KR20200130115A - 포스포리파아제 a2를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 봉독의 주요 성분 중 하나인 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 비만 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물; 사료 조성물; 및 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만 예반 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 물질 봉독의 주요성분인 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 염증성 대식세포 감소 및 비만 예방 또는 치료용 조성물은, 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

Description

포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물{Composition of preventing or treating obesity comprising phospholipase A2}

본 발명은 봉독의 주요 성분 중 하나인 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 비만 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물; 사료 조성물; 및 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만 예반 또는 치료방법에 관한 것이다.

비만은 지방이 체내에 과잉 축적되는 증상으로 대표되며 주요 대사 질환 중 하나로 분류되며, 전 세계 국가들이 겪고 있는 심각한 건강문제로 오는 2025년에 이르면 3억 명 이상 될 것으로 예측되어 비만 약물 시장은 국내뿐만 아니라 전 세계적으로 크게 성장할 것으로 예상된다.

당뇨, 심장질환, 고혈압, 암 등을 복합적으로 일으키고 심한 경우 조기 사망에 이르게 되는 것으로 알려져 있다.

비만은 만성 염증으로도 분류되며 최근 연구에 의해 지방조직 내 축적되는 염증성 대식세포가 비만과 밀접하게 관련되어 있음이 밝혀졌다. 더 나아가, 비만 상태인 경우 지방 내 염증성과 항 염증성 대식세포가 불균형을 이루어 염증 환경을 조성하며, 염증성 대식세포의 침윤은 염증성 사이토카인인 TNF-a 혹은 인터루킨 6등의 분비를 증가시키기 때문에 비만의 증상을 더욱 악화시킬 수 있다.

따라서 염증성 환경의 완화와 대식세포의 균형이 비만 환자의 치료에 중요할 것으로 예상되나, 대식세포를 표적하는 비만 치료제는 현재까지 전무한 상태이다.

현재 비만의 치료법으로는 식사요법, 운동요법, 약물요법이 있으나 약물 요법의 경우 투여 기간이 길어짐에 따라 안정성과 부작용 문제가 대두되면서 새로운 비만 치료제의 개발이 요구되어졌다.

현재 국내에서는 orlistat과 lorcaserine만이 장기적으로 사용 가능하도록 허가되어 있으며 미국에서는 liraglutide, phentermine/topiramate, naltrexone/bupropion등 다양한 치료제가 개발 및 허가되었다. 그러나 대다수의 약물이 음식을 통해 섭취하는 지방의 흡수를 저해하는 방식으로 체중을 감량하도록 하기 때문에 근본적인 비만 치료 약물의 개발이 시급하다.

한편, 포스포리파아제 A2는 단백질 효소 중 하나로서 봉독 내 12% 함유되어 있는 포스포리파아제는 인지질을 가수분해하는 효소로서 레시티나아제라고도 한다. 상기 포스포리파아제 A2 성분은 세포막 구성 지질인 포스포리피드의 글리세린의 BDP 결합하는 지방산을 유리시켜 리조포스파티드로 만들기 때문에 세포조직의 파괴, 용혈작용 및 촉매 작용 등을 일으키는 것으로 알려져 있다. 포스포리파아제 A2의 이러한 작용을 활용하여 다양한 약학 조성물을 개발 할 수 있으며, 대한민국 공개 특허 제10-2015-0049438호에서 인플루엔자, 수포성 구내염 등과 같은 바이러스성 질환을 예방 및 치료할 수 있는 조성물을 제시하고 있다. 또한 대한민국 공개특허 제10-2012-0139313호에서 포스포리파아제를 유효성분으로 포함하는 프리온 질병 치료용 조성물을 제시하고 있으며 이는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 부작용을 나타내지 않고, 비만을 개선하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 봉독으로부터 유래된 포스포리파아제 A2가 비만에 대한 예방 또는 치료 효능을 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만 예반 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 “포스포리파아제 A2(Phospholipase A2; PLA2)”는 단백질 효소 중 하나로서 봉독 내 12% 함유되어 있는 포스포리파아제는 인지질을 가수분해하는 효소로서 레시티나아제라고도 한다. 포스포리파아제는 인지질을 분해하는 위치에 따라 A1, A2, B, C, D 로 분류된다.

상기 PLA2의 비만 개선용 효능에 대하여는 알려진 바 없으며, 본 발명자에 의해서 최초로 규명되었다.

보다 구체적으로, 상기 PLA2는 양봉꿀벌(Apis mellifera)의 봉독에서부터 유래한 것(bvPLA2) 또는 유전자 재조합에 의한 것(유전자 변형조작 포함)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 PLA2는 봉독의 주요성분은 멜리틴과 비교하여, 월등히 우수한 비만 억제 또는 치료 효능이 있음을 확인하였다.

또한, 상기 PLA2는 만노스 수용체에 작용하는 것일 수 있고, 지질 방울(lipid droplet) 축적을 감소시켜 간 지방증 또는 신장 손상 완화에 의해서 이루어질 수 있으며, 아미노 트랜스퍼라제, 알라닌 아미노 트랜스퍼라제, 혈액 우레아 질소, 크레아틴, 트리글리세리드(TG), 포도당(GLU), 고밀도 지방단백질(HDL-C), 또는 저밀도 지방단백질(LDL-C), 인슐린 및 렙틴(leptin) 감소에 의한 대사 기능 장애 완화에 의한 것 일수 있고, 전염증성 대식세포의 침윤 억제에 의해서 이루어지는 것일 수 있으며, M1 대식세포의 억제 또는 M2 대식세포의 증가를 통한 M1/M2 조절에 의한 것일 수 있고, 지질 축적 및 지방합성 저해를 통해서 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, “비만”은 체내에 지방이 과다한 상태를 의미하며, 구체적으로 신체비만지수(체질량지수, Body mass index: 체중(kg)을 신장(m)의 제곱으로 나눈 값)가 25 이상이면 비만으로 정의한다. 비만은 유전적, 환경적 요인 등 매우 복합적인 원인으로 유발될 수 있으나, 결과적으로 오랜 기간에 걸쳐 에너지 소비량에 비해 영양소를 과다 섭취할 경우 에너지 불균형에 의해 지방이 축적되어 유발된다. 비만이 될 경우, 당뇨병 및 고지혈증이 생길 가능성이 높아지고, 성기능장애, 관절염, 심혈관계 질환의 발병 위험이 커진다.

본 발명의 용어, “예방”은 본 발명에 따른 PLA2를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 비만을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명의 용어, “치료”는 본 발명의 상기 조성물을 비만 의심 개체에 투여하여 비만 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 PLA2를 마우스에 투여하여 지방 조직 및 체중 감소 효능을 확인하고(도 1), 만노스 수용체가 결여된 마우스를 통해 bvPLA2의 비만 억제 효능이 만노스 수용체에 의한 것임을 확인하였으며(도 2), H&E 염색을 통해 지질 방울 축적을 감소시켜 간 지방증 및 신장 손상 완화 효능이 있음을 확인하고, 각 그룹별 마우스의 혈청을 조사하여 대사 기능 장애 완화 효능이 있음을 확인하였으며(도 3), 조직 검사를 통해 대식세포의 침윤 억제 효능을 통한 비만 개선 효능이 있음을 확인하였고, M1/M2 대식세포 마커 분석을 통해 M1/M2 대식세포의 비율을 조절(도 4) 및 지방 생성 인자 발현을 조절(도 5)을 통해 비만 억제 또는 치료 효능이 있음을 확인하였으며, 봉독의 주요성분인 멜리틴 보다 우수한 비만 억제 효능을 확인하여(도 6) 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 약학 조성물은 단일제제로도 사용할 수 있고, 공인된 비만 치료 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한 되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 담체는 비자연적 담체 (non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.

또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 PLA2를 포함할 수 있다.

본 발명에서의 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 실시양태는 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는, 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 하나의 실시양태는 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는, 비만 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 “포스포리파아제 A2”, “비만”, 및 “예방”은 상기에서 서술한 바와 같다.

본 발명의 용어, “개선”은 PLA2를 유효성분으로 포함하는 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, 건강기능식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special 24-8 health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 비만의 예방 또는 개선에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 식품학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 PLA2를 포함하는 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 보조 식품류 등이 있다. 상기 식품 조성물에는 비만의 예방 또는 개선 효과에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다.

예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 식품보조첨가제는 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 그 종류가 제한되는 것은 아니다.

이때, 상기 식품에 포함되는 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다.

식품이 음료인 경우에는 100㎖를 기준으로 1 내지 30g, 바람직하게는 3 내지 20g의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.

본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 실시양태는 본 발명의 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 비만 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 비만 상태가 되었거나 될 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 비만 상태가 되었거나 될 가능성이 있는 개체에 상기 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 실시양태는 본 발명의 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 조성물의 비만 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명의 물질 봉독의 주요성분인 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 염증성 대식세포 감소 및 비만 예방 또는 치료용 조성물은, 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

도 1A는 실험 단계를 나타내는 모식도이다.
도 1B는 각 그룹별 마우스의 상태를 나타내는 사진이다.
도 1C는 각 그룹별 마우스의 체중량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 1D는 각 그룹별 마우스의 음식 섭취량을 나타내는 그래프이다.
도 1E는 각 그룹별 부고환 및 사타구니의 백색 지방 세포를 나타내는 사진이다.
도 1F는 각 그굽별 부고환 및 사타구니 백색 지방 세포의 무게 변화를 나타내는 사진이다.
도 2A는 각 그룹별 CD206이 결여된 마우스의 상태를 나타내는 사진이다.
도 2B는 각 그룹별 체중량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2C는 각 그룹별 부고환 및 사타구니의 백색 지방 세포를 나타내는 사진이다.
도 2D는 각 그룹별 부고환 및 사타구니 백색 지방 세포의 무게 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2E는 IgG를 추가로 처리한 각 그룹별 CD206이 결여된 마우스의 체중량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3A는 각 그룹별 마우스의 간을 나타내는 사진이다.
도 3B는 각 그룹별 마우스의 간 무게를 나타내는 사진이다.
도 3C는 각 그룹별 마우스 간의 H&E 염색 사진이다.
도 3D는 각 그룹별 마우스 간 내 지질 방울 축적을 나타내는 그래프이다.
도 3E는 각 그룹별 마우스 신장의 H&E 염색 사진이다.
도 3F는 각 그룹별 마우스의 신장 비대율을 나타내는 그래프이다.
도 3G는 각 그룹별 마우스 혈청 내 ALT, AST, BUN, Crea의 수치를 나타내는 그래프이다.
도 3H는 각 그룹별 마우스 혈청 내 TG, GLU, HDL-C, LDL-C의 수치를 나타내는 그래프이다.
도 3I는 각 그룹별 마우스 혈청 내 인슐린, 렙틴의 수치를 나타태는 그래프이다.
도 4A는 각 그룹별 지방 내 대식세포 침윤을 나타내는 사진이다.
도 4B는 각 그룹별 지방 내 대식세포 침윤을 나타내는 그래프이다.
도 5A는 정량 real-time PCR을 통한 각 그룹별 TNF-α, IL-1β, 및 IL-12a의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 5B는 정량 real-time PCR을 통한 각 그룹별 IL-4, CD206, 및 Ym1의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 5C는 정량 real-time PCR을 통한 각 그룹별 PPAR γ, C/EBP α, 및 UCP-1의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 6은 PLA2와 멜리틴을 각각 마우스에 투여하여 체중량 변화를 확인하는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: bvPLA2에 의한 항염증성 대식세포 증가

봉독 유래 포스포리파제 A2(bvPLA2, Apis mellifera), 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 덱사메타손 (Dexamethasone; DEX), 인슐린, 및 오일 레드 O(Oil red O)는 Sigma-aldrich (St.Louis,MO,USA)에서 구매하였다.

실험예 2: bvPLA2에 의한 염증 환경 완화

3T3-L1 지방전구세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하였으며, 10% 송아지 혈청(BCS)이 포함된 DMEM에서 배양하였고, 배양액은 2-3일마다 교체하였다. 이후, 상기 세포를 96웰 플레이트에 접종하고, 배지를 MDI 배지(IBMX 111 μg/mL, DEX 2μM, 및 인슐린 2 μg/mL이 포함된 DMEM)로 교체하여 지방 세포 분화를 유도하였다. 분화 배지는 2일마다 교체하였고, 분화 4일 후, 완전히 분화된 세포는 오일 레드 O 염색을 통해 분석하였다.

실험예 3: 오일 레드 O 염색

분화된 3T3-L1 세포는 PBS로 2회 세척한 뒤, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 버퍼에 20분간 고정하였다. 오일 레드 O(Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA)는 60% 이소프로판올(isopropanol)에 용해시킨 뒤, 세포에 20분간 실온에서 처리하여 염색하였다. 증류수로 2회 세척 한 후, 510 nm에서 OD값을 측정하였다.

실험예 4: 실험 동물

수컷 C57BL/6 마우스 (5주령; 무게 18-20 g) 및 CD206-/- 마우스(B6.129P2-MRC1tm1Mnz/J)는 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)에서 구입하였다. 1주일간 적응시킨 뒤, 15주간 정상식이 (ND; normal diet, 10 kcal%) 또는 고지방식이 (HFD; high-fat diet, 60 kcal%)를 공급하였다. 이후, 5주째부터 11주 동안, 마우스 복강 내로 PBS 또는 bvPLA2 (0.5 mg/kg)를 주사하였다.

실험예 5: T조절세포 결핍(Treg depletion)

항-마우스 CD25 (clone: PC61)는 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)에서 얻은 하이브리도마로부터 생산하여, 11주 동안, 3일마다 항-마우스 CD25 또는 랫트 IgG (Sigma-aldrich)를 마우스 복강 내로 주사하였다.

실험예 6: 정량(Quantitative) real-time PCR

전체 RNA는 백색 지방 세포 (white adipose tissue; WAT) 샘플에서 easy-BLUE RNA 추출 키트 (iNtRON Biotechnology, Korea)를 이용하여 분리하고, Cyclescript reverse transcriptase (Bioneer, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성 된 cDNA는 SensiFAST SYBR no-Rox kit (Bioline, Korea)와 함께 정량 real-time PCR(95 ℃ 15초, 55 ℃ 10초, 및 72 ℃ 10 초)을 수행하였으며, 이는 3번 반복하여 실험하였다. 실험의 프라이머 시퀀스는 하기와 같다.

GAPDH:

forward, 5’-CCCAGAAGACTGTGGATGG-3’ (서열번호 1)

reverse, 5’-CACATTGGGGGTAGGAACAC-3’ (서열번호 2)

TNF-α:

forward, 5’-TTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCC-3’ (서열번호 3)

reverse, 5’-GTATGAGATAGCAAATCGGCTGACGGTGTGGG-3’ (서열번호 4)

IL-1β:

forward, 5’-GGACAGAATATCAACCAACAAGTGATA-3’ (서열번호 5)

reverse, 5’-GTGTGCCGTCTTTCATTACACAG-3’ (서열번호 6)

IL-12a:

forward, 5’-GCTCTAGACCCTGTGCCTTG-3’ (서열번호 7)

reverse, 5’-GAAGGCTTACCTGCA TCAGC-3’ (서열번호 8)

IL-4:

forward, 5’-ACGAAGAACACCACAGAG-3’ (서열번호 9)

reverse, 5’-TGATGTGGACTTGGACTC-3’ (서열번호 10)

CD206

forward, 5’-AGTGGCAGGTGGCTTATG-3’ (서열번호 11)

reverse, 5’-GGTTCAGGAGTTGTTGTG-3’ (서열번호 12)

Ym1

forward, 5’-CATTCAGTCAGTTATCAGATTCC-3’ (서열번호 13)

reverse, 5’-AGTGAGTAGCAGCCTTGG-3’ (서열번호 14)

PPAR γ

forward, 5’-GAAGGCTGAAGTCACCAAGC-3’ (서열번호 15)

reverse, 5’-TCAGCCTTGCCAGAGTTTTT-3’ (서열번호 16)

C/EBP α

forward, 5’-TTACAACAGGCCAGGTTTCC-3’ (서열번호 17)

reverse, 5’-CTCTGGGATGGATCGATTGT-3’ (서열번호 18)

UCP-1

forward, 5’-TCTCAGCCGGCTTAATGACT-3’ (서열번호 19)

reverse, 5’-GCTGGGTGTATGTGCCTTTT-3’ (서열번호 20)

실험예 7: H&E 염색

간 및 신장 조직은 4% 파라포름알데히드에서 밤새 고정시킨 후, 탈수 및 파라핀으로 포매하여 4μm 두께로 절편화 하였다. 상기 절편은 자일렌으로 탈파라핀화한 뒤, 100%, 90%, 80%, 및 70% 에탄올로 다시 수화시켰다. 수화된 절편은 수돗물로 세척하고, 5분간 헤마톡실린(hematoxylin) 용액으로 염색하였다. 이후, 1% 산성 알코올(acid alcohol)에 침지시킨 후, 에오신 용액에 3분간 다시 염색하였다. 그 뒤, 마운팅 하기 위하여 70%, 80%, 90%, 및 100% 에탄올로 탈수시켜 자일렌을 제거하였다.

실험예 8: 통계 조사

실험 결과는 평균 및 표준 오차로 표시하며, 통계적 유의성은 prism 5 소프트웨어를 사용한 Newman-Keuls 테스트 및 one-way ANOVA를 통해 분석하였다.

실시예 1: bvPLA2의 지방조직 및 체중 감소 효능

HFD로 비만이 유도된 마우스의 지방 조직(adipose tissue) 및 체중 변화를 통해 bvPLA2의 비만 개선 효능을 평가하였다.

보다 구체적으로, C57BL/6 마우스에 15주 동안 ND 또는 HFD를 공급하였다. 4주간의 ND 또는 HFD 공급 후, 5주차부터 PLA2 또는 PBS를 주사하였다(도 1A). 이후, bvPLA2의 주사 유무에 따른 지방 조직 및 체중량을 측정하였다.

그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, HFD 그룹의 체중은 ND 그룹의 체중보다 높았으며, HFD + PLA2 그룹은 PLA2를 투여하지 않은 HFD 그룹보다 체중이 현저히 감소하였다(도 1B, C). 반면, 모든 그룹의 음식 섭취량의 변화는 나타나지 않았다(도 1D). 또한, 부고환(epididymal) WAT 및 사타구니(inguinal) WAT의 무게가 HFD 그룹에서 현저하게 증가한 반면, HFD + PLA2 그룹에서 크게 감소함을 확인하였다(도 1E, F).

이를 통해, bvPLA2를 투여는 음식 섭취에는 영향을 미치지 않으면서, 체중 및 지방 조직 중량을 상당히 감소시키는 것을 확인하여, 비만 개선 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 2: CD206- 결핍 및 T조절세포가 결핍된 마우스 체중 및 지방 조직 중량에 대한 bvPLA2 영향

bvPLA2의 면역 조절 효과를 확인하기 위하여, 만노스(mannose) 수용체가 결여된 CD206- 결핍 (CD206-/-) 마우스를 이용하였다.

보다 구체적으로, 상기 실험 방법(도 1A)과 동일한 방법으로 CD206-/- 마우스의 체중 및 지방 조직 중량을 측정하였다.

그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, HFD 및 HFD + PLA2 그룹간의 유의한 체중 변화 및 지방 조직 중량 변화는 나타나지 않았다(도 2A 내지 D).

또한, bvPLA2과 T조절세포와의 연관성을 확인하기 위하여, 항-마우스 CD25(clone PC61)를 3일마다 마우스에 주사하여 T조절세포를 결여시켰다. 또한, 대조군으로 랫트 IgG를 사용하였다.

그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, IgG만 투여한 비만-유도 마우스 그룹보다 IgG + PLA2 비만-유도 마우스 그룹에서 체중량의 현저한 감소가 일어나는 것을 확인하였다. 또한, PC61- 처리군에 비해 PC61 + PLA2 그룹에서도 현저한 체중 감소를 확인하였다(도 2E).

이를 통해, PLA2는 만노스 수용체 매개를 통해 비만 억제 효능이 나타나는 반면, IgG + PLA2 그룹 및 PC61 + PLA2 그룹간의 차이가 없음을 확인하여, PLA2의 비만 억제 효능은 PC61로 인해 매개된 T조절세포와는 연관이 없음을 확인하였다.

실시예 3: bvPLA2의 간 독성/ 신 독성 감소 효능

실시예 3-1: bvPLA2의 간 지방증 및 신장 손상 완화 효능

bvPLA2가 HFD로 인해 유도된 간 지방증 및 신장 염증을 완화시키는지 확인하기 위하여, 마우스로부터 얻은 간 및 신장 조직을 H&E로 염색하였다.

그 결과, 도 3A 내지 3D에서 볼 수 있듯이, ND 그룹과 비교하여 HFD 그룹에서 지질 방울(lipid droplet) 축적 및 간 비대(hepatomegaly)로 인한 간 무게 및 크기 증가가 관측되었다. 반면, bvPLA2를 처리한 HFD 그룹에서는 상기 증가가 억제되었으며, ND + PLA2 그룹에서는 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.

또한, 신장 손상에 의한 당뇨병성 신장병증의 초기 증상을 나타내는 사구체의 직경을 확인하였다.

그 결과, 도 3E 내지 3F에서 볼 수 있듯이, HFD 그룹에서 지질 축적으로 인한 신장비대가 발견되었으나, ND, ND + PLA2, 및 HFD + PLA2 그룹에서는 신장비대(사구체 직경 증가)가 발견되지 않았다(도 3E, F).

이를 통해, bvPLA2가 지질 방울 축적을 감소시켜 간 지방증 및 신장 손상을 완화하는 것을 확인하였다.

실시예 3-2. bvPLA2의 대사 기능 장애 완화 효능

간 및 신장의 기능에 대한 bvPLA2의 효능을 확인하였다.

보다 구체적으로, 아미노 트랜스퍼라제(AST), 알라닌 아미노 트랜스퍼라제(ALT), 혈액 우레아 질소(BUN), 및 크레아틴(Crea)의 각 그룹별 혈청 수치를 확인하였다.

그 결과, 도 3G에서 볼 수 있듯이, ND 그룹과 비교하여 HFD 투여 그룹의 AST, ALT 및 Crea 수준이 증가하였다. 반면, bvPLA2를 처리한 HFD 그룹에서는 증가된 AST, ALT 및 Crea 수준이 감소된 것을 확인하였다.

또한, bvPLA2에 의한 대사증후군에 미치는 효능을 확인하기 위하여, 각 그룹별 트리글리세리드(TG), 포도당(GLU), 고밀도 지방단백질(HDL-C), 및 저밀도 지방단백질(LDL-C) 수준을 분석하였다.

그 결과, 도 3H에서 볼 수 있듯이, ND 그룹과 비교하여 HFD 그룹에서 TG, GLU, HDL-C, 및 LDL-C 수치가 현저히 높았다. 반면, HFD + PLA2 그룹에서는 상기 증가된 수치가 현저히 낮아지는 것을 확인하였다.

또한, 각 그룹별 혈장 인슐린 및 렙틴(leptin) 수치를 분석하였다.

그 결과, 도 3I에서 볼 수 있듯이, ND 그룹과 비교하여 HFD 그룹에서 혈장 인슐린 및 렙틴(leptin) 수치가 증가하였으며, HFD + PLA2 그룹에서 상기 증가된 수치가 현저히 낮아지는 것을 확인하였다(도 3I).

이를 통해, bvPLA2가 HFD로 인해 유도된 대사 기능 장애를 완화시키는 것을 확인하였다.

실시예 4: bvPLA2의 지방 조직 내 대식세포 침윤 억제 효능

비만은 AT28 내 죽은 지방세포에 둘러싸인 전염증성 대식세포에 의해 형성된 크라운 유사 구조(CLS; crown like structure)의 지방화를 특징으로 하기에, bvPLA2가 상기 대식세포의 WAT 내 침윤을 억제하는지 확인하기 위하여, H&E 조직학적 검사를 실시하였다.

그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, ND 그룹에서는 WAT에서 전염증성 대식세포의 침윤이 거의 발견되지 않았으나, HFD 그룹에서는 CLS 형성이 현저하게 증가하였다. 반면, bvPLA2를 처리한 HFD + PLA2 그룹의 AT에서는 대식세포 침윤 및 CLS 형성이 감소된 것을 확인하였다.

이를 통해, bvPLA2는 비만의 원인이 되는 전염증성 대식세포의 침윤을 억제하여, 비만 완화 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 5: bvPLA2의 M1 또는 M2 표현형 마커 및 지방 생성 인자 조절 효능

대식세포의 표현형의 변화를 정량적 real-time PCR을 통해 분석하였다.

보다 구체적으로, TNF-α, IL-1β, 및 IL-12a의 발현을 측정하여 bvPLA2의 M1-관련 마커에 대한 효능을 확인하였다.

그 결과, 도 5A에서 볼 수 있듯이, ND 그룹과 비교하여 HFD 그룹에서 TNF-α, IL-1β, 및 IL-12a의 발현이 증가하였으나, HFD + PLA2 그룹에서는 상기 증가한 TNF-α, IL-1β, 및 IL-12a의 발현이 ND와 비슷한 수준으로 억제되는 것을 확인하였다(도 5A).

또한, M2-관련 마커인 IL-4, CD206, 및 Ym1의 발현을 측정하였다.

그 결과, 도 5B에서 볼 수 있듯이, ND 그룹과 비교하여 HFD 그룹에서 IL-4, 및 CD206의 발현이 감소하였으나, HFD + PLA2 그룹에서는 감소된 발현이 현저하게 증가되는 것을 확인하였다(도 5B).

또한, 지질 축적 및 지방 생성과 관련된 마커인 PPAR γ, C/EBP α, 및 UCP-1의 발현을 측정하였다.

그 결과, 도 5C에서 볼 수 있듯이, ND 그룹과 비교하여 HFD 그룹에서 PPAR γ, 및 C/EBP α의 발현이 증가한 것을 확인하였으나, HFD + PLA2 그룹에서는 상기 증가가 억제되는 것을 확인하였다. 반면, UCP-1는 ND 그룹과 비교하여 HFD 그룹에서 발현이 현저하게 감소하였으나, HFD + PLA2 그룹에서 현저히 증가한 것을 확인하였다.

이를 통해, HFD 조건에서 M1-관련 마커가 증가되고, M2-관련 마커가 감소시켰으며, 지방 생성 관련 마커의 발현도 변화하는 것을 확인하였으나, bvPLA2는 이러한 변화를 억제시키고 현저히 개선하는 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 6: 봉독 내 멜라틴과의 비교

봉독의 성분 중 우수한 비만 억제 효능을 지니는 성분을 확인하기 위하여, 봉독에 가장 많이 함유된 멜리틴과 봉독 유래 PLA2인 bvPLA2를 비교하였다.

보다 구체적으로, ND 및 HFD 그룹의 마우스에게 16주간 PBS, 멜리틴, 및 bvPLA2를 각각 0.5mg/kg씩 복강으로 투여한 뒤, 체중량의 변화를 매일 비교하였다.

그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이, 멜리틴을 투여한 HFD 그룹에서는 멜리틴을 투여하지 않은 대조군보다 오히려 체중이 더 증가한 반면, PLA2를 투여한 HFD 그룹은 대조군에 비해 체중이 감소하는 것을 확인하였다.

이를 통해, 봉독의 주요 성분인 멜리틴에는 비만 억제 효능이 없으며, PLA2 성분에 비만 억제 효능이 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Composition of preventing or treating obesity comprising phospholipase A2 <130> KPA190587-KR-P1 <150> KR 10-2019-0053866 <151> 2019-05-08 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 1 cccagaagac tgtggatgg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 2 cacattgggg gtaggaacac 20 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha forward primer <400> 3 ttctgtctac tgaacttcgg ggtgatcggt cc 32 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha reverse primer <400> 4 gtatgagata gcaaatcggc tgacggtgtg gg 32 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta forward primer <400> 5 ggacagaata tcaaccaaca agtgata 27 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1 beta reverse primer <400> 6 gtgtgccgtc tttcattaca cag 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12a forward primer <400> 7 gctctagacc ctgtgccttg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12a reverse primer <400> 8 gaaggcttac ctgcatcagc 20 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 forward primer <400> 9 acgaagaaca ccacagag 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 reverse primer <400> 10 tgatgtggac ttggactc 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD206 forward primer <400> 11 agtggcaggt ggcttatg 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD206 reverse primer <400> 12 ggttcaggag ttgttgtg 18 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ym1 forward primer <400> 13 cattcagtca gttatcagat tcc 23 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ym1 reverse primer <400> 14 agtgagtagc agccttgg 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma forward primer <400> 15 gaaggctgaa gtcaccaagc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR gamma reverse primer <400> 16 tcagccttgc cagagttttt 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBP alpha forward primer <400> 17 ttacaacagg ccaggtttcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C/EBP alpha reverse primer <400> 18 ctctgggatg gatcgattgt 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP-1 forward primer <400> 19 tctcagccgg cttaatgact 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP-1 reverse primer <400> 20 gctgggtgta tgtgcctttt 20

Claims (11)

1. 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는, 비만 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 포스포리파아제 A2의 비만 예방 또는 치료는 전염증성 대식세포의 침윤 억제에 의해서 이루어지는 것인, 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 포스포리파아제 A2의 비만 예방 또는 치료는 M1 대식세포의 억제 또는 M2 대식세포의 증가에 의해서 이루어지는 것인, 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 포스포리파아제 A2의 비만 예방 또는 치료는 간 지방증 또는 신장 손상 완화에 의해서 이루어지는 것인, 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 포스포리파아제 A2의 비만 예방 또는 치료는 대사 기능 장애 완화에 의해서 이루어지는 것인, 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 포스포리파아제 A2는 봉독으로부터 유래 또는 유전자 재조합에 의하여 생산된 것인, 조성물.
8. 제13항에 있어서, 상기 봉독은 양봉 꿀벌(Apis mellifera)로부터 유래된 것인, 조성물.
9. 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는, 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
10. 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는, 비만 예방 또는 개선용 사료 조성물.
11. 포스포리파아제 A2를 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비만 예방 또는 치료방법.
    

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