KR20230169273A - 대장암 검출용 조성물, 키트 및 응용 - Google Patents

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Abstract

대장암 검출용 조성물, 키트 및 응용을 제공한다. 제공된 조성물은 ADHFE1 유전자, PPP2R5C 유전자 및 SDC2 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 시약을 포함하고, 대장암을 검출하는 데 사용될 수 있으며, 높은 민감도와 특이도를 갖는다.

Description

대장암 검출용 조성물, 키트 및 응용
본 발명은 생명공학 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 대장암 검출용 조성물, 키트 및 응용에 관한 것이다.
대장암은 하부 소화기관의 결장, 직장 부위에 발생하는 흔한 악성 종양이다. 최신 통계수치에 따르면 전세계 범위 내에서 대장암 신규 발병 사례 건수는 남성에서 3위, 여성에서 2위이고, 사망자 비율은 남성에서 4위, 여성에서 3위인 것으로 나타났다(Bray 등, 2018). 중국의 대장암 예방 및 통제 상황도 매우 심각하여 악성 종양 신규 발병 사례 중 3위(38.8만명), 사망 사례 중 5위(18.7만명)(Zheng Rongshou 등, 2019)를 기록하고 있다. 대장암은 천천히 진행되며, 일반적으로 용종, 선종, 장암 등 과정을 거치게 되고, 선종에서 장암까지 진행되는 시간은 길게는 5~10년이 걸린다. 하지만 대장암 진행 조기에 개입한다면 사망률을 현저히 줄일 수 있다. I기 대장암 환자의 5년 생존율은 90% 이상에 달할 수 있는 반면, IV기 대장암 환자의 5년 생존율은 20% 미만이다(Marzieh Araghi 등, 2020).
종래의 대장암 조기 선별 기술에는 주로 대장 내시경, 대변 잠혈 검사, 종양 마커 CEA 및 CA19-9 등이 포함되는데, 이러한 기술적 수단에는 현재 일정한 제한이 있다. 대장 내시경 검출은 장암 진단의 최적 기준으로서, 항문에서 렌즈와 광원을 삽입하여 캐비티에 따라 직장, 구불결장 등 부위를 거쳐 회장의 말단에 도달할 수 있으며, 이미지를 실시간으로 모니터에 전송하여 조작 의사가 관찰하도록 할 수 있다. 대장 내시경 이미지는 직관적이고 선명하여 암, 용종, 궤양, 출혈 등 다양한 병변을 관찰할 수 있으며, 용종 등에 대해서도 렌즈 하에 제거 등 조작을 수행할 수 있다. 그러나 이는 침습적 검출 기술로, 준비 과정이 복잡하고, 식이조절과 장 세척이 필요하며, 수검자의 순응도가 낮다. 또한 기기 및 인력에 대한 요구사항이 있는 바, 병원에서 전문과 및 마취사가 조작해야 하며, 일부 수검자는 불편함을 느끼고 합병증의 위험이 있다(3~5건/1000명). 대변 잠혈 검사는 대변 내 혈액 성분(헤모글로빈)을 검출하여 소화기관 출혈 유무를 판별하여 의사가 장암의 위험도를 판단할 수 있도록 하는 비침습적 방법이다. 상기 방법은 빠르고 쉬우며 수검자의 순응도가 높다. 그러나 상기 검출 방법은 간, 혈액 제품, 녹황색 채소 등의 식단 영향으로 위양성이 나타남과 동시에 출혈량이 적은 조기 대장암 환자에 대한 민감도가 낮아 진단 누락이 발생하기 쉽다. 또한 CEA 등은 광범위한 종양 마커로서, 특이도가 낮고 많은 위양성이 발생하기 쉬우며 민감도도 제한적이다. 따라서, 정확하고 간편하며 경제적인 대장암 조기 선별 방법의 확립이 필요하다.
DNA 메틸화는 유전자의 발현과 침묵을 조절할 수 있는 중요한 유전자 발현 조절 기전으로, 종양의 발생과 진행에 상당한 영향을 미친다. 암 관련 유전자의 비정상적인 메틸화는 종종 암 발생 조기에 나타나므로, DNA 메틸화 신호는 잠재적인 종양 조기 선별 마커로 간주된다. 인간의 분변 샘플에는 메틸화 등의 정보를 담고 있는 장 세포 DNA가 혼합되어 있으며, 이러한 정보를 검출 및 분석함으로써 수검자가 장암에 걸렸을 가능성을 유추할 수 있다. SFRP2, SEPT9, NDRG4 및 SDC2(Hannes M M
Figure pct00001
ller 등, 2004; Jie Chen 등, 2019)와 같은 일부 유전자는 이미 분변에서 장암 검출을 위한 메틸화 마커로 사용 가능한 것으로 입증되었지만 이들의 성능은 임상적 요구를 완전히 충족시킬 수 없는데, 예를 들어 장암에 대한 SFRP2의 민감도와 특이도는 77%에 불과하다(Hannes M M
Figure pct00002
ller 등, 2004).
본 발명은 관련 기술의 기술적 과제 중 하나를 적어도 어느 정도 해결하기 위해 대장암 검출용 조성물, 키트 및 응용을 제공한다. 제공된 조성물은 대장암을 검출하는 데 사용될 수 있고, 높은 특이도와 민감도를 가지며, 임상적 검출을 보조할 수 있어 대장암의 진단 및 검출을 풍부하게 한다.
구체적으로, 본 발명은 하기와 같은 기술적 해결수단을 제공한다.
본 발명의 제1 양태에서, 본 발명은 ADHFE1 유전자, PPP2R5C 유전자 및 SDC2 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 시약을 포함하는 대장암 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 제2 양태에서, 본 발명은 상기 제1 양태의 대장암 검출용 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 제3 양태에서, 본 발명은 샘플 내 유전자의 메틸화 상태 결정 방법을 제공하며, 상기 유전자는 SDC2 유전자, ADHFE1 및 PPP2R5C 유전자를 포함하고, 상기 방법은,
(1) 상기 샘플로부터의 게놈 DNA를 얻는 단계;
(2) 상기 게놈 DNA를 메틸화 전환 처리하여 전환 생성물을 얻되, 상기 게놈 DNA는 메틸화 처리되고, 메틸화 부위와 비메틸화 부위는 차이를 나타내는 단계; 및
(3) 프라이머 세트와 프로브를 이용하여 상기 전환 생성물에 대한 형광 정량적 PCR 검출을 수행하여 샘플 내 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제4 양태에서, 본 발명은 분리된 핵산 서열을 제공하며, 상기 분리된 핵산 서열은 프라이머 세트 및 프로브를 포함하고, 상기 프라이머 세트는, (a) SEQ ID NO:3~SEQ ID NO:40으로 표시되는 서열 중 적어도 한쌍;
(b) SEQ ID NO:41~SEQ ID NO:60으로 표시되는 서열 중 적어도 한쌍; 및
(c) SEQ ID NO:61~SEQ ID NO:98로 표시되는 서열 중 적어도 한쌍을 포함하며,
상기 프로브는,
SEQ ID NO:100~SEQ ID NO:112로 표시되는 서열 중 적어도 하나;
SEQ ID NO:113~SEQ ID NO:127로 표시되는 서열 중 적어도 하나; 및
SEQ ID NO:128~SEQ ID NO:142로 표시되는 서열 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명의 제5 양태에서, 본 발명은 피험자의 대장암 발병 상태 평가 방법을 제공하며, 상기 방법은, a) 피험자의 샘플을 제공하되, 상기 샘플은 상기 피험자의 표적 핵산을 함유하고, 상기 표적 핵산은 ADHFE1 유전자, PPP2R5C 유전자 및 SDC2 유전자를 포함하는 단계; b) 상기 표적 핵산의 메틸화 상태를 평가하는 단계; 및 c) 상기 표적 핵산의 메틸화 상태를 기반으로 상기 피험자의 대장암 발병 상태를 평가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 부가적 양태 및 이점 중 일부는 아래 설명에서 설명될 것이며, 일부는 아래 설명으로부터 자명해지거나 본 발명의 실천을 통해 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 상기 및/또는 부가적 양태 및 이점은 하기 도면과 함께 실시예의 설명으로부터 명백해지고 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 여기서,
도 1은 본 발명의 실시예에 따라 제공된 TCGA 데이터베이스에서 대장암과 비장암 샘플의 메틸화 수준의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에서 양성 표준품의 형광 정량적 PCR 증폭 곡선도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에서 음성 표준품의 형광 정량적 PCR 증폭 곡선도이다.
도 4는 본 발명의 실시예 3에서 제공되는 대장암 진단용 키트의 검출 흐름도이다.
도 5는 본 발명의 실시예 3에서 각 유전자에 의해 검출된 대장암 샘플의 ROC 곡선도이다.
이하, 본 발명의 실시예를 상세히 설명하지만 설명된 실시예는 예시적인 것으로, 본 발명을 해석하기 위한 것일 뿐 본 발명을 한정하는 것으로 이해해서는 안 된다는 점에 유의해야 한다. 본 발명에서 제공하는 기술적 해결수단을 설명하는 과정에서 본 명세서에 관련된 용어를 해석하고 설명하는데, 이러한 해석과 설명은 기술적 해결수단에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 보호수단에 대한 제한으로 볼 수 없다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 ADHFE1 유전자, PPP2R5C 유전자 및 SDC2 유전자를 검출하기 위한 시약을 포함하는 대장암 검출용 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 언급된 조성물은 2종 이상의 물질이 혼합 및 접촉 형태로 존재하도록 요구하지 않으며, 언급된 조성물은 사용 시 동일한 환경에서 응용됨을 의미한다. 예를 들어, 대장암 검출 시, ADHFE1 유전자, PPP2R5C 유전자 및 SDC2 유전자의 메틸화 상태를 동시에 검출한다.
본 명세서에서 언급된 ADHFE1 유전자, PPP2R5C 유전자 및 SDC2 유전자의 메틸화 변형은 암의 발생 및 진행과 밀접한 관련이 있으며, 정상 조직과 암 조직에서 유의한 차이를 나타낸다. 예를 들어 SDC2 유전자, ADHFE1 유전자, PPP2R5C 유전자는 암 조직에서 높은 메틸화 수준을 나타낸다. ADHFE1 유전자는 수소 전이 효소를 코딩하며, 상기 유전자의 과메틸화로 인한 비정상적 조절은 장암 세포 주기를 단축시키고 암 세포 증식을 촉진할 수 있다(Hu YH 등, 2019). 대장의 정상 조직과 비교하여, ADHFE1 유전자는 암 조직 및 진행기 선종 조직 모두에서 높은 메틸화 수준을 나타내며(Tae CH 등, 2013), 그 메틸화 수준은 정상 조직, 장암 조직 및 선종 조직에서 유의한 차이가 있고, 이는 장암 검출의 이상적인 마커이다(Naumov VA 등, 2013.Fan, J 등, 2020). PPP2R5C 유전자는 PP2A 인산효소의 조절 서브 유닛으로, 세포 성장 및 증식에 대한 부정적인 조절인자이며(Veerle JANSSENS 등, 2001), 그의 코딩 단백질은 DNA 손상에 대처하기 위해 p53 단백질의 제인산화를 조절함으로써, 장암 세포의 성장을 억제한다는 증거가 있다(Li HH 등, 2007). PPP2R5C 유전자의 과메틸화 상태는 장암의 발생 및 진행과 밀접한 관련이 있으며, 장암 검출의 잠재적 마커로 사용될 수 있다(Galamb O 등, 2016). SDC2 유전자는 세포 분열 및 이동 등 과정에서 중요한 생물학적 기능을 갖는 세포 내 막 단백질을 코딩한다(Kim JH 등, 2018). 다수의 연구에서는 대장암 환자의 암 조직과 암 주위 조직의 메틸화 변형 상태 비교를 통해 SDC2 유전자의 메틸화 수준이 암 조직과 암 주위 조직에서 유의한 차이가 있고, 암 조직, 선종 조직, 용종 조직 및 정상 조직에서의 검출율이 분명한 감소 추세가 있어 장암 검출의 효과적인 마커로 사용될 수 있음을 발견하였다(Oh TJ 등, 2017).
현재 SDC2 유전자는 이미 대장암의 진단 및 검출에 비교적 신뢰할 수 있는 표준으로 되었다. 본 명세서에서는 SDC2 유전자를 ADHFE1 유전자 및 PPP2R5C 유전자와 조합함으로써, 단일 SDC2 유전자 검출과 비교하여 민감도와 특이도가 더 높다. 또한 NDRG4, BMP3과 같은 다른 유전자와 비교하여, SDC2 유전자, ADHFE1 유전자 및 PPP2R5C 유전자의 조합을 통한 대장암 진단의 특이도 및 민감도가 더 높다. 예를 들어, 민감도는 85% 이상, 특이도는 90% 이상일 수 있고, 다른 예를 들어, 민감도는 87% 이상, 심지어 90% 이상일 수 있으며, 특이도는 90% 이상, 심지어 94% 이상일 수 있다. 또한 대장암 샘플 및 정상 샘플에서 더 많은 차이를 보일 수 있다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 시약은 프라이머 세트 및 프로브를 포함한다. 명세서에서 언급된 “프라이머”는 상보적인 탬플릿과 염기쌍을 형성할 수 있고 탬플릿 가닥 복제의 기점 역할을 할 수 있는 프리 3’하이드록실기의 짧은 핵산 서열을 의미한다. 적절한 버퍼 및 온도 조건에서 프라이머는 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트와 중합 시약(예: DNA 중합효소 또는 역전사 효소)의 존재 하에 DNA 합성을 시작한다.
용어 “프로브”는 특정 유전자의 mRNA 또는 상보적 DNA(cDNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 RNA 또는 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 수개 내지 수백개의 염기쌍에 달하는 길이를 갖는다. 프로브는 표지되어 있기 때문에 결합하고자 하는 표적 mRNA 또는 cDNA의 존재 여부 또는 발현 수준을 검사하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 프라이머 세트는,
(a-1) SEQ ID NO:3~SEQ ID NO:40으로 표시되는 서열 중 적어도 한가닥(예를 들어, 표시되는 서열 중 적어도 한쌍);
(b-1) SEQ ID NO:41~SEQ ID NO:60으로 표시되는 서열 중 적어도 한가닥(예를 들어, 표시되는 서열 중 적어도 한쌍); 및
(c-1) SEQ ID NO:61~SEQ ID NO:98로 표시되는 서열 중 적어도 한가닥(예를 들어, 표시되는 서열 중 적어도 한쌍)을 포함하고,
상기 프로브는,
(a-2) SEQ ID NO:100~SEQ ID NO:112로 표시되는 서열 중 적어도 하나;
(b-2) SEQ ID NO:113~SEQ ID NO:127로 표시되는 서열 중 적어도 하나; 및
(c-2) SEQ ID NO:128~SEQ ID NO:142로 표시되는 서열 중 적어도 하나를 포함한다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 프라이머 세트는, (a-1) SEQ ID NO:3~SEQ ID NO:40으로 표시되는 서열 중 적어도 한쌍; (b-1) SEQ ID NO:41~SEQ ID NO:60으로 표시되는 서열 중 적어도 한쌍; 및 (c-1) SEQ ID NO:61~SEQ ID NO:98로 표시되는 서열 중 적어도 한쌍을 포함하고, 상기 프로브는, (a-2) SEQ ID NO:100~SEQ ID NO:112로 표시되는 서열 중 적어도 하나; (b-2) SEQ ID NO:113~SEQ ID NO:127로 표시되는 서열 중 적어도 하나; 및 (c-2) SEQ ID NO:128~SEQ IDNO:142로 표시되는 서열 중 적어도 하나를 포함한다.
언급된 서열 중 적어도 한쌍은 동일한 유전자(즉, 본 명세서에서 언급된 ADHFE1 유전자, PPP2R5C 유전자, 또는 SDC2 유전자)의 임의의 정방향 프라이머와 임의의 역방향 프라이머를 한쌍의 프라이머로 사용하는 것을 의미한다. 설명해야 할 점은, 동일한 유전자를 위한 프라이머와 프로브를 조합하여 사용하는 경우, 동일한 특정 유전자의 임의의 정방향 프라이머, 상기 정방향 프라이머 뒤의 역방향 프라이머, 및 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 사이의 프로브를 모두 조합하여 사용함으로써, 대장암 관련 유전자의 증폭 및 검출을 구현할 수 있다. 당업자는 본 명세서에 의해 제공되는 서열에 따라 서열을 게놈에 비교하고, 프라이머 및 프로브의 조합을 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 번호가 SEQ ID NO:7, 또는 SEQ ID NO:11인 정방향 프라이머 는 각각 번호가 SEQ ID NO:8, 또는 SEQ ID NO:24인 역방향 프라이머와 조합되어 한쌍의 프라이머로 사용될 수 있으며, 필요에 따라 번호가 SEQ ID NO:115, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO:125, 또는 SEQ ID NO:126 등인 프로브와 배합하여 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 프라이머 세트는 SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:2로 표시되는 서열을 추가로 포함하고, 상기 프로브는 SEQ ID NO:99로 표시되는 서열을 추가로 포함한다. SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:2로 표시되는 서열 및 SEQ ID NO:99로 표시되는 서열은 내부 참조 유전자인 GAPDH 유전자의 PCR 증폭 및 검출에 사용할 수 있다.
여기서, 각 서열은 표 1에 나열되어 있다. 이러한 프라이머 세트 및 프로브는 관련 유전자인 ADHFE1, PPP2R5C, SDC2 유전자의 메틸화 변형된 서열을 위해 설계되었으며, 메틸화에 의해 변형된 서열을 특이적으로 식별할 수 있고; GAPDH 유전자를 내부 참조로 사용하면, 내부 참조 유전자의 증폭이 메틸화 변형의 영향을 받지 않으므로, 샘플 내 탬플릿 수를 정량화할 수 있으며; 목적 유전자의 Ct값과 내부 참조 유전자의 Ct값의 차이값을 계산함으로써, 샘플의 메틸화 정도를 판정하여 대장암 검출에 도움이 될 수 있다. 언급된 프로브의 5'말단은 FAM, VIC, ROX, CY5 형광기와 연결될 수 있고, 3'말단은 MGB 등 소광기와 연결될 수 있다. 사용되는 형광기 및 소광기는 당업계에서 통상적으로 사용되는 기일 수 있다.
표 1 : 프라이머 세트 및 프로브 서열표
서열번호 서열 작용
SEQ ID NO:1 TTTAGGAGTGAGTGGAAGATAGA GAPDH 정방향 프라이머 1
SEQ ID NO:2 AAACCACACCATCCTAATTACCT GAPDH 역방향 프라이머 1
SEQ ID NO:3 TCGTTGGGGTAGTTGGC ADHFE1 정방향 프라이머 1
SEQ ID NO:4 CCTATCTAAACCTCAAACCAATCG ADHFE1 역방향 프라이머 1
SEQ ID NO:5 GTTTTGGGTTTTTATCGCGC ADHFE1 정방향 프라이머 2
SEQ ID NO:6 GCCCTAAAAAACTACATCGCG ADHFE1 역방향 프라이머 2
SEQ ID NO:7 GATGGTGCGAGCGTC ADHFE1 정방향 프라이머 3
SEQ ID NO:8 CTATCTAAACCTCAAACCAATCG ADHFE1 역방향 프라이머 3
SEQ ID NO:9 GGTAATTTTAAGGGTGGATG ADHFE1 정방향 프라이머 4
SEQ ID NO:10 CTCAAAACCATTTTCCCAC ADHFE1 역방향 프라이머 4
SEQ ID NO:11 AAGTAAGGAGATTTAAGGTAG ADHFE1 정방향 프라이머 5
SEQ ID NO:12 CTCAAAACCATTTTCCCAC ADHFE1 역방향 프라이머 5
SEQ ID NO:13 GGGTTATTTGTTTAAGTTTTAAGT ADHFE1 정방향 프라이머 6
SEQ ID NO:14 CCCCAAATCCTCAACA ADHFE1 역방향 프라이머 6
SEQ ID NO:15 GTTGTAGTTGTTTTAGTAAGT ADHFE1 정방향 프라이머 7
SEQ ID NO:16 TTAAAACTTAAACAAATAACCC ADHFE1 역방향 프라이머 7
SEQ ID NO:17 GATTGGTTTGAGGTTTAGA ADHFE1 정방향 프라이머 8
SEQ ID NO:18 AATCCTCTTCCCTCCT ADHFE1 역방향 프라이머 8
SEQ ID NO:19 GATTGGTTTGAGGTTTAGA ADHFE1 정방향 프라이머 9
SEQ ID NO:20 TTACAATTACCTCAACAAATAC ADHFE1 역방향 프라이머 9
SEQ ID NO:21 GGTAATTTTAAGGGTGGATGGTG ADHFE1 정방향 프라이머 10
SEQ ID NO:22 TCACCTATCTAAACCTCAAACCA ADHFE1 역방향 프라이머 10
SEQ ID NO:23 AGGTTTAGATAGGTGATTTCGC ADHFE1 정방향 프라이머 11
SEQ ID NO:24 AAACTACCCGCCTCCC ADHFE1 역방향 프라이머 11
SEQ ID NO:25 TTGGCGTTTTGGTTTTTATTTC ADHFE1 정방향 프라이머 12
SEQ ID NO:26 CCTATCTAAACCTCAAACCAATCG ADHFE1 역방향 프라이머 12
SEQ ID NO:27 GATTTAAGGTAGAATTCGAGGTTTAC ADHFE1 정방향 프라이머 13
SEQ ID NO:28 CACGAAATAAAAACCAAAACG ADHFE1 역방향 프라이머 13
SEQ ID NO:29 CGTAGTTTTTTGGGTGTGATTC ADHFE1 정방향 프라이머 14
SEQ ID NO:30 AAAACGATATCCAAATTCTCCG ADHFE1 역방향 프라이머 14
SEQ ID NO:31 CGTATTTTGTGATTTCGTTGTTTC ADHFE1 정방향 프라이머 15
SEQ ID NO:32 AAAAATTCGAAAAATTTAAATACCG ADHFE1 역방향 프라이머 15
SEQ ID NO:33 CGTTTGTTTATTCGTTTCGC ADHFE1 정방향 프라이머 16
SEQ ID NO:34 CGCCGCTAAAACAACTAACG ADHFE1 역방향 프라이머 16
SEQ ID NO:35 CGTTTTGAGAGGTTGTATCGC ADHFE1 정방향 프라이머 17
SEQ ID NO:36 AAAAATTCGAAAAATTTAAATACCG ADHFE1 역방향 프라이머 17
SEQ ID NO:37 GTTTAGGGCGGTATTTAAATTTTTC ADHFE1 정방향 프라이머 18
SEQ ID NO:38 ATATAACCCGCTCAAATCCTACG ADHFE1 역방향 프라이머 18
SEQ ID NO:39 TGTATCGCGTATTTTGTGATTTC ADHFE1 정방향 프라이머 19
SEQ ID NO:40 CCGCTTACTTTCAAAAATTCG ADHFE1 역방향 프라이머 19
SEQ ID NO:41 GGTTTTCGTTGTTTCGTTTC PPP2R5C 정방향 프라이머 1
SEQ ID NO:42 CCAAATCGACGTCCTCCG PPP2R5C 역방향 프라이머 1
SEQ ID NO:43 GGTTTTAGGTCGGGGTTTC PPP2R5C 정방향 프라이머 2
SEQ ID NO:44 CCTCCTCCGAACTCCG PPP2R5C 역방향 프라이머 2
SEQ ID NO:45 TTTCGGTATGGGTTTTAGGTC PPP2R5C 정방향 프라이머 3
SEQ ID NO:46 CCTCCTCCGAACTCCG PPP2R5C 역방향 프라이머 3
SEQ ID NO:47 CGTTGTTTCGTTTCGGAGTTC PPP2R5C 정방향 프라이머 4
SEQ ID NO:48 CAAATCGACGTCCTCCG PPP2R5C 역방향 프라이머 4
SEQ ID NO:49 TGTTTCGGTTTTCGTTGTTTC PPP2R5C 정방향 프라이머 5
SEQ ID NO:50 CAAATCGACGTCCTCCG PPP2R5C 역방향 프라이머 5
SEQ ID NO:51 GGAAACGGGAGAGCGC PPP2R5C 정방향 프라이머 6
SEQ ID NO:52 CGCCGATCTAACCTCCTACG PPP2R5C 역방향 프라이머 6
SEQ ID NO:53 CGGGACGGAAAGGAAAC PPP2R5C 정방향 프라이머 7
SEQ ID NO:54 GCCGATCTAACCTCCTACG PPP2R5C 역방향 프라이머 7
SEQ ID NO:55 GGTTGGAGGATGAAGTT PPP2R5C 정방향 프라이머 8
SEQ ID NO:56 TCCAACCCTCTACTTAAC PPP2R5C 역방향 프라이머 8
SEQ ID NO:57 GGTATGGGTTTTAGGT PPP2R5C 정방향 프라이머 9
SEQ ID NO:58 ACTAAAAAATAAAACCCCC PPP2R5C 역방향 프라이머 9
SEQ ID NO:59 AAGTAGAGGGTTGGAG PPP2R5C 정방향 프라이머 10
SEQ ID NO:60 AAAACCCTTAACTCCC PPP2R5C 역방향 프라이머 10
SEQ ID NO:61 AGTGTAGAAATTAATAAGTGAGAGGGC SDC2 정방향 프라이머 1
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SEQ ID NO:63 ATAAGTGAGAGGGCGTCGC SDC2 정방향 프라이머 2
SEQ ID NO:64 TTCCTCCTCCTACGCCTACT SDC2 역방향 프라이머 2
SEQ ID NO:65 CGTTGCGGTATTTTGTTTC SDC2 정방향 프라이머 3
SEQ ID NO:66 AACGAAACCTCCTACCCAA SDC2 역방향 프라이머 3
SEQ ID NO:67 AAATTAGAAATTGAATTTCGGTACG SDC2 정방향 프라이머 4
SEQ ID NO:68 AACTACTCTCTAAAACTCTTCTTACTCTACT SDC2 역방향 프라이머 4
SEQ ID NO:69 GCGTTGGGTAGGAGGTTTC SDC2 정방향 프라이머 5
SEQ ID NO:70 ATATTCCCCAAAAACCGACTACT SDC2 역방향 프라이머 5
SEQ ID NO:71 TCGTTTAGGGTGTTTGAAGTTAC SDC2 정방향 프라이머 6
SEQ ID NO:72 CCAACGAATCTCCGATATATACTT SDC2 역방향 프라이머 6
SEQ ID NO:73 CGTGGTTTGGGAAGGAC SDC2 정방향 프라이머 7
SEQ ID NO:74 CGAAATAAAACCGTTCCCTC SDC2 역방향 프라이머 7
SEQ ID NO:75 GGAGTTTGGGTCGGGTTC SDC2 정방향 프라이머 8
SEQ ID NO:76 AAATTTCCAAATCATCCCTAATCTC SDC2 역방향 프라이머 8
SEQ ID NO:77 GGGAGTGTAGAAATTAATAAGTGAGAGG SDC2 정방향 프라이머 9
SEQ ID NO:78 CTCCTACGCCTACTCCCG SDC2 역방향 프라이머 9
SEQ ID NO:79 GAGTTCGAGTTTTCGAGTTTGAGT SDC2 정방향 프라이머 10
SEQ ID NO:80 CTACCCAACGCTCGACG SDC2 역방향 프라이머 10
SEQ ID NO:81 GAGTTCGAGTTTTCGAGTTTGAGT SDC2 정방향 프라이머 11
SEQ ID NO:82 CGAAACCTCCTACCCAACG SDC2 역방향 프라이머 11
SEQ ID NO:83 GAGTCGGTGAGTGGGTTAGG SDC2 정방향 프라이머 12
SEQ ID NO:84 GCTCCCCTATTCCCTACG SDC2 역방향 프라이머 12
SEQ ID NO:85 ATATTTTAAACGGCGCGC SDC2 정방향 프라이머 13
SEQ ID NO:86 TAAATCCTACTCACCTTAAACTTAATAACCT SDC2 역방향 프라이머 13
SEQ ID NO:87 TTGAGGAAGGGAAGAGGG SDC2 정방향 프라이머 14
SEQ ID NO:88 CAATCCCCAAATATACACCG SDC2 역방향 프라이머 14
SEQ ID NO:89 TTTAGGGATCGGTTGTTTTTAGTC SDC2 정방향 프라이머 15
SEQ ID NO:90 GAATTCGTATACGCGAACTACG SDC2 역방향 프라이머 15
SEQ ID NO:91 AGTTTAAGGTGAGTAGGATTTACGC SDC2 정방향 프라이머 16
SEQ ID NO:92 TTTTACCCTAATTACAAACAACGAC SDC2 역방향 프라이머 16
SEQ ID NO:93 GGTTTTTGCGGTTAGATTAAATC SDC2 정방향 프라이머 17
SEQ ID NO:94 AAAAAACGCTACTCGCTAACGT SDC2 역방향 프라이머 17
SEQ ID NO:95 GTAGGGAATAGGGGAG SDC2 정방향 프라이머 18
SEQ ID NO:96 AAATAACTTCAAAAACCTC SDC2 역방향 프라이머 18
SEQ ID NO:97 GAAGAAGTTGGGAGTGAT SDC2 정방향 프라이머 19
SEQ ID NO:98 CCTCTTCCCTTCCTCA SDC2 역방향 프라이머 19
SEQ ID NO:99 CCCAAAACACATTTCTTCCATTC GAPDH 프로브 1
SEQ ID NO:100 AAACGAAGTTTTTTGTTTAGCGTT SDC2 프로브 1
SEQ ID NO:101 GAAAAAACTTCGTTTTACCCTAATTAC SDC2 프로브 2
SEQ ID NO:102 ACACCGAAAATTACGATTTAATCTAAC SDC2 프로브 3
SEQ ID NO:103 ACACCAAAAATTACAATTTAATCTAAC SDC2 프로브 4
SEQ ID NO:104 CTACTCGCTAACGTTACCC SDC2 프로브 5
SEQ ID NO:105 CTACTCACTAACATTACCC SDC2 프로브 6
SEQ ID NO:106 CCTCTTCCCTTCCTCA SDC2 프로브 7
SEQ ID NO:107 TAACGCCAACGAACAACGCTTT SDC2 프로브 8
SEQ ID NO:108 CTAAACCAAACCGCAATTCTCGATA SDC2 프로브 9
SEQ ID NO:109 TAACACCAACAAACAACACTTT SDC2 프로브 10
SEQ ID NO:110 CTAAACCAAACCACAATTCTCAATA SDC2 프로브 11
SEQ ID NO:111 ACCCCGCGATCCGCGAAAATAAAA SDC2 프로브 12
SEQ ID NO:112 CCCGCGATCCGCGAAAATAAAAACACCG SDC2 프로브 13
SEQ ID NO:113 TCACCTATCTAAACCTCAAACCA ADHFE1 프로브 1
SEQ ID NO:114 CCCAACGACGCTCGCAC ADHFE1 프로브 2
SEQ ID NO:115 CAACGACGCTCGCACCAT ADHFE1 프로브 3
SEQ ID NO:116 TAAATAATACGAACGCCGCTAAAAC ADHFE1 프로브 4
SEQ ID NO:117 ATACGAACGCCGCTAAAACAACTAAC ADHFE1 프로브 5
SEQ ID NO:118 CCCAACAACACTCACAC ADHFE1 프로브 6
SEQ ID NO:119 CAACAACACTCACACCAT ADHFE1 프로브 7
SEQ ID NO:120 TAAATAATACAAACACCACTAAAAC ADHFE1 프로브 8
SEQ ID NO:121 ATACAAACACCACTAAAACAACTAAC ADHFE1 프로브 9
SEQ ID NO:122 ACTCAAAACCATTTTCCCACGAAAT ADHFE1 프로브 10
SEQ ID NO:123 AACGAAAAACGCCACTACCCGATACGA ADHFE1 프로브 11
SEQ ID NO:124 AACGCCACTACCCGATACGAACTACACC ADHFE1 프로브 12
SEQ ID NO:125 AAAAACCAAAACGCCAACTACCCCA ADHFE1 프로브 13
SEQ ID NO:126 CCCACGAAATAAAAACCAAAACGCCAAC ADHFE1 프로브 14
SEQ ID NO:127 CAAAACGCCAACTACCCCAACGAC ADHFE1 프로브 15
SEQ ID NO:128 CGAACCGCGCTCTCCC PPP2R5C 프로브 1
SEQ ID NO:129 TTTCCTTTCCGTCCCGTCTCG PPP2R5C프로브2
SEQ ID NO:130 AATTAAAACGCGCAACGCAA PPP2R5C프로브3
SEQ ID NO:131 CGATTCGCGAACGACC PPP2R5C프로브4
SEQ ID NO:132 CTTTACCCCGACCTCCGCTA PPP2R5C프로브5
SEQ ID NO:133 CAAACCACACTCTCCC PPP2R5C프로브6
SEQ ID NO:134 TTTCCTTTCCATCCCATCTCA PPP2R5C프로브7
SEQ ID NO:135 AATTAAAACACACAACACAA PPP2R5C프로브8
SEQ ID NO:136 ACACAATTCACAAACAACCA PPP2R5C프로브9
SEQ ID NO:137 CTTTACCCCAACCTCCACTA PPP2R5C 프로브 10
SEQ ID NO:138 CCGCCCGCGAACCGCGCTC PPP2R5C 프로브 11
SEQ ID NO:139 TACGCGCTCCAACCCTCTACTTAACCGC PPP2R5C 프로브 12
SEQ ID NO:140 CAACCCTCTACTTAACCGCCCGCGAA PPP2R5C 프로브 13
SEQ ID NO:141 CGTTACGCGCTCCAACCCTCT PPP2R5C 프로브 14
SEQ ID NO:142 TACGTTACGCGCTCCAACCCTCT PPP2R5C 프로브 15
일부 실시형태에서, ADHFE1 유전자를 검출하기 위한 시약은 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:127로 표시되는 서열을 포함하고; PPP2R5C 유전자를 검출하기 위한 시약은 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54 및 SEQ ID NO:139로 표시되는 서열을 포함하며; SDC2 유전자를 검출하기 위한 시약은 SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90 및 SEQ ID NO:101로 표시되는 서열을 포함하고; 상기 조성물은 GAPDH 유전자를 검출하기 위한 시약을 더 포함하며, 상기 GAPDH 유전자를 검출하기 위한 시약은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:99로 표시되는 서열을 포함한다.
언급된 프라이머 또는 프로브는 인위적으로 합성될 수 있는데, 예를 들어 포스포라미다이트 고체상 지지체를 사용하여 합성 또는 당업계에서 통상적으로 사용되는 다른 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 조성물은 PCR 버퍼, 염이온, dNTP, DNA 중합효소 또는 표적 핵산 중에서 선택되는 적어도 하나를 포함한다. 언급된 표적 핵산은 시판되는 일부 키트를 사용하여 샘플에서 추출하여 얻을 수 있다. 상기 표적 핵산은 ADHFE1, PPP2R5C, SDC2 유전자로부터의 핵산 서열을 포함한다.
적어도 일부 실시형태에서, 언급된 형광 정량적 PCR 검출 조건은 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 45 사이클을 포함한다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 프라이머 세트와 상기 프로브의 질량비는 1: 1: 1: 1이다. 이로부터 이상적인 검출 결과를 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 대장암 진단용 키트를 제공하며, 상기 키트는 상기 조성물을 포함한다. 본 발명에 의해 제공되는 키트는 샘플 내 ADHFE1, PPP2R5C, SDC2 유전자의 메틸화 변형 상황을 특이적으로 검출하여 대장암을 앓고 있는 수검자의 위험성을 평가할 수 있다. 본 발명은 ADHFE1, PPP2R5C, SDC2 이 3개 유전자의 메틸화 상태를 공동으로 검출하는 바, 이는 단일 유전자 메틸화 검출에 비해 검출 성능을 효과적으로 향상시킬 수 있다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 키트는 DNA 추출 시약, DNA 메틸화 전환 시약, 핵산 정제 시약 중 적어도 하나를 추가로 포함한다. DNA 추출 시약은 샘플 내 DNA를 얻는 데 사용될 수 있다. DNA 메틸화 전환 시약은 DNA 내 시토신을 우라실로 전환할 수 있다. 핵산 정제 시약은 정제된 핵산을 얻는 데 사용될 수 있으며, 이는 후속 반응 과정에 사용될 수 있다.
언급된 키트는 또한 하기와 같은 방법으로 샘플 내 유전자의 메틸화 상태를 결정하거나, 피험자 대장암의 발병 상태를 평가하는 데 사용될 수 있다. 이에, 본 발명은 또한 샘플 내 유전자의 메틸화 상태를 결정하기 위한 키트의 제조에서 시약의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 피험자의 대장암 발병 상태를 평가하기 위한 키트의 제조에서 시약의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 ADHFE1 유전자, PPP2R5C 유전자 및 SDC2 유전자를 포함하는 유전자의 메틸화 상태 결정 방법을 제공하고,
상기 방법은,
(1) 상기 샘플로부터의 게놈 DNA를 얻는 단계;
(2) 상기 게놈 DNA를 메틸화 전환 처리하여 전환 생성물을 얻는 단계; 및
(3) 프라이머 세트와 프로브를 이용하여 상기 전환 생성물에 대한 형광 정량적 PCR 검출을 수행하여 샘플 내 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함한다.
메틸화 상태는 일반적으로 DNA 서열 중 하나 이상의 CpG 디뉴클레오티드에서 5-메틸시토신의 존재 또는 부재를 의미한다. 본 발명은 샘플 내 유전자의 메틸화 상태 결정 방법을 제공하며, 이는 대장암의 조기 선별을 위한 정확하고 간단하며 경제적인 수단으로 사용될 수 있고, 대장암 고위험군 및 일반신체검사군에서 대장암, 특히 조기 장암의 검출율을 높여 대장암 환자의 생존율을 높이고, 대량의 의료 지출을 절감하며 의료 부담을 줄일 수 있다.
상기 샘플은 특별히 제한되지 않으며, 표적 핵산을 포함하는 생물학적 샘플일 수 있고, 이러한 생물학적 샘플은 생체 외 샘플이다. 조직 샘플, 혈액 샘플, 타액 샘플, 분비물 또는 배설물 중 적어도 하나를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 언급된 배설물은 뇨액 샘플, 땀 샘플 또는 눈물 샘플일 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 상기 배설물은 분변 샘플이다. 분변 샘플은 장 박리 세포를 함유하고, 또한 분변 샘플을 사용하여 검출하는 것은 비침습적 특징을 갖고 있으므로 분변 샘플을 우선적인 검출 대상으로 사용할 수 있다.
언급된 메틸화 전환 처리는 아황산수소나트륨과 같은 일부 화학 시약일 수 있다. 예를 들어 일부 상용 키트를 사용하여 메틸화 전환 처리를 수행할 수 있는데, 예를 들어 EZ DNA Methylation-Gold Kit를 사용하여 DNA에 대한 아황산수소나트륨 전환을 수행한다. 얻어진 생성물은 상용 키트를 사용하여 컬럼 정제 및 재용해 처리를 수행하여 정제된 생성물을 얻을 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 분리 가능한 핵산 서열을 제공하며, 상기 분리 가능한 핵산 서열은 프라이머 세트 및 프로브를 포함하고, 상기 프라이머 세트는,
(a) SEQ ID NO:3~SEQ ID NO:40으로 표시되는 서열 중 적어도 한쌍;
(b) SEQ ID NO:41~SEQ ID NO:60으로 표시되는 서열 중 적어도 한쌍; 및
(c) SEQ ID NO:61~SEQ ID NO:98로 표시되는 서열 중 적어도 한쌍을 포함하며,
상기 프로브는,
SEQ ID NO:100~SEQ ID NO:112로 표시되는 서열 중 적어도 하나;
SEQ ID NO:113~SEQ ID NO:127로 표시되는 서열 중 적어도 하나;
SEQ ID NO:128~SEQ ID NO:142로 표시되는 서열 중 적어도 하나를 포함한다.
본 발명은 또한 피험자의 대장암 발병 상태 평가 방법을 제공하며, 상기 방법은, a) 피험자의 샘플을 제공하되, 상기 샘플은 상기 피험자의 표적 핵산을 함유하고, 상기 표적 핵산은 ADHFE1 유전자, PPP2R5C 유전자 및 SDC2 유전자로부터의 핵산을 포함하는 단계; b) 상기 표적 핵산의 메틸화 상태를 평가하는 단계; 및 c) 상기 표적 핵산의 메틸화 상태를 기반으로 상기 피험자의 대장암 발병 상태를 평가하는 단계를 포함한다. 상기 표적 핵산의 메틸화 상태를 평가하기 위한 시약은 아황산염 또는 아황산수소염, 중아황산염과 같은 화학 시약을 사용할 수 있으며, 아황산수소나트륨일 수 있다. 이러한 화학 시약으로 처리된 표적 핵산 내 비메틸화 시토신은 우라실로 전환되고, 메틸화 시토신은 이러한 전환이 발생하지 않는다. 이후 전환된 서열의 차이는 시퀀싱, PCR, 고해상도 용융 곡선 분석과 같은 다양한 수단으로 분석할 수 있으며; 특히 형광 정량적 PCR 수단을 이용하면 빠르고 편리하게 구분할 수 있다. 물론, 상기 표적 핵산의 메틸화 상태를 평가하기 위한 시약은 일부 메틸화 민감성 제한 효소와 같은 폴리펩티드 또는 효소와 같은 일부 생물학적 시약일 수 있다.
본 명세서에서 언급된 피험자는 인간이다. 예를 들어 진단이 필요한 환자일 수 있다. 피험자로부터의 생물학적 샘플의 유형은 조직 샘플, 혈액 샘플, 타액 샘플 등 분비물 또는 배설물 중 적어도 하나를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 언급된 배설물은 뇨액 샘플, 땀 샘플 또는 눈물 샘플일 수 있다. 분변 샘플은 장 박리 세포를 함유하고, 또한 분변 샘플을 사용하여 검출하는 것은 비침습적 특징을 갖고 있으므로 분변 샘플을 우선적인 검출 대상으로 사용할 수 있다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 피험자는 포유동물이다. 적어도 일부 실시형태에서, 단계 b)에서는 상기 언급된 프라이머 세트 및 프로브를 사용하여 상기 표적 핵산의 메틸화 상태를 평가한다.
상기 방법은 상기 샘플로부터 상기 표적 핵산을 분리하는 단계를 더 포함한다. 당업계의 일부 상용 키트를 사용하여 샘플에서 상기 표적 핵산을 분리할 수 있다.
상기 방법은 상기 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 더 포함한다. 핵산 증폭을 위한 일부 일반적인 시약을 사용할 수 있다. 핵산 증폭용 시약은 형광 정량적 중합효소 반응(qPCR)에 사용되는 효소, 폴리뉴클레오티드 증폭 반응에 사용될 수 있는 효소와 같은 효소를 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 표적 핵산의 메틸화 상태를 평가하여 메틸화 지표를 얻고, 상기 메틸화 지표를 참조값과 비교하여 상기 샘플의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학 시약을 사용하여 상기 표적 핵산의 메틸화 상태를 평가하는 단계를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 화학 시약은 아황산수소염 또는 아황산염을 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에서, 상기 참조값은 내부 참조 유전자 GAPDH로부터 유래되고, ADHFE1, PPP2R5C, SDC2 유전자의 증폭 Ct값을 내부 참조 GAPDH 유전자의 증폭 Ct값과 비교하고, 임계값에 기반하여 샘플 유전자의 메틸화 상태를 판정한다. 언급된 임계값은 병리학적 정보가 공지된 대량의 임상적 샘플 분석에 따라 설정할 수 있다. 물론, 언급된 메틸화 지표는 일부 메틸화 지표, 예를 들어 메틸화 빈도, 메틸화 일배체형 부하 등과 같은 다른 일반적인 일부 메틸화 지표일 수 있다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 방법은, 내부 참조 유전자를 사용하여 DNA ?t량이 검출 요건을 충족시키는지 여부를 결정하고, 타겟 유전자의 Ct값과 내부 참조 유전자의 Ct값의 차이값(△Ct)을 사용하여 메틸화 상태를 판단하는 단계를 추가로 포함한다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 방법은, GAPDH를 내부 참조 유전자로 사용하고, 형광 정량적 PCR 방법으로 상기 피험자의 대장암 발병 상태를 평가하는 단계;
GAPDH의 Ct값이 37보다 크면, 품질 제어 실패로 판정하는 단계;
ADHFE1, PPP2R5C, SDC2 유전자가 37보다 크면, 음성으로 판정하는 단계; 및
ADHFE1, PPP2R5C, SDC2 유전자의 Ct값≤37이면, ADHFE1, PPP2R5C, SDC2 유전자의 증폭 Ct값과 내부 참조GAPDH 유전자의 증폭 Ct값의 차이값 △Ct를 계산하고, ADHFE1, PPP2R5C, SDC2 유전자 △Ct의 ROC 곡선 결과 및 AUC 결과를 기반으로 상기 피험자의 대장암 발병 상태를 평가하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법은 △Ct(ADHFE1)≤8, △Ct(PPP2R5C)≤5, △Ct(SDC2)≤12이면, 양성으로 판정하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법은, 상기 피험자의 메틸화 상태를 기반으로 대장암 발병 가능성을 평가하여 보조 진단 및 종양 선별 등 목적을 달성함으로써, 가능한 한 조기에 피험자에 대한 치료를 제공하는 단계를 더 포함한다. 적어도 일부 실시형태에서, 상기 치료는 화학 요법, 방사선 요법, 면역 요법, 세포 요법, 수술 중 적어도 하나를 포함한다.
이하, 실시예를 결부하여 본 발명의 실시형태를 해석한다. 당업자는 하기 실시예가 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주하여서는 안된다는 것을 이해할 것이다. 실시예에 구체적인 기술이나 조건이 표시되지 않은 경우, 당업계의 문헌에 설명된 기술 또는 조건 또는 제품 사양에 따라 수행된다. 제조사 표시 없이 사용되는 시약이나 기구는 모두 시중에서 구할 수 있는 재래품이다.
실시예 1
발명인은 하기 방법 및 단계에 따라 대장암 진단용 표적 핵산을 결정하였다.
먼저, 발명인은 암 게놈 아틀라스(The Cancer Genome Atlas, TCGA) 데이터베이스에서 상이한 유전자의 종양/비종양 샘플의 메틸화 수준의 유의한 차이를 비교하여 메틸화 검출을 위한 후보 유전자: CDH4, ZNF132, PPP2R5C, LONRF2, ADHFE1, SDC2, NDRG4, BMP3을 스크리닝하고 결정하였으며;
둘째, 상기 후보 유전자에 대해 특이적 프라이머 및 프로브를 각각 설계하였다. 발명인은 프라이머 및 프로브를 설계하는 과정에서 표적 핵산의 메틸화 검출과 관련되므로, 시험할 게놈 서열은 아황산수소염 전환 후 대부분의 C가 U로 전환되어 게놈의 복잡도가 낮고, 프라이머, 프로브 설계 시 많은 단일 염기가 연속적으로 나타나는 상황이 발생하고 일반적으로 어닐링 온도가 낮아 프라이머를 설계할 수 있는 영역이 상대적으로 적음을 발견하였다.
이어서, 상기 설계를 통해 얻어진 프라이머 및 프로브를 기반으로, 소량의 종양/비종양 샘플을 이용하여 후보 유전자를 초기 스크리닝하였으며, 각 유전자의 민감도/특이도 결과는 다음과 같다. CDH4(61.5%/61.5%), ZNF132(50%/100%), PPP2R5C(78.9%/100%), LONRF2(77.8%/72%), ADHFE1(100%/91.3%), SDC2(88.9%/100%), NDRG4(70%/95%), BMP3(65%/90%). 여기서, BMP3, NDRG4, ADHFE1, PPP2R5C 및 SDC2의 민감도/특이도가 우수하였다.
나아가, 상기 민감도/특이도가 우수한 5개의 후보 유전자에 대해, TCGA 데이터베이스에서 이들의 메틸화 데이터를 비교한 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, BMP3 유전자 및 NDRG4 유전자와 비교하여, ADHFE1, PPP2R5C 및 SDC2 유전자는 모두 암 주위 조직에서 더 낮은 배경을 보였고, 암 조직과 암 주위 조직도 더 분명한 차이를 보임을 발견하였다.
따라서, 발명인은 ADHFE1, PPP2R5C, SDC2 유전자를 대장암 진단용 표적 핵산으로 최종 결정하고, 상기 표적 유전자에 대한 특이적 프라이머 및 프로브 서열을 설계 및 최적화하여 구체적으로 표 1에 나타내었다.
실시예 2
발명인은 실시예 1에서 얻은 대장암 진단용 표적 핵산(ADHFE1, PPP2R5C, SDC2 유전자)의 각 프라이머 및 프로브를 이용하여 양성 또는 음성 세포주에서 형광 정량적 PCR 증폭을 수행하여 프라이머 및 프로브의 효과를 검증하였다.
단계 1, 샘플 수집: 양성 표준품 DNA(CpGenome Human Methylated DNA Standard Set, Sigma-Aldrich, S8001M), 음성 표준품 DNA(CpGenome Human Non-Methylated DNA Standard Set, Sigma-Aldrich, S8001U)
단계 2, DNA 변형: 상기 표준품 DNA 각각 10ng을 취하고, EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO RESEARCH)를 사용하여 DNA를 아황산수소염으로 전환하였으며, 컬럼 정제 후, 33ul NF water에 재용해하여 준비해 두었다.
단계 3, PCR 검출:
각각 표 1의 프라이머 및 프로브를 예로 들어 하기 PCR 시스템 및 PCR 반응 절차에 따라 형광 정량적 PCR 검출을 수행하였다. 여기서 ADHFE1의 프라이머, 프로브는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:127을 선택하고; PPP2R5C의 프라이머, 프로브는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54 및 SEQ ID NO:139를 선택하였으며; SDC2의 프라이머, 프로브는 SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90 및 SEQ ID NO:101을 선택하고; 내부 참조 GAPDH 유전자의 프라이머, 프로브는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:99를 선택하였다.
여기서, 프로브 SEQ ID NO:127의 5'말단은 FAM이고, 3'말단은 BHQ1이며;
프로브 SEQ ID NO:139의 5'말단은 CY5이고, 3'말단은 BHQ3이며;
프로브 SEQ ID NO:101의 5'말단은 VIC이고, 3'말단은 BHQ1이며;
프로브 SEQ ID NO:99의 5'말단은 ROX이고, 3'말단은 MGB이다.
(1) PCR 시스템을 표 2에 나타내었다.
표 2: PCR 시스템
성분 최종 농도
PCR Buffer 1x
마그네슘 이온 2~5mM
dNTP 0.2~0.8mM
프라이머 0.2~0.8μM
프로브 50~200mM
Taq Polymerase 1~5U
탬플릿 up to 30ul
(2) PCR 반응 절차를 표 3에 나타내었다.
표 3: PCR 반응 절차
온도 시간 사이클 수
95℃ 10min 1
95℃ 15s 45
55℃ 30s
72℃ 30s
단계 4, 결과 분석: ADHFE1, PPP2R5C, SDC2 유전자의 증폭 Ct값과 내부 참조GAPDH 유전자의 증폭 Ct값의 차이값(△Ct값)을 계산하고, 병리학적 정보가 공지된 대량의 임상적 샘플을 분석하여 설정한 판정 임계값에 따라 샘플 유전자의 메틸화 정도가 정상인지 여부를 판정하였다.
여기서, 상기 프라이머, 프로브의 증폭 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
실시예 3
발명인은 ADHFE1 유전자, PPP2R5C 유전자 및 SDC2 유전자의 메틸화를 특이적으로 검출하기 위한 특이적 프라이머 및 프로브를 포함하는 대장암 진단용 키트를 설계 및 개발하였으며, 여기서 상이한 키트에 포함된 특이적 프라이머는 표 1에 나열된 프라이머 중에서 선택하고, 프로브는 표 1에 나열된 프로브 중에서 선택하였다. 각 키트는 ADHFE1 유전자의 특이적 검출을 위한 적어도 하나의 정방향 및 역방향 프라이머, PPP2R5C 유전자의 특이적 검출을 위한 적어도 하나의 정방향 및 역방향 프라이머 및 SDC2 유전자의 특이적 검출을 위한 적어도 하나의 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하고; 또한 필요에 따라 ADHFE1 유전자의 검출을 위한 적어도 하나의 프로브, PPP2R5C 유전자의 검출을 위한 적어도 하나의 프로브 및 SDC2 유전자의 검출을 위한 적어도 하나의 프로브를 포함할 수 있다.
개발된 키트는 필요에 따라 GAPDH와 같은 내부 참조 유전자를 검출하기 위한 정방향 및 역방향 프라이머 및 프로브를 더 포함할 수 있다.
프로브의 5'말단은 FAM, VIC, ROX 또는 CY5 등일 수 있는 형광기와 연결되고, 3'말단은 MGB와 같은 소광기와 연결될 수 있다.
키트 내 프라이머 및 프로브 서열은 분말 형태로 제공될 수 있다.
또한, 제공된 키트는 필요에 따라 PCR 반응 버퍼, 중합효소, DNA 메틸화 전환 시약 등을 더 포함하여 당업자가 본 발명의 방법에 따라 대장암 진단을 수행하는 데 편리하다.
실시예 4
발명인은 실시예 3의 대장암 진단용 키트를 이용하여 하기 방법으로 샘플의 메틸화를 검출하였으며, 도 4에 도시된 바와 같이, 하기와 같은 단계를 포함한다.
1, 샘플 수집:
총 201건의 대장암 샘플, 184건의 건강한 인간 대조군, 4건의 선종 샘플 및 7건의 용종 샘플을 수집하였다.
2, 샘플 DNA 추출:
상용 분변 샘플 DNA 추출 키트를 사용하여 수집된 샘플에 대한 DNA 추출을 수행하였다.
3, DNA 변형:
EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO RESEARCH)를 사용하여 DNA를 아황산수소염으로 전환하고, 컬럼 정제 및 재용해하여 준비해 두었다.
4, PCR 검출:
본 실시예에서, ADHFE1의 프라이머, 프로브는 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:127을 선택하고; PPP2R5C의 프라이머, 프로브는 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54 및 SEQ ID NO:139를 선택하였으며; SDC2의 프라이머, 프로브는 SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90 및 SEQ ID NO:101을 선택하고; 내부 참조 GAPDH 유전자의 프라이머, 프로브는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:99를 선택하였다. 상기 실시예 2의 PCR 시스템 및 반응 조건에 따라 수집된 샘플에 대한 형광 정량적 PCR 검출을 수행하였다.
5, 결과 분석:
검출에는 Hongshi 96S qPCR 기기를 사용하였고, 기준선, 임계값은 기본값에 따라 설정되었으며, 각 유전자의 Ct값의 임계값은 37이었다.
여기서, GAPDH의 Ct값이 37보다 크면, 품질 제어 실??로 판정하고;
ADHFE1, PPP2R5C, SDC2 유전자가 37보다 크면, 음성으로 판정하였으며;
ADHFE1, PPP2R5C, SDC2 유전자의 Ct값≤37이면, ADHFE1, PPP2R5C, SDC2 유전자의 증폭 Ct값과 내부 참조 GAPDH 유전자의 증폭 Ct값의 차이값(△Ct값)을 계산하고, SPSS 소프트웨어를 사용하여 검출할 3개의 유전자 △Ct의 ROC 곡선을 만들어 ROC 곡선을 도 5에 나타내었으며, 각 유전자의 성능 및 곡선 아래 면적(AUC)을 표 4에 나타내었다.
표 4: 각 유전자의 성능 및 곡선 아래 면적(AUC)
유전자 AUC 임계값 SEN SPE
△Ct_ADHFE1 0.886 11.04 79.10% 88.60%
△Ct_PPP2R5C 0.883 12.66 83.60% 83.20%
△Ct_SDC2 0.902 11.15 81.10% 92.40%
키트 성능을 추가로 향상시키기 위해 3개 유전자의 △Ct값을 통합하여 분석한 결과, AUC는 0.945에 달할 수 있었다. 최종적으로 △Ct(ADHFE1)≤8, △Ct(PPP2R5C)≤5, △Ct(SDC2)≤12로 결정되면 상기 유전자 검출을 양성으로 판정하고, 임의의 유전자가 양성이면 상기 샘플 검출을 양성으로 판정하였으며, 해당 판정 조건에서 특이도가 94.02%이면 민감도는 87.56%에 달할 수 있었다. 여기서, 민감도는 검출을 통해 최종 임상병리학적 진단이 대장암인 양성 샘플 또는 대장암으로 진단된 환자의 비율을 나타내는 데 사용된다.
특이도는 검출을 통해 최종 임상적병리학적 진단이 정상인 샘플 또는 정상으로 진단된 환자의 비율을 나타내는 데 사용된다.
상기 결과는 본 발명이 다중 유전자의 공동 검출을 통해 단일 유전자 검출보다 더 우수한 검출 성능을 얻을 수 있음을 보여준다.
본 명세서의 설명에서, "일 실시예", "일부 실시예", "예", "구체적 예" 또는 "일부 예" 등의 용어를 참조한 설명은 해당 실시예 또는 예와 관련하여 설명된 구체적 특징, 구조, 재료 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시예 또는 예에 포함됨을 의미한다. 본 명세서에서, 상기 용어의 예시적 표현은 반드시 동일한 실시예 또는 예를 가리키는 것은 아니다. 또한, 설명된 구체적 특징, 구조, 재료 또는 특성은 임의의 하나 이상의 실시예 또는 예에서 임의의 적절한 방식으로 결합될 수 있다. 이 밖에, 당업자는 서로 상충되지 않는 범위에서 본 명세서에 기술된 상이한 실시예 또는 예 뿐만 아니라 상이한 실시예 또는 예의 특징을 결합 및 조합할 수 있다.
이상에서 본 발명의 실시예가 도시되고 설명되었지만, 상술한 실시예는 예시적인 것일 뿐 본 발명을 제한하는 것으로 이해해서는 안되며, 당업자는 본 발명의 범위 내에서 상기 실시예를 변화, 수정, 대체 및 변형시킬 수 있음을 이해할 수 있다.
<110> BGI GENOMICS CO., LTD. <120> COMPOSITION, KIT, AND APPLICATION FOR DETECTION OF COLORECTAL CANCER <130> BI3210459P <160> 142 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer 1 <400> 1 tttaggagtg agtggaagat aga 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer 1 <400> 2 aaaccacacc atcctaatta cct 23 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 forward primer 1 <400> 3 tcgttggggt agttggc 17 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 reverse primer 1 <400> 4 cctatctaaa cctcaaacca atcg 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 forward primer 2 <400> 5 gttttgggtt tttatcgcgc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 reverse primer 2 <400> 6 gccctaaaaa actacatcgc g 21 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 forward primer 3 <400> 7 gatggtgcga gcgtc 15 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 reverse primer 3 <400> 8 ctatctaaac ctcaaaccaa tcg 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 forward primer 4 <400> 9 ggtaatttta agggtggatg 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 reverse primer 4 <400> 10 ctcaaaacca ttttcccac 19 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 forward primer 5 <400> 11 aagtaaggag atttaaggta g 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 reverse primer 5 <400> 12 ctcaaaacca ttttcccac 19 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 forward primer 6 <400> 13 gggttatttg tttaagtttt aagt 24 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 reverse primer 6 <400> 14 ccccaaatcc tcaaca 16 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 forward primer 7 <400> 15 gttgtagttg ttttagtaag t 21 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 reverse primer 7 <400> 16 ttaaaactta aacaaataac cc 22 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 forward primer 8 <400> 17 gattggtttg aggtttaga 19 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 reverse primer 8 <400> 18 aatcctcttc cctcct 16 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 forward primer 9 <400> 19 gattggtttg aggtttaga 19 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 reverse primer 9 <400> 20 ttacaattac ctcaacaaat ac 22 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 forward primer 10 <400> 21 ggtaatttta agggtggatg gtg 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 reverse primer 10 <400> 22 tcacctatct aaacctcaaa cca 23 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 forward primer 11 <400> 23 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forward primer 15 <400> 31 cgtattttgt gatttcgttg tttc 24 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 reverse primer 15 <400> 32 aaaaattcga aaaatttaaa taccg 25 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 forward primer 16 <400> 33 cgtttgttta ttcgtttcgc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 reverse primer 16 <400> 34 cgccgctaaa acaactaacg 20 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 forward primer 17 <400> 35 cgttttgaga ggttgtatcg c 21 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 reverse primer 17 <400> 36 aaaaattcga aaaatttaaa taccg 25 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 forward primer 18 <400> 37 gtttagggcg gtatttaaat ttttc 25 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 reverse primer 18 <400> 38 atataacccg ctcaaatcct acg 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 forward primer 19 <400> 39 tgtatcgcgt attttgtgat ttc 23 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 reverse primer 19 <400> 40 ccgcttactt tcaaaaattc g 21 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C forward primer 1 <400> 41 ggttttcgtt gtttcgtttc 20 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C reverse primer 1 <400> 42 ccaaatcgac gtcctccg 18 <210> 43 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C forward primer 2 <400> 43 ggttttaggt cggggtttc 19 <210> 44 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C reverse primer 2 <400> 44 cctcctccga actccg 16 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C forward primer 3 <400> 45 tttcggtatg ggttttaggt c 21 <210> 46 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C reverse primer 3 <400> 46 cctcctccga actccg 16 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C forward primer 4 <400> 47 cgttgtttcg tttcggagtt c 21 <210> 48 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C reverse primer 4 <400> 48 caaatcgacg tcctccg 17 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C forward primer 5 <400> 49 tgtttcggtt ttcgttgttt c 21 <210> 50 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C reverse primer 5 <400> 50 caaatcgacg tcctccg 17 <210> 51 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C forward primer 6 <400> 51 ggaaacggga gagcgc 16 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C reverse primer 6 <400> 52 cgccgatcta acctcctacg 20 <210> 53 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C forward primer 7 <400> 53 cgggacggaa aggaaac 17 <210> 54 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C reverse primer 7 <400> 54 gccgatctaa cctcctacg 19 <210> 55 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C forward primer 8 <400> 55 ggttggagga tgaagtt 17 <210> 56 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C reverse primer 8 <400> 56 tccaaccctc tacttaac 18 <210> 57 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C forward primer 9 <400> 57 ggtatgggtt ttaggt 16 <210> 58 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C reverse primer 9 <400> 58 actaaaaaat aaaaccccc 19 <210> 59 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C forward primer 10 <400> 59 aagtagaggg ttggag 16 <210> 60 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C reverse primer 10 <400> 60 aaaaccctta actccc 16 <210> 61 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 1 <400> 61 agtgtagaaa ttaataagtg agagggc 27 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 1 <400> 62 ttcctcctcc tacgcctact 20 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 2 <400> 63 ataagtgaga gggcgtcgc 19 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 2 <400> 64 ttcctcctcc tacgcctact 20 <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 3 <400> 65 cgttgcggta ttttgtttc 19 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 3 <400> 66 aacgaaacct cctacccaa 19 <210> 67 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 4 <400> 67 aaattagaaa ttgaatttcg gtacg 25 <210> 68 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 4 <400> 68 aactactctc taaaactctt cttactctac t 31 <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 5 <400> 69 gcgttgggta ggaggtttc 19 <210> 70 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 5 <400> 70 atattcccca aaaaccgact act 23 <210> 71 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 6 <400> 71 tcgtttaggg tgtttgaagt tac 23 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 6 <400> 72 ccaacgaatc tccgatatat actt 24 <210> 73 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 7 <400> 73 cgtggtttgg gaaggac 17 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 7 <400> 74 cgaaataaaa ccgttccctc 20 <210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 8 <400> 75 ggagtttggg tcgggttc 18 <210> 76 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 8 <400> 76 aaatttccaa atcatcccta atctc 25 <210> 77 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 9 <400> 77 gggagtgtag aaattaataa gtgagagg 28 <210> 78 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 9 <400> 78 ctcctacgcc tactcccg 18 <210> 79 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 10 <400> 79 gagttcgagt tttcgagttt gagt 24 <210> 80 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 10 <400> 80 ctacccaacg ctcgacg 17 <210> 81 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 11 <400> 81 gagttcgagt tttcgagttt gagt 24 <210> 82 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 11 <400> 82 cgaaacctcc tacccaacg 19 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 12 <400> 83 gagtcggtga gtgggttagg 20 <210> 84 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 12 <400> 84 gctcccctat tccctacg 18 <210> 85 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 13 <400> 85 atattttaaa cggcgcgc 18 <210> 86 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 13 <400> 86 taaatcctac tcaccttaaa cttaataacc t 31 <210> 87 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 14 <400> 87 ttgaggaagg gaagaggg 18 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 14 <400> 88 caatccccaa atatacaccg 20 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 15 <400> 89 tttagggatc ggttgttttt agtc 24 <210> 90 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 15 <400> 90 gaattcgtat acgcgaacta cg 22 <210> 91 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 16 <400> 91 agtttaaggt gagtaggatt tacgc 25 <210> 92 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 16 <400> 92 ttttacccta attacaaaca acgac 25 <210> 93 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 17 <400> 93 ggtttttgcg gttagattaa atc 23 <210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 17 <400> 94 aaaaaacgct actcgctaac gt 22 <210> 95 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 18 <400> 95 gtagggaata ggggag 16 <210> 96 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 18 <400> 96 aaataacttc aaaaacctc 19 <210> 97 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 forward primer 19 <400> 97 gaagaagttg ggagtgat 18 <210> 98 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 reverse primer 19 <400> 98 cctcttccct tcctca 16 <210> 99 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH probe 1 <400> 99 cccaaaacac atttcttcca ttc 23 <210> 100 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 probe 1 <400> 100 aaacgaagtt ttttgtttag cgtt 24 <210> 101 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 probe 2 <400> 101 gaaaaaactt cgttttaccc taattac 27 <210> 102 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 probe 3 <400> 102 acaccgaaaa ttacgattta atctaac 27 <210> 103 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 probe 4 <400> 103 acaccaaaaa ttacaattta atctaac 27 <210> 104 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 probe 5 <400> 104 ctactcgcta acgttaccc 19 <210> 105 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 probe 6 <400> 105 ctactcacta acattaccc 19 <210> 106 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 probe 7 <400> 106 cctcttccct tcctca 16 <210> 107 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 probe 8 <400> 107 taacgccaac gaacaacgct tt 22 <210> 108 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 probe 9 <400> 108 ctaaaccaaa ccgcaattct cgata 25 <210> 109 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 probe 10 <400> 109 taacaccaac aaacaacact tt 22 <210> 110 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 probe 11 <400> 110 ctaaaccaaa ccacaattct caata 25 <210> 111 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 probe 12 <400> 111 accccgcgat ccgcgaaaat aaaa 24 <210> 112 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDC2 probe 13 <400> 112 cccgcgatcc gcgaaaataa aaacaccg 28 <210> 113 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 probe 1 <400> 113 tcacctatct aaacctcaaa cca 23 <210> 114 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 probe 2 <400> 114 cccaacgacg ctcgcac 17 <210> 115 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 probe 3 <400> 115 caacgacgct cgcaccat 18 <210> 116 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 probe 4 <400> 116 taaataatac gaacgccgct aaaac 25 <210> 117 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 probe 5 <400> 117 atacgaacgc cgctaaaaca actaac 26 <210> 118 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 probe 6 <400> 118 cccaacaaca ctcacac 17 <210> 119 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 probe 7 <400> 119 caacaacact cacaccat 18 <210> 120 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 probe 8 <400> 120 taaataatac aaacaccact aaaac 25 <210> 121 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 probe 9 <400> 121 atacaaacac cactaaaaca actaac 26 <210> 122 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 probe 10 <400> 122 actcaaaacc attttcccac gaaat 25 <210> 123 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 probe 11 <400> 123 aacgaaaaac gccactaccc gatacga 27 <210> 124 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 probe 12 <400> 124 aacgccacta cccgatacga actacacc 28 <210> 125 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 probe 13 <400> 125 aaaaaccaaa acgccaacta cccca 25 <210> 126 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 probe 14 <400> 126 cccacgaaat aaaaaccaaa acgccaac 28 <210> 127 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ADHFE1 probe 15 <400> 127 caaaacgcca actaccccaa cgac 24 <210> 128 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C probe 1 <400> 128 cgaaccgcgc tctccc 16 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C probe 2 <400> 129 tttcctttcc gtcccgtctc g 21 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C probe 3 <400> 130 aattaaaacg cgcaacgcaa 20 <210> 131 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C probe 4 <400> 131 cgattcgcga acgacc 16 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C probe 5 <400> 132 ctttaccccg acctccgcta 20 <210> 133 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C probe 6 <400> 133 caaaccacac tctccc 16 <210> 134 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C probe 7 <400> 134 tttcctttcc atcccatctc a 21 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C probe 8 <400> 135 aattaaaaca cacaacacaa 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C probe 9 <400> 136 acacaattca caaacaacca 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C probe 10 <400> 137 ctttacccca acctccacta 20 <210> 138 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C probe 11 <400> 138 ccgcccgcga accgcgctc 19 <210> 139 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C probe 12 <400> 139 tacgcgctcc aaccctctac ttaaccgc 28 <210> 140 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C probe 13 <400> 140 caaccctcta cttaaccgcc cgcgaa 26 <210> 141 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C probe 14 <400> 141 cgttacgcgc tccaaccctc t 21 <210> 142 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R5C probe 15 <400> 142 tacgttacgc gctccaaccc tct 23

Claims (19)

  1. 대장암 검출용 조성물로서,
    ADHFE1 유전자, PPP2R5C 유전자 및 SDC2 유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위한 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 시약은 프라이머 세트 및 프로브를 포함하고,
    상기 프라이머 세트는,
    (a-1) SEQ ID NO:3~SEQ ID NO:40으로 표시되는 서열 중 적어도 한가닥;
    (b-1) SEQ ID NO:41~SEQ ID NO:60으로 표시되는 서열 중 적어도 한가닥; 및
    (c-1) SEQ ID NO:61~SEQ ID NO:98로 표시되는 서열 중 적어도 한가닥을 포함하며,
    상기 프로브는,
    (a-2) SEQ ID NO:100~SEQ ID NO:112로 표시되는 서열 중 적어도 하나;
    (b-2) SEQ ID NO:113~SEQ ID NO:127로 표시되는 서열 중 적어도 하나; 및
    (c-2) SEQ ID NO:128~SEQ ID NO:142로 표시되는 서열 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:2로 표시되는 서열을 추가로 포함하고;
    상기 프로브는 SEQ ID NO:99로 표시되는 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    ADHFE1 유전자를 검출하기 위한 시약은 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:127로 표시되는 서열을 포함하고;
    PPP2R5C 유전자를 검출하기 위한 시약은 SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54 및 SEQ ID NO:139로 표시되는 서열을 포함하며;
    SDC2 유전자를 검출하기 위한 시약은 SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90 및 SEQ ID NO:101로 표시되는 서열을 포함하고;
    선택적으로, 상기 조성물은 GAPDH 유전자를 검출하기 위한 시약을 더 포함하며, 상기 GAPDH 유전자를 검출하기 위한 시약은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:99로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은,
    PCR 버퍼, 염이온, dNTP, DNA 중합효소 또는 표적 핵산 중에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 대장암 진단용 키트로서,
    상기 키트는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    DNA 추출 시약, DNA 메틸화 전환 시약, 핵산 정제 시약 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 샘플 내 유전자의 메틸화 상태 결정 방법으로서,
    상기 유전자는 ADHFE1 유전자, PPP2R5C 유전자 및 SDC2 유전자를 포함하고,
    상기 방법은,
    (1) 상기 샘플로부터의 게놈 DNA를 얻는 단계;
    (2) 상기 게놈 DNA를 메틸화 전환 처리하여 전환 생성물을 얻되, 상기 게놈 DNA는 메틸화 처리되고, 메틸화 부위와 비메틸화 부위는 차이를 나타내는 단계; 및
    (3) 프라이머 세트와 프로브를 이용하여 상기 전환 생성물에 대한 형광 정량적 PCR 검출을 수행하여 샘플 내 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 샘플은 조직 샘플, 혈액 샘플, 분비물 또는 배설물 중에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 배설물은 분변 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는,
    (a) SEQ ID NO:3~SEQ ID NO:40으로 표시되는 서열 중 적어도 한가닥;
    (b) SEQ ID NO:41~SEQ ID NO:60으로 표시되는 서열 중 적어도 한가닥; 및
    (c) SEQ ID NO:61~SEQ ID NO:98로 표시되는 서열 중 적어도 한가닥을 포함하고,
    상기 프로브는,
    SEQ ID NO:100~SEQ ID NO:112로 표시되는 서열 중 적어도 하나;
    SEQ ID NO:113~SEQ ID NO:127로 표시되는 서열 중 적어도 하나; 및
    SEQ ID NO:128~SEQ ID NO:142로 표시되는 서열 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 형광 정량적 PCR 검출 조건은 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초, 총 45 사이클을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 분리된 핵산 서열로서,
    상기 분리된 핵산 서열은 프라이머 세트 및 프로브를 포함하고,
    상기 프라이머 세트는,
    (a) SEQ ID NO:3~SEQ ID NO:40으로 표시되는 서열 중 적어도 한가닥;
    (b) SEQ ID NO:41~SEQ ID NO:60으로 표시되는 서열 중 적어도 한가닥; 및
    (c) SEQ ID NO:61~SEQ ID NO:98로 표시되는 서열 중 적어도 한가닥을 포함하며,
    상기 프로브는,
    SEQ ID NO:100~SEQ ID NO:112로 표시되는 서열 중 적어도 하나;
    SEQ ID NO:113~SEQ ID NO:127로 표시되는 서열 중 적어도 하나; 및
    SEQ ID NO:128~SEQ ID NO:142로 표시되는 서열 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 서열.
  14. 피험자의 대장암 발병 상태 평가 방법으로서,
    상기 방법은,
    a) 피험자의 샘플을 제공하되, 상기 샘플은 상기 피험자의 표적 핵산을 함유하고, 상기 표적 핵산은 ADHFE1 유전자, PPP2R5C 유전자 및 SDC2 유전자로부터의 핵산을 포함하는 단계;
    b) 상기 표적 핵산의 메틸화 상태를 평가하는 단계; 및
    c) 상기 표적 핵산의 메틸화 상태를 기반으로 상기 피험자의 대장암 발병 상태를 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 피험자는 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    단계 b)에서는 프라이머 세트와 프로브를 사용하여 상기 표적 핵산의 메틸화 상태를 평가하고, 상기 프라이머 세트는,
    (a) SEQ ID NO:3~SEQ ID NO:40으로 표시되는 서열 중 적어도 한가닥;
    (b) SEQ ID NO:41~SEQ ID NO:60으로 표시되는 서열 중 적어도 한가닥; 및
    (c) SEQ ID NO:61~SEQ ID NO:98로 표시되는 서열 중 적어도 한가닥을 포함하며,
    상기 프로브는,
    SEQ ID NO:100~SEQ ID NO:112로 표시되는 서열 중 적어도 하나;
    SEQ ID NO:113~SEQ ID NO:127로 표시되는 서열 중 적어도 하나; 및
    SEQ ID NO:128~SEQ ID NO:142로 표시되는 서열 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 방법은 상기 샘플로부터 상기 표적 핵산을 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 방법은 상기 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제14항에 있어서,
    내부 참조 유전자를 사용하여 DNA ?t량이 검출 요건을 충족시키는지 여부를 결정하고, 타겟 유전자의 Ct값과 내부 참조 유전자의 Ct값의 차이값(△Ct)을 사용하여 메틸화 상태를 판단하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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