JP2023025184A5 - メチル化ｄｎａの分析による腫瘍の検出 - Google Patents

Claims (22)

1. ヒト対象から得た血漿試料で腫瘍をスクリーニングする方法であって、
   ａ）前記血漿試料からＤＮＡを抽出すること；
   ｂ）前記抽出ＤＮＡを、複数の異なるメチル化マーカーＤＮＡの量についてアッセイすること、ただし、前記複数の異なるメチル化マーカーＤＮＡは、ＧＲＩＮ２Ｄ；ＺＮＦ６７１；ＶＡＶ３；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；及びＱＫＩからなる群から選択される少なくとも２つのメチル化マーカーＤＮＡを含む；
   ｃ）前記試料中の標準核酸の量について前記抽出ＤＮＡをアッセイすること、
   ｄ）前記抽出ＤＮＡにおいて、前記メチル化マーカーＤＮＡの量と前記標準核酸の量とを比較し、前記試料中の前記メチル化マーカーＤＮＡのメチル化状態を決定すること；及び
   ｅ）少なくとも１つの前記複数のメチル化マーカーＤＮＡの前記メチル化状態が、腫瘍のない対象にてアッセイしたメチル化マーカーＤＮＡのメチル化状態と異なる場合に、前記対象を、腫瘍があると同定すること、
   を含む、前記方法。
2. 前記血漿試料からＤＮＡを抽出することは、前記血漿試料にゼブラフィッシュｒａｓｓｆ１遺伝子の少なくとも一部を含むゼブラフィッシュＤＮＡヌクレオチド配列を含むメチル化ＤＮＡを含む組成物を加えることを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記アッセイは、前記試料から得たＤＮＡを、得られたＤＮＡ中の非メチル化シトシン残基を選択的に修飾して修飾残基を生成する試薬で処理することを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記試薬は、重亜硫酸塩試薬である、請求項３に記載の方法。
5. 前記標準核酸は、Ｂ３ＧＡＬＴ６ ＤＮＡを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記複数の異なるメチル化マーカーＤＮＡはさらに、ＡＮＫＲＤ１３Ｂ；ＬＲＲＣ４；ＯＰＬＡＨ；ＳＥＰ９；ＳＬＣ１２Ａ８；ＺＮＦ３０４；ＤＯＣＫ２；ＦＥＲＭＴ３；ＰＫＩＡ；ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ；及びＴＢＸ１５からなる群から選択されるメチル化マーカーＤＮＡを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記方法はさらに、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）タンパク質について前記試料をアッセイすることを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記試料中のメチル化マーカーＤＮＡの量のアッセイは、前記メチル化マーカーＤＮＡの１つの塩基の前記メチル化状態を決定することを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記試料中のメチル化マーカーＤＮＡの量のアッセイは、メチル化マーカーＤＮＡの複数の塩基におけるメチル化の程度を決定することを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記試料中のメチル化マーカーＤＮＡの量は、メチル化マーカー遺伝子のメチル化状態を示し、ここで、前記メチル化マーカー遺伝子の前記メチル化状態は、
    －正常試料中の前記メチル化マーカー遺伝子の量より増量した量の前記メチル化マーカー遺伝子；
    －正常試料中の前記メチル化マーカー遺伝子のメチル化パターンと比べて、前記マーカー遺伝子の異なるパターンのメチル化、
    の少なくとも１つを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記腫瘍は結腸腫瘍である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記アッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応、核酸シークエンシング、質量分析法、メチル化特異的ヌクレアーゼ、質量による分離法、標的捕捉、フラップエンドヌクレアーゼ法、またはマルチプレックス増幅を使用することを含み、少なくとも２つのメチル化マーカーＤＮＡの量の決定は、メチル化特異的ＰＣＲ、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素解析、定量的バイサルファイトパイロシークエンス法、フラップエンドヌクレアーゼ法、ＰＣＲ－フラップ法、及びバイサルファイトゲノムシークエンシングＰＣＲからなる群から選択される１つ以上の方法を使用することを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. ａ）複数のオリゴヌクレオチドであって、前記複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つの少なくとも一部が、ＧＲＩＮ２Ｄ；ＺＮＦ６７１；ＶＡＶ３；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；及びＱＫＩからなる群から選択されるメチル化マーカーＤＮＡに対して特異的にハイブリダイズし、前記複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのさらなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、ＧＲＩＮ２Ｄ；ＺＮＦ６７１；ＶＡＶ３；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；及びＱＫＩからなる群から選択される異なるメチル化マーカーＤＮＡに対して特異的にハイブリダイズする、複数のオリゴヌクレオチド；
    ｂ）少なくとも１つの標準オリゴヌクレオチドであって、前記少なくとも１つの標準オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、標準核酸に対し特異的にハイブリダイズする、少なくとも１つの標準オリゴヌクレオチド；
    並びに任意に
    ｃ）以下のうち１つ以上
    －ゼブラフィッシュｒａｓｓｆ１遺伝子の少なくとも一部を含むゼブラフィッシュＤＮＡヌクレオチド配列を含むメチル化ＤＮＡ；
    －ゼブラフィッシュｒａｓｓｆ１オリゴヌクレオチドであって、前記ゼブラフィッシュｒａｓｓｆ１オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、ゼブラフィッシュｒａｓｓｆ１遺伝子の少なくとも一部を含むゼブラフィッシュＤＮＡヌクレオチド配列を含む前記メチル化ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする、ゼブラフィッシュｒａｓｓｆ１オリゴヌクレオチド；
    －重亜硫酸塩；
    －ＣＥＡタンパク質検出用試薬；
    －固体支持体；及び
    －１つ以上の捕捉用試薬、
    を含む、ヒト対象から得られた試料における腫瘍のスクリーニングに使用するための、キット。
14. 前記標準核酸は、Ｂ３ＧＡＬＴ６ ＤＮＡを含む、請求項１３に記載のキット。
15. 前記固体支持体は、磁気ビーズである、請求項１３または請求項１４に記載のキット。
16. 前記１つ以上の捕捉用試薬は、前記複数のメチル化マーカーＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項１３～１５のいずれか１項に記載のキット。
17. 前記１つ以上の捕捉用試薬は、前記標準核酸に相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項１３～１６のいずれか１項に記載のキット。
18. 前記複数のオリゴヌクレオチドにおける前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、核酸プライマー一対、核酸プローブ、及び侵入オリゴヌクレオチドのうちの１つ以上から選択される、請求項１３～１７のいずれか１項に記載のキット。
19. 少なくとも２つの複合体を含む反応混合物を含む組成物であって、
    それぞれの複合体は、腫瘍があると疑われるヒト対象からの血漿試料から抽出した標的ＤＮＡ、及び、オリゴヌクレオチドを含み、それぞれの前記複合体において、前記オリゴヌクレオチドは、前記標的ＤＮＡに対して特異的にハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドは任意に１つ以上のフルオロフォア及びフラップ配列を含み；前記複合体は、
    ｉ）オリゴヌクレオチドに対して特異的にハイブリダイズする、ＧＲＩＮ２Ｄ；ＺＮＦ６７１；ＶＡＶ３；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；及びＱＫＩからなる群から選択される標的ＤＮＡを含む、第１の複合体；及び
    ｉｉ）オリゴヌクレオチドに対して特異的にハイブリダイズする、ＧＲＩＮ２Ｄ；ＺＮＦ６７１；ＶＡＶ３；ＣＨＳＴ２；ＦＬＩ１；ＪＡＭ３；ＳＦＭＢＴ２；ＰＤＧＦＤ；ＤＴＸ１；ＴＳＰＹＬ５；ＺＮＦ５６８；及びＱＫＩからなる群から選択される異なる標的ＤＮＡを含む、少なくとも１つのさらなる複合体、
    からなる群から選択される、組成物。
20. ゼブラフィッシュｒａｓｓｆ１遺伝子の少なくとも一部を含むゼブラフィッシュＤＮＡヌクレオチド配列を含むメチル化ＤＮＡをさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
21. ＦＲＥＴカセットの１つ以上；ＦＥＮ－１エンドヌクレアーゼ；及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１９または請求項２０に記載の組成物。
22. Ｂ３ＧＡＬＴ６ ＤＮＡを含む標準核酸、及び前記Ｂ３ＧＡＬＴ６ ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の組成物。