JP2023025184A - メチル化ｄｎａの分析による結腸腫瘍の検出 - Google Patents

メチル化ｄｎａの分析による結腸腫瘍の検出 Download PDF

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Abstract

【課題】結腸癌などの腫瘍を検出するための方法、組成物、及び関連使用を提供する。【解決手段】ａ）対象からの試料を提供すること、ｂ）ＡＮＫＲＤ１３Ｂ；ＣＨＳＴ２；ＣＮＮＭ１；ＧＲＩＮ２Ｄ；ＪＡＭ３；ＬＲＲＣ４；ＯＰＬＡＨ；ＳＥＰ９；ＳＦＭＢＴ２；ＳＬＣ１２Ａ８；ＴＢＸ１５；ＺＤＨＨＣ１；ＺＮＦ３０４；ＺＮＦ５６８；ＺＮＦ６７１；ＤＯＣＫ２；ＤＴＸ１；ＦＥＲＭＴ３；ＯＰＬＡＨ；ＰＤＧＦＤ；ＰＫＩＡ；ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ；ＴＢＸ１５；ＴＳＰＹＬ５；ＶＡＶ３；ＦＥＲ１Ｌ４；及びＺＮＦ６７１からなるメチル化マーカー遺伝子群から選択される、少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量について前記試料をアッセイすること、ｂ）前記試料中の標準核酸の量について前記試料をアッセイすることを含む、対象からの試料を特徴付ける方法である。【選択図】なし

Description

[関連出願の相互参照］
本出願は、２０１７年１月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５１，３２７号、及び２０１８年１月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／６２２，１０７号の優先権の利益を主張するものであり、各々は参照によりその全体が組み込まれる。
本明細書では、腫瘍検出に関する技術、特に、非限定的には、結腸癌などの腫瘍を検出するための方法、組成物、及び関連使用に関する技術を提供する。
大腸癌は、米国人の男性及び女性を合せて依然として２番目に多く見られる（Ｓｉｅｇｅｌ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，ＣＡ Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｃｌｉｎ ２０１３；６３：１１－３０）。前駆病変からがんへと進行する基礎にある生態のため、がんはスクリーニングがしやすい（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３；３３９：１５４６－５８）。いくつかの試験及び戦略が証拠により支持され、かつガイドラインにより是認されている（Ｌｅｖｉｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００８；１３４：１５７０－９５；Ｒｅｘ ＤＫ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２００９；１０４：７３９－５０；Ｋａｒｌ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２００８；６：１１２２－８）。社会的観点から、スクリーニングは費用対効果があると考えられる（Ｋａｒｌ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２００８；６：１１２２－８；Ｈｅｉｔｍａｎ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ ２０１０；７：ｅ１０００３７０；Ｐａｒｅｋｈ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２００８；２７：６９７－７１２；Ｓｈａｒａｆ ＲＮ，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２０１３；１０８：１２０－３２）。
大腸癌は、遺伝子変化及びエピジェネティックな変化が蓄積したことにより生じるもので、腫瘍特異的な変化について糞便を分析する根拠となっている（Ｂｅｒｇｅｒ ＢＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２０１２；４４：８０－８）。スクリーニング設定における初期世代の糞便ＤＮＡ検査のこれまでの大規模研究では、大腸癌に対して普通の感度を、また進行腺腫に対して低い感度を示したに過ぎなかった（Ａｈｌｑｕｉｓｔ ＤＡ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２００８；１４９：４４１－５０，Ｗ８１；Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ ＴＦ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５１：２７０４－１４）。以降、重要な進歩が取り入れられてきており、それらには、安定化緩衝液（Ｂｏｙｎｔｏｎ ＫＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００３；４９：１０５８－６５；Ｚｏｕ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２００６；１５：１１１５－９）、判別度の高いマーカー（Ａｈｌｑｕｉｓｔ ＤＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１２；１４２：２４８－５６；Ｂａｒｄａｎ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｓｒａｅｌ
ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ １９９７；３３：７７７－８０）、分析感度がより高いプラットフォーム（Ａｈｌｑｕｉｓｔ ＤＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１２；１４２：２４８－５６；Ａｒｏｎｃｈｉｃｋ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ ２０００；５２：３４６－５２）、個々のマーカー値ではなくロジスティック回帰分析の使用による結果判定、及びオートメーションなどがある。
スクリーニングにより大腸癌の死亡率は低下するが（Ｍａｎｄｅｌ ＪＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．１９９３，３２８：１３６５－７１；Ｈａｒｄｃａｓｔｌｅ ＪＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．１９９６，３４８：１４７２－７；Ｋｒｏｎｂｏｒｇ Ｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００４，３９：８４６－５１；Ｗｉｎａｗｅｒ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．１９９３，８５：１３１１－８；Ｓｉｎｇｈ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ．２００６，２９５：２３６６－７３）、観察された低下はわずかであり（Ｓｉｎｇｈ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ．２００６；２９５，２３６６－７３；Ｈｅｒｅｓｂａｃｈ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２００６，１８：４２７－３３）、米国の成人の半数以上はスクリーニングを受けていなかった（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ＨＩ，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ．２００６，１５：３８９－９４）。
がんスクリーニングの新たな方法では、がん患者の身体試料、例えば、糞便、血清、及び尿などにおける腫瘍特異的なＤＮＡ変化のアッセイを行う（Ｏｓｂｏｒｎ ＮＫ，Ａｈｌｑｕｉｓｔ ＤＡ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００５；１２８：１９２－２０６；Ａｈｌｑｕｉｓｔ ＤＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０００；１１９：１２１９－２７；Ａｈｌｑｕｉｓｔ ＤＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００２；１２２：Ｓｕｐｐｌ Ａ４０；Ｃｈｅｎ ＷＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ２００５；９７：１１２４－３２；Ｚｏｕ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２００６；１５：１１１５－９；Ｚｏｕ ＨＺ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００２；８：１８８－９１；Ｈｏｑｕｅ ＭＯ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００５；２３：６５６９－７５；Ｂｅｌｉｎｓｋｙ ＳＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６；６６：３３３８－４４；Ｉｔｚｋｏｗｉｔｚ ＳＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２００７；５：１１１－７’ Ｋａｎｎ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００６；５２：２２９９－３０２）。がんスクリーニングにおいて効率と効果を達成しなければならない場合は精度の高いマーカーを選択することが重要である。大腸腫瘍は分子的に不均一であるため、高検出率にはマーカーのパネルを必要とすることが多い。
大腸癌患者の糞便試料及び血清／血漿試料でいくつかのメチル化遺伝子が検出されている（Ａｈｌｑｕｉｓｔ ＤＡ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００２；１２２：Ｓｕｐｐｌ Ａ４０；Ｃｈｅｎ ＷＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ２００５；９７：１１２４－３２；Ｚｏｕ ＨＺ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００２；８：１８８－９１；Ｉｔｚｋｏｗｉｔｚ ＳＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２００７；５：１１１－７；Ｐｅｔｋｏ Ｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；１１：１２０３－９；Ｍｕｌｌｅｒ ＨＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２００４；３６３：１２８３－５；Ｌｅｕｎｇ ＷＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００４；５０：２１７９－８２；Ｅｂｅｒｔ ＭＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００６；１３１：１４１８－３０；Ｇｒａｄｙ ＷＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１；６１：９００－２）。大部分の大腸癌でいくつかのメチル化遺伝子が見出されているが、体液を用いるアッセイの結果は依然として最適下限にとどまっている（Ａｈｌｑｕｉｓｔ ＤＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００２；１２２：Ｓｕｐｐｌ Ａ４０；Ｃｈｅｎ ＷＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ２００５；９７：１１２４－３２；Ｚｏｕ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ ２００６；１５：１１１５－９；Ｚｏｕ ＨＺ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００２；８：１８８－９１；Ｂｅｌｉｎｓｋｙ ＳＡ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６；６６：３３３８－４４；Ｉｔｚｋｏｗｉｔｚ ＳＨ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ２００７；５：１１１－７；Ｋａｎｎ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００６；５２：２２９９－３０２；Ｐｅｔｋｏ Ｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５；１１：１２０３－９；Ｍｕｌｌｅｒ ＨＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２００４；３６３：１２８３－５；Ｌｅｕｎｇ ＷＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２００４；５０：２１７９－８２；Ｅｂｅｒｔ ＭＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００６；１３１：１４１８－３０；Ｇｒａｄｙ ＷＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ
２００１；６１：９００－２）。
スクリーニングの効果、認容性、及び利用しやすさを改善する、より正確で使いやすい、広く配布可能なツールが必要とされている。
本明細書では、腫瘍検出に関する技術、特に、非限定的には、対象、例えば、患者の血液試料及び／または血漿試料の分析によって前悪性大腸癌及び悪性大腸癌を検出するための方法、組成物、及び関連使用に関する技術を提供する。本明細書では技術が記載されているが、使用される項目見出しはあくまで構成のためであり、主題をなんら限定するものではないと解釈されるべきである。
本明細書では、大腸癌について極めて高度な識別を達成しつつ、正常な大腸組織では陰性のままである、組織でアッセイするメチル化ＤＮＡマーカーのパネルを提供する。このパネルを、例えば、血液または体液を用いた試験に利用して、大腸癌スクリーニングに応用することができる。
大腸癌試料のＤＮＡマーカーのメチル化状態と正常（非がん性）試料での対応するマーカーとを比較することによって、マーカー及び／またはマーカーパネル（例えば、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ；ＣＨＳＴ２；ＧＲＩＮ２Ｄ；ＪＡＭ３；ＬＲＲＣ４；ＯＰＬＡＨ；ＳＥＰ９；ＳＦＭＢＴ２；ＳＬＣ１２Ａ８；ＴＢＸ１５；ＺＤＨＨＣ１；ＺＮＦ３０４；ＺＮＦ５６８；ＺＮＦ６７１；ＣＮＮＭ１；ＤＯＣＫ２；ＤＴＸ１；ＦＥＲＭＴ３；ＯＰＬＡＨ；ＰＤＧＦＤ；ＰＫＩＡ；ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ；ＴＢＸ１５；ＴＳＰＹＬ５；ＶＡＶ３；ＦＥＲ１Ｌ４；及びＺＮＦ６７１から選択されるアノテーションを有する染色体領域）を試験で同定した。
本明細書に記載するように、技術により、結腸癌を高度に識別する多数のメチル化ＤＮＡマーカー及びそのサブセット（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれ以上のマーカーのセット）が提供される。実験では、高いシグナル対ノイズ比と低いバックグラウンドレベルを提供して、がんのスクリーニングまたは診断用に高い特異度及び選択性を提供するマーカーを同定するため、候補マーカーに対し選択フィルターを適用した。例えば、本明細書で以下に記載するように、１２のマーカーとがん胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質の組み合わせでは、試験したがん血漿試料のすべてに対し感度が６７．４％（がん８９例中６０例）であり、特異度９２．６％という結果であった。
したがって、本明細書では、対象から得た試料で結腸癌についてスクリーニングする方法に関する技術を提供し、かかる方法は、例えば対象から得た試料におけるマーカーのメチル化状態を評価するため、メチル化マーカーＤＮＡの量をアッセイすること、及びマーカーのメチル化状態が、腫瘍のない対象にてアッセイしたマーカーのメチル化状態と異なる場合に、かかる対象を結腸癌であると同定することを含む。いくつかの実施形態では、マーカーは、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ；ＣＨＳＴ２；ＧＲＩＮ２Ｄ；ＪＡＭ３；ＬＲＲＣ４；ＯＰＬＡＨ；ＳＥＰ９；ＳＦＭＢＴ２；ＳＬＣ１２Ａ８；ＴＢＸ１５；ＺＤＨＨＣ１；ＺＮＦ３０４；ＺＮＦ５６８；ＺＮＦ６７１；ＣＮＮＭ１；ＤＯＣＫ２；ＤＴＸ１；ＦＥＲＭＴ３；ＯＰＬＡＨ；ＰＤＧＦＤ；ＰＫＩＡ；ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ；ＴＢＸ１５；ＴＳＰＹＬ５；ＶＡＶ３；ＦＥＲ１Ｌ４；及びＺＮＦ６７１から選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む。いくつかの実施形態では、技術は、複数マーカーをアッセイすることを含み、例えば、２～２０、好ましくは２～１４、より好ましくは２～１２のマーカーをアッセイすることを含む。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩから選択される２つ以上のマーカーのメチル化ステータスの分析を含む。好ましい実施形態では、アッセイは、ＣＥＡタンパク質の検出を含む。
技術は、メチル化状態の評価に限定されない。いくつかの実施形態では、試料中のマーカーのメチル化状態評価は、１つの塩基のメチル化状態の決定を含む。いくつかの実施形態では、試料におけるマーカーのメチル化状態のアッセイには、複数の塩基におけるメチル化の程度を決定することを含む。さらに、いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態より、すなわち、腫瘍のない対象のＤＮＡにおけるマーカーのメチル化状態よりマーカーのメチル化が高いものを含む。いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態よりマーカーのメチル化が低いものを含む。いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態に対しマーカーのメチル化パターンが異なるものを含む。
いくつかの実施形態では、技術は、対象から得た試料の結腸腫瘍を報告する記録の作成方法を提供し、
ａ）対象から得た試料において、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ；ＣＨＳＴ２；ＧＲＩＮ２Ｄ；ＪＡＭ３；ＬＲＲＣ４；ＯＰＬＡＨ；ＳＥＰ９；ＳＦＭＢＴ２；ＳＬＣ１２Ａ８；ＴＢＸ１５；ＺＤＨＨＣ１；ＺＮＦ３０４；ＺＮＦ５６８；ＺＮＦ６７１；ＣＮＮＭ１；ＤＯＣＫ２；ＤＴＸ１；ＦＥＲＭＴ３；ＯＰＬＡＨ；ＰＤＧＦＤ；ＰＫＩＡ；ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ；ＴＢＸ１５；ＴＳＰＹＬ５；ＶＡＶ３；ＦＥＲ１Ｌ４；及びＺＮＦ６７１からなる群から選択される少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子の量について対象の試料をアッセイし、
ｂ）前記試料中の標準マーカーの量について前記試料をアッセイし、
ｃ）前記試料中の前記少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子の量と標準マーカー、好ましくはメチル化標準マーカーの量とを比較して、前記試料中の前記少なくとも１つのマーカー遺伝子のメチル化状態を決定し、
ｄ）前記試料中の前記少なくとも１つのマーカー遺伝子のメチル化状態を報告する記録を作成する
というステップを含む。
マーカーのメチル化状態を報告する記録は、特定形式の報告になんら限定されることはなく、例えば、電子カルテの更新、印刷された報告書、または電子メッセージを含んでよい。いくつかの実施形態では、アッセイ中に得られた検査データは報告に含まれるが、いくつかの実施形態では、データの概要、または少なくとも１つのマーカー遺伝子について決定されたメチル化状態に基づく診断結果のみが報告に含まれる。
いくつかの実施形態では、マーカーのうち少なくとも２つについて試料をアッセイし、好ましくは、少なくとも１つのメチル化マーカー遺伝子は、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩからなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩを含むマーカーの一群について試料をアッセイする。好ましい実施形態では、ＣＥＡタンパク質の存在について対象の試料をアッセイする。
いくつかの実施形態では、アッセイするために使用する方法は、ＤＮＡを含む試料を対象から得ること、及びかかる試料から得たＤＮＡを、得られたＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して修飾残基を生成する試薬で処理することを含む。好ましい実施形態では、試薬は重亜硫酸塩試薬を含む。
方法は、分析するメチル化マーカー領域の特定のサイズ、またはメチル化ステータスを分析するヌクレオチド数に限定されない。いくつかの実施形態では、試料中のＤＮＡマーカーのメチル化状態のアッセイは、１つの塩基のメチル化状態を決定することを含み、他の実施形態では、アッセイは、複数の塩基におけるメチル化の程度を決定することを含む。いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、マーカーの正常なメチル化状態よりマーカーのメチル化が高いまたは低いものを含むが、いくつかの実施形態では、マーカーのメチル化状態は、メチル化パターンの異なるもの、例えば、マーカーの正常なメチル化状態と比べて、マーカーのメチル化領域におけるメチル化ヌクレオチドのサブセットが異なるものを含む。
技術は、特定の試料種類に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、試料は、組織試料、血液試料、血清試料、または痰試料である。ある実施形態では、組織試料は結腸組織を含む。
技術は、ＤＮＡ試料をアッセイする特定の方法に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、アッセイには、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シークエンシング、質量分析法、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量による分離法、及び／または標的捕捉を使用することを含む。特定の好ましい実施形態では、アッセイには、フラップエンドヌクレアーゼ法を使用することを含む。特に好ましい実施形態では、試料ＤＮＡ及び／または標準マーカーＤＮＡを重亜硫酸塩により変換し、またＤＮＡのメチル化レベルを決定するアッセイは、メチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素解析、定量的バイサルファイトパイロシークエンス法、ＰＣＲ－フラップ法、フラップエンドヌクレアーゼ法、及び／またはバイサルファイトゲノムシークエンシングＰＣＲの使用を含む技法によって達成される。
いくつかの実施形態では、前記混合物中のオリゴヌクレオチドはレポーター分子を含み、好ましい実施形態では、かかるレポーター分子はフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドはフラップ配列を含む。いくつかの実施形態では、混合物はさらに、ＦＲＥＴカセットのうち１つ以上、ＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼ及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは細菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。
いくつかの実施形態では、使用する技術は、複数マーカー及び／または単一マーカーの複数領域の検出を、単一シグナル出力、例えば、単一蛍光色素に対する報告するアッセイを使用して、複数マーカー及び／または単一マーカーの複数領域を検出することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、アッセイは、複数の異なる標的部位に対して特異的なフラップエンドヌクレアーゼプローブの切断を、単一ＦＲＥＴカセットを介して報告するように構成される。
その後、いくつかの実施形態では、試料のアッセイは、少なくとも２つのメチル化マーカーＤＮＡを増幅させるための増幅試薬と、増幅させたマーカーＤＮＡでフラップエンドヌクレアーゼ法を実施するためのフラップ切断試薬とを含む反応混合物を調製することを含み、ここで、前記試薬は、
ｉ）メチル化マーカーＤＮＡの第１の増幅領域を生成する第１のプライマーペアと、
ｉｉ）ａ）メチル化マーカーＤＮＡの前記第１の増幅領域の少なくとも一部に相補的な配列を含み、かつ、ｂ）メチル化マーカーＤＮＡの前記第１の増幅領域に実質的に相補的ではない第１のフラップ配列を有するフラップ部分を含む、第１のプローブと、
ｉｉｉ）メチル化マーカーＤＮＡの第２の増幅領域を生成する第２のプライマーペアと、ｉｖ）ａ）メチル化マーカーＤＮＡの前記第２の領域の少なくとも一部に相補的な配列を含み、かつ、ｂ）メチル化マーカーＤＮＡの前記第２の増幅領域に実質的に相補的ではない前記第１のフラップ配列を有するフラップ部分を含む、第２のプローブと、
ｖ）ＤＮＡポリメラーゼと、
ｖｉ）フラップエンドヌクレアーゼと
を含む。
いくつかの実施形態では、メチル化マーカーＤＮＡの前記第１の増幅領域及びメチル化マーカーＤＮＡの前記第２の増幅領域を同一のメチル化マーカー遺伝子の異なる領域から増幅させ、また他の実施形態では、メチル化マーカーＤＮＡの第１の増幅領域及びメチル化マーカーＤＮＡの第２の増幅領域を異なるメチル化マーカー遺伝子から増幅させる。いくつかの好ましい実施形態では、少なくとも２つのメチル化マーカーＤＮＡの増幅は、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ；ＣＨＳＴ２；ＣＮＮＭ１；ＧＲＩＮ２Ｄ；ＪＡＭ３；ＬＲＲＣ４；ＯＰＬＡＨ；ＳＥＰ９；ＳＦＭＢＴ２；ＳＬＣ１２Ａ８；ＴＢＸ１５；ＺＤＨＨＣ１；ＺＮＦ３０４；ＺＮＦ５６８；ＺＮＦ６７１；ＤＯＣＫ２；ＤＴＸ１；ＦＥＲＭＴ３；ＯＰＬＡＨ；ＰＤＧＦＤ；ＰＫＩＡ；ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ；ＴＢＸ１５；ＴＳＰＹＬ５；ＶＡＶ３；ＦＥＲ１Ｌ４；及びＺＮＦ６７１からなる群から選択される少なくとも２つのメチル化マーカーＤＮＡを増幅させることを含む。
好ましい実施形態では、少なくとも２つのメチル化マーカーＤＮＡの増幅は、少なくとも３つのメチル化マーカーＤＮＡを増幅させることを含む。そのような実施形態では、試薬は、好ましくは、メチル化マーカーＤＮＡの第３の増幅領域を生成する第３のプライマーペアと、ａ）メチル化マーカーＤＮＡの第３の増幅領域の少なくとも一部に相補的な配列を含み、かつ、ｂ）メチル化ＤＮＡの第３の増幅領域に実質的に相補的ではない同一の第１のフラップ配列を有するフラップ部分を含む第３のプローブとを含んでよい。
いくつかの実施形態では、標準核酸にもアッセイを行う。そのような実施形態では、試薬はさらに、標準核酸の増幅領域を生成するための標準プライマーペアと、ａ）標準核酸の増幅領域の少なくとも一部に相補的な配列を含み、かつ、ｂ）標準核酸の増幅領域または第１のＦＲＥＴカセットに実質的に相補的ではない第２のフラップ配列を有するフラップ部分を含む標準プローブと、第２のフラップ配列に相補的な配列を含む第２のＦＲＥＴカセットとを含んでよい。
複数マーカー及び／または単一マーカーの複数領域の検出を単一のシグナル出力、例えば、単一蛍光色素に報告するアッセイを使用して、複数の核酸配列（例えば、複数マーカー及び／または単一マーカーの複数領域）を検出する技術は、メチル化の分析にも、また上述の試料種類もしくはマーカーの検出またはアッセイにも限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、技術は、試料中の少なくとも１つの標的核酸を検出することを含む、任意の試料（例えば、対象由来）を特徴付ける方法を提供し、ここで、試料中の前記少なくとも１つの標的核酸の前記検出は、少なくとも２つの異なる増幅ＤＮＡを生成するための増幅試薬と、少なくとも２つの異なる増幅ＤＮＡでフラップエンドヌクレアーゼ法を実施するためのフラップ切断試薬とを含む反応混合物を調製することを含み、ここで、前記試薬は、
ｉ）第１の増幅ＤＮＡを生成する第１のプライマーペアと、
ｉｉ）ａ）前記第１の増幅ＤＮＡの領域に相補的な配列を含み、かつ、ｂ）前記第１の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではない第１のフラップ配列を有するフラップ部分を含む、第１のプローブと、
ｉｉｉ）第２の増幅ＤＮＡを生成する第２のプライマーペアと、
ｉｖ）ａ）前記第２の増幅ＤＮＡの領域に相補的な配列を含み、かつ、ｂ）前記第２の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではない前記第１のフラップ配列を有するフラップ部分を含む、第２のプローブと、
ｖ）前記第１のフラップ配列に相補的な配列を含むＦＲＥＴカセットと、
ｖｉ）ＤＮＡポリメラーゼと、
ｖｉｉ）フラップエンドヌクレアーゼと
を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる標的ＤＮＡは、前記試料中の少なくとも２つの異なるマーカー遺伝子またはマーカー領域を含んでよいが、いくつかの実施形態では、少なくとも２つの異なる標的ＤＮＡは、試料中の単一マーカー遺伝子の少なくとも２つの異なる領域を含む。本明細書に開示する方法を使用して分析可能な核酸は、いかなる特定の種類の核酸にも限定されず、例えばＰＣＲによる、インビトロでの増幅のための標的として使用することができる核酸を含んでよい。いくつかの実施形態では、試料中の少なくとも１つの標的核酸の１つ以上はＲＮＡである。上述のように、方法は、２つのマーカーまたは領域の分析に限定されるものではなく、例えば、同一のＦＲＥＴカセットに報告する３つ、４つ、５つ、６つ、７つなどといった標的配列に応用してよい。さらに、あるアッセイの複数の異なる標的核酸を第１のＦＲＥＴカセットに報告させ、同一アッセイの複数の異なる標的を第２のＦＲＥＴカセットに報告させ、また同一アッセイの複数の異なる標的を第３のＦＲＥＴカセットに報告させるようにアッセイを組み合わせてよい。
技術はキットも提供する。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、第１の増幅ＤＮＡを生成する第１のプライマーペアと、ａ）前記第１の増幅ＤＮＡの領域に相補的な配列を含み、かつ、ｂ）前記第１の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではない第１のフラップ配列を有するフラップ部分を含む、第１のプローブと、第２の増幅ＤＮＡを生成する第２のプライマーペアと、ａ）前記第２の増幅ＤＮＡの領域に相補的な配列を含み、かつ、ｂ）前記第２の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではない前記第１のフラップ配列を有するフラップ部分を含む、第２のプローブと、前記第１のフラップ配列に相補的な配列を含むＦＲＥＴカセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、フラップエンドヌクレアーゼとを含む。
特定の好ましい実施形態では、技術は、ａ）ＡＮＫＲＤ１３Ｂ；ＣＨＳＴ２；ＧＲＩＮ２Ｄ；ＪＡＭ３；ＬＲＲＣ４；ＯＰＬＡＨ；ＳＥＰ９；ＳＦＭＢＴ２；ＳＬＣ１２Ａ８；ＴＢＸ１５；ＺＤＨＨＣ１；ＺＮＦ３０４；ＺＮＦ５６８；ＺＮＦ６７１；ＣＮＮＭ１；ＤＯＣＫ２；ＤＴＸ１；ＦＥＲＭＴ３；ＯＰＬＡＨ；ＰＤＧＦＤ；ＰＫＩＡ；ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ；ＴＢＸ１５；ＴＳＰＹＬ５；ＶＡＶ３；ＦＥＲ１Ｌ４；及びＺＮＦ６７１からなる群から選択されるマーカーに対し少なくとも一部が特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含み、かつ、ｂ）標準核酸に対し少なくとも一部が特異的にハイブリダイズする少なくとも１つのさらなるオリゴヌクレオチドを含むキットを提供する。好ましい実施形態では、キットは、ＣＥＡタンパク質を検出するアッセイを含む。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも２つのさらなるオリゴヌクレオチドを含み、いくつかの実施形態では、キットはさらに重亜硫酸塩試薬を含む。
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩからなる群から選択されるマーカーの少なくとも１つに特異的にハイブリダイズする。好ましい実施形態では、キットは、少なくとも１２のオリゴヌクレオチドを含み、ここで、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩからなる群のマーカーの各々は、１２オリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つに特異的にハイブリダイズする。
好ましい実施形態では、キットで提供されるオリゴヌクレオチド（複数可）は、捕捉用オリゴヌクレオチド、核酸プライマー一対、核酸プローブ、及び侵入オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上から選択される。
いくつかの実施形態では、上述キットのいずれか１つはさらに、固体支持体、例えば、磁気ビーズまたは磁気粒子などを含む。好ましい実施形態では、固体支持体は、１つ以上の捕捉用試薬、例えば、前記１つ以上のマーカー遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドを含む。
技術は、組成物も提供する。例えば、いくつかの実施形態では、技術は、第１の増幅ＤＮＡを生成する第１のプライマーペアと、ａ）第１の増幅ＤＮＡの領域に相補的な配列を含み、かつ、ｂ）第１の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではない第１のフラップ配列を有するフラップ部分を含む、第１のプローブと、第２の増幅ＤＮＡを生成する第２のプライマーペアと、ａ）第２の増幅ＤＮＡの領域に相補的な配列を含み、かつ、ｂ）第２の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではない前記第１のフラップ配列を有するフラップ部分を含む、第２のプローブと、前記第１のフラップ配列に相補的な配列を含むＦＲＥＴカセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、フラップエンドヌクレアーゼとを含む混合物、例えば反応混合物を含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、組成物はさらに、第１の増幅ＤＮＡ及び第２の増幅ＤＮＡを含み、ここで、第１のプローブは第２の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではなく、第２のプローブは第１の増幅ＤＮＡに実質的に相補的ではない。いくつかの実施形態では、組成物は、ＤＮＡに結合させたプライマーまたはプローブを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ；ＣＨＳＴ２；ＧＲＩＮ２Ｄ；ＪＡＭ３；ＬＲＲＣ４；ＯＰＬＡＨ；ＳＥＰ９；ＳＦＭＢＴ２；ＳＬＣ１２Ａ８；ＴＢＸ１５；ＺＤＨＨＣ１；ＺＮＦ３０４；ＺＮＦ５６８；ＺＮＦ６７１；ＣＮＮＭ１；ＤＯＣＫ２；ＤＴＸ１；ＦＥＲＭＴ３；ＯＰＬＡＨ；ＰＤＧＦＤ；ＰＫＩＡ；ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ；ＴＢＸ１５；ＴＳＰＹＬ５；ＶＡＶ３；ＦＥＲ１Ｌ４；及びＺＮＦ６７１からなる群から選択される標的核酸と、標的核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとの複合体を含む。好ましい実施形態では、混合物は、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩからなる群から選択される標的核酸と、標的核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとの複合体を含む。混合物中のオリゴヌクレオチドには、捕捉用オリゴヌクレオチド、核酸プライマー一対、ハイブリダイゼーションプローブ、加水分解プローブ、フラップ法プローブ、及び侵入オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上が挙げられるが、これに限定されるものではない。
いくつかの実施形態では、混合物中の標的核酸は、配列番号１、６、１１、１６、２１、２６、３１、３６、４１、４６、５１、５６、６１、６６、７１、７６、８１、８６、９１、９６、１０１、１０６、１１１、１１６、１２１、１２６、１３１、及び１３６からなる群から選択される核酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、混合物は、配列番号２、７、１２、１７、２２、２７、３２、３７、４２、４７、５２、５７、６２、６７、７２、７７、８２、８７、９２、９７、１０２、１０７、１１２、１１７、１２２、１２７、１３２、及び１３７からなる群から選択される核酸配列を含む重亜硫酸塩変換した標的核酸を含む。
［定義］
本願技術を理解しやすいよう、多数の用語及び語句を以下に定義する。さらなる定義は、詳細な説明を通して記載される。
明細書及び請求項全体をとおして、以下の用語は、文脈で特に明確に指示されない限り、本明細書に明示的に関連付けられた意味を持つ。本明細書で使用する語句「一実施形態では」とは、同一の実施形態の場合もあるが、必ずしも同一実施形態を指すわけではない。さらに、本明細書で使用する語句「別の実施形態では」とは、異なる実施形態の場合もあるが、必ずしも異なる実施形態を指すわけではない。したがって、以下に記載するように、本発明のさまざまな実施形態は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく容易に組み合わされ得る。
さらに、本明細書で使用する場合、用語「または」は、包含的な操作詞「または」であり、文脈で特に明確に指示されない限り、用語「及び／または」と同義である。用語「に基づいた」は、限定的なものではなく、文脈で特に明確に指示されない限り、記載のないさらなる要因に基づくことを認めるものである。さらに、本明細書を通じて、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味には複数の指示対象が含まれる。「での（ｉｎ）」の意味には、「での（ｉｎ）」及び「で（ｏｎ）」が含まれる。
Ｉｎ ｒｅ Ｈｅｒｚ，５３７ Ｆ．２ｄ ５４９，５５１－５２，１９０ ＵＳＰＱ
４６１，４６３（ＣＣＰＡ １９７６）で考察されているように、本出願の請求項で使用される移行句「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ
ｏｆ）」は、請求の範囲を、明記される材料またはステップ、ならびに特許請求する発明の「基本的及び新規な特徴（複数可）に実質的に影響を与えないもの」に限定する。例えば、記述されている要素「から本質的になる」組成物は、純粋な組成物、すなわち、記述されている成分「からなる」組成物と比較した場合に、記述されていない交雑物を、たとえ存在していても、その交雑物が記述されている組成物の機能を改変させないようなレベルで含有してよい。
本明細書で使用する場合、「メチル化」とは、シトシンのＣ５位もしくはＮ４位におけるシトシンのメチル化、アデニンのＮ６位におけるメチル化、または他の種類の核酸メチル化を指す。典型的なインビトロでのＤＮＡ増幅法では増幅鋳型のメチル化パターンは保持されないため、インビトロで増幅させたＤＮＡは通常は非メチル化ＤＮＡである。しかしながら、「非メチル化ＤＮＡ」または「メチル化ＤＮＡ」はそれぞれ、元の鋳型が非メチル化またはメチル化されていた増幅ＤＮＡも指し得る。
したがって、本明細書で使用する場合、「メチル化ヌクレオチド」または「メチル化ヌクレオチド塩基」とは、認識されている典型的ヌクレオチド塩基には存在しないメチル部分がヌクレオチド塩基上に存在することを指す。例えば、シトシンはそのピリミジン環にメチル部分を含有しないが、５－メチルシトシンはそのピリミジン環の５位にメチル部分を含有する。したがって、シトシンはメチル化ヌクレオチドではなく、５－メチルシトシンはメチル化ヌクレオチドである。別の例では、チミンはそのピリミジン環の５位にメチル部分を含有するが、本明細書の目的上、チミンはＤＮＡの典型的ヌクレオチド塩基であるため、ＤＮＡに存在する場合、チミンをメチル化ヌクレオチドとはみなさない。
本明細書で使用する場合、「メチル化核酸分子」とは、１つ以上のメチル化ヌクレオチドを含有する核酸分子を指す。
本明細書で使用する場合、核酸分子の「メチル化状態」、「メチル化プロファイル」、及び「メチル化ステータス」とは、核酸分子における１つ以上のメチル化ヌクレオチド塩基の有無を指す。例えば、メチル化シトシンを含有している核酸分子はメチル化しているとみなされる（例えば、核酸分子のメチル化状態はメチル化である）。メチル化ヌクレオチドを含有しない核酸分子は非メチル化であるとみなされる。
特定の核酸配列（例えば、本明細書に記載する遺伝子マーカーまたはＤＮＡ領域）のメチル化状態は、その配列内のあらゆる塩基のメチル化状態を示し得るか、またはその配列内部の塩基（例えば、１つ以上のシトシン）のサブセットのメチル化状態を示し得るか、またはその配列内部の局所的メチル化密度に関する情報を、メチル化が生じている配列内部の正確な位置情報とともに、もしくは位置情報なしで示し得る。
核酸分子におけるヌクレオチド座位のメチル化状態とは、核酸分子の特定の座位におけるメチル化ヌクレオチドの有無を指す。例えば、核酸分子の７番目のヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化状態は、その核酸分子の７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドが５－メチルシトシンであればメチル化である。同様に、核酸分子の７番目のヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化状態は、核酸分子の７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドがシトシンであれば（かつ５－メチルシトシンでなければ）非メチル化である。
メチル化ステータスは、任意選択で、「メチル化値」によって表すかまたは示すことができる（例えば、メチル化の頻度、量、比、百分率などを表す）。メチル化値は、例えば、メチル化依存性制限酵素を用いた制限消化後に存在する完全状態の核酸の量の定量、または重亜硫酸塩反応後の増幅プロファイルの比較、または重亜硫酸塩処理核酸と未処理核酸の配列比較によって生成され得る。したがって、値、例えば、メチル化値はメチル化ステータスを表すため、ある座位の複数コピーにわたるメチル化ステータスの定量的指標として使用することができる。これは、試料の配列のメチル化ステータスを閾値または基準値と比較することが望ましい場合の、具体的な使用法である。
本明細書で使用する場合、「メチル化頻度」または「メチル化率（％）」は、分子または座位が非メチル化である例数に対する、当該分子または座位がメチル化である例数を指す。
したがって、メチル化状態は、核酸（例えば、ゲノム配列）のメチル化の状態を表す。さらに、メチル化状態とは、メチル化に関連する特定のゲノム遺伝子座における核酸セグメントの特徴を指す。そのような特徴には、このＤＮＡ配列内にメチル化されたシトシン（Ｃ）残基があるか否か、メチル化Ｃ残基（複数可）の位置、核酸の任意の特定領域にわたるメチル化Ｃの頻度または割合、及び、例えばアレルの起源の違いなどによる、アレルのメチル化の違いが挙げられるが、これに限定されるものではない。用語「メチル化状態」、「メチル化プロファイル」、及び「メチル化ステータス」もまた、相対濃度、絶対濃度、または生体試料における核酸の任意の特定領域にわたるメチル化Ｃもしくは非メチル化Ｃのパターンを指す。例えば、核酸配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）がメチル化されている場合には、これを「高メチル化」または「メチル化が高い」と呼ばれ得、またＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）がメチル化されていない場合は、「低メチル化」または「メチル化が低い」と呼ばれ得る。同様に、ある核酸配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）が別の核酸配列（例えば、異なる領域に由来するかまたは異なる個体に由来するものなど）と比較した場合にメチル化されていれば、その配列は、もう一方の核酸配列と比べて高メチル化である、またはメチル化が高いとみなされる。別法として、ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基（複数可）が別の核酸配列（例えば、異なる領域に由来するかまたは異なる個体に由来するものなど）と比較した場合にメチル化されていなければ、その配列は、もう一方の核酸配列と比べて低メチル化である、またはメチル化が低いとみなされる。さらに、本明細書で使用する用語「メチル化パターン」とは、ある核酸のある領域にわたる、メチル化ヌクレオチド及び非メチル化ヌクレオチドの部位をまとめたものを指す。２つの核酸が、その領域にわたるメチル化ヌクレオチド及び非メチル化ヌクレオチドの数は同数または同様であるがメチル化ヌクレオチド及び非メチル化ヌクレオチドの位置が異なる場合は、メチル化頻度またはメチル化率は、同一または同様であるがメチル化パターンは異なり得る。配列が、メチル化の程度（例えば、一方の配列のメチル化が他方のそれと比べて高いかまたは低い）、頻度、またはパターンにおいて異なる場合、それらの配列は「特異的にメチル化されている」または「メチル化に特異性がある」または「異なるメチル化状態にある」という。用語「特異的メチル化」とは、がん陰性試料における核酸メチル化のレベルまたはパターンと比較した場合の、がん陽性試料における核酸メチル化のレベルまたはパターンの相違を指す。この用語は、術後にがんの再発がある患者と再発がない患者間のレベルまたはパターンの相違も指し得る。特異的メチル化及びＤＮＡのメチル化の個々のレベルまたはパターンは、例えば、一旦正しいカットオフまたは予測的特徴が定義された後は、予後及び予測のバイオマーカーとなる。
メチル化状態頻度は、個体集団または単一個体から得た試料を表すために使用することができる。例えば、メチル化状態頻度が５０％であるヌクレオチド座位は、例の５０％がメチル化であり、例の５０％が非メチル化である。そのような頻度を使用して、例えば、個体集団または核酸コレクションの、ヌクレオチド座位または核酸領域がメチル化されている度合いを明らかにすることができる。したがって、核酸分子の第１の集団またはプールでのメチル化が、核酸分子の第２の集団またはプールでのメチル化とは異なる場合、第１の集団またはプールのメチル化状態頻度は、第２の集団またはプールのメチル化状態頻度とは異なる。また、そのような頻度を使用して、例えば、単一個体におけるヌクレオチド座位または核酸領域がメチル化されている度合いを明らかにすることもできる。例えば、そのような頻度を使用して、ヌクレオチド座位または核酸領域において、組織試料由来の細胞群のメチル化または非メチル化の度合いを明らかにすることができる。
本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド座位」とは、核酸分子におけるヌクレオチドの位置を指す。メチル化ヌクレオチドのヌクレオチド座位とは、核酸分子におけるメチル化ヌクレオチドの位置を指す。
典型的に、ヒトＤＮＡのメチル化は、隣り合うグアニンとシトシンを含み、シトシンがグアニンの５’位に位置するジヌクレオチド配列（ＣｐＧジヌクレオチド配列とも呼ばれる）で生じる。ヒトゲノムではＣｐＧジヌクレオチド内の大部分のシトシンはメチル化されるが、一部のシトシンは、ＣｐＧアイランドと呼ばれるＣｐＧジヌクレオチドリッチな特定のゲノム領域で非メチル化のままである（例えば、Ａｎｔｅｑｕｅｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ ６２：５０３－５１４を参照のこと）。
本明細書で使用する場合、「ＣｐＧアイランド」とは、総ゲノムＤＮＡに対しＣｐＧジヌクレオチド数を多く含有している、ゲノムＤＮＡのＧ：Ｃリッチ領域を指す。ＣｐＧアイランドは長さが少なくとも１００、２００、またはそれ以上の塩基対であり得、その場合、その領域のＧ：Ｃ含量は少なくとも５０％、予測ＣｐＧ頻度に対する実測ＣｐＧ頻度の比は０．６であるが、いくつかの例では、ＣｐＧアイランドは長さが少なくとも５００塩基対であり得、その場合、その領域のＧ：Ｃ含量は少なくとも５５％、予測ＣｐＧ頻度に対する実測ＣｐＧ頻度の比は０．６５である。予測ＣｐＧ頻度に対する実測ＣｐＧ頻度は、Ｇａｒｄｉｎｅｒ－Ｇａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：２６１－２８１に記載の方法に従って計算することができる。例えば、予測ＣｐＧ頻度に対する実測ＣｐＧ頻度は、式Ｒ＝（Ａ×Ｂ）／（Ｃ×Ｄ）に従って計算することができ、ここで、Ｒは予測ＣｐＧ頻度に対する実測ＣｐＧ頻度の比であり、Ａは分析配列中のＣｐＧジヌクレオチド数であり、Ｂは分析配列中の総ヌクレオチド数であり、Ｃは分析配列中の総Ｃヌクレオチド数であり、Ｄは分析配列中の総Ｇヌクレオチド数である。メチル化状態は典型的にＣｐＧアイランド内、例えば、プロモーター領域で決定される。しかし、ＣｐＡ及びＣｐＴなど、ヒトゲノムの他の配列もＤＮＡメチル化を受けやすいことを理解されよう（Ｒａｍｓａｈｏｙｅ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：５２３７－５２４２；Ｓａｌｍｏｎ ａｎｄ Ｋａｙｅ（１９７０）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２０４：３４０－３５１；Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２８２７－２８４２；Ｎｙｃｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４３５３－４３６７；Ｗｏｏｄｃｏｃｋ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４５：８８８－８９４を参照のこと）。
本明細書で使用する場合、「メチル化特異的試薬」とは、核酸分子のヌクレオチドを、かかる核酸分子のメチル化状態と相関して修飾する試薬を指すか、またはメチル化特異的試薬とは、核酸分子のヌクレオチド配列を、その核酸分子のメチル化状態を反映させて変えることができる化合物もしくは組成物または他の薬剤を指す。そのような試薬で核酸分子を処理する方法には、核酸分子と試薬を接触させ、必要に応じさらなるステップを組み合わせてヌクレオチド配列に所望の変化をもたらすことが含まれ得る。そのような方法を適用して、非メチル化ヌクレオチド（例えば、非メチル化シトシンの各々）が修飾されて異なるヌクレオチドになるようにすることができる。例えば、いくつかの実施形態では、そのような試薬は、非メチル化シトシンヌクレオチドを脱アミノ化させてデオキシウラシル残基を生成させる。例示的な試薬は重亜硫酸塩試薬である。
用語「重亜硫酸塩試薬」とは、重亜硫酸塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、またはその組み合わせを含む試薬であり、本明細書に開示するように、メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列との区別に有用なものを指す。前記処理方法は当該技術分野で公知である（例えば、各々が参照によりその全体が組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５及びＷＯ２０１３／１１６３７５）。いくつかの実施形態では、ｎ－アルキレングリコールまたはジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）などに限定されない変性溶媒の存在下、またはジオキサンまたはジオキサン誘導体などの存在下で重亜硫酸塩処理を行う。いくつかの実施形態では、変性溶媒を１％～３５％の濃度（ｖ／ｖ）で使用する。いくつかの実施形態では、例えば６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン２－カルボン酸などのクロマン誘導体、またはトリヒドロキシ安息香酸及びその誘導体、例えば、没食子酸（参照によりその全体が組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照のこと）などに限定されないスカベンジャーの存在下で重亜硫酸塩反応を実施する。特定の好ましい実施形態では、重亜硫酸塩反応は、例えば、ＷＯ２０１３／１１６３７５に記載のような、亜硫酸水素アンモニウムでの処理を含む。
また、メチル化特異的試薬で核酸ヌクレオチド配列を変化させることにより、各メチル化ヌクレオチドが修飾されて異なるヌクレオチドになっている核酸分子がもたらされ得る。
用語「メチル化アッセイ」とは、核酸の配列内の１つ以上のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を決定するあらゆるアッセイを指す。
本明細書で使用する場合、所与のマーカー（または共に使用するマーカーセット）の「感度」とは、腫瘍性試料と非腫瘍性試料を区別する閾値を上回るＤＮＡメチル化値を報告する試料の割合を指す。いくつかの実施形態では、陽性とは、閾値を上回るＤＮＡメチル化値（例えば、疾患に関連する範囲）を報告する組織学的に確認された腫瘍と定義され、偽陰性とは、閾値を下回るＤＮＡメチル化値（例えば、どの疾患にも関連しない範囲）を報告する組織学的に確認された腫瘍と定義される。したがって、感度の値は、既知の罹患試料から得た所与のマーカーのＤＮＡメチル化測定値が疾患関連測定値の範囲内となる確率を反映する。ここで定義するように、計算により求めた感度値の臨床的意義は、ある臨床状態にある対象に適用した場合に、その状態の存在を所与のマーカーが検出するであろう確率推定を表す。
本明細書で使用する場合、所与のマーカー（または共に使用するマーカーセット）の「特異度」とは、腫瘍性試料と非腫瘍性試料を区別する閾値を下回るＤＮＡメチル化値を報告する非腫瘍性試料の割合を指す。いくつかの実施形態では、陰性とは、閾値を下回るＤＮＡメチル化値（例えば、どの疾患にも関連しない範囲）を報告する組織学的に確認された非腫瘍性試料と定義され、偽陽性とは、閾値を上回るＤＮＡメチル化値（例えば、疾患に関連する範囲）を報告する組織学的に確認された非腫瘍性試料と定義される。したがって、特異性の値は、既知の非腫瘍性試料から得た所与のマーカーのＤＮＡメチル化測定値が非疾患関連測定値の範囲内となる確率を反映する。ここで定義するように、計算により求めた特異性値の臨床的意義は、ある臨床状態にない患者に適用した場合に、その状態にないことを所与のマーカーが検出するであろう確率推定を表す。
本明細書で使用する場合、「選択ヌクレオチド」とは、核酸分子で典型的に出現する４つのヌクレオチド（ＤＮＡではＣ、Ｇ、Ｔ、及びＡ、及びＲＮＡではＣ、Ｇ、Ｕ、及びＡ）のうちの１つのヌクレオチドを指し、これには、典型的に出現するヌクレオチドのメチル化誘導体（例えば、Ｃが選択ヌクレオチドの場合、メチル化Ｃと非メチル化Ｃの両方が選択ヌクレオチドの意味に含まれる）が含まれ得るが、メチル化選択ヌクレオチドとは具体的には、典型的にメチル化されているヌクレオチドを指し、非メチル化選択ヌクレオチドとは具体的には、典型的に非メチル化形態で出現するヌクレオチドを指す。
用語「メチル化特異的制限酵素」または「メチル化感受性制限酵素」とは、その認識部位のメチル化状態に依存して核酸を選択的に消化する酵素を指す。認識部位がメチル化されていないかまたはヘミメチル化されている場合に特異的に切断する制限酵素の場合、認識部位がメチル化されていれば切断は起こらない、または起きたとしても効率は有意に低いであろう。認識部位がメチル化されている場合に特異的に切断する制限酵素の場合、認識部位がメチル化されていなければ切断は起こらない、または起きたとしても効率は有意に低いであろう。メチル化特異的制限酵素が好ましく、それらの認識配列はＣＧジヌクレオチドを含有する（例えば、ＣＧＣＧまたはＣＣＣＧＧＧのような認識配列）。いくつかの実施形態では、このジヌクレオチド内のシトシンが炭素原子Ｃ５でメチル化されている場合に切断しない制限酵素がさらに好ましい。
用語「プライマー」とは、例えば制限消化物から得た核酸断片として非人工物として生じるか、合成により製造されるかを問わず、核酸鋳型鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が開始される条件に置かれた場合（例えば、ＤＮＡポリメラーゼなどの開始剤とヌクレオチドの存在下、適切な温度及びｐＨにおいて）、合成開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅効率を最大にするため一本鎖が好ましいが、あるいは二本鎖でもよい。二本鎖の場合、まずプライマーの鎖を分離する処理をし、それから伸長産物を調製するのに使用する。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、開始剤の存在下での伸長産物の合成を開始させるために十分に長くなければならない。プライマーの厳密な長さは、温度、プライマーの供給源、及びその方法の使用法など多くの因子に依存するであろう。
用語「プローブ」とは、精製された制限消化物中でのように非人工物として生じるか、合成、組換え、またはＰＣＲ増幅により製造されるかを問わず、関心対象の別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド（例えば、一連のヌクレオチド）を指す。プローブは、一本鎖でも二本鎖でもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定、及び単離に有用である（例えば、「捕捉プローブ」）。本発明で使用する任意のプローブは、実施形態によっては、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、ならびに酵素を用いる組織化学分析）、蛍光システム、放射性システム、及び発光システムなどを含むがこれらに限定されない任意の検出システムにおいて検出可能なように任意の「レポーター分子」で標識してよいことが意図される。本発明は、特定の検出システムまたは標識に限定されることを意図しない。
用語「標的」とは、本明細書で使用する場合、他の核酸から、例えば、プローブ結合、増幅、単離、捕捉などによって選別することが求められる、ある核酸を指す。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応に関して使用する場合、「標的」とは、ポリメラーゼ連鎖反応に使用したプライマーが結合している核酸の領域を指し、また標的ＤＮＡを増幅させないアッセイ、例えば、侵入切断法を行ういくつかの実施形態で使用する場合には、標的は、プローブ及び侵入オリゴヌクレオチド（例えば、ＩＮＶＡＤＥＲオリゴヌクレオチド）が結合して侵入切断構造を形成し、それにより標的核酸の存在を検出することができるような部位を含む。「セグメント」は、標的配列内の核酸の領域と定義される。
用語「マーカー」とは、本明細書で使用する場合、非正常細胞（例えば、がん細胞）と正常細胞の区別を、例えば、マーカー物質の存在の有無、またはステータス（例えば、メチル化状態）に基づいて行うために使用され得る物質（例えば、核酸、または核酸の領域、またはタンパク質）を指す。
本明細書で使用する用語「腫瘍」とは、組織の新生かつ異常な増殖を指す。したがって、腫瘍は、前悪性腫瘍または悪性腫瘍であり得る。
用語「腫瘍特異的マーカー」とは、本明細書で使用する場合、腫瘍の存在を示すのに使用することができる任意の生物学的な物質または要素を指す。生物学的物質の例には、限定することなく、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂肪酸、細胞成分（例えば、細胞膜及びミトコンドリア）、及び全細胞が含まれる。いくつかの例では、マーカーは、特定の核酸領域（例えば、遺伝子、遺伝子内領域、特定の遺伝子座など）である。マーカーである核酸の領域は、例えば、「マーカー遺伝子」、「マーカー領域」、「マーカー配列」、「マーカー座位」などと呼んでよい。
用語「試料」は、その最も広い意味で使用される。ある意味では、動物の細胞または組織を指す。別の意味では、供給源、ならびに生体試料及び環境試料から得た検体または培養物を指す。生体試料は、植物または動物（ヒトを含む）から得てよく、液体、固形物、組織、及びガスが包含される。環境試料には、地表物質試料、土壌試料、水試料、及び産業による試料などの環境物質が含まれる。これらの例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定するものと解釈されるべきではない。
本明細書で使用する場合、用語「患者」または「対象」とは、技術により提供されるさまざまな試験の対象となる生物を指す。用語「対象」には、動物、好ましくはヒトを含む哺乳類が含まれる。好ましい実施形態では、対象は霊長類である。さらにより好ましい実施形態では、対象はヒトである。さらに、診断方法に関しては、好ましい対象は脊椎動物である対象である。好ましい脊椎動物は温血動物であり、好ましい温血脊椎動物は哺乳類である。好ましい哺乳類は、最も好ましくはヒトである。本明細書で使用する場合、用語「対象」には、ヒト及び動物いずれの対象も含まれる。したがって、本明細書では、動物治療での使用法を提供する。そのため、本願技術は、ヒトなどの哺乳類、ならびにアムールトラなどの絶滅の危機にあることから重要とされる哺乳類、人間による消費用に農場で飼育される動物などの経済的に重要な哺乳類、及び／またはペットとして飼われている、もしくは動物園で飼育されている動物など、人間にとって社会的に重要な哺乳類の診断を提供する。そのような動物の例としては、ネコ及びイヌなどの肉食動物；ブタ（ｐｉｇ）、雄ブタ、及びイノシシなどを含むブタ（ｓｗｉｎｅ）；ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダなどの反芻動物及び／または有蹄動物；ひれ足動物；ならびにウマが挙げられるが、これに限定されるものではない。したがって、家畜の診断及び治療もまた提供され、それらとしては、飼育されているブタ、反芻動物、有蹄動物、ウマ（競走馬を含む）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。本願に開示の主題にはさらに、対象の結腸癌を診断するシステムが含まれる。システムは、例えば、生体試料を採取した対象において、結腸癌のリスクについてスクリーニングを行う、または結腸癌の診断を行うために使用することができる、市販のキットとして提供され得る。本願技術に従って提供される例示的なシステムには、本明細書に記載するマーカーのメチル化状態を評価することが含まれる。
核酸において用語「増幅させる」または「増幅」とは、複数コピーのポリヌクレオチド、またはかかるポリヌクレオチドの一部分を生成させることを指し、典型的に少量のポリヌクレオチド（例えば、単一ポリヌクレオチド分子）から開始し、その場合、増幅産物またはアンプリコンは概して検出可能である。ポリヌクレオチドの増幅には、さまざまな化学過程及び酵素過程が包含される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，４９４，８１０号を参照のこと）中に、標的ＤＮＡ分子または鋳型ＤＮＡ分子の１コピーもしくは少数コピーから複数のＤＮＡコピーが生成されるのは、増幅という形態である。増幅のさらなる種類としては、アレル特異的ＰＣＲ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，６３９，６１１号を参照のこと）、アセンブリＰＣＲ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，９６５，４０８号を参照のこと）、ヘリカーゼ依存性増幅（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，６６２，５９４号を参照のこと）、ホットスタートＰＣＲ（例えば、各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，７７３，２５８号及び第５，３３８，６７１号を参照のこと）、配列間特異的ＰＣＲ、インバースＰＣＲ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＴｒｉｇｌｉａ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１６：８１８６を参照のこと）、ライゲーション媒介ＰＣＲ（例えば、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＧｕｉｌｆｏｙｌｅ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：１８５４－１８５８（１９９７）；米国特許第５，５０８，１６９号を参照のこと）、メチル化特異的ＰＣＲ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＨｅｒｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）ＰＮＡＳ ９３（１３）９８２１－９８２６を参照のこと）、ミニプライマーＰＣＲ、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅法（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｃｈｏｕｔｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０（１２）：ｅ５７を参照のこと）、マルチプレックスＰＣＲ（例えば、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６（２３）１１１４１－１１１５６；Ｂａｌｌａｂｉｏ，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８４（６）５７１－５７３；Ｈａｙｄｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００８）ＢＭＣ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９：８０を参照のこと）、ネステッドＰＣＲ、重複エクステンションＰＣＲ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＨｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６（１５）７３５１－７３６７を参照のこと）、リアルタイムＰＣＲ（例えば、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＨｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：４１３－４１７；Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１０２６－１０３０を参照のこと）、逆転写ＰＣＲ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｕｓｔｉｎ，Ｓ．Ａ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２５：１６９－１９３を参照のこと）、固相ＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲ、及びタッチダウンＰＣＲ（例えば、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＤｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）１９（１４）４００８；Ｒｏｕｘ，Ｋ．（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６（５）８１２－８１４；Ｈｅｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２０（３）４７８－４８５を参照のこと）が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、ポリヌクレオチドの増幅もデジタルＰＣＲを使用して達成することができる（例えば、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫａｌｉｎｉｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２５；１９９９－２００４，（１９９７）；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９６；９２３６－４１，（１９９９）；国際特許公開第ＷＯ０５０２３０９１Ａ２号；米国特許出願公開第２００７０２０２５２５号を参照のこと）。
用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）とは、クローニングまたは精製を行うことなくゲノムまたは他のＤＮＡもしくはＲＮＡの混合物における標的配列のセグメントの濃度を高める方法が記載されている、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，９６５，１８８号の方法を指す。標的配列を増幅させるこの方法は、所望の標的配列を含有している大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーをＤＮＡ混合物に導入すること、それに続き、ＤＮＡポリメラーゼ存在下で正確な一連のサーマルサイクリングを行うことからなる。２つのプライマーはそれぞれ、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅を実行するには、混合物を変性させ、その後、標的分子内のプライマー相補配列にプライマーをアニールする。アニーリングの後、新たな一対の相補鎖が形成されるようポリメラーゼを用いてプライマーを伸長させる。変性、プライマーアニーリング、及びポリメラーゼ伸長の各ステップを何度も繰り返し行って（すなわち、変性、アニーリング及び伸長で１つの「サイクル」を構成し、「サイクル」数は多数になり得る）、所望の標的配列が高濃度で増幅されたセグメントを得ることができる。所望の標的配列の増幅セグメントの長さはプライマーの互いの相対的位置により決定されるため、この長さは管理可能なパラメータである。工程が繰り返し行われることから、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）と呼ばれる。混合物中では標的配列の所望の増幅セグメントが主要配列となる（濃度の点で）ので、それらのセグメントを「ＰＣＲ増幅産物」及びは「ＰＣＲ産物」または「アンプリコン」と言う。当業者は、用語「ＰＣＲ」は、例えば、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、単一プライマー及び任意プライムＰＣＲなどを使用する、本来の記載方法の多くの変形を包含することを理解できよう。
本明細書で使用する場合、用語「核酸検出法」とは、関心対象核酸のヌクレオチド組成を決定する任意の方法を指す。核酸検出法には、ＤＮＡ塩基配列決定法、プローブハイブリダイゼーション法、構造特異的切断法（例えば、ＩＮＶＡＤＥＲ法（Ｈｏｌｏｇｉｃ，Ｉｎｃ．）（例えば、米国特許第５，８４６，７１７号、第５，９８５，５５７号、第５，９９４，０６９号、第６，００１，５６７号、第６，０９０，５４３号、及び第６，８７２，８１６号；Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２９２（１９９９），Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，ＵＳＡ，９７：８２７２（２０００）、及びＵＳ２００９／０２５３１４２に記載されており、その各々はあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）；ミスマッチの酵素的切断法（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｖａｒｉａｇｅｎｉｃｓ社の米国特許第６，１１０，６８４号、第５，９５８，６９２号、第５，８５１，７７０号）；上述のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；分岐ハイブリダイゼーション法（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｉｒｏｎ社の米国特許第５，８４９，４８１号、第５，７１０，２６４号、第５，１２４，２４６号、及び第５，６２４，８０２号）；ローリングサークル複製（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２１０，８８４号、第６，１８３，９６０号、及び第６，２３５，５０２号）；ＮＡＳＢＡ（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，４０９，８１８号）；分子ビーコン法（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１５０，０９７号）；Ｅ－センサー法（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｏｔｏｒｏｌａ社の米国特許第６，２４８，２２９号、第６，２２１，５８３号、第６，０１３，１７０号、及び第６，０６３，５７３号）；サイクリングプローブ法（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，４０３，７１１号、第５，０１１，７６９号、及び第５，６６０，９８８号）；Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇシグナル増幅法（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１２１，００１号、第６，１１０，６７７号、第５，９１４，２３０号、第５，８８２，８６７号、及び第５，７９２，６１４号）；リガーゼ連鎖反応（例えば、Ｂａｒａｎａｙ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８，１８９－９３（１９９１））；ならびにサンドイッチハイブリダイゼーション法（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，２８８，６０９号）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
いくつかの実施形態では、標的核酸を増幅させ（例えば、ＰＣＲにより）、侵入切断法を同時に使用して増幅核酸を検出する。増幅法と組み合わせた検出法（例えば、侵入切断法）実施用に構成された試験法は米国特許第９，０９６，８９３号に記載されており、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＱｕＡＲＴＳ法と呼ばれる、増幅法と侵入切断法を併用するさらなる検出構成は、例えば、その各々があらゆる目的のために参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３６１，７２０号、第８，７１５，９３７号、第８，９１６，３４４号、及び第９，２１２，３９２号に記載されている。本明細書で使用する用語「侵入切断構造」とは、ｉ）標的核酸、ｉｉ）上流核酸（例えば、侵入オリゴヌクレオチドまたは「ＩＮＶＡＤＥＲ」オリゴヌクレオチド）、及びｉｉｉ）下流核酸（例えば、プローブ）を含む切断構造を指し、その場合、上流及び下流の核酸が標的核酸の連続領域にアニールし、下流核酸と標的核酸との間で形成された二重鎖と、上流核酸の３’部分との間に重複が形成される。重複は、上流及び下流の核酸に由来する１つ以上の塩基が標的核酸の塩基に対して同じ位置を占有する箇所で生じ、上流核酸の重複塩基（複数可）が標的核酸と相補的であるか否か、またそれらの塩基が天然塩基であるか非天然塩基であるかは問わない。いくつかの実施形態では、下流の二重鎖と重複する上流核酸の３’部分は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，０９０，５４３号などに例えば開示されている芳香環構造のような、塩基以外の化学部分である。いくつかの実施形態では、核酸の１つ以上を、例えば、核酸のステムループのような共有結合を介して、または核酸以外の化学結合（例えば、多重炭素鎖）を介して互いに結合させてよい。本明細書で使用する場合、用語「フラップエンドヌクレアーゼ法」には、上述のような「ＩＮＶＡＤＥＲ」侵入切断法及びＱｕＡＲＴＳ法が含まれる。
用語「プローブオリゴヌクレオチド」または「フラップオリゴヌクレオチド」とは、フラップ法に関して使用する場合、侵入オリゴヌクレオチドの存在下で標的核酸と相互作用して切断構造を形成するオリゴヌクレオチドを指す。
用語「侵入オリゴヌクレオチド」は、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション領域に隣接する位置で標的核酸とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指し、ここで、侵入オリゴヌクレオチドの３’末端は、プローブと標的とのハイブリダイゼーション領域と重複する部分（例えば、化学部分、または１つ以上のヌクレオチド）を含む。侵入オリゴヌクレオチドの３’末端のヌクレオチドは、標的内のヌクレオチドと塩基対を形成しても形成しなくてもよい。いくつかの実施形態では、侵入オリゴヌクレオチドはその３’末端において、標的鎖にアニールするプローブオリゴヌクレオチドの一部分の５’末端に位置する配列と実質的に同一な配列を含有する。
用語「フラップエンドヌクレアーゼ」または「ＦＥＮ」とは、本明細書で使用する場合、核酸分解酵素の一クラス、典型的に５’ヌクレアーゼを指し、これらは、核酸の別の鎖で置換されている（例えば、その一本鎖と二本鎖ＤＮＡとの間の接合部に重複ヌクレオチドができるよう）ほうの一本鎖に５’突出末端、すなわちフラップを含有する二重鎖を有しているＤＮＡ構造上で構造特異的エンドヌクレアーゼとして作用する。ＦＥＮは、一本鎖ＤＮＡと二本鎖ＤＮＡの接合部におけるホスホジエステル結合の加水切断を触媒し、突出末端、すなわちフラップを遊離させる。フラップエンドヌクレアーゼは、Ｃｅｓｋａ及びＳａｖｅｒｓ（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９８ ２３：３３１－３３６）及びＬｉｕら（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４ ７３：５８９－６１５）により概説されている。ＦＥＮは、個々の酵素、多重サブユニット酵素であっても、または別の酵素もしくはタンパク質複合体（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の活性として存在してもよい。
フラップエンドヌクレアーゼは熱安定であってよい。例えば、保存記録のある好熱性生物のＦＥＮ－１フラップエンドヌクレアーゼは典型的に熱安定性である。本明細書で使用する場合、用語「ＦＥＮ－１」とは、真核生物または古細菌生物に由来する非ポリメラーゼフラップエンドヌクレアーゼを指す。例えば、あらゆる目的のために参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ０２／０７０７５５、及びＫａｉｓｅｒ Ｍ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：２１３８７を参照のこと。
本明細書で使用する場合、用語「切断フラップ」とは、フラップ法の切断産物である一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。
用語「カセット」とは、フラップ切断反応に関して使用する場合、例えば、フラップ切断法で形成された一次または第１の切断構造において、フラップまたはプローブオリゴヌクレオチドの切断に応答して検出可能シグナルを発生するよう構成されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組み合わせを指す。好ましい実施形態では、カセットは、フラップオリゴヌクレオチドの切断により生成された非標的である切断産物とハイブリダイズして第２の重複切断構造を形成し、その後、かかるカセットが同一酵素、例えば、ＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼによって切断され得るようになっている。
いくつかの実施形態では、カセットは、ヘアピン部分（すなわち、反応条件下でカセットオリゴヌクレオチドの一部分が同オリゴヌクレオチドの第２の部分とハイブリダイズし、二重鎖を形成する領域）を含む単一オリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、カセットは、反応条件下で二重鎖を形成することができる相補部分を含む少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。好ましい実施形態では、カセットは、標識、例えば、フルオロフォアを含む。特に好ましい実施形態では、カセットは、ＦＲＥＴ効果を出す標識部分を含む。そのような実施形態では、カセットは、「ＦＲＥＴカセット」と呼ばれ得る。例えば、その各々があらゆる目的のために参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１５年１０月３０日に出願された米国特許出願第６２／２４９，０９７号、２０１６年１０月２６日に出願された第１５／３３５，０９６号；及び２０１６年１０月２６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／５８８７５号も参照のこと。
本明細書において、プローブのフラップまたはアームに関して「実質的に相補的ではない」という語句を使用する場合、そのフラップ部分は、指定のアニーリング条件下またはストリンジェントな条件下で核酸配列、例えば、標的核酸または増幅ＤＮＡと選択的にハイブリダイズしないほど十分に非相補的であることを意味し、「実質的に非相補的」及び「完全に非相補的」という用語を包含する。
用語「相補的」とは、本明細書で使用する場合、プライマーまたはプローブが、例えば指定のアニーリング条件下またはストリンジェントな条件下で標的核酸配列に対し、選択的にハイブリダイズするのに十分に相補的であることを意味し、「実質的に相補的」及び「完全に相補的」という用語を包含する。
本明細書で使用する場合、用語「ＦＲＥＴ」とは、部分（例えば、フルオロフォア）が、例えば、部分同士で、またはフルオロフォアから非フルオロフォア（例えば、クエンチャー分子）へとエネルギーを移動させるプロセスである蛍光共鳴エネルギー移動を指す。いくつかの状況では、ＦＲＥＴでは、短距離（例えば、約１０ｎｍ以下）の双極子－双極子相互作用によって、エネルギーがより低い受容体フルオロフォアへとエネルギーを移動させる励起された供与体フルオロフォアが使用される。他の状況では、ＦＲＥＴでは、供与体からの蛍光エネルギーの損失、及び受容体フルオロフォアにおける蛍光の増加が使用される。さらなる他の形態のＦＲＥＴでは、励起された供与体フルオロフォアから非蛍光分子（例えば、「ダーク」クエンチ分子）へエネルギーが交換され得る。ＦＲＥＴは当業者に公知であり、これまでに記載がある（例えば、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｔｒｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：８１９；Ｓｅｌｖｉｎ，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２４６：３００；Ｏｒｐａｎａ，２００４ Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ ２１，４５－５０；Ｏｌｉｖｉｅｒ，２００５ Ｍｕｔａｎｔ Ｒｅｓ ５７３，１０３－１１０を参照のこと）。
例示的なフラップ検出法では、侵入オリゴヌクレオチド及びフラップオリゴヌクレオチドを標的核酸とハイブリダイズさせ、上記のような重複を有する第１の複合体を作製する。対になっていない「フラップ」はフラップオリゴヌクレオチドの５’末端上に含まれている。第１の複合体は、フラップオリゴヌクレオチドを切断して５’フラップ部分を遊離させるフラップエンドヌクレアーゼ、例えば、ＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼの基質である。二次反応では、遊離した５’フラップ産物は、ＦＲＥＴカセットでの侵入オリゴヌクレオチドとして使用され、再びフラップエンドヌクレアーゼにより認識される構造を作り、ＦＲＥＴカセットが切断されるようにする。フルオロフォア及びクエンチャーがＦＲＥＴカセットの切断により分離されると、バックグラウンドの蛍光より高い検出可能な蛍光シグナルが生成される。
本明細書で使用する用語「リアルタイム」とは、核酸増幅またはシグナル増幅の検出に関して使用する場合、反応の進行中、例えば、インキュベーション中またはサーマルサイクリング中の、反応における産物またはシグナルの蓄積の検出または測定を指す。そのような検出または測定は、継続的に行われる、または増幅反応の進行中に行われる、またはその組み合わせのいずれであってもよい。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応では、検出（例えば、蛍光の検出）は、サーマルサイクリングの全部もしくは一部の進行中に行われても、または１つ以上のサイクル中の１つ以上のポイントで一過性に行われてもよい。いくつかの実施形態では、ＰＣＲまたはＱｕＡＲＴＳ反応のリアルタイム検出は、サイクルごと、または複数サイクルの各々における同一ポイント（例えば、サイクルの時点、またはサイクルの温度ステップ）での蛍光レベルを決定することによって達成される。増幅のリアルタイム検出は、増幅反応「中」検出とも呼ばれる。
本明細書で使用する場合、用語「定量的増幅データセット」とは、標的試料、例えば、標的ＤＮＡの定量的増幅中に得たデータを指す。定量的ＰＣＲまたはＱｕＡＲＴＳ法の場合、定量的増幅データセットは、増幅中、例えば、複数のサーマルサイクルまたはすべてのサーマルサイクルの間に得た蛍光値を集めたものである。定量的増幅についてのデータは、反応の特定のポイントにおける収集データに限定されるものではなく、各サイクルの別個のポイントで、または各サイクルを通して継続的に蛍光を測定してよい。
本明細書で使用する略語「Ｃｔ」及び「Ｃｐ」は、リアルタイムＰＣＲ及びＰＣＲ＋ＩＮＶＡＤＥＲ法の間に収集されたデータに関して使用する場合、シグナル（例えば、蛍光シグナル）が、陽性シグナルであることを示す所定の閾値と交差しているサイクルを指す。濃度に対するシグナルの決定因子として使用する閾値の計算にはさまざまな方法が使用されており、その値は一般に、「交差閾値（ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）」（Ｃｔ）または「交点（ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）」（Ｃｐ）で表される。本明細書で提示する方法の実施形態では、アッセイまたは試料中の変異型構成要素及び／または非変異型構成要素の割合決定のためのリアルタイムシグナル分析には、Ｃｐ値またはＣｔ値のいずれを使用してもよい。
本明細書で使用する場合、用語「対照」とは、核酸の検出または分析に関して使用する場合、実験上の標的（例えば、濃度が不明の核酸）との比較で使用するための、既知の特徴（例えば、既知配列、既知である細胞あたりのコピー数）を有する核酸を指す。対照は内在性であってよく、アッセイの被験核酸または標的核酸をそれにあわせて正規化できるインバリアント遺伝子が好ましい。そのような正規化により、例えば、試料処理、アッセイ効率などで生じ得る試料間のばらつきが調節され、試料間のデータを正確に比較することができる。ヒト試料での核酸検出法の正規化に利用される遺伝子には、例えば、β－アクチン、ＺＤＨＨＣ１、及びＢ３ＧＡＬＴ６が含まれる（例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１４／９６６，６１７号及び第６２／３６４，０８２号を参照のこと）。
対照は、外部の対照であってもよい。例えば、ｑＰＣＲ、ＱｕＡＲＴＳなどのような定量的アッセイでは、「キャリブレーター」または「キャリブレーション用対照」は、配列が既知である核酸、例えば、実験上の標的核酸の一部と配列が同じであり、濃度または濃度系列（例えば、定量的ＰＣＲで較正曲線作成用に段階希釈した対照標的）が既知である核酸である。典型的に、実験ＤＮＡで使用した場合と同じ試薬及び反応条件を使用してキャリブレーション用対照を分析する。ある実施形態では、キャリブレーターの測定は、例えば同一サーマルサイクラーで、実験アッセイと同時に行う。好ましい実施形態では、複数のキャリブレーターを単一プラスミドに含めて、異なるキャリブレーター配列を等モル量で容易に得られるようにしてよい。特に好ましい実施形態では、プラスミドキャリブレーターを、例えば１つ以上の制限酵素で、消化させてキャリブレーター部分をプラスミドベクターから遊離させる。例えば、参照により本明細書に含まれるＷＯ２０１５／０６６６９５を参照のこと。いくつかの実施形態では、キャリブレーターＤＮＡは合成されたものであり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１５／１０５，１７８号に記載されている。
本明細書で使用する「ＺＤＨＨＣ１」とは、Ｃｈｒ１６上のヒトＤＮＡ（１６ｑ２２．１）に位置し、ＤＨＨＣパルミトイル転移酵素ファミリーに属するジンクフィンガー、ＤＨＨＣ－ｔｙｐｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １として特徴付けられているタンパク質をコードする遺伝子を指す。
本明細書で使用する場合、用語「プロセス対照」とは、プロセスの有効性を評価し、また方法の成功または失敗を決定することができるよう、抽出後に測定可能な標的ＤＮＡの抽出前に試料に加える外因性分子、例えば、外因性核酸を指す。使用するプロセス対照核酸の性質は通常、アッセイの種類及び測定対象となる物質に依存する。例えば、使用するアッセイが、二本鎖ＤＮＡまたはそこに含まれる変異の検出及び／または定量を目的とするのであれば、二本鎖ＤＮＡプロセス対照は典型的に予備抽出試料に添加される。同様に、ｍＲＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡをモニターするアッセイの場合、使用プロセス対照は典型的にＲＮＡ転写産物または合成ＲＮＡである。例えば、参照により本明細書に組み込まれ、ヒト試料のプロセス対照としてゼブラフィッシュのＤＮＡを使用することが記載されている、２０１６年７月１９日に出願された米国特許出願第６２／３６４，０４９号を参照のこと。
本明細書で使用する場合、用語「ゼブラフィッシュのＤＮＡ」は、大量の「魚類ＤＮＡ」（例えば、精製したサケＤＮＡ）とは異なり、Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏから単離されたＤＮＡ、またはＤａｎｉｏ ｒｅｒｉｏのＤＮＡに見られるヌクレオチド配列を有するようインビトロで作製された（例えば、酵素により、合成により）ＤＮＡを指す。好ましい実施形態では、ゼブラフィッシュのＤＮＡは、メチル化ＤＮＡであり、検出可能な対照ＤＮＡ、例えば、試料のプロセシング各工程を通してのＤＮＡ回収を検証するためのプロセス対照として加えられる。特に、ＲＡＳＳＦ１遺伝子の少なくとも一部を含むゼブラフィッシュＤＮＡは、米国特許出願第６２／３６４，０４９号に記載されるように、プロセス対照、例えばヒト試料用のプロセス対照として利用される。
本明細書で使用する場合、用語「魚類ＤＮＡ」は、ゼブラフィッシュのＤＮＡとは異なるものであり、例えば、米国特許第９，２１２，３９２号に記載のように、魚類から単離された大量の（例えば、ゲノム）ＤＮＡを指す。大量に精製された魚類ＤＮＡは市販されており、例えば、タラ及び／またはニシンの精子ＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはサケＤＮＡ（ＵＳＢ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の形態で提供されている。
本明細書で使用する場合、用語「粒子」及び「ビーズ」は同じ意味で使用され、また用語「磁性粒子」及び「磁気ビーズ」は同じ意味で使用され、磁場に応答する粒子またはビーズを指す。典型的に、磁性粒子は、磁場を持たないが、磁場に曝露されると磁気双極子を形成する材料、例えば、磁場の存在下で磁化されることはできるが、そのような磁場がない場合はそれ自体は磁性ではない材料を含む。これに関して使用する用語「磁性」には、常磁性材料または超常磁性材料が含まれる。本明細書で使用する場合、用語「磁性」とは、一時的磁性材料、例えば、キュリー温度が低い強磁性またはフェリ磁性の材料などをも包含するが、そのような一時的磁性材料は、そのような材料を含有するシリカ磁性粒子が生物学的物質単離のため本願方法に従い使用される温度域では常磁性である。
本明細書で使用する場合、用語「キット」とは、物質送達用の任意の送達システムを指す。反応アッセイにおいては、そのような送達システムには、ある場所から別の場所まで、反応試薬（例えば、適切な容器に入ったオリゴヌクレオチド、酵素など）及び／または支持材料（例えば、緩衝液、アッセイ実施のための説明書など）の保存、輸送、もしくは送達を可能にするシステムが含まれる。例えば、キットには、関連する反応試薬及び／または支持材料を含有する１つ以上の同封物（例えば、箱）が含まれる。本明細書で使用する場合、用語「細分化キット」とは、キットの全構成要素を細分したものを含有する２つ以上の別個の容器を含む送達システムを指す。容器は、送達が意図されるレシピエントにまとめて送達されるかまたは別々に送達されてよい。例えば、第１の容器はアッセイで使用する酵素を含有し、第２の容器はオリゴヌクレオチドを含有してよい。
本明細書で使用する用語「システム」とは、特定の目的に使用するための物品の集合体を指す。いくつかの実施形態では、物品は、使用説明書、例えば、物品上、紙面、または記録可能媒体（例えば、ＤＶＤ、ＣＤ、フラッシュドライブなど）で提供される情報を含む。いくつかの実施形態では、説明書は使用者に対しオンラインの場所、例えば、ウェブサイトへ行くよう指示をする。
本明細書で使用する場合、用語「情報」とは、事実またはデータの任意の集合体を指す。インターネットを含むがこれに限定されない、コンピュータシステム（複数可）を使用して保存または処理した情報に関して使用する場合、「情報」という用語は、任意の形式（例えば、アナログ形式、デジタル形式、光形式など）で保存されたあらゆるデータを指す。本明細書で使用する場合、用語「対象に関する情報」とは、対象（例えば、ヒト、植物、または動物）に関連する事実またはデータを指す。用語「ゲノム情報」とは、核酸配列、遺伝子、メチル化率、アレル頻度、ＲＮＡ発現レベル、タンパク質発現、遺伝子型と相関する表現型などを含むがこれに限定されない、ゲノムに関連する情報を指す。「アレル頻度情報」とは、アレル頻度に関連する事実またはデータを指し、これには、アレル同一性、アレルの存在と対象（例えば、ヒト対象）の特徴間の統計的相関、個体または集団におけるアレルの存在の有無、１つ以上の特定の特徴を有する個体にアレルが存在する尤度（％）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
図１Ａ～図１ＡＧは、マーカー標的領域の未変換型及び重亜硫酸塩変換型の概略図を示す。重亜硫酸塩変換された標的ＤＮＡ検出用のフラップ法のプライマー及びプローブを示す。 図２Ａ～図２Ｈは、核酸配列及び対応する配列番号の表を提供する。 図３Ａ～図３Ｌは、実施例２のアッセイから得たデータ及び結果を示す表を提供する。 図４Ａ～図４Ｅは、実施例２のアッセイから得たデータ及び結果を示す表を提供する。 図５は、ＰＣＲと侵入切断法の複合アッセイ（「ＰＣＲ－フラップ法」）、例えば、ＱｕＡＲＴＳ法を示す略図を提供し、ここでは、標的核酸、例えば、メチル化マーカーの３つの異なる領域を、それら異なる領域の各々について特異的なプライマーペアで増幅させるが、その際、異なるフラッププローブの存在下で行い、各フラッププローブは異なる領域のうちの１領域について特異的であるが、それぞれのフラップアーム配列は同一である。フラップは、ＰＣＲ－フラップ法それぞれの進行中、すべてのレポートを同一のＦＲＥＴカセットに送り、同一フルオロフォアからの蛍光シグナルを生成させる。
本明細書では、ＤＮＡ、例えば、メチル化ＤＮＡの検出及び定量を行うアッセイで使用するための核酸マーカーの選択及び使用に関する技術を提供する。特に、技術は、結腸癌検出にメチル化アッセイを使用することに関する。
ここでのさまざまな実施形態についての詳細な説明では、説明を目的として、開示の実施形態が十分に理解されるよう具体的な詳細が多数記載されている。しかしながら、これらの具体的な詳細を用いても用いなくても、これらのさまざまな実施形態を実施してよいことを当業者は理解するであろう。他の例では、構造及びデバイスをブロック図形式で示している。さらに、当業者は、方法を提示し、実施している具体的な順序は例示的なものであり、かかる順序は、本明細書に開示する各種実施形態の趣旨及び範囲内に留まりつつ変更可能であることが意図されることを容易に理解できる。
いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡの分析は、複数の異なるＤＮＡを単一反応で分析することを含む。増幅反応のリアルタイム検出用の典型的な計測手段では、一度に検出及び定量を行うことができるのは３～５種の蛍光色素のみである。これは、主に、励起及び／または放出スペクトルが重複する多くの色素を一緒に使用した場合に、フルオロフォア間のスペクトルが重複するため、ある色素と別の色素の区別が困難になるからである。生物学的検体から特定の疾患を検出するために約５種以上の異なるマーカーを含むパネルを必要とする場合はこれが問題となり、特に、試料の大きさが小さく、マーカーが低レベルでしか存在しない場合、状況によっては一つの試料の全部を一回の増幅実施で使用しなければならないことが多い。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、各試料に同一色素から結果を生じさせることによって、同一試料で複数の異なるマーカーの検出を可能にする。ここに詳述する実施形態では、複数の異なるマーカー用の多重化フラップ切断法（例えば、ＱｕＡＲＴＳフラップエンドヌクレアーゼ法）では、同じＦＲＥＴカセットを使用して蛍光シグナルを生成する最初の切断産物が複数生成される。
好ましい実施形態では、複合アッセイは、いくつかの異なるプローブオリゴヌクレオチドを含み、その各々は、異なる標的核酸とハイブリダイズする部分を有するが、どのプローブオリゴヌクレオチドも本質的に同一の５’アーム配列を有する。各プローブそれぞれの標的核酸存在下でプローブが切断されると、すべてのプローブから同じ５’アームが遊離され、その後、遊離したすべてのアームは、同一フラップ結合配列及び同一色素を有するＦＲＥＴカセットと結合し、エンドヌクレアーゼのＦＲＥＴカセット切断により蛍光シグナルが生成される。他の実施形態では、異なる標的に対するプローブは、異なるフラップアームを有して異なるＦＲＥＴカセットに報告してよく、その場合、かかる異なるＦＲＥＴカセットにはいずれも同じレポーターフルオロフォアが使用される。
このような様態でアッセイを組み合わせることには多数の利点がある。例えば、状態（例えば、大腸癌のような疾患状態）に関連する標的配列のいずれかがアッセイで検出されれば、試料を複数の異なるアッセイに分割しなくても一つの試料から結果得ることができる。さらに、標的配列の２つ以上からそのような結果が得られた場合、これらのシグナルを単一色素チャンネルに統合すれば、バックグラウンドに対するより強いシグナルを得ることができ、アッセイ結果にさらなる確実性を提供することができる。本明細書に記載の方法の開発中、驚くべきことに、複数の異なる標的配列を検出するために多数のプライマーとフラップ法用プローブを組み合わせ、共有ＦＲＥＴカセットと共に用い、増幅とフラップ切断法を合せて１回で反応させたところ、標的ではない対照または陰性試料でのバックグラウンドシグナルは増強しないことがわかった。
いくつかの実施形態では、単一ＦＲＥＴカセット及び単一色素チャンネルに報告する異なる標的配列は、異なるマーカー遺伝子または領域に由来しなくてもよいが、単一マーカー（例えば、単一メチル化マーカー遺伝子）内の異なる領域に由来し得る。実施例４に記載のように、すべての領域が、例えば、単一ＦＲＥＴカセットを介して、単一色素に報告する一度のアッセイで単一マーカー遺伝子の複数領域を検出するようアッセイを構成することにより、反応物中に存在する標的遺伝子の複数コピーからの検出可能シグナルのレベルが増強される。
さらに別の実施形態では、検出されるべき異なる標的配列は、異なるマーカー（複数可）の１つ以上の領域の混合物であってよいほか、１つのマーカーの複数の領域の混合物であってよい。異なる標的配列は、ＱｕＡＲＴＳ増幅／フラップ切断法などのアッセイで検出可能な、メチル化マーカー、変異マーカー、欠失、挿入、または他の任意の様態の核酸変異型の任意の組み合わせを含んでよい。
いくつかの実施形態では、マーカーは１００以下の塩基からなる領域であるか、マーカーは５００以下の塩基からなる領域であるか、マーカーは１０００以下の塩基からなる領域であるか、マーカーは５０００以下の塩基からなる領域であるか、または、いくつかの実施形態では、マーカーは１つの塩基である。いくつかの実施形態では、マーカーはＣｐＧ高密度プロモーター内にある。
技術は試料の種類により限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、試料は、糞便試料、組織試料、痰、血液試料（例えば、血漿、血清、全血）、排泄物、または尿試料である。
さらに、技術は、メチル化状態の決定に使用される方法に限定されない。いくつかの実施形態では、アッセイには、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シークエンシング、質量分析法、チップまたはアレイのハイブリダイゼーション、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量による分離法、または標的捕捉を使用することを含む。いくつかの実施形態では、アッセイには、メチル化特異的オリゴヌクレオチドの使用を含む。いくつかの実施形態では、技術では、メチル化状態を決定する超並列シークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）、例えば、合成時解読、リアルタイム（例えば、単一分子）シークエンシング、ビーズエマルジョンシークエンシング、ナノポアシークエンシングなどを使用する。
技術により、特異的メチル化領域（ＤＭＲ）検出用試薬が提供される。いくつかの実施形態では、染色体領域に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドが提供される。キットの実施形態、例えば、重亜硫酸塩試薬；及びＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩから選択されるアノテーションを有し、かつ、がん（例えば、結腸癌）ではない対象に関連するメチル化状態を有する染色体領域を含む対照核酸を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、重亜硫酸塩試薬及び本明細書に記載するオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、そのような染色体領域に由来する配列を含み、かつ、結腸癌である対象に関連するメチル化状態を有する対照核酸と、重亜硫酸塩試薬とを含む。
技術は、組成物（例えば、反応混合物）の実施形態に関連する。いくつかの実施形態では、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む核酸ならびに重亜硫酸塩試薬を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む核酸ならびに本明細書に記載するオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む核酸ならびにメチル化感受性制限酵素を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む核酸ならびにポリメラーゼを含む組成物が提供される。
対象から得た試料で腫瘍（例えば、結腸癌腫）のスクリーニングを行うための関連方法のさらなる実施形態を提供し、例えば、方法は、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩから選択されるアノテーションを有する染色体領域の塩基を含む試料におけるマーカーのメチル化状態を決定すること；対象試料のマーカーのメチル化状態と、結腸癌ではない対象の正常対照試料のマーカーのメチル化状態とを比較すること；ならびに信頼区間及び／または対象試料のメチル化状態と正常対照試料のメチル化状態との差のｐ値を決定することを含む。いくつかの実施形態では、信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％または９９．９９％であり、ｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、または０．０００１である。方法のいくつかの実施形態では、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む核酸を重亜硫酸塩試薬と反応させて、重亜硫酸塩と反応した核酸を生成させる；重亜硫酸塩と反応した核酸のシークエンシングを行い、重亜硫酸塩と反応した核酸のヌクレオチド配列を得る；重亜硫酸塩と反応した核酸のヌクレオチド配列と、結腸癌ではない対象の染色体領域を含む核酸のヌクレオチド配列とを比較し、２配列間の違いを特定する；違いが存在する場合、かかる対象を腫瘍があるとして同定する、という各ステップが提供される。
対象から得た試料で結腸癌についてスクリーニングするシステムが本技術により提供される。システムの例示的な実施形態には、例えば、対象から得た試料で結腸癌についてスクリーニングするシステムが含まれ、かかるシステムは、試料のメチル化状態を決定するよう構成される分析構成要素、対象から得た試料のメチル化状態とデータベースに記録されている対照試料または標準試料のメチル化状態とを比較するよう構成されるソフトウェア構成要素、及び、がん関連メチル化状態であることを使用者に警告するよう構成される警告構成要素を含む。いくつかの実施形態では、警告は、複数のアッセイから結果を受け取るソフトウェア構成要素によって決定される（例えば、複数マーカー、例えば、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩから選択されるアノテーションを有する染色体領域などのメチル化状態を決定し、値または結果を計算して複数の結果に基づく報告を行う）。いくつかの実施形態では、値もしくは結果を計算する際に使用するための、本明細書で提供するＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩから選択されるアノテーションを有する各染色体領域に関連する加重パラメータのデータベース、及び／または使用者（例えば、医師、看護婦、臨床医など）に報告する警告が提供される。いくつかの実施形態では、複数のアッセイの全結果が報告され、実施形態によっては、１つ以上の結果を使用して、複数アッセイからの１つ以上の結果の複合に基づいた、対象の結腸癌リスクを示すスコア、値、または結果が提供される。
システムのいくつかの実施形態では、試料は、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、システムはさらに、核酸を単離する構成要素、糞便試料を採取する構成要素など試料を採取する構成要素を含む。いくつかの実施形態では、システムは、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、データベースは、結腸癌ではない対象の核酸配列を含む。また、核酸、例えば、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩから選択されるアノテーションを有する染色体領域を含む配列を各々が有する核酸のセットも提供される。
関連システムの実施形態は、記載の核酸セット、及びかかる核酸セットに関連する核酸配列のデータベースを含む。いくつかの実施形態はさらに重亜硫酸塩試薬を含む。また、いくつかの実施形態ではさらに、核酸シークエンサーを含む。
ある実施形態では、ヒト対象から得られた試料の特徴付けを行う方法を提供し、かかる方法は、ａ）ヒト対象から試料を得ること、ｂ）試料中の１つ以上のマーカーのメチル化状態をアッセイすること、ただし、かかるマーカーは、ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩからなるマーカー群から選択されるアノテーションを有する染色体領域の塩基を含む、ｃ）アッセイしたマーカーのメチル化状態と、腫瘍のない対象でアッセイしたマーカーのメチル化状態とを比較することを含む。
いくつかの実施形態では、技術は、本明細書で生体試料において同定されるマーカーの１つ以上の存在とメチル化状態を評価することに関連する。これらのマーカーは、本明細書で論じる１つ以上の特異的メチル化領域（ＤＭＲ）を含む。メチル化状態は、技術の実施形態で評価される。したがって、本明細書で提供する技術は、遺伝子のメチル化状態を測定する方法に拘束されない。例えば、いくつかの実施形態では、ゲノムスキャニング法によりメチル化状態を測定する。例えば、ある方法では、ランドマーク制限酵素切断部位によるゲノムスキャニング（Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：７４２１－７４２７）が行われ、また別の例では、メチル化感受性の任意プライムＰＣＲ（Ｇｏｎｚａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：５９４－５９９）が行われる。いくつかの実施形態では、メチル化感受性制限酵素でゲノムＤＮＡを消化させ、その後、関心領域のサザン解析を行うことにより（消化－サザン方法）、特定のＣｐＧ部位でのメチル化パターンの変化をモニターする。いくつかの実施形態では、メチル化パターンの変化の分析には、ＰＣＲ増幅に先立ちメチル化感受性制限酵素でゲノムＤＮＡを消化させる、ＰＣＲを用いた方法を使用する（Ｓｉｎｇｅｒ－Ｓａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６８７）。さらに、メチル化解析の出発点としてＤＮＡの重亜硫酸塩処理を利用する他の技法が報告されている。これらには、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）（Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６）及び重亜硫酸塩で変換したＤＮＡから増幅させたＰＣＲ産物の制限酵素による消化（Ｓａｄｒｉ ａｎｄ Ｈｏｒｎｓｂｙ（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０５８－５０５９；及びＸｉｏｎｇ ａｎｄ Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４）が含まれる。遺伝子変異を検出するためのＰＣＲ法、（Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１１４３－１１４７）及びアレル特異的発現を定量するためのＰＣＲ法（Ｓｚａｂｏ ａｎｄ Ｍａｎｎ（１９９５）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：３０９７－３１０８；及びＳｉｎｇｅｒ－Ｓａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＰＣＲ
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．１：１６０－１６３）が開発されている。そのような技法ではインターナルプライマーが使用され、ＰＣＲで作製された鋳型とアニールしてアッセイ対象の単一ヌクレオチドの５’で直接末端を形成する。いくつかの実施形態では、米国特許第７，０３７，６５０号に記載されている「定量的Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ法」を使用する方法を利用する。
メチル化状態を評価する際、メチル化状態は、特定の部位（例えば、単一ヌクレオチド、特定の領域または座位、より長い関心配列、例えば、最高約１００ｂｐ、２００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐ、またはそれ以上のＤＮＡ部分列）を含む試料中のＤＮＡ集団全体に対する、その特定部位でメチル化されているＤＮＡの個々の鎖の量または割合として表されることが多い。従来より、非メチル化核酸の量はキャリブレーターを用いるＰＣＲによりを決定される。その後、既知量のＤＮＡを重亜硫酸塩処理し、得られるメチル化特異的配列を、リアルタイムＰＣＲまたは他の指数級数的増幅法、例えば、ＱｕＡＲＴＳ法（例えば、米国特許第８，３６１，７２０号、第８，７１５，９３７号、第８，９１６，３４４号、及び第９，２１２，３９２号）を使用して決定する。
例えば、いくつかの実施形態では、方法は、外部標準を用いて非メチル化標的の検量線を作成することを含む。検量線は、少なくとも２つのポイントから作成され、非メチル化ＤＮＡのリアルタイムＣｔ値を既知の定量標準と関連付ける。その後、メチル化標的の第２の検量線を、少なくとも２つのポイント及び外部標準から作成する。この第２の検量線は、メチル化ＤＮＡのＣｔを既知の定量標準と関連付ける。次に、被験試料のＣｔ値をメチル化集団及び非メチル化集団で決定し、最初の２ステップで得た検量線からＤＮＡのゲノム当量を計算する。関心部位におけるメチル化の割合は、集団における総ＤＮＡ量に対するメチル化ＤＮＡの量から計算し、例えば、（メチル化ＤＮＡ数）／（メチル化ＤＮＡ数＋非メチル化ＤＮＡ数）×１００となる。
また、本明細書は、方法を実施するための組成物及びキットを提供する。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のマーカーに対して特異的な試薬（例えば、プライマー、プローブ）を単独またはセット（例えば、複数マーカーを増幅させるプライマーペアのセット）で提供する。検出法を行うためのさらなる試薬も提供され得る（例えば、ＱｕＡＲＴＳ法、ＰＣＲ法、シークエンシング、重亜硫酸塩法、または他のアッセイを行うための陽性対照と陰性対照、酵素、緩衝液など）。いくつかの実施形態では、方法の実施に必要であるか、十分であるか、または有用である１つ以上の試薬を含有するキットを提供する。また、試薬を含有する反応混合物も提供される。複数の試薬を含有するマスターミックス試薬セットをさらに提供し、これを、それぞれ互いに加える、及び／または被験試料に加えて完全な反応混合物としてよい。
これらのアッセイ技術に好適なＤＮＡ単離方法は当該技術分野で公知である。特に、いくつかの実施形態は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，０００，１４６号に記載のような核酸の単離を含む。
ゲノムＤＮＡは、市販のキットを使用するなど任意の手段で単離され得る。簡単に言えば、関心ＤＮＡを細胞膜で封入する場合は、生体試料を破壊して酵素手段、化学的手段または機械的手段により溶解させる必要がある。その後で、ＤＮＡ溶液からタンパク質及び他の汚染物質を、例えば、プロテイナーゼＫを用いた消化などにより除去してよい。その後、溶液からゲノムＤＮＡを回収する。これは、塩析、有機抽出、または固相支持体へのＤＮＡ結合など、多種多様な方法を手段として実施され得る。どの方法を選択するかは、時間、費用、及び必要とされるＤＮＡ量などいくつかの因子により影響される。腫瘍性物質または前腫瘍性物質を含むどの種類の臨床試料でも本願方法での使用に好適であり、例えば、細胞株、組織学的スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、糞便、結腸排出液、尿、血漿、血清、全血、単離された血液細胞、血液から単離された細胞、及びその組み合わせなどがある。
技術は、試料を調製して試験用核酸を得るために使用される方法に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子の直接キャプチャー、例えば、米国特許第８，８０８，９９０号または第９，０００，１４６号に詳述されている方法、または関連方法を使用してＤＮＡを糞便試料から、または血液から、または血漿試料から単離する。
技術は、結腸癌に関連した任意の試料の分析に関する。例えば、いくつかの実施形態では、試料は、患者から得た組織及び／または生体液を含む。いくつかの実施形態では、試料は、分泌物を含む。いくつかの実施形態では、試料は、痰、血液、血清、血漿、胃液分泌、結腸組織試料、結腸細胞または糞便から回収した結腸ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。そのような試料は、当該技術分野で公知の任意の数の手段により得ることができ、当業者には明らかであろう。
［Ｉ．結腸癌を検出するメチル化アッセイ］
選択された結腸癌症例組織及び結腸対照組織にバイアスのない全メチロームシークエンシングを行い候補となるメチル化ＤＮＡマーカーを同定した。がん８９例及び正常９５例の血漿試料で上位マーカー候補をさらに評価した。患者の組織試料から抽出したＤＮＡを重亜硫酸塩で処理し、その後、正規化遺伝子としての標準遺伝子（例えば、β－アクチンまたはＢ３ＧＡＬＴ６）及び候補マーカーを、定量的アレル特異的リアルタイム標的及びシグナル増幅法（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｌｌｅｌｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ Ｔａｒｇｅｔ ａｎｄ Ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＱｕＡＲＴＳ増幅法）によりアッセイした。ＱｕＡＲＴＳ法化学は、メチル化マーカーの選択及びスクリーニングの識別度が高い。
個々のマーカー候補の受信者操作特性解析では、曲線下面積（ＡＵＣ）は０．６３～０．７５の範囲であった。９２．６％の特異性で、１２種のメチル化マーカー（ＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、及びＱＫＩ）の複合パネルと、ＣＥＡタンパク質アッセイとの併用では、結腸癌の全病期を通じて６７．４％の感度が得られた。
［ＩＩ．メチル化検出法及びキット］
本明細書に記載するマーカーは多種多様なメチル化検出法で利用される。５－メチルシトシンの存在についての核酸分析に最も頻繁に使用される方法は、Ｆｒｏｍｍｅｒらにより記載された、ＤＮＡ中の５－メチルシトシンを検出する重亜硫酸塩法（あらゆる目的のために参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれるＦｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７－３１）またはその変形に基づいている。５－メチルシトシンをマッピングする重亜硫酸塩法は、シトシンは亜硫酸水素イオン（重亜硫酸塩としても知られる）と反応するが５－メチルシトシンは反応しないという所見に基づいている。反応は通常、以下のステップに従って実施される。まず、シトシンを亜硫酸水素塩と反応させてスルホン化シトシンを形成させる。次に、スルホン化反応中間体が自発的に脱アミノ化しスルホン化ウラシルとなる。最後に、アルカリ性条件下、スルホン化ウラシルを脱スルホン化してウラシルを生成させる。ウラシルはアデニンと塩基対を形成し（したがって、チミンと同様の挙動）、また５－メチルシトシンはグアニンと塩基対を形成する（したがって、シトシンと同様の挙動）ので検出が可能である。このため、メチル化シトシンと非メチル化シトシンの識別が可能となり、例えば、バイサルファイトゲノムシークエンシング（Ｇｒｉｇｇ Ｇ，＆Ｃｌａｒｋ Ｓ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ（１９９４）１６：４３１－３６；Ｇｒｉｇｇ Ｇ，ＤＮＡ Ｓｅｑ．（１９９６）６：１８９－９８）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、例えば、米国特許第５，７８６，１４６号に開示されているもの、または配列特異的プローブ切断を含むアッセイ、例えば、ＱｕＡＲＴＳフラップエンドヌクレアーゼ法（例えば、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５６：Ａ１９９；ならびに米国特許第８，３６１，７２０号、第８，７１５，９３７号、第８，９１６，３４４号、及び第９，２１２，３９２号を参照のこと）の使用により可能となる。
従来の技術の中には、解析対象のＤＮＡをアガロース基質に封入することによりＤＮＡの拡散及び再生を防ぎ（重亜硫酸塩は一本鎖ＤＮＡとしか反応しない）、沈殿及び精製のステップを高速透析で置き換えることを含む方法に関連するものがある（Ｏｌｅｋ Ａ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）“Ａ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｂａｓｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０６４－６）。そのようにして個々の細胞をメチル化ステータスについて分析することが可能であり、方法の有用性及び感度を示している。５－メチルシトシンを検出する従来方法の概要は、Ｒｅｉｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：２２５５に記載されている。
重亜硫酸塩法では典型的に、重亜硫酸塩処理に続いて既知の核酸の短い特定断片の増幅を行い、その後、その産物のアッセイを配列決定（Ｏｌｅｋ＆Ｗａｌｔｅｒ（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１７：２７５－６）、またはプライマー伸長反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ＆Ｊｏｎｅｓ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９－３１；ＷＯ９５／００６６９；米国特許第６，２５１，５９４号）によって行い、個々のシトシンの位置を解析する。酵素による消化を利用する方法もある（Ｘｉｏｎｇ＆Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－４）。また、ハイブリダイゼーションによる検出法も当該技術分野で記載がある（Ｏｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９９／２８４９８）。さらに、個々の遺伝子に関するメチル化を検出するための重亜硫酸塩法の使用が記載されている（Ｇｒｉｇｇ＆Ｃｌａｒｋ（１９９４）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １６：４３１－６，；Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｈｕｍ
Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．６：３８７－９５；Ｆｅｉｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：６９５；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５７：２６１－４；ＷＯ９７４６７０５；ＷＯ９５１５３７３）。
本願技術に従った重亜硫酸塩処理を併用してさまざまなメチル化アッセイの手順を行うことができる。これらのアッセイにより、核酸配列内の１つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチド（例えば、ＣｐＧアイランド）のメチル化状態の測定が可能になる。そのようなアッセイでは、数ある技法の中でも特に、重亜硫酸塩処理した核酸のシークエンシング、ＰＣＲ（配列特異的増幅用）、サザンブロット解析、及びメチル化感受性制限酵素の使用が行われる。
例えば、重亜硫酸塩処理の使用（Ｆｒｏｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７－１８３１）により、メチル化パターン及び５－メチルシトシンの分布を解析するためのゲノムシークエンシングは簡便化されている。さらに、重亜硫酸塩で変換したＤＮＡから増幅させたＰＣＲ産物の制限酵素による消化は、例えば、Ｓａｄｒｉ＆Ｈｏｒｎｓｂｙ（１９９７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：５０５８－５０５９による記載、またはＣＯＢＲＡ（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ：複合重亜硫酸制限酵素分析法）として知られる方法での例示（Ｘｉｏｎｇ＆Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４）のように、メチル化状態の評価に利用される。
ＣＯＢＲＡ（商標）法は、少量ゲノムＤＮＡで特定の遺伝子座におけるＤＮＡメチル化レベルの決定に有用な定量的メチル化アッセイである（Ｘｉｏｎｇ＆Ｌａｉｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４，１９９７）。簡単に言えば、制限酵素による消化を利用して、亜硫酸水素ナトリウム処理したＤＮＡのＰＣＲ産物においてメチル化依存性配列の違いを明らかにする。Ｆｒｏｍｍｅｒらが記載の手順（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８２７－１８３１，１９９２）に従った標準的重亜硫酸塩処理により、まずメチル化依存性配列の違いをゲノムＤＮＡに導入する。その後、関心対象のＣｐＧアイランドに対して特異的なプライマーを使用して、重亜硫酸塩変換したＤＮＡのＰＣＲ増幅を実施し、次いで、制限エンドヌクレアーゼによる消化、ゲル電気泳動、及び特定の標識ハイブリダイゼーションプローブを使用した検出を行う。元のＤＮＡ試料のメチル化レベルは、消化されたＰＣＲ産物の相対量及び未消化ＰＣＲ産物の相対量により、広範囲のＤＮＡメチル化レベルにわたり定量的な直線状で表される。さらに、この技法は、顕微切断したパラフィン包埋組織試料から得たＤＮＡに信頼して適用可能である。
ＣＯＢＲＡ（商標）解析用の典型的試薬（例えば、典型的なＣＯＢＲＡ（商標）を用いるキット内に入っているような試薬）としては、特定の遺伝子座（例えば、特定遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、重亜硫酸塩処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）用のＰＣＲプライマー；制限酵素及び適切な緩衝液；遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド；対照ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド；オリゴヌクレオチドプローブ用キナーゼ標識キット；ならびに標識ヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、重亜硫酸塩変換試薬には、ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ回収用試薬またはキット（例えば、沈殿、限外ろ過、親和性カラム）；脱スルホン化緩衝液；及びＤＮＡ回収構成要素が含まれ得る。
「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」（蛍光によるリアルタイムＰＣＲ法）（Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２－２３０６，１９９９）、Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）反応（Ｇｏｎｚａｌｇｏ＆Ｊｏｎｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９－２５３１，１９９７）、メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」；Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６，１９９６；米国特許第５，７８６，１４６号）、及びメチル化ＣｐＧアイランド増幅（「ＭＣＡ」；Ｔｏｙｏｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０７－１２，１９９９）などのアッセイは、単独で使用されるか、またはこれらの方法のうち１つ以上と併用される。
「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）」法という技法は、重亜硫酸塩処理したＤＮＡのメチル化特異的増幅に基づいてメチル化の違いを評価する定量的方法である。増幅プライマーに挟まれているＣｐＧ位置または増幅プライマーが占めるＣｐＧ位置を包含するメチル化特異的ブロッキングプローブ（「ブロッカー」）により、核酸試料のメチル化特異的な選択的増幅が可能になる。
用語「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」法とは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）法の変形であるＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）法を指し、増幅プライマーに挟まれたＣｐＧ位置を包含するメチル化特異的ブロッキングプローブをＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）法に組み合わせたものである。ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）法を、メチル化特異的増幅プライマーと併用してもよい。
ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ解析用の典型的試薬（例えば、典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）を用いるキット内に入っているような試薬）としては、特定の遺伝子座（例えば、特定遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、重亜硫酸塩処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランド、または重亜硫酸塩処理したＤＮＡ配列もしくはＣｐＧアイランドなど）用のＰＣＲプライマー；ブロッキングオリゴヌクレオチド；最適化されたＰＣＲ緩衝液及びデオキシヌクレオチド；ならびにＴａｑポリメラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）では、メチル化感受性制限酵素の使用の如何を問わず、ＣｐＧアイランド内の事実上どの群のＣｐＧ部位でもメチル化ステータスを評価することが可能である（Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６，１９９６；米国特許第５，７８６，１４６号）。簡単に言えば、ＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで修飾し、それにより非メチル化シトシンはウラシルに変換されるがメチル化シトシンはウラシルに変換されず、その後、それらの生成物を、メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーと非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーを用いて増幅させる。ＭＳＰは、少量のＤＮＡしか必要とせず、所与のＣｐＧアイランド遺伝子座の０．１％のメチル化アレルに対して感受性であり、パラフィン包埋試料から抽出したＤＮＡで実施可能である。ＭＳＰ解析用の典型的試薬（例えば、典型的なＭＳＰを用いるキット内に入っているような試薬）としては、特定の遺伝子座（例えば、特定遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、重亜硫酸塩処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）用のメチル化及び非メチル化の両ＰＣＲプライマー；最適化されたＰＣＲ緩衝液及びデオキシヌクレオチド、ならびに特定のプローブが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）法は、ＰＣＲステップ後のさらなる操作が不要な、蛍光によるリアルタイムＰＣＲ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標））を利用するハイスループットの定量的メチル化アッセイである（Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２－２３０６，１９９９）。簡単に言えば、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）工程は、ゲノムＤＮＡの混合試料から始め、標準的手順に従ってそれを亜硫酸水素ナトリウム反応で変換させて、メチル化依存性配列の違いのある混合プールとする（重亜硫酸塩法による工程で非メチル化シトシン残基がウラシルに変換される）。その後、例えば、既知のＣｐＧジヌクレオチドと重複するＰＣＲプライマーなどとの「バイアスのある」反応で、蛍光によるＰＣＲを実施する。増幅工程レベル及び蛍光検出工程レベルの両レベルで配列識別を行う。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）法は、核酸、例えば、ゲノムＤＮＡ試料などのメチル化パターンの定量試験として使用されるが、その場合、配列識別はプローブハイブリダイゼーションレベルで行われる。定量的バージョンでは、ＰＣＲ反応で、特定の推定上のメチル化部位と重複する蛍光プローブの存在下、メチル化特異的な増幅が得られる。投入ＤＮＡ量についてのバイアスのない対照は、プライマーもプローブもＣｐＧジヌクレオチドを覆っていない反応により得られる。別法として、ゲノムのメチル化の定性試験は、既知のメチル化部位を包含しない対照オリゴヌクレオチドを用いて（例えば、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）及びＭＳＰ技法の蛍光によるバージョン）、または可能性のあるメチル化部位を包含するオリゴヌクレオチドを用いて、バイアスのあるＰＣＲプールをプローブすることにより達成される。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）工程は、適切なプローブ（例えば、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブなど）を用いて使用する。例えば、用途によっては、二本鎖ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用する２セットのＰＣＲ反応、例えば、ＭＳＰプライマー及び／またはＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌブロッカーオリゴヌクレオチドならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用するＰＣＲ反応のうち１セットに供する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光を発する「レポーター」分子及び「クエンチャー」分子で二重標識されており、ＰＣＲサイクルにおいてフォワードプライマーまたはリバースプライマーよりも約１０℃高い温度で融解するよう、ＧＣ含量が比較的高い領域に特異的であるよう設計されている。こうすることにより、ＰＣＲのアニーリング／伸長ステップの間もＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは完全にハイブリダイズされた状態のまま残ることができる。ＰＣＲの間、Ｔａｑポリメラーゼは酵素により新しい鎖を合成していき、最終的にはアニールしたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに達する。その後、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’方向のエンドヌクレアーゼ活性により、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが消化を受けて置換され、蛍光レポーター分子が遊離し、クエンチが解除されたそのシグナルをリアルタイム蛍光検出システムを使用して定量検出する。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ解析用の典型的試薬（例えば、典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）を用いるキット内に入っているような試薬）としては、特定の遺伝子座（例えば、特定遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、重亜硫酸塩処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）用のＰＣＲプライマー；ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ；最適化されたＰＣＲ緩衝液及びデオキシヌクレオチド；ならびにＴａｑポリメラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
ＱＭ（商標）（定量的メチル化）法はゲノムＤＮＡ試料中のメチル化パターンについての代替的定量試験であり、配列識別はプローブハイブリダイゼーションレベルで行われる。この定量的バージョンでは、ＰＣＲ反応で、特定の推定上のメチル化部位と重複する蛍光プローブの存在下、バイアスのない増幅が得られる。投入ＤＮＡ量についてのバイアスのない対照は、プライマーもプローブもＣｐＧジヌクレオチドを覆っていない反応により得られる。別法として、ゲノムのメチル化の定性試験は、既知のメチル化部位を包含しない対照オリゴヌクレオチドを用いて（例えば、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）及びＭＳＰ技法の蛍光によるバージョン）、または可能性のあるメチル化部位を包含するオリゴヌクレオチドを用いて、バイアスのあるＰＣＲプールをプローブすることにより達成される。
ＱＭ（商標）工程は、適切なプローブ、例えば、「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブを用いて増幅工程で使用することができる。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、バイアスのないプライマー及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに供する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光を発する「レポーター」分子及び「クエンチャー」分子で二重標識されており、ＰＣＲサイクルにおいてフォワードプライマーまたはリバースプライマーよりも約１０℃高い温度で融解するよう、ＧＣ含量が比較的高い領域に特異的であるよう設計されている。こうすることにより、ＰＣＲのアニーリング／伸長ステップの間もＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは完全にハイブリダイズされた状態のまま残ることができる。ＰＣＲの間、Ｔａｑポリメラーゼは酵素により新しい鎖を合成していき、最終的にはアニールしたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに達する。その後、Ｔａｑポリメラーゼの５’から３’方向のエンドヌクレアーゼ活性により、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが消化を受けて置換され、蛍光レポーター分子が遊離し、クエンチが解除されたそのシグナルをリアルタイム蛍光検出システムを使用して定量検出する。ＱＭ（商標）解析用の典型的試薬（例えば、典型的なＱＭ（商標）を用いるキット内に入っているような試薬）としては、特定の遺伝子座（例えば、特定遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、重亜硫酸塩処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）用のＰＣＲプライマー；ＴａｑＭａｎ（登録商標）またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ；最適化されたＰＣＲ緩衝液及びデオキシヌクレオチド；ならびにＴａｑポリメラーゼが挙げられるが、これに限定されるものではない。
Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）法は、ＤＮＡの重亜硫酸塩処理、それに続く単一ヌクレオチドプライマー伸長法に基づいた、特定のＣｐＧ部位でのメチル化の違いを評価する定量的方法である（Ｇｏｎｚａｌｇｏ＆Ｊｏｎｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９－２５３１，１９９７）。簡単に言えば、ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムと反応させて非メチル化シトシンをウラシルに変換させるが、その際、５－メチルシトシンは未変化のまま残る。その後、重亜硫酸塩により変換されたＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを使用して所望の標的配列の増幅を行い、得られる産物を単離して、関心ＣｐＧ部位でのメチル化解析用の鋳型として使用する。少量のＤＮＡの解析が可能なので（例えば、顕微切断した病理切片）、ＣｐＧ部位でのメチル化ステータス決定に制限酵素を使用しなくて済む。
Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）解析用の典型的試薬（例えば、典型的なＭｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）を用いるキット内に入っているような試薬）としては、特定の遺伝子座（例えば、特定遺伝子、マーカー、遺伝子の領域、マーカーの領域、重亜硫酸塩処理ＤＮＡ配列、ＣｐＧアイランドなど）用のＰＣＲプライマー；最適化されたＰＣＲ緩衝液及びデオキシヌクレオチド；ゲル抽出キット；陽性対照プライマー；特定遺伝子座についてのＭｓ－ＳＮｕＰＥ（商標）プライマー；反応緩衝液（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ反応用）；及び標識ヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに、重亜硫酸塩変換試薬には、ＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ回収用試薬またはキット（例えば、沈殿、限外ろ過、親和性カラム）；脱スルホン化緩衝液；及びＤＮＡ回収構成要素が含まれ得る。
Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ：濃縮提示重亜硫酸塩シークエンシング）では、核酸を重亜硫酸塩処理して非メチル化シトシンをもれなくウラシルに変換させることから始め、その後、制限酵素（例えば、ＭｓｐＩのように、ＣＧ配列が含まれた部位を認識する酵素）により消化を行い、断片をアダプターリガンドと結合させてから完全シークエンシングを行う。制限酵素の選択により、断片にＣｐＧ密度の高い領域が多くなり、解析中、複数の遺伝子位置に位置し得る冗長配列数が減る。したがって、ＲＲＢＳは、シークエンシング用の制限酵素による断片のサブセットを選択することにより（例えば、分取ゲル電気泳動を使用したサイズ選択により）核酸試料の複雑度を低減する。全ゲノム重亜硫酸塩シークエンシングとは対照的に、制限酵素による消化で生成されたどの断片にも、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドについてのＤＮＡメチル化情報が含有されている。したがって、ＲＲＢＳでは、試料は、プロモーター、ＣｐＧアイランド、及びゲノムの他の特徴が豊富になり、かつ、これらの領域内の制限酵素切断部位が高頻度で伴うため、１つ以上のゲノム遺伝子座のメチル化状態を評価するアッセイが提供される。
ＲＲＢＳの典型的なプロトコルは、ＭｓｐＩなどの制限酵素により核酸試料を消化させ、突出末端を埋めてＡ尾部を付加し、アダプターを結合させ、重亜硫酸塩で変換し、ＰＣＲを行うというステップを含む。例えば、ｅｔ ａｌ．（２００５）“Ｇｅｎｏｍｅ－ｓｃａｌｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ
ｓａｍｐｌｅｓ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ” Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７：１３３－６；Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）“Ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ” Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：５８６８－７７を参照のこと。
いくつかの実施形態では、定量的アレル特異的リアルタイム標的及びシグナル増幅（ＱｕＡＲＴＳ）法を使用してメチル化状態を評価する。各ＱｕＡＲＴＳ法につき３回の反応を順次行い、これには、一次反応における増幅（反応１）及び標的プローブの切断（反応２）；ならびに二次反応におけるＦＲＥＴ切断と蛍光シグナル発生（反応３）が含まれる。特定のプライマーを用いて標的核酸を増幅させる場合、フラップ配列を有する特定の検出プローブはアンプリコンに緩く結合する。標的結合部位に特定の侵入オリゴヌクレオチドが存在すると、５’ヌクレアーゼ、例えば、ＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼは検出プローブとフラップ配列の間を切断してフラップ配列を遊離させる。フラップ配列は、対応するＦＲＥＴカセットの非ヘアピン部分に相補的である。したがって、フラップ配列は、ＦＲＥＴカセット上で侵入オリゴヌクレオチドとして機能し、ＦＲＥＴカセットのフルオロフォアとクエンチャーの間の切断を実行し、これにより蛍光シグナルを発生させる。切断反応により、標的あたり複数のプローブを切断することができ、それによりフラップあたり複数のフルオロフォアを遊離させ、指数級数的シグナル増幅を得ることができる。ＱｕＡＲＴＳでは、異なる色素のＦＲＥＴカセットの使用により、単一の反応ウェルで複数標的を検出することができる。（例えば、Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ５６：Ａ１９９を参照のこと）。本明細書に記載の実施形態では、ＱｕＡＲＴＳ法を、同一ＦＲＥＴカセットを使用して、複数の異なる標的または同一標的の異なる領域を検出し、単一色素から相加的蛍光シグナルを発生するように構成することもできる。
いくつかの実施形態では、重亜硫酸塩処理したＤＮＡを精製してから定量する。この精製は、限定するわけではないが、限外ろ過、例えばＭｉｃｒｏｃｏｎ（商標）カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）製）を手段とするような当該技術分野で公知の任意の手段で行ってよい。修正された製造者によるプロトコルに従って精製を行う（例えば、参照によりその全体が組み込まれるＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照のこと）。いくつかの実施形態では、重亜硫酸塩処理したＤＮＡを固体支持体、例えば、磁気ビーズなどに結合させ、ＤＮＡを固体支持体に結合させたまま脱スルホン化及び洗浄を行う。そのような実施形態の例は、例えば、ＷＯ２０１３／１１６３７５に記載されている。特定の好ましい実施形態では、支持体に結合したＤＮＡは、支持体上での脱スルホン化及び洗浄の直後にそのままメチル化アッセイに使用できる状態にある。いくつかの実施形態では、アッセイを行う前に、脱スルホン化されたＤＮＡを支持体から溶出させる。
いくつかの実施形態では、処理したＤＮＡの断片を、本発明によるプライマーオリゴヌクレオチドセット（例えば、図１を参照のこと）及び増幅用酵素を使用して増幅させる。いくつかのＤＮＡセグメントの増幅を１つの同一反応槽で同時に行うことができる。典型的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅を行う。
これらのアッセイ技術に好適なＤＮＡ単離方法は当該技術分野で公知である。特に、いくつかの実施形態は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／４７０，２５１号（ＵＳ２０１２／０２８８８６８として公開されている”Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”）に記載のような核酸単離を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するマーカーは、糞便試料で実施するＱＵＡＲＴＳ法で利用される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料を作製する方法、特に、高度に精製された少量の核酸を小容量で（例えば、１００マイクロリットル未満、６０マイクロリットル未満）含み、ＤＮＡ試料の検査に使用するアッセイ（例えば、ＰＣＲ、ＩＮＶＡＤＥＲ法、ＱｕＡＲＴＳ法など）の妨げとなる物質を実質的及び／または事実上含まないＤＮＡ試料を作製する方法を提供する。そのようなＤＮＡ試料は、患者から採取された試料中に存在する遺伝子、遺伝子変異型（例えば、アレル）、もしくは遺伝子修飾（例えば、メチル化）の、活性、発現、もしくは量を、存在について定性的に検出するかまたは定量的に測定する診断検査で利用される。例えば、一部のがんは、特定の変異アレルまたは特定のメチル化状態の存在と相関しており、そのため、そのような変異アレルまたはメチル化状態の検出及び／または定量化は、がんの診断及び治療において予測的な価値がある。
多くの重要な遺伝子マーカーは、試料中に極めて少量で存在しており、そのようなマーカーが生じるイベントの多くがまれにしか起こらない。結果として、感度の高いＰＣＲなどの検出法でさえ、アッセイの検出閾値を満たすかまたはそれに優先するだけの十分量の少量標的を得るために大量のＤＮＡを必要とする。さらに、たとえ少量でも阻害物質が存在すると、そのような少量の標的の検出を対象とするこれらのアッセイの真度及び精度が損なわれる。したがって、本明細書は、そのようなＤＮＡ試料を作製するために必要な容量及び濃度を管理する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、試料は、血液、血清、血漿、または唾液を含む。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。そのような試料は、当該技術分野で公知の任意の数の手段により得ることができ、当業者には明らかであろう。無細胞または実質的に無細胞の試料は、遠心分離及びろ過を含むがこれに限定されない、当業者に公知の多種多様な技法に試料を供して得ることができる。侵襲的技法を使用せずに試料を得ることが一般には好ましいが、それでもやはり組織ホモジネート、組織切片、及び生検標本などの試料を得ることが好ましい場合がある。技術は、試料を調製して試験用核酸を得るために使用される方法に限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第８，８０８，９９０号及び第９，１６９，５１１号、及びＷＯ２０１２／１５５０７２に詳述されているような遺伝子の直接キャプチャー、または関連方法を使用して、糞便試料または血液または血漿試料からＤＮＡを単離する。
マーカーの解析は、１つの被験試料内でさらなるマーカーを用いて別々または同時に行うことができる。例えば、複数試料を効率的に処理するため、及び高い診断精度及び／または予後診断精度を提供可能にするため、いくつかのマーカーを１回の試験にまとめることができる。さらに、当業者であれば、同一対象の複数試料を検査すること（例えば、連続する時点で）の価値を認識するであろう。そのような連続採取試料の検査により、マーカーのメチル化状態の変化を経時的に特定することができる。メチル化状態の変化、ならびにメチル化状態に変化がないということから、疾患の状態について有用な情報を得ることができ、そのような情報には、イベント発症からのおよその時間の特定、救済可能な組織の存在と量、薬物療法の妥当性、さまざまな治療法の有効性、及び将来的にイベントが起こるリスクを含む対象の転帰の確認が挙げられるが、これに限定されるものではない。
バイオマーカーの解析は、さまざまな物理的形式で行うことができる。例えば、大量の被験試料の処理を容易にするためにマイクロタイタープレートの使用またはオートメーションを利用することができる。別法として、例えば、外来輸送または救急治療室という状況などで、適時の迅速な治療及び診断を容易に行うために単一試料形式を作製することができるであろう。
技術の実施形態はキットの形態で提供されることが意図される。キットは、本明細書に記載の組成物、デバイス、器具類などの実施形態、及びキットの使用説明書を含む。そのような説明書には、試料から分析対象物を調製するため、例えば、試料を採取し、その試料から核酸を調製するための適切な方法が記載されている。キットの個々の構成要素は、適切な容器及び包装材料（例えば、バイアル、箱、ブリスターパック、アンプル、広口瓶、ボトル、チューブなど）に包装され、かかる構成要素は、保存、輸送、及び／またはキット使用者が使用するのに好都合な適切な容器（例えば、箱（複数可））にまとめて包装される。液体構成要素（例えば、緩衝液）は、使用者が再構成するよう凍結乾燥形態で提供されてよいことが理解される。キットには、キットの性能を評価する、確認する、及び／または保証するための対照または標準が含まれ得る。例えば、試料中に含まれる核酸の量を定量するキットには、比較用に既知濃度の同一または別の核酸を含む対照が含まれ得、いくつかの実施形態では、対照核酸に対して特異的な検出試薬（例えば、プライマー）が含まれ得る。キットは臨床現場での使用に適切であり、いくつかの実施形態では、使用者の自宅での使用に適切である。いくつかの実施形態では、キットの構成要素は、試料から核酸溶液を調製するためのシステムの機能性を提供する。いくつかの実施形態では、システムの特定の構成要素は使用者により提供される。
［ＩＩＩ．用途］
いくつかの実施形態では、診断検査により個体の疾患または病態の存在が同定される。いくつかの実施形態では、疾患はがん（例えば、結腸癌）である。いくつかの実施形態では、その異常なメチル化が結腸癌に関連しているマーカー（例えば、表１に挙げられているマーカーから選択される１つ以上のマーカー、または好ましくはＶＡＶ３；ＺＮＦ６７１；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；ＧＲＩＮ２Ｄ、ＱＫＩ、ＦＥＲ１Ｌ４の１つ以上）を使用する。いくつかの実施形態では、アッセイはさらに、標準遺伝子（例えば、β－アクチン、ＺＤＨＨＣ１、Ｂ３ＧＡＬＴ６）の検出を含む。
いくつかの実施形態では、技術は、患者（例えば、結腸癌患者、初期結腸癌患者、または結腸癌を発症し得る患者）の治療に応用され、その方法は、本明細書で提供する１つ以上のマーカーのメチル化状態を決定すること、及び、先で決定のメチル化状態の結果に基づいて患者に治療を施術することを含む。治療は、医薬化合物の投与、ワクチン投与、手術の実施、患者の画像診断、別の検査の実施であってよい。好ましくは、前記のような使用は、臨床的スクリーニングをする方法、予後を評価する方法、治療結果をモニターする方法、特定の治療的処置に応答する可能性の高い患者を同定する方法、患者または対象を画像診断する方法、及び薬物のスクリーニング及び開発をする方法においてである。
いくつかの実施形態では、技術は、対象の結腸癌を診断する方法に応用される。本明細書で使用する用語「診断する」及び「診断」は、対象が所与の疾患または病態に罹患しているか否か、または将来的に所与の疾患または病態を発症し得るか否かを当業者が推定し、さらに決定することができる方法を指す。当業者はしばしば、そのメチル化状態が病態の存在、重症度、または病態がないことを示す１つ以上の診断指標、例えば、バイオマーカーなどに基づいて診断を行う。
診断と共に、がんの臨床的予後診断は、がんの悪性度及び腫瘍再発の可能性を決定し、最も有効な治療法を計画することに関係する。より正確な予後診断をすることができる、さらにはがん発症の潜在的リスクを評価することができる場合、適切な治療、場合によっては患者にとって重度の低い治療を選択することができる。がんバイオマーカーの評価（例えば、メチル化状態の決定）は、治療が不要であるかまたは限定的な治療ですむ、予後良好及び／またはがん発症のリスクが低い対象と、より強度の高い治療による利益を受けると思われる、がん発症の可能性が高いかまたはがん再発に苦しむ対象とを区別するのに有用である。
したがって、本明細書で使用する場合、「診断を行うこと」または「診断すること」には、がん発症のリスク判定を行うこと、または予後を決定することがさらに含まれ、これにより、本明細書に開示する診断用バイオマーカーの測定に基づいた臨床転帰（薬物療法の有無を問わない）の予測、適切な治療の選択（または治療が有効であるかどうか）、または現在の治療のモニタリング及び可能な治療変更が提供され得る。
さらに、技術のいくつかの実施形態では、診断及び／または予後診断を容易に行うためにバイオマーカーの複数の判定を経時的に行うことができる。バイオマーカーの時間的変化を使用して、臨床転帰の予測、結腸癌の進行のモニタリング、及び／またはがんに対する適切な治療法の有効性のモニタリングを行うことができる。例えば、そのような実施形態では、有効な治療法の期間中、生体試料において本明細書に開示する１つ以上のバイオマーカー（モニタリングされる場合はおそらく１つ以上のさらなるバイオマーカー（複数可））のメチル化状態に経時的に変化が見られると予測し得るであろう。
技術はさらに、対象のがんの予防または治療の開始または継続について決定するための方法に応用される。いくつかの実施形態では、方法は、ある期間にわたる対象の一連の生体試料を提供すること；かかる一連の生体試料を分析し、本明細書に開示する少なくとも１つのバイオマーカーのメチル化状態を生体試料の各々で決定すること；及び１つ以上のバイオマーカーのメチル化状態の測定可能な変化を生体試料の各々で比較することを含む。その期間にわたるバイオマーカーのメチル化状態の変化を使用して、がん発症のリスクを予測すること、臨床転帰を予測すること、がんの予防または治療の開始または継続について決定すること、及び現在の治療によりがんが有効に治療されているかどうかを決定することができる。例えば、第１の時点を治療開始前に選択し、第２の時点を治療開始後のある時にして選択することができる。異なる時点から採取した試料の各々でメチル化状態を測定し、定性的及び／または定量的な違いを記述することができる。異なる試料から得たバイオマーカーレベルのメチル化状態の変化と、対象における結腸癌発症のリスク、予後、治療有効性、及び／またはがんの進行とを相関させることができる。
好ましい実施形態では、本発明の方法及び組成物は、疾患を初期、例えば、疾患の症状が出現する前に、治療または診断するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の方法及び組成物は、疾患を臨床病期に治療または診断するためのものである。
上記のように、いくつかの実施形態では、１つ以上の診断用または予後用バイオマーカーの複数の判定を行うことができ、マーカーの時間的変化を使用して、診断または予後を決定することができる。例えば、診断用マーカーを初回に決定し、２回目に再び決定することができる。そのような実施形態では、初回から２回目までのマーカーの増加は、がんの特定の型もしくは重症度、または所与の予後の診断につながり得る。同様に、初回から２回目までのマーカーの減少は、がんの特定の型もしくは重症度、または所与の予後を示し得る。さらに、１つ以上のマーカーの変化の程度は、がんの重症度及び将来的な有害事象に関連し得る。当業者は、ある実施形態では、同一バイオマーカーについて複数時点で比較測定を行うことができるが、所与のバイオマーカーを１つの時点で、また第２のバイオマーカーを第２の時点で測定することもでき、これらのマーカーの比較から診断につながる情報を得られることを理解できよう。
本明細書で使用する場合、語句「予後を決定する」とは、それによって当業者が対象の病態の経過または転帰を予測することができる方法を指す。用語「予後」は、病態の経過または転帰を１００％の精度で予測する能力を指すわけではなく、さらには、所与の経過または転帰が生じやすいことをバイオマーカーのメチル化状態に基づいて予測できることを指すわけではない。そうではなく、当業者は、用語「予後」とは、特定の経過または転帰が生じる確率が高いこと、すなわち、所与の病態を示す対象では、かかる病態を示さない個体よりも、ある経過または転帰が生じる可能性が高いことを指すことを理解できよう。例えば、かかる病態を示さない個体では、所与の転帰（例えば、結腸癌に罹患）の可能性は非常に低い場合がある。
いくつかの実施形態では、統計解析により、予後指標と有害転帰の素因とが関連付けられる。例えば、いくつかの実施形態では、統計的有意水準で決定した場合に、がんではない患者から得られた正常対照試料のメチル化状態とは異なるメチル化状態は、対象が、対照試料のメチル化状態により類似したレベルの対象よりもがんに罹患する可能性が高いことを示唆し得る。さらに、ベースライン（例えば、「正常」）レベルからのメチル化状態の変化は、対象の予後を反映し得、メチル化状態の変化の程度は、有害事象の重症度に関連し得る。統計的有意性は、２つ以上の集団を比較して信頼区間及び／またはｐ値を決定することにより決定されることが多い。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＤｏｗｄｙ ａｎｄ Ｗｅａｒｄｅｎ，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３を参照のこと。本願主題の例示的な信頼区間は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％及び９９．９９％であり、例示的なｐ値は、０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、及び０．０００１である。
他の実施形態では、本明細書に開示する予後用または診断用バイオマーカーのメチル化状態の変化の程度の閾値を設定することができ、生体試料中のバイオマーカーのメチル化状態の変化の程度と、メチル化状態の変化の程度の閾値とを単純に比較する。本明細書で提供するバイオマーカーのメチル化状態の変化の好ましい閾値は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約５０％、約７５％、約１００％、及び約１５０％である。さらに別の実施形態では、「ノモグラム」を設定することができ、それにより、予後用または診断用指標（バイオマーカー１種または複数種の組み合わせ）のメチル化状態と、所与の転帰に対し関連する素因とが直接関連付けられる。当業者は、そのような２つの数値を関連付けるノモグラムの使用に精通しており、また、集団平均ではなく個々の試料の測定値を参照しているため、この測定値における不確実性はマーカー濃度における不確実性と同じであることを理解している。
いくつかの実施形態では、生体試料から得られた結果と対照試料から得られた結果とを比較することができるよう、生体試料と同時に対照試料を解析する。さらに、検量線が提供され得、それを用いて生体試料のアッセイ結果を比較してよいことが意図される。そのような検量線は、バイオマーカーのメチル化状態をアッセイ単位の関数として、例えば、蛍光標識を使用する場合は蛍光シグナル強度の関数として表す。複数のドナーから採取した試料を使用して、正常組織での１つ以上のバイオマーカーのメチル化状態である対照、ならびに結腸癌ドナーから採取した組織での１つ以上のバイオマーカーの「リスク」レベルについて検量線を得ることができる。
マーカーの解析は、１つの被験試料内でさらなるマーカーを用いて別々または同時に行うことができる。例えば、複数試料を効率的に処理するため、及び高い診断精度及び／または予後診断精度を提供可能にするため、いくつかのマーカーを１回の試験にまとめることができる。さらに、当業者であれば、同一対象の複数試料を検査すること（例えば、連続する時点で）の価値を認識するであろう。そのような連続採取試料の検査により、マーカーのメチル化状態の変化を経時的に特定することができる。メチル化状態の変化、ならびにメチル化状態に変化がないということから、疾患の状態について有用な情報を得ることができ、そのような情報には、イベント発症からのおよその時間の特定、救済可能な組織の存在と量、薬物療法の妥当性、さまざまな治療法の有効性、及び将来的にイベントが起こるリスクを含む対象の転帰の確認が挙げられるが、これに限定されるものではない。
バイオマーカーの解析は、さまざまな物理的形式で行うことができる。例えば、大量の被験試料の処理を容易にするためにマイクロタイタープレートの使用またはオートメーションを利用することができる。別法として、例えば、外来輸送または救急治療室という状況などで、適時の迅速な治療及び診断を容易に行うために単一試料形式を作製することができると思われる。
いくつかの実施形態では、対照のメチル化状態と比較したときに試料中の少なくとも１つのバイオマーカーのメチル化状態に測定可能な違いがある場合、対象は結腸癌であると診断される。逆に、生体試料においてメチル化状態の変化が同定されない場合は、対象は、結腸癌ではない、結腸癌のリスクはない、または結腸癌のリスクは低いとして同定される。この関連で、結腸癌であるかまたはそのリスクがある対象と、結腸癌またはそのリスクが低いかまたは実質的にない対象とを鑑別することができる。結腸癌を発症するリスクのある対象には、より集中的及び／または通常のスクリーニングスケジュールを実施することができる。一方、リスクが低い対象及び実質的にリスクのない対象は、以降のスクリーニング、例えば、本願技術に従って行われるスクリーニングなどで、それらの対象に結腸癌のリスクが認められることが示されるまでスクリーニング法を受けなくて済む場合がある。
上述のように、本願技術の方法の実施形態に応じて、１つ以上のバイオマーカーのメチル化状態の変化の検出は、定性的決定の場合もあれば定量的決定の場合もあり得る。したがって、結腸癌である、または結腸癌を発症するリスクがあるとして対象を診断するステップでは、特定の閾値測定が行われたことを示し、例えば、生体試料中の１つ以上のバイオマーカーのメチル化状態は所定の対照メチル化状態とは異なる。方法のいくつかの実施形態では、対照メチル化状態は、バイオマーカーの任意の検出可能なメチル化状態である。対照試料と生体試料が同時に試験される方法の他の実施形態では、所定のメチル化状態は対照試料のメチル化状態である。方法の他の実施形態では、所定のメチル化状態は、検量線に基づいている、及び／または検量線により特定される。方法の他の実施形態では、所定のメチル化状態は、特定の状態または状態の特定範囲である。したがって、所定のメチル化状態は、実施される方法の実施形態、及び所望の特異性などに部分的に基づいて、当業者には明らかとなる許容限度内で選ぶことができる。
ここ数年、転移性腫瘍細胞を表す血中循環上皮細胞は多くのがん患者の血液で検出され得ることが明らかになってきている。希少な細胞の分子プロファイリングは生物学的研究及び臨床研究において重要である。用途は、疾患予後診断及び個別化医療のための、がん患者末梢血中循環上皮細胞（ＣＥｐＣ）の特性解析から利用できる（例えば、Ｃｒｉｓｔｏｆａｎｉｌｌｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５１：７８１－７９１；Ｈａｙｅｓ ＤＦ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ １２：４２１８－４２２４；Ｂｕｄｄ ＧＴ，ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １２：６４０３－６４０９；Ｍｏｒｅｎｏ ＪＧ，ｅｔ
ａｌ．（２００５）Ｕｒｏｌｏｇｙ ６５：７１３－７１８；Ｐａｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｎａｔ Ｒｅｖ ８：３２９－３４０；及びＣｏｈｅｎ ＳＪ，ｅｔ
ａｌ．（２００８）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２６：３２１３－３２２１を参照のこと）。したがって、本開示の実施形態は、対象の血漿または全血中のメチル化マーカーの存在を確認することによって対象での転移癌の存在を検出するための組成物及び方法を提供する。
［実施例］
［試料調製方法］
［ＤＮＡ単離方法及びＱＵＡＲＴＳ法］
以下に、技術の実施形態に従って使用され得るような、分析前に行う例示的なＤＮＡ単離方法、及び例示的なＱｕＡＲＴＳ法を提供する。本実施例では、血液及びさまざまな組織試料から得たＤＮＡへのＱｕＡＲＴＳ法の応用を記載するが、他の実施例に示すように、かかる技術は他の核酸試料にも容易に適用される。
［細胞及び血漿からのＤＮＡ単離］
細胞株の場合、例えば、「Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）ＲＳＣ ｃｃｆＤＮＡ Ｐｌａｓｍａ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して細胞条件培地からゲノムＤＮＡを単離してよい。キットのプロトコルに従い、１ｍＬの細胞条件培地（ＣＣＭ）を血漿の代わりに使用し、キットの手順に従って処理する。溶出容量は１００μＬであり、一般に、そのうち７０μＬを重亜硫酸塩変換に使用する。その各々があらゆる目的のために参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１５年１０月３０日に出願された米国特許出願第６２／２４９，０９７号；ともに２０１６年１０月２６日に出願された第１５／３３５，１１１号及び第１５／３３５，０９６号；ならびに２０１６年１０月２６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／５８８７５号も参照のこと。
例えば検出法などで使用する、血液試料からＤＮＡを単離するための全工程の一例を本実施例で提供する。任意選択の重亜硫酸塩変換及び検出方法も記載する。
［Ｉ．血液処理］
抗凝固剤ＥＤＴＡまたはＳｔｒｅｃｋ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ＢＣＴのチューブに全血を採取する。例示的手順は以下のとおりである。
１．１０ｍＬの全血をバキュテナーチューブ（抗凝固剤ＥＤＴＡまたはＳｔｒｅｃｋ ＢＣＴ）に採血し、血液と抗凝固剤とが確実に正確な比となるよう最大容量採取する。
２．採取後、血液と抗凝固剤が混合するようチューブを８～１０回逆さにして血液を穏やかに混合し、遠心分離にかけるまで室温で保つが、遠心分離は採血時から４時間以内に行わなければならない。
３．血液試料を水平ローター（スイングアウトヘッド）で１５００ｇ（±１００ｇ）にて室温で１０分間遠心分離する。遠心分離の停止にブレーキを使用しないこと。
４．上清（血漿）を室温で慎重に吸引し、遠沈管にプールする。細胞層が破壊されたり、細胞が移動したりしないよう確認する。
５．上清の分注量４ｍＬをクリオバイアルチューブに慎重に移す。
６．キャップをしっかりと閉じ、分注次第すぐに氷上に置く。この工程は遠心分離の１時間以内に終了させなければならない。
７．必ず、血液中に含まれる添加物の詳細など関連情報を含むラベルがクリオバイアルに適切に貼付されていること。
８．検体は、－８０℃のフリーザーに移すまで－２０℃で最大４８時間凍結保存が可能である。
［ＩＩ．合成プロセス対照ＤＮＡの調製］
下記に示す配列を有するメチル化ゼブラフィッシュＤＮＡの相補鎖を、ホスホロアミダイト付加などの標準的ＤＮＡ合成方法を使用して合成し、５－メチルＣ塩基を指示された位置に組み込む。合成鎖をアニールしてプロセス対照として使用する二本鎖ＤＮＡ断片を作製する。
Figure 2023025184000001
Ａ．濃縮ゼブラフィッシュ（ＺＦ－ＲＡＳＳ Ｆ１ １８０ｍｅｒ）合成プロセス対照のアニーリング及び調製 １．凍結乾燥した一本鎖オリゴヌクレオチドを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ中に１μＭの濃度で再構成する。
２．５００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、及び２０ｍＭ ＭｇＣｌ２の１０×アニーリングバッファーを作製する。
３．合成鎖をアニールする。
総容量１００μＬ中で、一本鎖オリゴヌクレオチドそれぞれの等モル量を１×アニーリングバッファーを、例えば、下記表に示すように合せる。
Figure 2023025184000002
４．アニーリング混合物を９８℃まで１１～１５分間加熱する。
５．反応チューブを加熱から外し、短時間スピンダウンしてチューブ底に濃縮物を集める。
６．反応チューブを室温で１０～２５分間インキュベートする。
７．０．９ｍＬの魚類ＤＮＡ希釈液（２０ｎｇ／ｍＬのバルク魚類ＤＮＡ含有Ｔｅ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ））を加えてゼブラフィッシュＲＡＳＳＦ１ ＤＮＡ断片の濃度を調整し、魚類ゲノムＤＮＡ担体中、アニールした二本鎖合成ゼブラフィッシュＲＡＳＳＦ１ ＤＮＡが１．０×１０１０コピー／μｌになるようにする。
８．プロセス対照を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて、例えば、下記表に記載のように所望の濃度に希釈し、－２０℃または－８０℃で保存する。
Figure 2023025184000003
Ｂ．１００×ストック用プロセス対照の調製（２００ｎｇ／μＬのバルク魚類ＤＮＡ中、ゼブラフィッシュＲＡＳＳＦ１ ＤＮＡ １２，０００コピー／μＬ） １．試薬を解凍する
２．解凍した試薬をボルテックスにかけ、スピンダウンする
３．以下の試薬を５０ｍＬ遠沈管に加える
Figure 2023025184000004
４．ラベル付き０．５ｍＬチューブに分注し、－２０℃で保存する
Ｃ．プロセス対照（２ｎｇ／μＬ魚類ＤＮＡ中、１２０コピー／μＬのゼブラフィッシュＲＡＳＳＦ１ ＤＮＡ）の１×ストックの調製
１．試薬を解凍する
２．解凍した試薬をボルテックスにかけ、スピンダウンする
３．以下の試薬を５０ｍＬ遠沈管に加える。
Figure 2023025184000005
４．ラベル付き０．５ｍＬチューブに０．３ｍＬ分注し、－２０℃で保存する
［ＩＩＩ．血漿からのＤＮＡ抽出］
１．血漿を解凍して試薬を調製し、チューブにラベル貼付した後、抽出に備えバイオセイフティ・キャビネットを清掃し準備する。
２．各試料ごとに３００μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）を１本の５０ｍＬ遠沈管に加える。
３．２～４ｍＬの血漿試料を各５０ｍＬ遠沈管に加える（ボルテックスにかけないこと）。
４．回転させるかまたはピペットで混合し、室温で５分間静置する。
５．４～６ｍＬの溶解バッファー１（ＬＢ１）溶液を加えて容量を約８ｍＬにする。
ＬＢ１処方：
・上記のような、１２０コピー／μＬのゼブラフィッシュＲＡＳＳＦ１ ＤＮＡのプロセス対照を０．１ｍＬ；
・１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（例えば、２ｍＬの血漿試料あたり２．９ｍＬを使用）を０．９～２．９ｍＬ
・１０％ ＩＧＥＰＡＬ添加グアニジンチオシアン酸塩４．３Ｍを３ｍＬ（５．３ｇのＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０と４５ｍＬのグアニジンチオシアン酸塩４．８Ｍとを混合したストックから）
６．チューブを３回逆さにする。
７．ベンチトップ型シェーカー（室温）に置き５００ｒｐｍで室温にて３０分間実施する。
８．２００μＬのシリカ結合ビーズ（粒子１６μｇ／μＬ）を加え、回転により混合する。
９．７ｍＬの溶解バッファー２（ＬＢ２）溶液を加え、回転により混合する。
ＬＢ２処方：
・１０％ ＩＧＥＰＡＬと混合したグアニジンチオシアン酸塩４．３Ｍを４ｍＬ
・１００％イソプロパノール３ｍＬ
（溶解バッファー２は、シリカ結合ビーズより先、後、または同時に加えてよい）
１０．チューブを３回逆さにする。
１１．ベンチトップ型シェーカーに置き、５００ｒｐｍで室温にて３０分間実施する。
１２．チューブをキャプチャーアスピレーターに置き、ビーズの磁気捕集でプログラムを１０分間実施し、その後、吸引を行う。これにより、ビーズが１０分間捕集された後、チューブから液体がもれなく除去される。
１３．０．９ｍＬの洗浄液１（グアニジン塩酸塩またはグアニジンチオシアン酸塩を３Ｍ、５６．８％ ＥｔＯＨ）を加えて結合ビーズを再懸濁させ、回転により混合する。
１４．ベンチトップ型シェーカーに置き、４００ｒｐｍで室温にて２分間実施する。（以降のステップはすべて、ＳＴＡＲｌｅｔ自動プラットフォームで実施可能である）。
１５．ピペット操作を繰り返して混合した後、含有されたビーズを９６ディープウェルプレートに移す。
１６．プレートをマグネットラックに１０分間置く。
１７．上清を吸引して廃棄する。
１８．１ｍＬの洗浄液２（８０％エタノール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）を加える。
１９．３分間混合する。
２０．チューブをマグネットラックに１０分間置く。
２１．上清を吸引して廃棄する。
２２．０．５ｍＬの洗浄液２を加える。
２３．３分間混合する。
２４．チューブをマグネットラックに５分間置く。
２５．上清を吸引して廃棄する。
２６．０．２５ｍＬの洗浄液２を加える。
２７．３分間混合する。
２８．チューブをマグネットラックに５分間置く。
２９．上清を吸引して廃棄する。
３０．０．２５ｍＬの洗浄液２を加える。
３１．３分間混合する。
３２．チューブをマグネットラックに５分間置く。
３３．上清を吸引して廃棄する。
３４．プレートを７０℃でヒートブロックに載せ、振とうしながら１５分置く。
３５．１２５μＬの溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加える。
３６．振とうしながら６５℃で２５分間インキュベートする。
３７．プレートを磁石に載せてビーズを捕集させ、８分間冷却する。
３８．溶出液を９６ウェルプレートに移し、－８０℃で保存する。回収できる／移すことができる容量は約１００μＬである。
［ＩＶ．重亜硫酸塩処理前ＤＮＡの定量化］
ＡＣＴＢ遺伝子を使用して試料中ＤＮＡを測定し、ゼブラフィッシュのプロセス対照の回収を評価するため、以降の処理を行う前にＤＮＡを測定してよい。以下のプロトコルを使用し、１０μＬの抽出ＤＮＡを使用するＱｕＡＲＴＳ ＰＣＲ－フラップ法の準備をする。
１．フォワードプライマー及びリバースプライマーを２μＭずつ、プローブ及びＦＲＥＴカセットを５μＭ、及びデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を２５０μＭずつ含有している１０×オリゴミックスを調製する。（プライマー、プローブ及びＦＲＥＴ配列については下記を参照のこと）
Figure 2023025184000006
２．マスターミックスを以下のとおり調製する。
Figure 2023025184000007
３．各試料を１０μＬずつ９６ウェルプレートのウェルにピペット採取する。
４．２０μＬのマスターミックスをプレートの各ウェルに加える。
５．プレートを密封し、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
６．以下の反応条件にしてプレートをリアルタイムサーマルサイクラーＡＢＩ７５００またはＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ４８０にかける
Figure 2023025184000008
［Ｖ．ＤＮＡの重亜硫酸塩変換及び精製］
１．血漿からのＤＮＡ抽出ステップで得た抽出ＤＮＡ試料をすべて解凍し、ＤＮＡをスピンダウンする。
２．試薬の調製：
Figure 2023025184000009
３．１００ｎｇ／μＬのＢＳＡ ＤＮＡ担体溶液５μＬをディープウェルプレート（ＤＷＰ）の各ウェルに加える。
４．各試料８０μＬをＤＷＰに加える。
５．調製されたばかりの１．６Ｎ ＮａＯＨの５μＬをＤＷＰ（複数可）の各ウェルに加える。
６．３０～４０μＬに設定したピペットを用いたピペット操作で気泡が発生しないよう慎重に混合する。
７．４２℃で２０分間インキュベートする。
８．１２０μＬのＢＩＳ ＳＬＮを各ウェルに加える。
９．最初の３分間は混合しながら６６℃で７５分間インキュベートする。
１０．７５０μＬのＢＮＤ ＳＬＮを加える。
１１．予めシリカビーズ（ＢＮＤ ＢＤＳ）を混合し、５０μＬのシリカビーズ（ＢＮＤ ＢＤＳ）をＤＷＰのウェルに加える。
１２．ヒーターシェーカー上で１，２００ｒｐｍ、３０℃で３０分間混合する。
１３．プレートマグネット上でビーズを５分間捕集し、その後、溶液を吸引し廃棄する。
１４．１ｍＬの洗浄緩衝液（ＣＮＶ ＷＳＨ）を加え、その後、プレートをヒーターシェーカーに移動させ、１，２００ｒｐｍで３分間混合する。
１５．プレートマグネット上でビーズを５分間捕集し、その後、溶液を吸引し廃棄する。
１６．０．２５ｍＬの洗浄緩衝液（ＣＮＶ ＷＳＨ）を加え、その後、プレートをヒーターシェーカーに移動させ、１，２００ｒｐｍで３分間混合する。
１７．プレートマグネット上でビーズを捕集し、その後、溶液を吸引し廃棄する。
１８．０．２ｍＬの脱スルホン化緩衝液（ＤＥＳ ＳＬＮ）を加え、３０℃、１，２００ｒｐｍで７分間混合する。
１９．マグネット上でビーズを２分間捕集し、その後、溶液を吸引し廃棄する。
２０．０．２５ｍＬの洗浄緩衝液（ＣＮＶ ＷＳＨ）を加え、その後、プレートをヒーターシェーカーに移動させ、１，２００ｒｐｍで３分間混合する。
２１．マグネット上でビーズを２分間捕集し、その後、溶液を吸引し廃棄する。
２２．０．２５ｍＬの洗浄緩衝液（ＣＮＶ ＷＳＨ）を加え、その後、プレートをヒーターシェーカーに移動させ、１，２００ｒｐｍで３分間混合する。
２３．マグネット上でビーズを２分間捕集し、その後、溶液を吸引し廃棄する。
２４．プレートをヒーターシェーカーに移動させて乾燥させ、１，２００ｒｐｍで混合しながら７０℃で１５分間インキュベートする。
２５．ＤＷＰの全試料にわたり８０μＬの溶出緩衝液（ＥＬＵＢＦＲ）を加える。
２６．１，２００ｒｐｍで混合しながら６５℃で２５分間インキュベートした。
２７．手作業で溶出液を９６ウェルプレートに移し、－８０℃で保存する。
２８．回収できる／移すことができる容量は約６５μＬである。
［ＶＩ．メチル化ＤＮＡを検出及び定量化するＱｕＡＲＴＳ－Ｘマルチプレックスフラップ法］
Ａ．マルチプレックスＰＣＲ（ｍＰＣＲ）の準備：
１．各関心対象メチル化マーカーのフォワードプライマー及びリバースプライマーを含有している１０×プライマーミックスを調製し、最終濃度が各々７５０ｎＭとなるようにする。上記実施例に記載のように、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを希釈剤として使用する。
２．１００ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０８％ Ｔｗｅｅｎ２０、０．０８％ ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを含有する１０×マルチプレックスＰＣＲ緩衝液を調製する。
３．マルチプレックスＰＣＲマスターミックスを以下のとおり調製する。
Figure 2023025184000010
４．ＤＮＡを解凍し、プレートをスピンダウンする。
５．２５μＬのマスターミックスを９６ウェルプレートに加える。
６．各試料を５０μＬずつ各ウェルに移す。
７．アルミ箔シールでプレートを密封する（ストリップキャップは使用しないこと）
８．蓋を加熱したサーマルサイクラーに入れ、以下のプロファイルを使用してサイクルに進み、約５～２０サイクル、好ましくは約１０～１３サイクル実施する。
Figure 2023025184000011
９．サーマルサイクリング完了後、アンプリコンの１：１０希釈を以下のとおり実施する。
ａ）１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡの１８０μＬをディープウェルプレートの各ウェルに移す。
ｂ）２０μＬの増幅試料を充填済みウェルの各々に加える。
ｃ）未使用チップ及び２００μＬピペッターを使用してピペット操作を繰り返し、希釈試料を混合する（エアロゾルを発生させないよう注意すること）。
ｄ）希釈済みプレートをプラスチックシールで密封する。
ｅ）希釈済みプレートを１０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
ｆ）希釈されていない残存するマルチプレックスＰＣＲ産物を新しいアルミ箔シールで密封する。－８０℃に置く。
［Ｂ．多重増幅ＤＮＡでのＱｕＡＲＴＳ法：］
１．魚類ＤＮＡ希釈液（２０ｎｇ／μＬ）を解凍し、アッセイで必要となるプラスミドキャリブレーター（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１５／０３３，８０３号を参照のこと）の希釈に使用する。以下の表を希釈の手引きとして使用する。
Figure 2023025184000012
２．マーカーＡ、Ｂ、及びＣについて以下の表を使用して１０×三重ＱｕＡＲＴＳオリゴミックスを調製する（例えば、関心マーカー、ならびに実施対照及び内部対照、例えば、β－アクチンまたはＢ３ＧＡＬＴ６など（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６２／３６４，０８２号を参照のこと））。
Figure 2023025184000013
例えば、重亜硫酸塩処理したβ－アクチン、Ｂ３ＧＡＬＴ６、及びゼブラフィッシュＲＡＳＳＦ１マーカーの検出には以下を使用してよいであろう。
Figure 2023025184000014
３．ＱｕＡＲＴＳフラップ法マスターミックスを以下の表を使用して調製する。
Figure 2023025184000015
４．９６ウェルＡＢＩプレートを使用し、２０μＬのＱｕＡＲＴＳマスターミックスを各ウェルにピペット採取する。
５．１０μＬの適切なキャリブレーターまたは希釈済みｍＰＣＲ試料を加える。
６．プレートをＡＢＩプラスチック製クリアシールで密封する。
７．プレートを３０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
８．以下のサーマルプロトコルで実施するようプログラムされたＡＢＩサーマルサイクラーにプレートを入れ、その後、装置をスタートさせる。
Figure 2023025184000016
希釈した増幅済みＤＮＡの分注量（例えば、１０μＬ）を、例えば上記のように、ＱｕＡＲＴＳ ＰＣＲ－フラップ法で使用する。その各々があらゆる目的のために参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１５年１０月３０日に出願された米国特許出願第６２／２４９，０９７号；２０１６年１０月２６日に出願された第１５／３３５，０９６号、及び２０１６年１０月２６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１６／５８８７５も参照のこと。
［血漿で大腸癌を検出するためのメチル化マーカーの選択及び試験］
Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ：濃縮提示重亜硫酸塩シークエンシング）のデータは、結腸癌患者１９例、ポリープ患者１９例、健常者１９例の組織、及び健常者のバフィーコートから抽出したＤＮＡ１９例で得たものである。
ヒトゲノム配列のインシリコでの重亜硫酸塩変換バージョンに対してアラインメントを行った後、各ＣｐＧアイランドにおける平均的メチル化を各試料種ごとに（すなわち、組織またはバフィーコート）算出し、マーカー領域を以下の基準に基づいて選択した。
・５０塩基対またはそれより長くなるよう領域を選択した。
・ＱｕＡＲＴＳフラップ法の設計では、ａ）プローブ領域、ｂ）フォワードプライマー結合領域、及びｃ）リバースプライマー結合領域の各々において、メチル化ＣｐＧを最低でも１つ有するよう領域を選択した。フォワードプライマー及びリバースプライマーの場合、メチル化ＣｐＧはプライマーの３’末端に近接するが、３’末端ヌクレオチドにはないことが好ましい。例示的なフラップエンドヌクレアーゼ法のオリゴヌクレオチドを図１に示す。
・好ましくは、関心領域内の任意のＣｐＧにおけるバフィーコートのメチル化は０．５％未満である。
・好ましくは、関心領域内のがん組織のメチル化は１０％超である。
・組織分析用に設計されたアッセイの場合、関心領域内の正常組織のメチル化は、好ましくは０．５％未満である。
上記基準に基づき、マーカーＡＮＫＲＤ１３Ｂ；ＣＨＳＴ２；ＣＮＮＭ１；ＧＲＩＮ２Ｄ；ＪＡＭ３；ＬＲＲＣ４；ＯＰＬＡＨ；ＳＥＰ９；ＳＦＭＢＴ２；ＳＬＣ１２Ａ８；ＴＢＸ１５；ＺＤＨＨＣ１；ＺＮＦ３０４；ＺＮＦ５６８；ＺＮＦ６７１；；ＤＯＣＫ２；ＤＴＸ１；ＦＥＲＭＴ３；ＯＰＬＡＨ；ＰＤＧＦＤ；ＰＫＩＡ；ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ；ＴＢＸ１５；ＴＳＰＹＬ５；ＶＡＶ３；及びＺＮＦ６７１を選択し、それらについてのＱｕＡＲＴＳフラップ法を図１に示すように設計した。
組織のスクリーニング結果から選択された２７のマーカーを重亜硫酸塩変換β－アクチン用アッセイと三重化し、上記のように血漿試料から単離したＤＮＡの試験に使用した。Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｍａｇｐｌｅｘアッセイを製造者のプロトコル（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．）に従って使用し、血漿中ＣＥＡタンパク質を測定した。２ｍＬの血漿試料（がん８９例及び正常９５例）から得たＤＮＡを抽出し、１２５μＬで溶出させた。抽出ＤＮＡの分注量１０μＬをＱｕＡＲＴＳ法で使用し、β－アクチン及びゼブラフィッシュ合成標的を検出した。ＤＮＡの分注量８０μＬを実施例１に記載のように重亜硫酸塩で変換し、７０μＬで溶出させた。
図１に示す標的のフォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して、マルチプレックスＰＣＲ反応を重亜硫酸塩変換したＤＮＡ試料の分注量５０μＬで実施し、実施例１に記載のように、ＱｕＡＲＴＳフラップ法を使用してマーカーを検出した。
個々のマーカーの感度に基づき、さらなる分析用に以下の１２のメチル化マーカー：ＶＡＶ３、ＺＮＦ６７１、ＣＨＳＴ２、ＦＬＩ１、ＪＡＭ３、ＳＦＭＢＴ２、ＰＤＧＦＤ、ＤＴＸ１、ＴＳＰＹＬ５、ＺＮＦ５６８、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＱＫＩを選択した。
全１２マーカーを、これらのマーカーについて図１に示すプライマーを使用して、共に事前増幅させた。事前増幅させた材料を、図１に示すプライマー及びプローブを使用して実施例１に記載のような多重化ＱｕＡＲＴＳ法で解析した。多重化アッセイを、以下のとおりグループ分けした。
Figure 2023025184000017
上記に加え、同一試料のＣＥＡタンパク質を上述のように測定した。データ及び結果を図３及び４に示す。特異度９０％における個々のマーカーの感度は以下のとおりであった。
Figure 2023025184000018
個々のマーカーの個々のカットオフ値９５％において、統合データセットを使用するための以下の最終感度を得た。
Figure 2023025184000019
アッセイの総合特異度は（８８／９５＝９２．６％）であった。
したがって、これらの１２のマーカーとＣＥＡタンパク質の組み合わせでは、すべての被験がん組織について感度６７％（がん９５例中８８例）、特異度９２．６％という結果であった。組織でアッセイした、このパネルのメチル化ＤＮＡマーカーは、どの種類の結腸癌についても極めて高度な識別を達成しつつ、正常な結腸組織では陰性のままである。このマーカーのパネル用のアッセイは、血液または体液を用いる試験にも適用することができ、例えば、結腸癌スクリーニングに利用される。
１つの色素に報告する複数の標的配列
複数の標的特異的一次切断反応を有するよう構成される、増幅フラップ切断法に関連した以下の実験では、単一ＦＲＥＴカセットに報告が行われるため、蛍光シグナルは単一色素チャンネルに生成される。検出されるべき異なる標的は、例えば、異なるマーカーもしくは遺伝子、異なる変異、または単一マーカーもしくは単一遺伝子の異なる領域であってよい。実施例３は、単一のＦＲＥＴカセット及び色素チャンネルを使用して、がん、例えば、大腸癌に関連する複数の異なるマーカーのメチル化を検出することに関し、実施例４は、単一のＦＲＥＴカセット及び色素チャンネルを使用して、単一マーカー内の複数領域を検出することに関する。
以下の実験に使用する試薬：
Figure 2023025184000020
Figure 2023025184000021

Figure 2023025184000022
［１つの色素に報告する複数マーカー］
上述のように、いくつかの実施形態では、単一ＦＲＥＴカセット及び単一色素チャンネルを使用して、１回の反応でのマーカー数がより多いことが望ましい。単一ＦＲＥＴカセット及び単一色素に報告する複数マーカーを検出する試験の開発に際し、単一色素チャンネルに報告する多重化反応に組み合わせるための、反応効率が同様のマーカー（すなわち、標的１コピーにつき、同量の検出可能シグナルを発生するもの）を選択した。反応効率が同じかまたは類似する検出法を組み合わせることによる利点は、アッセイのうちの１つに対する個別キャリブレーターのどれでも、効率が一致するあらゆる検出法にキャリブレーション標準として使用してよいことである。
複数マーカー／１つの色素系（ＳＦＭＢＴ２、ＶＡＶ３、及びＣＨＳＴ２）での試験用に３つのマーカーを選択した。これらの標的ＤＮＡを、オリゴヌクレオチドミックス中で混合し、ここで、３つのマーカーすべてに対するアッセイ用オリゴヌクレオチドは、同一のＦＲＥＴカセットに報告し、そのため同一色素（ＦＡＭ）に報告するように構成された。ＦＡＭ色素に報告する３つの疾患関連マーカーと、対照としての重亜硫酸塩変換β－アクチンＤＮＡを検出する試薬とを同じ反応で結合させた（ＱＵＡＳＡＲ６７０ ＦＲＥＴカセットを使用）。
プラスミドキャリブレーターでの試験を実施したところ、データは、単一色素に報告する複数マーカーの使用は、別々のウェルでマーカーを反応させる必要性を克服する効率的な方法であることを示した。
［実施例３．１］
単一ＦＲＥＴカセットに報告する、１つの多重反応で実施されるべき複数の異なるマーカーのＱｕＡＲＴＳフラップエンドヌクレアーゼ法では、多重構成で結合させた時に反応が平衡状態になれるよう、それぞれの個々のマーカーの反応効率を最初に分析した。重亜硫酸塩変換β－アクチン（ＢＴＡＣＴ）と二重鎖を形成した１つの色素（ＦＡＭ）に報告する３つの選択マーカー（ＶＡＶ３、ＳＦＭＢＴ２＿８９７及びＣＨＳＴ２＿７８９０）のアッセイ性能を決定するためアッセイを実施し、その際、Ｑｕａｓａｒ６７０チャネルに報告するシグナルを生成するように構成した。
また、アッセイは、３つのマーカーが同一チャネル（ＦＡＭ）に報告する場合に、各マーカーが同様のＱｕＡＲＴＳ法性能（傾き／切片／コピー数）を示すかどうかを決定するようにも構成された。
ＦＡＭ ＦＲＥＴカセットに報告する３つのメチル化マーカーすべてを検出する試薬を含むオリゴヌクレオチドミックスを調製した。オリゴヌクレオチドミックスは、Ｑｕａｓａｒ６７０に報告する対照としてのＢＴＡＣＴを検出する試薬を含んだ。このオリゴヌクレオチドミックスを、ＢＴＡＣＴ ＤＮＡ及びマーカー標的ＤＮＡを含む個々のプラスミドを含有しているプラスミド標的に対して試験した。計算を行い、１つのマーカーのキャリブレーター曲線を使用して他のマーカーを正確に定量化できるかどうかを調べた。すべての反応を４連で行った。
プロトコル：
１つのマーカーのプラスミド及び１つのＢＴＡＣＴ対照プラスミドをそれぞれ含むストックプラスミドの希釈（前出の試薬表を参照のこと）を、２０ｎｇ／μＬの魚類ＤＮＡ含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡの希釈液に以下のとおり調製した。
Figure 2023025184000023
上記で調製した３つのプラスミド混合液から以下の希釈を調製した：
Figure 2023025184000024
アッセイ用オリゴヌクレオチド（プライマー、プローブ、ＦＲＥＴカセット）及びｄＮＴＰを含む１０×オリゴヌクレオチドミックスを以下のとおり作製した：
Figure 2023025184000025
ＱｕＡＲＴＳフラップエンドヌクレアーゼ法の反応準備：
ＱｕＡＲＴＳ増幅反応用マスターミックスを以下のとおり調製する：
Figure 2023025184000026
［反応を以下のとおり準備した：］
マルチチャンネルピペットを使用して、２０μｌのマスターミックスを９６ウェルＱｕＡＲＴＳプレートにピペット採取する
１０μｌの試料を加える
プレートを密封し、３０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
以下の条件を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０でプレートを反応させ、ＦＡＭ、ＨＥＸ及びＱｕａｓａｒ６７０のチャンネル：４６５～５１０ｎｍ、５３３～５８０ｎｍ、及び６１８～６６０ｎｍで検出する
Figure 2023025184000027
［結果：］
ＶＡＶ３／ＢＴＡＣＴプラスミドキャリブレーター検量線を使用した鎖数計数：
Figure 2023025184000028
ＳＦＭＢＴ２＿８９７／ＢＴＡＣＴプラスミドキャリブレーター検量線を使用した鎖数計数：
Figure 2023025184000029
ＣＨＳＴ２＿７８９０／／ＢＴＡＣＴプラスミドキャリブレーター検量線を使用した鎖数計数：
Figure 2023025184000030
これらのデータから以下のことが示される：
・マーカー及び対照群を増幅させてまとめて検出した場合、交差反応性またはバックグラウンドシグナルは発生しなかった；
・Ｃｐ値はＣＨＳＴ２＿７８９０及びＶＡＶ３ともに同様であった；
・ＳＦＭＢＴ２＿８９７のＣｐ値はＣＨＳＴ２＿７８９０及びＶＡＶ３よりも早い段階のサイクルで現われ、ＱｕＡＲＴＳ法反応でこの方が高速あることを示している；
・ＳＦＭＢＴ２＿８９７の反応が速いため、ＳＦＭＢＴ２＿８９７キャリブレーターとオリゴヌクレオチドミックスの組み合わせにより、ＶＡＶ３及びＣＨＳＴ２＿７８９０について存在する鎖数が過小評価される；
・ＣＨＳＴ２＿７８９０キャリブレーターは、ＣＨＳＴ２＿７８９０のアッセイ反応と等しいアッセイ性能を示すＶＡＶ３の計算値を与えるが、ＳＦＭＢＴ２＿８９７の量を過大評価する；
・ＶＡＶ３キャリブレーターは、ＶＡＶ３のアッセイ反応と等しいアッセイ性能を示すＣＨＳＴ２＿７８９０の計算値を与えるが、ＳＦＭＢＴ２＿８９７の量の過大評価を発生させる；及び
・反応を平衡状態にするためには、ＳＦＭＢＴ２＿８９７を検出するＱｕＡＲＴＳ法の性能を低下させて、ＳＦＭＢＴ２＿８９７とＣＨＳＴ２＿７８９０の両標的の性能を合せる必要がある。
［実験３．２］
上記データは、ＳＦＭＢＴ２＿８９７のアッセイ反応は、より高いシグナルを生成することを示したが、これは、反応が高速であることを示している。これらのマーカーを多重化するためには、より低速なアッセイの効率と一致するよう（すなわち、ＶＡＶ３及びＣＨＳＴ２＿７８９０の両アッセイのシグナル出力と一致するよう）ＳＦＭＢＴ２＿８９７のアッセイを精密にしなければいけない。以下の実験で、ＳＦＭＢＴ２＿８９７のフォワードプライマーの濃度修正によりこれが達成されるかどうかを試験した。
プロトコル：
上記実験３．１に記載のようにアッセイを実施した。上掲の構成要素を含むが、最終アッセイ濃度が２００ｎＭ（実験３．１同様）、１００ｎＭ、または５０ｎＭとなるようＳＦＭＢＴ２＿８９７フォワードプライマーを減量させた１０×オリゴヌクレオチドミックスを構築した。他のアッセイ用プライマーすべての濃度は最終反応混合物中２００ｎＭであり、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒプロトコルは実験３．１に記載のものと同様であった。結果から、ＳＦＭＢＴ２＿８９７フォワードプライマー濃度の低下は、ＰＣＲ効率を反映するシグナル曲線の傾きまたは切片に対し何ら影響を及ぼさないようであることが示された（データ図示せず）。さらに、Ｃｐ値は変化しておらず、したがって、ＳＦＭＢＴ２＿８９７について計算した鎖数は、他のマーカー標的の計算鎖数と一致しなかった。
［実験３．３：］
以下の実験で、ＳＦＭＢＴ２＿８９７プローブの濃度修正により、ＳＦＭＢＴ２＿８９７のアッセイの効率が低下し、ＣＨＳＴ２＿７８９０及びＶＡＶ３の増幅反応のシグナル出力と一致するかどうかを試験した。上記実験３．１のようにアッセイを実施した。上掲の構成要素を含むが、最終アッセイ濃度が２５０ｎＭまたは１００ｎＭとなるような量のＳＦＭＢＴ２＿８９７プローブオリゴヌクレオチド、及びＣＨＳＴ２＿７８９０及びＶＡＶ３の両プローブが５００ｎＭで存在する（実験３．１に記載）、１０×オリゴヌクレオチドミックスを構築した。Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒプロトコルは実験３．１に記載のものと同様であった。
結果：
ＶＡＶ３／ＢＴＡＣＴプラスミドキャリブレーター検量線を使用した鎖数計数：
Figure 2023025184000031
ＳＦＭＢＴ２＿８９７／ＢＴＡＣＴプラスミドキャリブレーター検量線を使用した鎖数計数：
Figure 2023025184000032
ＣＨＳＴ２＿７８９０／ＢＴＡＣＴプラスミドキャリブレーター検量線を使用した鎖数計数：
Figure 2023025184000033
結果：
これらのデータは、プローブ濃度を調節して低くすることにより切片がわずかに増加し、ＰＣＲ効率（％）がわずかに高まることを示す。Ｃｐ値も増加するため、鎖数の計算では、キャリブレーション標準に他のマーカーを使用した計算結果と同様の値が得られた。
２５０ｎＭのＳＦＭＢＴ２＿８９７プローブ濃度では、３つのマーカーで同様の鎖数計算値が得られ、ＳＦＭＢＴ２＿８９７の鎖数値は他のマーカーよりわずかに高かった。５０ｎＭのプローブ濃度では、鎖数をわずかに過小評価する計算結果となったが、ある程度の改善が得られた。したがって、２００ｎＭプローブというＳＦＭＢＴ２＿８９７プローブ濃度を以降の試験用に選択した。
［実験３．４：］
この実験では、ＳＦＭＢＴ２＿８９７プローブを２００ｎＭ、他のプローブを５００ｎＭで提供する１０×オリゴヌクレオチドミックスに対する実験３．１に記載の標準条件（全マーカープローブとも５００ｎＭで使用）を試験した。この実験でも、複数の標的を使用し、そのすべてが同一のＦＲＥＴカセット及び色素を使用してシグナルを報告する単一反応で反応させることに相加効果があるかどうかを決定する。単一プラスミド標的、二重及び三重に組み合わせたプラスミド標的を使用し、どの標的組み合わせにも対照としてＢＴＡＣＴ標的を含めた。
１つのマーカーと対照の場合のプラスミド希釈：
単一マーカープラスミドとＢＴＡＣＴ対照プラスミドを用いる反応では、２０ｎｇ／μＬ魚類ＤＮＡ含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡの希釈液中に各プラスミドを１．００Ｅ＋０４コピー／μＬ含有している混合物を作製した。マーカープラスミドは、実験３．１の試薬表に記載されている。プラスミド混合液中の標的は以下のとおりであった。
－ＳＦＭＢＴ２＿８９７／ＢＴＡＣＴ
－ＣＨＳＴ２＿７８９０／ＢＴＡＣＴ
－ＶＡＶ３／ＢＴＡＣＴ
２つのマーカーと対照の場合のプラスミド希釈：
２つのマーカープラスミドとＢＴＡＣＴ対照プラスミドを用いる反応では、２０ｎｇ／μＬ魚類ＤＮＡ含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡの希釈液中に各プラスミドを１．００Ｅ＋０４コピー／μＬ含有している混合物を作製した。プラスミド混合液中の標的は以下のとおりであった。
－ＳＦＭＢＴ２＿８９７／ＶＡＶ３／ＢＴＡＣＴ
－ＣＨＳＴ２＿７８９０／ＶＡＶ３／ＢＴＡＣＴ
－ＣＨＳＴ２＿７８９０／ＳＦＭＢＴ２＿８９７／ＢＴＡＣＴ
３つのマーカーと対照の場合のプラスミド希釈：
３つのマーカープラスミドとＢＴＡＣＴ対照プラスミドを用いる反応では、２０ｎｇ／μＬ魚類ＤＮＡ含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡの希釈液中に各プラスミドを１．００Ｅ＋０４コピー／μＬ含有している混合物を作製した。プラスミド混合液は以下のとおりであった。
－ＶＡＶ３／ＣＨＳＴ２＿７８９０／ＳＦＭＢＴ２＿８９７／ＢＴＡＣＴ
プラスミド混合液の各々を使用して、魚類ＤＮＡ希釈液中に各プラスミドを１．００Ｅ＋０３コピー／μＬ及び１．００Ｅ＋０２コピー／μＬ有する溶液を調製した。
１０×オリゴヌクレオチドミックスは、３つのマーカーすべてのプライマーとプローブ及びＢＴＡＣＴ対照プラスミドのプライマーとプローブ含有し、プローブ濃度は各ＱｕＡＲＴＳ法反応で５００ｎＭ プローブが得られる濃度であるが、ＳＦＭＢＴ２＿８９７プローブについては、各反応で２００ｎＭの濃度のＳＦＭＢＴ２＿８９７プローブが得られる量で使用した。ＱｕＡＲＴＳ法構成成分を混合し、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒで実験３．１に記載のようにアッセイを実施した。
［結果：］
ＶＡＶ３／ＢＴＡＣＴプラスミドキャリブレーター検量線を使用した鎖数計数：
Figure 2023025184000034
単一マーカーと対照プラスミドの場合の鎖数：
Figure 2023025184000035
２つのマーカーと対照プラスミドの場合の鎖数：
Figure 2023025184000036
３つのマーカーと対照プラスミドの場合の鎖数：
Figure 2023025184000037
ＳＦＭＢＴ２＿８９７／ＢＴＡＣＴプラスミドキャリブレーター検量線を使用した鎖数計数：
Figure 2023025184000038
単一マーカーと対照プラスミドの場合の鎖数：
Figure 2023025184000039
２つのマーカーと対照プラスミドの場合の鎖数：
Figure 2023025184000040
３つのマーカーと対照プラスミドの場合の鎖数：
Figure 2023025184000041
ＣＨＳＴ２＿７８９０／ＢＴＡＣＴプラスミドキャリブレーター検量線を使用した鎖数計数：
Figure 2023025184000042
単一マーカーと対照プラスミドの場合の鎖数：
Figure 2023025184000043
２つのマーカーと対照プラスミドの場合の鎖数：
Figure 2023025184000044
３つのマーカーと対照プラスミドの場合の鎖数：
Figure 2023025184000045
これらのデータは、実験３．２に示した結果を確認し、ＳＦＭＢＴ２＿８９７プローブ濃度を下げて２００ｎＭに調節すると、このアッセイ反応の効率と、ＶＡＶ３及びＣＨＳＴ２＿７８９０の検出用反応の効率とが整列することを示している。また、これらのデータは、ある反応中の複数の標的が同一のＦＲＥＴカセット及び色素チャンネルにシグナルを報告すると、その反応で生成される蛍光シグナルの量に対する相加効果が結果に現われることも示す。驚くべきことに、バックグラウンドまたは交差反応性の増加は観察されなかった。データはさらに、ことを示す、ＶＡＶ３の希釈系列をキャリブレーション標準として使用した場合、曲線の下端におけるデータから計算したＳＦＭＢＴ２＿８９７及びＣＨＳＴ２＿７８９０のＤＮＡの鎖数は、これらの反応に実際に加えた量を過大評価する。ＶＡＶ３増幅曲線は、検量線の下端においてさらにばらつきがあり、他のマーカーの鎖数の過大評価が生じる。
［実験３．５：］
この実験では、ＶＡＶ３マーカーのプローブ濃度とプライマー濃度を調整して、ＶＡＶ３キャリブレーター曲線をＤＮＡ濃度算出用の基準曲線として使用する場合にレベルが低い標的についての過大評価が小さくなるようにした。
ＶＡＶ３の較正曲線では、ＢＴＡＣＴプラスミドと組み合わせたＶＡＶ３プラスミドを有する希釈系列は、実験３．４に記載のものと同様であった。３つのマーカーすべてとＢＴＡＣＴ対照を有するプラスミド希釈液を使用した。
３つのマーカーすべてのプライマーとプローブ及びＢＴＡＣＴ対照プラスミドのプライマーとプローブを含有する１０×オリゴヌクレオチドミックスを作製し、プライマー及びプローブは下記に示す濃度が得られるようにした。
１．ＶＡＶ３（４００ｎＭ プライマー）／ＳＦＭＢＴ２＿８９７（２００ｎＭ プローブ）／ＣＨＳＴ２＿７８９０／ＢＴＡＣＴ
２．ＶＡＶ３（７５０ｎＭ プローブ）／ＳＦＭＢＴ２＿８９７（２００ｎＭ プローブ）／ＣＨＳＴ２＿７８９０／ＢＴＡＣＴ
３．ＶＡＶ３／ＳＦＭＢＴ２＿８９７（２００ｎＭ プローブ）／ＣＨＳＴ２＿７８９０／ＢＴＡＣＴ
上記で示したプライマー濃度及びプローブ濃度の変形を除いては、他のプライマーすべての最終反応濃度は、各プライマーとも２００ｎＭであり、他のプローブすべての最終反応濃度は各プローブとも５００ｎＭであった。ＱｕＡＲＴＳ法反応物を混合し、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒで実験３．１に記載のようにアッセイを実施した。ＶＡＶ３キャリブレーション反応を図５Ａ～５Ｄに示す。図５Ｅでは、それぞれの条件下で測定した、２００鎖の標的ＤＮＡを有する反応の蛍光曲線を比較している。
いずれの条件修正でも、ＶＡＶ３アッセイの低キャリブレーターの傾きが改善されているが、これらの条件は、単一マーカーのオリゴヌクレオチドミックスと同じシグナルを生成させる。データは、単一マーカーミックスでは、検量線下端における鎖数を過大に評価するという問題はないことを示している。これらのデータに基づき、臨床試料でアッセイを試験する研究に各ＶＡＶ３プライマーを４００ｎＭ、及びプローブを５００ｎＭにすることを選択した。
［実験３．６］
この実験では、ヒト血漿臨床試料で複数マーカー／１色素という試料構成を試験する。血漿試料を、実施例２に記載のように標準的な１マーカー：１色素の方法を使用してあらかじめ試験した。１つの蛍光チャネル（ＦＡＭ）に報告するＶＡＶ３、ＳＦＭＢＴ２＿８９７及びＣＨＳＴ２＿７８９０を有するオリゴヌクレオチドミックスを使用して、同一試料を再度試験した。
実施例２では、ＤＮＡを一連の血漿試料から調製し、標的ＤＮＡをＱｕＡＲＴｓ法で増幅させた。実施例２で試料１０５～１２０（図３参照）から作製されたアンプリコン材料を１：１０で希釈し、３－標的／１対照オリゴヌクレオチドミックス（上記実験３．５）を使用して試験した。
単一マーカー／ＢＴＡＣＴプラスミドキャリブレーターの希釈は実験３．１に記載のものと同様であった。実験３．５に記載のように、すべての３つのマーカー及びＢＴＡＣＴ対照ＤＮＡそれぞれについてのプライマー及びプローブを含み、４００ｎＭの各ＶＡＶ３プライマー及び２００ｎＭのＳＦＭＢＴ２＿８９７プローブを有する反応を生成するように構成され、かつ、他のすべてのプライマーを２００ｎＭと他のすべてのプローブを５００ｎＭ有する、１０×オリゴヌクレオチドミックスを使用した。ＱｕＡＲＴＳ法を混ぜ合わせ、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒで実験３．１に記載のようにアッセイを実施した。各反応を二連で行った。結果を図６に示す。
これらのマーカー（図３より）を用いて試験した臨床試料１０５～１２０から得た元データを図６Ａにまとめている。すべてのマーカーが単一ＦＲＥＴカセット／単一色素に報告する三重化アッセイを使用した結果を図６Ｂにまとめている。
３つの異なるマーカーそれぞれの較正曲線を使用して、試料各々の標的鎖数を別々に計算した。どの検量線を使用したかにかかわらず得られた鎖数値は同様であった。さらに、単一色素構成を使用した試料各々の鎖数は、実施例２で別々のＦＲＥＴカセット及び別々の色素チャンネルを使用して測定したこのセットのマーカーの総合鎖数に近似していた。さらに、検出された鎖がゼロであった試料、すなわち、実施例２の実験でシグナルを生成しなかった試料は、１色素構成に報告する複数マーカーを使用した場合にゼロのままであったことから、多重化反応が１ＦＲＥＴカセット／単一色素チャンネルに報告する場合はバックグラウンドシグナルは増加しないことが示される。
これらの結果は、１つのＦＲＥＴカセット及び同一色素に報告する複数の異なる標的部位、例えば、複数の異なるマーカー遺伝子を使用することにより検出感度を高めることができることを示し、また、多重の組み合わせは、シグナル検出に利用可能な色素チャンネルの数による制限を受けなくて済むことも示している。さらに、この方法の使用は、反応ウェルごとに単一色素を有していなければならないというわけではない。例えば、アッセイを、第１の色素（例えば、ＦＡＭ）に報告する３つ（またはそれ以上）のマーカー、及び第２の色素（例えば、ＨＥＸ）に報告する３つ（またはそれ以上）のマーカーを有し、核酸試料の単一調製物に対し、単一反応で試験され得るマーカーの数が２倍になるように構成することができるであろう。さらなるセットのマーカー及び／または１つ以上の内部対照標的に対し、さらなる色素チャンネルを使用してよい。
［１つの色素に報告するマーカーの複数領域］
本明細書で上述した方法を使用した際に正常血漿で少ない、またはゼロの鎖数を示した３つのメチル化マーカーＶＡＶ３（８７７）、ＳＦＭＢＴ２（８９７）、及びＣＨＳＴ２（７８９０）について、マーカー各々の内部の他の領域を標的にするさらなるＱｕＡＲＴＳ法オリゴヌクレオチドセットを設計して試験を行い、これにより、同一反応においてマーカーのさらなる領域を検出し、同一色素チャンネルに報告することで、各マーカーのシグナル対雑音比を増加させ、それによりアッセイ感度が、例えば、がんの検出などにおいて高まるかどうかを検討した。
これらのマーカー各々について、がん組織と正常組織の間に特異的メチル化があることがＲＲＢＳで決定された２つの異なる領域を同定した。それらの領域は以下のとおりである。
－ＶＡＶ３領域８７７：ｃｈｒ１：１０８５０７６１８～１０８５０７６７５
－ＶＡＶ３領域１１８７８：ｃｈｒ１：１０８５０７４０６～１０８５０７４９９
－ＳＦＭＢＴ２領域８９５：ｃｈｒ１０：７４５２３３７～７４５２４０６
－ＳＦＭＢＴ２領域８９７：ｃｈｒ１０：７４５２８６５～７４５２９２２
－ＣＨＳＴ２領域７８９０：ｃｈｒ３：１４２８３８８４７～１４２８３９０００
－ＣＨＳＴ２領域７８８９：ｃｈｒ３：１４２８３８３００～１４２８３８３８８
［実験４．１］
ＨＥＸ色素に報告するＣＨＳＴ２領域（７８８９及び７８９０）を個別反応及び統合反応の両方で試験し、統合させた場合にそれら２つの領域間で何らかの相乗効果があるか評価した。ＣＨＳＴ２インサートを含有しているキャリブレータープラスミドを実験３．１に記載のように希釈し、１μＬあたり１Ｅ４～１Ｅ０コピーの希釈系列を得た。領域７８８９の個々の検出では、アッセイ反応には、フォワードプライマーとリバースプライマー及びＣＨＳＴ２＿７８８９用アーム１プローブ、アーム１ ＨＥＸ ＦＲＥＴカセット、ならびにプライマー及びＢＴＡＣＴ対照用アーム３プローブが含有され、これと共にアーム３ Ｑｕａｓａｒ６７０ ＦＲＥＴカセットが含有された。領域７８９０の個々の検出では、アッセイ反応には、フォワードプライマーとリバースプライマー及びＣＨＳＴ２＿７８９０用アーム１プローブ、アーム１ ＨＥＸ ＦＲＥＴカセット、ならびにプライマー及びＢＴＡＣＴ対照用アーム３プローブが含有され、これと共にアーム３ Ｑｕａｓａｒ６７０ ＦＲＥＴカセットが含有された。統合させた反応には、ＣＨＳＴ２＿７８８９及び７８９０両方についてのアーム１のプローブとプライマーからなる完全セットと共に、ＢＴＡＣＴ検出用オリゴヌクレオチド及び２つの同一ＦＲＥＴカセットが含有された。
１０×オリゴヌクレオチドミックスには、それぞれのＱｕＡＲＴＳ法反応で各プローブが５００ｎＭ、また各プライマーが２００ｎＭ得られる濃度のプライマー及びプローブが含有された。ＱｕＡＲＴＳ法構成成分を混合し、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒで実験３．１に記載のようにアッセイを実施した。
統合させた反応では、単一ＦＲＥＴカセットを使用して、これらの２つの領域に同一色素に報告させてもシグナルの増加はもたらされないことがわかった。ＣＨＳＴ２＿７８８９の増幅の方が実質的に効率的であり、得られたシグナルの大半を占めると思われたことから、実施例３で考察したように、異なる反応は、効率がより類似するよう修正しなければならないことが示唆される。
［実験４．２］
異なる領域同士の反応速度論を平衡にするために各マーカーの各領域対｛ＣＨＳＴ２（７８８９及び７８９０）、ＳＦＭＢＴ２（８９５及び８９７）及びＶＡＶ３（８７７及び１１８７８）｝に対してどのプローブ濃度を使用するべきかを決定するため実験を行った。１０×オリゴヌクレオチドミックスを作製し、アッセイ用オリゴヌクレオチドの以下の混合物を、示されている最終濃度で得た。
Figure 2023025184000046
Figure 2023025184000047

Figure 2023025184000048

Figure 2023025184000049

Figure 2023025184000050

Figure 2023025184000051

Figure 2023025184000052

Figure 2023025184000053
ＱｕＡＲＴＳ法構成成分を混合し、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒで実験３．１に記載のようにアッセイを実施した。異なる反応条件下で達成された平均Ｃｐ値は以下のとおりである。
Figure 2023025184000054
これらのデータは、各マーカーの２つの領域それぞれについて、プローブ濃度を変化させることにより個々のアッセイのＣｐ値を較正曲線の５つの点それぞれがＣｐ値１未満になる点まで調整可能であることを示す。被験マーカーでは、ＱｕＡＲＴＳ法反応で以下のプローブ濃度を使用することにより、標的領域セットに対しバランスのとれた反応効率が得られた。
Figure 2023025184000055
［実験４．３］
多重化反応において複数領域／１色素というアッセイ構成を使用するため、新しい三重鎖反応（元の三重鎖反応構成については実施例２を参照のこと）を設計した。下記「プール１７」は６つのマーカーからなるセットの一覧であり、β－アクチン対照と共増幅させ、その後、下記に示すグループに分け三重ＱｕＡＲＴＳ法で解析した。プール１７＋ＭＲ－ＯＤは、ＳＦＭＢＴ２、ＶＡＶ３、及びＣＨＳＴ２の各マーカー用に複数領域／１色素というアッセイ構成を含むよう構成されている。ＪＡＭ３、ＺＮＦ６７１、及びＺＮＦ５６８のアッセイ設計は、図１及び図２に示されるとおりにした。プールの各グループ分けの３文字または４文字の略語は、各遺伝子名の頭文字に、β－アクチン対照を示すＡを付したものである。
Figure 2023025184000056
上掲グループの全標的領域を含むプール１７マルチプレックスを、アッセイ反応１回につき各標的の鎖を２ｅ５～２ｅ１提供する一連の希釈液に含んでいるプラスミドキャリブレーション希釈系列で、新しい三重鎖処方を試験した。ＳＦＭＢＴ２、ＶＡＶ３、及びＣＨＳＴ２のＭＲ－ＯＤのプローブ最終濃度は、実験４．２の結果に記載されているものと同様であった。ＪＡＭ３、ＺＮＦ６７１、及びＺＮＦ５６８のマーカー用プローブ及びＢＴＡＣＴ対照用プローブは１μＭであった。全ＦＲＥＴカセットとも最終反応混合物中で５００ｎＭであった。ＱｕＡＲＴＳ法構成成分を混合し、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒで実験３．１に記載のようにアッセイを実施した。
ＶＡＶ３－８７７とＶＡＶ－１１８７８とを含有している三重鎖の性能は予測通りであり、反応に加えた標的数に対し約２～３倍の鎖数増加が得られ、領域が１つしかない標的は標的として指向されていた。しかしながら、ＣＨＳＴ２－７８８９＿ＣＨＳＴ－７８９０及びＳＦＭＢＴ２－８９５＿ＳＦＭＢＴ２－８９７を含有している三重鎖は、期待された相加的シグナルを示さなかった。上記のようにグループ分けした多重ＱｕＡＲＴＳ法で試験するため、ＣＨＳＴ２－７８８９＿ＣＨＳＴ２－７８９０及びＳＦＭＢＴ２－８９５＿ＳＦＭＢＴ２－８９７のプローブの異なる濃度を使用してさらなる実験を行った。三重鎖フォーマット内では、ＣＨＳＴ２＿７８８９及びＣＨＳＴ２＿７８９０のプローブ濃度を修正して、プラスミド較正曲線に基づく、予測されたＭＲ＿ＯＤの結果（すなわち、個々の反応について予測された相加的な値を有する結果）を達成することが可能であった。しかしながら、ＳＦＭＢＴ２＿８９５及びＳＦＭＢＴ２＿８９７のアッセイは、修正したプローブ濃度を使用して改善されたものの、三重鎖フォーマットで使用した場合、アッセイでは依然として、２つの領域の検出に期待される２００％という予測レベルを下回るシグナルが生成された。それでもなお、血漿試料で三重鎖アッセイを試験するため、プローブの以下の修正濃度を選択した。
Figure 2023025184000057
［実験４．４］
この実験では、健常者及びがん患者から得たヒト血漿試料を試験するために、複数領域－１色素というアッセイ設計を使用する三重ＱｕＡＲＴＳ法による検出と多重鎖事前増幅とを統合することの効果を調べた。実験では、プール１７の１３のメチル化マーカー（他にプロセス対照であるＺＦ＿ＲＡＳＳＦ１）の検出と、プール１７＋ＭＲ＿ＯＤ構成を使用した検出とを、正常血漿試料６３例及び結腸癌血漿試料１２例で比較した。プール１７のマーカーを共に事前増幅で共増幅させ、その後、下記一覧のグループ分けされた反応で、実施例１に詳述されるように事前増幅ＤＮＡを検出した。
Figure 2023025184000058
三重鎖の名称は、含まれているマーカー各々の頭文字と、β－アクチン対照の「Ａ」とを含む。右列で、三重鎖名称中の繰り返し文字（例えば、「ＪＳＳＡ」）は、１種のマーカーが２つの異なる領域で試験されたことを示す。
実施例１に記載のようにＤＮＡを血漿試料から単離した。多重増幅ＤＮＡに対し、重亜硫酸塩変換、多重鎖事前増幅、及びＱｕＡＲＴＳ法を実施例１に記載のように行った。重亜硫酸塩変換の前に、単離したＤＮＡの分注量を、ＫＲＡＳ ３８Ａ及び３５Ｃの変異を未変換ＤＮＡで試験するために確保した。各マーカーに使用した増幅プライマー及び検出プローブを図１及び２に示した。
以下に示すように、ＶＡＶ３、ＳＦＭＢＴ２、ＣＨＳＴ２、及びＺＮＦ６７１の反応あたりの鎖数を使用するロジスティック線形回帰適合度は、ＱｕＡＲＴｓをＭＲ＿ＯＤ（複数領域＿１色素）と組み合わせて使用した場合に、ＱｕＡＲＴｓ法の標準構成と比べてかなりの優位性を示した。これらの解析では、マーカーＺＮＦ６７１が検出結果の主な寄与因子となっており、これをＱｕＡＲＴｓ単独及びＱｕＡＲＴｓ＋ＭＲ＿ＯＤのいずれのロジスティック適合度にも含めた。上記のように、未変換ＤＮＡでのＫＲＡＳ ３８Ａ及び３５Ｃの変異もまた試験した。
標準の三重鎖アッセイで多重鎖事前増幅を使用した場合は以下の感度及び特異度が得られた。
Figure 2023025184000059
複数領域／１色素という構成を使用した場合の感度及び特異度は以下のとおりであった。
Figure 2023025184000060
試料サイズは小さくても、このように複数領域を１色素に対応させる（ＦＲＥＴカセット）構成は、感度において実質的な改善を示すが、特異度がいくらか損われる場合がある。
この実施例では血漿試料から単離されたＤＮＡを検出したが、このパネルのマーカー、及び上記のように修正した多重鎖ＱｕＡＲＴＳ法の使用は、糞便または他の血液または体液を用いる試験に適用可能であり、例えば、結腸癌及び他のがんのスクリーニングに利用されることに留意すべきである。
特許、特許出願、記事、書籍、論文、及びインターネットウェブページなどを含むが、これに限定されない、本出願で引用された文献及び同様の材料はいずれも、いかなる目的のためでも参照によりその全体が明白に組み込まれる。特に明記しないかぎり、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本明細書に記載のさまざまな実施形態が属する分野の当業者が共通して理解する意味と同じ意味を持つ。組み込まれている参照中の用語の定義が、本願教示に記載される定義と異なる場合、本願教示に記載の定義が優先するものとする。
記載のように技術の範囲及び趣旨から逸脱することなく、記載されている組成物、方法、及び技術使用についてのさまざまな修正及び変形は、当業者には明らかであろう。技術は、具体的な例示の実施形態と関連させて記載されているが、主張される本発明がそのような具体的な実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されるべきである。事実、薬理学、生化学、医学、または関連分野の当業者には明白である、本発明を実施するための記載方法の各種変更は、以下の請求項の範囲内であることが意図される。

Claims (1)

  1. ａ）対象からの試料を提供すること、
    ｂ）ＡＮＫＲＤ１３Ｂ；ＣＨＳＴ２；ＣＮＮＭ１；ＧＲＩＮ２Ｄ；ＪＡＭ３；ＬＲＲＣ４；ＯＰＬＡＨ；ＳＥＰ９；ＳＦＭＢＴ２；ＳＬＣ１２Ａ８；ＴＢＸ１５；ＺＤＨＨＣ１；ＺＮＦ３０４；ＺＮＦ５６８；ＺＮＦ６７１；ＤＯＣＫ２；ＤＴＸ１；ＦＥＲＭＴ３；ＯＰＬＡＨ；ＰＤＧＦＤ；ＰＫＩＡ；ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ；ＴＢＸ１５；ＴＳＰＹＬ５；ＶＡＶ３；ＦＥＲ１Ｌ４；及びＺＮＦ６７１からなるメチル化マーカー遺伝子群から選択される、少なくとも１つのメチル化マーカーＤＮＡの量について前記試料をアッセイすること、
    ｂ）前記試料中の標準核酸の量について前記試料をアッセイすること
    を含む、対象からの試料を特徴付ける方法。
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