异片段(single-chain variablefragment,scFv)、抗原结合片段(antigen-binding fragment,Fab)、F(ab)2及单链抗体。

“单克隆抗体”(monoclonal antibody)一词在本说明书是指一抗体，其系由一群具有相同构型的抗体分离出来，且不需经过特定方法加以建构。相较于多克隆抗体，其包含可分别辨识不同表位的多种抗体，单克隆抗体仅能专一辨识一抗原的单一表位。本发明内容之单克隆抗体可通过融合方法或重组DNA方法来制备。本说明书之单克隆抗体可包含“嵌合型”(chimeric)或“重组型”(recombinant)抗体，其中该抗体重链及/或轻链的部分区域是与一源自一特定物种的抗体或一分属一特定抗体型或亚型的抗体，具有相同或同源的对应序列；而重链及轻链的其他区域则是与源自其他物种或分属其他抗体型或亚型的另一抗体，或是抗体片段(只要该片段具有相关的生物活性)，具有相同或同源的对应序列。

“互补性决定区域”(complementarity determining region,CDR)在本说明书是指一抗体分子的高可变区域，其可与结合抗原的三维立体表面形成互补表面。由N端到C端，各抗体重链及轻链皆包含三个CDR(CDR 1、CDR 2及CDR3)。因此，一抗原结合位置包含共6个CDR，其分别为位于重链可变区域的3个CDR(即CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)，以及位于轻链可变区域的3个CDR(即CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)。各CDR的氨基酸残基会与结合抗原紧密接触，其中与抗原接触最紧密的位置通常为重链CDR3。

一抗体的“可变区域”(variable region)或“变异域”(variable domain)是指该抗体重链或轻链的氨基末端域。该些位置为抗体最易变动的部分，且包含抗原结合位点。“变异”(variable)一词指变异域中某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合及专一性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个变异域。其主要集中于轻链及重链变异域中3个CDR或高度可变区域。变异域中更加高度保守的部分称作框架区域(framework region,FR)。天然重链和轻链的变异域各自包含四个FR，它们大多采取β-折迭片构形，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折迭片结构一部分的三个CDR连接。每条抗体链中的CDR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但具有不同的作用功效，例如抗体于抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular toxicity)的作用。

可依据恒定域的氨基酸序列，将任何源自脊椎动物的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”(light chain)归入两种截然不同的分型，即卡帕(kappa,κ)或拉姆达(lambda,λ)。

本发明内容及请求保护之发明概念也包含抗体的氨基酸序列的微小变异，其中氨基酸序列的变异维持至少85％序列相似度，例如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相似度。可藉由特定修饰来改变抗体的特性，而不影响其生理活性。举例来说，可改变及/或删除某些氨基酸而不影响本发明抗体的生理活性(即治疗登革热病毒感染之能力)。特别是，保留性氨基酸取代也包含于其中。保留性取代为具有相似/相关侧链的氨基酸间的相互取代。一般来说，由基因编码的氨基酸可分为四大类：(1)酸性氨基酸，即天门冬氨酸(aspartate)、谷氨酸(glutamate，麸胺酸)；(2)碱性氨基酸，即赖氨酸(lysine)、精氨酸(arginine)、组氨酸(histidine)；(3)非极性氨基酸，即丙氨酸(alanine)、缬氨酸(valine)、白氨酸(leucine，亮氨酸)、异白氨酸(isoleucine，异亮氨酸)、脯氨酸(proline)、苯丙氨酸(phenylalanine)、甲硫氨酸(methionine)、色氨酸(tryptophan)；以及(4)非带电极性氨基酸，即甘氨酸(glycine)、天门冬酰胺(asparagine)、谷氨酰胺(glutamine，麸酰氨酸)、半胱氨酸(cysteine)、丝氨酸(serine)、苏氨酸(threonine)、酪氨酸(tyrosine)。优选的分类是：丝氨酸及苏氨酸系属脂肪羟基(aliphatic-hydroxy)类；天冬酰胺酸及麸酰氨属含酰胺(amide-containing)类；丙氨酸、缬氨酸、白氨酸及异白氨酸属脂肪类；而苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸则属芳香(aromatic)类。举例来说，当可想见若以异白氨酸或缬氨酸取代白氨酸、以麸氨酸取代天门冬氨酸、以丝氨酸取代苏氨酸，或是以一结构相似的氨基酸取代另一氨基酸时，并不会造成分子结合或蛋白特性的显著改变，特别是当该取代位置不是位于骨架区域时，氨基酸之间的取代更不会影响上述特性。可藉由检测抗体衍生物之特定活性来了解一氨基酸的改变是否可形成一具功能性的抗体。可利用本发明所属技术领域具有普通技术知识者所知的方法来制备抗体片段或类似物。片段或类似物之优选的氨基及羧基末端是邻近功能域的边界。在一实施例中，是对本发明抗体的一氨基酸残基(例如缬氨酸)进行保留性置换(例如以白氨酸进行置换)。在其他实施例中，是以其他适合的氨基酸残基来对本发明抗体的二个氨基酸残基进行保留性置换；举例来说，可以例示性的甲硫氨酸(M)及离氨酸(K)、离氨酸(K)及脯氨酸(P)、色氨酸(W)及异白氨酸(I)、异白氨酸(I)及脯氨酸(P)、天门冬酰胺(N)及缬氨酸(V)，以及麸酰氨酸(G)及离氨酸(K)等氨基酸对来置换缬氨酸(V)及精氨酸(R)。

此处针对蛋白质或核酸片段的氨基酸序列或核苷酸序列所述的“序列相似度百分比”(Percent(％)sequence identity)是指一候选蛋白质或核酸片段的氨基酸/核苷酸残基与一参考蛋白质或核酸片段的氨基酸/核苷酸残基完全相同的百分比。于进行上述比对时，可将所述的候选蛋白质/核酸片段与所述的蛋白质或核酸片段并排，并于必要时引入间隙，以使二序列形成最高的序列相似度。在计算相似度时，保守性置换的氨基酸残基视为不同的残基；简并密码子的核苷酸残基也视为不同的残基，譬如同样编码天门冬酰胺酸(asparagine,Asn,N)的密码子AAU和AAC之间，视为有一个不同的残基。相关领域已有多种方法可供进行上述并排，譬如可公开取得的软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本发明所属技术领域中具有普通技术知识者在进行并排时，可选择适当的参数与计算方式，以得到最佳的排列方式。在本说明书中，二氨基酸/核苷酸序列间的序列比较是采用美国国家生物科技信息中心(Nation Center for Biotechnology Information，简称NCBI)所提供的蛋白质-蛋白质BLAST分析数据库Blastp或核苷酸-核苷酸BLAST分析数据库Blastn来进行。一候选序列A相较于一参考序列B的氨基酸/核苷酸序列相似度(在本说明书中亦称之为序列A与序列B具有特定百分比(％)的氨基酸/核苷酸序列相似度)的计算方式如下:

其中X是利用Blastp或Blastn分析数据库对序列A、B进行排列后所得到的相同氨基酸/核苷酸残基数目(identical matches)，而Y是A、B二序列中较短者的氨基酸/核苷酸残基总数。

在本发明内容中，“治疗”(treat)一词包含部分或完全预防、改善、减轻及/或处理DENV感染之相关病征(symptom)、次要病征(secondary disorder)或症状(condition)，其中是通过抑制DENV复制及/或减少病毒效价来使罹患或疑似患有相关病征、疾病或症状之个体获得效益。“治疗”(treat)一词于本说明书中也指对一个体应用或给予一或多本发明抗体，该个体患有DENV感染之相关病征、次要病征或症状，以达到部分或完全减轻、减缓、治愈疾病、延迟发病、抑制病程发展、降低疾病严重性，及/或降低一或多种与DENV感染相关之病征、症状、或次要病征的发生。与DENV感染相关之病征、次要病征及/或症状包含，但不限于，疲劳、恶心、呕吐、发烧、头痛、关节与肌肉酸痛、DHF及DSS。在此“治疗”(treat)也可指给予至患有早期该些病征或症状的个体，以降低该个体发展与DENV相关的病征、次要病征及/或症状的风险。当一治疗可减少一或多种病症或临床标记时，则该治疗为“有效的”(effective)。或者是，当一治疗可降低、减缓或终止疾病病程、病征或症状的发展时，则该治疗为“有效的”(effective)。

“有效量”(effective amount)在此处是指一药物的用量足以产生希望的疗效反应。有效量也指一种化合物或组合物，其治疗利益效果超越其毒性或有害影响。具体的有效量取决于多种因素，如欲治疗的特定状况、患者的生理条件(如，患者体重、年龄或性别)、接受治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、目前疗法(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。举例来说，可将有效量表示成药物的总重量(譬如以克、毫克或微克为单位)或表示成药物重量与体重的比例(其单位为毫克/公斤(mg/kg))。或者是，可将有效量表示成活性成分(例如，本发明内容之抗体)的浓度，例如莫耳浓度、重量浓度、体积浓度、重量莫耳浓度、莫耳分率、重量分率及混合比值。具体来说，“治疗有效量”(therapeutically effective amount)一词若与本发明内容的抗体共同使用时，是指足以减少或减缓与个体肿瘤相关之病征的抗体剂量。本领域技术人员可依据动物模式的剂量来计算药物(如本发明内容的谷氨酰胺)的人体等效剂量(human equivalent dose,HED)。举例来说，本领域技术人员可依据美国食品药物管理局(US Food and DrugAdministration,FDA)所公告的“估算成人健康志愿者在初始临床治疗测式之最大安全起始剂量”(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trialsfor Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)来估算人体使用的最高安全剂量。

“个体”(subject)一词是指包含人类的动物，其可接受本发明方法的治疗。除非特定指出，否则“个体”(subject)一词同时意指男性及女性。

2.实施方式

(i)抗-DENV抗体

本发明内容的第一方面是关于一种抗体，其可辨识经DENV感染的细胞，并抑制病毒增殖。本发明抗体包含一重链可变区及一轻链可变区，其分别包含三个CDR。依据本发明内容实施方式，重链可变区的CDR(即重链可变区的CDR-1、CDR-2及CDR-3)分别包含SEQ IDNo.：1-3的氨基酸序列，而轻链可变区的CDR(即轻链可变区的CDR-1、CDR-2及CDR-3)则分别包含SEQ ID No.：5-7的氨基酸序列。

依据本发明内容某些实施方式，该重链可变区具有一至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相似于SEQ ID No.：4的序列的氨基酸序列，且该轻链可变区具有一至少85％(例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)相似于SEQ ID No.：8的序列的氨基酸序列。优选地，该重链可变区具有一至少90％相似于SEQID No.：4的序列的氨基酸序列，且该轻链可变区具有一至少90％相似于SEQ ID No.：8的序列的氨基酸序列。更优选地，该重链可变区具有一至少95％相似于SEQ ID No.：4的序列的氨基酸序列，且该轻链可变区具有一至少95％相似于SEQ ID No.：8的序列的氨基酸序列。依据本发明内容一操作实施例，该重链可变区具有SEQ ID No.：4的氨基酸序列，且该轻链可变区具有SEQ ID No.：8的氨基酸序列。

为制备所述的单克隆抗体，先将适量的抗原注入诸如小鼠、大鼠或兔子等动物体内，使其产生免疫反应。一般来说，佐剂会先与适当抗原混合，再将其注入动物体内。依据本发明内容一操作实施例，可用以制备本发明单克隆抗体(即mAb 33D2)的抗原包含SEQ IDNo.：11或12的氨基酸序列。依据本发明内容优选的实施例，是先以包含SEQ ID No.：11的氨基酸序列的抗原(即DENV NS1蛋白)免疫化动物，使其产生抗-DENV抗体，之后再于活体外以包含SEQ ID No.：12的氨基酸序列的抗原由该些抗-DENV抗体中筛选本发明mAb 33D2。适用于本发明的佐剂包含弗氏完全佐剂(Freund’s complete adjuvant,FCA)、弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant,FIA)及氢氧化铝佐剂。抗体的注射可以血管、皮下、腹腔或肌肉等方式给予。抗原注射的时间间隔并无特定限定。抗原注射的间隔时间可为数天至数周，优选的方法是，2至3周，共1至10次(优选为2至5次)。注射后，一旦抗体的效价到达2或更高的吸光值，则停止后续注射，并继续饲养该动物1个月。接着，至少再注射一次(优选为3至4次)。于最后一剂注射数天后(优选约3至5天)，取出该动物之脾脏细胞及区域淋巴结。采取血液检体并将之离心处理以分离血清。可利用任何适合的方法来检测所得血清中的抗体效价，例如酵素结合免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、酵素免疫分析(enzyme immunoassay,EIA)或放射免疫分析(radio immunoassay,RIA)。在一优选的实施例中，是利用ELISA来测定抗体的效价。

由分离的脾脏细胞及区域淋巴结制备可产生抗体的细胞。在制备可产生抗体的细胞时，宜先尽可能移出组织残渣及红血球。在此步骤可使用商业购买的红血球去除剂。或者是，可以使用包含氯化铵及三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane(Tris))的缓冲液。立即将可产生抗体的细胞与永生细胞(例如骨髓瘤细胞)进行融合，以制得融合瘤细胞；融合瘤细胞为一种可持续生长繁殖，并产生抗体的半永生细胞。可以使用由动物(例如小鼠)取得的常用的细胞株。较适用于本发明的细胞株为可有效融合、持续产生高量抗体、对次黄嘌呤-氨蝶呤-胸腺核苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine,HAT)培养液具有敏感性，且唯有在与可产生抗体的细胞融合后方可存活的细胞株。适合的骨髓瘤细胞包含，但不限于，小鼠骨髓瘤细胞株(例如骨髓瘤FO细胞)及人类骨髓瘤细胞株(例如Karpas 707H)。

细胞融合通常是将脾脏细胞或淋巴结细胞与商业取得的骨髓瘤细胞在一促进细胞融合因子的作用下，进行融合反应，例如平均分子量约为200至20,000kDa的聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)或其他类似物。或者是，细胞融合可以利用商业细胞融合仪，通过电刺激(例如电融合)来进行融合反应。融合后，将所得细胞稀释并培养于HAT培养液中。

由该些融合细胞中挑选出适合的融合瘤细胞。于HAT培养液中存活的融合细胞会形成聚集群落。收集各培养液的上清液，且以抗原来检测是否具有抗体效价。如上所述，可以使用酵素免疫吸附法、酵素免疫分析或放射免疫分析来进行检测，其是将抗原涂布于盘中，并由此进行筛选。一旦确认可产生抗体的孔洞，即可将其中的细胞转移至不含氨蝶呤的次黄嘌呤-胸腺核苷(hypoxanthine-thymidine,HT)培养液中培养。经过培养，再次确认培养上清液中的抗体效价。由最终筛选出的细胞中，分离出单一颗细胞。待单一颗细胞生长繁殖成一聚集群落后，筛选对抗原具有高度专一性的聚集群落，并使其持续生长繁殖以制成融合瘤细胞株。

依据本发明内容优选的实施方式，在筛选出一株融合瘤细胞株后，可利用任何已知方式由该融合瘤细胞株单离或制备单克隆抗体(例如本发明mAb 33D2)。举例来说，可以将融合瘤细胞株培养于低血清浓度的培养液中，再由该培养上清液制备抗体。或者是，将融合瘤细胞株注入动物的腹腔，由腹水来制备抗体。抗体可以任何方式进行纯化，该方式包含亲和性管柱、胶滤层析、离子交换层析或相关技术。可以使用任何相关领域技术人员所熟知的方法或其组合。

或者是，可通过DNA基因选殖或DNA合成来制备本发明抗体。可利用常规步骤来单离及定序分析(例如可专一结合至用以编码单克隆抗体的重链及轻链基因的寡核苷酸探针)用以编码本发明抗体的DNA。优选的DNA来源是利用该些融合瘤细胞株。一旦分离后，可将DNA建构至表现载体，再将表现载体转染至宿主细胞(例如大肠杆菌细胞、猿猴细胞COS、中国仓鼠卵巢细胞CHO或不会产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，藉此于重组宿主细胞中制备出单克隆抗体。

依据本发明内容一操作实施例，用以编码本发明单克隆抗体(即mAb 33D2)的DNA包含二多核苷酸序列，其分别对应于本发明单克隆抗体的重链可变区及轻链可变区。在该实施例中，第一多核苷酸序列包含SEQ ID No.：9的序列，且第二多核苷酸序列包含SEQ IDNo.：10的序列。依据该实施例，CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3分别由SEQ ID No.：13-15的多核苷酸序列编码而得，而CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3则分别由SEQ ID No.：16-18的多核苷酸序列编码而得。

所制得的单克隆抗体及用以编码该些单克隆抗体的DNA可用以制备嵌合型抗体(例如双专一性抗体)、人类化抗体及/或其中的抗体片段。

一般来说，可利用CDR移植来制备人类化抗体，其中将人类抗体的VH及VL基因中的CDR置换为特定的CDR编码片段(例如分别具有SEQ ID No.：1-3及5-7之氨基酸序列的CDR)。由此制备出的抗体仅有CDR是源自于小鼠的抗体，而VH及VL基因中其他骨架区及恒定区的基因(即CK或CH1-H-CH2-CH3)则为人类IgG基因。

依据治疗需求的不同，本发明mAb 33D2可为免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白D(IgD)或免疫球蛋白M(IgM)的形式。依据优选的实施方式，本发明mAb 33D2为IgG形式。在一操作实施例中，本发明mAb 33D2为一IgG 2a抗体。

依据本发明内容某些实施方式，本发明抗体可辨识经DENV感染的细胞，且抑制病毒增殖，而不会与个体的蛋白、细胞、组织或器官(举例来说，宿主蛋白、血小板、内皮细胞及凝血因子)产生交叉反应。据此，相较于传统抗体，本发明抗体可较安全地保护个体及/或治疗个体的DENV感染。

依据本发明内容某些实施方式，可为本发明抗体辨识及中和的DENV是DENV血清型1、2、3或4。

(ii)包含本发明抗-DENV抗体的药学组合物

本发明内容的第二方面是关于一种用以预防及/或治疗DENV感染的药学组合物。本发明药学组合物包含任一种本发明内容方面及实施方式所述的抗体，以及一药学上可接受的载体。

一般来说，本发明mAb33D2的重量约占药学组合物总重的0.1％到99％。在某些实施方式中，本发明mAb33D2的重量至少占药学组合物总重的1％。在某些实施方式中，本发明mAb33D2的重量至少占药学组合物总重的5％。在某些实施方式中，本发明mAb33D2的重量至少占药学组合物总重的10％。在其他实施方式中，本发明mAb33D2的重量至少占药学组合物总重的25％。

依据作用目的不同，药学上可接受的载体可以是液体、凝胶、乳膏、软膏、洗剂、悬浮液或乳液。可依据常规技术、使用本领域技术人员熟知的常规成分及试剂来制备载体，据以制得组合物。其他可分散于载体中的试剂包含保湿剂、湿润剂、防尘剂、乳化剂及特定的氨基酸。

例示性的可作为药学上可接受的载体的物质包含明胶、赋形剂、无菌水、等张生理食盐水及磷酸缓冲溶液。基本上，可依据组合物的给予方式来选择与抗体共同使用的药学上可接受的载体种类。

可依据给予路径来配制药学组合物。例式性的给予路径包含非口服(，例如静脉内、皮内及皮下)、口服(例如吸入)、经皮(局部)、经黏膜及直肠给予。用于非口服、皮内或皮下给予的溶液或悬浮液可包含以下成分：无菌稀释剂(例如注射用水、生理食盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂)、抗菌菌(例如芐醇或对羟基苯甲酸甲酯)、抗氧化剂(例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠)、螫合剂(例如乙二胺四乙酸)、缓冲液(例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)及氯化钠或葡萄糖等用以调整溶液张力之试剂。可利用盐酸或氢氧化钠等酸或碱来调整pH值。可将非口服制剂封装于由玻璃或塑料制成之安瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。

依据某些实施方式，是以非口服方式对有需要的个体给予本发明组合物。为制备非口服制剂，需使用无菌注射液或悬浮液，以避免个体遭受微生物感染。适当之用以制备无菌注射溶液或悬浮液的稀释剂或溶剂包含，但不限于，1,3-丁二醇、甘露糖醇、水、林格氏液及等张氯化钠溶液。可使用油酸及其甘油酯衍生物等脂肪酸，或是橄榄油或蓖麻油等天然药学上可接受之油剂来制备注射液。该些油溶液或悬浮液可包含酒精稀释剂或羧甲基纤维素或相似之分散剂。配制时亦可使用表面活性剂(例如Tweens及Spans)、其他相似之乳化剂或生物可利用性增强剂等相关领域惯用以制备药学上可接受剂型的物质。

(iii)用以治疗DENV感染的方法

本发明内容的另一方面是关于一种用以治疗个体的DENV感染的方法。本发明方法包含对该个体给予一有效量之本发明内容任一方面或实施例所述的抗体或药学组合物。

一般来说，本发明抗体或药学组合物的有效量会随着不同因素而有所改变，例如病患的生理状况(例如病患的体重、年龄或性别)、欲接种疫苗的个体，治疗时间及目前疗法(若有的话)。

依据一实施方式，该个体为一小鼠。为对小鼠产生治疗功效，本发明抗体是以每公斤个体体重约12微克到1.2公克的剂量给予至小鼠体内，例如每公斤体重12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980或990微克，或是每公斤体重1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1,000、1,100或1,200毫克。优选地，本发明抗体是以每公斤体重约120微克到120毫克的剂量给予至个体体内。依据一操作实施例，本发明抗体是以每公斤体重约1.2-12毫克的剂量给予至个体体内。

本领域技术人员可基于由动物模式得到的数据来计算本发明多肽的人体等效计量(human equivalent dose,HED)。据此，本发明抗体的有效HED约为每公斤个体体重1微克到每公斤体重100毫克，例如每公斤体重1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980或990微克，或是每公斤体重1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100毫克。优选地，有效HED约为每公斤体重10微克到每公斤体重10毫克。在一优选实施例中，有效HED约为每公斤体重0.1毫克到每公斤体重1毫克。

依据特定的治疗功效，该剂量可于一天内以单一剂量或多剂量(例如每天2、3、4或更多剂)的方式给予。或者是，该剂量可于多天内以多剂量的方式给予。

可以适当路径给予本发明抗体或包含该抗体的药学组合物，例如经黏膜、皮下、皮内、肌肉内、静脉内或腹腔内注射。依据一特定实施方式，是以静脉内或腹腔内注射方式对个体给予本发明抗体或包含该抗体的药学组合物。

基本上，可接受本发明方法治疗的个体为一哺乳动物；举例来说，人类、小鼠、大鼠、仓鼠、天竺鼠、兔子、狗、猫、牛、山羊、绵羊、猴子及马。优选地，该个体为人类。

下文提出多个实验例来说明本发明的某些方面，以利本发明所属技术领域中具有普通技术知识者实施本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人员在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。

实施例

材料及方法

测定病毒效价及荧光斑点试验(fluorescent focus assay,FFA)

为测定病毒效价，利用荧光斑点试验来决定病毒的效量。简单来说，收集包含感染病毒的上清液，并将其冷冻于-70℃中以待后续使用。连续稀释上清液后，加至BHK-21细胞，于37℃反应2小时。以包含2％FBS及1％甲基纤维素(methylcellulose)的DMEM覆盖单层细胞，于37℃培养2-3天。以抗-NS1抗体(mAb33D2)及与Alexa 488连结的山羊抗-小鼠IgG染色病毒斑点，之后以荧光显微镜进行观察。

细胞辨识试验

为评估抗-NS1 mAb 33D2是否能辨识经DENV感染的细胞，以包含4mM EDTA的PBS分离经四种血清型的DENV或对照组感染的HuH-7细胞，并以PBS洗涤之。以mAb 33D2(每毫升10微克)染色细胞后，加入与Alexa 488连结的二级抗体。利用流式细胞仪进行侦测及分析。以软件来分析定量结果。图2阐述分析数据。

细胞存活率及MTT试验

将8×103HuH-7细胞种植于96孔洞细胞盘中。将处理后的细胞与每毫升5毫克的MTT原液(以1:10比例稀释)共同培养4小时。之后，移除培养液，并于每孔洞加入100微升的DMSO。在以DMSO溶解沉淀物约10分钟后，读取570奈米的吸光值。以[1-(OD对照组-OD检体)/OD对照组]×100％来计算细胞存活率。

酶联免疫吸附分析试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)

在进行间接ELISA时，将50微升的溶于PBS(pH 7.3)的蛋白涂布于96-孔洞的ELISA盘中，并于4℃放置至隔日。以1％的溶于PBS的BSA阻断1小时后，以13.33nM为起始浓度，2倍连续稀释mAb 33D2，之后加入细胞，并于37℃反应1小时。接着，于各孔洞加入与山葵过氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)连结的山羊抗-兔子、抗-小鼠IgG(1:10,000稀释)，于37℃反应1小时。利用PBST洗涤各孔洞后，以四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)作为受质(受体)进行呈色反应。在加入反应停止溶液(2N H2SO4)后，以微盘读取器读取OD450奈米的吸光值。图1阐述mAb 33D2与NS1蛋白的结合亲和力。

由补体媒介的细胞溶解反应

为分析感染细胞中与补体相关之细胞溶解反应，以DENV 1-4(感染复数(multiplicity of infection,M.O.I.)＝5)感染HuH-7细胞(8×103)48小时。以PBS洗涤细胞后，在有或无Low-Tox-M兔子补体(1:20稀释，包含2％FBS之无酚红细胞培养液)的条件下，加入PBS(作为负对照组)或特定浓度(每毫升50微克)的56℃热去活性的抗体(即对照小鼠IgG(标示为cmIgG)、mAb 33D2或mAb 2E8(作为正对照组))，于37℃反应4-6小时。之后，收集50微升的上清液，并与50微升的CYTOTOX

受质试剂反应。以490奈米的吸光值来分析LDH的释放量。

为以FFA决定细胞溶解量，以DENV(血清型1-4，M.O.I＝5)或对照组感染HuH-7细胞24小时。感染24小时后，在含有补体(1:20稀释)的条件下，加入PBS(作为负对照组)、对照小鼠IgG(标示为cmIgG)、mAb 33D2或mAb 2E8(每毫升50微克，作为正对照组)，于37℃反应4-6小时。重新补入新鲜培养液反应特定时间后，收集上清液中的感染病毒，并以FFA进行分析。

图4A及4B分别阐述LDH及FFA的分析结果。

与补体无关的抑制反应

以DENV2(M.O.I＝2)感染HuH-7细胞12小时后，加入PBS、cmIg、mAb DN5C6(另一种抗-NS1 mAb)、mAb 33D2或经热变性的mAb 33D2(每毫升50微克)，反应24小时。以FFA分析包含感染病毒的上清液来决定病毒效价。图5A阐述分析结果。

或者是，以DENV 2(M.O.I＝2)感染HuH-7细胞12小时后，加入不同剂量的cmIg或mAb 33D2。以FFA分析包含感染病毒的上清液来决定病毒效价。将MTT试剂加入经处理之细胞，之后以MTT试验来决定细胞存活率，图5B阐述该些结果。

为决定不同DENV血清型的病毒效价，以DENV血清型1-4(M.O.I＝2)分别感染HuH-7细胞12小时后，加入PBS、cmIg、mAb DN5C6(另一种抗-NS1 mAb)及不同剂量之mAb 33D2。利用FFA分析包含感染病毒的上清液以决定病毒效价。图5C阐述分析结果。

苏木精与伊红染色(Hematoxylin and Eosin staining,H&E stain)及免疫组织化学分析(Immunohistochemistry,IHC)

以4％甲醛固定新鲜的小鼠皮肤组织，并进行石蜡包埋。为分析组织病理，以H&E染色组织切片。为进行免疫组织化学染色，阻断玻片后，加入抗-NS3抗体，并于4℃反应至隔日。利用PBS洗涤玻片后，加入以HRP标记的二级抗体，室温反应30分钟；之后加入3,3’-二胺基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)或HRP绿色混合试剂反应1-5分钟。以苏木精复染2分钟。通过软件来定量分析DAB染色结果。

评估mAb 33D2的交叉反应

为分析mAb 33D2的交叉反应，以不同剂量的mAb33D2(每毫升2、5、25微克)直接染色人类内皮细胞(HUVEC)及人类血小板1小时，之后以与Alexa 488连结的二级抗体进行染色。利用流式细胞仪来检测及分析染色结果。以软件进行定量分析。图3A阐述了mAb 33D2及HUVEC之间的交叉反应，而图3B则阐述mAb33D2及血小板之间的交叉反应。

在评估与凝血因子的交叉反应时，将50微升的溶于PBS(pH 7.3)的NS1、纤维蛋白溶酶原、凝血酶或BSA(每毫升2微克)涂布于96孔洞之ELISA盘中，置于4℃直至隔日。以1％的溶于PBS的BSA阻断1小时后，以每毫升2微克为起始浓度，2倍连续稀释mAb 33D2，加入各孔洞后，置于37℃反应1小时。接着加入与HRP连结的抗-小鼠IgG(1:10,000稀释)，并于37℃再反应1小时。以PBST洗涤各孔洞后，以TMB作为受质进行呈色反应。在加入反应停止溶液后，以微盘读取器读取OD450奈米的吸光值。图3C阐述关于mAb 33D2及凝血因子间的交叉反应。

动物

由成功大学(National Cheng Kung University,NCKU)实验动物中心取得BALB/C小鼠，将其饲养于12小时光照/黑暗周期的环境中，并给予充足的食物及饮用水。

为评估mAb 33D2于小鼠的治疗功效，对C3H/HeN小鼠以皮下注射方式(intradermally,i.d.)给予四种血清型之DENV(每只小鼠2×108PFU)或对照培养液。给予病毒1天后，以腹腔注射方式给予单剂PBS(对照组)、cmIgG(每只小鼠100微克)或mAb 33D2(每只小鼠100微克)。给予病毒3天后，分析各小鼠的出血时间，图6A阐述分析结果。收集各小鼠之新鲜皮肤检体，以观察局部性出血状况，图6B及6C分别阐述该些结果。利用H&E染色分析局部皮肤出血，图6B阐述分析结果。以IHC染色分析DENV NS3的表现量，并以Image J定量分析，据以评估局部DENV的复制状况。

实施例1制备及确定单克隆抗体(mAb)

为制备小鼠mAb，以一般免疫化步骤，将50微克的源自果蝇的DENV 2NS1腹腔注射至5到6周大的BALB/c小鼠体内。简单来说，先将包含FCA及25微克DENV NS1抗原(SEQ IDNo.：11)的混合物腹腔注射至BALB/C小鼠(6到8周大)体内，以诱发其免疫反应。2周后，再将包含FIA及25微克相同抗原(SEQ ID No.：11)的混合物腹腔注射至经诱发产生免疫反应之小鼠内，共注射2次，藉以增强其免疫反应。3天后，杀小鼠，收集其脾脏细胞，并立即与小鼠骨髓瘤细胞进行融合。连续稀释融合细胞，并将细胞培养于HAT及HT培养液中，据以制备融合瘤细胞。独立培养各融合瘤细胞，收集各培养孔洞的上清液，以ELISA试验检测对包含氨基酸序列“YKDWSEWGKAC”(SEQ ID No.：12)的抗原的抗体效价。筛选对抗原具有最高专一性的融合瘤细胞株，将由该融合瘤细胞株产生的单克隆抗体命名为mAb 33D2。利用ELISA小鼠单克隆抗体同型试剂盒来决定mAb 33D2的血清型，表1总结分析数据。

表1 mAb 33D2的血清型

实施例2mAb 33D2对DENV感染的活体保护功效

2.1mAb 33D2可辨识四种血清型的DENV NS1及经DENV感染的细胞

有鉴于仅有少数表位暴露于NS1(与膜相关的NS1或循环中分泌的NS1)外侧，相关领域不易找到对所有血清型的NS1皆具有功效的抗体。依据结构分析研究，DENV NS1翼域的无序环状区域为一具有潜力的区域，其涵盖四种血清型的NS1的保留区域。此外，也推测该区域位于NS1的外侧。

以间接ELISA试验来决定mAb 33D2及NS1蛋白之间的结合亲和力，图1阐述分析结果。

依据西方墨点分析，mAb 33D2可辨识四种血清型的商业化天然NS1，而无法辨识牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(结果未显示)。流式细胞分析数据进一步确认mAb 33D2可辨识表达于细胞表面的NS1蛋白，其中该细胞是分别经DENV血清型1、2、3及4所感染(第2图)。

整体来看，该些数据指出mAb 33D2可辨识四种血清型的DENV(即，DENV血清型1、2、3及4)。

2.2 mAb 33D2不会与宿主蛋白及/或细胞产生交叉反应

已知某些由NS1诱发产生的抗体会与人类内皮细胞、人类血小板或凝血因子产生交叉反应，进而恶化DHF病况。因此，本实施例将检测mAb 33D2与不同宿主蛋白产生交叉反应的可能性。

流式细胞分析数据指出，高剂量(每毫升25微克)的抗-全长NS1抗体会与人类内皮细胞(HUVEC，图3A)、血小板(图3B)及凝血因子(包含纤维蛋白溶酶原及凝血酶，图3C)产生交叉反应。相较之下，实施例1的mAb 33D2则不会与该些细胞及/或蛋白产生交叉反应(图3A-3C)。

该些数据证实本发明抗-DENV抗体(即mAb 33D2)对DENV具有结合专一性。

2.3经四种血清型的DENV感染后，实施例1的mAb33D2可通过补体相关及/或无关的方式来减少病毒效价

本实施例将探讨mAb 33D2对DENV感染的保护机制。结果指出，mAb 33D2不只可通过促进感染细胞之补体相关细胞溶解反应(complement dependent cytolysis,CDC)来抑制病毒扩散(图4A及4B)，也可直接减少四种血清型的DENV感染后的病毒效价(图5A-5C)。FFA的分析指出，mAb 33D2可显著地降低DENV血清型2的效价(图5A)。图5B的结果进一步证实mAb 33D2可以剂量相关的方式降低DENV血清型2的效价。除了DENV血清型2外，mAb 33D2也对DENV血清型1、3及4具有抑制功效(图5C)。

实施例3 mAb 33D2提供小鼠对DENV感染的被动保护

本实施例将检测mAb 33D2的生物活性，图6A-6E分别阐述分析结果。

3.1被动给予mAb 33D2可减缓小鼠由DENV引发的延长出血时间

利用由DENV引发的出血小鼠模式来探讨mAb 33D2的活体治疗功效。简单来说，将2x 108 DENV以皮下注射方式种植至小鼠背部。24小时后，以腹腔注射方式对各经DENV感染的小鼠给予mAb 33D2(每只小鼠每毫升100微克)。于第3天分析各小鼠的出血时间(尾静脉切断)。结果显示，DENV(即DENV血清型1、2、3或4)感染会延长小鼠的出血时间(第6A图之图A-D)。相较于对照组(给予cmIg的小鼠)，给予mAb 33D2可减少经DENV感染的小鼠的出血时间(图6A中的图A-D)。

3.2被动给予mAb 33D2可减缓小鼠体内由DENV引发的局部性出血、RBC外渗及DENVNS3表现量

为分析DENV的病理特征，利用H&E染色分别确认小鼠皮肤之局部性出血及RBC外渗。此外，也通过IHC染色来评估DENV的局部复制及NS3表现量。相较于对照组(给予cmIg的小鼠)，给予mAb 33D2的小鼠具有较少量的局部性出血、RBC外渗及NS3表现量(第6B-6E图)。具体来说，图6B的照片指出DENV(包含DENV血清型1、2、3及4)感染会造成局部性出血(如图6B箭号所指位置)，而给予mAb 33D2则会明显地降低由DENV造成的局部性出血的程度。定量分析结果也确认mAb 33D2对由DENV造成的局部性出血的抑制功效(图6C，图A：经DENV 1感染，图B：经DENV 2感染，图C：经DENV 3感染，图D：经DENV 4感染)。本研究也证实mAb33D2可明显减少由DENV造成的RBC外渗量(图6D，箭号所指位置为皮肤的出血处)及NS3表现量(图6E)。

总结上述，本发明提供一种新颖的抗体33D2，其对DENV(包含DENV血清型1、2、3及4)具有结合亲和力及专一性。本发明抗体不会与宿主蛋白及细胞(例如内皮细胞、血小板及凝血因子)产生交叉反应。据此，本发明抗体可有效治疗个体的DENV感染。

虽然上文实施方式中公开了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有普通技术知识者，在不悖离本发明之原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明之保护范围当以附随权利要求书范围所界定为准。

序列表

<110>国立成功大学

DCB-USA LLC

<120> 抗-登革热病毒抗体、包含该抗体的药学组合物及其用途

<130> 19FAP0452CPT

<150> US62509205

<151> 2017-05-22

<160> 18

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成-CDRH1

<400> 1

Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成-CDRH2

<400> 2

Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Ile Ser

1 5 10 15

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成-CDRH3

<400> 3

Ala Arg Val Glu Arg Leu Gly Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 4

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成-VH键

<400> 4

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Arg Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Ile Ser Arg Thr Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu His Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Glu Arg Leu Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr

100 105 110

Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成-CDRL1

<400> 5

Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met His

1 5 10 15

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成-CDRL2

<400> 6

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 7

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成-CDRL3

<400> 7

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Thr

1 5

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成-VL键

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Phe

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 9

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成-VH键

<400> 9

gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120

tttccaggaa acaagctgga gtggatgggc ttcataagtt acagtggtag cgctaggtac 180

aatccatctc tcataagtcg aacctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240

ctgcacttga attctgtgac tactgaggac acagccatat attactgtgc gagagtggaa 300

cggctagggt acttcgatgt ctggggcgca gggaccacgg tcaccgtctc ctca 354

<210> 10

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成-VL键

<400> 10

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggcctcc 60

atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gcactggtac 120

caacagaaac caggacagcc attcaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180

gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag tcttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgacg 300

ttcggtggag gcaccaggct ggaaatcaaa cgg 333

<210> 11

<211> 354

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成-DENV NS1抗原

<400> 11

Ser Gly Cys Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ile Phe Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys

20 25 30

Phe Gln Pro Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys Ala

35 40 45

His Glu Glu Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu Asn

50 55 60

Leu Met Trp Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser Glu

65 70 75 80

Asn Glu Val Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile Met

85 90 95

Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Arg Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys Tyr

100 105 110

Ser Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Leu His

115 120 125

Asn His Thr Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn

130 135 140

Thr Asn Arg Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly

145 150 155 160

Val Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Lys Glu Arg Gln Asp Val

165 170 175

Phe Cys Asp Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg Ala

180 185 190

Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp Thr

195 200 205

Trp Lys Ile Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His Trp

210 215 220

Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met

225 230 235 240

Ile Ile Pro Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr Arg

245 250 255

Pro Gly Tyr His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu

260 265 270

Glu Met Asp Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr Glu

275 280 285

Asp Cys Gly Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly

290 295 300

Lys Leu Ile Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu

305 310 315 320

Arg Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro

325 330 335

Leu Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala Gly

340 345 350

His Gly

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>合成

<400> 12

Tyr Lys Asp Trp Ser Glu Trp Gly Lys Ala Cys

1 5 10

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成-CDRH1

<400> 13

ggctactcaa tcaccagtga ttatgcctgg aac 33

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成-CDRH2

<400> 14

ttcataagtt acagtggtag cgctaggtac aatccatctc tcataagt 48

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成-CDRH3

<400> 15

gcgagagtgg aacggctagg gtacttcgat gtc 33

<210> 16

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>合成-CDRL1

<400> 16

Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly

1 5 10 15

Thr Thr Gly Ala Thr Thr Ala Thr Gly Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala

20 25 30

Thr Ala Gly Thr Thr Ala Thr Ala Thr Gly Cys Ala Cys

35 40 45

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>合成-CDRL2

<400> 17

gctgcatcca atctagaatc t 21

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>合成-CDRL3

<400> 18

cagcaaagta atgaggatcc gacg 24

Claims (15)

1.一种抗体或其片段，包含

一重链可变区，其包含SEQ ID No.：1、SEQ ID No.：2及SEQ ID No.：3的氨基酸序列；以及

一轻链可变区，其包含SEQ ID No.：5、SEQ ID No.：6及SEQ ID No.：7的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的抗体，其中

该重链可变区具有一至少85％相似于SEQ ID No.：4的序列的氨基酸序列，以及

该轻链可变区具有一至少85％相似于SEQ ID No.：8的序列的氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的抗体，其中该重链可变区具有SEQ ID No.：4的氨基酸序列，且该轻链可变区具有SEQ ID No.：8的氨基酸序列。

4.一种用以治疗登革热病毒感染的药学组合物，包含如权利要求1所述的抗体，以及一药学上可接受的载体。

5.如权利要求4所述的药学组合物，其中该登革热病毒是登革热病毒血清型1、2、3或4。

6.如权利要求4所述的药学组合物，其中

该重链可变区具有一至少85％相似于SEQ ID No.：4的序列的氨基酸序列，以及

该轻链可变区具有一至少85％相似于SEQ ID No.：8的序列的氨基酸序列。

7.如权利要求6所述的药学组合物，其中该重链可变区具有SEQ ID No.：4的氨基酸序列，且该轻链可变区具有SEQ ID No.：8的氨基酸序列。

8.一种用以治疗一个体的登革热病毒感染的方法，包含对该个体给予一有效量的如权利要求1所述的抗体。

9.如权利要求8所述的方法，其中该有效量约为每公斤1微克到每公斤100毫克。

10.如权利要求9所述的方法，其中该有效量约为每公斤10微克到每公斤10毫克。

11.如权利要求10所述的方法，其中该有效量约为每公斤0.1毫克到每公斤1毫克。

12.如权利要求8所述的方法，其中该个体为一人类。

13.如权利要求8所述的方法，其中该登革热病毒是登革热病毒血清型1、2、3或4。

14.如权利要求8所述的方法，其中

该重链可变区具有一至少85％相似于SEQ ID No.：4的序列的氨基酸序列，以及

该轻链可变区具有一至少85％相似于SEQ ID No.：8的序列的氨基酸序列。

15.如权利要求8所述的方法，其中该重链可变区具有SEQ ID No.：4的氨基酸序列，且该轻链可变区具有SEQ ID No.：8的氨基酸序列。

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