JP2022532153A

JP2022532153A - ホスホリパーゼａ２を有効成分として含む肥満予防または治療用組成物

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Publication number: JP2022532153A
Application number: JP2021566344A
Authority: JP
Inventors: ペ、ヒョンス; チョン、ヒョンジュ
Original assignee: Twinpig Biolab Inc
Current assignee: Twinpig Biolab Inc
Priority date: 2019-05-08
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2022-07-13
Also published as: CN114126641A; EP3964228A1; WO2020226450A1; US20220211821A1; JP2023179581A; KR20220042333A; EP3964228A4

Abstract

本発明は、ハチ毒の主要成分の一つであるホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む肥満改善用組成物に関し、より具体的には、ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む肥満予防または治療用薬学的組成物；ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む肥満予防または改善用健康機能食品組成物；飼料組成物；ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む肥満予防または治療方法；及びホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む組成物の肥満予防または治療における使用に関する。本発明の物質ハチ毒の主要成分であるホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む炎症性マクロファージ減少及び肥満予防または治療用組成物は、薬学的組成物として有用に用いられる。

Description

本発明は、ハチ毒の主要成分の一つであるホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む肥満改善用組成物に関し、より具体的には、ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む肥満予防または治療用薬学的組成物；ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む肥満予防または改善用健康機能食品組成物；飼料組成物；ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む肥満予防または治療方法；及びホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む組成物の肥満予防または治療における使用に関する。

肥満は、脂肪が体内に過剰蓄積される症状に代表され、主要代謝疾患の一つに分類され、全世界国家が経ている深刻な健康問題であり、来る２０２５年には３億人以上になると予測され、肥満薬物の市場は韓国内だけでなく、全世界的に大きく成長することが予想される。

糖尿、心臓疾患、高血圧、癌などを複合的に引き起こし、ひどい場合、早期死亡に至ることが知られている。
肥満は、慢性炎症にも分類され、最近、研究により脂肪組織内に蓄積される炎症性マクロファージが肥満と密接に関連していることが明らかになった。さらに、肥満状態の場合、脂肪内における炎症性と抗炎症性マクロファージが不均衡をなして炎症環境を造成し、炎症性マクロファージの浸潤は、炎症性サイトカインであるＴＮＦ－ａあるいはインターロイキン６などの分泌を増加させるため、肥満の症状をさらに悪化させることがある。

従って、炎症性環境の緩和とマクロファージの均衡が肥満患者の治療に重要であると予想されるが、マクロファージを標的とする肥満治療剤は現在まで皆無な状態である。
現在、肥満の治療法としては、食事療法、運動療法、薬物療法があるが、薬物療法の場合、投与期間が長くなるにつれて安定性と副作用の問題が台頭し、新たな肥満治療剤の開発が求められてきた。

現在、韓国内ではｏｒｌｉｓｔａｔとｌｏｒｃａｓｅｒｉｎｅのみが長期的に使用可能に許可されており、米国ではｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ、ｐｈｅｎｔｅｒｍｉｎｅ／ｔｏｐｉｒａｍａｔｅ、ｎａｌｔｒｅｘｏｎｅ／ｂｕｐｒｏｐｉｏｎなど、多様な治療剤が開発及び許可された。しかし、多くの薬物が飲食を通じて摂取する脂肪の吸収を阻害する方式で体重を減量させるため、根本的な肥満治療薬物の開発が至急である。

一方、ホスホリパーゼＡ２は、タンパク質酵素の一つであり、ハチ毒中に１２％含まれているホスホリパーゼは、リン脂質を加水分解する酵素であり、レシチナーゼとも言う。上記ホスホリパーゼＡ２成分は、細胞膜の構成脂質であるホスホリピドのグリセリンのＢＤＰ結合する脂肪酸を遊離させてリソホスファチドにするため、細胞組織の破壊、溶血作用及び触媒作用などを引き起こすことが知られている。ホスホリパーゼＡ２のこのような作用を活用して多様な薬学組成物を開発することができ、特許文献１においてインフルエンザ、水疱性口内炎などのようなウイルス性疾患を予防及び治療できる組成物を提示している。また、特許文献２においてホスホリパーゼを有効成分として含むプリオン病治療用組成物を提示しており、これは、退行性脳疾患の予防及び治療用薬学組成物として有用に用いられる。

韓国公開特許第１０－２０１５－００４９４３８号公報韓国公開特許第１０－２０１２－０１３９３１３号公報

本発明者らは、副作用を示さずに、肥満を改善する方法を開発すべく鋭意研究努力した結果、ハチ毒に由来したホスホリパーゼＡ２が肥満に対する予防または治療効能を示すことを確認し、本発明を完成した。

本発明の一つの目的は、ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む肥満予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む肥満予防または改善用健康機能食品組成物を提供することにある。

本発明の更に他の一つの目的は、ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む肥満予防または改善用飼料組成物を提供することにある。
本発明の更に他の一つの目的は、ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む肥満予防または治療方法を提供することにある。

本発明の更に他の一つの目的は、ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む組成物の肥満予防または治療における使用を提供することにある。

本発明の物質のハチ毒の主要成分であるホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む炎症性マクロファージ減少及び肥満予防または治療用組成物は、薬学的組成物として有用に用いられる。

実験段階を示す模式図である。各グループ別マウスの状態を示す写真である。各グループ別マウスの体重量変化を示すグラフである。各グループ別マウスの飲食摂取量を示すグラフである。各グループ別副睾丸及び鼠径部の白色脂肪細胞を示す写真である。各グループ別副睾丸及び鼠径部の白色脂肪細胞の重量変化を示す写真である。各グループ別ＣＤ２０６が欠如しているマウスの状態を示す写真である。各グループ別体重量変化を示すグラフである。各グループ別副睾丸及び鼠径部の白色脂肪細胞を示す写真である。各グループ別副睾丸及び鼠径部の白色脂肪細胞の重量変化を示すグラフである。ＩｇＧを追加で処理した各グループ別ＣＤ２０６が欠如しているマウスの体重量変化を示すグラフである。各グループ別マウスの肝臓を示す写真である。各グループ別マウスの肝臓の重量を示す写真である。各グループ別マウスの肝臓のＨ＆Ｅ染色写真である。各グループ別マウスの肝臓内における脂肪滴蓄積を示すグラフである。各グループ別マウスの腎臓のＨ＆Ｅ染色写真である。各グループ別マウスの腎臓の肥大率を示すグラフである。各グループ別マウスの血清内におけるＡＬＴ、ＡＳＴ、ＢＵＮ、Ｃｒｅａの数値を示すグラフである。各グループ別マウスの血清内におけるＴＧ、ＧＬＵ、ＨＤＬ－Ｃ、ＬＤＬ－Ｃの数値を示すグラフである。各グループ別マウスの血清内におけるインスリン、レプチンの数値を示すグラフである。各グループ別脂肪内におけるマクロファージ浸潤を示す写真である。各グループ別脂肪内におけるマクロファージ浸潤を示すグラフである。定量ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲによる各グループ別ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－１２ａの水準を示すグラフである。定量ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲによる各グループ別ＩＬ－４、ＣＤ２０６及びＹｍｌの水準を示すグラフである。定量ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲによる各グループ別ＰＰＡＲ γ、Ｃ／ＥＢＰ α及びＵＣＰ－１の水準を示すグラフである。ＰＬＡ２とメリチンをそれぞれマウスに投与して体重量変化を確認するグラフである。

上記目的を達成するための本発明の一実施様態は、ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む肥満予防または治療用薬学的組成物を提供する。
本発明の用語「ホスホリパーゼＡ２（ＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅＡ２；ＰＬＡ２）」は、タンパク質酵素の一つであり、ハチ毒中に１２％含まれているホスホリパーゼは、リン脂質を加水分解する酵素であってレシチナーゼとも言う。ホスホリパーゼは、リン脂質を分解する位置に応じてＡ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｄに分類される。

上記ＰＬＡ２の肥満改善用効能については知られたことがなく、本発明者により初めて究明された。
より具体的には、上記ＰＬＡ２は、西洋蜜蜂（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ）のハチ毒に由来したもの（ｂｖＰＬＡ２）または遺伝子組換えによるもの（遺伝子改変操作を含む）であってもよいが、これに制限されるものではない。

本発明のＰＬＡ２は、ハチ毒の主要成分はメリチンと比較して卓越した肥満抑制または治療効能があることを確認した。
また、上記ＰＬＡ２は、マンノース受容体に作用するものであってもよく、脂肪滴（ｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔ）の蓄積を減少させ、脂肪肝または腎臓損傷緩和によりなされてもよく、アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液尿素窒素、クレアチン、トリグリセリド（ＴＧ）、ブドウ糖（ＧＬＵ）、高密度脂肪タンパク質（ＨＤＬ－Ｃ）、または低密度脂肪タンパク質（ＬＤＬ－Ｃ）、インスリン及びレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）の減少による代謝機能障害緩和によるものであってもよく、前炎症性マクロファージの浸潤抑制によりなされたものであってもよく、Ｍ１マクロファージの抑制またはＭ２マクロファージの増加によるＭ１／Ｍ２調節によるものであってもよく、脂質蓄積及び脂肪合成の阻害を通じてなされるものであってもよいが、これに制限されるものではない。

本発明の用語、「肥満」とは、体内に脂肪が過多な状態を意味し、具体的には、身体肥満指数（体質量指数、Ｂｏｄｙｍａｓｓｉｎｄｅｘ：体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の二乗で除した値）が２５以上であれば肥満と定義する。肥満は、遺伝的、環境的要因など非常に複合的な原因で誘発され得るが、結果的には、長い期間にわたりエネルギー消費量に比べて栄養素を過多摂取する場合、エネルギー不均衡により脂肪が蓄積して誘発される。肥満になる場合、糖尿病及び高脂血症が生じる可能性が高くなり、性機能障害、関節炎、心血管系疾患の発病リスクが大きくなる。

本発明の用語、「予防」とは、本発明によるＰＬＡ２を有効成分として含む組成物を個体に投与して肥満を抑制したり遅延させる全ての行為を意味し得る。
本発明の用語、「治療」とは、本発明の上記組成物を肥満の疑いのある個体に投与して肥満症状を好転させたり有益にさせる全ての行為を意味し得る。

本発明の一実施例では、ＰＬＡ２をマウスに投与して脂肪組織及び体重減少効能を確認し（図１）、マンノース受容体が欠如しているマウスを通じてｂｖＰＬＡ２の肥満抑制効能がマンノース受容体によることを確認し（図２）、Ｈ＆Ｅ染色を通じて脂肪滴蓄積を減少させて脂肪肝及び腎臓損傷緩和効能があることを確認し、各グループ別マウスの血清を調査して代謝機能障害緩和効能があることを確認し（図３）、組織検査を通じてマクロファージの浸潤抑制効能による肥満改善効能があることを確認し、Ｍ１／Ｍ２マクロファージマーカー分析を通じてＭ１／Ｍ２マクロファージの比率を調節（図４）及び脂肪生成因子発現の調節（図５）を通じて肥満抑制または治療効能があることを確認し、ハチ毒の主要成分であるメリチンより優れた肥満抑制効能を確認し（図６）、本発明を完成した。

本発明の薬学組成物は、単一製剤としても用いることができ、公認された肥満治療効果を奏することが知られている薬物をさらに含めて複合製剤に製造して用いることができ、薬学的に許容される担体または賦形剤を用いて製剤化することにより単位容量形態に製造されたり多用量容器内に入れて製造されてもよい。

本発明における用語、「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せずに、注入される化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を意味する。本発明に使用可能な上記担体の種類は特に制限されず、当該技術分野において通常に用いられ、薬学的に許容される担体であれば、いずれも用いることができる。上記担体の非制限的な例としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールなどを挙げることができる。これらは単独で用いられたり２種以上を混合して用いられてもよい。上記担体は、非自然的担体（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｉｎｇｃａｒｒｉｅｒ）を含んでもよい。

また、必要な場合、抗酸化剤、緩衝液及び／又は静菌剤など、他の通常の添加剤を添加して用いることができ、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤などに製剤化して用いることができる。

また、本発明の薬学的組成物は、薬学的に有効な量のＰＬＡ２を含み得る。
本発明における用語、「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスクの比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、一般に、０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇの量、望ましくは０．０５～２００ｍｇ／ｋｇ、より望ましくは０．１～１００ｍｇ／ｋｇの量を一日１回～数回に分けて投与できる。しかし、本発明の目的上、特定患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって他の製剤が用いられるかどうかをはじめとした具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食物、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に用いられたり同時に用いられる薬物をはじめとする多様な因子と医薬分野によく知られている類似因子によって異なって適用することが好ましい。

本発明の薬学組成物は、個別治療剤として投与したり、他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順序的または同時に投与できる。そして、単一または多重投与され得る。上記要素をいずれも考慮して副作用を誘発しないながら最少限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者により容易に決定され得る。

本発明における用語、「投与」とは、任意の適切な方法で患者に本発明の薬学組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は目的組織に到達できる限り、経口または非経口の多様な経路を通じて投与され得る。

本発明による薬学組成物の投与方式は、特に制限されず、当該技術分野において通常に用いる方式に従うことができる。上記投与方式の非制限的な例として、組成物を経口投与または非経口の投与方式で投与できる。本発明による薬学組成物は、目的とする投与方式に従って多様な剤形に製作され得る。

本発明の組成物の投与頻度は、特にこれに制限されないが、１日１回投与したりまたは用量を分割して数回投与できる。
本発明のもう一つの実施様態は、ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む、肥満予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。

本発明の更に他の一つの実施様態は、ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む、肥満予防または改善用飼料組成物を提供する。
本発明において、上記「ホスホリパーゼＡ２」、「肥満」及び「予防」は、上記で記述した通りである。

本発明の用語、「改善」とは、ＰＬＡ２を有効成分として含む組成物の投与により治療される状態と関連したパラメータ、例えば、症状の程度を少なくとも減少させる全ての行為を意味する。

本発明の用語、健康機能食品（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｆｏｏｄ）とは、特定保健用食品（ｆｏｏｄｆｏｒｓｐｅｃｉａｌ２４－８ｈｅａｌｔｈｕｓｅ、ＦｏＳＨＵ）と同様の用語であり、栄養供給以外にも生体調節機能が効率よく示されるように加工された医学、医療効果が高い食品を意味するが、上記食品は、肥満の予防または改善に有用な効果を得るために、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状、丸剤などの多様な形態に製造され得る。

本発明の食品組成物は、食品学的に許容可能な担体をさらに含むものであってもよい。
本発明のＰＬＡ２を含む組成物を添加し得る食品の種類には、特に制限がなく、例えば、各種飲料、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康補助食品類などがある。上記食品組成物には肥満の予防または改善効果を妨げない他の成分を追加でき、その種類は、特に制限されない。

例えば、通常の食品のように様々な生薬抽出物、食品学的に許容可能な食品補助添加剤または天然炭水化物などを追加成分として含有してもよい。
上記食品補助添加剤は、各剤形の健康機能食品を製造するのに添加されるものであり、当業者が適宜選択して用いることができる。例えば、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び充填剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などが含まれるが、上記例によりその種類が制限されるものではない。

この時、上記食品に含まれる抽出物の含量は、特にこれに制限されないが、食品組成物の全重量に対して０．０１～１００重量％、より望ましくは１～８０重量％として含まれ得る。

食品が飲料の場合には、１００ｍｌを基準に１～３０ｇ、好ましくは３～２０ｇの比率で含まれてもよい。また、上記組成物は食品組成物に通常用いられ、臭い、味、視覚などを向上させる追加の成分を含んでもよい。例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ナイアシン（ｎｉａｃｉｎ）、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、フォレート（ｆｏｌａｔｅ）、パントテン酸（ｐａｎｔｈｏｔｅｎｉｃａｃｉｄ）などを含んでもよい。また、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、カルシウム（Ｃａ）、クロム（Ｃｒ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、銅（Ｃｕ）などのミネラルを含んでもよい。また、リシン、トリプトファン、システイン、バリンなどのアミノ酸を含んでもよい。また、防腐剤（ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、デヒドロ硝酸ナトリウムなど）、殺菌剤（さらし粉と高度さらし粉、次亜塩素酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）など）、着色剤（タール色素など）、発色剤（亜硝酸ナトリウム、亜酢酸ナトリウムなど）、漂白剤（亜硫酸ナトリウム）、調味料（ＭＳＧグルタミン酸ナトリウムなど）、甘味料（ズルチン、シクラメート、サッカリン、ナトリウムなど）、香料（バニリン、ラクトン類など）、ふくらし粉（明礬、Ｄ－酒石酸水素カリウムなど）、強化剤、乳化剤、増粘剤（糊料）、皮膜剤、ガム基礎剤、消泡剤、溶剤、改良剤などの食品添加物（ｆｏｏｄａｄｄｉｔｉｖｅｓ）を添加できる。上記添加物は、食品の種類に応じて選別され、適切な量で用いられる。

本発明の健康機能食品は、当業界において通常に用いられる方法により製造可能であり、上記製造時には当業界において通常に添加する原料及び成分を添加して製造できる。また、一般薬品とは異なって食品を原料として薬品の長期服用時に発生し得る副作用などがない長所があり、携帯性に優れる。

本発明の更に他の一つの実施様態は、本発明のホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む肥満予防または治療方法を提供する。
本発明で用いられる用語、「個体」とは、肥満状態となったり／なる可能性があるヒトを含む全ての動物を意味してもよい。上記動物はヒトだけでなく、これと類似の症状の治療を必要とする牛、馬、羊、豚、ヤギ、ラクダ、カモシカ、犬、ネコなどの哺乳動物であってもよいが、これに制限されない。

本発明の上記予防または治療方法は、具体的には、肥満状態となったり／なる可能性がある個体に上記組成物を薬学的に有効な量で投与する段階を含み得る。
本発明で用いられた用語、「投与」とは、任意の適切な方法で患者に本発明の薬学的組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は目的組織に到達できる限り、経口または非経口の多様な経路を通じて投与され得る。

本発明の更に他の一つの実施様態は、本発明のホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む組成物の肥満予防または治療における使用を提供する。
以下、実施例を通じて本発明の構成及び効果をより詳細に説明する。これら実施例は、専ら本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例により限定されるものではない。

実験例１：ｂｖＰＬＡ２による抗炎症性マクロファージ増加
ハチ毒由来ホスホリパーゼＡ２（ｂｖＰＬＡ２、Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ）、３－Ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ；ＤＥＸ）、インスリン及びオイルレッドＯ（ＯｉｌｒｅｄＯ）は、Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購買した。

実験例２：ｂｖＰＬＡ２による炎症環境の緩和
３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞は、韓国細胞株銀行（ＫＣＬＢ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）から購入し、１０％仔牛血清（ＢＣＳ）が含まれたＤＭＥＭで培養し、培養液は２－３日ごとに交換した。その後、上記細胞を９６ウェルプレートに接種し、培地をＭＤＩ培地（ＩＢＭＸ１１１μｇ／ｍＬ、ＤＥＸ２μＭ及びインスリン２μｇ／ｍＬが含まれたＤＭＥＭ）に交換して脂肪細胞分化を誘導した。分化培地は２日ごとに交換し、分化４日後、完全に分化された細胞はオイルレッドＯ染色を通じて分析した。

実験例３：オイルレッドＯ染色
分化された３Ｔ３－Ｌ１細胞はＰＢＳで２回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）バッファに２０分間固定した。オイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈＳｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）は６０％イソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）に溶解させた後、細胞に２０分間室温で処理して染色した。蒸溜水で２回洗浄した後、５１０ｎｍでＯＤ値を測定した。

実験例４：実験動物
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（５週齢；体重１８－２０ｇ）及びＣＤ２０６－／－マウス（Ｂ６．１２９Ｐ２－ＭＲＣ１ｔｍ１Ｍｎｚ／Ｊ）はＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。１週間適応させた後、１５週間正常食餌（ＮＤ；ｎｏｒｍａｌｄｉｅｔ、１０ｋｃａｌ％）または高脂肪食餌（ＨＦＤ；ｈｉｇｈ－ｆａｔｄｉｅｔ、６０ｋｃａｌ％）を供給した。その後、５週目から１１週間、マウス腹腔内にＰＢＳまたはｂｖＰＬＡ２（０．５ｍｇ／ｋｇ）を注射した。

実験例５：Ｔ調節細胞欠乏（Ｔｒｅｇｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）
抗マウスＣＤ２５（ｃｌｏｎｅ：ＰＣ６１）はＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から得たハイブリドーマから生産し、１１週間、３日ごとに抗マウスＣＤ２５またはラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ）をマウス腹腔内に注射した。

実験例６：定量（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ
全体ＲＮＡは、白色脂肪細胞（ｗｈｉｔｅａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ；ＷＡＴ）のサンプルからｅａｓｙ－ＢＬＵＥＲＮＡ抽出キット（ｉＮｔＲＯＮＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｏｒｅａ）を用いて分離し、Ｃｙｃｌｅｓｃｒｉｐｔｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋｏｒｅａ）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡは、ＳｅｎｓｉＦＡＳＴＳＹＢＲｎｏ－Ｒｏｘｋｉｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｋｏｒｅａ）と共に定量ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ（９５℃１５秒、５５℃１０秒及び７２℃１０秒）を行い、これを３回繰り返して実験した。実験のプライマーシーケンスは下記の通りである。
ＧＡＰＤＨ：
ｆｏｒｗａｒｄ、５’－ＣＣＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧ－３’
ｒｅｖｅｒｓｅ、５’－ＣＡＣＡＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧＧＡＡＣＡＣ－３’
ＴＮＦ－α：
ｆｏｒｗａｒｄ、５’－ＴＴＣＴＧＴＣＴＡＣＴＧＡＡＣＴＴＣＧＧＧＧＴＧＡＴＣＧＧＴＣＣ－３’
ｒｅｖｅｒｓｅ、５’－ＧＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＣＡＡＡＴＣＧＧＣＴＧＡＣＧＧＴＧＴＧＧＧ－３’
ＩＬ－１β：
ｆｏｒｗａｒｄ、５’－ＧＧＡＣＡＧＡＡＴＡＴＣＡＡＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡ－３’
ｒｅｖｅｒｓｅ、５’－ＧＴＧＴＧＣＣＧＴＣＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＣＡＧ－３’
ＩＬ－１２ａ：
ｆｏｒｗａｒｄ、５’－ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧ－３’
ｒｅｖｅｒｓｅ、５’－ＧＡＡＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＣＡＴＣＡＧＣ－３’
ＩＬ－４：
ｆｏｒｗａｒｄ、５’－ＡＣＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＡＧ－３’
ｒｅｖｅｒｓｅ、５’－ＴＧＡＴＧＴＧＧＡＣＴＴＧＧＡＣＴＣ－３’
ＣＤ２０６
ｆｏｒｗａｒｄ、５’－ＡＧＴＧＧＣＡＧＧＴＧＧＣＴＴＡＴＧ－３’
ｒｅｖｅｒｓｅ、５’－ＧＧＴＴＣＡＧＧＡＧＴＴＧＴＴＧＴＧ－３’
Ｙｍ１
ｆｏｒｗａｒｄ、５’－ＣＡＴＴＣＡＧＴＣＡＧＴＴＡＴＣＡＧＡＴＴＣＣ－３’
ｒｅｖｅｒｓｅ、５’－ＡＧＴＧＡＧＴＡＧＣＡＧＣＣＴＴＧＧ－３’
ＰＰＡＲ γ
ｆｏｒｗａｒｄ、５’－ＧＡＡＧＧＣＴＧＡＡＧＴＣＡＣＣＡＡＧＣ－３’
ｒｅｖｅｒｓｅ、５’－ＴＣＡＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＡＧＴＴＴＴＴ－３’
Ｃ／ＥＢＰ α
ｆｏｒｗａｒｄ、５’－ＴＴＡＣＡＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＴＴＣＣ－３’
ｒｅｖｅｒｓｅ、５’－ＣＴＣＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＧＡＴＴＧＴ－３’
ＵＣＰ－１
ｆｏｒｗａｒｄ、５’－ＴＣＴＣＡＧＣＣＧＧＣＴＴＡＡＴＧＡＣＴ－３’
ｒｅｖｅｒｓｅ、５’－ＧＣＴＧＧＧＴＧＴＡＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴ－３’
実験例７：Ｈ＆Ｅ染色
肝臓及び腎臓組織は４％パラホルムアルデヒドで一晩中固定させた後、脱水及びパラフィンで包埋して４μｍの厚さに切片化した。上記切片はキシレンで脱パラフィン化した後、１００％、９０％、８０％及び７０％のエタノールで再度水和させた。水和された切片は水道水で洗浄し、５分間ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）溶液で染色した。その後、１％の酸性アルコール（ａｃｉｄａｌｃｏｈｏｌ）に浸漬させた後、エオシン溶液に３分間再度染色した。その後、マウンティングするために７０％、８０％、９０％及び１００％のエタノールで脱水させてキシレンを除去した。

実験例８：統計調査
実験結果は、平均及び標準誤差で表し、統計的有意性はｐｒｉｓｍ５ソフトウェアを用いたＮｅｗｍａｎ－Ｋｅｕｌｓテスト及びｏｎｅ－ｗａｙＡＮＯＶＡを通じて分析した。

実施例１：ｂｖＰＬＡ２の脂肪組織及び体重減少効能
ＨＦＤで肥満が誘導されたマウスの脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ）及び体重変化を通じてｂｖＰＬＡ２の肥満改善効能を評価した。

より具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに１５週間ＮＤまたはＨＦＤを供給した。４週間のＮＤまたはＨＦＤ供給後、５週目からＰＬＡ２またはＰＢＳを注射した（図１Ａ）。その後、ｂｖＰＬＡ２の注射有無による脂肪組織及び体重量を測定した。

その結果、図１で見られるように、ＨＦＤグループの体重はＮＤグループの体重より重く、ＨＦＤ＋ＰＬＡ２グループはＰＬＡ２を投与していないＨＦＤグループより体重が顕著に減少した（図１Ｂ，Ｃ）。一方、全てのグループの飲食摂取量の変化は示されなかった（図１Ｄ）。また、副睾丸（ｅｐｉｄｉｄｙｍａｌ）ＷＡＴ及び鼠径部（ｉｎｇｕｉｎａｌ）ＷＡＴの重量がＨＦＤグループで顕著に増加した一方、ＨＦＤ＋ＰＬＡ２グループで大きく減少することを確認した（図１Ｅ，Ｆ）。

これを通じて、ｂｖＰＬＡ２の投与は飲食摂取には影響を及ぼさず、さらに体重及び脂肪組織の重量を相当減少させることを確認し、肥満改善効能があることを確認した。
実施例２：ＣＤ２０６－欠乏及びＴ調節細胞が欠乏したマウス体重及び脂肪組織重量に対するｂｖＰＬＡ２の影響
ｂｖＰＬＡ２の免疫調節効果を確認するために、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）受容体が欠如しているＣＤ２０６－欠乏（ＣＤ２０６－／－）マウスを用いた。

より具体的には、上記実験方法（図１Ａ）と同様の方法でＣＤ２０６－／－マウスの体重及び脂肪組織重量を測定した。
その結果、図２で見られるように、ＨＥＤ及びＨＦＤ＋ＰＬＡ２グループ間の有意な体重変化及び脂肪組織重量変化は示されなかった（図２Ａ～Ｄ）。

また、ｂｖＰＬＡ２とＴ調節細胞との連関性を確認するために、抗マウスＣＤ２５（ｃｌｏｎｅＰＣ６１）を３日ごとにマウスに注射してＴ調節細胞を欠如させた。また、対照群としてラットＩｇＧを用いた。

その結果、図２で見られるように、ＩｇＧのみ投与した肥満誘導マウスグループよりＩｇＧ＋ＰＬＡ２肥満誘導マウスグループで体重量の顕著な減少が起きることを確認した。また、ＰＣ６１－処理群に比べてＰＣ６１＋ＰＬＡ２グループでも顕著な体重減少を確認した（図２Ｅ）。

これを通じて、ＰＬＡ２はマンノース受容体の媒介を通じて肥満抑制効能が示される一方、ＩｇＧ＋ＰＬＡ２グループ及びＰＣ６１＋ＰＬＡ２グループ間の差がないことを確認し、ＰＬＡ２の肥満抑制効能はＰＣ６１により媒介されたＴ調節細胞とは連関がないことを確認した。

実施例３：ｂｖＰＬＡ２の肝毒性／腎毒性減少効能
実施例３－１：ｂｖＰＬＡ２の脂肪肝及び腎臓損傷緩和効能
ｂｖＰＬＡ２がＨＦＤにより誘導された脂肪肝及び腎臓炎症を緩和させるかを確認するために、マウスから得た肝臓及び腎臓組織をＨ＆Ｅで染色した。

その結果、図３Ａ～３Ｄで見られるように、ＮＤグループと比較してＨＦＤグループで脂肪滴（ｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔ）の蓄積及び肝腫大（ｈｅｐａｔｏｍｅｇａｌｙ）による肝臓の重量及びサイズ増加が観測された。一方、ｂｖＰＬＡ２を処理したＨＦＤグループでは上記増加が抑制され、ＮＤ＋ＰＬＡ２グループでは影響を及ぼさないことを確認した。

また、腎臓損傷による糖尿病性腎臓病症の初期症状を示す糸球体の直径を確認した。
その結果、図３Ｅ～３Ｆで見られるように、ＨＦＤグループから脂質蓄積による腎肥大が発見されたが、ＮＤ、ＮＤ＋ＰＬＡ２及びＨＦＤ＋ＰＬＡ２グループでは腎肥大（糸球体直径増加）が発見されなかった（図３Ｅ、Ｆ）。

これを通じて、ｂｖＰＬＡ２が脂肪滴蓄積を減少させて脂肪肝及び腎臓損傷を緩和することを確認した。
実施例３－２．ｂｖＰＬＡ２の代謝機能障害緩和効能
肝臓及び腎臓の機能に対するｂｖＰＬＡ２の効能を確認した。

より具体的には、アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、血液尿素窒素（ＢＵＮ）及びクレアチン（Ｃｒｅａ）の各グループ別血清数値を確認した。

その結果、図３Ｇで見られるように、ＮＤグループと比較してＨＥＤ投与グループのＡＳＴ、ＡＬＴ及びＣｒｅａ水準が増加した。一方、ｂｖＰＬＡ２を処理したＨＦＤグループでは増加したＡＳＴ、ＡＬＴ及びＣｒｅａ水準が減少したことを確認した。

また、ｂｖＰＬＡ２によるメタボリックシンドロームに及ぼす効能を確認するために、各グループ別トリグリセリド（ＴＧ）、ブドウ糖（ＧＬＵ）、高密度脂肪タンパク質（ＨＤＬ－Ｃ）及び低密度脂肪タンパク質（ＬＤＬ－Ｃ）の水準を分析した。

その結果、図３Ｈで見られるように、ＮＤグループと比較してＨＦＤグループでＴＧ、ＧＬＵ、ＨＤＬ－Ｃ及びＬＤＬ－Ｃ数値が顕著に高かった。一方、ＨＦＤ＋ＰＬＡ２グループでは上記増加した数値が顕著に低くなることを確認した。

また、各グループ別血漿インスリン及びレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）数値を分析した。
その結果、図３Ｉで見られるように、ＮＤグループと比較してＨＦＤグループで血漿インスリン及びレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）数値が増加し、ＨＥＤ＋ＰＬＡ２グループで上記増加した数値が顕著に低くなることを確認した（図３Ｉ）。

これを通じて、ｂｖＰＬＡ２がＨＦＤにより誘導された代謝機能障害を緩和させることを確認した。
実施例４：ｂｖＰＬＡ２の脂肪組織内マクロファージ浸潤抑制効能
肥満は、ＡＴ２８内の死んだ脂肪細胞に囲まれた前炎症性マクロファージにより形成された王冠様構造（ＣＬＳ；ｃｒｏｗｎｌｉｋｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の脂肪化を特徴とするため、ｂｖＰＬＡ２が上記マクロファージのＷＡＴ内の浸潤を抑制するかを確認するために、Ｈ＆Ｅ組織学的検査を実施した。

その結果、図４で見られるように、ＮＤグループではＷＡＴで前炎症性マクロファージの浸潤がほぼ発見されなかったが、ＨＦＤグループではＣＬＳの形成が顕著に増加した。一方、ｂｖＰＬＡ２を処理したＨＦＤ＋ＰＬＡ２グループのＡＴではマクロファージの浸潤及びＣＬＳの形成が減少したことを確認した。

これを通じて、ｂｖＰＬＡ２は肥満の原因となる前炎症性マクロファージの浸潤を抑制し、肥満緩和効能があることを確認した。
実施例５：ｂｖＰＬＡ２のＭ１またはＭ２表現型マーカー及び脂肪生成因子調節効能
マクロファージの表現型の変化を定量的ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲを通じて分析した。

より具体的には、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－１２ａの発現を測定してｂｖＰＬＡ２のＭ１－関連マーカーに対する効能を確認した。
その結果、図５Ａで見られるように、ＮＤグループと比較してＨＦＤグループでＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－１２ａの発現が増加したが、ＨＦＤ＋ＰＬＡ２グループでは上記増加したＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－１２ａの発現がＮＤと同様の水準に抑制されることを確認した（図５Ａ）。

また、Ｍ２－関連マーカーであるＩＬ－４、ＣＤ２０６及びＹｍｌの発現を測定した。
その結果、図５Ｂで見られるように、ＮＤグループと比較してＨＦＤグループでＩＬ－４及びＣＤ２０６の発現が減少したが、ＨＦＤ＋ＰＬＡ２グループでは減少した発現が顕著に増加することを確認した（図５Ｂ）。

また、脂質蓄積及び脂肪生成と関連したマーカーであるＰＰＡＲ γ、Ｃ／ＥＢＰ α及びＵＣＰ－１の発現を測定した。
その結果、図５Ｃで見られるように、ＮＤグループと比較してＨＦＤグループでＰＰＡＲ γ及びＣ／ＥＢＰ αの発現が増加したことを確認したが、ＨＦＤ＋ＰＬＡ２グループでは上記増加が抑制されることを確認した。一方、ＵＣＰ－１はＮＤグループと比較してＨＦＤグループで発現が顕著に減少したが、ＨＦＤ＋ＰＬＡ２グループで顕著に増加したことを確認した。

これを通じて、ＨＦＤ条件でＭ１－関連マーカーが増加し、Ｍ２－関連マーカーが減少させ、脂肪生成関連マーカーの発現も変化することを確認したが、ｂｖＰＬＡ２はこのような変化を抑制させ、顕著に改善する効果があることを確認した。

実施例６：ハチ毒内メラチンとの比較
ハチ毒の成分中、優れた肥満抑制効能を有する成分を確認するために、ハチ毒に最も多く含まれたメリチンとハチ毒由来ＰＬＡ２であるｂｖＰＬＡ２を比較した。

より具体的には、ＮＤ及びＨＦＤグループのマウスに１６週間ＰＢＳ、メリチン及びｂｖＰＬＡ２をそれぞれ０．５ｍｇ／ｋｇずつ腹腔に投与した後、体重量の変化を毎日比較した。

その結果、図６で見られるように、メリチンを投与したＨＦＤグループではメリチンを投与していない対照群よりむしろ体重がさらに増加した一方、ＰＬＡ２を投与したＨＦＤグループは対照群に比べて体重が減少することを確認した。

これを通じて、ハチ毒の主要成分であるメリチンには肥満抑制効能がなく、ＰＬＡ２成分に肥満抑制効能があることを確認した。
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

Claims

ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む、肥満予防または治療用薬学的組成物。
上記ホスホリパーゼＡ２の肥満予防または治療は、前炎症性マクロファージの浸潤抑制によりなされるものである、請求項１に記載の組成物。
上記ホスホリパーゼＡ２の肥満予防または治療は、Ｍ１マクロファージの抑制またはＭ２マクロファージの増加によりなされるものである、請求項１に記載の組成物。
上記ホスホリパーゼＡ２の肥満予防または治療は、脂肪肝または腎臓損傷緩和によりなされるものである、請求項１に記載の組成物。
上記ホスホリパーゼＡ２の肥満予防または治療は、代謝機能障害緩和によりなされるものである、請求項１に記載の組成物。
上記薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むものである、請求項１に記載の組成物。
上記ホスホリパーゼＡ２は、ハチ毒に由来または遺伝子組換えにより生産されるものである、請求項１に記載の組成物。
上記ハチ毒は、西洋蜜蜂（Ａｐｉｓｍｅｌｌｉｆｅｒａ）に由来したものである、請求項１３に記載の組成物。
ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む、肥満予防または改善用健康機能食品組成物。
ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む、肥満予防または改善用飼料組成物。
ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、肥満予防または治療方法。
ホスホリパーゼＡ２を有効成分として含む組成物の肥満予防または治療における使用。