JP2022107724A - 操作されたヘム結合性構成物およびその使用 - Google Patents

操作されたヘム結合性構成物およびその使用 Download PDF

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Abstract

【課題】ヘム結合性構成物およびそれらの使用に関する方法、例えば、敗血症および横紋筋融解症などの治療方法を提供する。【解決手段】ヘモペキシンドメインと、リンカー；微生物結合性分子；および／または基質結合性ドメインからなる群より選択される第２ドメインとを含む、操作されたヘム結合性分子であって、第２ドメインがヘモペキシンドメインにコンジュゲートされている、操作されたヘム結合性分子。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2013年5月21日に出願された米国仮出願第61/825,707号の米国特許法第119条(e)の下での恩典を主張し、この内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、配列表を含有する。2015年11月18日に作成された、前記ASCIIコピーは、002806-076886-JP_SL.txtという名称であり、51,140バイトのサイズである。
技術分野
本明細書に記載の技術は、ヘムおよび／またはミオグロビン関連疾患および障害、例えば、敗血症、横紋筋融解症、圧挫損傷などの治療に関する方法および構成物に関する。
背景
敗血症は、重篤な微生物感染症に関係していることが多い致死的な状態である。しかし、多くの仮説が提案されたが、敗血症性ショックの正確な原因は合意されておらず、これらの様々な仮説の源を標的化することに基づく治療法は、全般的に臨床試験において（または臨床試験前に）失敗した。現在の治療は一般に抗生物質の投与を含む。過去の臨床試験は、微生物感染症に対する免疫系反応を制限し、それによって敗血症の原因因子であると仮定された「サイトカインストーム」を減らすことに集中した。加えて、人々はサイトカインを除去するために透析の使用に目を向けた。
概要
ヘムおよび／またはミオグロビン関連疾患および障害、例えば、敗血症および横紋筋融解症の治療に関する方法および構成物を本明細書に記載する。本明細書に記載の技術は、血液中の過剰な遊離ヘムが敗血症の進行において役割を果たし得るという認識に基づいている。敗血症患者または動物において、微生物感染は、赤血球（RBS）溶解の大幅な増加をもたらし得、これは、今度は、血流中の可溶性遊離ヘムの著しい増加をもたらす。この増加は、ヘムの内因性レベルを通常は除去するヘモペキシンの内因性レベルを圧倒し、ヘムの危険なほど高いレベルへ至る。血液中の過剰なヘムは、微生物病原体に容易に利用可能な鉄源を提供し、これは微生物増殖における制限因子であり得、細菌またはウイルス感染が血液と共存する場合、ヘモグロビンおよびヘムは、微生物誘発炎症に実質的に寄与し得る。
本明細書において実証されるように、ヘモペキシン融合タンパク質は、例えば、敗血症を治療するために、対象の血液中の遊離ヘムのレベルを低下させるために使用され得る。一局面において、Fcドメインにコンジュゲートされたヘモペキシンドメインを含むヘム結合性分子および／または構成物を本明細書に記載する。いくつかの態様において、ヘモペキシンドメインは、SEQ ID NO: 2の配列を含むポリペプチドである。いくつかの態様において、ヘモペキシンドメインは、SEQ ID NO: 2の配列を有するポリペプチドである。いくつかの態様において、構成物は、SEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 5の配列を有する。
一局面において、対象の血液と本明細書に記載のヘム結合性分子および／または構成物とを接触させる工程を含む、対象の血液中の遊離ヘムのレベルを減少させる方法を、本明細書に記載する。いくつかの態様において、方法は、接触させる工程の前に対象の血液の一部分を取り出し、接触させる工程を体外で行い、次いで対象の血液の該一部分を対象へ戻す工程をさらに含む。いくつかの態様において、ヘム結合性分子および／または構成物は、体外デバイスの固体基板に結合されている。いくつかの態様において、固体基板はフィルターまたはアフィニティーカラムである。いくつかの態様において、ヘム結合性分子および／または構成物を治療剤として対象へ投与することができる。
一局面において、タンパク質の産生に適した条件下で本明細書に記載のヘム結合性分子および／または構成物をコードする核酸を含む細胞を培養する工程、ならびに安定化ドメイン結合性試薬を用いたアフィニティー精製によって該ヘム結合性分子および／または構成物を精製する工程を含む、ヘム結合性分子および／または構成物を産生する方法を、本明細書に記載する。いくつかの態様において、細胞は微生物細胞または哺乳動物細胞である。
単離されたFc-ヘモペキシン融合物の純度を示すSDSゲルの画像を表す。 遊離ヘミンへのFc-ヘモペキシンおよびFc-ヘモペキシン-NT結合のグラフを表す。 ヘモペキシンのN末端ドメインの変異体を有するFc融合物のヘム結合のグラフを表す。 完全長ヘモペキシンの変異体を有するFc融合物のヘム結合のグラフを表す。 ミオグロビンへのFcヘモペキシン変異体結合のグラフを表す。
詳細な説明
本明細書に記載されるように、本発明者らは、血液中の遊離ヘムを結合するために、あるヘモペキシン融合タンパク質を使用することができることを見出した。従って、これらの融合タンパク質に関する方法および構成物、ならびに、例えば、敗血症の治療のために、血液中のヘムレベルを減少させるためのそれらの使用を、本明細書に提供する。
一局面において、本明細書に記載の本発明は、Fcドメインにコンジュゲートされたヘモペキシンドメインを含むヘム結合性分子および／または構成物に関する。いくつかの態様において、構成物は多量体であり得る。本明細書において使用される場合、「ヘモペキシンドメイン」は、ヘモペキシンポリペプチドまたはその断片を含む本明細書に記載のポリペプチド構成物のドメインまたは部分を指す。「ヘモペキシン（hemopexin）」（「ヘモペキシン（haemopexin）」、「HPX」または「ベータ-1B-糖タンパク質」とも呼ばれる）は、ヘムに対して最も高い公知の親和性を有し、ヘムと複合体を形成するとLRP1受容体と相互作用する、タンパク質を指す。様々な種についてのヘモペキシンの配列が公知である：例えば、ヒトヘモペキシン(NCBI Gene ID: 3263 (SEQ ID NO: 1; NCBI Ref Seq: NP_00604；ポリペプチド)(SEQ ID NO: 6; NCBI Ref Seq: NM_000613；mRNA)。
ヘモペキシンポリペプチドは、SEQ ID NO: 1、またはそのホモログ、変異体および／もしくは機能的断片を含み得る。いくつかの態様において、ヘモペキシンポリペプチドは、SEQ ID NO: 1のアミノ酸24～462（即ち、シグナルペプチド配列が除去された成熟ヘモペキシンポリペプチド）、またはそのホモログ、変異体および／もしくは機能的断片を含み得る。いくつかの態様において、ヘモペキシンドメインは、SEQ ID NO: 1のアミノ酸24～アミノ酸256、またはそのホモログ、変異体および／もしくは機能的断片を含み得る。いくつかの態様において、ヘモペキシンドメインは、SEQ ID NO: 1のアミノ酸27～アミノ酸213、またはそのホモログ、変異体および／もしくは機能的断片を含み得る。いくつかの態様において、ヘモペキシンドメインは、SEQ ID NO: 1のアミノ酸1～アミノ酸213、220、233、もしくは256、またはそのホモログ、変異体および／もしくは機能的断片を含み得る。いくつかの態様において、ヘモペキシンドメインは、SEQ ID NO: 1のアミノ酸24～アミノ酸213、220、233、もしくは256、またはそのホモログ、変異体および／もしくは機能的断片を含み得る。いくつかの態様において、ヘモペキシンドメインは、SEQ ID NO: 1のアミノ酸27～アミノ酸213、220、233、もしくは256、またはそのホモログ、変異体および／もしくは機能的断片を含み得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のヘモペキシンポリペプチドは、本明細書において上述されるアミノ酸配列のホモログ、誘導体、変異体、保存的置換変異体、欠失突然変異体、挿入突然変異体、または機能的断片であり得る。いくつかの態様において、ヘモペキシンドメインは、SEQ ID NO: 1の残基220～226に対応する残基が配列GSGS（SEQ ID NO: 18）で置き換えられている突然変異を含み得る。
いくつかの態様において、ヘモペキシンドメインは、SEQ ID NO: 2のアミノ酸24～アミノ酸256、またはそのホモログ、変異体および／もしくは機能的断片を含み得る。いくつかの態様において、ヘモペキシンドメインは、SEQ ID NO: 2のアミノ酸27～アミノ酸213、またはそのホモログ、変異体および／もしくは機能的断片を含み得る。いくつかの態様において、ヘモペキシンドメインは、SEQ ID NO: 2のアミノ酸1～アミノ酸213、220、233、もしくは256、またはそのホモログ、変異体および／もしくは機能的断片を含み得る。いくつかの態様において、ヘモペキシンドメインは、SEQ ID NO: 2のアミノ酸24～アミノ酸213、220、233、もしくは256、またはそのホモログ、変異体および／もしくは機能的断片を含み得る。いくつかの態様において、ヘモペキシンドメインは、SEQ ID NO: 2のアミノ酸27～アミノ酸213、220、233、もしくは256、またはそのホモログ、変異体および／もしくは機能的断片を含み得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のヘモペキシンポリペプチドは、本明細書において上述されるアミノ酸配列のホモログ、誘導体、変異体、保存的置換変異体、欠失突然変異体、挿入突然変異体、または機能的断片であり得る。いくつかの態様において、ヘモペキシンドメインは、SEQ ID NO: 2の残基220～226に対応する残基が配列GSGS（SEQ ID NO: 18）で置き換えられている突然変異を含み得る。
本明細書において使用される場合、例えばSEQ ID NO: 1の、「機能的断片」は、参照ポリペプチド（即ち、SEQ ID NO: 1）と少なくとも10%同じぐらい強く、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも100%同じぐらい強く、またはそれ以上強く、ヘムに結合することができる、そのポリペプチドの断片またはセグメントである。ヘム濃度およびヘムへのタンパク質の結合を測定するためのアッセイは、当技術分野において周知であり、非限定的な例として、例えば、Airola et al. Biochemistry 2001 49:43217-4338に記載されるような、亜ジチオン酸塩を使用する分光学的滴定；米国特許第4,340,668号に記載のアッセイ；またはSinclair et al. Current Protocols in Toxicology 2001; unit 8.3に記載のアッセイのいずれかを含む。前述の参考文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。機能的断片は、本明細書に開示の配列の保存的置換を含み得る。いくつかの態様において、ヘム結合は、ミオグロビン結合活性を含み得る。
本明細書に記載の単離されたペプチド（例えば、SEQ ID NO: 1～5）の変異体は、天然ヌクレオチドまたはアミノ酸配列、例えば、SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 1を含むペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異によって得ることができる。「変異体」は、本明細書において言及される場合、本明細書に記載のヘモペキシンポリペプチド（例えば、SEQ ID NO: 1および2）に実質的に相同であるが、1つまたは複数の欠失、挿入もしくは置換に起因して本明細書に記載の配列のうちの1つのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドである。
本明細書に記載のヘモペキシンポリペプチドのホモログはまた、本明細書に記載のヘモペキシンポリペプチドによって含まれるヘモペキシンの領域に相同であるアミノ酸配列を含み得る。
変異アミノ酸またはDNA配列は、それが誘導される配列（本明細書において「当初の」配列と呼ばれる）と、好ましくは、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上、同一である。当初の配列と突然変異配列との相同性の程度（パーセント同一性）は、例えば、ワールド・ワイド・ウェブにおいてこの目的のために一般的に用いられている自由に入手可能なコンピュータプログラムを使用して2つの配列を比較することによって、決定することができる。変異アミノ酸またはDNA配列は、それが誘導される配列（本明細書において「当初の」配列と呼ばれる）と、好ましくは、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、またはそれ以上、類似している。当初の配列と突然変異配列との類似性の程度（パーセント類似性）は、例えば、類似性マトリックスを使用することによって、決定することができる。類似性マトリックスは当技術分野において周知であり、類似性マトリックスを使用して2つの配列を比較するための多数のツールが、オンラインで自由に入手可能である：例えば、BLASTp（ワールド・ワイド・ウェブにおいてhttp://blast.ncbi.nlm.nih.govで入手可能）。
当初のアミノ酸配列の変更は、当業者に公知の多数の公知の手法のいずれかによって達成され得る。突然変異は、天然配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位が隣接する、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって、例えば、特定の場所に導入され得る。ライゲーション後、得られた再構築配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有するアナログをコードする。あるいは、オリゴヌクレオチド指定部位特異的変異誘発手順を用いて、必要な置換、欠失、または挿入によって変化させた特定のコドンを有する変化させたヌクレオチド配列を提供することができる。そのような変化を作製する手法としては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981)；ならびに米国特許第4,518,584号および第4,737,462号によって開示されるものが挙げられる。いくつかの態様において、本明細書に記載の単離されたペプチドは、化学合成することができ、突然変異を、化学合成プロセスの一部として組み入れることができる。
変異体は、保存的に置換された配列を含み得、これは、当初のペプチドの1つまたは複数のアミノ酸残基が異なる残基によって置き換えられていること、および、保存的に置換されたペプチドが、当初のペプチドのそれと本質的に等価である、所望の生物学的活性、即ち、ヘムに結合する能力を保持していることを意味する。保存的置換の例としては、全体的もしくは局所的な疎水性特徴を変化させない置換、全体的もしくは局所的な電荷を変化させない置換、等価の側鎖サイズの残基による置換、または類似の反応基を有する側鎖による置換が挙げられる。
例えば1つの脂肪族残基を別の脂肪族残基で（例えば、Ile、Val、Leu、またはAlaを互いに）置換することによって、または1つの極性残基を別の極性残基で（例えば、LysとArg；GluとAsp；またはGlnとAsnとの間で）置換することによって、所定のアミノ酸を類似の生理化学的特徴を有する残基に交換することができる。他のそのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特徴を有する領域全体の置換、または類似の側鎖体積を有する残基の置換も周知である。保存的アミノ酸置換を含む単離されたペプチドは、本明細書の他の箇所に記載のアッセイによって決定されるように、所望の活性、例えば、ヘムに結合する能力が保持されていることを確認するために、本明細書に記載のアッセイのいずれか1つにおいて試験することができる。
アミノ酸はそれらの側鎖の特性における類似性に従ってグループ化することができる（A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)において）：(1)非極性：Ala (A)、Val (V)、Leu (L)、Ile (I)、Pro (P)、Phe (F)、Trp (W)、Met (M)；(2)非荷電極性：Gly (G)、Ser (S)、Thr (T)、Cys (C)、Tyr (Y)、Asn (N)、Gln (Q)；(3)酸性：Asp (D)、Glu (E)；(4)塩基性：Lys (K)、Arg (R)、His (H)。あるいは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループへ分けられ得る：(1)疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、Ala、Tyr、His、Pro、Gly；(3)酸性：Asp、Glu；(4)塩基性：His、Lys、Arg；(5)鎖配向に影響を与える残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe、Pro、His、またはヒドロキシプロリン。非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスのものと交換することを伴う。
本明細書に記載の変異体における使用について特に好ましい保存的置換は、以下の通りである：AlaをGlyへもしくはSerへ；ArgをLysへ；AsnをGlnへもしくはHisへ；AspをGluへもしくはAsnへ；CysをSerへ；GlnをAsnへ；GluをAspへ；GlyをAlaへもしくはProへ；HisをAsnへもしくはGlnへ；IleをLeuへもしくはValへ；LeuをIleへもしくはValへ；LysをArgへ、GlnへもしくはGluへ；MetをLeuへ、TyrへもしくはIleへ；PheをMetへ、LeuへもしくはTyrへ；SerをThrへ；ThrをSerへ；TrpをTyrへもしくはPheへ；TyrをPheへもしくはTrpへ；および／またはPheをValへ、Tyrへ、IleへもしくはLeuへ。一般に、保存的置換は、類似の物理化学的特性のものでの残基交換（即ち、別の疎水性アミノ酸での疎水性残基の置換）を包含する。
本明細書に記載の単離されたペプチドの適切なコンフォメーションの維持には関与しない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化的安定性を改善するため、および異常な架橋形成を防止するために、一般的にはセリンで置換することができる。逆に、その安定性を改善するためまたは多量体化を容易にするために、システイン結合を本明細書に記載の単離されたペプチドに付加することができる。
いくつかの態様において、ヘモペキシンの機能的断片は、SEQ ID NO: 1のおよそアミノ酸24～およそアミノ酸256を含み得る。いくつかの態様において、ヘモペキシンの機能的断片は、SEQ ID NO: 1のアミノ酸24～アミノ酸256、即ち、SEQ ID NO: 2を含む。いくつかの態様において、ヘモペキシンの機能的断片は、SEQ ID NO: 2の配列を有するポリペプチドであり得る。
本明細書において使用される場合、「Fcドメイン」は、Fcポリペプチドを含むポリペプチドのドメイン、パーツまたは部分を指す。本明細書において使用される場合、「Fcポリペプチド」は、Fc受容体および補体系のある成分と相互作用する抗体の領域を指す。所定のタイプの抗体についてのFc領域は、個体においてそのタイプの全ての抗体について一定であるが、抗体のFab領域は変化し、抗原特異性を与える。いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、SEQ ID NO: 7の配列を有するポリペプチド、またはそのホモログ、変異体および／もしくは機能的断片であり得る。いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、SEQ ID NO: 8の配列を有するポリペプチド、またはそのホモログ、変異体および／もしくは機能的断片であり得る。いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、SEQ ID NO: 17の配列を有するポリペプチド、またはそのホモログ、変異体および／もしくは機能的断片であり得る。FCポリペプチドの文脈において、機能的断片は、参照ポリペプチド（即ち、SEQ ID NO: 7）と少なくとも10%同じぐらい強く、例えば、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも90%、少なくとも100%同じぐらい強く、またはそれ以上強く、Fc受容体および／またはC1qに結合することができるまたはFc受容体および／またはC1qによって結合されることができる、そのポリペプチドの断片またはセグメントである。リガンドおよびその受容体の結合についてのアッセイは、当技術分野において周知である。
そのような態様において、Fc領域は、ヒンジ領域、CH2領域、CH3領域、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも1つの領域を含むことができる。一例として、いくつかの態様において、CH2領域は、第2ドメインとしてのFc領域の部分から除外され得る。一態様において、含まれるFc領域は、ヒンジ領域、CH2ドメインおよびCH3ドメインを含む。
いくつかの態様において、Fc領域は、本明細書に記載の操作された分子および構成物の発現および精製を容易にするために使用され得る。N末端Fcは、融合パートナーの発現レベル、タンパク質折り畳みおよび分泌を改善することが示されている。加えて、Fcは、一工程精製プロテインAアフィニティークロマトグラフィーのために使用され得る、ブドウ球菌プロテインA結合部位を有する。Lo KM et al. (1998) Protein Eng. 11: 495-500を参照のこと。さらに、プロテインA結合部位は、カルシウムイオンの非存在下でのプロテインA発現またはプロテインG発現微生物の結合を容易にするために使用することができる。さらに、そのようなFc領域は、腎臓の閾値である約45 kDaを超える分子量を有し、それによって、操作された分子が糸球体濾過によって除去される可能性を低下させる。加えて、Fc領域は、2つの操作されたヘム結合性ドメイン分子を二量体化させ、二量体などの多量体複合体を形成させることができる。
いくつかの態様において、Fc領域またはその断片は、例えば、操作されたヘム結合性分子および／または構成物の性能を変化させるために、少なくとも1つの突然変異を含み得る。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載の操作されたヘム結合性分子および／または構成物の半減期は、例えば、SEQ ID NO. 5の残基224のアミノ酸リジン（K）をアラニン（A）に変異させることによって、増加させることができる。他の突然変異、例えば、Hinton et al (2004) J Biol Chem. 279:6213-6216およびVaccaro C. et al. (2005) Nat Biotechnol. 23: 1283-1288に示されるCH2およびCH3ドメイン間の境界における突然変異もまた、IgG1の半減期を増加させ、従って、操作されたヘム結合性分子および／または構成物の半減期を増加させるために使用することができる。
いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、アグリコシル化（aglycosylated）Fcポリペプチドを生じさせる、N297D突然変異を含み得る。
いくつかの態様において、Fcポリペプチドは、Fc受容体によって結合され、細胞中へ、例えば細胞内区画中へインターナライズされ得る、ポリペプチドである。これは、結合されたヘムを血液から除去し、それを細胞リサイクリング経路へ向けさせることができる。ヘム-ヘモペキシン複合体は、典型的に、CD91媒介性エンドサイトーシスによって血流から除去される。Fc-ヘモペキシン分子は、Fc受容体とのその相互作用を介してのFc含有タンパク質のエンドサイトーシスおよびリサイクリングを利用することによって、このクリアランス率を増加させることができる。
一局面において、ヘモペキシンドメイン、ならびにそれにコンジュゲートされたリンカー、基質結合性ドメイン、および／または微生物結合性分子を含む、操作されたヘム結合性分子を、本明細書に記載する。本明細書において使用される場合、「操作された」は、人の手によって操られた局面を指す。例えば、ポリヌクレオチドは、天然ではその順序で連結されていない2つ以上の配列が、操作されたポリヌクレオチドにおいて互いに直接連結されるように人の手によって操られている場合、「操作された」とみなされる。例えば、本発明のいくつかの態様において、操作された分子は、天然において各々見られるが、天然において同じ転写物中には見られない、複数のドメインを含む。一般的でありかつ当業者によって理解されるように、操作されたポリヌクレオチドの子孫およびコピーは、たとえ実際の操作は先のエンティティーにおいて行われたとしても、典型的に依然として「操作された」と呼ばれる。
ヘム結合性構成物および／または分子の複数のドメインは、リンカーによって連結され得る。さらに、ヘム結合性構成物および／または分子は、リンカーを介して担体足場にコンジュゲートされ得る。従って、本開示において使用される場合、用語「リンカー」は、化合物または分子の2つの部分を接続する部分を意味する。リンカーは、典型的に以下を含む：直接結合、または、原子、例えば、酸素もしくは硫黄、ユニット、例えば、NR1、C(O)、C(O)O、OC(O)O、C(O)NH、NHC(O)O、NH、SS、SO、SO2、SO3、およびSO2NH、または原子の鎖、例えば、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール、ここで、1つまたは複数のメチレンは、O、S、S(O)、SO2、NH、C(O)N(R1)2、C(O)、切断可能な連結基、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、置換もしくは非置換ヘテロ環式によって中断または終結される得；ここで、R1は、水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。いくつかの態様において、リンカーは、コンジュゲートされる分子の2つの部分の（例えば、非共有結合的相互作用による）非共有結合的会合であり得る。いくつかの例示的な非共有結合的相互作用は、イオン相互作用、ファンデルワールス相互作用、双極子間相互作用、水素結合、静電気相互作用、および／または形状認識相互作用である。
いくつかの態様において、リンカーは、少なくとも1つの切断可能な連結基を含むことができる。切断可能な連結基は、1つの一連の条件の下では十分に安定であるが、異なる一連の条件の下では切断され、リンカーがひとまとめにして保持している2つの部分を解放するものである。いくつかの態様において、切断可能な連結基は、第1の参照条件下（例えば、微生物感染条件、例えば微生物感染組織もしくは体液、または環境中で生じる微生物バイオフィルムを模倣または表すよう選択され得る）で、第2の参照条件下（例えば、非感染条件、例えば非感染血液もしくは血清中でまたは非感染環境中で見出される条件を模倣または表すよう選択され得る）よりも、少なくとも10倍またはそれ以上、例えば少なくとも100倍速く切断される。
切断可能な連結基は、切断剤、例えば加水分解、pH、酸化還元電位または分解性分子の存在、に対して易反応性である。一般に、切断剤は、関心対象（例えば、微生物感染）の部位において、非感染領域よりも多く見られるまたは高レベルもしくは高活性で見出される。そのような分解剤の例は：例えば、酸化もしくは還元酵素または還元剤、例えばメルカプタンを含む、特定の基質に対して選択されたまたは基質特異性を有さない、細胞中に存在する、酸化還元切断可能な連結基を還元により分解することができる、酸化還元剤；エステラーゼ；アミダーゼ；エンドソームまたは酸性環境を形成し得る剤、例えば5またはそれ未満のpHにするもの；一般酸として機能することによって酸切断可能な連結基を加水分解または分解することができる酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）およびプロテアーゼ、ならびにホスファターゼを含む。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能な連結基のタイプは、標的となる細胞、臓器または組織に依存し得る。いくつかの態様において、切断可能な連結基は、第1の参照条件下（または微生物感染条件、例えば微生物感染組織もしくは体液、または環境中でもしくは作業表面上で生じる微生物バイオフィルムを模倣するよう選択されたインビトロ条件下）で、第2の参照条件下（または非感染条件、例えば非感染血液もしくは血清中でまたは非感染環境中で見出される条件を模倣するよう選択されたインビトロ条件下）よりも少なくとも1.25、1.5、1.75、2、3、4、5、10、25、50または100倍速く切断される。いくつかの態様において、切断可能な連結基は、微生物感染条件、例えば微生物感染組織もしくは体液または環境中でもしくは作業表面上で生じる微生物バイオフィルムと比較して、非感染条件、例えば非感染血液もしくは血清においてまたは非感染環境中で見出される条件において、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％または1％未満が切断される。
例示的な切断可能な連結基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：加水分解可能なリンカー、酸化還元切断可能な連結基（例えば、-S-S-および-C(R)2-S-S-、ここで、RはHまたはC1～C6アルキルであり、少なくとも1つのRはC1～C6アルキル、例えばCH3またはCH2CH3である）；リン酸ベースの切断可能な連結基（例えば、-O-P(O)(OR)-O-、-O-P(S)(OR)-O-、-O-P(S)(SR)-O-、-S-P(O)(OR)-O-、-O-P(O)(OR)-S-、-S-P(O)(OR)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(OR)-O-、-O-P(O)(R)-O-、-O-P(S)(R)-O-、-S-P(O)(R)-O-、-S-P(S)(R)-O-、-S-P(O)(R)-S-、-O-P(S)(R)-S-、. -O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、および-O-P(S)(H)-S-、ここで、Rは置換されてもよい直鎖または分枝鎖のC1～C10アルキルである）；酸切断可能な連結基（例えば、ヒドラゾン、エステル、ならびにアミノ酸のエステル、-C=NN-および-OC(O)-）；エステルベースの切断可能な連結基（例えば、-C(O)O-）；ペプチドベースの切断可能な連結基（例えば、細胞中の酵素、例えばペプチダーゼおよびプロテアーゼによって切断される連結基、例えば、-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-、ここで、RAおよびRBは2つの隣接するアミノ酸のR基である）。ペプチドベースの切断可能な連結基は、2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、ペプチドベースの切断可能な連結基は、ペプチダーゼまたはプロテアーゼの基質であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、酸切断可能な連結基は、pHが約6.5もしくはそれ未満（例えば、約6.5、6.0、5.5、5.0もしくはそれ未満）の酸性環境下でまたは一般酸として作用し得る酵素等の剤によって切断可能である。
非限定的に、リンカーは、本明細書に開示のヘム結合性分子および／または構成物に対して所望の機能または特性を提供するように選択され得る。例えば、リンカーは、ヘム結合性分子および／または構成物の特定の必要性または使用に従って選択または構成され得る。ほんの一例として、いくつかの態様において、リンカーは、微生物結合性ドメインが微生物に対して所望の配向で配向することを可能にし得るように、十分な長さおよび可撓性を有するように、選択または構成され得る。いくつかの態様において、リンカーは、生物学的活性（例えば、ヘム結合性活性）を保持しながら、少なくとも2つの操作されたヘム結合性分子および／または構成物の多量体化を可能にするように（例えば、二、三、四、五、六またはそれより高次の多量体複合体を形成するように）、選択または構成され得る。いくつかの態様において、リンカーは、第2ドメイン（例えば、Fcドメイン）と相互作用して、ヘム結合性活性を保持しながら、少なくとも2つの操作されたヘム結合性分子および／または構成物の多量体化を可能にするように（例えば、二、三、四、五、六またはそれより高次の多量体複合体を形成するように）、選択または構成され得る。
いくつかの態様において、リンカーは、本明細書に記載の操作されたヘム結合性分子および／または構成物の発現および精製を容易にするように、選択または構成され得る。いくつかの態様において、リンカーは、プロテアーゼまたはヌクレアーゼについての認識部位を提供するよう選択または構成され得る。加えて、リンカーは、本明細書に記載の操作された分子の機能的成分と非反応性であり得る。例えば、ヘム結合性分子および／または構成物のドメインと反応する疎水性または荷電特性が最小限である。いくつかの態様において、リンカーは、ヘム結合性分子および／または構成物のドメインの部分であり得る。
いくつかの態様において、リンカーはペプチドまたは核酸であり得る。いくつかの態様において、ペプチドリンカーは、約1～約1000アミノ酸長、約10～約500アミノ酸長、約30～約300アミノ酸長、または約50～約150アミノ酸長で変化し得る。いくつかの態様において、ペプチジルリンカーは約1アミノ酸～約20アミノ酸長である。いくつかの態様において、核酸リンカーは、約1～約1000ヌクレオチド長、約10～約500ヌクレオチド長、約30～約300ヌクレオチド、または約50～約150ヌクレオチドで変化し得る。より長いまたはより短いリンカー配列も、本明細書に記載の操作されたヘム結合性分子および／または構成物について使用することができる。
ペプチジルリンカーは、グリシン(Gly)、セリン(Ser)、アスパラギン(Asn)、スレオニン(Thr)、メチオニン(Met)またはアラニン(Ala)からなる群より選択されるアミノ酸のうちの少なくとも1つを含む配列を有するように構成され得る。そのようなアミノ酸は、一般に、リンカーの可撓性を提供するために使用される。しかし、いくつかの態様において、他の非荷電極性アミノ酸（例えば、Gln、CysまたはTyr）、非極性アミノ酸（例えば、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、およびTrp）。代替の態様において、極性アミノ酸は、リンカーの可撓性を調節するために追加され得る。当業者は、リンカー中の残基のタイプおよび数を変更することによってリンカーの可撓性を制御することができる。例えば、Perham, 30 Biochem. 8501 (1991); Wriggers et al., 80 Biopolymers 736 (2005)を参照のこと。
いくつかの態様において、ペプチジルリンカーは、1～およそ25のアミノ酸、即ち、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25のアミノ酸を含むことができる。いくつかの態様において、第1ドメインおよび第2ドメインを連結するペプチジルリンカーは、アミノ酸配列HHHHHH（SEQ ID NO: 34）を含む。
いくつかの態様において、ヘム結合性分子および／または構成物がFc領域を含む場合、ヘム結合およびFcドメインを連結するリンカーは、結合またはペプチドではない。
いくつかの態様において、リンカーは結合である。
いくつかの態様において、担体足場にヘム結合性分子および／または構成物をコンジュゲートするリンカーは、ポリエチレングリコールである。リンカーとしての使用についての例示的なPEGとしては、PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG-40Kなどが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、リンカーは、アルブミン、トランスフェリンまたはそれらの断片であり得る。非限定的に、そのようなリンカーは、操作されたヘム結合性分子および／または構成物の血漿中半減期を延長するために使用することができる。従って、操作されたヘム結合性分子および／または構成物は、インビボ投与について有用であり得る。Schmidt SR (2009) Curr Opin Drug Discov Devel. 12: 284を参照のこと。いくつかの態様において、リンカーは、物理的基板、例えば、マイクロ粒子または磁性マイクロビーズであり得る。
第1ドメインと第2ドメインとの間のリンカーは、第1ドメインがヘムと相互作用することを可能にするために十分な、第1ドメインと第2ドメインとの間の距離を提供し得る。従って、いくつかの態様において、第1ドメインと第2ドメインとの間の距離は、約50オングストローム～約5000オングストローム、約100オングストローム～約2500オングストローム、または約200オングストローム～約1000オングストロームの範囲であり得る。
リンカーは任意の形状のものであり得る。例えば、リンカーは、直鎖状、フォールディングされたもの、分枝状であり得る。いくつかの態様において、リンカーは、担体足場の形状をとり得る。いくつかの態様において、リンカーは直鎖状であり得る。いくつかの態様において、リンカーはフォールディングされたものであり得る。いくつかの態様において、リンカーは分枝状であり得る。分枝リンカーについて、分子の各枝は、少なくとも1つのヘム結合性ドメインを含み得る。他の態様において、リンカーは、物理的基板の形状をとる。
いくつかの態様において、ヘム結合性分子および／または構成物は、ヘモペキシンドメインを別の分子、構成物、物理的基板などにコンジュゲートするための官能基を含み得る。例えば、第2ドメインは、ヘム結合性ドメインを別の分子、構成物、物理的基板などと共有結合的に連結するための官能基を含み得る。コンジュゲーションのためのいくつかの例示的な官能基としては、アミノ基、N置換アミノ基、カルボキシル基、カルボニル基、酸無水物基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、エポキシ基、チオール、ジスルフィド基、アルケニル基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、結合対の一方のパートナー、アミド基、アリール基、エステル基、エーテル基、グリシジル基、ハロ基、ヒドリド基、イソシアネート基、尿素基、ウレタン基、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、本明細書に開示のヘム結合性分子および／または構成物は、様々な適用または目的のために担体足場上に固定化され得る。例えば、操作されたヘム結合性分子および／または構成物は、使用時の取り扱いを容易にするために、例えば、単離、観察または顕微鏡イメージングのために、担体足場上に固定化され得る。
担体足場の表面への本明細書に開示のヘム結合性分子および／または構成物の付加は、多数のアプローチによって、例えば、操作されたヘム結合性分子および／または構成物を担体足場表面に直接架橋することによって；検出感度を増大させる配向および濃縮のために核酸マトリックス（例えば、DNAマトリックスもしくはDNA／オリゴヌクレオチド折り紙構造）を介して操作されたヘム結合性分子を担体足場表面に架橋することによって；検出感度を増大させるためにデンドリマー様構造（例えば、PEG／キチン構造）を介してヘム結合性分子および／または構成物を担体足場表面に架橋することによって；収束磁場勾配を担体足場表面に適用しつつ、ヘム結合性分子および／または構成物でコートされた磁性マイクロビーズを担体足場表面へ誘引することによって、ビオチン-アビジンもしくはビオチン-アビジン様相互作用を介して操作されたヘム結合性分子および／または構成物を担体足場へ付加することによって、または当技術分野で知られている任意のその他の方法によって、行うことができる。
非限定的に、2つの分子または構成物の異なる部分をコンジュゲートするための当技術分野で公知の任意のコンジュゲーション化学が、少なくとも1つの操作されたヘム結合性分子および／または構成物を担体足場にコンジュゲートするために使用され得る。少なくとも1つの操作されたヘム結合性分子および／または構成物を基板にコンジュゲートするための例示的なカップリング分子および／または官能基としては、ポリエチレングリコール（PEG、1<X<100の様々な長さXのPEGスペーサーアームを有し得るNH2-PEGx-COOH、例えば、PEG-2K、PEG-5K、PEG-10K、PEG-12K、PEG-15K、PEG-20K、PEG-40K等）、マレイミドコンジュゲート剤、PAS化、HES化、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）コンジュゲート剤、DNAコンジュゲート剤、ペプチドコンジュゲート剤、シランコンジュゲート剤、多糖類コンジュゲート剤、加水分解性コンジュゲート剤およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
操作されたヘム結合性分子および／または構成物が担体足場上に固定化されるまたは担体足場にコンジュゲートされるために、本明細書に記載のヘム結合性分子および／または構成物は、例えば、担体足場表面から離れてヘム結合性ドメインを配向させるのに適している、少なくとも1つ（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20またはそれ以上）の第2ドメインをさらに含み得る。いくつかの態様において、担体足場表面は、固体表面への操作されたヘム結合性分子および／または構成物のコンジュゲーションを容易にするために、カップリング分子で官能化され得る。
従って、いくつかの態様において、第2ドメインは、ヘム結合性ドメインと担体足場または検出可能な標識とをコンジュゲートするための1つまたは複数の官能基を提供するように、選択または構成され得る。ヘム結合性分子を担体足場にコンジュゲートするために適しているドメインは、本明細書において「コンジュゲーションドメイン」とも呼ばれる。本明細書において使用される場合、用語「コンジュゲーションドメイン」は、担体足場への本明細書に記載の操作された分子のコンジュゲーションを容易にする任意の分子またはその部分を指す。
いくつかの態様において、コンジュゲーションドメインの長さは、1アミノ酸残基から約10アミノ酸残基まで、または約2アミノ酸残基から約5アミノ酸残基まで異なり得る。種々の担体足場との結合のためのコンジュゲーションドメインの好適なアミノ酸配列の決定は、十分に当技術分野の技能内である。例えば、1つまたは複数の態様によれば、コンジュゲーションドメインは、ストレプトアビジンへの後の結合のために単一のビオチン化部位を提供する、アミノ酸配列AKT（SEQ ID NO: 35）を含み得る。好ましくは、AKT（SEQ ID NO: 35）は、ヘム結合性分子および／または構成物の末端または末端付近（例えば、末端から10アミノ酸未満以内）にある。いくつかの態様において、コンジュゲーションドメインは、担体足場にヘム結合性分子および／または構成物をコンジュゲートするまたは連結するための官能基を含む。コンジュゲーションのためのいくつかの例示的な官能基としては、アミノ基、N置換アミノ基、カルボキシル基、カルボニル基、酸無水物基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、エポキシ基、チオール、ジスルフィド基、アルケニル基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基、結合対の一方のパートナー、アミド基、アリール基、エステル基、エーテル基、グリシジル基、ハロ基、ヒドリド基、イソシアネート基、尿素基、ウレタン基、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
活性化剤は、コンジュゲートされる要素を活性化するために使用され得る。非限定的に、コンジュゲーション活性化についての当技術分野で公知の任意のプロセスおよび／または試薬が使用され得る。例示的な活性化法または試薬としては、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはEDAC）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、2-(1H-7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファートメタンアミニウム（HATU）、シラン処理、プラズマ処理を通じた表面活性化等を含むがこれらに限定されない。
いくつかの態様において、コンジュゲーションドメインは、担体足場上の官能基と非共有結合的にまたは共有結合的にカップリングされ得る少なくとも1つのアミノ基を含み得る。例えば、アミノ酸残基（例えば、リジンまたはシステイン残基）の第1級アミンが、ヘム結合性分子および／または構成物と担体足場とをコンジュゲートするために使用され得る。いくつかの態様において、ヘム結合性分子および／または構成物のN末端のアミノ基が、ヘム結合性分子および／または構成物と担体足場とをコンジュゲートするために使用され得る。
非限定的に、操作されたヘム結合性分子および／または構成物は、共有結合的もしくは非共有結合的相互作用または共有結合的および非共有結合的相互作用の任意の組み合わせによって担体足場にコンジュゲートされ得る。さらに、コンジュゲーションは、当業者に公知の方法のいずれかによって達成され得る。例えば、共有結合的な固定化は、例えば、シランカップリングを通じて達成され得る。例えば、Weetall, 15 Adv. Mol. Cell Bio. 161 (2008); Weetall, 44 Meths. Enzymol. 134 (1976)を参照のこと。操作されたヘム結合性分子および／もしくは構成物ならびに／またはカップリング分子と表面との間の共有結合的な相互作用はまた、当技術分野で知られているその他の化学反応、例えば、NHS反応またはコンジュゲート剤によって媒介され得る。操作されたヘム結合性分子および／もしくは構成物ならびに／またはカップリング分子と表面との間の非共有結合的な相互作用は、イオン相互作用、ファンデルワールス相互作用、双極子間相互作用、水素結合、静電気相互作用、および／または形状認識相互作用に基づき形成され得る。
非限定的に、コンジュゲーションは、安定または不安定（例えば、切断可能）のいずれかの結合またはコンジュゲート剤を含み得る。例示的なコンジュゲーションとしては、共有結合、アミド結合、炭素・炭素多重結合への付加、アジド・アルキン・ヒュスゲン環化付加、ディールス・アルダー反応、ジスルフィド連結、エステル結合、マイケル付加、シラン結合、ウレタン、求核開環反応；エポキシド、非アルドールカルボニル化学、環化付加反応；1,3-双極子環化付加、温度依存性、照射（IR、近IR、UV）感受性結合またはコンジュゲート剤、pH感受性結合またはコンジュゲート剤、非共有結合（例えば、イオン性電荷錯体形成、水素結合、pi-pi相互作用、シクロデキストリン／アダマントリ（adamantly）・ホスト・ゲスト相互作用）などが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、ヘム結合性分子および／または構成物は、リンカーを用いて担体足場にコンジュゲートされ得る。いくつかの態様において、ヘム結合性分子および／または構成物は、直接結合、原子、例えば、酸素もしくは硫黄、C(O)、C(O)O、OC(O)O、C(O)NH、NHC(O)O、NH、SS、SO、SO2、SO3、およびSO2NHからなる群より選択される連結基を用いて担体足場にコンジュゲートされ得る。
いくつかの態様において、操作されたヘム結合性分子および／または構成物は、カップリング分子対によって担体足場にコンジュゲートされ得る。本明細書において交換可能に使用される「カップリング分子対」および「カップリング対」という用語は、相互に特異的に結合する第1および第2の分子を指す。結合対の一方のメンバーは担体足場とコンジュゲートされ、第2のメンバーはヘム結合性分子および／または構成物とコンジュゲートされる。本明細書において使用される場合、句「相互に特異的に結合する第1および第2の分子」は、カップリング対の第1のメンバーがカップリング対の第2のメンバーに対して、他の分子に対するよりも高い親和性および特異性で結合することを指す。例示的なカップリング分子対は、任意のハプテン性または抗原性化合物と対応する抗体またはその結合部分もしくは断片の組み合わせ（例えば、ジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン；マウス免疫グロブリンおよびヤギ抗マウス免疫グロブリン）ならびに非免疫学的結合対（例えば、ビオチン・アビジン、ビオチン・ストレプトアビジン）、ホルモン（例えば、サイロキシンおよびコルチゾール・ホルモン結合タンパク質）、受容体・受容体アゴニスト、受容体・受容体アンタゴニスト（例えば、アセチルコリン受容体・アセチルコリンまたはそのアナログ）、IgG・プロテインA、レクチン・糖質、酵素・酵素補因子、酵素・酵素阻害剤、ならびに核酸二重鎖を形成することができる相補的なオリゴヌクレオチド対を含むがこれらに限定されない。カップリング分子対はまた、負に荷電した第1の分子と正に荷電した第2の分子を含み得る。
カップリング対コンジュゲーションを使用する1つの例は、ビオチン・アビジンまたはビオチン・ストレプトアビジンコンジュゲーションである。このアプローチにおいて、コンジュゲートされる分子のメンバーの一方（例えば、操作されたヘム結合性分子および／もしくは構成物または担体足場）はビオチン化され、他方はアビジンまたはストレプトアビジンとコンジュゲートされる。タンパク質等の分子のビオチン化に関しては多くの市販のキットが入手可能である。例えば、アミノオキシ-ビオチン（AOB）は、アルデヒドまたはケトン基を有する分子にビオチンを共有結合的に付加するのに使用することができる。いくつかの態様において、AOBが、操作されたヘム結合性分子および／または構成物へ付加される。さらに、本明細書の他の箇所に記載されるように、操作されたヘム結合性分子および／または構成物のN末端のAKT配列（SEQ ID NO: 35）は、操作されたヘム結合性分子および／または構成物を単一部位でビオチン化させ、さらにストレプトアビジンでコートされた固体表面にコンジュゲートさせることが可能である。さらに、ヘム結合性分子および／または構成物は、ビオチンアクセプターペプチド、例えば、AviTagまたはAcceptor Peptide（APと称される；Chen et al., 2 Nat. Methods 99 (2005)）へカップリングされ得る。Acceptor Peptide配列は、大腸菌（E. coli）酵素ビオチンリガーゼ（BirA；同文献）による部位特異的なビオチン化を可能にする。従って、いくつかの態様において、コンジュゲーションドメインは、ビオチンアクセプターペプチドのアミノ酸配列を含む。
カップリング分子対によるコンジュゲーションを使用する別の非限定的な例は、ビオチンサンドイッチ法である。例えば、Davis et al., 103 PNAS 8155 (2006)を参照のこと。このアプローチにおいて、コンジュゲートされる2つの分子はビオチン化され、その後に4価のストレプトアビジンを用いてコンジュゲートされる。コンジュゲーションの別の例は、PLPを介したバイオコンジュゲーションを使用することであろう。例えば、Witus et al., 132 JACS 16812 (2010)を参照のこと。カップリング対コンジュゲーションを使用するさらに別の例は、二本鎖核酸コンジュゲーションである。
このアプローチにおいて、コンジュゲートされる分子のメンバーの一方は二本鎖核酸の第1の鎖とコンジュゲートされ得、そして他方は二本鎖核酸の第2の鎖とコンジュゲートされる。核酸は、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、修飾ヌクレオチドならびに骨格修飾、分枝点および非ヌクレオチド残基、基または架橋を含むヌクレオチドを含む、定義された配列セグメントおよび配列を含み得るがこれらに限定されない。
担体足場はまた、ヘム結合性分子および／または構成物とコンジュゲートするための官能基を含むように官能化され得る。いくつかの態様において、担体足場は、本明細書に記載の操作されたヘム結合性分子および／または構成物と選択的に結合することができるカップリング分子またはその機能的断片を含むように官能化され得る。本明細書において使用される場合、用語「カップリング分子」は、本明細書に記載の操作された微生物表面結合性ドメインと選択的に結合することができる任意の分子または任意の官能基を指す。カップリング分子の代表例は、抗体、抗原、レクチン、タンパク質、ペプチド、核酸（DNA、RNA、PNAおよびそれらの混合物であるかまたはヌクレオチド誘導体もしくはアナログを含む核酸）；受容体分子、例えばインスリン受容体；受容体に対するリガンド（例えば、インスリン受容体に対するインスリン）；ならびに別の分子に対する親和性を有する生物学的、化学的またはその他の分子を含むがこれらに限定されない。
いくつかの態様において、カップリング分子はアプタマーである。本明細書において使用される場合、用語「アプタマー」は、ワトソン・クリック塩基対またはトリプレックス形成以外のメカニズムによって選択された非オリゴヌクレオチド分子または分子群を特異的に認識することができる、一本鎖、部分的に一本鎖、部分的に二本鎖、または二本鎖のヌクレオチド配列を意味する。アプタマーは、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、修飾ヌクレオチドならびに骨格修飾、分枝点および非ヌクレオチド残基、基または架橋を含むヌクレオチドを含む、定義された配列セグメントおよび配列を含み得るが、これらに限定されない。分子との結合のためにアプタマーを選択する方法は、当技術分野で周知であり、当業者が容易に入手することができる。アプタマーは、任意の長さ、例えば、約1ヌクレオチド～約100ヌクレオチド、約5ヌクレオチド～約50ヌクレオチド、または約10ヌクレオチド～約25ヌクレオチドであり得る。
いくつかの態様において、ヘム結合性構成物および／または分子は、治療剤をさらに含み得る。例えば、ヘム結合性構成物および／または分子は、抗微生物剤を含み得る。治療剤は本明細書において下記に記載される。ペプチドに治療剤をコンジュゲートするために当業者に利用可能である任意の方法が、ヘム結合性構成物および／または分子に治療剤をコンジュゲートするために使用され得る。例えば、担体足場に分子をコンジュゲートするために使用される官能基または方法はまた、治療剤に分子をコンジュゲートするために使用され得る。これは、感染症の病巣に治療剤（例えば、抗微生物剤）を送達するまたは濃縮するために有利であり得る。
ヘム結合性分子および／または構成物の複数のドメインは、操作されたヘム結合性分子および／または構成物において任意の所望の配向で配置され得る。例えば、ヘム結合性ドメインのN末端が第2ドメインのC末端に連結され得、またはヘム結合性ドメインのC末端が第2ドメインのN末端に連結され得る。いくつかの態様において、第1ドメインと第2ドメインとのその連結は、リンカーによるものである。
さらに、本明細書に開示される場合、操作されたヘム結合性分子および／または構成物は、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10またはそれ以上のヘム結合性ドメインを含む、少なくとも1つのヘム結合性ドメインを含み得る。2つ以上の第1または第2ドメインが存在する場合、そのようなドメインは全て同じであってもよく、全て異なっていてもよく、またはいくつかが同じでいくつかが異なっていてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に開示の操作されたヘム結合性分子および／または構成物は、2つ以上のヘム結合性ドメインおよび1つの第2ドメインを含む。そのような分子において、一方のヘム結合性ドメインは第2ドメインに連結され得、他方のヘム結合性ドメインは、第2ドメインに連結されたヘム結合性ドメインに連結され得る。あるいは、2つのヘム結合性ドメインが第2ドメインに連結され得、他のヘム結合性ドメインは、第2ドメインに連結された2つのヘム結合性ドメインの一方または両方に連結され得る。
いくつかの態様において、本明細書に開示の操作されたヘム結合性分子および／または構成物は、2つ以上の第2ドメインおよび1つのヘム結合性ドメインを含む。そのような分子において、一方の第2ドメインはヘム結合性ドメインに連結され得、他方の第2ドメインは、ヘム結合性ドメインに連結された第2ドメインに連結され得る。あるいは、2つの第2ドメインがヘム結合性ドメインに連結され得、他の第2ドメインは、ヘム結合性ドメインに連結された2つの第2ドメインの一方または両方に連結され得る。
いくつかの態様において、操作されたヘム結合性分子および／または構成物は、少なくとも2つ（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上）の操作されたヘム結合性分子および／または構成物を含む多量体複合体の形態である。従って、多量体複合体は、二、三、四、五、六またはそれより高次の多量体複合体であり得る。非限定的に、多量体複合体は、第1分子の第2ドメインまたはリンカーと第2分子の第2ドメインまたはリンカーとの相互作用によって形成され得る。そのような相互作用は、共有結合的な連結または非共有結合的な連結を含み得る。多量体複合体中のヘム結合性分子および／または構成物は、全て同じであってもよく、全て異なっていてもよく、またはいくつかが同じでいくつかが異なっていてもよい。
いくつかの態様において、操作されたヘム結合性分子は、基質結合性ドメインをさらに含み得る。基質結合性ドメインの非限定的な例は、FcドメインまたはAKT（SEQ ID NO: 35）を含み得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヘム結合性構成物および／または分子は、例えば、ヘモペキシンドメインを含む分子と組み合わせておよび／またはこれにコンジュゲートされた、微生物結合性ドメインをさらに含み得る。微生物結合性ドメインの非限定的な例は、MBLおよびCRPを含み得る。用語「微生物結合性ドメイン」は、微生物もしくは病原体の表面、例えば、微生物もしくは病原体の表面上に存在する任意の成分、または、微生物もしくは病原体から得られる、微生物もしくは病原体を起源とするまたは微生物もしくは病原体から分泌される任意の物質または成分／断片に特異的に結合することができる、任意の分子またはその断片を指し得る。微生物結合性ドメインにおいて使用することができる分子は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド模倣体、抗体、抗体断片（例えば、抗体の抗原結合性断片）、糖質結合性タンパク質、例えば、レクチン、糖タンパク質、糖タンパク質結合性分子、アミノ酸、糖質（単糖類、二糖類、三糖類および多糖類を含む）、脂質、ステロイド、ホルモン、脂質結合性分子、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸（例えば、DNAもしくはRNA、核酸のアナログおよび誘導体、またはアプタマー）、ペプチドグリカン、リポ多糖類、小分子ならびにそれらの任意の組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。
微生物結合性ドメインを含む構成物および／または分子は、例えば、インビボ、インサイチューもしくはインビトロで試験サンプルから微生物を分離するために使用され得る。一般に、本明細書に開示の微生物結合性分子は、少なくとも1つの微生物に結合するまたはこれらを捕獲することができる。微生物は、無傷のもしくは全体の微生物、または微生物から得られる、微生物を起源とするもしくは微生物から分泌される任意の物質もしくは成分であり得る。微生物から得られる、微生物を起源とするもしくは微生物から分泌される任意の物質もしくは成分はまた、本明細書において「微生物物質」と呼ばれる。従って、本明細書に開示の微生物結合性分子は、無傷のもしくは全体の微生物、または微生物から得られる、微生物を起源とするまたは微生物から分泌される微生物物質に結合する／これらを捕獲することができる。微生物結合性分子に結合することができる例示的な微生物物質としては、細胞壁成分、外膜、細胞膜、リボソーム、微生物莢膜、線毛または鞭毛、上記の微生物成分の任意の断片、微生物から得られる任意の核酸（例えば、16SリボソームDNAを含むDNA、およびRNA）、ならびに微生物内毒素（例えば、リポ多糖類）などが挙げられ得るが、これらに限定されない。加えて、微生物物質は、宿主または環境に対して有害な作用（例えば、毒性）をもたらし得る非生存性の微生物物質を包含し得る。用語「微生物結合性分子」および「微生物標的化分子」は、本明細書において交換可能に使用される。
本明細書に記載の様々な態様によれば、分子は、C反応性タンパク質（CRP）の少なくとも一部分を含む少なくとも1つの微生物結合性ドメイン、および少なくとも1つのヘモペキシンドメインを含み得る。いくつかの態様において、2つのドメインはリンカーを介してコンジュゲートされ得る。微生物結合性ドメインアミノ酸配列に加えて、分子は、微生物結合性配列のN-またはC-末端上に1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上）のアミノ酸をさらに含み得る。一般に、微生物結合性ドメインは約10～約300アミノ酸残基のアミノ酸配列を有し得る。いくつかの態様において、微生物結合性ドメインは約50～約250アミノ酸残基のアミノ酸配列を有し得る。いくつかの態様において、微生物結合性ドメインは、少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約15、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約80、少なくとも約90、少なくとも約100アミノ酸残基またはそれ以上のアミノ酸配列を有し得る。微生物結合性ドメインの任意の公知の配列について、当業者は、微生物結合活性を保持するためにアミノ酸配列の最適な長さを決定することができる。
C反応性タンパク質（CRP）は、グラム陽性微生物と結合することができ、微生物を捕獲／検出するために使用され得る。本明細書において使用される場合、「CRP」は、完全長CRPまたは微生物結合活性を保持しているその断片を含み得る。非限定的に、CRPは、当業者に入手可能な任意の供給源に由来し得る。例えば、CRPは哺乳動物供給源に由来し得る。例えば、CRPはヒトCRP（NCBI Reference Sequence: NP_000558.2）またはマウスCRP（NCBI Reference Sequence: NP_031794.3）であり得る。いくつかの態様において、第1ドメインは、ヒトのアミノ酸19～224を含むアミノ酸配列を含む。CRPは、当技術分野において、例えば、2013年12月18日に出願された米国特許出願公開第61/917,705号において、さらに記載されている。
いくつかの態様において、微生物結合性ドメインは、微生物もしくは病原体の表面、または微生物物質に特異的に結合することができる分子またはその断片を模倣するペプチド模倣体を含み得る。例えば、微生物結合性ドメインは、糖質認識ドメインまたはその断片、例えば、MBLの糖質認識ドメインまたはその断片を模倣するペプチド模倣体を含み得る。
いくつかの態様において、微生物結合性ドメインは、糖質結合性タンパク質の糖質認識ドメインまたはその断片であり得る。用語「糖質認識ドメイン」は、本明細書において使用される場合、その少なくとも一部分が微生物または病原体の表面上の糖質に結合することができる領域を指す。いくつかの態様において、第2ドメインは、微生物表面上の糖質に結合することができる、完全長CRDの少なくとも約50%、例えば、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%またはそれ以上を含み得る。いくつかの態様において、糖質認識ドメインの100%が、微生物または病原体への結合に使用され得る。他の態様において、糖質認識ドメインは、糖質に結合できないが他の特徴を有し得るまたは他の機能を発揮し得る、例えば微生物または病原体と相互作用する際に糖質認識ドメインに可撓性を提供する、追加の領域を含み得る。
例示的な糖質結合性タンパク質としては、レクチン、コレクチン、フィコリン、マンノース結合レクチン（MBL）、マルトース結合タンパク質、アラビノース結合タンパク質、およびグルコース結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の微生物結合性ドメインに含まれ得る追加の糖質結合性タンパク質としては、植物から得られるレクチンまたは凝集素、例えばガランサス（スノードロップ）植物由来のガランサス・ニバリス（Galanthus nivalis）凝集素（GNA）、およびピーナツレクチンレクチンが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ペントラキシンファミリーのメンバー（例えば、C反応性タンパク質）もまた、糖質結合性タンパク質として使用され得る。ペントラキシンファミリーのメンバーは、一般に、莢膜に覆われた微生物に結合することができる。非限定的に、糖質結合性タンパク質は、野生型、組換えまたは融合タンパク質であり得る。そのような糖質結合性タンパク質の各々の糖質認識ドメインは当技術分野で公知であり、そしてこれらは本明細書に記載の操作された微生物結合性分子の様々な態様のために改変され得る。
当技術分野で知られている任意の組換え糖質結合性タンパク質または糖質認識ドメインが、操作された分子において使用することができる。例えば、本明細書に記載の分子および構成物を構築する上で、組換えマンノース結合レクチン、例えば、非限定的に、それらの全ての内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,270,199号；同第6,846,649号；米国特許出願公開第US 2004/0229212号；および2011年1月19日に出願されたPCT出願第WO 2011/090954号に開示されるものを使用することができる。
いくつかの態様において、CRDは、コレクチンファミリータンパク質のメンバーであるMBLに由来する。天然MBLは、各々が3つの同一のポリペプチド鎖を含むサブユニットから構成される多量体構造（例えば、約650 kDa）である。各々のMBLポリペプチド鎖（シグナル配列を含めて248アミノ酸残基長を含む）は、N末端システインリッチ領域、コラーゲン様領域、ネック領域および糖質認識ドメイン（CRD）を含む。各領域の配列は同定されており、当技術分野で周知であり、例えば、ヒトMBLは、NCBI BLASTデータベースにおいてアクセッション番号NP_000233として入手可能である。ヒトMBLのCRDは、NP_000233のアミノ酸114～248を含む。いくつかの態様において、操作されたMBL分子の糖質認識ドメインはCRDの断片を含み得る。そのような断片の例示的なアミノ酸配列としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ND（SEQ ID NO. 29）、EZN（SEQ ID NO. 30：ここで、Zは任意のアミノ酸、例えばPである）、
Figure 2022107724000002
またはEZN（SEQ ID NO: 30）を含むその断片、GSDEDCVLL（SEQ ID NO. 32）またはEを含むその断片、および
Figure 2022107724000003
またはND（SEQ ID NO: 29）を含むその断片。そのようなCRD断片に対する修飾、例えば保存的置換による修飾もまた、本明細書に記載される範囲に含まれる。いくつかの態様において、本明細書に記載の操作された分子において使用されるMBLまたはその断片は、野生型分子または組換え分子であり得る。
いくつかの状況において、糖質結合性タンパク質またはその断片によって誘導される補体活性化または凝固活性化は、様々な用途、例えば、敗血症の治療のためのインビボ投与、によっては望ましくないものであり得る。そのような態様において、糖質結合性タンパク質の追加の部分は、補体および凝固活性化領域の少なくとも1つを除外し得る。一例として、糖質結合性タンパク質がマンノース結合レクチンまたはその断片である場合、マンノース結合レクチンまたはその断片は、コラーゲン様領域に位置する補体および凝固活性化領域の少なくとも1つを除外し得る。そのような態様において、マンノース結合レクチンまたはその断片は、MBL（例えば、NCBI Ref Seq: NP_000233）のアミノ酸残基K55またはL56の周囲の、少なくとも約2つのアミノ酸残基、少なくとも約3つのアミノ酸残基、少なくとも約4つのアミノ酸残基、少なくとも約5つのアミノ酸残基、少なくとも約6つのアミノ酸残基、少なくとも約7つのアミノ酸残基、少なくとも約8つのアミノ酸残基、少なくとも約9つのアミノ酸残基、少なくとも約10のアミノ酸残基またはそれ以上を含む、少なくとも約1つのアミノ酸残基を除外し得る。本明細書に記載の操作された分子または構成物から除外され得るMBLのK55またはL56を含む例示的なアミノ配列は、
Figure 2022107724000004
またはそれらの任意の断片を含むがこれらに限定されない。
いくつかの態様において、糖質結合性タンパク質の追加の部分は、補体系を活性化することができる。代替の態様において、糖質結合性タンパク質の追加の部分は、補体系を活性化することができない。いくつかの態様において、糖質結合性タンパク質の追加の部分は、それが補体系を活性化しないように、選択、構成、または修飾され得る。
いくつかの態様において、微生物結合性ドメインは、レクチン由来のネック領域またはその断片を含み得る。レクチンのネック領域とは、CRDと分子の残りとを接続するレクチンの部分を意味する。理論に拘束されることを望まないが、ネック領域は、微生物表面に結合するための可撓性および適切な配向を提供することができる。本明細書に開示の微生物結合性分子がネック領域および追加の第2ドメインを含む場合、ネック領域は、第1ドメインと追加の第2ドメインとの間に配置され得、即ち、ネック領域は、第1ドメインと追加の第2ドメインとを連結するためのリンカーとして機能し得る。いくつかの態様において、第2ドメインは、ネック領域のNまたはC末端上に1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上）の追加のアミノ酸を含み得る。いくつかの態様において、ネック領域は、アミノ酸配列
Figure 2022107724000005
を含む。
微生物結合性ドメインに対する修飾、例えば保存的置換による修飾もまた、本明細書に記載される範囲内に含まれる。いくつかの態様において、本明細書に記載される分子において使用される微生物結合性ドメインまたはその断片は、野生型分子または組換え分子であり得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載されるような分子および／または構成物は、検出可能な標識をさらに含み得る。本明細書において使用される場合、用語「検出可能な標識」は、標的の存在を示す検出可能なシグナルを発生させることができる構成物を指す。検出可能な標識は、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の構成物を含む。適当な標識は、蛍光分子、放射性同位元素、ヌクレオチド発色団、酵素、基質、化学発光部分、生物発光部分等を含む。従って、標識は、本明細書に記載される方法および装置に必要とされる分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の構成物である。
いくつかの態様において、検出可能な標識は、画像化剤または造影剤であり得る。本明細書において使用される場合、用語「画像化剤」は、状態、病理学的な障害、および／または疾患の存在および／または進行の検出、画像化、および／またはモニタリングを可能にする、分子中の元素または官能基を指す。画像化剤は、エコー源性物質（液体またはガス）、非金属同位体、光学レポーター、ホウ素中性子吸収体、常磁性金属イオン、強磁性金属、ガンマ線放射性同位体、陽電子放射性同位体、またはx線吸収体であり得る。本明細書において使用される場合、用語「造影剤」は、分子を含有する組織または臓器の光学的性質を変える任意の分子を指す。変えられ得る光学的性質としては、吸光度、反射率、蛍光、複屈折、光学散乱などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、検出可能な標識はまた、例えば感染の診断のために、対象における組織または臓器の画像化または可視化を容易にすることができる任意の画像化剤（例えば、泡状体、リポソーム、球体、造影剤、または本明細書に記載される任意の検出可能な標識であるがこれらに限定されない）も包含する。
好適な光学レポーターとしては、蛍光レポーターおよび化学発光基が挙げられるが、これらに限定されない。幅広い蛍光レポーター色素が当技術分野で公知である。典型的に、発蛍光団は、芳香族または複素環式芳香族化合物であり、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール、ベンズインドール、オキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、シアニン、カルボシアニン、サリチル酸塩／エステル、アントラニル酸塩／エステル、クマリン、フルオレセイン、ローダミンなどの化合物であり得る。
例示的な発蛍光団は、1,5 IAEDANS；1,8-ANS；4-メチルウンベリフェロン；5-カルボキシ-2,7-ジクロロフルオレセイン；5-カルボキシフルオレセイン（5-FAM）；5-カルボキシナフトフルオレセイン（pH 10）；5-カルボキシテトラメチルローダミン（5-TAMRA）；5-FAM（5-カルボキシフルオレセイン）；5-ヒドロキシトリプタミン（HAT）；5-ROX（カルボキシ-X-ローダミン）；5-TAMRA（5-カルボキシテトラメチルローダミン）；6-カルボキシローダミン6G；6-CR 6G；6-JOE；7-アミノ-4-メチルクマリン；7-アミノアクチノマイシンD（7-AAD）；7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン；9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン；ABQ；酸性フクシン；ACMA（9-アミノ-6-クロロ-2-メトキシアクリジン）；アクリジン オレンジ；アクリジン レッド；アクリジン イエロー；アクリフラビン；アクリフラビン フォイルゲンSITSA；エクオリン（光タンパク質）；Alexa Fluor 350（商標）；Alexa Fluor 430（商標）；Alexa Fluor 488（商標）；Alexa Fluor 532（商標）；Alexa Fluor 546（商標）；Alexa Fluor 568（商標）；Alexa Fluor 594（商標）；Alexa Fluor 633（商標）；Alexa Fluor 647（商標）；Alexa Fluor 660（商標）；Alexa Fluor 680（商標）；アリザリン コンプレクソン；アリザリン レッド；アロフィコシアニン（APC）；AMC、AMCA-S；AMCA（アミノメチルクマリン）；AMCA-X；アミノアクチノマイシンD；アミノクマリン；アニリン ブルー；アントロシルステアレート（anthrocyl stearate）；APC-Cy7；APTS；アストラゾン ブリリアント レッド4G；アストラゾン オレンジR；アストラゾン レッド6B；アストラゾン イエロー7GLL；アタブリン；ATTO-TAG（商標）CBQCA；ATTO-TAG（商標）FQ；オーラミン；オーロホスフィン（Aurophosphine）G；オーロホスフィン；BAO 9（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）；BCECF（高pH）；BCECF（低pH）；硫酸ベルベリン；ベータ ラクタマーゼ；BFPブルーシフトGFP（Y66H）；BG-647；ビマン；ビスベンズアミド；ブランコフォアFFG；ブランコフォアSV；BOBO（商標）-1；BOBO（商標）-3；ボディピー492/515；ボディピー493/503；ボディピー500/510；ボディピー505/515；ボディピー530/550；ボディピー542/563；ボディピー558/568；ボディピー564/570；ボディピー576/589；ボディピー581/591；ボディピー630/650-X；ボディピー650/665-X；ボディピー665/676；ボディピーFl；ボディピーFL ATP；ボディピーFl-セラミド；ボディピーR6G SE；ボディピーTMR；ボディピーTMR-Xコンジュゲート；ボディピーTMR-X、SE；ボディピーTR；ボディピーTR ATP；ボディピーTR-X SE；BO-PRO（商標）-1；BO-PRO（商標）-3；ブリリアント スルホフラビンFF；カルセイン；カルセイン ブルー；カルシウム クリムゾン（商標）；カルシウム グリーン；カルシウム グリーン-1 Ca2+ 色素；カルシウム グリーン-2 Ca2+；カルシウム グリーン-5N Ca2+；カルシウム グリーン-C18 Ca2+；カルシウム オレンジ；カルコフロール ホワイト；カルボキシ-X-ローダミン（5-ROX）；カスケード ブルー（商標）；カスケード イエロー；カテコールアミン；CFDA；CFP-シアン蛍光タンパク質；クロロフィル；クロモマイシンA；クロモマイシンA；CMFDA；セレンテラジン；セレンテラジンcp；セレンテラジンf；セレンテラジンfcp；セレンテラジンh；セレンテラジンhcp；セレンテラジンip；セレンテラジンO；クマリンファロイジン；CPMメチルクマリン；CTC；Cy2（商標）；Cy3.1 8；Cy3.5（商標）；Cy3（商標）；Cy 5.1 8；Cy5.5（商標）；Cy5（商標）；Cy7（商標）；シアンGFP；環状AMPフルオロセンサー（FiCRhR）；d2；ダブシル；ダンシル；ダンシルアミン；ダンシル カダベリン；ダンシルクロリド；ダンシルDHPE；ダンシルフルオリド；DAPI；ダポキシル（Dapoxyl）；ダポキシル2；ダポキシル3；DCFDA；DCFH（ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸塩）；DDAO；DHR（ジヒドロローダミン123）；ジ-4-ANEPPS；ジ-8-ANEPPS（非放射性）；DiA（4-ジ-16-ASP）；DIDS；ジヒドロローダミン123（DHR）；DiO（DiOC18(3)）；DiR；DiR（DiIC18(7)）；ドパミン；DsRed；DTAF；DY-630-NHS；DY-635-NHS；EBFP；ECFP；EGFP；ELF97；エオシン；エリスロシン；エリスロシンITC；エチジウムホモダイマー-1（EthD-1）；ユークリシン（Euchrysin）；塩化ユーロピウム（III）；ユーロピウム；EYFP；ファスト ブルー；FDA；フォイルゲン（パラローザリニン）；FITC；FL-645；フラゾ オレンジ；Fluo-3；Fluo-4；フルオレセイン二酢酸塩；フルオロ エメラルド；フルオロ ゴールド（ヒドロキシスチルバミジン）；Fluor-Ruby；FluorX；FM 1-43（商標）；FM 4-46；Fura Red（商標）（高pH）；Fura-2、高カルシウム；Fura-2、低カルシウム；ゲナクリル（Genacryl）ブリリアント レッドB；ゲナクリル ブリリアント イエロー10GF；ゲナクリル ピンク3G；ゲナクリル イエロー5GF；GFP（S65T）；GFPレッドシフト（rsGFP）；GFP野生型、非UV励起（wtGFP）；GFP野生型、UV励起（wtGFP）；GFPuv；グリオキサール酸（Gloxalic Acid）；グラニュラー ブルー；ヘマトポルフィリン；ヘキスト33258；ヘキスト33342；ヘキスト34580；HPTS；ヒドロキシクマリン；ヒドロキシスチルバミジン（フルオロ ゴールド）；ヒドロキシトリプタミン；インドジカルボシアニン（DiD）；インドトリカルボシアニン（DiR）；イントラホワイトCf；JC-1；JO-JO-1；JO-PRO-1；レーザープロ；ラロダン（Laurodan）；LDS 751；ロイコホール（Leucophor）PAF；ロイコホールSF；ロイコホールWS；リサミンローダミン；リサミンローダミンB；LOLO-1；LO-PRO-1；ルシファー イエロー；マグ グリーン；マグダラ レッド（フロキシンB）；マグネシウム グリーン；マグネシウム オレンジ；マラカイト グリーン；マリーナ ブルー；マキシロン（Maxilon）ブリリアント フラビン10GFF；マキシロン ブリリアント フラビン8GFF；メロシアニン；メトキシクマリン；ミトトラッカー グリーンFM；ミトトラッカー オレンジ；ミトトラッカー レッド；ミトラマイシン；モノブロモビマン；モノブロモビマン（mBBr-GSH）；モノクロロビマン；MPS（メチルグリーンピロニンスチルベン）；NBD；NBDアミン；ナイル レッド；ニトロベンゾオキサジドール（Nitrobenzoxadidole）；ノルアドレナリン；ニュークリア（Nuclear）ファスト レッド；ニュークリア イエロー；ナイロサン ブリリアント イアビン（Nylosan Brilliant Iavin）E8G；オレゴン グリーン（商標）；オレゴン グリーン488-X；オレゴン グリーン（商標）488；オレゴン グリーン（商標）500；オレゴン グリーン（商標）514；パシフィック ブルー；パラローザリニン（フォイルゲン）；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；PE-テキサス レッド（レッド613）；フロキシンB（マグダラ レッド）；フォーワイト（Phorwite）AR；フォーワイトBKL；フォーワイトRev；フォーワイトRPA；ホスフィン3R；フォトレジスト；フィコエリトリンB［PE］；フィコエリトリンR［PE］；PKH26；PKH67；PMIA；ポントクロム（Pontochrome）ブルーブラック；POPO-1；POPO-3；PO-PRO-1；PO-PRO-3；プリムリン；プロシオン イエロー；ヨウ化プロピジウム（Propidium Iodid）（PI）；PyMPO；ピレン；ピロニン；ピロニンB；ピロザル（Pyrozal）ブリリアント フラビン7GF；QSY 7；キナクリン マスタード；レゾルフィン；RH 414；Rhod-2；ローダミン；ローダミン110；ローダミン123；ローダミン5GLD；ローダミン6G；ローダミンB540；ローダミンB200；ローダミンBエクストラ；ローダミンBB；ローダミンBG；ローダミン グリーン；ローダミン ファリシジン（Phallicidine）；ローダミン ファロイジン；ローダミン レッド；ローダミンWT；ローズベンガル；R-フィコエリトリン（PE）；レッドシフトGFP（rsGFP、S65T）；S65A；S65C；S65L；S65T；サファイアGFP；セロトニン；セブロン（Sevron）ブリリアント レッド2B；セブロン ブリリアント レッド4G；セブロン ブリリアント レッドB；セブロン オレンジ；セブロン イエローL；sgBFP（商標）；sgBFP（商標）（スーパーグローBFP）；sgGFP（商標）；sgGFP（商標）（スーパーグローGFP）；SITS；SITS（プリムリン）；SITS（スチルベンイソチオスルホン酸）；SPQ（6-メトキシ-N-(3-スルホプロピル)-キノリニウム）；スチルベン；スルホローダミンBおよびC；スルホローダミンGエクストラ；テトラサイクリン；テトラメチルローダミン；テキサス レッド（商標）；テキサス レッド-X（商標）コンジュゲート；チアジカルボシアニン（DiSC3）；チアジン レッドR；チアゾール オレンジ；チオフラビン5；チオフラビンS；チオフラビンTCN；チオライト（Thiolyte）；チオゾール オレンジ；チノポール（Tinopol）CBS（カルコフロール ホワイト）；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；トリカラー（TriColor）（PE-Cy5）；TRITC（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）；トゥルー ブルー（True Blue）；トゥルー レッド；ウルトラライト（Ultralite）；ウラニンB；ユービテックス（Uvitex）SFC；wtGFP；WW 781；XL665；X-ローダミン；XRITC；キシレン オレンジ；Y66F；Y66H；Y66W；イエローGFP；YFP；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1；およびYOYO-3を含むがこれらに限定されない。これらの蛍光化合物の多くの適当な形態が入手可能でありかつ使用することができる。
他の例示的な検出可能な標識は、発光および生物発光マーカー（例えば、ビオチン、ルシフェラーゼ（例えば、細菌、ホタル、コメツキムシ等）、ルシフェリンおよびエクオリン）、放射性標識（例えば、3H、125I、35S、14Cまたは32P）、酵素（例えば、ガラクトシダーゼ、グルコリニダーゼ、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、ペルオキシダーゼ（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）およびコリンエステラーゼ）ならびに比色標識、例えば、金コロイドまたは有色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレンおよびラテックス）ビーズを含む。そのような標識の使用について教示する特許は、米国特許第3,817,837号、同第3,850,752号、同第3,939,350号、同第3,996,345号、同第4,277,437号、同第4,275,149号および同第4,366,241号を含み、これらの各々は参照により本明細書に組み入れられる。
好適なエコー源性ガスとしては、六フッ化硫黄またはパーフルオロカーボンガス、例えばパーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロシクロブタン、パーフルオロペンタン、もしくはパーフルオロヘキサンが挙げられるが、これらに限定されない。好適な非金属同位体としては、11C、14C、13N、18F、123I、124I、および125Iが挙げられるが、これらに限定されない。好適な放射性同位体としては、99mTc、95Tc、111In、62Cu、64Cu、Ga、68Ga、および153Gdが挙げられるが、これらに限定されない。好適な常磁性金属イオンとしては、Gd(III)、Dy(III)、Fe(III)、およびMn(II)が挙げられるが、これらに限定されない。好適なX線吸収体としては、Re、Sm、Ho、Lu、Pm、Y、Bi、Pd、Gd、La、Au、Au、Yb、Dy、Cu、Rh、Ag、およびIrが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、放射性核種が、ヘム結合性分子および／または構成物へ付加されたキレート剤またはキレート剤-リンカーに結合される。直接コンジュゲーションについての好適な放射性核種としては、非限定的に、18F、124I、125I、131I、およびその混合物が挙げられる。キレート剤と共の使用についての好適な放射性核種としては、非限定的に、47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi、およびその混合物が挙げられる。好適なキレート剤としては、DOTA、BAD、TETA、DTPA、EDTA、NTA、HDTA、それらのホスホネートアナログ、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、放射性核種、キレート剤、およびキレート剤-リンカーを分子、例えば、本明細書に開示のヘム結合性分子および／または構成物ならびに担体足場へ付加するための方法に精通していると考えられる。
そのような標識を検出する手段は、当業者に周知である。従って、例えば、放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出され得、蛍光マーカーは、発せられた光を検出する光検出器を用いて検出され得る。酵素標識は、典型的に、その酵素に酵素基質を提供し、酵素基質に対するその酵素の作用によって生じた反応生成物を検出することによって検出され、そして比色標識は、有色の標識を可視化することによって検出され得る。検出可能な標識のインビボ検出または画像化のための例示的な方法としては、X線撮影法、磁気共鳴画像法（MRI）、陽電子断層撮影法（PET）、単一光子放射断層撮影（SPECT、または一般的ではないが、SPET）、シンチグラフィ、超音波、CATスキャン、光音響イメージング、サーモグラフィ、リニア断層撮影法、多重断層撮影法、狭角断層撮影法、オルソパントモグラフィー（OPTまたはOPG）、およびコンピュータ断層撮影（CT）、またはコンピュータX線体軸断層撮影（CATスキャン）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、検出可能な標識は酵素を含み得る。検出可能な標識としての使用のための例示的な酵素としては、ホースラディシュペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AP）、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、検出可能な標識は、検出可能な物質にコンジュゲートされた酵素基質（例えば、微生物酵素基質）を含み得る。例えば、検出可能な物質は、酵素によって酵素基質から切断された際に、検出可能な部分を形成するが、そのコンジュゲートされた状態では検出可能ではない、任意の部分であり得る。酵素基質、例えば、微生物酵素基質は、検出される微生物の1つまたは複数のタイプに特異的な基質であり得、それはその微生物がどのような酵素を保持または分泌するかに依存して選択され得る。例えば、微生物の検出におけるそのような検出可能な標識の使用に関して、その内容が参照により本明細書に組み入れられる国際特許出願：WO 2011/103144を参照のこと。
いくつかの態様において、検出可能な標識は発蛍光団または量子ドットである。理論に拘束されることを望まないが、蛍光試薬を使用することで、画像化／読み取りの際のシグナル対ノイズを小さくし、それによって感度を維持することができる。いくつかの態様において、検出可能な標識は金粒子である。
いくつかの態様において、検出可能な標識は、ヘム結合性分子および／または構成物とコンジュゲートしているときは検出不可能であるが、酵素、例えば微生物酵素の存在下で操作された分子から放出された際には色変化を生じる「スマート標識（smart label）」を含むよう構成され得る。従って、微生物が操作された分子に結合した際、微生物は、操作された分子から検出可能な標識を放出させる酵素を放出する。色変化の観察は、サンプル中の微生物の存在を示す。いくつかの態様において、検出可能な標識は、操作された微生物標的化分子に微生物が結合したときに、微生物の放出する酵素が検出可能な標識と相互作用し色変化を誘導することができるような、比色性または発蛍光性の微生物酵素基質であり得る。そのような微生物酵素基質の例としては、インドキシルブチレート、インドキシルグルコシド、エスクリン、マグネタグルコシド（magneta glucoside）、赤色β-グルクロニド、2-メトキシ-4-(2-ニトロビニル)フェニルβ-D-グルコピラノシド、2-メトキシ-4-(2-ニトロビニル)フェニルβ-D-セトアミド（cetamindo）-2-デオキシグルコピラノシド、および当技術分野で知られている任意のその他の微生物酵素基質が挙げられ得るが、これらに限定されない。そのような態様は、微生物もしくは病原体または酵素の存在の指標として機能し得る。
一局面において、対象の血液と、本明細書に記載のヘム結合性構成物とを接触させる工程を含む、対象の血液中の遊離ヘムのレベルを減少させる方法を、本明細書に記載する。いくつかの態様において、方法は、対象に前記構成物を投与する工程を含み得る。いくつかの態様において、方法は、接触させる工程の前に対象の血液の一部分を取り出し、接触させる工程を体外で行い、次いで対象の血液の該一部分を対象へ戻す工程を含み得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヘム結合性構成物、例えば、本明細書に記載のヘモペキシンポリペプチドを含む構成物は、ミオグロビンに結合することができる。
一局面において、対象の血液と、本明細書に記載のヘム結合性構成物とを接触させる工程を含む、対象の血液中の遊離ミオグロビンのレベルを減少させる方法を、本明細書に記載する。いくつかの態様において、方法は、対象に前記構成物を投与する工程を含み得る。いくつかの態様において、方法は、接触させる工程の前に対象の血液の一部分を取り出し、接触させる工程を体外で行い、次いで対象の血液の該一部分を対象へ戻す工程を含み得る。
いくつかの態様において、対象に本明細書に記載のヘム結合性分子および／または構成物を投与することによって、対象における例えば、圧挫損傷および／または横紋筋融解症を治療する方法を、本明細書に記載する。横紋筋融解症は、多数の原因、例えば、圧挫損傷、感染症、毒素などから生じ得、腎臓障害を引き起こし得る。いくつかの態様において、投与は、対象の血液とヘム結合性分子および／または構成物とを接触させる工程を含み得る。いくつかの態様において、方法は、対象に前記分子および／または構成物を投与する工程を含み得る。いくつかの態様において、方法は、接触させる工程の前に対象の血液の一部分を取り出し、接触させる工程を体外で行い、次いで対象の血液の該一部分を対象へ戻す工程を含み得る。
いくつかの態様において、体外デバイスは、例えば、国際特許公開公報第WO2012/135834号および同第WO2011/091037号に記載されるようなデバイスであり；これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。血液濾過のためのさらなる体外デバイスおよびそれらを構築するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、国際特許公開公報第PCT/US04/012911号；同第PCT/US05/065126号；同第PCT/US04/040923号；同第PCT/SE87/006471号；同第PCT/IB11/056000号；同第PCT/US90/006924号；同第PCT/US06/0016747号；同第PCT/JP10/072557号；米国特許出願公開第2011/0272343号；同第2012/0220915号ならびに米国特許第3,954,623号；同第7,059,480号；同第7,217,365号；同第7,014,648号；同第4,517,090号；同第7,488,302号；同第7,332,096号を参照のこと；これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。非限定的な例として、デバイスは、血液除去手段、例えば、注射針および付属のチューブ、濾過ユニット、ならびに血液返送手段、例えば、第2のチューブおよび注射針を含み得る。濾過ユニットは、大きな表面積を有する基板、例えば、フィルター、カラム、メンブレン、多孔性表面、チャネルなどを含み得る。血液濾過デバイスは、任意でさらに、ポンプ、シリンジ、血液貯蔵コンパートメント、リザーバ、チューブ、滅菌手段など含み得る。
いくつかの態様において、体外デバイスは、中空繊維DLT様デバイス、例えば、HEMOPURIFIER（商標）デバイス(Aethlon Medical; San Diego, CA)にコンジュゲートされた本明細書に記載のヘム結合性分子および／または構成物を含み得る。さらなる情報は、当技術分野、例えば、米国特許第6,254,567号；同第8,105,487号；同第6,117,100号；米国特許出願公開第2012/0164628号；国際特許公開公報第WO2012135834号；同第WO2006041125号；同第WO2010065765号；ならびに欧州特許第2694970号；同第2344233号；同第1624785号において見られ得る。
一局面において、本明細書に記載のヘム結合性分子または構成物を含み、かつ、ヘム結合性分子または構成物がコンジュゲートされた固体基板または支持体をさらに含む、構成物を、本明細書に記載する。いくつかの態様において、固体基板または支持体は、中空繊維、例えば、本明細書において上述したような、DLTデバイスの中空繊維であり得る。
いくつかの態様において、ヘム結合性構成物は、体外デバイスの固体基板、例えば、フィルター、アフィニティーカラム、キャビティ、またはチューブに結合されている。固体基板の非限定的な例としては、ヘム結合性構成物が結合され得る、中空糸リアクターまたは任意の他の血液濾過膜もしくはフローデバイス（例えば、単純な透析チューブ）、または他の樹脂、繊維、もしくはシートが挙げられる。いくつかの態様において、結合は、非共有結合的、例えば、水素、静電気、またはファンデルワールス相互作用によるものであり得るが、結合は共有結合的であってもよい。「コンジュゲートされた」は、少なくとも2つの分子の共有結合的連結を意味する。いくつかの態様において、ヘム結合性構成物は、固体基板上のタンパク質にコンジュゲートされ得る。
いくつかの態様において、ヘム結合性分子および／または構成物は、例えば、ビーズまたは粒子に結合され得る。ビーズおよび／または粒子を対象の血液と接触させることができる。血液中に存在するヘムは、ヘム結合性分子および／または構成物によって結合され、次いで、ヘムとヘム結合性分子および／または構成物との複合体は、例えば、遠心分離してビーズをペレット化することによって、または磁場を加えて血液から磁性ビーズを分離することによって、血液から除去され得る。本明細書において使用される場合、用語「ビーズ」は、任意の設計または構造のマイクロ粒子、しかし好ましくは、細胞と同じくらいまたはそれよりも小さいサイズであるマイクロ粒子を指す。細胞サイズは細胞タイプによって変わるが、ビーズ（マイクロ粒子）は、そのようなサイズまたはそれよりも小さいもの、例えばナノスケールのサイズのものであることができる。いくつかの態様において、ビーズまたは粒子は、1 nm～1 mmのサイズの範囲であり得る。いくつかの態様において、ビーズは、約250 nm～約250μmのサイズであり得る。
ビーズは、ヘム結合性分子および／または構成物が結合され得る、任意の材料から形成され得る。好適な材料としては、非限定的に、合成ポリマー、生体高分子、ラテックス、またはシリカが挙げられ、材料は常磁性を有し得る。そのようなビーズおよび／または粒子の使用は、当技術分野において公知でありかつ記載されており、例えば、磁性ビーズおよびナノ粒子が周知であり、それらの産生方法は、当技術分野、例えば、米国特許第6,878,445号；同第5,543,158号；同第5,578,325号；同第6,676,729号；同第6,045,925号および同第7,462,446号、ならびに米国特許出願公開第2005/0025971号；同第2005/0200438号；同第2005/0201941号；同第2005/0271745号；同第2006/0228551号；同第2006/0233712号；同第2007/01666232号および同第2007/0264199号において記載されており、これらの全ての内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。磁性マイクロビーズは、アフィニティー分子に結合することができる官能基の有無にかかわらず、容易にかつ広く商業的に入手可能である。好適な超常磁性マイクロビーズは、Dynal Inc., Lake Success, N. Y.；PerSeptive Diagnostics, Inc., Cambridge, MA.；Invitrogen Corp., Carlsbad, CA；Cortex Biochem Inc., San Leandro, CA；およびBangs Laboratories, Fishers, INなどから商業的に入手可能である。
いくつかの態様において、担体足場またはその表面にコンジュゲートされた、少なくとも1つの、例えば、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも250、少なくとも500、またはそれ以上の操作されたヘム結合性分子および／または構成物を含む、微生物を標的化するかまたは微生物に結合するための物品または製品を、本明細書において提供する。「担体足場」は、本明細書において「担体基板」とも呼ばれる。いくつかの態様において、担体足場の表面は、本明細書に開示のヘム結合性分子および／または構成物でコーティングされ得る。本明細書において使用される場合、用語「物品」は、任意の別個の物理的なマイクロスケールまたはマクロスケール物体を指す。担体足場にコンジュゲートされたヘム結合性分子および／または構成物を含む物品は、本明細書において「ヘム結合性物品」とも呼ばれる。
非限定的に、担体足場は、多種多様の材料からかつ様々なフォーマットで選択され得る。例えば、担体足場は、ビーズまたは粒子（ナノ粒子、マイクロ粒子、ポリマーマイクロビーズ、磁性マイクロビーズなどを含む）、フィルター、繊維、スクリーン、メッシュ、チューブ、中空繊維、スキャフォールド、プレート、チャネル、金粒子、磁性材料、平面的な形状（例えば、長方形のストリップもしくは円形のディスク、または湾曲した表面、例えばスティック）、アッセイフォーマットで一般に利用されるその他の基板、およびそれらの任意の組み合わせ、の形態で利用され得る。
担体足場の例としては、核酸足場、タンパク質足場、脂質足場、デンドリマー、マイクロ粒子またはマイクロビーズ、ナノチューブ、マイクロタイタープレート、医療器具（例えば、注射針もしくはカテーテル）またはインプラント、ディップスティックまたは試験ストリップ、マイクロチップ、濾過装置または膜、メンブレン（membranse）、診断用ストリップ、中空糸リアクター、マイクロ流体デバイス、生細胞および生物学的組織または器官、体外デバイス、混合要素（例えば、スパイラルミキサー）などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、担体足場は、試験領域および任意で参照領域が、連続する線または一連の点の形態で存在する、連続的なロールの形態であり得る。
担体足場は、金属、金属合金、ポリマー、プラスチック、紙、ガラス、ファブリック、包装材、生物学的材料、例えば、細胞、組織、ヒドロゲル、タンパク質、ペプチド、核酸、およびそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない任意の材料から作製され得る。
いくつかの態様において、本明細書に開示のヘム結合性物品は、任意の供給源からまたは任意の流体、例えば、生物学的流体（例えば、血液サンプル）において、ヘムおよび／またはミオグロビンを捕獲、検出、または除去するために使用され得る。流体が血液であるいくつかの態様において、ヘム結合性磁性マイクロビーズを用いて対象から集められた血液からヘムおよび／またはミオグロビンを除去した後、治療的介入として、血液を同じ対象へ再循環させ得る。あるいは、担体足場は、中空糸リアクターまたは任意の他の血液濾過膜もしくはフローデバイス（例えば、単純な透析チューブ、スパイラルミキサーまたはスタティックミキサー）、またはヘムおよび／またはミオグロビンを選択的に結合および隔離する他の樹脂、繊維、もしくはシートを含み得る。
担体足場の特定のフォーマットまたは材料は、特定の使用または適用、例えば、アッセイ適用において用いられる分離／検出方法に依存する。いくつかの態様において、担体足場のフォーマットまたは材料は、シグナル対ノイズ比を最大化するよう、例えば、バックグラウンド結合を最小化するよう、または試薬の分離を容易にするためにおよび費用の面で、選択または修飾され得る。例えば、担体足場は、化学的凝集および非特異的結合を最小化するために、表面化学により処理または修飾され得る。いくつかの態様において、試験サンプルと接触する担体足場表面の少なくとも一部分は、試験サンプル中に存在する任意の分子（存在する場合、微生物を含む）への接着性が低下するよう処理され得る。ほんの一例として、試験サンプルと接触する担体足場表面は、その表面が細胞またはその断片（血液細胞および血液成分を含む）、タンパク質、核酸、ペプチド、小分子、治療剤、微生物、微小生物およびそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない試験サンプル中に存在する分子に対して不活性となるように、シラン処理またはポリマーコーティングされ得る。他の態様において、担体足場表面は、オムニフォビック（omniphobic）層で処理され得る。例えば、滑性担体足場表面を産生する方法に関する、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、Wong TS et al., "Bioinspired self-repairing slippery surfaces with pressure-stable omniphobicity." (2011) Nature 477 (7365): 443-447、および国際出願第PCT/US12/21928号を参照のこと。従って、基板表面への試験サンプル由来の分子の非特異的結合は軽減され得、それによってヘム結合性物質の感度および特異性が向上し得る。
いくつかの態様において、担体足場は、生体適合性材料から製作され得るまたは生体適合性材料でコーティングされ得る。本明細書において使用される場合、用語「生体適合性材料」は、感知できる程度に劣化せず、かつ対象の生物学的組織に移植もしくはそれに接して置かれたときに時間と共に有意な免疫応答もしくは有害な組織反応、例えば毒性反応もしくは有意な刺激を誘導しない、または血液と接触させたときに凝血もしくは凝固を誘導しない、任意の材料を表す。適当な生体適合性材料は、例えば、ポリイミドの誘導体およびコポリマー、ポリ（エチレングリコール）、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミンおよびポリビニルアミン、ポリアクリレート、ポリアミド、ポリエステル、ポリカーボネートならびにポリスチレンを含む。いくつかの態様において、生体適合性材料は、金属、例えばチタンおよびステンレス鋼、または医療用インプラントで使用される任意の生体適合性金属を含み得る。いくつかの態様において、生体適合性材料は、例えば、診断用ストリップのための担体足場としての、紙基板を含み得る。いくつかの態様において、生体適合性材料は、ペプチドまたは核酸分子、例えば、核酸足場、例えば、2-D DNAシートまたは3-D DNAスキャフォールドを含み得る。
担体足場を製作またはコーティングするために使用することができる追加の材料は、ポリジメチルシロキサン、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレンポリスルホン、ポリカーボネート、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリシリコン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリブタジエン、ポリ（ブチレンテレフタレート）、ポリ（エーテルスルホン）、ポリ（エーテルエーテルケトン）、ポリ（エチレングリコール）、スチレン・アクリロニトリル樹脂、ポリ（トリメチレンテレフタレート）、ポリビニルブチラール、ポリ2フッ化ビニリデン、ポリ（ビニルピロリドン）、およびそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、担体足場は、生分解性材料で製作またはコーティングすることができる。本明細書において使用される場合、用語「生分解性」は、インビボで侵食されまたは分解してより小さな化学断片を形成する組成物の能力を表す。分解は、例えば、酵素的、化学的または物理的プロセスによって起こり得る。本明細書に提供される局面において使用することができる生分解性ポリマーの非限定的な例は、ポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ラクチド-co-グリコリド）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリカーボネート、ポリシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリアクリレート、それらのブレンドおよびコポリマーを含む。
その他の追加の生分解性ポリマーは、生分解性ポリエーテルエステルコポリマーを含む。一般的に言うと、ポリエーテルエステルコポリマーは、親水性（例えば、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール）および疎水性のブロック（例えば、ポリエチレンテレフタレート）を含む両親媒性ブロックコポリマーである。例示的なブロックコポリマーは、ポリ（エチレングリコール）ベースおよびポリ（ブチレンテレフタレート）ベースのブロック（PEG/PBTポリマー）であるがこれらに限定されない。PEG/PBTポリマーは、PolyActive（商標）の商品表示の下でOctoPlus Incから市販されている。生分解性コポリマーまたはマルチブロックコポリマーの非限定的な例は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,980,948号および同第5,252,701号に記載されるものを含む。
その他の生分解性ポリマー材料は、リン含有連結を含む生分解性テレフタレートコポリマーを含む。ポリ（ホスフェート）、ポリ（ホスホネート）およびポリ（ホスファイト）と呼ばれる、ホスホエステル連結を有するポリマーは、当技術分野で公知である。例えば、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、Penczek et al., Handbook of Polymer Synthesis, Chapter 17: "Phosphorus-Containing Polymers," 1077-1 132 (Hans R. Kricheldorf ed., 1992)、ならびに米国特許第6,153,212号；同第6,485,737号；同第6,322,797号；同第6,600,010号；同第6,419,709号；同第6,419,709号；同第6,485,737号；同第6,153,212号；同第6,322,797号および同第6,600,010号を参照のこと。
生分解性の多価アルコールエステルも、担体足場（例えば、マイクロ粒子）の材料として使用することができる（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,592,895号を参照のこと）。いくつかの態様において、生分解性ポリマーは、架橋されたポリマー構造を有するヒドロゲルを形成する疎水性成分および親水性成分を含む三次元架橋ポリマーネットワーク、例えば、米国特許第6,583,219号に記載されるもの、であり得る。なおさらなる態様において、生分解性ポリマーは、α-アミノ酸に基づくポリマー（例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,503,538号に記載されるような、弾性のコポリエステルアミドまたはコポリエステルウレタン）を含み得る。
いくつかの態様において、担体足場は、紙、ニトロセルロース、ガラス、プラスチック、ポリマー、膜材料、ナイロン、およびそれらの任意の組み合わせを含み得る。これは、物品をディップスティックの試験ストリップ（a test strip of a dipstick）として使用することについて有用である。
本明細書において使用される場合、「コーティング」または「コート」は、概して、表面の最外層または露出層に形成された分子または材料の層を意味する。担体足場上の操作されたヘム結合性分子および／または構成物のコーティングに関して、用語「コーティング」または「コート」は、担体足場表面の最外層または露出層に形成された操作されたヘム結合性分子および／または構成物の層を表す。いくつかの態様において、担体足場表面は、例えば中空構造に関して、外側表面または内側表面を包含し得る。
担体足場にコンジュゲートまたはコーティングされる操作されたヘム結合性分子および／または構成物の量は、多くの因子、例えば、表面積、コンジュゲーション／コーティングの密度、操作されたヘム結合性分子および／または構成物のタイプ、および／または結合性能によって変化し得る。当業者は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて、担体足場上の操作されたヘム結合性分子および／または構成物の最適密度を決定することができる。ほんの一例として、担体足場としての磁性マイクロ粒子に関して、磁性マイクロ粒子にコンジュゲートするまたは磁性マイクロ粒子をコーティングするのに使用される操作されたヘム結合性分子および／または構成物の量は、約1 wt%から約30 wt%まで、または約5 wt%から約20 wt%まで変化し得る。いくつかの態様において、磁性マイクロ粒子にコンジュゲートするまたは磁性マイクロ粒子をコーティングするのに使用される操作されたヘム結合性分子および／または構成物の量は、個別の要求に依存してそれより多いまたは少ないものであり得る。しかし、磁性マイクロ粒子にコンジュゲートするまたは磁性マイクロ粒子をコーティングするのに使用される操作されたヘム結合性分子および／または構成物の量が少なすぎる場合、磁性マイクロ粒子がヘムおよび／またはミオグロビンに対して低い結合性能を示し得ることに留意されたい。逆に、磁性マイクロ粒子にコンジュゲートするまたは磁性マイクロ粒子をコーティングするのに使用される操作されたヘム結合性分子および／または構成物の量が多すぎる場合、操作されたヘム結合性分子および／または構成物の高密度の層が磁性マイクロビーズの磁気特性に悪影響を及ぼし得、そのため磁場勾配を用いた流体からの磁性マイクロビーズの分離の効率が悪化し得る。同様の懸念が他の基板タイプに当てはまる。
いくつかの態様において、担体足場は、参照領域としての使用に適している少なくとも1つの領域をさらに含み得る。ほんの一例として、参照領域は、陽性対照、陰性対照、参照、またはそれらの任意の組み合わせとしての使用に適している場合がある。いくつかの態様において、担体足場は、少なくとも2つの領域をさらに含み得、ここで、1つの領域は陽性対照に適しており、第2の領域は陰性対照に適している。
いくつかの態様において、担体足場は、試験領域から決定された読み取りシグナルとの比較のために、少なくとも1つの参照領域または対照領域をさらに含み得る。参照領域は、通常、例えば任意のバックグラウンドシグナルを考慮するために、操作されたヘム結合性分子および／または構成物を含まない。いくつかの態様において、参照領域は、試験領域中の操作されたヘム結合性分子および／または構成物が有している検出可能な標識の1つまたは複数の既知量を含み得る。そのような態様において、参照領域は、試験サンプル中のヘムおよび／またはミオグロビンの量を概算または定量することができるよう、較正のために使用され得る。
いくつかの態様において、担体足場は検出可能な標識をさらに含み得る。検出可能な標識は、担体足場とコンジュゲートされたヘム結合性分子および／または構成物から離れていてもよく、または担体足場とコンジュゲートされたヘム結合性分子および／または構成物に連結されていてもよい。
ヘム結合性マイクロ粒子：いくつかの態様において、担体足場はマイクロ粒子である。従って、本明細書に記載のいくつかの態様は、その表面に少なくとも1つの操作されたヘム結合性分子および／または構成物を含むヘム結合性マイクロ粒子を提供する。用語「マイクロ粒子」は、本明細書において使用される場合、約0.001μm～約1000μm、約0.005μm～約50μm、約0.01μm～約25μm、約0.05μm～約10μm、または約0.05μm～約5μmの粒子サイズを有する粒子を指す。一態様において、マイクロ粒子は約0.05μm～約1μmの粒子サイズを有する。一態様において、マイクロ粒子は約0.09μm～約0.2μmのサイズである。
いくつかの態様において、マイクロ粒子は、サイズが1 nm～1 mm、約2.5 nm～約500μm、または約5 nm～約250μmのサイズ範囲であり得る。いくつかの態様において、マイクロ粒子は約5 nm～約100μmのサイズであり得る。いくつかの態様において、マイクロ粒子は約0.01μm～約10μmのサイズであり得る。いくつかの態様において、マイクロ粒子は約0.05μm～約5μmのサイズであり得る。いくつかの態様において、マイクロ粒子は約0.08μm～約1μmのサイズであり得る。一態様において、マイクロ粒子は約10 nm～約10μmのサイズであり得る。いくつかの態様において、マイクロ粒子は約1 nm～約1000 nm、約10 nm～約500 nm、約25 nm～約300 nm、約40 nm～約250 nm、または約50 nm～約200 nmであり得る。一態様において、マイクロ粒子は約50 nm～約200 nmであり得る。
マイクロ粒子は通常、示される「サイズ」付近の粒子サイズ分布を示すことが当業者に理解されるであろう。そうでないことが示されない限り、本明細書で使用される「サイズ」という用語は、マイクロ粒子のサイズ分布の最頻値、即ち、そのサイズ分布において最も高頻度で見られる値を表す。例えば動的光散乱（例えば、光子相関分光法（photocorrelation spectroscopy）、レーザー回折、低角レーザー光散乱（LALLS）および中角レーザー光散乱（MALLS））、光遮蔽法（例えば、コールター分析法）またはその他の技術（例えば、レオロジー、および光学または電子顕微鏡）による、マイクロ粒子のサイズを測定する方法は、当業者に公知である。
非限定的に、マイクロ粒子は任意の形状のものであり得る。従って、マイクロ粒子は、球形、棒形、楕円形、円柱形およびディスク形などであり得るが、これらに限定されない。いくつかの態様において、用語「マイクロ粒子」は、本明細書において使用される場合、マイクロスフェアを包含し得る。用語「マイクロスフェア」は、本明細書において使用される場合、実質的に球形の形状を有するマイクロ粒子を表す。実質的に球形のマイクロ粒子は、最小半径と最大半径の間の差が概ね小さい方の半径の約40％を超えず、より典型的には約30％未満または20％未満である、マイクロ粒子である。
いくつかの態様において、実質的に球形の形状および定義された表面化学を有するマイクロ粒子が、化学的凝集および非特異的結合を最小化するために使用され得る。
一態様において、用語「マイクロ粒子」は、本明細書において使用される場合、マイクロカプセルを包含する。用語「マイクロカプセル」は、本明細書において使用される場合、活性成分、例えば治療剤または画像化剤を含む微小のカプセルを表す。従って、いくつかの態様において、それらの表面上に操作されたヘム結合性分子および／または構成物を含むマイクロ粒子は、その中に少なくとも1つの活性成分、例えば治療剤をカプセル被包し得る。
一般に、マイクロ粒子の製作に関して当技術分野で周知の任意の生体適合性材料が、本明細書に記載されるマイクロ粒子の態様において使用され得る。従って、脂質性のマイクロ粒子コアを含むマイクロ粒子もまた、本明細書に記載の範囲内である。例示的な脂質性マイクロ粒子コアは、リポソームであるがこれに限定されない。リポソームは、一般に、内部空間、例えば水性の内部空間、を取り囲む1つまたは複数の脂質二重層を含む粒子と定義される。一態様において、リポソームは、二重の脂質膜によって形成された小包であり得る。リポソームを調製する方法は、当技術分野で十分に解説されている、例えば、Szoka and Papahadjopoulos (1980) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467, Deamer and Uster (1983) Pp. 27-51 In: Liposomes, ed. M. J. Ostro, Marcel Dekker, New York。
ヘム結合性磁性マイクロ粒子：いくつかの態様において、マイクロ粒子は磁性マイクロ粒子である。従って、いくつかの態様において、磁性マイクロ粒子がその表面上に少なくとも1つの操作されたヘム結合性分子および／または構成物を含む、「ヘム結合性磁性マイクロ粒子」を本明細書に提供する。非限定的に、そのようなヘム結合性磁性マイクロ粒子は、試験サンプル、例えば、しかしこれらに限定されないが、血液などの生物学的流体を含む任意の流体から、ヘムおよび／またはミオグロビンを分離するために使用され得る。いくつかの態様において、ヘム結合性磁性マイクロ粒子は、ヘムおよび／またはミオグロビンを除去するために使用され得る。基板としての磁性マイクロ粒子の使用は、ヘムに結合した磁性マイクロ粒子を、磁場勾配を用いてサンプル流体から容易に分離することができ、ヘムおよび／またはミオグロビンの存在について試験することができる点で、有利であり得る。従って、いくつかの態様において、ヘム結合性磁性マイクロ粒子は、任意の供給源からまたは任意の流体、例えば生物学的流体（例えば、血液サンプル）において、ヘムおよび／またはミオグロビン夾雑物を捕獲、検出、または除去するために使用され得る。流体が血液であるいくつかの態様において、ヘム結合性磁性マイクロビーズを用いて対象から集められた血液からヘムおよび／またはミオグロビン（my）を除去した後、治療的介入として、血液を同じ対象へ再循環させ得る。あるいは、固体基板は、中空糸リアクターまたは任意の他の血液濾過膜もしくはフローデバイス（例えば、単純な透析チューブ、スパイラルミキサーまたはスタティックミキサー）、またはヘムおよび／またはミオグロビンを選択的に結合および隔離する他の樹脂、繊維、もしくはシートを含み得る。
磁性マイクロ粒子は、磁場または磁場勾配を用いて操作され得る。そのような粒子は、一般に、磁性元素、例えば鉄、ニッケルおよびコバルトならびにそれらの酸化物化合物からなる。磁性マイクロ粒子は周知であり、それらの調製方法は当技術分野で解説されている。例えば、その内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,878,445号；同第5,543,158号；同第5,578,325号；同第6,676,729号；同第6,045,925号；および同第7,462,446号；ならびに米国特許出願公開第2005/0025971号；同第2005/0200438号；同第2005/0201941号；同第2005/0271745号；同第2006/0228551号；同第2006/0233712号；同第2007/01666232号；および同第2007/0264199号を参照のこと。
磁性マイクロ粒子はまた、本明細書に開示のヘム結合性分子および／または構成物にコンジュゲーションできる官能基を有するものまたは有さないものを、幅広くかつ商業的に入手可能である。様々な官能基、例えば、アミノ基、カルボン酸基、エポキシ基、トシル基またはシリカ様基で官能化された磁性マイクロ粒子もまた、幅広くかつ商業的に入手可能である。適当な磁性マイクロ粒子は、AdemTech, Miltenyi, PerSeptive Diagnostics, Inc. (Cambridge, MA)；Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)；Cortex Biochem Inc. (San Leandro, CA)；およびBangs Laboratories (Fishers, IN) 等から市販されている。特定の態様において、本明細書で使用され得る磁性マイクロ粒子は、基板表面化学に依存して、任意のDYNABEADS（登録商標）磁性マイクロビーズ（Invitrogen Inc.）であり得る。
ヘム結合性マイクロタイタープレート：いくつかの態様において、マイクロタイターウェルの底面が、例えばサンプル中のヘムおよび／またはミオグロビンの量を検出および／または決定するために、本明細書に記載の操作されたヘム結合性分子および／または構成物でコーティングされ得る。マイクロウェル表面に結合された操作されたヘム結合性分子および／または構成物へサンプル中のヘムおよび／またはミオグロビンを結合させた後、サンプルの残りが除去され得る。次いで、ヘムおよび／またはミオグロビンへさらに結合することができる検出可能な分子（例えば、本明細書に記載される検出可能な分子にコンジュゲートされた操作されたヘム結合性分子および／または構成物）が、ヘムおよび／またはミオグロビンの検出のために、マイクロウェルへ添加され得る。例えば酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いる、異なる検出可能な分子によりタンパク質の量を決定する様々なシグナル検出法が、当技術分野で十分に確立されており、これらのシグナル検出法もまた、操作されたヘム結合性分子および／または構成物上のヘムおよび／またはミオグロビン結合により誘導されるシグナルの検出を容易にするために本発明で使用され得る。
ヘム結合性ディップスティック／試験ストリップ：いくつかの態様において、その上にコンジュゲートされたヘム結合性分子および／または構成物を有する担体足場は、ヘムおよび／またはミオグロビンの捕獲、検出、またはクリアランスのためのディップスティックおよび／または試験ストリップの形態であり得る。例えば、ディップスティックおよび／または試験ストリップは、1つまたは複数の本明細書に記載の操作されたヘム結合性分子および／または構成物を含有する少なくとも1つの試験領域を含み得る。ディップスティックおよび／または試験ストリップは、任意の形状および／または任意のフォーマット、例えば、平面的な形状、例えば長方形のストリップもしくは円形のディスク、または湾曲した表面、例えばスティック、であり得る。あるいは、個別の試験ストリップではなく、試験領域および任意で参照領域が連続する線または一連の点の形態で存在する連続的なロールが利用され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載のヘム結合性ディップスティックまたは試験ストリップは、ヘムおよび／またはミオグロビンについてのポイント・オブ・ケア診断ツールとして使用することができる。
いくつかの態様において、ディップスティックまたは試験ストリップの形態の担体足場は、紙、ニトロセルロース、ガラス、プラスチック、ポリマー、膜材料、ナイロン、およびそれらの任意の組み合わせを非限定的に含む、任意の材料から作製され得る。一態様において、ディップスティックまたは試験ストリップの形態の担体足場は、紙を含み得る。一態様において、ディップスティックまたは試験ストリップの形態の担体足場は、ナイロンを含み得る。
いくつかの態様において、ディップスティックまたは試験ストリップは、試験領域から決定された読み取りシグナルとの比較のために、少なくとも1つの参照領域または対照領域をさらに含み得る。参照領域は、通常、例えば任意のバックグラウンドシグナルを考慮するために、操作されたヘム結合性分子および／または構成物を含まない。いくつかの態様において、参照領域は、試験領域中の操作されたヘム結合性分子および／または構成物が有している検出可能な標識の1つまたは複数の既知量を含み得る。そのような態様において、参照領域は、試験サンプル中のヘムおよび／またはミオグロビンの量を概算または定量することができるよう、較正のために使用され得る。
いくつかの態様において、ディップスティック／試験ストリップは、本明細書に記載の検出可能な標識をさらに含み得る。検出可能な標識は、ディップスティック／試験ストリップとコンジュゲートされたヘム結合性分子に連結されていてもよく、またはディップスティック／試験ストリップとコンジュゲートされたヘム結合性分子から離れていてもよい。
一態様において、約1μg～約100μgのヘム結合性分子が、ディップスティックまたは膜表面にコーティングまたは付加され得る。別の態様において、約3μg～約60μgのヘム結合性分子が、ディップスティックまたは膜表面にコーティングまたは付加され得る。いくつかの態様において、約0.1mg/mL～約50mg/mL、約0.5mg/mL～約40mg/mL、約1mg/mL～約30mg/mL、約5mg/mL～約20mg/mLのヘム結合性分子および／または構成物が、ディップスティックまたは膜表面にコーティングまたは付加され得る。
一局面において、タンパク質の産生に適した条件下で本明細書に記載のヘム結合性分子および／または構成物をコードする核酸、例えば単離された核酸、を含む細胞を培養する工程、ならびに、Fcドメイン結合性試薬を用いたアフィニティー精製によって、該ヘム結合性分子および／または構成物を精製する工程を含む、ヘム結合性分子および／または構成物を産生する方法を、本明細書に記載する。
ヘム結合性分子および／または構成物をコードする核酸は、例えば、SEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 5をコードする核酸であり得る。本明細書に記載のヘム結合性分子および／または構成物をコードする核酸分子は、当技術分野において公知の様々な方法によって作製される。これらの方法としては、PCT、ライゲーション、および直接合成が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸配列は、ライゲーションのための平滑末端または突出末端（staggered-ended terminus）、適切な末端を提供するための制限酵素消化、必要に応じて付着末端の埋め込み、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および適切なリガーゼでのライゲーションを含む、従来の手法に従って、ベクターDNAと組換えすることができる。そのような操作の手法は、例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning, Lab. Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 and 1989), and Ausubel, 1987, 1993に開示されており、本明細書に記載のヘム結合性分子および／または構成物ポリペプチドをコードする核酸配列を構築するために使用することができる。
用語「ベクター」は、適切な制御要素に結合した場合に複製することができ、かつ遺伝子配列を細胞に移入することができる任意の遺伝子要素を含む。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン等を含み得るがこれらに限定されるわけではない。これらのトランスジーンは、線形構築物、環状プラスミド、または組込み型もしくは非組込み型ベクターであり得るウイルスベクターとして導入され得る。トランスジーンはまた、染色体外プラスミドとして受け継がれることを可能にするように構築され得る（Gassmann, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292）。
一局面において、本明細書に記載の技術は、本明細書に記載のヘム結合性分子ポリペプチドおよび／またはヘム結合性構成物ポリペプチドのいずれかをコードする核酸を含む発現ベクターに関する。そのようなベクターは、例えば、コード化ポリペプチドを産生するために細胞を形質転換するために、使用され得る。本明細書において使用される場合、用語「発現ベクター」は、ベクター上の転写調節配列に連結した配列からRNAまたはポリペプチドの発現を誘導するベクターを意味する。発現される配列は細胞に対して異種であることが多いが、必ずしもその必要はない。発現ベクターは、追加の要素を含んでもよく、例えば発現ベクターは、2つの複製システムを有してもよく、これにより、2つの生物において、例えば発現のための哺乳動物細胞において、ならびにクローニングおよび増幅のための原核細胞宿主において維持されることが可能になる。「発現」という用語は、適用可能であれば、例えば転写、転写物プロセシング、翻訳ならびにタンパク質フォールディング、修飾、およびプロセシングを含むがこれらに限定されない、RNAおよびタンパク質の産生、ならびに必要に応じてタンパク質の分泌に関係する細胞プロセスを意味する。「発現産物」は、遺伝子から転写されたRNA、および遺伝子から転写されたmRNAの翻訳によって得られたポリペプチドを含む。用語「遺伝子」は、適切な調節配列に機能的に連結された場合に、インビトロまたはインビボでRNAに転写される核酸配列（DNA）を意味する。遺伝子は、コード領域の前および後に領域、例えば5'非翻訳（5'UTR）または「リーダー」配列および3'UTRまたは「トレーラー」配列を、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間に介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
「組換えベクター」とは、インビボで発現することができる異種核酸配列または「トランスジーン」を含むベクターを意味する。本明細書において記述されるベクターは、いくつかの態様において、他の適した組成物および治療と組み合わせることができると理解すべきである。本明細書に記載の単離ペプチドをコードする配列の送達に有用なベクターは、所望の標的細胞または組織における単離ペプチドの発現に十分な1つまたは複数の調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を含み得る。調節エレメントは、構成的または調節／誘導性発現を提供するように選択され得る。本明細書において使用される場合、用語「ウイルスベクター」は、ウイルス起源の少なくとも1つの要素を含み、パッケージングされてウイルスベクター粒子となる能力を有する核酸ベクター構築物を意味する。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合性部分をコードする核酸を含み得る。ベクターおよび／または粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞に任意の核酸を移入する目的のために利用され得る。多数の形状のウイルスベクターが当技術分野において公知である。
本明細書に記載の単離されたペプチドをコードする核酸の送達において有用なベクターの例としては、以下が挙げられる：プラスミドベクター、非ウイルスプラスミドベクター（例えば、6,413,942、6,214,804、5,580,859、5,589,466、5,763,270および5,693,622を参照のこと；これらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み入られる）；レトロウイルス（例えば、米国特許第5,219,740号；Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-90; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-52; Miller et al. , Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993); Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-37; Boris-Lawrie and Temin (1993) Curr. Opin. Genet. Develop. 3:102-09. Boesen et al. , Biotherapy 6:291-302 (1994); Clowes et al. , J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al. , Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); およびGrossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)を参照のこと；これらの各々の内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる）；レンチウイルス（例えば、米国特許第6,143,520号；同第5,665,557号；および同第5,981,276号を参照のこと；これらの内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる；アデノウイルスに基づく発現ベクター（例えば、参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる、Haj-Ahmad and Graham (1986) J. Virol. 57:267-74; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-21; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717-29; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933-40; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6:616-29; およびRich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461-76; Wu et al. (2001) Anesthes. 94:1119-32; Parks (2000) Clin. Genet. 58:1-11; Tsai et al. (2000) Curr. Opin. Mol. Ther. 2:515-23; ならびに米国特許第6,048,551号；同第6,306,652号および同第6,306,652号を参照のこと）；アデノ随伴ウイルス（AAV）（例えば、米国特許第5,139,941号；同第5,622,856号；同第5,139,941号；同第6,001,650号；および同第6,004,797号を参照のこと；これらの各々の内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる）；ならびにアビポックスベクター（例えば、WO 91/12882; WO 89/03429;およびWO 92/03545を参照のこと；これらは参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる）。
トランスフェクションの有用な方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション（sonoporation）、プロトプラスト融合、ペプトイド送達、またはマイクロインジェクションが挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、関心対象の細胞を形質転換するための手法の考察については、Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York；および遺伝子移入のために有用な送達系の概説については、Felgner, P. L. (1990) Advanced Drug Delivery Reviews 5:163-87を参照のこと。エレクトロポレーションを使用してDNAを送達する例示的な方法は、米国特許第6,132,419号、同第6,451,002号、同第6,418,341号、同第6,233,483号、米国特許出願公開第2002/0146831号、および国際公開公報第WO/0045823号に記載されており、これらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み入れられる。
原核細胞における発現について有用なベクターの非限定的な例としては、プラスミドが挙げられ得る。プラスミドベクターとしては、pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV 40、pBluescript II SK +/-またはKS +/-（"Stratagene Cloning Systems" Catalog (1993) from Stratagene, La Jolla, Califを参照のこと；これは参照により本明細書に組み入れられる）、pQE、pIH821、pGEX、pETシリーズ（Studier et. al., "Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes," Gene Expression Technology , vol. 185 (1990)を参照のこと；これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）が挙げられ得るが、これらに限定されない。哺乳動物および昆虫に適したベクターの非限定的な例としては、pcDNA3、pCMV6、pOptiVec、pFUSE、およびpFastBacが挙げられ得る。
いくつかの態様において、ポリペプチドは構成的に発現され得る。いくつかの態様において、ポリペプチドをコードする核酸は、構成的プロモーターに機能的に連結され得る。いくつかの態様において、ポリペプチドは誘導的に発現され得る。いくつかの態様において、ポリペプチドをコードする核酸は、誘導性プロモーターに機能的に連結され得る。本明細書に記載される場合、「誘導性プロモーター」は、インデューサもしくは誘導物質が存在しない場合、インデューサもしくは誘導物質の影響下にない場合、またはインデューサもしくは誘導物質と接触していない場合と比べて、インデューサもしくは誘導物質が存在する場合、インデューサもしくは誘導物質によって影響された場合、またはインデューサもしくは誘導物質によって接触された場合に、転写活性を開始または増強することを特徴とするものである。「インデューサ」または「誘導物質」は、誘導性プロモーターから転写活性を誘導することにおいて活性となるように投与される、内因性の、または通常は外因性の化合物もしくはタンパク質であり得る。いくつかの態様において、インデューサまたは誘導物質、例えば、化学物質、化合物またはタンパク質はそれ自体、それ自体が誘導性プロモーターの制御下にあり得る、核酸配列の転写または発現の結果であり得る（例えば、インデューサは、転写抑制因子タンパク質であり得る）。誘導性プロモーターの非限定的な例としては、lacオペロンプロモーター、窒素感受性プロモーター、IPTG-誘導性プロモーター、塩-誘導性プロモーター、およびテトラサイクリン、ステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。原核細胞系における使用についての誘導性プロモーターは、当技術分野において周知であり、例えば、以下を参照のこと：β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム（Chang et al., Nature, 275: 615 (1978、これは参照により本明細書に組み入れられる）；Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)、これは参照により本明細書に組み入れられる)、アラビノースプロモーターシステム、例えば、araBADプロモーター（Guzman et al., J . Bacteriol., 174: 7716-7728 (1 992)、これは参照により本明細書に組み入れられる；Guzman et al., J. Bacteriol., 177: 4121-4130 (1995)、これは参照により本明細書に組み入れられる；Siegele and Hu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 8168-8172 (1997)、これは参照により本明細書に組み入れられる）、ラムノースプロモーター（Haldimann et al., J. Bacteriol., 180: 1277-1286 (1998)、これは参照により本明細書に組み入れられる）、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン(trp)プロモーターシステム（Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980)、これは参照により本明細書に組み入れられる）、PLtetO-1およびPlac/are-1プロモーター（Lutz and Bujard, Nucleic Acids Res., 25: 1203-1210 (1997)、これは参照により本明細書に組み入れられる）、ならびにハイブリッドプロモーター、例えば、tacプロモーター、deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)、これは参照により本明細書に組み入れられる。哺乳動物および昆虫プロモーターの非限定的な例としては、CMV、SV40、LTR、およびポリヘドリンプロモーターが挙げられ得る。
本明細書に開示されるような方法およびシステムにおいて有用な誘導性プロモーターは、1つまたは複数の生理学的条件、例えば、pH、温度、放射線、浸透圧、食塩水勾配、細胞表面結合、および1つまたは複数の外在性もしくは内在性誘導物質の濃度における変化によって誘導され得る。外在性インデューサまたは誘導物質は、アミノ酸およびアミノ酸アナログ、糖類および多糖類、核酸、タンパク質転写活性化因子および抑制因子、サイトカイン、毒素、石油系化合物、金属含有化合物、塩、イオン、酵素基質アナログ、ホルモン、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。特定の態様において、誘導性プロモーターは、環境条件の変化、例えば、化学物質、金属、温度、放射線、栄養素の濃度における変化、またはpH変化に応答して、活性化または抑制される。従って、本明細書に開示されるような方法およびシステムにおいて有用な誘導性プロモーターは、ファージ誘導性プロモーター、栄養素誘導性プロモーター、温度誘導性プロモーター、放射線誘導性プロモーター、金属誘導性プロモーター、ホルモン誘導性プロモーター、ステロイド誘導性プロモーター、および／またはハイブリッド、ならびにそれらの組み合わせであり得る。好適な環境インデューサとしては、熱への曝露（即ち、熱パルスもしくは一定熱への曝露）、様々なステロイド化合物、二価の陽イオン（Cu2+およびZn2+を含む）、ガラクトース、テトラサイクリン、IPTG（イソプロピル-β-Dチオガラクトシド）、ならびに他の天然および合成インデューサおよび自然の（gratuitous）インデューサが挙げられ得るが、これらに限定されない。
本明細書に開示されるような方法およびシステムにおいて有用な誘導性プロモーターはまた、環境的、外部物質、または別の遺伝子の産物の作用による不活性化に依存する、「転写抑制因子」によって抑制されるものを含む。そのような誘導性プロモーターはまた「抑制可能なプロモーター」とも呼ばれ得、ここで、本明細書に記載の生物学的スイッチコンバータの所定のモジュールまたはコンポーネントにおいて他のタイプのプロモーターを識別することが必要とされる。本発明における使用について好ましいリプレッサーは、生理学的に良性の物質による不活性化に対して感受性である。従って、lacリプレッサータンパク質が、lacOオペレーター配列を含有するように操作されたプロモーター配列の発現を制御するために使用される場合、IPTGでの宿主細胞の処理は、lacOオペレーター配列を含有する操作されたプロモーターからlacリプレッサーを解離させ、転写を生じさせる。同様に、tetリプレッサーが、tetOオペレーター配列を含有するように操作されたプロモーター配列の発現を制御するために使用される場合、テトラサイクリンでの宿主細胞の処理は、操作されたプロモーターからtetリプレッサーを解離させ、操作されたプロモーターの下流の配列の転写を生じさせる。
核酸を含む細胞は、例えば、微生物細胞または哺乳動物細胞であり得る。いくつかの態様において、本明細書に記載の細胞は、ヘム結合性構成物ポリペプチドの発現に適した条件下で培養される。そのような条件としては、細胞が増殖するおよび／またはポリペプチド合成することができる条件が挙げられ得るが、これらに限定されない。条件は、選択される細胞の種および株に依存して変化し得る。細胞、例えば、原核細胞および哺乳動物細胞の培養についての条件は、当技術分野において周知である。組換えポリペプチドが誘導性プロモーターに機能的に連結されている場合、そのような条件は、適切な誘導性分子の存在を含み得る。
本明細書において使用される場合、「Fcドメイン結合性試薬」は、Fcドメインに特異的に結合することができる剤を指す。いくつかの態様において、Fcドメイン結合性試薬は、抗Fc抗体もしくはFcR受容体またはその部分であり得る。用語「剤」は、一般に、通常は存在しないかまたは細胞へ投与されるレベルでは存在しない任意のエンティティーを指す。剤は、ポリヌクレオチド；ポリペプチド；小分子；抗体；またはその機能的断片を含む群より選択され得る。本明細書において使用される場合、用語「特異的結合」は、2つの分子、化合物、細胞および／または粒子間の化学的相互作用を指し、ここで、第1エンティティーは、非標的である第3エンティティーに結合する場合と比べてより高い特異性および親和性で第2標的エンティティーに結合する。いくつかの態様において、特異的結合は、第3非標的エンティティーについての親和性と比べて少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍またはそれ以上である、第2標的エンティティーについての第1エンティティーの親和性を指し得る。
本明細書において使用される場合、「精製すること」は、特定の分子または構成物を単離する、および／または、分子または構成物が処理前よりも多く単離される（例えば、より高い純度レベルで存在する）ように特定の分子または構成物を含むサンプルを処理するプロセスを指す。用語「単離された」または「部分的に精製された」は、本明細書において使用される場合、分子または構成物が、その天然供給源において見出される場合にその分子と共に存在する、および／または、細胞によって発現される場合もしくは分泌型ポリペプチドの例では分泌される場合にその分子と共に存在するであろう、少なくとも1つの他の成分（例えば、核酸またはポリペプチド）から分離されていることを指す。化学合成された核酸もしくはポリペプチドまたはインビトロ転写／翻訳を用いて合成されたものは、「単離されている」とみなされる。
いくつかの態様において、本明細書に記載のポリペプチドは、ポリペプチドの1つまたは複数のドメインについて特異的な剤によって、例えば、Fc、リンカー、微生物結合性ドメインなどに特異的に結合する、例えば、基質および／または抗体試薬によって、精製され得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の方法または構成物で、敗血症を有するまたは敗血症を有すると診断された対象を治療することに関する。敗血症を有する対象は、敗血症を診断する現在の方法を用いて医師によって特定され得る。これらの状態を特徴付けかつ診断の助けとなる敗血症の症状および／または合併症は、当技術分野において周知であり、高熱、熱く紅潮した皮膚、高心拍数、過換気、精神状態の変化、腫脹、および低血圧を含むが、これらに限定されない。例えば敗血症の、診断を助け得る検査としては、血液培養が挙げられるが、これに限定されない。敗血症（例えば、免疫不全）の危険因子への曝露もまた、対象が敗血症を有する可能性が高いかどうかを決定することにおいて、または敗血症の診断を下すことにおいて、助けとなり得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、敗血症の症状および／または血液中の過剰なヘムを緩和するために、有効量の本明細書に記載の構成物、例えば、ヘム結合性分子および／または構成物を対象へ投与する工程を含む。本明細書において使用される場合、「敗血症の症状を緩和する」は、敗血症と関連する任意の状態または症状を改善することである。相当する未処置対照と比較した場合、そのような減少は、任意の標準的手法によって測定して、少なくとも5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%、99%またはそれ以上の減少である。本明細書に記載の構成物を対象へ投与するための様々な手段が当業者に公知である。そのような方法としては、経口、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアゾール）、肺、注射、または皮膚投与が挙げられ得るが、これらに限定されない。投与は局所または全身であり得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、横紋筋融解症（例えば、圧挫損傷）の治療の必要がある対象へ、有効量の本明細書に記載の構成物、例えば、ヘム結合性分子および／または構成物を投与する工程を含み得る。
用語「有効量」は、本明細書において使用される場合、疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症状を緩和するために必要とされる構成物の量を指し、所望の効果を提供するための薬理学的構成物の十分な量に関する。従って、用語「治療有効量」は、典型的な対象へ投与した場合に特定の効果を提供するために十分である構成物の量を指す。有効量は、様々な文脈において、本明細書において使用される場合、疾患の症状の進展を遅延させる、疾患の症状の経過を変える（例えば、しかしこれに限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせる）、または疾患の症状を逆転するために十分な量も含むだろう。従って、一般に、正確な「有効量」を明示することは実行可能でない。しかし、任意の所定のケースについて、適切な「有効量」は、通常の実験を使用するだけで当業者によって決定することができる。
有効量、毒性、および治療有効性は、例えば、LD50（集団の50%において致死的な用量）およびED50（集団の50%において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準の薬学的手順によって決定することができる。投薬量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化し得る。毒性効果と治療効果との用量比率は、治療指数であり、比率LD50/ED50として表され得る。大きな治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定され得る。さらに、細胞培養においてまたは適切な動物モデルにおいて決定されたIC50（即ち、症状の最大半値阻害を達成する組成物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、用量は動物モデルにおいて処方され得る。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。任意の特定の投薬量の効果は、適切なバイオアッセイ、例えば、特に、対象の血液中の遊離ヘムのレベルについてのアッセイによってモニタリングすることができる。投薬量は、医師によって決定され得、必要に応じて、観察される治療効果に適合するように調節され得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載の技術は、本明細書に記載のヘム結合性分子および／または構成物、ならびに任意で薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。薬学的に許容される担体および希釈剤としては、食塩水、水性緩衝液、溶媒および／または分散媒が挙げられる。そのような担体および希釈剤の使用は当技術分野において周知である。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの非限定的な例としては、以下が挙げられる：(1)糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；(2)デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；(3)セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロース；(4)トラガカント末；(5)麦芽；(6)ゼラチン；(7)滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；(8)賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤用ワックス；(9)油、例えば、ピーナツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；(10)グリコール、例えば、プロピレングリコール；(11)ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（PEG）；(12)エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；(13)寒天；(14)緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；(15)アルギン酸；(16)発熱物質非含有水；(17)等張食塩水；(18)リンガー溶液；(19)エチルアルコール；(20)pH緩衝溶液；(21)ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；(22)充填剤、例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸；(23)血清成分、例えば、血清アルブミン、HDLおよびLDL；(22)C2～C12アルコール、例えば、エタノール；ならびに(23)薬学的製剤において使用されるその他の非毒性、適合性の物質。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、保存剤および抗酸化剤もまた、製剤中に存在し得る。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などのような用語は、本明細書において交換可能に使用される。いくつかの態様において、担体は、活性物質、例えば、本明細書に記載のヘム結合性構成物の分解を阻害する。
いくつかの態様において、本明細書に記載のヘム結合性分子および／または構成物を含む薬学的組成物は、非経口投与形態であり得る。非経口投薬形態の投与は、典型的に、汚染物質に対する患者の自然防御を迂回するため、非経口投薬形態は、好ましくは、無菌であるか、または患者への投与前に滅菌することができる。非経口投薬形態の例としては、注射用液剤、薬学的に許容される注射用ビヒクル中に溶解もしくは懸濁できる乾燥製品、注射用懸濁剤、および乳剤が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、DUROS（登録商標）タイプ投薬形態および用量ダンピング（dose dumping）を含むがこれらに限定されない、放出制御非経口投薬形態を、患者への投与用に調製することができる。
開示されるヘム結合性分子および／または構成物の非経口投薬形態を提供するために使用することができる適切なビヒクルは、当業者に周知である。例としては、滅菌水；USP注射用水；食塩水；グルコース溶液；塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、デキストロース注射、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射、および乳酸化リンゲル注射などの、ただしこれらに限定されない水性ビヒクル；エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールなどの、ただしこれらに限定されない水混和性ビヒクル；ならびにコーン油、綿実油、落花生油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルなどの、ただしこれらに限定されない非水性ビヒクルが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩の可溶性を変更または改変する化合物がまた、従来の放出制御非経口投薬形態を含む、本開示の非経口投薬形態中へ組み入れられ得る。
本明細書に記載の方法は、例えば、併用療法の一部として、第2の薬剤および／または治療を対象へ投与する／施す工程をさらに含み得る。第2の薬剤および／または治療の非限定的な例としては、抗生物質、補液、限外濾過、血液濾過、透析、血液透析、血液透析濾過、機械換気、血糖値を制御するためのインスリン、および血管収縮薬が挙げられ得る。
いくつかの態様において、本明細書において上述されるように、治療は、敗血症の治療の必要がある対象の血液濾過を含み得る。いくつかの態様において、濾過を体外で行う。
ある態様において、本明細書に記載のヘム結合性分子および／または構成物を含む組成物の有効用量を患者へ投与することができ、または患者を、本明細書に記載のヘム結合性構成物を使用する血液濾過へ1回供することができる。ある態様において、本明細書に記載のヘム結合性分子および／または構成物を含む組成物の有効用量を患者へ投与することができ、または患者を、本明細書に記載のヘム結合性構成物を使用する血液濾過へ繰り返し供することができる。全身投与について、ヘム結合性分子および／または構成物を含む組成物の治療量、例えば、0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg、またはそれ以上を、対象へ投与することができる。
いくつかの態様において、最初の治療レジメン後、より少ない頻度で治療を施すことができる。例えば、隔週で3ヵ月間治療した後、6ヵ月または1年またはそれ以上の間、月1回で治療を繰り返すことができる。本明細書に記載の方法に従う治療は、状態、例えば敗血症、の症状またはマーカーのレベルを、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%またはそれ以上、減少させることができる。
本明細書に記載の組成物の投薬量は、医師によって決定され得、必要に応じて、観察される治療効果に適合するように調節され得る。治療の期間および頻度に関して、いつ治療が治療的利益を提供しているかを決定するために、ならびに投薬量を増加もしくは減少させるかどうか、投与頻度を増加もしくは減少させるかどうか、治療を中止するかどうか、治療を再開するかどうか、または治療レジメンに対して他の変更を行うかどうかを決定するために、熟練した臨床医が対象をモニタリングすることは、典型的である。投薬スケジュールは、多数の臨床的因子、例えば、ヘムレベルに対する対象の感受性に依存して、週1回から毎日まで変化し得る。活性化の所望の用量または量を、一度に、またはサブ用量、例えば2～4のサブ用量に分割して投与することができ、ある期間にわたって、例えば、その日を通じての適切な間隔でまたは他の適切なスケジュールで、投与することができる。いくつかの態様において、投与は、長期的、例えば、1つまたは複数の用量および／または治療を数週間または数ヶ月の期間にわたって毎日、であり得る。投薬および／または治療スケジュールの例は、1週間、2週間、3週間、4週間、1ヵ月間、2ヵ月間、3ヵ月間、4ヵ月間、5ヵ月間、または6ヵ月間またはそれ以上の期間にわたって、毎日、1日2回、1日3回、または1日4回またはそれ以上の投与である。ヘム結合性分子および／または構成物を含む組成物は、ある期間にわたって、例えば、5分、10分、15分、20分、または25分の期間にわたって、投与することができる。
本明細書に記載の方法に従うヘム結合性分子および／または構成物の投与についての投薬量範囲は、例えば、ポリペプチドの形態、その効力、および本明細書に記載の状態の症状、マーカーまたは指標が減らされるように望まれる程度、例えば、血液中の遊離ヘムレベルについて望まれるパーセンテージ減少に依存する。投薬量は、有害な副作用を引き起こすほど大量であってはならない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態および性別に従って変化し、当業者によって決定され得る。何らかの合併症が認められる場合には、投薬量はまた、個々の医師によって調節され得る。
例えば、本明細書に記載の状態の治療、または本明細書に記載の反応（例えば、血液中の遊離ヘムレベルの減少）を誘導することにおける、ヘム結合性分子および／または構成物の効能は、熟練した臨床医によって決定することができる。しかし、本明細書に記載の状態の徴候または症状のうちの1つまたは複数が有利に変化する場合、他の臨床的に受け入れられる症状が改善するもしくはさらには好転する場合、または所望の反応が本明細書に記載の方法に従う治療後に例えば少なくとも10%誘導される場合、治療は、その用語が本明細書において使用される場合、「有効な治療」とみなされる。効能は、例えば、本明細書に記載の方法に従って治療される状態のマーカー、指標、症状および／もしくは発生数、または任意の他の適切な測定可能なパラメータ、例えば血液中の遊離ヘムのレベル、を測定することによって、評価され得る。効能はまた、入院、または医学的介入の必要性によって評価されるように、個体が悪化しない（即ち、疾患の進行が停止している）ことによって、測定することができる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ／または、本明細書に記載されている。治療は、個体または動物（いくつかの非限定的な例はヒトまたは動物を含む）における疾患の任意の治療を含み、(1)疾患の阻止、例えば、症状（例えば、疼痛または炎症）の悪化の予防；または(2)疾患の重症度の軽減、例えば、症状の後退を生じさせることを含む。疾患の治療に対する有効量は、その必要がある対象へ投与されると、その疾患に対して有効な治療（その用語は本明細書に定義される）を生じさせるために十分である量を意味する。薬剤の効能は、状態の物理的指標または所望の反応（例えば、血液中の遊離ヘムレベルの低下）を評価することによって、決定することができる。そのようなパラメータの任意の1つまたはパラメータの任意の組み合わせを測定することによって投与および／または治療の効能をモニタリングすることは、十分に当業者の能力内にある。効能は、本明細書に記載の状態、例えば敗血症の治療の動物モデルにおいて評価することができる。実験動物モデルを使用する場合、治療の効能は、マーカー、例えば、血液中の遊離ヘムのレベルの統計的に有意な変化が観察される場合に、証明される。
所定の用量の組成物の評価を可能にするインビトロアッセイを本明細書に提供する。所定の投薬組み合わせの効能も、動物モデル、例えば、敗血症の動物モデルにおいて評価することができる。
便宜上、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用されるいくつかの用語および句の意味を、以下に提供する。特に指定のない限り、または文脈から暗示されない限り、以下の用語および句は、以下に提供する意味を含む。定義は、特定の態様を記載するのを助けるために提供されるが、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、特許請求される発明を限定するようには意図されない。特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。当技術分野における用語の使用法と本明細書に提供されるその定義との間に明らかな矛盾が存在する場合、本明細書で提供される定義が優先する。
便宜上、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において用いられる特定の用語をここに集める。
用語「低下する」、「減少した」、「減少」、または「阻害する」は全て、統計的に有意な量の低下を意味するために本明細書において使用される。いくつかの態様において、「減少する」、「減少」または「低下する」または「阻害する」は、典型的に、参照レベル（例えば、所定の治療の欠如）と比較して少なくとも10%の低下を意味し、例えば、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、またはそれ以上の低下を含み得る。本明細書において使用される場合、「減少」または「阻害」は、参照レベルと比較しての完全な阻害または減少を包含しない。「完全な阻害」は、参照レベルと比較しての100%阻害である。低下は、好ましくは、所定の障害を有さない個体についての正常の範囲内として認められるレベルへの低下であり得る。
用語「増加した」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」は全て、統計的に有意な量の増加を意味するために本明細書において使用される。いくつかの態様において、用語「増加した」、「増加する」、「増強する」、または「活性化する」は、参照レベルと比較して少なくとも10%の増加、例えば、少なくとも約20%、または少なくとも約30%、または少なくとも約40%、または少なくとも約50%、または少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%の増加、または100%増加までかつ100%増加を含む増加、または、参照レベルと比較して10～100%の任意の増加、または、参照レベルと比較して少なくとも約2倍、または少なくとも約3倍、または少なくとも約4倍、または少なくとも約5倍または少なくとも約10倍の増加、または、2倍～10倍もしくはそれ以上の任意の増加を意味し得る。マーカーまたは症状の文脈において、「増加」は、そのようなレベルでの統計的に有意な増加である。
本明細書において使用される場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、脊椎動物、例えば、霊長動物、齧歯動物、家畜または狩猟動物である。霊長動物には、チンパンジー、カニクイザル、クモザルおよびマカクザル、例えば、アカゲザルが含まれる。齧歯動物には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、家飼いネコなどのネコ科動物種、イヌ、キツネ、オオカミなどのイヌ科動物種、ニワトリ、エミュー、ダチョウなどの鳥類種、ならびにマス、ナマズおよびサケなどの魚類が含まれる。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物、例えば、霊長動物、例えば、ヒトである。用語「個体」、「患者」および「対象」は、本明細書において交換可能に使用される。
好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物を、敗血症の動物モデルとなる対象として有益に利用することができる。対象は雄性または雌性であり得る。
本明細書において使用される場合、「ヘム」は、Fe2+に結合されたプロトポルフィリンIX（即ち、式Iの構造を有する化合物）を指す。いくつかの態様において、「ヘム」は、ヘミン（即ち、プロトポルフィリンIX-Fe3+の塩化物塩）および／またはヘマチン（即ち、プロトポルフィリンIX-Fe3+水酸化物）をさらに指し得る。
Figure 2022107724000006
本明細書において使用される場合、「部分」は、全体のパーツまたは断片、例えば、完全な分子のパーツまたは断片を指す。特定の分子は、複数の部分、例えば、2つの部分、3つの部分、4つの部分、5つの部分、またはそれ以上の部分を有することができる。
対象は、治療の必要がある状態（例えば、敗血症）またはそのような状態に関連する1つもしくは複数の合併症に苦しんでいるまたはこれを有していると以前に診断または特定され、任意で、敗血症または敗血症に関連する1つもしくは複数の合併症の治療を既に受けたものであり得る。あるいは、対象はまた、敗血症または敗血症に関連する1つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されていないものであり得る。例えば、対象は、敗血症または敗血症に関連する1つもしくは複数の合併症についての1つまたは複数の危険因子を示すもの、または危険因子を示さないものであり得る。
特定の状態に対する治療の「必要がある対象」は、その状態を有する、その状態を有すると診断された、またはその状態を発症する危険性がある対象であり得る。
本明細書において用いられる場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、隣接残基のαアミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結された一連のアミノ酸残基を示すために本明細書において交換可能に用いられる。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能にかかわらず、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化等）およびアミノ酸アナログを含むアミノ酸のポリマーを意味する。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、比較的大きいポリペプチドに関連して用いられることが多く、「ペプチド」という用語は、小さいポリペプチドに関連して用いられることが多いが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は一部共通する。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において、遺伝子産物およびその断片について言及する場合、交換可能に用いられる。このため、例示的なポリペプチドまたはタンパク質は、遺伝子産物、天然のタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、ならびに前述のものの他の同等物、変異体、断片、およびアナログを含む。
本明細書において用いられる場合、「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはそれらのアナログの単位を組み込んでいる任意の分子、好ましくはポリマー分子を意味する。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。一本鎖核酸は、変性させた二本鎖DNAの一方の核酸鎖であり得る。あるいは、それは、いかなる二本鎖DNAにも由来しない一本鎖核酸であり得る。一局面において、核酸はDNAである。別の局面において、核酸はRNAである。好適な核酸分子は、ゲノムDNAまたはcDNAを含むDNAである。他の好適な核酸分子は、mRNAを含むRNAである。
本明細書において使用される場合、用語「治療する」、「治療」、「治療すること」、または「改善」は、疾患または障害、例えば敗血症、と関連する状態の進行または重症度を逆転する、軽減する、改善する、阻害する、遅らせる、または停止させることを目的とする、状態の治療的処置を意味する。「治療する」という用語は、敗血症と関連する状態、疾患または障害の少なくとも1つの有害な効果または症状を減少または軽減することを含む。1つまたは複数の症状または臨床マーカーが減少したら、治療は一般的に「有効」である。あるいは、状態の進行が低下または停止したら、治療は「有効」である。即ち、「治療」とは、症状またはマーカーの改善のみならず、治療の非存在下で予想されるであろうものと比較しての症状の進行または悪化の停止または少なくとも遅延を含む。有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能または検出不可能にかかわらず、1つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（即ち、悪化しない）、疾患進行の遅延または遅れ、疾患状態の改善または緩和、寛解（部分的であるか完全であるかにかかわらず）、および／または死亡率の低下を含むがこれらに限定されるわけではない。疾患の「治療」という用語はまた、疾患の症状または副作用からの軽減をもたらすことを含む（姑息的療法を含む）。
本明細書において使用される場合、用語「薬学的組成物」は、薬学的に許容される担体、例えば、製薬産業において一般的に用いられる担体と組み合わせた活性物質を指す。句「薬学的に許容される」は、本明細書において、妥当な利益／リスク比に相応し、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適している化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を指すために用いられる。
本明細書において使用される場合、用語「投与すること」は、所望の部位への薬剤の少なくとも部分的な送達をもたらす方法または経路によって対象へ本明細書に開示される化合物を配置することを指す。本明細書に開示される化合物を含む薬学的組成物は、対象において有効な治療をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。
用語「統計的に有意な」または「有意に」は、統計学的有意性を指し、一般に、2標準偏差（2SD）またはそれ以上の差を意味する。
操作実施例（operating example）以外において、または別のように指示される場合を除き、本明細書において用いられる成分の数量または反応条件を表す全ての数は、いかなる場合にも「約」という用語で修飾されていると解釈されるべきである。「約」という用語は、パーセンテージに関連して用いられる場合、±1％を意味し得る。
本明細書において使用される場合、用語「含むこと」または「含む」は、組成物、方法、および該方法または該組成物にとって必須であるそれらの各構成要素に関して用いられるが、必須であるか否かにかかわらず明記されていない要素を含めることは許容される。
用語「からなる」は、本明細書において記述される組成物、方法、およびそれらの各構成要素を意味し、態様のその記述において記載されていない全ての要素を除外する。
本明細書において使用される場合、用語「から本質的になる」は、所定の態様にとって必要な要素を意味する。この用語は、その態様の基本的かつ新規なまたは機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。
単数形の用語「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかにそれ以外であることを示している場合を除き、複数形の指示物を含む。同様に、「または」という用語は、文脈が明らかにそれ以外であると示している場合を除き「および」を含むと意図される。本明細書において記述される方法および材料と類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験において用いることができるが、適した方法および材料を以下に記述する。省略語「e.g.」は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書において非制限的な例を示すために用いられる。このため、省略語「e.g.」は、「例えば」という用語と同義である。
細胞生物学および分子生物学における一般的な用語の定義は、"The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 19th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); Benjamin Lewin, Genes X, published by Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (eds.), , Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)およびCurrent Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., edsにおいて見出すことができる。
それ以外であると明記している場合を除き、本発明は、例えば、それらの全体が参照により本明細書に全て組み入れられる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2001); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995); Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), およびCulture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998)において記述されるように、標準的な手順を用いて行われた。
他の用語を本明細書において本発明の様々な局面の説明内で定義する。
本出願にわたって引用された、参照文献、交付済み特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む、全ての特許および他の刊行物は、例えば、本明細書に記載の技術に関連して用いられ得るそのような刊行物に記述される方法論を説明および開示する目的のために、参照により本明細書に明白に組み入れられる。これらの刊行物は、単にその開示が本出願の提出日より前になされたために提供される。この点に関していかなるものも、本発明者らが、先行発明であるとの理由でまたは他の何らかの理由により、そのような開示に先行する権利がないことの承認と解釈すべきではない。これらの文献の日付に関する言明または内容に関する説明は全て、本出願人が入手可能な情報に基づくものであり、これらの文献の日付または内容が正確であると決して認めるものではない。
本開示の態様の説明は、網羅的であることも、本開示を厳密な開示された形式に制限することも、意図していない。本開示の特定の態様および実施例は、説明目的のために本明細書において記述されるが、関連する当業者によって認識されるように、本開示の範囲内で、様々な同等の修飾が可能である。例えば、方法の段階または機能は、所定の順序で示されるが、別の態様は、異なる順序で機能を行ってもよく、または機能を実質的に同時に行ってもよい。本明細書において提供される本開示の教示は、必要に応じて他の技法または方法に適用され得る。本明細書において記述される様々な態様を組み合わせて、さらなる態様を提供することができる。本開示の局面は、本開示のなおさらなる態様を提供するために、必要であれば、上記の参考文献および出願の組成物、機能、および概念を使用するように変更することができる。さらに、生物学的機能の等価性の考慮に起因して、種類または量の点で生物学的または化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造においていくらかの変更を行うことができる。これらおよび他の変更を、詳細な説明に照らして本開示に対して行うことができる。全てのそのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるように意図される。
前述の態様のいずれかの特定の要素を、他の態様の要素と組み合わせてもよく、または置換してもよい。さらに、本開示のある態様に関連する利点がこれらの態様の文脈において記述されているが、他の態様もまた、そのような利点を示し得、必ずしも全ての態様が本開示の範囲内に入るためにそのような利点を示す必要はない。
本明細書に記載の技術を、さらに制限的であると決して解釈されるべきではない下記の実施例によってさらに説明する。
本明細書に記載の技術のいくつかの態様は、以下の番号が付けられた項目のいずれかに従って定義され得る：
1. ヘモペキシンドメインと、
リンカー；微生物結合性分子；および／または基質結合性ドメインからなる群より選択される第2ドメインと
を含む、操作されたヘム結合性分子であって、
第2ドメインがヘモペキシンドメインにコンジュゲートされている、操作されたヘム結合性分子。
2. 基質結合性ドメインがFcドメインまたはAKT（SEQ ID NO: 35）である、項目1の操作されたヘム結合性分子。
3. Fcドメインにコンジュゲートされたヘモペキシンドメインを含むヘム結合性構成物。
4. 検出可能な標識をさらに含む、項目1～3のいずれかの分子または構成物。
5. 項目1～4のいずれかのヘム結合性分子またはヘム結合性構成物を含み、さらに微生物結合性ドメインを含む、構成物。
6. 微生物結合性ドメインが、
MBLおよびCRP
からなる群より選択される、項目1または5の構成物。
7. ヘム結合性分子または構成物がコンジュゲートされている固体基板または支持体をさらに含む、項目1～6のいずれかの構成物または分子。
8. 固体基板または支持体が中空繊維である、項目7の構成物または分子。
9. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の配列を含むポリペプチドである、項目1～8のいずれかのヘム結合性構成物または分子。
10. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の配列を有するポリペプチドである、項目1～9のいずれかのヘム結合性構成物または分子。
11. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基27～233に対応する配列を有するポリペプチドを含む、項目1～8のいずれかのヘム結合性構成物または分子。
12. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基1～233に対応する配列を有するポリペプチドを含む、項目1～8のいずれかのヘム結合性構成物または分子。
13. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基27～220に対応する配列を有するポリペプチドを含む、項目1～8のいずれかのヘム結合性構成物または分子。
14. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基1～220に対応する配列を有するポリペプチドを含む、項目1～8のいずれかのヘム結合性構成物または分子。
15. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基27～213に対応する配列を有するポリペプチドを含む、項目1～8のいずれかのヘム結合性構成物または分子。
16. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基1～213に対応する配列を有するポリペプチドを含む、項目1～8のいずれかのヘム結合性構成物または分子。
17. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基220～226に対応する残基が約1～10アミノ酸長のポリペプチドリンカーで置き換えられている突然変異を含む、項目1～16のいずれかのヘム結合性構成物または分子。
18. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基220～226に対応する残基が配列GSGS（SEQ ID NO: 18）で置き換えられている突然変異を含む、項目1～17のいずれかのヘム結合性構成物または分子。
19. Fcドメインが、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 17の配列を有するポリペプチドである、項目1～18のいずれかのヘム結合性構成物または分子。
20. SEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 5の配列を有する、項目3のヘム結合性構成物。
21. 対象の血液と、項目1～20のいずれかのヘム結合性構成物もしくは分子またはヘモペキシンドメインを含む分子とを接触させる工程を含む、対象の血液中の遊離ヘムのレベルを減少させる方法。
22. 有効量の項目1～20のいずれかのヘム結合性構成物もしくは分子またはヘモペキシンドメインを含む分子を投与する工程を含む、敗血症を治療する方法。
23. 対象の血液と、項目1～20のいずれかのヘム結合性構成物もしくは分子またはヘモペキシンドメインを含む分子とを接触させる工程を含む、対象の血液中のミオグロビンのレベルを減少させる方法。
24. 有効量の項目1～20のいずれかのヘム結合性構成物もしくは分子またはヘモペキシンドメインを含む分子を投与する工程を含む、横紋筋融解症または圧挫損傷を治療する方法。
25. 投与が、対象の血液と、ヘモペキシンドメインを含むヘム結合性構成物または分子とを接触させる工程を含む、項目22または24の方法。
26. 接触させる工程の前に対象の血液の一部分を取り出し、接触させる工程を体外で行い、次いで対象の血液の該一部分を対象へ戻す工程をさらに含む、項目21～25のいずれかの方法。
27. ヘモペキシンドメインを含むヘム結合性構成物または分子が、体外デバイスの固体基板に結合されている、項目26の方法。
28. 固体基板が、フィルター、アフィニティーカラム、ビーズ、または粒子である、項目27の方法。
29. ヘモペキシンドメインを含む分子が、ヘモペキシンドメインから本質的になる分子である、項目21～28のいずれかの方法。
30. ヘモペキシンドメインを含む分子が、ヘモペキシンドメインからなる分子である、項目21～29のいずれかの方法。
31. ヘモペキシンドメインを含む分子が、SEQ ID NO: 1～2または9～16のいずれかの配列を有する、項目21～30のいずれかの方法。
32. タンパク質の産生に適した条件下で項目1～20のいずれかのヘム結合性構成物または分子をコードする核酸を含む細胞を培養する工程；および
安定化ドメイン結合性試薬を用いたアフィニティー精製、イオン交換精製、またはサイズに基づく精製によって、該ヘム結合性構成物または分子を精製する工程
を含む、ヘム結合性構成物または分子を産生する方法。
33. 細胞が、
微生物細胞；哺乳動物細胞；昆虫細胞；および植物細胞
からなる群より選択される、項目32の方法。
34. タンパク質の産生に適したインビトロ転写および／またはインビトロ翻訳条件下で項目1～20のいずれかのヘム結合性構成物または分子をコードする核酸を維持する工程；ならびに
安定化ドメイン結合性試薬を用いたアフィニティー精製、イオン交換精製、またはサイズに基づく精製によって、該ヘム結合性構成物を精製する工程
を含む、ヘム結合性分子または構成物を産生する方法。
実施例1：敗血症の治療のためのヘモペキシンおよびヘモペキシン断片へのFc融合物
敗血症は、重篤な微生物感染症に関係していることが多い致死的な状態である。しかし、多くの仮説が提案されたが、敗血症性ショックの正確な原因は合意されておらず、これらの様々な仮説の源を標的化することに基づく治療法は、全般的に臨床試験において（または臨床試験前に）失敗した。研究によって、最近、血液中の過剰な遊離ヘムが敗血症の進行において役割を果たしているようであり、血液から過剰なヘムを除去する機構は、敗血症に苦しんでいる患者において非常に有用であり得ることが示唆された。宿主抗微生物機構は、病原体への鉄の利用可能性を減少させる。自然免疫反応に影響を与える鉄タンパク質としては、ヘプシジン、ラクトフェリン、シデロカリン（siderocalin）、ハプトグロビン、ヘモペキシン、Nramp1、フェロポーチンおよびトランスフェリン受容体が挙げられる(1)。
通常の生理学的条件下で、タンパク質ヘモペキシンは、遊離ヘムに結合し、肝臓を活性化し、循環から過剰な遊離ヘムを除去することを担っている。敗血症患者または動物において、微生物感染は、赤血球（RBS）溶解の大幅な増加をもたらし得、これは次に、血流中の可溶性遊離ヘムの著しい増加をもたらす。この増加は、ヘモペキシンの内因性レベルを圧倒し、ヘムの危険なほど高いレベルへ至る。血液中の過剰なヘムは、微生物病原体に容易に利用可能な鉄源を提供し、これは微生物増殖における制限因子であり得、細菌またはウイルス感染が血液と共存する場合、ヘモグロビンおよびヘムは、微生物誘発炎症に実質的に寄与し得る(2)。さらに、正確なメカニズムは全体として決定されていないが、遊離ヘムは個体に対して負の効果を有し得る。
現在、血液中の高いヘムに直接対処する戦略は存在しない。現在の治療は一般に抗生物質の投与を含む。過去の臨床試験は、微生物感染症に対する免疫系反応を制限し、それによって敗血症の原因因子であると仮定された「サイトカインストーム」を減らすことに集中した。加えて、人々は、可溶性サイトカインを除去するために、さらにはサイトカインを除去するために、透析の使用に目を向けた。
免疫原性物質を導入することなくヘムを標的化して除去するための内因性タンパク質の内因性型または操作型へのFc融合物を本明細書に記載する。完全長ヘモペキシンおよびヘモペキシンのアミノ末端ドメインは両方とも、それぞれ、1pMおよび1nMの結合定数でヘムに結合することが示された。完全長ヒトヘモペキシンへのFc融合物、ヒトヘモペキシンのN末端ドメインの複数の断片へのFc融合物、および完全長ヘモペキシンへのFc融合物（ここで、2つの構造ドメインを連結するリンカーが異なるポリペプチドリンカーで置き換えられている）の設計および産生をここに記載する。
多くの内因性タンパク質の組換え型の発現および精製は困難であり得、ヘモペキシンでの大抵の実験は、血液から精製されたヘモペキシンを使用した(3)。
Fc-ヘモペキシン融合物の配列：
> aktFcヘモペキシン；N末端からC末端へ列挙された以下のモチーフの融合タンパク質：トリペプチドAla-Lys-Thr（SEQ ID NO: 35）、ヒトIgG1（N297D）のネックおよびFc領域、単一アラニン挿入、ヒトヘモペキシン（リーダー配列は除去されている）（SEQ ID NO:3）。
Figure 2022107724000007
> aktFcヘモペキシンNT：N末端からC末端へ列挙された以下のモチーフの融合タンパク質：トリペプチドAla-Lys-Thr（SEQ ID NO: 35）、ヒトIgG1（N297D）のネックおよびFc領域、単一アラニン挿入、ヒトヘモペキシンのN末端ドメイン（発現されたタンパク質の残基24～256）（SEQ ID NO: 4）。
Figure 2022107724000008
FcのN末端でのAKTトリペプチド（SEQ ID NO: 35）は、タンパク質の部位特異的修飾を可能にし、任意である。N297D突然変異は、Fc断片のアグリコシル化（agylcosylated）型を生じさせ、野生型アスパラギン（N297）は、発現およびFc受容体相互作用について望ましいグリコシル化状態に依存して使用され得る。
Fc-ヘモペキシン融合物の発現および精製。上記の遺伝子を哺乳動物発現ベクターへクローン化し、293F細胞(Invitrogen)へトランスフェクションした。5日後、上澄みを集め、プロテインAカラム(GE)上へロードした。プロテインAに結合されたFc含有タンパク質を、低pH緩衝液中に溶出し、pH 7へ中和した。精製されたタンパク質の量を定量し、SDSゲルにおいて泳動させ、その純度を確認した（表1および図1）。
Figure 2022107724000009
遊離ヘミンへのFc-ヘモペキシン融合物の結合（ヘミンはヘムの塩化物イオンである）。Fc-ヘモペキシン、Fc-ヘモペキシン-NT、Fcヘモペキシン-G220、Fcヘモペキシン-H213およびFcヘモペキシン-G220H226GSGS（「GSGS」はSEQ ID NO: 18として開示）は全て、遊離ヘミンに結合し、Fc-ヘモペキシンへのヘミンの結合は、天然ヒトヘモペキシンへのヘミンの結合と識別不可能である（図2、4、および5）。
参考文献
Figure 2022107724000010
実施例2
ミオグロビンへの様々なFcHx構築物の結合を測定した（表2）。
表2に記載のポリペプチドをSEQ ID NO: 17のC末端へ融合し、これは、N末端上にアラニン-リジン-スレオニントリペプチドおよびC末端上に単一アラニンを有するヒトIgGのFc断片を含む。表2はこれらのタンパク質からの発現および結合データを要約する。
ヘモペキシンのN末端ドメインの変異体を有するFc融合物のヘム結合を測定した（図3）。遊離ヘムを、指定のタンパク質と共にインキュベートし、次いで、酵素的ヘム依存性ペルオキシダーゼ反応を使用して遊離ヘムを間接的に検出した。完全長ヘモペキシンの変異体を有するFc融合物のヘム結合も測定した（図4）。
ミオグロビンへのFcヘモペキシン変異体の結合を測定した（図5）。ミオグロビンをアッセイウェルにコートし、次いで、Fcヘモペキシン融合物、Fc単独（陰性対照）、組換えヘモペキシンおよび抗ミオグロビン抗体（陽性対照）を含む、様々なタンパク質プローブと共にインキュベートした。次いで、タンパク質プローブの結合を、ホースラディシュペルオキシダーゼ検出システムを使用してアッセイし、各タンパク質プローブについてのデータを、ミオグロビンがコートされていないウェルと比較した。
Figure 2022107724000011
 * 開始および終了残基は成熟ヒトヘモペキシンのナンバリングシステムを使用する
** gly 220からthr 219までの残基はgly-ser-gly-serリンカー（SEQ ID NO: 18）で置き換えられている
一般的なELISA試薬および条件は以下の通りであった：洗浄バッファー：PBS-T (175 ul x 6)；インキュベーションバッファー：PBS；プレブロック = 1%ミルクおよびPBS (RT、1時間)；タンパク質とのインキュベーション(RT、1時間)；抗体-HRPバッファー = PBS中0.5%ミルク(RT、1時間)。

Claims (34)

  1. ヘモペキシンドメインと、
    リンカー；微生物結合性分子；および／または基質結合性ドメインからなる群より選択される第2ドメインと
    を含む、操作されたヘム結合性分子であって、
    第2ドメインがヘモペキシンドメインにコンジュゲートされている、操作されたヘム結合性分子。
  2. 基質結合性ドメインがFcドメインまたはAKT（SEQ ID NO: 35）である、請求項1記載の操作されたヘム結合性分子。
  3. Fcドメインにコンジュゲートされたヘモペキシンドメインを含むヘム結合性構成物。
  4. 検出可能な標識をさらに含む、請求項1～3のいずれか一項記載の分子または構成物。
  5. 請求項1～4のいずれか一項記載のヘム結合性分子またはヘム結合性構成物を含み、さらに微生物結合性ドメインを含む、構成物。
  6. 微生物結合性ドメインが、
    MBLおよびCRP
    からなる群より選択される、請求項1または5記載の構成物。
  7. ヘム結合性分子または構成物がコンジュゲートされている固体基板または支持体をさらに含む、請求項1～6のいずれか一項記載の構成物または分子。
  8. 固体基板または支持体が中空繊維である、請求項7記載の構成物または分子。
  9. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の配列を含むポリペプチドである、請求項1～8のいずれか一項記載のヘム結合性構成物または分子。
  10. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の配列を有するポリペプチドである、請求項1～9のいずれか一項記載のヘム結合性構成物または分子。
  11. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基27～233に対応する配列を有するポリペプチドを含む、請求項1～8のいずれか一項記載のヘム結合性構成物または分子。
  12. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基1～233に対応する配列を有するポリペプチドを含む、請求項1～8のいずれか一項記載のヘム結合性構成物または分子。
  13. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基27～220に対応する配列を有するポリペプチドを含む、請求項1～8のいずれか一項記載のヘム結合性構成物または分子。
  14. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基1～220に対応する配列を有するポリペプチドを含む、請求項1～8のいずれか一項記載のヘム結合性構成物または分子。
  15. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基27～213に対応する配列を有するポリペプチドを含む、請求項1～8のいずれか一項記載のヘム結合性構成物または分子。
  16. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基1～213に対応する配列を有するポリペプチドを含む、請求項1～8のいずれか一項記載のヘム結合性構成物または分子。
  17. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基220～226に対応する残基が約1～10アミノ酸長のポリペプチドリンカーで置き換えられている突然変異を含む、請求項1～16のいずれか一項記載のヘム結合性構成物または分子。
  18. ヘモペキシンドメインが、SEQ ID NO: 2の残基220～226に対応する残基が配列GSGS（SEQ ID NO: 18）で置き換えられている突然変異を含む、請求項1～17のいずれか一項記載のヘム結合性構成物または分子。
  19. Fcドメインが、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 17の配列を有するポリペプチドである、請求項1～18のいずれか一項記載のヘム結合性構成物または分子。
  20. SEQ ID NO: 4またはSEQ ID NO: 5の配列を有する、請求項3記載のヘム結合性構成物。
  21. 対象の血液と、請求項1～20のいずれか一項記載のヘム結合性構成物もしくは分子またはヘモペキシンドメインを含む分子とを接触させる工程を含む、対象の血液中の遊離ヘムのレベルを減少させる方法。
  22. 有効量の請求項1～20のいずれか一項記載のヘム結合性構成物もしくは分子またはヘモペキシンドメインを含む分子を投与する工程を含む、敗血症を治療する方法。
  23. 対象の血液と、請求項1～20のいずれか一項記載のヘム結合性構成物もしくは分子またはヘモペキシンドメインを含む分子とを接触させる工程を含む、対象の血液中のミオグロビンのレベルを減少させる方法。
  24. 有効量の請求項1～20のいずれか一項記載のヘム結合性構成物もしくは分子またはヘモペキシンドメインを含む分子を投与する工程を含む、横紋筋融解症または圧挫損傷を治療する方法。
  25. 投与が、対象の血液と、ヘモペキシンドメインを含むヘム結合性構成物または分子とを接触させる工程を含む、請求項22または24記載の方法。
  26. 接触させる工程の前に対象の血液の一部分を取り出し、接触させる工程を体外で行い、次いで対象の血液の該一部分を対象へ戻す工程をさらに含む、請求項21～25のいずれか一項記載の方法。
  27. ヘモペキシンドメインを含むヘム結合性構成物または分子が、体外デバイスの固体基板に結合されている、請求項26記載の方法。
  28. 固体基板が、フィルター、アフィニティーカラム、ビーズ、または粒子である、請求項27記載の方法。
  29. ヘモペキシンドメインを含む分子が、ヘモペキシンドメインから本質的になる分子である、請求項21～28のいずれか一項記載の方法。
  30. ヘモペキシンドメインを含む分子が、ヘモペキシンドメインからなる分子である、請求項21～29のいずれか一項記載の方法。
  31. ヘモペキシンドメインを含む分子が、SEQ ID NO: 1～2または9～16のいずれかの配列を有する、請求項21～30のいずれか一項記載の方法。
  32. タンパク質の産生に適した条件下で請求項1～20のいずれか一項記載のヘム結合性構成物または分子をコードする核酸を含む細胞を培養する工程；および
    安定化ドメイン結合性試薬を用いたアフィニティー精製、イオン交換精製、またはサイズに基づく精製によって、該ヘム結合性構成物または分子を精製する工程
    を含む、ヘム結合性構成物または分子を産生する方法。
  33. 細胞が、
    微生物細胞；哺乳動物細胞；昆虫細胞；および植物細胞
    からなる群より選択される、請求項32記載の方法。
  34. タンパク質の産生に適したインビトロ転写および／またはインビトロ翻訳条件下で請求項1～20のいずれか一項記載のヘム結合性構成物または分子をコードする核酸を維持する工程；ならびに
    安定化ドメイン結合性試薬を用いたアフィニティー精製、イオン交換精製、またはサイズに基づく精製によって、該ヘム結合性構成物を精製する工程
    を含む、ヘム結合性分子または構成物を産生する方法。
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