JP2022512543A - 泡沫安定性 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＡｃＨＦＡ量が低減されたビールを対象にする。ＡｃＨＦＡ量が低減されたビールは、改善された泡沫安定性を有することが見出された。本発明は、ＡｃＨＦＡ量が低減されたビール、および発酵中もしくは後にＡｃＨＦＡをビールから除去するまたはＡｃＨＦＡの前駆体を麦汁から除去する方法を提供する。
Description
本発明は、泡沫安定性が改善されたビール、およびビールの泡沫安定性を改善する方法を対象とする。
ビールは、世界中で最も人気のあるアルコール飲料の１つである。ビールは、糖をエタノール（「アルコール」）に変換する酵母を使用して、穀類に由来する糖含有水性マトリックスの発酵によって調製される。ビールの生成プロセスは一般的に知られており、当業者は、共通一般知識（例えば、Ｔｈｅ Ｂｒｅｗｅｒｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ （第２版） ｏｆ Ｔｅｄ Ｇｏｌｄａｍｍｅｒ （２００８、Ａｐｅｘ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社）を参照のこと）および本明細書に開示されている情報に基づいてビールを得ることができる。
ビールは、通常は大麦などの穀物から作製されるが、小麦またはモロコシを含むがこれらに限定されない他の穀物のタイプも使用することができる。ビールは、通常は次の基本的ステップ含むプロセスによって生成される：穀類と水の混合物をマッシングして、マッシュを生成するステップ；マッシュを麦汁とビール粕に分離するステップ；麦汁を煮沸して、煮沸した麦汁を生成するステップ；煮沸した麦汁を生酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）で発酵させて、発酵した麦汁を生成するステップ；発酵した麦汁を１つまたは複数の別のプロセスステップ（例えば、成熟および濾過）にかけて、ビールを生成するステップ；およびビールを密封容器、例えば瓶、缶または樽にパッケージングするステップ。
大麦モルトビールを生成する例示的なプロセスにおいて、大麦を製麦する。それは、大麦を発芽させ、続いて乾燥（「焙燥」）して、モルトを生成することを意味する。このプロセスは、味および色化合物の形成、ならびに別のフレーバー発生およびデンプン分解にとって重要である酵素の形成にとって重要である。続いて、モルトを製粉し、水に懸濁する（「マッシング」）。マッシュを加熱して、デンプン分解を促進する。続いて、濾過により、麦汁が得られ、麦汁は発酵性糖のほぼ清澄な水性溶液であり、様々なフレーバーおよびアロマならびに他の多くの化合物も含有する。麦汁中に、望ましいフレーバー化合物と望ましくないフレーバー化合物が両方存在する。
麦汁を煮沸して、滅菌し、タンパク質を沈殿させ、濃縮する。場合によって、ホップを添加し、苦味およびフレーバーを加える。この混合物を、沈殿物の除去後に発酵にかける。発酵によって、発酵性糖をエタノールおよび二酸化炭素中に変換し、様々な新規フレーバー化合物も形成する。同時に、発酵に使用される酵母は、多くの別の化学変換をもたらす。外観および味を最適化するために、発酵後にビールを濾過および／または貯蔵することができる。
ビールの重要な側面は、ビールのヘッドである。ヘッドは、ビールの上にある泡沫層である。この泡沫は、発酵および／または発酵後の添加によってビール中に存在するが、ビール容器（例えば、缶または瓶）中の高圧の結果としてビールに本質的に溶解している二酸化炭素に由来する。ビールを容器から例えばグラスに放出することにより、二酸化炭素気泡の形成が起こり、その気泡がビール液体を通ってグラスの上部に上昇して、泡沫を形成する。
ビールの泡沫の顕著な特徴は、その安定性である。他の起泡性酵母発酵飲料（例えば、シャンパン）とは対照的に、ビールの泡沫は安定している。これは、（とりわけ）ビール中のタンパク質および異性化されたホップ酸によって引き起こされ、それらは、二酸化炭素気泡が形成するときおよびビールを通って上昇するとき、気泡と液体の界面の位置につく。液体の上部に到達すると、これらの成分がビールの泡沫気泡を安定化する。その結果、泡沫層は、長期間無変化のままである。無変化で安定な泡沫層は、楽しめるビールの重要な側面とみなされる。
しかし、泡沫安定化は、期間が限定されている。注いだ後、数分のうちに、泡沫層はより薄くなり、最終的に泡沫は全く残らない。このプロセスが、消費者がビールを消費しようとするより速く発生するということが起こりうる。これは、ビールが、消え行く泡沫層のために経時的に楽しめるものでなくなるということを意味する。ゆっくりと飲む人にとっては、ビールを飲み終える前であるのに泡沫が消失してしまう可能性がある。
本発明は、改善された泡沫安定性を有するビール、およびビールの泡沫安定性を改善する方法を提供する。
本発明は、ＡｃＨＦＡ量が低減されたビールを対象にする。ＡｃＨＦＡ量が低減されたビールは、改善された泡沫安定性を有することが見出された。本発明は、ＡｃＨＦＡ量が低減されたビール、および発酵中もしくは後にＡｃＨＦＡをビールから除去するまたはＡｃＨＦＡの前駆体を麦汁から除去する方法を提供する。
本発明は、２ｍｇ／ｌ未満のＡｃＨＦＡを含むビールであって、ＡｃＨＦＡが、カルボン酸基およびＣ１１～Ｃ２１直鎖状アルキル基を含むＣ１２～Ｃ２２脂肪酸であり、前記アルキル基が、部分不飽和であってもよく、かつ少なくとも１つのヒドロキシ基および少なくとも１つのアセテート基で置換されている、ビールを提供する。好ましくは、ビールは、１．５ｍｇ／ｌ未満、好ましくは１．０ｍｇ／ｌ未満、より好ましくは０．５ｍｇ／ｌ未満、さらにより好ましくは０．２５ｍｇ／ｌ未満、さらにより好ましくは０．１ｍｇ／ｌ未満のＡｃＨＦＡを含む。したがって、本発明は、９ｍｇ／ｌ未満、８ｍｇ／ｌ未満、７ｍｇ／ｌ未満、６ｍｇ／ｌ未満、５ｍｇ／ｌ未満、４ｍｇ／ｌ未満、または３ｍｇ／ｌ未満など、確実に１０ｍｇ／ｌ未満のＡｃＨＦＡを含むビールに関する。
現在、ＡｃＨＦＡは、酵母による麦汁の通常の発酵時にアセチルトランスフェラーゼ酵素（ＡＴＦ）の作用によって形成することが見出されている。ＡｃＨＦＡは、発酵により得られたビール中に、少なくとも２ｍｇ／ｌ、時には少なくとも３ｍｇ／ｌ、またはさらに少なくとも４ｍｇ／ｌ、または少なくとも５ｍｇ／ｌ、または少なくとも６ｍｇ／ｌ、または少なくとも７ｍｇ／ｌ、または少なくとも８ｍｇ／ｌ、または少なくとも９ｍｇ／ｌ、または少なくとも１０ｍｇ／ｌのレベルで通常存在することが見出されている。したがって、ＡｃＨＦＡは、発酵により得られたビール中に、１ｍｇ／ｌより高い、確実に０．５ｍｇ／ｌより高い、最も確実に０．２５ｍｇ／ｌより高い量で存在することができる。本発明者らは、ＡｃＨＦＡが泡沫に対する負の因子であり、泡沫安定性にマイナスの効果を及ぼすもつのであることを見出した。発酵プロセスを最終ビール中のＡｃＨＦＡの量が低下するように改変することによって、泡沫安定性を少なくとも１０％、最大４０％、増大させることができる。
ＡｃＨＦＡ（「アセチル化ヒドロキシ脂肪酸」）は、カルボン酸基およびＣ１１～Ｃ２１直鎖状アルキル基を含むＣ１２～Ｃ２２脂肪酸であり、前記アルキル基は、部分不飽和であってもよく、かつ少なくとも１つのヒドロキシ基および少なくとも１つのアセテート基で置換されている。アセテート基（Ｈ３ＣＣＯ２－）は、（当技術分野においてよく見られるように）－ＯＡｃと略される。
ＡｃＨＦＡは、構造１と定義することができる
［構造１において、ｎ＝４～９の整数であり、
、Ａ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤはそれぞれ同じでも異なってもよく、
ａ）
は単結合であり、その場合、
ＡおよびＢの一方はＨ、ＯＨまたはＯＡｃであり、ＡおよびＢの他方はＨであり、
ＣおよびＤの一方はＨ、ＯＨまたはＯＡｃであり、ＣおよびＤの他方はＨであるか；あるいは
ｂ）
は二重結合であり、その場合、
ＡおよびＢの一方はＨであり、ＡおよびＢの他方は存在せず（これは、ＡおよびＢの他方は存在しないものであることを意味する）、ＣおよびＤの一方はＨであり、ＣおよびＤの他方は存在せず（これは、ＡおよびＢの他方は存在しないものであることを意味する）；
ただし、構造１において、すべてのＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄのうちの少なくとも１つはＯＨであり、すべてのＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄのうちの少なくとも１つはＯＡｃであることを条件とする］。
［構造１において、ｎ＝４～９の整数であり、
、Ａ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤはそれぞれ同じでも異なってもよく、
ａ）
は単結合であり、その場合、
ＡおよびＢの一方はＨ、ＯＨまたはＯＡｃであり、ＡおよびＢの他方はＨであり、
ＣおよびＤの一方はＨ、ＯＨまたはＯＡｃであり、ＣおよびＤの他方はＨであるか；あるいは
ｂ）
は二重結合であり、その場合、
ＡおよびＢの一方はＨであり、ＡおよびＢの他方は存在せず（これは、ＡおよびＢの他方は存在しないものであることを意味する）、ＣおよびＤの一方はＨであり、ＣおよびＤの他方は存在せず（これは、ＡおよびＢの他方は存在しないものであることを意味する）；
ただし、構造１において、すべてのＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄのうちの少なくとも１つはＯＨであり、すべてのＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄのうちの少なくとも１つはＯＡｃであることを条件とする］。
一般に知られているように、二重結合は、シスまたはトランス立体配置をとることができるが、立体配置はシスであることが好ましい。さらに、有機酸によく見られるように、酸基は、中性の形態（－ＣＯ２Ｈとして表される）をとることができるが、イオンの形態（－ＣＯ２
－）、または塩の形態（（－ＣＯ２）ｘＭ、ここで、Ｍは、いずれかの金属イオン、好ましくは例えばＮａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｃｕ、ＺｎまたはＭｎのイオンなどビールにおいて有効な金属イオンであってもよく、Ｍが１価（ＮａまたはＫ）である場合ｘ＝１であり、より高次の原子価イオンの場合ｘは１、２または３であってもよい）もとり得る。ＯＨまたはＯＡｃを有する炭素原子は独立して、ＲまたはＳ立体配置を有することができるが、好ましくは、ＯＨおよびＯＡｃ基を有する隣接する炭素原子は、両方ともＲ立体配置を有し、または両方ともＳ立体配置を有する（ＲＲおよびＳＳ）。あるいは、ＯＨおよびＯＡｃ基を有する隣接する炭素原子の一方の炭素原子は、Ｓ立体配置を有し、隣接する２個の炭素原子の他方の炭素は、Ｒ立体配置を有する（ＲＳまたはＳＲ）。
好ましくは、ＡｃＨＦＡは、場合によって複数のヒドロキシおよび／またはアセテート基のうち、隣接する炭素原子上に位置する１つのヒドロキシ基および１つのアセテート基を含む。さらに好ましくは、ＡｃＨＦＡは、Ｃ１６～Ｃ２０脂肪酸（構造１中、ｎ＝６～８）、最も好ましくはＣ１８脂肪酸（構造１中、ｎ＝７）である。ＡｃＨＦＡが１または２つの二重結合、好ましくは１つの二重結合を含む場合、はるかに好ましい。二重結合は、好ましくはカルボン酸基から数えて６番目、９番目、１２番目または１５番目の炭素原子上に位置する。最も好ましくは、二重結合は、９番目の炭素原子上に位置する。
はるかに好ましい実施形態において、ＡｃＨＦＡは、構造２によって表される
［構造２中、
ｎ＝１、２、または３、好ましくは２または３、最も好ましくは３であり、
ｍ＝１または２、好ましくは２であり、
ＡおよびＢの一方はＯＨであり、ＡおよびＢの他方はＯＡｃである］。
［構造２中、
ｎ＝１、２、または３、好ましくは２または３、最も好ましくは３であり、
ｍ＝１または２、好ましくは２であり、
ＡおよびＢの一方はＯＨであり、ＡおよびＢの他方はＯＡｃである］。
構造２についても、二重結合は、シスまたはトランス立体配置（炭素－炭素二重結合から伸びる炭素－炭素単結合の向きはいかなる方向であってもよいことを示すライン形式
によって示される）をとることができるが、立体配置はシスであることが好ましい。構造２中の酸基は、描かれたように中性の形態をとることができるが、以上に定義したようにイオンの形態または塩の形態もとることができる。
によって示される）をとることができるが、立体配置はシスであることが好ましい。構造２中の酸基は、描かれたように中性の形態をとることができるが、以上に定義したようにイオンの形態または塩の形態もとることができる。
はるかに好ましい実施形態において、ＡｃＨＦＡは、構造３によって表される
［構造３中、ＡおよびＢの一方はＯＨであり、ＡおよびＢの他方はＯＡｃである］。これらの実施形態において、ＡｃＨＦＡは、（シスまたはトランス；ＲＲ、ＳＳ、ＲＳまたはＳＲ）１２－アセトキシ－１３－ヒドロキシオクタデカ－９－エン酸（３ａ）、または（シスまたはトランス；ＲＲ、ＳＳ、ＲＳまたはＳＲ）１３－アセトキシ－１２－ヒドロキシオクタデカ－９－エン酸（３ｂ）である。
［構造３中、ＡおよびＢの一方はＯＨであり、ＡおよびＢの他方はＯＡｃである］。これらの実施形態において、ＡｃＨＦＡは、（シスまたはトランス；ＲＲ、ＳＳ、ＲＳまたはＳＲ）１２－アセトキシ－１３－ヒドロキシオクタデカ－９－エン酸（３ａ）、または（シスまたはトランス；ＲＲ、ＳＳ、ＲＳまたはＳＲ）１３－アセトキシ－１２－ヒドロキシオクタデカ－９－エン酸（３ｂ）である。
ＡｃＨＦＡは、酵母酵素のアセチルトランスフェラーゼ（ＡＴＦ）による発酵時に形成されるので、ビール中で自然発生することが見出された。
ＡｃＨＦＡ前駆体は、例えば以上に定義した構造１～３などのジヒドロキシ脂肪酸であり、ＡｃＨＦＡ中のＯＡｃ－基が存在する各位置にＯＨ－基を有する。酵母ＡＴＦ酵素は、（少なくとも）１つのＯＨ－基をアセチル化して、ＡｃＨＦＡ前駆体をＡｃＨＦＡに変換する。
さらに、同様のレギュラービールに比べてＡｃＨＦＡ含有量が低減されたビールは、改善された起泡性を有することが見出された。特に、ＡｃＨＦＡ量の低減により、ビールの泡沫安定性が増大する。
本明細書において、ビールの泡沫安定性は、ＮＩＢＥＭ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって定められた基準に基づいて測定され、秒（［ｓ］）単位で表される。したがって、ビールの泡沫安定性は、泡沫層が基準検査条件下で安定な時間を秒単位で表示する。
ＮＩＢＥＭ方法は一般に知られており、分析９．４２．１のＥＢＣ方法として見つけることができる。検査は、２０℃、大気圧下で行われる。泡沫安定性は、（泡沫が注がれる期間を含めて）基準条件下において泡沫を調製したときから泡沫層の高さが３ｃｍ減少するまでの経過時間として測定される。
ビールは、いかなるタイプのビールを指してもよく、エール、ポーター、スタウト、ラガーおよびボックビールが挙げられるが、これらに限定されない。ビールは、好ましくはモルトベースのビールであり、すなわち、モルトから調製された麦汁の発酵により調製されるビールである。好ましくは、ビールはラガービールであり、これは下面発酵酵母を使用して７～１５℃で発酵させ、その後低温で貯蔵による熟成を行うことによって得られるビールである。ラガービールとしては、例えばピルスナーが挙げられる。最も好ましくは、本明細書に記載されるビールはピルスナーである。ピルスナーは、ペールラガービールである。
本明細書において、ビールは広義の意味で理解されるものとし、レギュラー（アルコール含有）ビールも低またはゼロアルコール（「ＮＡ」）ビールも含む。したがって、本明細書におけるビールは、好ましくはエタノール含有量が０～１５体積％（「ＡＢＶ」）、好ましくは１～１５体積％であるビールである。ビールは、ホップを強化してもよく（「ホップを加えたビール」）、またはホップを加えていない可能性がある（「ホップを加えていないビール」）。ホップを加えたビールとしては、ρ－ホップなどの改変ホップを使用して調製されたビールが挙げられる。
好ましい一実施形態において、ビールはレギュラービールである。この文脈では、「レギュラービール」は、１体積％より高いエタノールを生じる発酵プロセスを使用して得られる通常の醸造ビールである。したがって、本明細書に定義されるレギュラービールは、エタノール含有量が１体積％より高く、好ましくは１５体積％未満である。レギュラービールのエタノール含有量は、好ましくは２～１５体積％、より好ましくは２．５～１２体積％、より好ましくは３．５～９体積％である。レギュラービールは、好ましくは上記のラガービールであり、最も好ましくはピルスナーである。当業者は、レギュラービール、そのうちレギュラーラガービールおよびピルスナーを例えばＴｈｅ Ｂｒｅｗｅｒｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ （第２版） ｏｆ Ｔｅｄ Ｇｏｌｄａｍｍｅｒ（２００８、Ａｐｅｘ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社）に記載されている方法または本明細書に開示されている方法によって得ることができる。あるいは、レギュラービールを商業的に得ることができる。
別の好ましい実施形態において、ビールは、ゼロまたは低アルコールビール（「ＮＡビール」）である。本文において、「ゼロまたは低アルコールビール」は、エタノール含有量が１．０体積％（「ＡＢＶ」）以下、好ましくは０．５体積％以下、より好ましくは０．２体積％以下であるビールである。したがって、ＮＡビールは、エタノール含有量が０～１．０体積％、好ましくは０～０．５体積％などであるビールである。
ＮＡビールは、例えばレギュラービールの脱アルコール（「脱アルコールビール」）、または麦汁の制限エタノール発酵（「制限発酵ビール」）によって得ることができる。
本明細書に定義されるＮＡビールを得る一つの方法は、通常の醸造ビールを例えば精留ステップ、逆浸透ステップ、透析ステップまたは凍結濃縮ステップなどの脱アルコールステップにかけて、エタノールを発酵ビールから除去することである。これらの技法は、例えばＢｒａｎｙｉｋら、Ｊ． Ｆｏｏｄ． Ｅｎｇ． １０８ （２０１２） ４９３－５０６、またはＭａｎｇｉｎｄａａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７１ （２０１８） ３６－４５に記載されている。
ＮＡビールを得る別の方法は、ビールを制限発酵プロセスによって作製し、制限発酵ビールを得ることである。制限発酵ビールは、本明細書に定義されるＮＡビールの別のタイプである。
制限発酵ビールは、麦汁の制限エタノール発酵によって得られた発酵ビールと定義される。麦汁の制限エタノール発酵は、正味のエタノール形成がそれほどされない発酵であり、すなわち、本明細書に定義される制限発酵は、１体積％以下、好ましくは０．５体積％以下、より好ましくは０．２体積％以下のエタノールを生じる。したがって、制限発酵ビールは、エタノール含有量が１．０体積％以下、好ましくは０．５体積％以下、より好ましくは０．２体積％以下である。
麦汁の制限発酵は、発酵から直接に得られた産物のエタノール含有量が１．０体積％以下、好ましくは０．５体積％以下、より好ましくは０．２体積％以下であるプロセスである。当業者は、正味のエタノール形成が著しくない様々な制限発酵技法を認識している。例としては、下記を特徴とする麦汁の制限エタノール発酵である。
・７℃未満、好ましくは－１～４℃、例えば－０．５～２．５℃の温度で、好ましくは８～７２時間、より好ましくは１２～４８時間（「低温接触発酵ビール」）；および／または
・短い（例えば、２時間未満）発酵時間、その発酵が温度不活性化、例えば－０．５～１℃への急速冷却、場合によってその後引き続いて殺菌によって急速に止まる（「停止発酵ビール」）；および／または
・適用された発酵条件下で低量のエタノールを産生する酵母株、例えば麦汁において発酵性糖１グラム当たりエタノール０．２ｇ未満、好ましくは発酵性糖１グラム当たりエタノール０．１ｇ未満を産生する酵母株、による発酵。好適な株（例えば、クラブトリー陰性株）は、当技術分野において既知であり、変動する発酵条件下で産生されるエタノールの量は、ルーチンの実験により決定することができる（「酵母制限ビール」）；および／または
・第１のエタノール産生酵母株を使用し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉなどエタノールを消費する第２の酵母株が、第１の酵母株によって産生されるエタノールの実質的にすべてを消費するのに十分な量で存在する下での発酵；および／または
・発酵性糖の含有量がその発酵完了後に最大１．０体積％のアルコールを産生するような麦汁。この場合、麦汁は、一般に発酵性糖の含有量が１７．５ｇ／ｌ未満、好ましくは１２ｇ／ｌ未満、より好ましくは８ｇ／ｌ未満である（「糖不足麦汁ビール」）。
・７℃未満、好ましくは－１～４℃、例えば－０．５～２．５℃の温度で、好ましくは８～７２時間、より好ましくは１２～４８時間（「低温接触発酵ビール」）；および／または
・短い（例えば、２時間未満）発酵時間、その発酵が温度不活性化、例えば－０．５～１℃への急速冷却、場合によってその後引き続いて殺菌によって急速に止まる（「停止発酵ビール」）；および／または
・適用された発酵条件下で低量のエタノールを産生する酵母株、例えば麦汁において発酵性糖１グラム当たりエタノール０．２ｇ未満、好ましくは発酵性糖１グラム当たりエタノール０．１ｇ未満を産生する酵母株、による発酵。好適な株（例えば、クラブトリー陰性株）は、当技術分野において既知であり、変動する発酵条件下で産生されるエタノールの量は、ルーチンの実験により決定することができる（「酵母制限ビール」）；および／または
・第１のエタノール産生酵母株を使用し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉなどエタノールを消費する第２の酵母株が、第１の酵母株によって産生されるエタノールの実質的にすべてを消費するのに十分な量で存在する下での発酵；および／または
・発酵性糖の含有量がその発酵完了後に最大１．０体積％のアルコールを産生するような麦汁。この場合、麦汁は、一般に発酵性糖の含有量が１７．５ｇ／ｌ未満、好ましくは１２ｇ／ｌ未満、より好ましくは８ｇ／ｌ未満である（「糖不足麦汁ビール」）。
制限発酵ビールは、１．０体積％以下、好ましくは０．５体積％以下、より好ましくは０．２体積％以下の前記エタノール含有量を達成するための脱アルコールステップにはかけられていない。当業者は、発酵ビールの脱アルコールに適した様々な技法を知っているが（ＢｒａｎｙｉｋらおよびＭａｎｇｉｎｄａａｎらについて、上記を参照のこと）、これらの技法は前記エタノール含有量を達成するために適用されていない。しかし、本明細書において制限発酵ビールに対して任意で脱アルコールステップを行い、発酵から得られるエタノール含有量を前記１．０体積％以下、好ましくは０．５体積％以下、より好ましくは０．２体積％以下からさらに低減されたエタノール含有量に低減することができる。しかし、好ましくは本明細書に定義される制限発酵ビールに対しては脱アルコールステップを全く行わない。
本明細書における制限発酵ビールは、好ましくは糖不足麦汁ビール、酵母制限ビール、停止発酵ビール、または低温接触発酵ビールである。本明細書において制限発酵ビールは、好ましくは低温接触発酵ビールである。
はるかに好ましい実施形態において、本明細書におけるビールは、レギュラービール、制限発酵ビール、またはこれら２つのタイプのビールの混合物、好ましくはレギュラービール、低温接触発酵ビール、またはこれら２つのタイプのビールの混合物である。最も好ましくは、本明細書におけるビールは、以上に定義したエタノール含有量が１～１５体積％であるレギュラービールである。
泡沫安定性の向上による最適な効果を得るために、本発明のビールは、好ましくは糖含有量が低い。本発明のビールのグルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、およびマルトトリオースの合計と定義される全糖含有量は、好ましくは０．０５～５ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．１～１ｇ／１００ｍｌ、さらにより好ましくは０．１５～０．５ｇ／１００ｍｌである。これは、全糖含有量が比較的低いビールにおいて、低減されたＡｃＨＦＡ量の泡沫安定化効果は強化されることが見出されたからである。
同様の理由で、本発明のビールは、好ましくは比較的高レベルの遊離アミノ窒素（ＦＡＮ）を有する。ＦＡＮは、泡沫安定性に寄与し、したがって本発明のビールは、好ましくはＦＡＮ含有量が５０～１６０ｍｇ／ｌ、好ましくは９０～１４０、より好ましくは１１０～１３５ｍｇ／ｌである。
イソアルファ酸も、ビールの泡沫安定性にプラスの効果を及ぼす。したがって、本発明のビールは、好ましくは合計２～５５ｍｇ／ｌ、好ましくは５～４５ｍｇ／ｌ、より好ましくは１０～３０ｍｇ／ｌ、より好ましくは１３～２５ｍｇ／ｌのイソアルファ酸を有する。本明細書においてイソアルファ酸は、雌性ホップ毬花で生成されるルプリンの軟性樹脂画分と定義される。アルファ酸としては、例えばフムロン、コフムロン、およびアドフムロンが挙げられる。
本明細書に定義されるＡｃＨＦＡ量が低減されたビールを得るために、発酵中または後にビールからＡｃＨＦＡを除去、発酵のためのＡＴＦ欠損酵母を使用することによりＡｃＨＦＡ形成を回避、および発酵対象の混合物からのＡｃＨＦＡ前駆体を除去、の３つの選択肢が開示される。したがって、本発明は、ビールの泡沫安定性を増大させる方法であって、麦汁を発酵させて前記ビールを得るステップを含み、
ａ）アセチルトランスフェラーゼ（ＡＴＦ）欠損酵母を使用して、発酵を達成し、および／または
ｂ）発酵中もしくは後に、ビールを、ＡｃＨＦＡを吸着可能な吸着剤と接触させ、および／または
ｃ）麦汁に対し、ＡｃＨＦＡ前駆体を吸着可能な吸着剤によってＡｃＨＦＡ前駆体を除去するステップが行われた、
方法を開示する。
ａ）アセチルトランスフェラーゼ（ＡＴＦ）欠損酵母を使用して、発酵を達成し、および／または
ｂ）発酵中もしくは後に、ビールを、ＡｃＨＦＡを吸着可能な吸着剤と接触させ、および／または
ｃ）麦汁に対し、ＡｃＨＦＡ前駆体を吸着可能な吸着剤によってＡｃＨＦＡ前駆体を除去するステップが行われた、
方法を開示する。
ＡＴＦ欠損酵母
好ましい一実施形態において、発酵は、アセチルトランスフェラーゼ（ＡＴＦ）欠損酵母（ＡＴＦのいかなるオルソログも含めて）を使用して達成され、その酵母は好ましくはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。そのような酵母は、酵母（好ましくは、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子改変、例えばＡＴＦコード遺伝子の置換または破壊（ノックアウト）、によって得ることができる。本明細書においてＡＴＦ欠損酵母は、ＡＴＦ遺伝子の複数のコピーが存在する酵母タイプにおいて、好ましくはそのＡＴＦ遺伝子のすべてのコピーがノックアウトされていることを意味する。
好ましい一実施形態において、発酵は、アセチルトランスフェラーゼ（ＡＴＦ）欠損酵母（ＡＴＦのいかなるオルソログも含めて）を使用して達成され、その酵母は好ましくはＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。そのような酵母は、酵母（好ましくは、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子改変、例えばＡＴＦコード遺伝子の置換または破壊（ノックアウト）、によって得ることができる。本明細書においてＡＴＦ欠損酵母は、ＡＴＦ遺伝子の複数のコピーが存在する酵母タイプにおいて、好ましくはそのＡＴＦ遺伝子のすべてのコピーがノックアウトされていることを意味する。
アセチルトランスフェラーゼ活性に関連する遺伝子が、（Ｓ． Ｃｅｒｅｖｉｓａｅにおいて）ＡＴＦ－１およびＡＴＦ－２の２種存在する。ＡＴＦ－１遺伝子は、遺伝子識別番号８５４５５９（ＮＣＢＩデータベース）を有し、ＡＴＦ－２遺伝子は、遺伝子識別番号８５３０８８（ＮＣＢＩデータベース）を有する。発酵に適した他の酵母タイプにおいて、共通一般知識を使用して、オルソログＡＴＦ遺伝子の位置を特定することができる。上述したように、ＡＴＦ－１欠損酵母において、好ましくはＡＴＦ－１遺伝子のすべてのコピーがノックアウトされている。ＡＴＦ－２欠損酵母において、好ましくはＡＴＦ－２遺伝子のすべてのコピーがノックアウトされている。
一実施形態において、ＡＴＦ欠損酵母は、ＡＴＦ－１欠損酵母である。ＡＴＦ－１欠損によって、ＡｃＨＦＡ形成の低減が約５０～９０％、好ましくは約６５～８５％になる。別の実施形態において、ＡＴＦ欠損酵母は、ＡＴＦ－２欠損酵母である。ＡＴＦ－２欠損によって、ＡｃＨＦＡ形成の低減が約１～４０％、好ましくは約１０～３０％になる。好ましい実施形態において、ＡＴＦ欠損酵母は、少なくともＡＴＦ－１が欠損しており、好ましくはＡＴＦ－２も欠損している。はるかに好ましい実施形態において、ＡＴＦ欠損酵母は、ＡＴＦ－１とＡＴＦ－２の両方が欠損した酵母である。ＡＴＦ－１とＡＴＦ－２の両方が欠損している酵母の使用によって、発酵時におけるＡｃＨＦＡの形成が完全に防止される。
ＡＴＦ欠損酵母は、変異生成、好ましくはランダム変異生成、または遺伝子工学など一般に知られている方法によって得ることができる。
本明細書で用いられている「変異生成」は、少なくとも１つの変異が少なくとも１つの酵母細胞またはその芽胞のＤＮＡにおいて生じ、したがって酵母細胞または芽胞の遺伝子情報が変更されるプロセスを指す。したがって、変異生成によって、上記のＡＴＦ欠損酵母を生じることができる。
本明細書で用いられているように、「変異」という用語は、酵母細胞または芽胞のＤＮＡのいかなる変化も指し、変異としては、点変異、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入または欠失、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、フレームシフト変異、ならびに染色体切断またはサブテロメア切断などの一本鎖または二本鎖ＤＮＡ切断、およびそのいずれかの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、変異は、上記のＡＴＦ欠損酵母を生じるようにＡＴＦ遺伝子中に位置する。
変異生成は、当技術分野において公知のいかなる方法を使用しても行うことができ、これは放射線および化学処理など従来のランダム変異生成方法、ならびに部位特異的変異生成または標的変異生成などの組換えＤＮＡ技術を含む。したがって、一実施形態において、少なくとも酵母の第１の種の少なくとも１つの酵母細胞または芽胞は、ＵＶ照射、Ｘ線照射、γ線照射または変異原性物質での処理、あるいは遺伝子工学にかけられる。
「遺伝子工学」は、当技術分野において周知であり、バイオテクノロジーを使用し、それによって酵母細胞または芽胞のＤＮＡの変化を導入して、酵母細胞または芽胞のゲノムを変化させることを指す。
「ランダム変異生成」は、変異の正確な部位が予想可能でない変異生成技法を指し、酵母細胞または芽胞の染色体においてどこでも起こりうる。一般に、これらの方法は、少なくとも１つの変異を誘導するための化学物質または放射線の使用を伴う。ランダム変異生成は、ＤＮＡポリメラーゼの複写精度が低く、ＰＣＲ産物における変異率が比較的高くなる条件下でＰＣＲが行われるエラープローンＰＣＲを使用してさらに達成することができる。部位特異的変異生成は、オリゴヌクレオチド指定変異生成を使用し、興味の対象となるＤＮＡ配列において部位特異的変異を生じて達成することができる。標的変異生成は、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼ技術などのプログラム制御可能なＲＮＡでガイドされたヌクレアーゼによって、特異的または標的遺伝子をインビボで変化させ、特異的部位に向けられた遺伝的構造の変化を生じる変異生成方法を指す。
好ましい実施形態において、本発明の方法において変異生成は、少なくとも１つの酵母細胞または芽胞を、ＵＶ照射、Ｘ線照射、γ線照射などの放射線、または変異原性物質、好ましくはＮＴＧ（Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン）もしくはＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）などの化学物質での処理にかけることによって行われる。
ＡｃＨＦＡまたはＡｃＨＦＡ前駆体の吸着
さらに好ましい実施形態において、発酵ビールを、ＡｃＨＦＡを吸着可能な吸着剤と接触させる。さらに、麦汁を、ＡｃＨＦＡ前駆体を吸着可能な吸着剤と接触させることによって、発酵より前に、麦汁からＡｃＨＦＡ前駆体を除去することができる。
さらに好ましい実施形態において、発酵ビールを、ＡｃＨＦＡを吸着可能な吸着剤と接触させる。さらに、麦汁を、ＡｃＨＦＡ前駆体を吸着可能な吸着剤と接触させることによって、発酵より前に、麦汁からＡｃＨＦＡ前駆体を除去することができる。
麦汁からのＡｃＨＦＡ前駆体の除去、および発酵中または後におけるビールからのＡｃＨＦＡの除去には、同じ吸着剤を使用できることが見出された。すなわち、ＡｃＨＦＡ前駆体およびＡｃＨＦＡ自体が実質的に同じ吸着剤に吸着する。好適な吸着剤としては、活性炭、疎水性吸着剤、親水性吸着剤、およびゼオライトが挙げられる。好ましくは、発酵中または後（好ましくは発酵後）にこれらの吸着剤を適用して、ＡｃＨＦＡをビールから吸着する。
ホップを加えていないビールの泡沫安定性を改善するために、ビールを、ＡｃＨＦＡ（またはその前駆体）を吸着するのに適したいかなる吸着剤と接触させてもよい。したがって、好ましい実施形態において、ビールはホップを加えていない。場合によって、ビールに、後にホップを加えて、さらなる泡沫安定性の向上およびさらなる（フレーバー）利点を達成してもよい。ホップを加えたビールは、ビールの泡沫にさらなる安定化効果を及ぼすイソアルファ酸を含む。
ホップを加えたビールの泡沫安定性を改善するために、ビールを、好ましくはイソアルファ酸を実質的には吸着しない吸着剤と接触させる。イソアルファ酸は、ホップから麦汁煮沸によって得られ、泡沫安定化効果を及ぼすことが知られている。当業者は、吸着剤が泡沫安定性に最終的な改善効果を及ぼす限り、ホップを加えたビールにもいずれの吸着剤を使用できるということを認識している。これは、ホップの使用量および／または発酵時におけるＡｃＨＦＡの形成量に依存する可能性がある。好ましい実施形態において、ホップを加えたビールに、ＡｃＨＦＡ除去ステップが完了した後、さらにホップを加えることができる。
活性炭は、当技術分野で周知であり、吸着剤として使用して、ＡｃＨＦＡを除去し、本発明によるＡｃＨＦＡが低減されたビールを得ることができる。しかし、活性炭の欠点は、ＡｃＨＦＡ除去にあまり効率的でないことである。さらに、活性炭は、イソアルファ酸を著しく吸着し、これは、ホップを加えたビールの処理における欠点である。さらなる欠点は、活性炭によって、ビールが脱色され、色が薄すぎて消費者に魅力的でない飲料が得られることである。
疎水性吸着剤としては、疎水性ポリマー吸着剤、好ましくは芳香族および／またはアシル基を含むポリマー吸着剤が挙げられる。当業者は、共通一般知識および本明細書に記載されている方法に基づいて、どの吸着剤がＡｃＨＦＡ（またはその前駆体）をビール（または麦汁）から低減するのに適しているかを容易に決定することができる。疎水性ポリマー吸着剤の利点は、ＡｃＨＦＡ（またはＡｃＨＦＡ前駆体）の除去に非常に効率的であることである。さらに、ビールの色が保持され、これらの吸着剤は、比較的わずかしか、またはさらには全くイソアルファ酸を吸着しない。したがって、特にポリスチレン／ジビニルベンゼン（ＰＳ／ＤＶＢ）、例えばＰＬＲＰ－Ｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ社によって販売されている）などの疎水性ポリマー吸着剤が好ましい。
親水性吸着剤は、好ましくは親水性ポリマー吸着剤である。はるかに好ましい親水性吸着剤は、混合セルロースエステル吸着剤、例えばＭＣＥ（ＭＦ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）メンブレンフィルター、Ｍｅｒｃｋ社）である。これは、試験された吸着剤のうち最も効率的な吸着剤であり、ビールの色を無変化のままにし、イソアルファ酸を吸着しない。さらに、この吸着剤は再生することができ、特にビール工業生産で、生産コストの低下および廃棄物の減少につながる。
さらに好ましい吸着剤は、例えば好ましくはＳｕｐｅｌｃｌｅａｎ ＬＣ Ｃ１８、Ｓｕｐｅｌｃｌｅａｎ ＬＣ Ｃ８、Ｓｕｐｅｌｃｌｅａｎ ＬＣ Ｐｈ、Ｓｕｐｅｌｃｌｅａｎ ＬＣ ＣＮ、またはＳｕｐｅｌｃｌｅａｎ ＬＣ ＳＣＸ、より好ましくはＳｕｐｅｌｃｌｅａｎ ＬＣ Ｃ１８、Ｓｕｐｅｌｃｌｅａｎ ＬＣ Ｃ８、またはＳｕｐｅｌｃｌｅａｎ ＬＣ Ｐｈ、最も好ましくはＳｕｐｅｌｃｌｅａｎ ＬＣ Ｃ１８、Ｓｕｐｅｌｃｌｅａｎ ＬＣ Ｃ８などのＳｕｐｅｌｃｌｅａｎ（商標）吸着剤である。これらの吸着剤は、ＭＣＥおよびＰＬＲＰ－Ｓについて上述したことと同じ理由で好ましい。
本明細書においてゼオライトは、好ましくは疎水性ゼオライトである。これは、ＳｉＯ２およびＡｌ２Ｏ３を少なくとも１５のモル比（ＳｉＯ２：Ａｌ２Ｏ３）で含有するシリケートベースのモレキュラーシーブである。本明細書で用いられている「モレキュラーシーブ」という用語は、直径２ｎｍ以下の細孔を有する微細孔性材料を指す。「シリケートベース」という用語は、材料が少なくとも６７重量％のシリケートを含有することを意味する。したがって、「ゼオライト」は、微細孔性アルミノシリケートである。本明細書においてゼオライト吸着剤は、天然ゼオライトまたは合成ゼオライトとすることができる。
ＳｉＯ２を含有するが、Ａｌ２Ｏ３を含有しない疎水性シリケートベースのモレキュラーシーブが、モレキュラーシーブはＳｉＯ２およびＡｌ２Ｏ３を少なくとも１５のモル比で含有するという条件を満たす（その場合、ゼオライトは、微細孔性アルミノシリケートではなく、微細孔性シリケートである）ことは理解されるべきである。
好ましい実施形態によれば、吸着剤は疎水性ゼオライトである。本プロセスにおいて採用される疎水性ゼオライトは、好ましくはＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３のモル比が少なくとも４０、より好ましくは少なくとも１００、さらにより好ましくは少なくとも２００、最も好ましくは少なくとも２５０である。
疎水性ゼオライトの平均細孔直径は、好ましくは０．２～１．２ナノメートル、より好ましくは０．３～１．０ナノメートル、さらにより好ましくは０．４～０．８ナノメートル、最も好ましくは０．４５～０．７０ナノメートルの範囲である。疎水性ゼオライトの細孔直径は、７７Ｋにおける窒素吸着等温線をｔ－プロット－Ｄｅ Ｂｏｅｒ法で分析することによって決定することができる。
疎水性ゼオライトの表面積は、好ましくは少なくとも１００ｍ２／ｇ、より好ましくは１５０～２０００ｍ２／ｇ、最も好ましくは２００～１０００ｍ２／ｇである。疎水性モレキュラーシーブの表面積は、ＢＥＴ法により決定することができる。
疎水性ゼオライトは、質量重みつき平均粒径が好ましくは１～２０００マイクロメートルの範囲、より好ましくは１０～８００マイクロメートルの範囲、最も好ましくは１００～３００マイクロメートルの範囲である。疎水性モレキュラーシーブ粒子の粒径分布は、異なるメッシュサイズの一組のシーブを使用して決定することができる。
疎水性ゼオライトは、好ましくはＺＭＳ－５ゼオライト、Ｙ型ゼオライト、ゼオライトβ、シリカライト、オールシリカフェリエライト、モルデン沸石およびそれらの組合せから選択される。より好ましくは、疎水性ゼオライトは、ＺＭＳ－５ゼオライト、Ｙ型ゼオライト、ゼオライトβおよびそれらの組合せから選択される。最も好ましくは、疎水性ゼオライトは、ＺＭＳ－５ゼオライトである。
本明細書に開示されている使用のための吸着剤を、当技術分野において既知であるように適用することができる。
発酵時におけるＡｃＨＦＡの除去には、発酵混合物を吸着剤と接触させることができるが、例えば混合物を吸着剤充填カラムに通すことによって、または吸着剤を粒子材料として発酵混合物に添加し、続いて吸着剤を濾過、サイクロニングもしくは別の好適な技法により除去することによって行うことができる。
発酵後におけるＡｃＨＦＡの除去には、発酵から得られたビールを吸着剤と接触させることができるが、例えばビールを吸着剤充填カラムに通すことによって、または吸着剤を粒子材料としてビールに添加し、続いて吸着剤を濾過、サイクロニングもしくは別の好適な技法により除去することによって行うことができる。好ましい実施形態において、発酵から得られたビールをホールドアップタンクに導入し、そこでＡｃＨＦＡを吸着するために吸着剤と例えば２０分～２４時間、好ましくは０．５～５時間接触させる。続いて、ＡｃＨＦＡを、濾過により除去することができる。あるいは、ビールを吸着剤担持フィルターで連続濾過してもよい。
ＡｃＨＦＡ前駆体の除去には、発酵より前に麦汁を吸着剤と接触させることができるが、例えば麦汁を吸着剤充填カラムに通すことによって、または吸着剤を粒子材料として麦汁に添加し、続いて吸着剤を濾過、サイクロニングもしくは別の好適な技法により除去することによって行うことができる。好ましくは、麦汁は、ピッチングより前にスウィート麦汁として接触させる。
当業者は、望ましくない成分を液体混合物から吸着により吸着する無数の技法を知っており、本明細書に定義するＡｃＨＦＡ量が低減されたビールを得るためにいかなる技法を適用してもよい。好適な技法は、例えばＣ． Ｊｕｄｓｏｎ Ｋｉｎｇ、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ（第２版）、ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ， Ｉｎｃ．社、１９８０に記載されている。
麦汁、発酵混合物またはビールを吸着剤と、ＡｃＨＦＡまたはその前駆体を吸着するのに十分な時間接触させる。これは、共通一般知識および本明細書に開示されている方法に基づいて当業者が容易に決定することができる。好ましくは、接触時間は、５分～４８時間、より好ましくは０．５～２４時間、より好ましくは１～２０時間である。
使用される吸着剤の量も、共通一般知識および本明細書に開示されている方法に基づいて当業者が容易に決定することができる。好ましくは、吸着剤は、０．００１～１０ｇ／ｌ、より好ましくは０．０１～５ｇ／ｌ、より好ましくは０．０５～２．５ｇ／ｌの投入量で使用される。
ビールのタイプおよび性質、吸着剤のタイプおよび量、ならびに接触時間に応じて、ＡｃＨＦＡ量を、当業者が容易に確認することができるように実質的に低減することができる。ＡｃＨＦＡ量を、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％低減することができる。一部の実施形態において、ＡｃＨＦＡ量を９０％まで、または９５％以上までも低減することができる。ＡｃＨＦＡがビールから吸着により除去される好ましい実施形態において、ＡｃＨＦＡ量は、初期量の６０％未満、より好ましくは初期量の２０％未満、最も好ましくは初期量の５％未満に低減される。
ＡｃＨＦＡ低減の効果は、泡沫安定性が少なくとも１０秒、好ましくは少なくとも１５秒、より好ましくは少なくとも２０秒増大されることである。泡沫安定性は、４０秒まで、または５０秒以上までも増大することができる。
はるかに好ましい実施形態において、本発明は、ビールの泡沫安定性を増大させる方法であって、発酵により得られたビールを、ＡｃＨＦＡを吸着可能な吸着剤と接触させるステップを含む方法に関する。吸着剤およびビールを吸着剤と接触させる方式は、以上に定義した通りである。これによって、上記の泡沫安定性が増大したビールになる。
明確性および簡潔な説明のために、本明細書においては同じまたは別個の実施形態の一部として構成を記載しているが、本発明の範囲は、記載されている構成のすべてまたは一部の組合せを有する実施形態を含むことができると認識されている。
次に、本発明を以下に示す非限定的な実施例によってさらに説明する。
方法
ＡｃＨＦＡ分析
ビール中のＡｃＨＦＡ含有量は、ＬＣ－ＭＳにより分析することができる。ＬＣ－ＭＳシステムは、Ｗａｔｅｒｓ ＴＱ－Ｓ質量分析計およびＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムからなるものであった。移動相は、
Ａ：ミリＱ水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸
Ｂ：アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸
からなるものであった。
ＡｃＨＦＡ分析
ビール中のＡｃＨＦＡ含有量は、ＬＣ－ＭＳにより分析することができる。ＬＣ－ＭＳシステムは、Ｗａｔｅｒｓ ＴＱ－Ｓ質量分析計およびＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムからなるものであった。移動相は、
Ａ：ミリＱ水＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸
Ｂ：アセトニトリル＋０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸
からなるものであった。
分析カラムは、１５ｃｍ×２．１ｍｍ ＩＤ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８（１．７μｍ）カラムであった。ＡｃＨＦＡを、次のグラジエントで他のマトリックス構成要素から分離した：
Ｔ ０分： ９５％ Ａ、５％ Ｂ
Ｔ １３分： ７０％ Ａ、３０％ Ｂ
Ｔ １７分： ５％ Ａ、９５％ Ｂ
Ｔ ２５分： ９５％ Ａ、５％ Ｂ
Ｔ ０分： ９５％ Ａ、５％ Ｂ
Ｔ １３分： ７０％ Ａ、３０％ Ｂ
Ｔ １７分： ５％ Ａ、９５％ Ｂ
Ｔ ２５分： ９５％ Ａ、５％ Ｂ
流速を０．２５ｍｌ／分に設定し、カラムをサーモスタットで５０℃に調節した。ＵＰＬＣシステムを、負イオンモードで操作したエレクトロスプレーインターフェース（ＥＳＩ）を介してＭＳに連結した。次の遷移のＭＲＭデータを記録した：ｍ／ｚ ３５５＞２９５。コーン電圧を４０ボルトに設定した。衝突エネルギーを１５ｅＶに設定した。ＡｃＨＦＡを構造３によって表される化合物として検出した。ＡｃＨＦＡ量を任意単位（ａ．ｕ）で表した。それは、クロマトグラムのピーク面に由来して、定量的結果をもたらす。
ビール中の糖含有量の決定
糖含有量を超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）で測定した。ＵＰＬＣは、６５℃の温度で好適に実施することができる。溶離液の好適な選択は、アセトニトリル／水の例えば体積比７５／２５の混合物である。使用した検出器は、典型的には屈折率（ＲＩ）検出器である。試料の糖含有量は、試料のＵＰＬＣ曲線を既知の糖濃度の標準試料の較正曲線と比較することによって決定した。
糖含有量を超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）で測定した。ＵＰＬＣは、６５℃の温度で好適に実施することができる。溶離液の好適な選択は、アセトニトリル／水の例えば体積比７５／２５の混合物である。使用した検出器は、典型的には屈折率（ＲＩ）検出器である。試料の糖含有量は、試料のＵＰＬＣ曲線を既知の糖濃度の標準試料の較正曲線と比較することによって決定した。
ＵＰＬＣ用の試料を以下の通り調製した。ビールまたは麦汁の試料を、アセトニトリル／水の混合物（５０／５０－等体積部）の添加により５倍に希釈した。ＣＯ２が存在する場合、希釈より前に（例えば、試料を振盪または撹拌することによって）除去した。希釈した後、試料を濾過して、清澄な溶液を得た。上述の溶離液を使用して、濾過した試料を６５℃でＵＰＬＣに注入した。
遊離アミノ窒素（ＦＡＮ）の決定
遊離アミノ窒素（アミノ酸、小ペプチドおよびアンモニアなど）の量を、Ｏ－フタルジアルデヒドアッセイによる窒素（ＮＯＰＡ）法に従って測定した。測光分析計（例えば、Ｇａｌｌｅｒｙ（商標） Ｐｌｕｓ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を使用して、ＮＯＰＡ法を実施した。ＮＯＰＡ法に従って、試験試料をオルト－フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）およびＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）による処理にかける。この処理によって、イソインドールの形成下で試験試料中に存在する第一級アミノ基の誘導体化が行われる。イソインドールの含有量は、続いて測光分析計を使用して３４０ｎｍの波長で決定される。次いで、遊離アミノ窒素（ｍｇ ＦＡＮ／ｌで表す）をイソインドール含有量の測定値に基づいて算出することができる。必要なら、ビールまたは麦汁試料を、分析前にまず遠心にかけて、試料を清澄化し、および／または（例えば、試料を撹拌または振盪することによる）ＣＯ２除去ステップにかける。
遊離アミノ窒素（アミノ酸、小ペプチドおよびアンモニアなど）の量を、Ｏ－フタルジアルデヒドアッセイによる窒素（ＮＯＰＡ）法に従って測定した。測光分析計（例えば、Ｇａｌｌｅｒｙ（商標） Ｐｌｕｓ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を使用して、ＮＯＰＡ法を実施した。ＮＯＰＡ法に従って、試験試料をオルト－フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）およびＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）による処理にかける。この処理によって、イソインドールの形成下で試験試料中に存在する第一級アミノ基の誘導体化が行われる。イソインドールの含有量は、続いて測光分析計を使用して３４０ｎｍの波長で決定される。次いで、遊離アミノ窒素（ｍｇ ＦＡＮ／ｌで表す）をイソインドール含有量の測定値に基づいて算出することができる。必要なら、ビールまたは麦汁試料を、分析前にまず遠心にかけて、試料を清澄化し、および／または（例えば、試料を撹拌または振盪することによる）ＣＯ２除去ステップにかける。
ビール中のエタノールの決定
測光分析計（例えば、Ｇａｌｌｅｒｙ（商標） Ｐｌｕｓ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を使用して、エタノール含有量を測定した。試験試料を酵素法にかけ、試料中に存在するエタノールを、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）でアセトアルデヒドに変換する。アセトアルデヒド含有量は、続いて測光分析計を使用して３４０ｎｍの波長で決定される。エタノール含有量は、アセトアルデヒド含有量に基づいて算出することができる。必要であれば、ビールまたは麦汁試料を、分析前にまず遠心にかけて、試料を清澄化し、および／または（例えば、撹拌または振盪による）ＣＯ２除去ステップにかける。
測光分析計（例えば、Ｇａｌｌｅｒｙ（商標） Ｐｌｕｓ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ）を使用して、エタノール含有量を測定した。試験試料を酵素法にかけ、試料中に存在するエタノールを、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）でアセトアルデヒドに変換する。アセトアルデヒド含有量は、続いて測光分析計を使用して３４０ｎｍの波長で決定される。エタノール含有量は、アセトアルデヒド含有量に基づいて算出することができる。必要であれば、ビールまたは麦汁試料を、分析前にまず遠心にかけて、試料を清澄化し、および／または（例えば、撹拌または振盪による）ＣＯ２除去ステップにかける。
ビール中のイソアルファ酸の決定
ＥＢＣ ９．４７ ２０１０：ＨＰＬＣによるビール中のＩｓｏ－α－ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｓｏ－α－ａｃｉｄｓ （Ｒｈｏ， Ｔｅｔｒａ， Ｈｅｘａ）を使用して、イソアルファ酸を定量的に決定した。
ＥＢＣ ９．４７ ２０１０：ＨＰＬＣによるビール中のＩｓｏ－α－ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｓｏ－α－ａｃｉｄｓ （Ｒｈｏ， Ｔｅｔｒａ， Ｈｅｘａ）を使用して、イソアルファ酸を定量的に決定した。
泡沫安定性の決定
泡沫安定性は、ＮＩＢＥＭ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ＥＢＣ ９．４２．１によって設定された基準に従って決定される。
泡沫安定性は、ＮＩＢＥＭ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ＥＢＣ ９．４２．１によって設定された基準に従って決定される。
脱気および再炭酸化
ビールからのＡｃＨＦＡ吸着を伴う実験はすべて、脱気しておいたレギュラービールで行った。泡沫安定性を測定する前に、ビールを再炭酸化した。
ビールからのＡｃＨＦＡ吸着を伴う実験はすべて、脱気しておいたレギュラービールで行った。泡沫安定性を測定する前に、ビールを再炭酸化した。
脱気したビールを以下の通り得た。
約２００ｍｌの瓶詰めビール（４℃）を、清浄な５００ｍｌの実験室用瓶に慎重に移した（起泡を防止する）。試料が入っている瓶を２０℃の水浴に入れ、穏やかに（４０ｒｐｍ）４０分間振盪した。
次に、振盪強度を１２０ｒｐｍに上げ、振盪を３０分間続けて、脱気したビールを得た。脱気処理全体において、瓶のヘッドスペースを窒素ガスで連続的にフラッシュして、ビールの酸化を防止した。
再炭酸化を実験室規模で以下の通り達成した。ステンレス鋼Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ容器（モデルＭｉｌｌｉｐｏｒｅ カタログ番号ｘｘ６７００ｐ０５）を準備して、レギュラービール樽として使用することができた。ビールを添加する前に、樽を清浄し、ＣＯ２でフラッシュして、空気を除去した。約１～２リットルのビール試料を樽に移し、試料を１００ｒｐｍで３０分間振盪しながら、２．５バールのＣＯ２圧下に置いた。手順全体を２０℃で行った。
ＣＯ２圧を使用して、ビールを、容器の底部から約０．７ｃｍに配置したスピアを使用して分注した。したがって、Ｎｉｂｅｍ泡沫ディスペンサー器具を、瓶詰めビールを使用するときに行われるように同様の（ＣＯ２加圧）樽に連結することによって、泡沫を調製した。上述のＮｉｂｅｍ法に従って、泡沫安定性を決定した。
ビールからのＡｃＨＦＡの除去によって、泡沫安定化がもたらされる
脱気したビールを、室温で０．１ｇ／ｌの市販のメチルセルロースエステル吸着剤（ＭＣＥ、ＭＦ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）メンブレンフィルター、Ｍｅｒｃｋ社）とともに１６時間インキュベートした。続いて、ビールを０．２μｍのフィルターで濾過し、再炭酸化した。
脱気したビールを、室温で０．１ｇ／ｌの市販のメチルセルロースエステル吸着剤（ＭＣＥ、ＭＦ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）メンブレンフィルター、Ｍｅｒｃｋ社）とともに１６時間インキュベートした。続いて、ビールを０．２μｍのフィルターで濾過し、再炭酸化した。
結果から、ＡｃＨＦＡのＭＣＥへの吸着、続いてビールからのＡｃＨＦＡの除去によって、泡沫安定性が向上したビールになることが示される。ブランクビールを、吸着ステップを除く同じ手順にかけた。処理した後、処理したビール中のＡｃＨＦＡを、レギュラービール中の量の６．３％に低減した。ブランクビールは、（ＮＩＢＥＭ）泡沫安定性が２５３秒であったが、ＭＣＥ処理したビールは泡沫安定性が２９６秒であった。したがって、ＡｃＨＦＡの９０％を超える除去によって、泡沫安定性が１７％増大した。
ＡｃＨＦＡ除去プロセスは、ホップを加えたビールでもホップを加えていないビールでも、ＡｃＨＦＡの効率的な除去をもたらす（データ不図示）ことが示されてきた。さらに、ＭＣＥはイソアルファ酸を著しくは吸着せず、ビールの色は減少されないことが見出された。これは、イソアルファ酸の存在がビールの泡沫にさらに安定化する効果を及ぼすので有益である。したがって、ＭＣＥは、はるかに好ましい吸着剤である。
ＡｃＨＦＡは泡沫に対する負の因子である
実施例１に記載したように、脱気したレギュラービールを得た。この場合のビールは、ホップを含まないフルモルトビールであった。脱気したビールを、室温で０．２ｇ／ｌのＰＬＲＰ－Ｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）とともに１６時間インキュベートして、ＡｃＨＦＡの完全除去を行い、ＡｃＨＦＡを含まないホップを加えていないビールを得た。
実施例１に記載したように、脱気したレギュラービールを得た。この場合のビールは、ホップを含まないフルモルトビールであった。脱気したビールを、室温で０．２ｇ／ｌのＰＬＲＰ－Ｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）とともに１６時間インキュベートして、ＡｃＨＦＡの完全除去を行い、ＡｃＨＦＡを含まないホップを加えていないビールを得た。
吸着剤を濾過および単離し、アセトニトリルで洗浄して、粗ＡｃＨＦＡを得た。粗ＡｃＨＦＡを逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃ１８）で水からアセトニトリルへのグラジエントを使用して分画した。得られた画分を、ビールに添加することにより泡沫安定性に及ぼす効果について試験し、泡沫への負の画分を回収し、ＬＣ－ＭＳにより分析し、明細書中の定義に従ってＮＭＲによりＡｃＨＦＡと特徴づけた。したがって、純粋なＡｃＨＦＡの単離および特徴づけを行った。
通常の発酵により得られたＡｃＨＦＡの量がレギュラーである、脱気したホップを加えたビールおよび脱気したホップを加えていないビールに、純粋なＡｃＨＦＡの追加量を添加した。実施例１に記載したように穏やかな均質化および再炭酸化を行った後、泡沫安定性を記載したように決定した。ＡｃＨＦＡの添加量を表１に示し、図２ａおよび２ｂに表す。
結果から、レギュラービール中のＡｃＨＦＡ量を増加させることによって、ビールの泡沫安定性が急速に低下することが示される。したがって、ＡｃＨＦＡは、泡沫に対する負の因子であり、ＡｃＨＦＡ量が低下したビールは、泡沫安定性を増大させると結論づけられた。
ＡｃＨＦＡ量が低減されたビールは、泡沫安定性が上昇する
別の実験において、室温で０．２ｇ／ｌのＰＬＲＰ－Ｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）とともに１６時間インキュベートして、ＡｃＨＦＡの完全除去を行うことによって、ＡｃＨＦＡを含まないホップを加えたビールおよびＡｃＨＦＡを含まないホップを含まないビールを得た。ホップを加えたビールにＡｃＨＦＡを添加する前に、吸着ステップ時におけるイソアルファ酸の損失を、２０ｍｇ／ｌのイソアルファ酸（「ＩＡＡ」、Ｂ－ホップ、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社）の添加により補償した。ＡｃＨＦＡビールは両方とも、続いて脱気した。
別の実験において、室温で０．２ｇ／ｌのＰＬＲＰ－Ｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）とともに１６時間インキュベートして、ＡｃＨＦＡの完全除去を行うことによって、ＡｃＨＦＡを含まないホップを加えたビールおよびＡｃＨＦＡを含まないホップを含まないビールを得た。ホップを加えたビールにＡｃＨＦＡを添加する前に、吸着ステップ時におけるイソアルファ酸の損失を、２０ｍｇ／ｌのイソアルファ酸（「ＩＡＡ」、Ｂ－ホップ、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社）の添加により補償した。ＡｃＨＦＡビールは両方とも、続いて脱気した。
ＡｃＨＦＡを含まないビールに、様々な量のＡｃＨＦＡを添加した。上記のように穏やかな均質化および再炭酸化を行った後、泡沫安定性を決定した。結果を表２、図３ａおよび３ｂに示す。
結果から、ビール中のＡｃＨＦＡ量をレギュラービール中のレベル未満に低下させることによって、泡沫安定性がＡｃＨＦＡ濃度依存的に増大することが示される。ＡｃＨＦＡを含まないビールは泡沫安定性が最高である。
ビール中のＡｃＨＦＡの低減
ＡｃＨＦＡが従来の量であるレギュラー（ホップを含まない）ビールを得た。このビールを記載したように脱気し、３０ｍｌずつ（１０カラム体積）を同じ量の様々なＳｕｐｅｌｃｌｅａｎ（商標）吸着剤（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）と３ｍｌのＳＰＥカラム中で接触させ、続いて再炭酸化を行った。結果を表３および図４に示す。
ＡｃＨＦＡが従来の量であるレギュラー（ホップを含まない）ビールを得た。このビールを記載したように脱気し、３０ｍｌずつ（１０カラム体積）を同じ量の様々なＳｕｐｅｌｃｌｅａｎ（商標）吸着剤（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）と３ｍｌのＳＰＥカラム中で接触させ、続いて再炭酸化を行った。結果を表３および図４に示す。
結果から、様々な疎水性および親水性吸着剤は、ビール中のＡｃＨＦＡ量を低減できることが示される。好ましい吸着剤は、ＬＣ Ｃ１８、ＬＣ Ｃ８およびＬｃＰｈである。好ましい実施形態において、ＡｃＨＦＡは、初期量の６０％未満、より好ましくは初期量の２０％未満、さらにより好ましくは初期量の５％未満に低減される。
ＰＬＲＰ－Ｓおよび活性炭を使用した、ビール中のＡｃＨＦＡの低減
ホップを含まない脱気したビールをＰＬＲＰ－Ｓ（０．１ｍｇ／ｌ）および１．０ｍｇ／ｌの活性炭（Ａｋｔｉｖｋｏｈｌｅ， ａｒｔ． ２１８６ Ｍｅｒｃｋ社）と接触させ、続いて再炭酸化を行った。結果を図５に示す。
ホップを含まない脱気したビールをＰＬＲＰ－Ｓ（０．１ｍｇ／ｌ）および１．０ｍｇ／ｌの活性炭（Ａｋｔｉｖｋｏｈｌｅ， ａｒｔ． ２１８６ Ｍｅｒｃｋ社）と接触させ、続いて再炭酸化を行った。結果を図５に示す。
結果から、ＰＬＲＰ－Ｓは、ＡｃＨＦＡをビールから除去する上でより効率的であることが示される。さらに、活性炭はビールの脱色を行うことが観察された。これは欠点とみなされる。ＰＬＲＰ－Ｓは、ビールの色を無変化のままにする。さらに、ＰＬＲＰ－Ｓは、イソアルファ酸を著しくは吸着しない。したがって、ＰＬＲＰ－Ｓ（およびＭＣＥ、実施例１を参照のこと）は、活性炭より好ましい吸着剤である。
従来のビールに比べてＡｃＨＦＡ量が低下したビールを得るための、スウィート麦汁からのＡｃＨＦＡ前駆体の除去
従来のパイロットプラントビール醸造プロセスにおいて、ラウタータンと銅製麦汁容器の間に設置されたＰＶＰＰフィルターを７５０ｇのＰＬＲＰ－Ｓでコーティングし、１５ｈｌのスウィート麦汁を、銅製麦汁容器への流入より前に前記フィルターで処理することによって、スウィート麦汁をＰＬＲＰ－Ｓで処理した（図６）。続いて、ビールを従来の方式（ホップ添加、煮沸、ワールプール、発酵、および後処理および瓶詰め）で醸造した。
従来のパイロットプラントビール醸造プロセスにおいて、ラウタータンと銅製麦汁容器の間に設置されたＰＶＰＰフィルターを７５０ｇのＰＬＲＰ－Ｓでコーティングし、１５ｈｌのスウィート麦汁を、銅製麦汁容器への流入より前に前記フィルターで処理することによって、スウィート麦汁をＰＬＲＰ－Ｓで処理した（図６）。続いて、ビールを従来の方式（ホップ添加、煮沸、ワールプール、発酵、および後処理および瓶詰め）で醸造した。
同じプロセス条件を使用するが、スウィート麦汁をＰＬＲＰ－Ｓ担持フィルターで濾過せずに、同じ麦汁から比較のビールを醸造した。
ＡｃＨＦＡ前駆体（ジヒドロキシ脂肪酸）の量の分析は、ホップを加えた麦汁（ピッチング麦汁）の試料について、ＡｃＨＦＡで記載されたＨＰＬＣ条件を使用して行った。ＡｃＨＦＡ量は、最終ビールについて決定した。結果を表４に示す。
結果から、ＡｃＨＦＡ前駆体の吸着による除去により、最終ビール中におけるＡｃＨＦＡの形成を防止できることが示される。これは、得られるビールの泡沫安定性が増大するという結果を生む。
結果から、吸着プロセスを工業上適切な規模で適用できることがさらに示される。
酵母の改変によりＡｃＨＦＡ量が低減されたビールを得ること
この実施例において、ＡＴＦ１およびＡＴＦ２の欠損対立遺伝子の異なる組合せを有するＳ． ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ野生型（ＷＴ）酵母の欠損ライブラリーを、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を使用して構築した。Ｓ． ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ ＷＴは、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＳ． ｅｕｂａｙａｎｕｓの両ゲノムに由来するＡＴＦ１の５つのコピーおよびＡＴＦ２の４つのコピーを含む。Ｓ． ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ中で機能的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いて、１つの遺伝子のすべてのコピーを１回の形質転換で標的とする。最終的に、９つのＡＴＦ１／２遺伝子が、異なる４つの染色体からわずか２回の形質転換で欠損した。ＡＴＦ－１欠損酵母を「ａ株」と称する。ＡＴＦ－２欠損酵母を「ｂ株」と称する。ＡＴＦ－１とＡＴＦ－２が両方欠損している酵母を「ｃ株」と称する。株を醸造関連条件下で成長させることによって、様々なノックアウトの影響を検討した。株は、１５°プラトー麦汁中で標準醸造発酵時に同様の成長速度、糖消費プロファイル、およびエタノール生成を示した。
この実施例において、ＡＴＦ１およびＡＴＦ２の欠損対立遺伝子の異なる組合せを有するＳ． ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ野生型（ＷＴ）酵母の欠損ライブラリーを、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９技術を使用して構築した。Ｓ． ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ ＷＴは、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとＳ． ｅｕｂａｙａｎｕｓの両ゲノムに由来するＡＴＦ１の５つのコピーおよびＡＴＦ２の４つのコピーを含む。Ｓ． ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ中で機能的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを用いて、１つの遺伝子のすべてのコピーを１回の形質転換で標的とする。最終的に、９つのＡＴＦ１／２遺伝子が、異なる４つの染色体からわずか２回の形質転換で欠損した。ＡＴＦ－１欠損酵母を「ａ株」と称する。ＡＴＦ－２欠損酵母を「ｂ株」と称する。ＡＴＦ－１とＡＴＦ－２が両方欠損している酵母を「ｃ株」と称する。株を醸造関連条件下で成長させることによって、様々なノックアウトの影響を検討した。株は、１５°プラトー麦汁中で標準醸造発酵時に同様の成長速度、糖消費プロファイル、およびエタノール生成を示した。
野生型酵母から変異体を得ること
「ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌａｇｅｒ ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ」、Ａｒｔｈｕｒ Ｒ． Ｇｏｒｔｅｒ ｄｅ Ｖｒｉｅｓら、Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ （２０１７） １６：２２２に記載されている方法に従って、変異株を得た。変異の表示を図７ａに示す。
「ＣＲＩＳＰＲ‐Ｃａｓ９ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌａｇｅｒ ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ」、Ａｒｔｈｕｒ Ｒ． Ｇｏｒｔｅｒ ｄｅ Ｖｒｉｅｓら、Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ （２０１７） １６：２２２に記載されている方法に従って、変異株を得た。変異の表示を図７ａに示す。
醸造条件下におけるＡＴＦ欠損を有するＷＴの特徴づけ
発酵性能を確認するために、オートクレーブおよび濾過滅菌にかけ、酵母の成長要件を満たすために亜鉛を追加した１５°プラトーの麦汁に、株を接種した。１株当たり３本の瓶に約５００万細胞の同じ細胞濃度で接種した。ＨＰＬＣによる分析のために、実験の開始時および発酵の数日後にすべての瓶をサンプリングした。しかし、糖消費ならびにグリセロール、エタノール、およびバイオマスの生成をモニタリングし、ＷＴによる発酵と比較するために、それぞれ３本の瓶のうちの１本の瓶を発酵時にもサンプリングした。発酵後に、各瓶の上澄みを糖、グリセロール、およびエタノールについてＨＰＬＣにより分析した。変異株は、発酵において適用されたとき、野生型酵母と実質的に同一の挙動を示すことが観察された。グルコース、マルトース、マルトトリオース、およびフルクトースの時間軸上の糖消費プロファイルは、実質的に同一の消費プロファイルが使用されていることを示す。また、発酵時にモニタリングされたグリセロールおよびエタノールの生成も、実質的に同一であった。また、細胞成長速度も（光学濃度によって測定して）実質的に同一であった。ａ株、ｂ株およびｃ株のエタノール生成を示す例示的な図を図７ｂとして組み入れる。すべての試験パラメータについて、変異株は、実質的に同一の特徴および実質的に同一の時間経過を示した。したがって、最終ビール中のＡｃＨＦＡの量を低下させるために、変異株を既存の生成プロセスに適用することができる。
発酵性能を確認するために、オートクレーブおよび濾過滅菌にかけ、酵母の成長要件を満たすために亜鉛を追加した１５°プラトーの麦汁に、株を接種した。１株当たり３本の瓶に約５００万細胞の同じ細胞濃度で接種した。ＨＰＬＣによる分析のために、実験の開始時および発酵の数日後にすべての瓶をサンプリングした。しかし、糖消費ならびにグリセロール、エタノール、およびバイオマスの生成をモニタリングし、ＷＴによる発酵と比較するために、それぞれ３本の瓶のうちの１本の瓶を発酵時にもサンプリングした。発酵後に、各瓶の上澄みを糖、グリセロール、およびエタノールについてＨＰＬＣにより分析した。変異株は、発酵において適用されたとき、野生型酵母と実質的に同一の挙動を示すことが観察された。グルコース、マルトース、マルトトリオース、およびフルクトースの時間軸上の糖消費プロファイルは、実質的に同一の消費プロファイルが使用されていることを示す。また、発酵時にモニタリングされたグリセロールおよびエタノールの生成も、実質的に同一であった。また、細胞成長速度も（光学濃度によって測定して）実質的に同一であった。ａ株、ｂ株およびｃ株のエタノール生成を示す例示的な図を図７ｂとして組み入れる。すべての試験パラメータについて、変異株は、実質的に同一の特徴および実質的に同一の時間経過を示した。したがって、最終ビール中のＡｃＨＦＡの量を低下させるために、変異株を既存の生成プロセスに適用することができる。
したがって、ＷＴ酵母と同じ条件下で適用することができるＡＴＦ欠損酵母タイプを得た。ＡＴＦ－１欠損酵母（ａ株）、ＡＴＦ－２欠損酵母（ｂ株）、およびＡＴＦ－１とＡＴＦ－２が両方欠損している酵母（ｃ株）を麦汁の標準発酵において使用して、標準ビール醸造プロセスにおけるそれらの活性を評価した。５ｍｉｏ細胞／ｍｌで接種した異なる酵母を、２５０ｍｌの浸出容器において、１５０ｍｌのフルモルトのホップを加えた１５～１６Ｐ麦汁中、２００ｒｐｍ、１３℃、微好気的条件下で７日間振盪して、発酵させた。得られたビールを、改変されていないＷＴ酵母で得られたビールと比較し。結果を表５に示す。
結果から、ＡＴＦ－１欠損酵母を使用すると、ＡｃＨＦＡが、野生型酵母を使用して観察されたＡｃＨＦＡ量の１５％に低減されることが示される。ＡＴＦ－２欠損酵母を用いると、ＡｃＨＦＡが、野生型酵母を使用して観察されたＡｃＨＦＡ量の７７％に低減される。ＡＴＦ－１とＡＴＦ－２（好ましくは、すべてのコピー）が両方欠損している酵母を使用することによって、ＡｃＨＦＡ形成を完全に抑制することができる。
ＡｃＨＦＡ量が低下したビールを得るための、工業上適切な規模でのレギュラービールからのＡｃＨＦＡの除去
従来のプロセスおよび従来の酵母を使用して、ビールをパイロットプラントで醸造した。醸造プロセスにより、ラガービールが生じた。イソアルファ酸（「ＩＡＡ」）が添加されたラガービール（２０ｍｇ／ｌのＢ－ホップ、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社）、およびイソアルファ酸が添加されていないビールを得た。
従来のプロセスおよび従来の酵母を使用して、ビールをパイロットプラントで醸造した。醸造プロセスにより、ラガービールが生じた。イソアルファ酸（「ＩＡＡ」）が添加されたラガービール（２０ｍｇ／ｌのＢ－ホップ、Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ社）、およびイソアルファ酸が添加されていないビールを得た。
ラガービールを濾過し、ＰＶＰＰで安定化し、ホールドアップタンク中で０．１ｇ／ｌのＰＬＲＰ－Ｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）と１または２時間接触させて貯蔵した。続いて、ビールを濾過して、ＰＬＲＰ－Ｓおよび吸着したＡｃＨＦＡを除去した（図８ａ）。あるいは、発酵から得られたビールを、ＰＬＲＰ－Ｓでコーティングされたフィルターで濾過して、ＡｃＨＦＡを除去することができた（図８ｂ；得られたビールのデータは示していないが、図８ａに表示したプロセスにより得られたビールのデータに匹敵する）。
ＡｃＨＦＡ量を分析し、前記濾過ステップを行わないビールの量と比較した。さらに、得られたビールの泡沫安定性を比較した。
結果から、発酵から得られたビールをＰＬＲＰ－Ｓで１または２時間処理することにより、ＡｃＨＦＡ量を有意に低減できることが示される。これは、イソアルファ酸が添加されたビールでもイソアルファ酸が添加されていないビールでも、泡沫安定性にプラスの大幅な効果を及ぼした。したがって、ＰＬＲＰ－Ｓなどの吸着剤を使用して、ＡｃＨＦＡを除去し、ビールの泡沫安定性を増大させることができる。
Claims (11)
- ２ｍｇ／ｌ未満のＡｃＨＦＡを含むビールであって、
ＡｃＨＦＡが、カルボン酸基およびＣ１１～Ｃ２１直鎖状アルキル基を含むＣ１２～Ｃ２２脂肪酸であり、前記アルキル基が、部分不飽和であってもよく、かつ少なくとも１つのヒドロキシ基および少なくとも１つのアセテート基で置換されている、ビール。 - 請求項１に記載のビールにおいて、
ＡｃＨＦＡが、構造１によって定義され、
構造１中、ｎ＝４～９の整数であり、
、Ａ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤのそれぞれは同じでも異なってもよく、
ａ）
ＡおよびＢの一方はＨ、ＯＨまたはＯＡｃであり、ＡおよびＢの他方はＨであり、
ＣおよびＤの一方はＨ、ＯＨまたはＯＡｃであり、ＣおよびＤの他方はＨであるか、あるいは
ｂ）
は二重結合であり、その場合、
ＡおよびＢの一方はＨであり、ＡおよびＢの他方は存在せず、ＣおよびＤの一方はＨであり、ＣおよびＤの他方は存在せず、
ただし、構造１において、すべてのＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄのうちの少なくとも１つはＯＨであり、すべてのＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄのうちの少なくとも１つはＯＡｃであることを条件とする、
、ビール。 - 請求項１または２に記載のビールにおいて、
ＡｃＨＦＡが、構造２によって定義され、
構造２中、ｎ＝１、２、または３、好ましくは２または３、最も好ましくは３であり、
ｍ＝１または２、好ましくは２であり、
ＡおよびＢの一方はＯＨであり、ＡおよびＢの他方はＯＡｃである、
、ビール。 - 請求項１から３のいずれか一項に記載のビールにおいて、
０～１５体積％のエタノールを含む、ビール。 - 請求項１から４のいずれか一項に記載のビールにおいて、
１．５ｍｇ／ｌ未満、好ましくは１．０ｍｇ／ｌ未満、より好ましくは０．５ｍｇ／ｌ未満、さらにより好ましくは０．２５ｍｇ／ｌ未満のＡｃＨＦＡを含む、ビール。 - 請求項１から５のいずれか一項に記載のビールにおいて、
合計５～５５ｍｇ／ｌのイソアルファ酸を含む、ビール。 - 請求項１から５のいずれか一項に記載のビールにおいて、
グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、およびマルトトリオースの合計と定義される全糖含有量が０．０５～５ｇ／１００ｍｌである、ビール。 - ビールの泡沫安定性を増大する方法であって、
麦汁を発酵させて前記ビールを得るステップを含み、
ａ）アセチルトランスフェラーゼ（ＡＴＦ）欠損酵母を使用して、発酵を達成する、および／または
ｂ）発酵中もしくは後に、ビールを、ＡｃＨＦＡを吸着可能な吸着剤と接触させる、および／または
ｃ）麦汁を、ＡｃＨＦＡ前駆体を吸着可能な吸着剤によってＡｃＨＦＡ前駆体を除去するステップにかけておく、
方法。 - 請求項８に記載の方法において、
前記吸着剤が、活性炭、疎水性吸着剤、親水性吸着剤、またはゼオライトである、方法。 - 請求項８または９に記載の方法において、
前記吸着剤が、活性炭、ポリスチレン／ジビニルベンゼン吸着剤、混合セルロースエステル吸着剤、または疎水性ゼオライト、好ましくはポリスチレン／ジビニルベンゼン吸着剤、混合セルロースエステル吸着剤、または疎水性ゼオライトである、方法。 - 請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法において、
発酵により得られたビールを、ＡｃＨＦＡを吸着可能な吸着剤、好ましくはポリスチレン／ジビニルベンゼン吸着剤、混合セルロースエステル吸着剤、または疎水性ゼオライトと接触させる、方法。
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