ES2326109B1 - Microdispositivo de separacion y extraccion selectiva y no invasiva de particulas en suspensiones polidispersas, procedimiento de fabricacion y sus aplicaciones. - Google Patents
Microdispositivo de separacion y extraccion selectiva y no invasiva de particulas en suspensiones polidispersas, procedimiento de fabricacion y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Microdispositivo de separación y extracción
selectiva y no invasiva de partículas en suspensiones
polidispersas, procedimiento de fabricación y sus aplicaciones.
La presente invención describe un
microdispositivo de separación y extracción no invasiva y selectiva
de partículas en suspensiones polidispersas mediante el uso
estratégico de ultrasonidos, flujo laminar y efectos de onda
estacionaria establecidos en un canal realizado en microtecnología
en un chip. Este dispositivo tipo lamda cuartos modificado permite
canalizar y separar las partículas en un flujo interior del canal
del sustrato sin tocar las paredes del dispositivo, por lo que son
menos dañadas. Este microdispositivo puede utilizarse en el campo
de la biomedicina y/o biotecnología para la separación y
concentración de células, preferentemente humanas, útiles para
procedimientos de investigación y médicos de diagnóstico y
tratamiento.
Description
Microdispositivo de separación y extracción
selectiva y no invasiva de partículas en suspensiones polidispersas,
procedimiento de fabricación y sus aplicaciones.
La presente invención se refiere a un
dispositivo en el que se combinan microtecnología y ondas
ultrasónicas como método no invasivo para realizar separación
selectiva y extracción de partículas en suspensiones polidispersas,
conteniendo microelementos con diferentes características físicas
(tamaño, densidad o compresiblidad) y para cualquier nivel de
concentración, siendo sus aplicaciones principales en el campo
biomédico y biotecnológico.
Durante la última década se han propuesto
diversas técnicas para manipulación o separación de partículas en
suspensión en diversos campos de aplicación tecnológica, entre los
cuales se destaca la biotecnología y la medicina. La separación de
partículas es de especial interés en la actualidad médica para
aplicaciones relacionadas con donaciones de sangre, procesos de
diálisis y análisis de laboratorio, así como reciclado y/o lavado
de sangre tras operaciones quirúrgicas.
La aplicación de ondas acústicas estacionarias
sobre suspensiones produce efectos de conducción de las partículas
hacia determinadas zonas de equilibrio relacionadas con la
distribución de nodos y máximos de presión acústica que establece
la onda estacionaria generada en el medio. Sobre cada partícula se
ejerce una fuerza de radiación primaria inducida acústicamente,
cuya magnitud varía proporcionalmente a la frecuencia de
operación. El camino que debe recorrer una partícula sometida a
esta fuerza para alcanzar la posición de equilibrio acústico más
próxima es menor cuanto menor sea la distancia entre nodos y máximos
de presión acústica. Estos están definidos por la longitud de onda,
que es inversamente proporcional a la frecuencia acústica. Por
ello, es más sencillo desde el punto de vista teórico concentrar
partículas a frecuencias más elevadas.
Este mecanismo de conducción no invasiva es
ampliamente conocido en la disciplina de los ultrasonidos y ha dado
lugar durante la última década al desarrollo de un número de
intentos para manipulación y/o separación de partículas. Se han
propuesto diversas técnicas usando este fenómeno para separar
partículas de un líquido u otro fluido. Típicamente el fluido
circula a través de un conducto o canal en el que se establece una
onda acústica estacionaria transversal a la longitud del canal. De
acuerdo a ello, las partículas se desplazan para formar bandas de
concentración a lo largo de las posiciones de equilibrio de la onda
dentro de estos conductos.
\sqbullet En la reciente patente WO
2007/044642 A2, "DEVICE AND METHOD FOR COMBINED
MICROFLUIDIC-MICROMAGNETIC SEPARATION OF MATERIAL
IN CONTINUOUS FLOW" (Ingber Donald, Xia Shannon, Tom Hunt, Peter
Westervelt), se presenta un dispositivo de separación celular en
flujo continuo basado en la aplicación de campos magnéticos. El
principio de operación es completamente diferente al de la presente
invención, ya que no se basa en la aplicación de energía mecánica
sino electromagnética y, a diferencia de la presente invención, es
una tecnología invasiva que requiere la inserción de
micropartículas inorgánicas ajenas a la suspensión a tratar. Estas,
susceptibles al campo magnético, se adhieren y arrastran a
determinadas células de la suspensión, conduciéndolas
magnéticamente hacia los lugares de equilibrio
pre-seleccionados. Por tratarse de un método
invasivo, la viabilidad de las células separadas se ve parcialmente
alterada para la realización de estudios posteriores, una vez
extraídas del medio. Estas dos características del dispositivo hacen
la patente fuertemente diferente al de la presente invención,
aunque ambas coincidan en la utilización de doble lecho de flujo
en régimen laminar con una interfase.
\sqbullet En la publicación J. Statis. Mech.:
"THEORY AND EXPERIMENTS", 2006, "CONTINUOUS PARTICLE SIZE
SEPARATION AND SE SIZE SORTING USING ULTRASOUND IN A
MICROCHANNEL" (Sergey Kapishnikov, Vasily Kantsler, Victor
Steingberg) se presentan dos dispositivos para la separación y
clasificación de partículas y células en suspensión mediante
ultrasonidos. El primero de ellos es un resonador conocido como
"lamda medios" (siendo lamda la longitud de onda acústica), en
el que se establece una onda estacionaria con un nodo de presión en
el centro del canal, hacia donde las partículas son conducidas y
concentradas durante la aplicación del campo acústico, y a lo largo
del cual continúan su circulación hasta alcanzar la salida. De este
modo, la suspensión enriquecida de partículas concentradas
ultrasónicamente abandona el dispositivo a través de un canal
central de salida, mientras el resto de la suspensión lo hace
mayoritariamente por otros dos canales laterales de salida
dispuestos simétricamente respecto al central. En el dispositivo no
es posible realizar una separación absoluta de las partículas
colectadas acústicamente respecto al resto de elementos presentes en
la suspensión, los cuales circulan distribuidos uniformemente en
todo el espacio que permite el canal. Al no estar afectados por el
campo ultrasónico su disposición espacial no se ve alterada durante
la aplicación acústica, de manera que abandonan el dispositivo por
los tres canales de salida, aunque mayoritariamente lo hagan a
través de los canales laterales. Esto se debe a que por el canal
central se produce una salida masiva de las células concentradas
ultrasónicamente. Para lograr una separación selectiva, denominada
por los autores como "clasificación celular", el artículo
presenta también el desarrollo de un resonador "lamda cuartos"
en el que el ancho del canal es aproximadamente un cuarto de la
longitud de onda y el nodo de presión se establece junto a una de
las paredes laterales del canal, hacia donde son conducidas y
colectadas las células seleccionadas. A diferencia de la presente
invención, este dispositivo requiere la utilización de dos
transductores ultrasónicos colocados a ambos lados de la sección
del canal de tratamiento, externos al mismo, paralelos y
enfrentados, emitiendo trenes de onda temporales con un desfase
variable. Este dispositivo, siendo el más parecido al de la
presente invención, muestra importantes diferencias que, en su
caso, provocan ciertas restricciones de actuación, tales como la
imposibilidad de aplicación de onda continua, así como limitaciones
físicas sobre la zona de actuación, determinadas por el espacio
contenido entre las dos fuentes de emisión ultrasónica y por la
disposición geométricamente simétrica de los canales de entrada y
salida respecto al canal central de tratamiento, limitando
fuertemente la zona de actuación ultrasónica. A diferencia de la
presente invención, este dispositivo lamda cuartos trabaja en torno
a f=4 MHz y presenta importantes restricciones tanto en el volumen
de tratamiento, cuya sección es inversamente proporcional a la
frecuencia (aproximadamente 4 veces inferiores a las de nuestra
invención), como en la precisión exigida en las medidas del canal,
como consecuencia de lo anterior.
\sqbullet En la patente WO/2002/072236)
PARTICLE SEPARATION (ERYSAVE AB, JÖNSSON Henrik, LAURELL Thomas,
ALLERS Mats, PERSSON Hans), se describe un dispositivo para separar
materia particulada (especialmente para tratamientos de soluciones
de sangre) en un dispositivo resonante con un número elevado de
nodos de presión acústica para la formación de múltiples bandas de
concentración de partículas. Se trata de un dispositivo muy
diferente al de la presente invención en cuanto al diseño y
actuación. El campo acústico se ejerce sobre una cámara de
tratamiento bien diferente a los canales resonadores lamda medios o
lamda cuartos, con dimensiones muy superiores a las de éstos para
permitir el establecimiento de una onda estacionaria con
distribución espacial de múltiples nodos y máximos de presión
acústica.
\sqbullet En la patente europea EP1365849,
también publicada como patente Americana U.S. Pat. US6929750,
US
2004069717 y WO02072235, "DEVICE AND METHOD FOR SEPARATION", (LAURELL Thomas, ALLERS Mats, JÖNSSON Henrik, PERSSON Hans), se describe un dispositivo de microfluídica para separación ultrasónica en resonadores de media longitud de onda dispuestos en paralelo formando una estructura de distribución espacial conocida como "array". Cada uno de estos elementos contiene un canal resonador "lamda medios" en el que se procede a una conducción y colección acústica de ciertas células hacia el centro del mismo. Como en los demás resonadores de este tipo, al final del proceso se logra una suspensión enriquecida de las células afectadas acústicamente, pero no constituye un proceso de extracción de las mismas con respecto al resto de la suspensión, sino una recolección en alta concentración a través del canal central de salida. El dispositivo está realizado sobre un sustrato de Silicio, de elevado coste, habitual en este tipo de micro-dispositivos. La patente contempla un aumento del volumen de tratamiento acústico mediante la ubicación en paralelo de múltiples canales de actuación ultrasónica. Cada uno de estos elementos constituyentes del panel de dispositivos conformando lo que se conoce técnicamente como un "array" contiene una entrada única por la que se introduce la suspensión y tres canales de salida, uno central por el que desaloja la suspensión enriquecida de las partículas previamente colectadas (eritrocitos) y dos canales laterales dispuestos simétricamente, por los que circula el resto de la suspensión. Aquellos elementos no afectados por la fuerza de radiación permanecen distribuidos homogéneamente en la muestra y abandonan el dispositivo por cualquiera de los tres canales de salida, incluyendo (aunque de forma minoritaria) el canal central por el que desalojan los eritrocitos de forma masiva.
2004069717 y WO02072235, "DEVICE AND METHOD FOR SEPARATION", (LAURELL Thomas, ALLERS Mats, JÖNSSON Henrik, PERSSON Hans), se describe un dispositivo de microfluídica para separación ultrasónica en resonadores de media longitud de onda dispuestos en paralelo formando una estructura de distribución espacial conocida como "array". Cada uno de estos elementos contiene un canal resonador "lamda medios" en el que se procede a una conducción y colección acústica de ciertas células hacia el centro del mismo. Como en los demás resonadores de este tipo, al final del proceso se logra una suspensión enriquecida de las células afectadas acústicamente, pero no constituye un proceso de extracción de las mismas con respecto al resto de la suspensión, sino una recolección en alta concentración a través del canal central de salida. El dispositivo está realizado sobre un sustrato de Silicio, de elevado coste, habitual en este tipo de micro-dispositivos. La patente contempla un aumento del volumen de tratamiento acústico mediante la ubicación en paralelo de múltiples canales de actuación ultrasónica. Cada uno de estos elementos constituyentes del panel de dispositivos conformando lo que se conoce técnicamente como un "array" contiene una entrada única por la que se introduce la suspensión y tres canales de salida, uno central por el que desaloja la suspensión enriquecida de las partículas previamente colectadas (eritrocitos) y dos canales laterales dispuestos simétricamente, por los que circula el resto de la suspensión. Aquellos elementos no afectados por la fuerza de radiación permanecen distribuidos homogéneamente en la muestra y abandonan el dispositivo por cualquiera de los tres canales de salida, incluyendo (aunque de forma minoritaria) el canal central por el que desalojan los eritrocitos de forma masiva.
\sqbullet En la patente WO 00/04978
CONCENTRATION OF PARTICLES IN A FLUID WITHIN AN ACOUSTIC
STANDING WAVE FIELD, (CEFAI Joseph BARROW; David Anthony;
COAKLEY William Terence; HAWKES Jeremy John, se describe un
dispositivo para manipulación de partículas suspendidas en un
fluido. Contiene un conducto a lo largo del cual circula la
suspensión, así como un transductor ultrasónico y un reflector para
el establecimiento de una onda estacionaria perpendicular a la
dirección de flujo en el canal. El dispositivo es un resonador
"lamda medios", con la formación de una banda sencilla de
partículas en el centro del conductor. La distancia entre el
transductor y el reflector es inferior a 300 micras,
correspondiendo a una frecuencia de resonancia de la cámara de
tratamiento y no a la del transductor ultrasónico. El dispositivo
contempla una variación para esta distancia, y con ella, de la
frecuencia de tratamiento, de acuerdo a las tolerancias de
construcción del dispositivo y de la naturaleza de la suspensión a
tratar. Las partículas de la suspensión son colectadas y conducidas
a través del nodo de presión acústica hacia una salida del
dispositivo ubicada en un canal lateral, por donde la suspensión
enriquecida de éstas abandona el dispositivo. Mientras tanto, el
resto lo hace a través de otro canal de salida dispuesto con otra
orientación.
\sqbullet En WO 98/50133 (WO 1998/050133)
PARTICLE MANIPULATION, (COAKLEY William Terence; HAWKES
Jeremy John, BARROW David Anthony CEFAI Joseph) se describe un
dispositivo para llevar a cabo la manipulación de partículas en
suspensión, consistente en un conducto con dimensiones equivalentes
a un número determinado de semi-longitudes de onda,
por el que circula la suspensión y en el que se establece una onda
estacionaria perpendicular a la dirección del flujo. En esta cámara
de tratamiento se establece una onda estacionaria con múltiples
nodos y máximos de presión acústica para la formación de bandas de
células colectadas acústicamente, paralelas, separadas media
longitud de onda y perpendiculares a la dirección de
circulación.
\sqbullet En IBM, technical disclosure
bulletin vol. 25, No. 1, June 1982, page 192/193, se describe un
separador de flujo continuo por ultrasonidos para plasmaféresis. El
dispositivo consta de dos transductores montados ortogonalmente,
cada uno con un reflector y un volumen de tratamiento entre ambos
donde someter una suspensión diluida a una onda acústica
estacionaria. Se trata de una cámara de tratamiento bien diferente
a la de la presente invención, tanto en la forma de la transducción
como en la cámara de tratamiento.
\sqbullet En JP 06241977 A se describe un
dispositivo para medición de partículas finas en base a la
actuación de una onda ultrasónica estacionaria, inducida
acústicamente mediante un haz ultrasónico en combinación con una
fuerza electrostática para proceder a la concentración y
separación de partículas de diferentes tamaños. En el centro de la
cámara de tratamiento se genera un nodo de presión, hacia donde las
partículas son conducidas y concentradas.
\sqbullet En EP0773055A2 (1996) (YASUDA K,
SAITAMA H G, UMEMURA S, HUDRIOHI S) se describe un dispositivo y
método para manipulación acústica de partículas basado en la
interacción de varios haces ultrasónicos generados por diversos
transductores ubicados estratégicamente. En una cámara se somete la
suspensión a un proceso de levitación acústica mediante un campo
ultrasónico generado por la interacción de varios haces generados
por múltiples fuentes ultrasónicas dispuestas en contacto directo
y/o indirecto con el medio.
\sqbullet En WO 93/19367A2 se describe un
método y dispositivo de aglomeración acústica consistente en un
tubo conteniendo una muestra líquida y un transductor ultrasónico
acoplado para generar una onda estacionaria perpendicular al tubo,
concentrando así las partículas en múltiples bandas transversales a
lo largo de las cuales sedimentan tras la aplicación ultrasónica.
El documento se basa en la patente Americana U.S. Pat. Nos.
5,665,605 y 5,912,182.
\sqbullet En JP 07 047259A se describe un
aparato para transportar pequeñas partículas en suspensión. El
dispositivo contiene múltiples elementos generadores de ondas
ultrasónicas dispuestos en un panel bidimensional de transductores
sobre dos superficies planas, entre las cuales se deposita la
solución a ser tratada.
\vskip1.000000\baselineskip
Un aspecto de la invención lo constituye un
microdispositivo de separación y extracción no invasiva y selectiva
de partículas en suspensiones polidispersas, en adelante
microdispositivo de la invención, caracterizado porque comprende,
integrados en un chip-sustrato de material
acústicamente blando, los siguientes componentes:
a) un sistema de microcanales de flujo de
distribución espacial asimétrica de las ramas de canalización de
salida desde el canal central de tratamiento (110) que comprende
(ver Figura 1):
- i.
- un camino o lecho por el que fluye la suspensión de partida (150), que incluye un canal de entrada (160) para el suministro y otro de salida (170) por donde abandona el dispositivo, en paralelo con
- ii.
- un camino o lecho por el que fluye el fluido puro (124) al que se extraerán las partículas seleccionadas (al que se denomina lecho del fluido colector), incluyendo un canal de entrada o suministro (162) y otro de salida (180), que forman
- iii.
- un canal central de tratamiento (110) donde la suspensión de partida y el fluido puro están separados por una interfase frontera de líneas de corriente en régimen laminar definida por las dimensiones transversales del canal y que se bifurca al final de su recorrido (175) en dos canales de salida mencionados (170) y (180), donde el ancho del canal resonador presenta una relación con la longitud de onda inversamente proporcional a la frecuencia acústica, y donde la profundidad del canal de tratamiento (250 \mum)- que conforma junto al ancho su sección transversal- es sensiblemente inferior a un cuarto de la longitud de onda acústica,
y,
b) un actuador o transductor ultrasónico en una
de sus paredes laterales (190)
- externo y paralelo al canal central de
tratamiento (110), que transmite la energía acústica al microcanal
de tratamiento a través del sustrato y del material en el que está
desarrollada la canalización, capaz de establecer una onda
estacionaria en el interior del canal de tratamiento entre sus
paredes laterales, produciendo un nodo de presión a una distancia
de la pared reflectora de aproximadamente 1/3 y 2/3 del ancho del
canal, respectivamente, y de producir un gradiente de presiones
generado acústicamente en el interior del canal central con un
efecto de conducción de ciertas partículas dentro del mismo hacia la
región de equilibrio acústico definida en el nodo, donde la fuerza
de radiación se anula, y
- cuya actuación incluye no sólo el canal
central de tratamiento sino también la zona de bifurcación hacia
los dos microcanales de salida con el objeto de aumentar al máximo
la eficiencia de separación selectiva y extracción.
Una realización particular de la invención lo
constituye el microdispositivo de la invención, en el que los
materiales constituyentes del chip-sustrato,
preferentemente un epoxy de resina SU-8 sobre el que
se realiza el canal y el sustrato acrílico PMMA "Polimetacrilato
de Metilo", presentan una impedancia acústica de 3.3 MRayls, y
donde el transductor ultrasónico b) consiste en una pequeña
cerámica piezoeléctrica, preferentemente, un dispositivo de la
marca PZT26.
Otro aspecto de la invención lo constituye el
proceso de fabricación del microdispositivo de la invención, en
adelante proceso de fabricación del microdispositivo de la
invención, basado en la técnica de fotolitografía de acuerdo al
diseño descrito en la Figura 1 y que comprende las siguientes
etapas (ver Figura 10):
- a)
- Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible, sobre la superficie de un sustrato independiente (oblea 1),
- b)
- Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible SU-8 sobre la superficie de un sustrato independiente (oblea 2) recubierto con un material antiadherente,
- c)
- Sellado de la oblea 1 y la oblea 2 enfrentado dichas obleas por la cara que contiene el material polimérico fotodefinible, y
- d)
- Retirada de la oblea recubierta con material antiadherente.
Así, otro aspecto de la invención lo constituye
el uso del microdispositivo de la invención, en adelante uso de la
invención, en un procedimiento, de separación no invasiva
selectiva, lavado y/o clasificación de partículas en suspensiones
polidispersas.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye el uso de la invención en el que las partículas
consisten en células pertenecientes, a título ilustrativo y sin que
limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: virus,
priones, células procariotas (bacterias, levaduras, hongos, algas,
etc.) y eucariotas.
Una realización más particular de la invención
lo constituye el uso del microdispositivo de la invención para la
separación y aislamiento selectivo de células eucariotas,
preferentemente células humanas, y más preferentemente células
tumorales, células sanguíneas (hematíes, plaquetas, macrófagos y
linfocitos), células troncales o células madre, ya sean somáticas o
embrionarias, u de otro tipo presentes en fluidos corporales, como
por ejemplo: sangre, orina, líquido cefalorraquídeo o presentes en
otros tipos de muestras biológicas provenientes de biopsias.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha desarrollado un microdispositivo para
separación y extracción ultrasónica de partículas y células en
suspensión mediante un resonador ultrasónico de tipo "lamda
cuartos modificado" con características singulares. En concreto,
presenta una configuración geométrica peculiar, tanto en cuanto a
las dimensiones del canal central de tratamiento, como a la
distribución espacial asimétrica de los canales de flujo de entrada
y de salida de las muestras con respecto al canal central de
tratamiento. Los inventores también han encontrado la importancia
de esta última característica, que refuerza la efectividad de
separación, como se describirá más adelante.
La presente invención se basa en que los
inventores han observado que la aplicación de una onda de
activación generada por un transductor en paralelo con respecto a
un canal central de tratamiento produce en el mismo una onda
estacionaria perpendicular a la dirección del flujo, con un nodo de
presión ubicado en una posición intermedia entre el centro del
canal y la pared reflectora, en la zona ocupada por el lecho del
fluido puro y que ocupa la longitud del canal de tratamiento
afectada acústicamente.
El dispositivo es activado mediante un actuador
o transductor ultrasónico, por ejemplo, una pequeña cerámica
piezoeléctrica de área rectangular (190 de la Figura 1). Una de las
características de la invención es que la fuente de ultrasonidos
está dispuesta en contacto perpendicular con el chip, transmitiendo
la energía ultrasónica en una dirección perpendicular a éste. El
elemento piezoeléctrico es pegado parcialmente en una de sus
superficies metalizadas a uno de los cantos exteriores del chip del
microdispositivo, en particular al canto más próximo al canal
central de tratamiento realizado en el chip, y paralelo al mismo
(110 de la Figura 1). De esta manera transmite la energía acústica
a través del chip hacia el canal, en cuyo interior se establece una
onda estacionaria perpendicular a la dirección del flujo.
Entre las paredes laterales del canal se genera
un gradiente de presión acústica, con el establecimiento de un
nodo ubicado en una posición intermedia entre el centro del canal
de tratamiento y la pared reflectora, en la zona ocupada por el
lecho del fluido puro a lo largo de toda la longitud del canal
afectada acústicamente. Este nodo de presión se produce a una
distancia de la pared reflectora de aproximadamente 1/3 del ancho
del canal y a 2/3 de la pared opuesta, respectivamente. Así, la
distribución de presiones establecida en esta dirección
perpendicular al flujo de las muestras a lo largo del canal origina
una fuerza de radiación que actúa de forma específica sobre cada
partícula en suspensión, perpendicularmente a la dirección de
flujo. Sin embargo, su efecto de conducción queda limitado
solamente a aquellas partículas con cierto tamaño, densidad o
compresibilidad que, susceptibles a las condiciones acústicas
aplicadas y seleccionadas en cada caso según el tipo de aplicación
concreta, son aceleradas por acción de dicha fuerza.
La ubicación estratégica de esta zona de
equilibrio acústico que constituye el nodo de presión, en el lecho
del fluido puro, obliga a las partículas arrastradas acústicamente
a atravesar la interfase de separación entre los dos medios
fluyentes, abandonando así la suspensión para ser colectadas en el
fluido puro, también denominado a partir de ahora fluido colector,
desde donde son extraídas a través de uno de los canales de
salida.
Los inventores también destacan la gran
importancia de esta ubicación estratégica del nodo, relativamente
alejada de la pared reflectora, pues representa una innovación
respecto a los resonadores "lamda cuartos", en los que dicho
nodo se ubica junto a la pared reflectora (Figura 2). De esta forma
se evitan problemas de adherencia de las partículas a dicha pared y
se favorece su circulación concentrada hacia la salida del canal,
evitando así problemas de atasco. Además, este nodo de presión
ocupa una longitud a lo largo del canal similar a la del actuador
ultrasónico (longitud ocupada por la cerámica piezoelétrica).
Otra novedad que presenta la presente invención
se refiere a la disposición asimétrica de los canales de entrada y
salida desde el canal central de tratamiento, permitiendo al
sistema de transducción ultrasónica ejercer su influencia a través
del chip sobre una zona del canal más amplia de la habitualmente
afectada en este tipo de separadores. Esta ordenación espacial
estratégica amplía las posibilidades de ubicación de la fuente de
ultrasonidos (área de pegado de la cerámica piezoeléctrica) sobre
el chip-sustrato, y con ella la zona de actuación
en el canal de tratamiento, incluyendo la zona de bifurcación hacia
las dos ramas de salida. En esta región, de geometría diferente al
resto del canal, la fuerza de radiación resultante está dirigida
hacia la salida del canal por donde el fluido colector de
partículas abandona el dispositivo, aumentando notablemente la
eficiencia de separación selectiva.
Esta ampliación del área de actuación acústica
asegura la salida de las partículas seleccionadas por el canal
deseado, optimizando la eficacia de separación y extracción de las
mismas desde su medio inicial, la suspensión.
Otra característica de esta invención es la
frecuencia de tratamiento ultrasónico, de 1 MHz, inferior a las
habituales en este tipo de microdispositivos (normalmente trabajan
a partir de 2 MHz, la mayoría por encima de este valor). Sin
embargo, esta frecuencia puede variar, escalando oportunamente las
dimensiones transversales del canal central de tratamiento, las
cuales han de variar proporcionalmente a los cambios producidos en
la longitud de onda (inversamente a la frecuencia acústica). De
esta forma, frecuencias bajas permiten manejar mayores volúmenes
de tratamiento. Sin embargo, para frecuencias inferiores a 500 kHz
el umbral de cavitación acústica (consistente en la generación en
el medio de microburbujas con fuertes y rápidos efectos de
implosión) es también inferior al de frecuencias más elevadas. Por
ello, el rango de variabilidad de la energía acústica para generar
conducción ultrasónica sin provocar daños en los
micro-elementos en suspensión está más restringido.
Además, debe tenerse en cuenta que la fuerza de radiación aumenta
linealmente con la frecuencia acústica, por lo que los beneficios
de volumen que reporta la utilización de dispositivos resonantes a
bajas frecuencias tienen como contrapartida un mayor gasto
energético. Con el microdispositivo de esta invención se ha
realizado una aplicación de ultrasonidos a una frecuencia inferior
a las habituales, en concreto a 1 MHz, para la que, sin embargo, el
umbral de cavitación acústica es elevado, poniendo de manifiesto su
viabilidad y permitiendo un volumen de tratamiento al menos dos
veces mayor que en los dispositivos pensados para resonar a 2 MHz.
Así, la invención aporta dos ventajas relacionadas con este
parámetro acústico respecto a los micro-dispositivos
existentes resonantes a frecuencias más elevadas; éstas se
refieren a un aumento del volumen de tratamiento, recién mencionado
y, en consecuencia, a una disminución en las restricciones
asociadas a la precisión en el ajuste de las medidas (paredes de
canalización fundamentalmente).
Otra novedad del microdispositivo de la
invención es el material sobre el que está realizado, un chip
integrado integrado por dos materiales acoplados en paralelo: PMMA
(Polimetacrilato de Metilo) utilizado como sustrato base
constituyente del fondo de los canales (con un espesor de
aproximadamente 900 \mum) y una lámina de epoxy fotodefinible
SU-8, dispuesta sobre el sustrato anterior (con un
espesor de 330 \mum), en el que se realiza la canalización. En
este sentido, no se han usado especiales reflectores o similares
para las paredes del canal central de tratamiento y, por el
contrario se ha confirmado un buen comportamiento del material
SU-8, que en el microdispositivo constituye las
paredes laterales del canal de tratamiento, actuando como reflector
acústico y validando su utilización sin requerimientos especiales
de reflectores o similares. Así pues, se ha validado
experimentalmente el material polimérico SU-8 como
elemento reflector para el establecimiento de la onda estacionaria
en el interior del canal y la aplicabilidad ventajosa de estos
materiales acrílicos acústicamente blandos. Además, se ha
encontrado un buen comportamiento acústico del material que
constituye la base de los canales, PMMA, como transmisor de la
energía ultrasónica con características acústicas parecidas a las
del SU-8 y buen acoplamiento
mecánico-acústico al mismo. Se trata de dos
materiales poliméricos de fácil manipulación y bajo coste. Ambos
materiales presentan una impedancia acústica baja (no superior a
tres veces la del agua y al menos 5 veces inferior a la de los
metales) y permiten una fácil manipulación de los mismos para la
elaboración de los canales, además de la evidente ventaja de
abaratamiento frente a otros sustratos habituales en este tipo de
microdispositivos, como es el Silicio, mucho más rígidos desde el
punto de vista acústico y más caros. En conjunto, aportan
interesante ventajas económicas.
El modelo utilizado para la experimentación en
el Ejemplo 1.2 es un modelo de micropartículas de poliestireno de
tamaños y densidades que mimetizan las características
físico-acústicas de dos tipos de células:
eritrocitos y células tumorales exfoliadas en sangre periférica,
fluyendo inicialmente juntas en un fluido asimilable al plasma
san-
guíneo.
guíneo.
Se destaca la elevada eficacia de separación
selectiva y extracción de las partículas de mayor diámetro obtenida
en la experimentación realizada con el dispositivo de la invención
(Ejemplo 1). Este comportamiento repetitivo se debe a la actuación
individual de la fuerza de radiación acústica sobre cada partícula,
independiente de su concentración en la suspensión. La eficacia de
actuación es válida tanto para concentraciones elevadas como para
el caso de suspensiones extremadamente diluidas, para las que
otras técnicas de separación presentan fuertes caídas de
sensibilidad y eficacia de actuación.
En resumen, de todas las novedades descritas, se
destaca la sencillez y efectividad que presenta el
microdispositivo: sencillez tanto por la fuente de ultrasonidos
(consistente en una cerámica piezoeléctrica), como por la geometría
del canal de tratamiento y sus bifurcaciones de entrada y salida,
así como los materiales en los que se realiza el chip del
dispositivo: un sustrato de PMMA que constituye la base de los
canales y el epoxy SU-8, en el que se realiza la
canalización, así como por la eficacia de resultados.
\newpage
Por lo tanto, un aspecto de la invención lo
constituye un microdispositivo de separación y extracción no
invasiva y selectiva de partículas en suspensiones polidispersas,
en adelante microdispositivo de la invención, caracterizado porque
comprende, integrados en un chip-sustrato de
material acústicamente blando, los siguientes componentes:
a) un sistema de microcanales de flujo de
distribución espacial asimétrica de las ramas de canalización de
salida desde el canal central de tratamiento (110) que comprende
(ver Figura 1):
- i.
- un camino o lecho por el que fluye la suspensión de partida (150), que incluye un canal de entrada (160) para el suministro y otro de salida (170) por donde abandona el dispositivo, en paralelo con
- ii.
- un camino o lecho por el que fluye el fluido puro (124) al que se extraerán las partículas seleccionadas (al que se denomina lecho del fluido colector), incluyendo un canal de entrada o suministro (162) y otro de salida (180), que forman
- iii.
- un canal central de tratamiento (110) donde la suspensión de partida y el fluido puro están separados por una interfase frontera de líneas de corriente en régimen laminar definida por las dimensiones transversales del canal y que se bifurca al final de su recorrido (175) en dos canales de salida mencionados (170) y (180), donde el ancho del canal resonador presenta una relación con la longitud de onda inversamente proporcional a la frecuencia acústica, y donde la profundidad del canal de tratamiento (por ejemplo, 250 \mum)- que conforma junto al ancho su sección transversal- es sensiblemente inferior a un cuarto de la longitud de onda acústica,
y,
b) un actuador o transductor ultrasónico en una
de sus paredes laterales (190)
- externo y paralelo al canal central de
tratamiento (110), que transmite la energía acústica al microcanal
de tratamiento a través del sustrato y del material en el que está
desarrollada la canalización, capaz de establecer una onda
estacionaria en el interior del canal de tratamiento entre sus
paredes laterales, produciendo un nodo de presión a una distancia
de la pared reflectora de aproximadamente 1/3 y 2/3 del ancho del
canal respectivamente, y de producir un gradiente de presiones
generado acústicamente en el interior del canal central con un
efecto de conducción de ciertas partículas dentro del mismo hacia
la región de equilibrio acústico definida en el nodo, donde la
fuerza de radiación se anula, y
- cuya actuación incluye no sólo el canal
central de tratamiento sino también la zona de bifurcación hacia
los dos microcanales de salida con el objeto de aumentar al máximo
la eficiencia de separación selectiva y extracción.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término partícula en "suspensiones polidispersas" se refiere a
una suspensión con partículas de diferentes características físicas
(tamaño, densidad o compresibilidad, entre otras), comprendiendo
microelementos inorgánicos u orgánicos, tales como células,
preferentemente células eucariotas, más preferentemente humanas,
microorganismos u otro tipo de microelementos presentes en fluidos
biológicos con parámetros del mismo orden.
Tal como se utiliza en la presente invención el
término "chip de materiales acústicamente blandos" se refiere
a materiales cuya impedancia es mucho menor a las que presentan
otros materiales o medios como los metales o cristal (al menos, 5
veces inferior), y, fundamentalmente, que no supera en tres veces
la impedancia de los medios líquidos (habitualmente delimitada en
un rango de variabilidad oscilante generalmente, salvo excepciones,
entre 0.8 MRayls y 2.6 MRayls). El concepto "blando" queda,
pues, referido a la relación de impedancias entre el material que
constituye las paredes del canal de tratamiento y los fluidos
circulantes por el interior del mismo, pero con suficiente
capacidad de producir reflexiones de la onda acústica para el
establecimiento de ondas estacionarias.
Así, cualquier material blando, preferentemente
un material acrílico, con propiedades acústicas parecidas al
SU-8 o similar a otros elementos plásticos, puede
ser utilizado como material para la elaboración del chip- sustrato
del microdispositivo de la invención en el que realizar la
canalización, por su similitud en la transmisión de energía
acústica a través del mismo y respuestas análogas de reflexión en
las paredes del canal.
Una realización particular de la invención lo
constituye el microdispositivo de la invención, en el que los
materiales constituyentes del chip-sustrato,
preferentemente un epoxy de resina SU-8 sobre el que
se realiza el canal y el sustrato acrílico PMMA "Polimetacrilato
de Metilo", presentan una impedancia acústica de 3.3 MRayls, y
donde el transductor ultrasónico b) consiste en una pequeña
cerámica piezoeléctrica, preferentemente, un dispositivo de la
marca PZT26.
Otro aspecto de la invención lo constituye el
proceso de fabricación del microdispositivo de la invención, en
adelante proceso de fabricación del microdispositivo de la
invención, basado en la técnica de fotolitografía de acuerdo al
diseño descrito en la Figura 1 y que comprende las siguientes
etapas (ver Figura 10):
- a)
- Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible, sobre la superficie de un sustrato independiente (oblea 1),
- b)
- Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible SU-8 sobre la superficie de un sustrato independiente (oblea 2) recubierto con un material antiadherente,
- c)
- Sellado de la oblea 1 y la oblea 2 enfrentado dichas obleas por la cara que contiene el material polimérico fotodefinible, y
- d)
- Retirada de la oblea recubierta con material antiadherente.
La elaboración del presente microdispositivo es
fácilmente ejecutable por un experto en la materia con el
conocimiento y diseños indicados en la presente invención y con el
estado de la técnica actual (véase documentos citados).
Adicionalmente, es posible mejorar el diseño del microdispositivo
de la invención con la introducción de canales vacíos adicionales
ubicados estratégicamente en torno al canal central para minimizar
las pérdidas de la energía acústica transmitiéndose a través del
sustrato PMMA del chip y del material SU-8. Estos
elementos adicionales podrán ser fácilmente incorporados al diseño
del dispositivo de la invención repitiendo los pasos b), c) y d)
del procedimiento de elaboración del dispositivo y añadiendo dos
canales cerrados con aire debajo del canal central y paralelo al
mismo (ver más adelante). La Figura 11 muestra un diseño donde un
canal relleno de aire es colocado tanto debajo como al lado del
canal fluídico de tratamiento donde se produce la separación. De
esta manera la señal de ultrasonidos utilizada para la separación
queda confinada en el lugar deseado, minimizando las pérdidas.
Por otro lado, el microdispositivo de la
invención también puede ser fabricado mediante técnicas de
estampación en caliente combinadas con un proceso de pegado
posterior, de la forma siguiente (ver Figura 12):
- a)
- Preparación de un molde en el que se incluyen los diseños de canales deseados,
- b)
- Moldeado del sustrato a utilizar usando el molde obtenido en a), mediante la acción de presión y/o temperatura, y
- c)
- Sellado del sustrato mediante el pegado con otro material plástico bajo la acción de presión y/o temperatura y/o activación superficial por plasma de oxígeno.
Por otro lado, el rango de frecuencia aplicable
al microdispositivo de la invención tanto para suspensiones
orgánicas como inorgánicas es amplio, aunque deben tenerse en
cuenta ciertas consideraciones para las suspensiones orgánicas,
como se explica a continuación. Una variación en la frecuencia
ultrasónica implica un proceso de escalamiento en las dimensiones
del dispositivo. Dado que el funcionamiento del microdispositivo se
basa en el modelo de resonador acústico en la dirección del ancho
del canal, las características espaciales asociadas a esta
dimensión lateral del microcanal de tratamiento han de ser variadas
inversamente proporcional a la variación de la frecuencia
acústica. Aunque la fuerza de radiación inducida sobre cada
microelemento de la suspensión es directamente proporcional a la
frecuencia, debe tenerse en cuenta la disminución del umbral
energético de cavitación acústica en el caso de suspensiones
orgánicas a bajas frecuencias (del orden de los kHz), con el fin de
evitar daños celulares. Este fenómeno no deseado se ve favorecido a
frecuencias bajas, por lo que habría limitaciones de aplicación de
la invención por debajo de los 500 kHz. Por el contrario, el
incremento de la frecuencia aumenta linealmente la magnitud de la
fuerza de radiación y permite una disminución de los niveles de
energía acústica necesarios para generar conducción selectiva por
ultrasonidos. Por esta razón, casi todos los dispositivos
desarrollados hasta el momento trabajan entre 2 MHz y 5 MHz. Como
contrapartida, el aumento hasta estas frecuencias implica una
disminución escalada de las dimensiones laterales del canal de
tratamiento, que ha de variar proporcionalmente a los cambios
inducidos en la longitud de onda acústica, encareciendo los
procesos de realización de estos dispositivos por el compromiso con
la precisión de los mismos.
Los resultados obtenidos con este modelo
permiten aplicar el dispositivo en el ámbito de la separación y
aislamiento de partículas, con importante aplicaciones en la
separación y aislamiento de células, preferentemente humanas, en
procedimientos de diagnóstico y tratamiento, por ejemplo,
tratamiento celular o de terapia génica, de enfermedades en
mamíferos, preferentemente seres humanos.
Así, otro aspecto de la invención lo constituye
el uso del microdispositivo de la invención, en adelante uso de la
invención, en un procedimiento, de separación no invasiva
selectiva, lavado y/o clasificación de partículas en suspensiones
polidispersas.
Otro aspecto más particular de la invención lo
constituye el uso de la invención en el que las partículas
consisten en células pertenecientes, a título ilustrativo y sin que
limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: virus,
priones, células procariotas (bacterias, levaduras, hongos, algas,
etc.) y eucariotas.
Una realización más particular de la invención
lo constituye el uso del microdispositivo de la invención para la
separación y aislamiento selectivo de células eucariotas,
preferentemente células humanas, y más preferentemente células
tumorales, células sanguíneas, células troncales o células madre,
ya sean somáticas o embrionarias, u de otro tipo presentes en
fluidos corporales, como por ejemplo: sangre, orina, líquido
cefalorraquídeo o presentes en otros tipos de muestras biológicas
provenientes de biopsias.
\newpage
Procedimientos o aplicaciones concretas
biomédicas, ya sean en su vertiente de diagnóstico o de
tratamiento, donde se puede utilizar el microdispositivo de la
invención se relaciona con donaciones de sangre, plasmaféresis,
procesos de diálisis y análisis de laboratorio, así como reciclado
y/o lavado de sangre tras operaciones quirúrgicas, donde se
precisan la separación y concentración de determinados tipos de
células, por ejemplo hematíes y plaquetas.
Otro ejemplo lo constituye el uso del
microdispositivo de la invención en un procedimiento de diagnóstico
y/o tratamiento de enfermedades humanas para la separación
selectiva y extracción de células dañadas o alteradas de pacientes,
las cuales pueden ser reparadas ex vivo y administradas de
nuevo al paciente.
Un campo concreto de aplicación biomédica es la
oncología, donde se puede utilizar como una herramienta de valor
diagnóstico y pronóstico para reproducir la separación selectiva y
extracción de células tumorales circulantes en sangre periférica
(CTC) de pacientes oncológicos con tumores sólidos con diferente
origen tisular y en diferentes estadios de la enfermedad.
La utilidad clínica demostrada hasta la fecha de
la cuantificación del número de células tumorales circulantes en
sangre periférica se centra en los siguientes aspectos:
- \bullet
- Factor pronóstico independiente en cáncer de mama y de próstata metastático (Cristofanilli M, Budd GT, Ellis MJ, Stopeck A, Matera J, Millar MC, Reuben JM, Doyle GV, Allard WJ, Terstappen LW, Hayes DF. Circulating tumor cells, disease progresión, and survival in metastatic breast cancer N Engl J Med 351:8, 2004) (Moreno JG, Milelr MC, Gross S, Allard WJ, Gomella LG, Terstappen LW. Circulating tumor cells predict survival in patients with metastatic prostate cancer. Urology; 65(4):713-718; 2005).
- \bullet
- Seguimiento de la respuesta a los tratamientos quimioterápicos en pacientes oncológicos con enfermedad avanzada (Cristofanilli M, Mendelsohn J, et al. Circulating tumor cells in breast cancer: advanced tools for tailored therapy. Proc Natl Acad Sci USA 103(46):17073-17074; 2006).
Los sistemas de análisis utilizados en estos
estudios se basan en la separación inmunomagnética positiva con
anticuerpos monoclonales y posterior análisis por microscopia de
fluorescencia. Estas aplicaciones han obtenido la aprobación de la
Food and Drug Administration (FDA) para su uso en la práctica
clínica en EEUU.
La generalización de ambas aplicaciones a otros
tipos de tumores está actualmente en pleno desarrollo. Asimismo,
existen estudios preliminares que indican la potencial utilidad del
análisis del número de CTC como marcador temprano de recidivas en
cáncer colorrectal (Soto JL, Garrigos N, Gallego J, Guaraz P,
Garcia-Bautista M, Castillejo A, Gomez A,
Casado-Llavona C, Rodríguez-Lescure
A, Carrato A. Toward a circulating tumor cell analysis as an early
marker for relapse in stage II and III colorectal cancer patients.
Eur J Cancer Supplements. 3(2):187; 2005).
Una de las grandes ventajas que presenta el
dispositivo motivo de la presente actuación, es la posibilidad
real, no solo de separar eficazmente las CTC; lo cual permite su
fácil contaje; sino el hecho de poder disponer de dicha población
celular aislada y en estado viable para ulteriores análisis; tanto
descriptivos a nivel genético y de perfiles de expresión génica;
como de estudios de comportamiento funcional ex vivo. Hasta
la fecha, este es el único dispositivo conocido capaz de ofrecer
dicha posibilidad con tan elevada eficacia.
El concepto de las CTC como biopsia asequible y
no invasiva del tumor, presenta aquí el valor añadido de la
posibilidad de caracterizar funcionalmente el comportamiento de
dichas células con respecto a su sensibilidad/resistencia al
arsenal terapéutico disponible como sistema de selección
personalizada de los tratamientos más eficaces para cada
paciente.
La utilidad clínica real y potencial del
dispositivo es por tanto de una gran trascendencia dentro de la
práctica clínica ofreciendo una información muy valiosa para un
mejor manejo de un paciente con distintas enfermedades.
El microdispositivo comprende un chip que
incluye un sustrato base sobre el que se asienta un material
polimérico (100) que contiene un sistema integrado de 4
microcanales (160, 162, 170 y 180), centrados en torno a un canal
central de tratamiento (110), dos de ellos en cada extremo del
mismo, situados de forma no simétrica o asimétrica, tanto para la
entrada como para la salida de dos medios que circulan en paralelo
en régimen laminar a lo largo del canal central de tratamiento
(110). Uno de estos medios es la suspensión (150) de la que se van
a extraer ciertas partículas (101) y el otro es un líquido puro
(124) que se introduce por su canal de entrada (162) que actuará
como colector ultrasónico de las partículas (101). El dispositivo
lleva integrado un transductor ultrasónico (190) en una de sus
paredes laterales, paralelo al canal de tratamiento acústico. El
canal central (110) se bifurca al final de su recorrido (175) en
dos canales de salida (170 y 180), donde se produce el proceso de
separación final, saliendo las partículas seleccionadas (101) por
el canal de salida (180), mientras que el resto de la suspensión
con las partículas restantes (122) sale por el canal (170).
Un transductor ultrasónico (190) pegado un una
de sus superficies metalizadas al canto del chip, que incluye dos
materiales poliméricos (uno con la canalización y otro que
constituye el sustrato sobre el que se asienta acoplado
mecánicamente) genera una onda de ultrasonidos y la transmite a
través del chip acrílico al canal central de tratamiento. El ancho
del canal "w" es algo mayor que un cuarto de la longitud de
onda acústica y permite el establecimiento de una onda estacionaria
en dicha dirección dentro del canal con un nodo de presión ubicado
a una distancia de aproximadamente w/3 respecto a una de sus
paredes laterales, la cual actúa como reflector.
\vskip1.000000\baselineskip
La fotografía 3.a muestra el dispositivo desde
arriba y la figura 3.b muestra de canto la estructura del chip,
con los dos materiales poliméricos acoplados mecánicamente.
\vskip1.000000\baselineskip
La fotografía 4.a muestra los
micro-canales realizados y la ubicación de la
cerámica piezoeléctrica pegada en el canto del chip. La figura 4.b
muestra un esquema de la sección transversal del chip, constituido
por dos materiales poliméricos SU-8 y PMMA.
\vskip1.000000\baselineskip
En el interior del canal se aprecia la ocupación
de los dos medios en el mismo, la suspensión circulando por la
sección izquierda del canal y agua en la mitad derecha, en ausencia
de la aplicación ultrasónica. La suspensión está constituida
mayoritariamente por pequeñas partículas de poliestireno con
diámetros de 6 micras en alta concentración y algunas más grandes
con diámetros de 20 micras circulando en muy baja concentración (Cv
< 1%). En la fotografía de la Figura 5.a) se observa la
distribución transversal de los medios para bajas velocidades de
circulación, permitiendo la visualización parcial de partículas de
6 um. La resolución de las imágenes es de 1.17 \mum/pixel. Por el
contrario, la imagen de la Figura 5b), correspondiente a una
velocidad de circulación mayor, no permite dicha distinción, pero
muestra una diferencia de tonalidad en el contraste luminoso de
ambos medios.
\vskip1.000000\baselineskip
La partícula situada en la parte superior del
canal se encuentra en el principio de la zona del canal afectada
por el actuador ultrasónico y experimenta un desplazamiento
lateral, perpendicular a la dirección del flujo, menos intenso que
la partícula ubicada en la parte inferior de la fotografía,
plenamente afectada por el campo acústico y, por ello, arrastrada
más intensamente. Por esta razón, dicha partícula se encuentra
ubicada en la posición del nodo de presión mientras que la
partícula superior todavía no lo ha alcanzado en el tiempo de
adquisición del fotograma.
\vskip1.000000\baselineskip
Imagen correspondiente a un fotograma de dos
partículas de 20 \mum circulando muy lentamente a lo largo del
canal central en el nodo de presión, posicionadas en el nodo de
presión acústica, separado de la pared reflectora.
\vskip1.000000\baselineskip
Resultados experimentales en una filmación del
proceso de separación-extracción de las partículas
seleccionadas a través de las canalizaciones de salida. El primer
fotograma (8.a) muestra en ausencia de ultrasonidos la salida
natural de las partículas de 20 \mum junto al resto de la
suspensión por el ramal izquierdo a partir del canal central,
siguiendo el lecho de flujo por el que circulaba. Los fotogramas de
(8.b), (8.c) y (8.d) muestran la salida selectiva de estas
partículas, separadas de la suspensión, por el canal de salida del
fluido puro-agua, una vez conducidas y colectadas
acústicamente en el nodo de presión, ubicado en el lecho del fluido
puro (semi-sección derecha), a lo largo del cual
continúan su circulación hasta abandonar el canal central de
tratamiento. Todos estos fotogramas corresponden a una misma
película. La velocidad de circulación de las partículas en estas
secuencias es de 2.4 mm/s a lo largo del canal.
\vskip1.000000\baselineskip
Se observa la extracción de las partículas por
el canal de salida de la derecha tras la conducción ultrasónica
individual para una velocidad de circulación extremadamente baja,
de aproximadamente 0.06 mm/s, que permite una visualización clara y
cuantificación de su comportamiento acústico. En los fotogramas
consecutivos (9.a) a (9.d) se aprecia claramente la eficacia del
tratamiento ultrasónico de separación selectiva, en el que todas las
partículas con diámetros de 20 \mum abandonan el dispositivo a
través del canal de salida del fluido puro colector, mientras que
el resto de las suspensión, conteniendo las pequeñas partículas de
6 \mum, circulando por su "cauce" izquierdo, sale a través
del canal correspondiente.
\vskip1.000000\baselineskip
a) Deposición y definición de una capa
polimérica fotodefinible sobre la superficie de un sustrato
independiente, b) Deposición y definición de una capa polimérica
fotodefinible sobre la superficie de un sustrato independiente
recubierto con un material antiadherente, c) Sellado de la oblea 1
y la oblea 2, y d) Retirada de la oblea recubierta con material
antiadherente.
\vskip1.000000\baselineskip
Diseño microdispositivo de la invención
donde canales cerrados en sus extremos y rellenos de aire son
dispuestos estratégicamente respecto al canal central para
minimizar la pérdida de energía en el proceso de transmisión a
través del sustrato. a) Chip visto desde arriba, b) Sección
transversal del chip.
\vskip1.000000\baselineskip
a) Preparación de un molde en el que se incluyen
los diseños de canales deseados, b) Moldeado del sustrato a
utilizar usando el molde obtenido en a), mediante la acción de
presión y/o temperatura, y c) Sellado del sustrato mediante el
pegado con otro material plástico bajo la acción de presión y/o
temperatura y/o activación superficial por plasma de oxígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
En el prototipo presentado en la Figura 4, el
material estructural utilizado para la realización de los canales
fluídicos ha sido el polímero fotodefinible SU-8,
acoplado mecánicamente a un sustrato de PMMA, que constituye el
fondo de los canales del dispositivo. Este material presenta
propiedades muy convenientes para la fabricación de dispositivos
debido a su alta definición (dentro del orden del micrometro),
verticalidad en las paredes reveladas [ref2], biocompatibilidad
[ref3], ancho rango de espesores [ref1] y posibilidad de pegado de
varias capas consecutivas [ref4]. El procedimiento de fabricación
de este prototipo del dispositivo de la invención utilizado y de
acuerdo con el diseño de la Figura 1 es el siguiente (ver Figura
10):
- a)
- Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible, sobre la superficie de un sustrato independiente (oblea 1),
- b)
- Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible SU-8 sobre la superficie de un sustrato independiente (oblea 2) recubierto con un material antiadherente,
- c)
- Sellado de la oblea 1 y la oblea 2 enfrentado dichas obleas por la cara que contiene el material polimérico fotodefinible, y
- d)
- Retirada de la oblea recubierta con material antiadherente.
El prototipo del microdispositivo se ha diseñado
y fabricado de tal forma que comprende un chip (100) con un
sistema integrado de 4 microcanales (160, 162, 170 y 180),
centrados en torno a un canal central de tratamiento (110), dos de
ellos en cada extremo del mismo, situados de forma no simétrica,
tanto para la entrada como para la salida de dos medios que
circulan en paralelo en régimen laminar a lo largo del canal (110)
(ver Figuras 1, 2, y 3). Uno de estos medios es la suspensión (150)
de la que se van a extraer ciertas partículas (101) y el otro es un
líquido puro (124) que actuará como colector ultrasónico de las
partículas (101).
Como se observa en la fotografía de la Figura 4,
el dispositivo lleva integrado en uno de sus laterales un actuador
o transductor ultrasónico (190), consistente en una pequeña
cerámica piezoeléctrica de área rectangular de PZ26 resonante en su
modo "thickness" (espesor) a 1 MHz, parcialmente pegada en una
de sus superficies metalizadas al espesor del chip constituido por
SU-8 y el sustrato PMMA en uno de sus bordes
laterales y ocupando parcialmente su espesor y dispuesta paralelo
al canal de tratamiento. La fuente de ultrasonidos está dispuesta
en contacto perpendicular con el chip, transmitiendo la energía
ultrasónica en una dirección perpendicular al mismo, de manera que
la transmisión de la energía acústica al medio dentro del canal se
produce perpendicularmente a la dirección del flujo.
Más concretamente, el ancho del canal es de 390
\pm 4,6 \mum (1,06 veces el cuarto de la longitud de onda para 1
MHz). El nodo de presión se encuentra localizado a una distancia de
117 \pm 4,6 \mum de la pared reflectora, en la zona ocupada por
el lecho del fluido puro, ajeno a la suspensión. Así, el canal
tiene una sección transversal de 0,0975 mm^{2} y una longitud que
puede variar libremente, aunque en el ejemplo concreto de la
invención es de 1 cm. De esta forma, el volumen del canal es de
0,975 mm^{3}.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el control microfluídico del
microdispositivo de la invención se usó una bomba de inyección de
presión constante con capacidad de aplicación simultánea sobre tres
jeringuillas de diferentes volúmenes (entre 10 \muL y 110 mL)
para controlar el flujo de ambos medios en cada una de las entradas
(160 y 162). La suspensión (150) y el fluido colector (124) fueron
inyectados simultáneamente con la misma presión mediante
jeringuillas del mismo volumen (5 mL cada una) a través de estas
entradas (160 y 162), respectivamente.
La separación ultrasónica de las partículas
seleccionadas y su conducción al nodo de presión, en el lecho del
fluido colector (124), fueron monitorizadas en tiempo real usando
filmaciones de resolución microscópica con una cámara CCD acoplada
a un conjunto de lentes ópticas con una resolución de 1,17 \mum
por pixel digital. El ancho del lecho de flujo ocupado por la
suspensión se mantuvo en torno a 1/2 del ancho del canal (110).
El modelo utilizado para la experimentación en
este ejemplo es un modelo de micropartículas de poliestireno de
tamaños y densidades que mimetizan las características
físico-acústicas de dos tipos de células:
eritrocitos y células tumorales exfoliadas en sangre periférica,
fluyendo inicialmente juntas en un fluido asimilable al plasma
sanguíneo.
Las características
físico-acústicas de este fluido, tales como su
densidad y velocidad de propagación acústica, son descritas en la
literatura (Cousins CM, Holownia P, Hawkes JJ, Limaye MS, Price CP,
Keay P, Coakley WT, Plasma preparation from whole blood using
ultrasound. Ultrasound Med Biol 26:881-888, 2000),
así como las de los eritrocitos (Duck F A, Physical properties of
tissue: a comprehensive referente book, Academia London, 1990,
Haider L, Snabre P, Boynard M, Rheology and ultrasound scattering
from aggregated red cell suspensions in shear flow, Biophysical
Journal, Vol. 87, 2322-2334, 2004). Por el
contrario, la inexistencia de referencias bibliográficas sobre
estas propiedades para las células tumorales circulantes en sangre
periférica, obligó a determinar dichos datos de forma indirecta
mediante el desarrollo de un modelo experimental de inducción. Para
ello, se recurrió a la caracterización acústica de dos medios
líquidos utilizados habitualmente en laboratorios oncológicos para
separación celular por centrifugación y gradiente de densidad:
Ficoll® y otro medio líquido no definido técnicamente pero
utilizado en un dispositivo experimental denominado Oncoquick®, muy
eficaz en la separación de células tumorales por su densidad, sobre
el cual las células tumorales exfoliadas en sangre periférica
permanecen flotando [Rosenberg R, Gertler R, Friedrichs J, Fuehrer
K, Dahm M, Phelps R, Trovan S, Nekarda H, Siewert JR. Comparision
of two density gradient centrifugation systems for the enrichment
of disseminated tumor cells in blood. Cytometry 49;
150-158. 2002].
A partir de las medidas de densidad y velocidad
de propagación del sonido en ambos medios líquidos se derivó el
margen de variabilidad posible para la densidad de las células
tumorales: 1,030 gr/cm^{3} < \rho(células tumorales)
< 1,055 gr/cm^{3}, con un grado de incertidumbre inferior a un
5% del valor mínimo. A partir de estos datos, y teniendo en cuenta
la dependencia aproximadamente lineal para microelementos
biológicos, se pudo realizar una estimación de su compresibilidad,
seleccionando, para este ejemplo, partículas con una densidad de
1,05 gr/cm^{3}, como representativas de las células
tumorales.
Una vez caracterizadas las células tumorales con
este modelo experimental, fueron mimetizadas por partículas de
poliestireno con diámetros seleccionados de 20 \mum. Aunque el
rango de variabilidad de estas células es muy amplio (se puede
definir entre 10 y 40 \mum) se eligió este tamaño como un valor
standard.
Así, se procedió a la introducción y análisis de
suspensiones acuosas "bi-dispersas", es decir,
conteniendo dos poblaciones de partículas, de 6 y 20 micras de
diámetro respectivamente en diferentes concentraciones y sometidas
a los ultrasonidos en el dispositivo. Los resultados de separación
selectiva y extracción de las partículas grandes pueden verse
claramente en la Figuras 6, 7, 8 y 9.
Los resultados de separación selectiva de las
partículas de 20 \mum fueron positivos para todas las pruebas
realizadas, para diversas velocidades de flujo de las muestras
inyectadas a través del canal central de tratamiento (en un rango
de variabilidad entre y 0,06 mm/s y 1,4 mm/s), siempre dentro del
régimen laminar requerido en la microfluídica. Se usaron
suspensiones acuosas bidispersas: con diferentes concentraciones
volumétricas de partículas pequeñas (6 \mum), no cuantificadas, de
partículas grandes con diámetros de 20 \mum en muy baja
concentración, siempre inferior al 1%. Todos los experimentos se
realizaron a la frecuencia determinada por el ancho del canal,
estratégicamente determinado en función de la frecuencia resonante
de la cerámica piezoeléctrica PZ26, de 1 MHz. Como fluido puro se
utilizó siempre agua desionizada.
Más concretamente, en el canal central se
introdujeron en paralelo los dos medios: una suspensión (150) de la
que extraer partículas de ciertas características (101)
(concretamente, partículas de diámetro de 20 \mum y densidad de
1,05 gr/cm^{3}) y un fluido líquido (agua desionizada) (124), a
través de dos canales (160 y 162), ambos con la misma sección
(0,049 mm^{2}) e integrados en el chip de la invención, cada uno
de los cuales ocupa la mitad de la sección del canal central (110).
Los dos medios fluyen a lo largo del canal (110) en paralelo y en
régimen laminar en sus lechos correspondientes: el fluido puro que
colectará las partículas (101) en un lecho de flujo (124) y la
suspensión en el lecho (122) que ocupa la otra parte de la sección
del canal (110), manteniendo estable la interfase que los separa
(120). Este comportamiento se observa en las imágenes de la Figura
5 para dos velocidades de flujo continuo (0,06 mm/s y 1,4 mm/s
respectivamente). Tras recorrer la longitud del canal (110) ambos
medios se separan en el punto de bifurcación (175) hacia dos
canales de salida (170 y 180), por los que abandonan el
dispositivo. Cuando la suspensión (150) fluye por su lecho (122)
dentro del canal (110), aquellas partículas de un determinado
tamaño y densidad (101) contenidas en la misma experimentan una
fuerza de radiación debido al establecimiento de una onda
estacionaria generada en el canal (110) por el transductor
piezoeléctrico (190) ubicado externamente.
Para voltajes de alimentación 15 volts aplicados
al transductor ultrasónico desde un generador de señal continua,
las partículas de 20 \mum (101) experimentan una fuerza de
radiación y son rápidamente conducidas perpendicular al flujo
continuo de la suspensión a lo largo del canal (110) por la acción
del los ultrasonidos hacia el nodo de presión, ubicado en la zona
ocupada por el fluido puro (agua) (124) (Figura 6), a lo largo del
cual continuaron su circulación hacia el final del canal (Figura
7), abandonando de forma diferenciada el dispositivo por el canal
de salida (180) inmersas en dicho fluido (124) y separadas del
resto de la suspensión en la que se encontraban antes de la
aplicación ultrasónica.
Por el contrario, las partículas pequeñas de 6
\mum contenidas en la suspensión (107) en alta concentración, no
son afectadas por el campo acústico y no experimentan ningún
arrastre acústico, dado que la fuerza de radiación ejercida sobre
ellas es mucho menor por ser proporcional a la potencia cúbica del
radio, tres veces inferior al de las grandes (101). De esta manera,
las partículas se mantienen circulando en la suspensión por su
lecho inicial de flujo sin desviar sus trayectorias. Finalmente,
abandonan el dispositivo por el canal de salida de la
suspensión.
Las Figuras 8 y 9 presentan dos colecciones de
fotogramas consecutivos en los que se aprecia claramente la
circulación de las partículas de 20 \mum una vez extraídas
ultrasónicamente de su suspensión y arrastradas y colectadas en el
fluido colector hacia el punto de bifurcación del canal central,
desde donde abandonan el dispositivo a través del canal (180),
separadas de su medio inicial. Dada la anchura del canal (110),
algo mayor a un cuarto de la longitud de la onda acústica
establecida en su interior, la formación del nodo de presión
acústica se produce en una posición intermedia entre la pared del
reflector y la interfase (120), aproximadamente en una posición
correspondiente a 1/3 -2/3 de la anchura del canal (110)
respectivamente. Las partículas (101) tenderán a concentrarse en la
posición nodal de la onda estacionaria desde el momento en que
durante su circulación a lo largo del canal (110) entran en la zona
activa del campo acústico.
El resto de componentes de la suspensión (150)
no son afectados por el campo acústico, no cruzarán la interfase
(120) entre los dos medios (150 y 130) y mantienen su circulación
fluyendo en su lecho correspondiente (122) a lo largo del canal
microfluídico (110), hasta alcanzar el punto de bifurcación (175),
a partir del cual abandonan el dispositivo a través del
canal-ramal de salida (170).
Se destaca la elevada eficacia de separación
selectiva y extracción de las partículas grandes de 20 \mum
obtenida en la experimentación realizada con el dispositivo de la
invención.
Como ejemplo, en experimentos en los que las
muestras eran inyectadas en el canal de tratamiento mediante
jeringuillas de 5 mL y una velocidad de circulación de las mismas
en el canal de 1,4 mm/s (12 minutos para el vaciado de 1 mL) no se
encontraron resultados negativos de actuación, en los que partículas
grandes de 20 \mum desalojasen el dispositivo por el canal de
salida de la suspensión, sino que eran continuamente conducidas
hacia el fluido colector, por cuyo canal de salida desalojaban.
Un análisis cualitativo de visualización de las
muestras recogidas a la salida de los dos canales (170) y (180)
confirma la eficacia de separación selectiva y extracción de las
partículas de 20 \mum de la suspensión en la que se hallaban
inmersas antes del tratamiento ultrasónico. El líquido recogido
durante 1 minuto del canal por el que desaloja la suspensión (170)
sometida a la onda acústica no contiene partículas de 20 \mum y,
sin embargo, presenta una presencia muy elevada de partículas más
pequeñas, con diámetros de 6 \mum. Por el contrario, el líquido
recogido a la salida del canal (180) contiene partículas de
poliestireno de 20 \mum que, como se observa previamente en el
canal central (110) y en la zona de bifurcación (175) son separadas
acústicamente de su suspensión inicial y extraídas al fluido
colector (124), abandonando el dispositivo por el canal (180).
Estos experimentos se realizaron en condiciones
de muy baja concentración para las partículas de 20 \mum, muy
inferior al 1% de su concentración volumétrica, simulando
situaciones reales de células tumorales exfoliadas en sangre. Este
comportamiento repetitivo encontrado en esta población de
partículas para diferentes concentraciones (siempre por debajo del
10%) se debe y se explica por la actuación individual de la fuerza
de radiación acústica sobre cada partícula, independiente de su
concentración en la suspensión. La eficacia de actuación es válida
tanto para concentraciones elevadas como para el caso de
suspensiones extremadamente diluidas, para las que otras técnicas
de separación presentan fuertes caídas de sensibilidad y eficacia
de actuación.
Claims (13)
1. Microdispositivo de separación y extracción
no invasiva y selectiva de partículas en suspensiones
polidispersas caracterizado porque comprende, integrados en
un chip-sustrato de material acústicamente blando,
los siguientes componentes:
a) un sistema de microcanales de flujo de
distribución espacial asimétrica de las ramas de canalización de
salida desde el canal central de tratamiento (110) que comprende
(ver Figura 1):
- i.
- un camino o lecho por el que fluye la suspensión de partida (150), que incluye un canal de entrada (160) para el suministro y otro de salida (170) por donde abandona el dispositivo, en paralelo con
- ii.
- un camino o lecho por el que fluye el fluido puro (124) al que se extraerán las partículas seleccionadas (al que se denomina lecho del fluido colector), incluyendo un canal de entrada o suministro (162) y otro de salida (180), que forman
- iii.
- un canal central de tratamiento (110) donde la suspensión de partida y el fluido puro están separados por una interfase frontera de líneas de corriente en régimen laminar definida por las dimensiones transversales del canal y que se bifurca al final de su recorrido (175) en dos canales de salida mencionados (170) y (180), donde el ancho del canal resonador presenta una relación con la longitud de onda inversamente proporcional a la frecuencia acústica, y donde la profundidad del canal de tratamiento -que conforma junto al ancho su sección transversal- es sensiblemente inferior a un cuarto de la longitud de onda acústica,
y,
b) un actuador o transductor ultrasónico en una
de sus paredes laterales (190)
- externo y paralelo al canal central de
tratamiento (110), que transmite la energía acústica al microcanal
de tratamiento a través del sustrato y del material en el que está
desarrollada la canalización, capaz de establecer una onda
estacionaria en el interior del canal de tratamiento entre sus
paredes laterales, produciendo un nodo de presión a una distancia
de la pared reflectora de aproximadamente 1/3 y 2/3 del ancho del
canal, respectivamente, y de producir un gradiente de presiones
generado acústicamente en el interior del canal central con un
efecto de conducción de ciertas partículas dentro del mismo hacia
la región de equilibrio acústico definida en el nodo, donde la
fuerza de radiación se anula, y
- cuya actuación incluye no sólo el canal
central de tratamiento sino también la zona de bifurcación hacia
los dos microcanales de salida con el objeto de aumentar al máximo
la eficiencia de separación selectiva y extracción.
2. Microdispositivo según la reivindicación 1
caracterizado porque el material acústicamente blando del
chip-sustrato es un material cuya impedancia no
supera en tres veces la impedancia de los medios líquidos, en un
rango de variabilidad oscilante entre 0.8 MRayls y 2.6 MRayls.
3. Microdispositivo según la reivindicación 1
caracterizado porque el material acústicamente blando del
chip-sustrato es un material acrílico.
4. Microdispositivo según la reivindicación 1
caracterizado porque el material acrílico es un epoxy de
resina SU-8 sobre el que se realiza el canal y el
sustrato acrílico es PMMA "Polimetacrilato de Metilo",
presentan una impedancia acústica de 3.3 MRayls, y donde el
transductor ultrasónico b) consiste en una pequeña cerámica
piezoeléctrica, preferentemente, un dispositivo de la marca
PZT26.
5. Procedimiento de fabricación del
microdispositivo según las reivindicaciones 1 a la 4 mediante
técnica de XXXX de acuerdo al diseño descrito en la Figura 1 y que
comprende las siguientes etapas (ver Figura 10):
- a)
- Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible, sobre la superficie de un sustrato independiente (oblea 1),
- b)
- Deposición y definición de una capa polimérica fotodefinible SU-8 sobre la superficie de un sustrato independiente (oblea 2) recubierto con un material antiadherente,
- c)
- Sellado de la oblea 1 y la oblea 2 enfrentado dichas obleas por la cara que contiene el material polimérico fotodefinible, y
- d)
- Retirada de la oblea recubierta con material antiadherente.
\newpage
6. Procedimiento de fabricación del
microdispositivo según las reivindicaciones 1 a la 4 mediante la
técnica de estampación en caliente combinadas con un proceso de
pegado posterior, que comprende las siguientes etapas:
- a)
- Preparación de un molde en el que se incluyen los diseños de canales deseados,
- b)
- Moldeado del sustrato a utilizar usando el molde obtenido en a), mediante la acción de presión y/o temperatura, y
- c)
- Sellado del sustrato mediante el pegado con otro material plástico bajo la acción de presión y/o temperatura y/o activación superficial por plasma de oxígeno.
7. Uso del microdispositivo según las
reivindicaciones 1 a la 4 en un procedimiento de separación no
invasiva selectiva, lavado y/o clasificación de partículas en
suspensiones polidispersas.
8. Uso del microdispositivo según la
reivindicación 7 caracterizado porque las partículas
consisten en células, preferentemente, virus, priones, células
procariotas (por ejemplo, bacterias, levaduras, hongos y algas) y
células eucariotas.
9. Uso del microdispositivo según la
reivindicación 8 caracterizado porque las células eucariotas
son, preferentemente células humanas, más preferentemente células
tumorales, células sanguíneas, células troncales o células madre,
ya sean somáticas o embrionarias, u de otro tipo presentes en
fluidos corporales, como por ejemplo: sangre, orina, líquido
cefalorraquídeo o presentes en otros tipos de muestras
biológicas.
10. Uso del microdispositivo según la
reivindicación 9 caracterizado porque dicho procedimiento de
separación de células eucariotas tiene por objeto el tratamiento de
enfermedades humanas pertenece al siguiente grupo: donaciones de
sangre, plasmaféresis, procesos de diálisis y análisis de
laboratorio, así como reciclado y/o lavado de sangre tras
operaciones quirúrgicas.
11. Uso del microdispositivo según la
reivindicación 9 caracterizado porque dicho procedimiento de
separación de células eucariotas tiene por objeto el diagnóstico y
pronóstico de cáncer en seres humanos para la separación selectiva y
extracción de células tumorales circulantes en sangre periférica
(CTC) de pacientes oncológicos.
12. Uso del microdispositivo según la
reivindicación 9 caracterizado porque dicho procedimiento de
separación de células eucariotas tiene por objeto el diagnóstico
y/o tratamiento de enfermedades humanas para la separación
selectiva y extracción de células dañadas o alteradas de pacientes,
las cuales pueden ser reparadas ex vivo y administradas de
nuevo al paciente.
13. Uso del microdispositivo según la
reivindicación 9 caracterizado porque dicho procedimiento de
separación de células eucariotas tiene por objeto el aislamiento de
células madre humanas o animales provenientes de distintos tejidos
o fluidos.
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