JP2021524496A - 持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体及びこれを含む薬剤学的組成物 - Google Patents

Abstract

本開示は、一側面において、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）の新規の持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体及びこれを含む薬剤学的組成物に関するものである。本開示は、脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体の優れた生体利用率、増加した血中半減期、顕著に優れた性ホルモン−依存性疾患治療の効果を通じて、性ホルモン−依存性疾患の治療において医薬の投薬頻度や投薬量の減少などに大きく寄与すると期待される。特に、既存の注射部位の残存感と痛みの副作用を有していたＧｎＲＨ徐放型製剤の短所を克服することができる。

Description

本開示は、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）の新規の持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体及びこれを含む薬剤学的組成物に関するものである。

生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）または黄体形成ホルモン放出ホルモンは、視床下部性神経ホルモンであって、神経内分泌ペプチド（ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）の一種である。具体的には、ＧｎＲＨは、視床下部の神経血管の末端で合成されて脳下垂体前葉性性腺刺激細胞に作用し、生殖腺刺激ホルモンである黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＬＨ）や濾胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＦＳＨ）の合成及び放出を促進することができる。ＧｎＲＨにより合成及び放出が調節される黄体形成ホルモンや濾胞刺激ホルモンは、男性及び女性の性ホルモンを調節して生殖細胞を成熟させる役割をする。

ＧｎＲＨは、日常の濃度では生殖腺ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）の分泌を促進したり排卵を促進したりする効果を奏する一方、高濃度臨床では反対に、拮抗的阻害効果が生じることが知られている。高濃度の投与を通じてホルモン−依存腫瘍である前立腺癌（Ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）や乳癌（Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）の治療に用いられ得、子宮内膜症（Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ）、子宮線維腫（Ｕｔｅｒｉｎｅ ｆｉｂｒｏｉｄｓ）、真性性早熟症（Ｃｅｎｔｒａｌ ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ ｐｕｂｅｒｔｙ）及び子宮腺筋腫（Ａｄｅｎｏｍｙｏｓｉｓ）などの治療に用いられ得る。ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ誘導体が各種性ホルモン依存性疾患に用いられ得ることが広く知られている（Ｋｕｍａｒ Ｐ．及びＳｈａｒｍａ Ａ，Ｊ Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ Ｓｃｉ，２０１４；７（３）：ｐｐ１７０−１７４）。

ＧｎＲＨを含む既存の治療剤としては、１ヶ月または３ヶ月ごとに注射すればよい既存の徐放型製品が存在し、これは生分解性多核性貯蔵型マイクロカプセル（ＰＬＧＡまたはＰＬＡ）にＧｎＲＨ作用剤を含めた形態である。具体的には、Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標）ＤｅｐｏｔというＧｎＲＨ誘導体徐放化製品が市販されている。これはＧｎＲＨ誘導体であるリュープロレリン酢酸塩（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）を活性物質としてＰＬＧＡ［ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）］微粒球を徐放性成分として含む製品である。前記Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標）Ｄｅｐｏｔは生分解性重合体を用いるため注射量も多く増え、筋肉及び皮下に大きい用量で投与する特徴を有している。これにより、注射部位に痛みや組織損傷が伴い、１ヶ月経っても生分解性重合体が全て吸収されず、数ヶ月間塊り（ｌｕｍｐ）が残っており、時によっては炎症まで起こる問題が生じる。このような問題は、Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標）Ｄｅｐｏｔ製品の場合、生分解性重合体がＧｎＲＨ誘導体と物理的に混合された後に投与されるために起こる。このように生分解性重合体とＧｎＲＨ誘導体が物理的に混合されれば、生分解性重合体は、ＧｎＲＨ誘導体を幾重にも取り囲むようになり、生体内ではＧｎＲＨ誘導体を取り囲んだ生分解性重合体が分解されながらＧｎＲＨ誘導体が放出されて、薬理効果を奏するようになる。ただし、生分解性重合体が物理的に混合されたため、これらが分解される過程で生分解性重合体が体内に長く残存するようになる副作用が生じるものである。

追加で、前記Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標）Ｄｅｐｏｔなどの短所を補完するためにエリガード注（登録商標）などが追加で開発されたが、初期薬物放出現象を有したり、混合溶液上における薬物安定性が低いなど、依然としてさらに他の短所を有している。これにより、ＧｎＲＨの血中濃度を長期間高く維持する製剤または剤形に対する開発の要求は継続している。

既存の徐放型製品は、ＧｎＲＨホルモンを血中に徐々に放出する目的の製剤であって、有効物質を徐放型で放出させるための追加の徐放性物質を含む。これにより、総医薬投与量が大きくなることによる痛み、投与組織の残存感、薬物安定性が低くなる等の問題が生じる。特に、既存の製品（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ Ａｃｅｔａｔｅ）を注射で投与された人のうち２３ないし３０％に至る患者が注射部位の痛みを訴えた（Ｌｅｅ ＰＡ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ，２０１４）。

一方、米国登録特許第９，６９４，０５１号は、アドレノメデュリン（ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ）の一部ペプチドのアミノ末端のリシン（Ｌｙｓ）にアルキルモイエティが接合されて変形されるペプチド結合体が、血清半減期を増加させることを開示している。アルキルモイエティをペプチドのアミノ末端に接合することを通じて血清半減期が増加することを示しているが、ＧｎＲＨと全く異なる機能と配列のペプチドに関するものであって、アルキルモイエティを結合するアミノ末端がリシンである差がある。

このような背景のもとに、本開示の発明者は、追加の物質や持続的放出のための製剤の構成などによる短所を有する徐放型製剤とは異なり、ＧｎＲＨホルモン成分自体の生体内半減期自体を増加させるための持続型製剤であるとともに生体利用率が増加した製剤を開発しようと努力した。具体的には、ＧｎＲＨ自体の生体内半減期を増加させたＧｎＲＨ誘導体に脂肪酸を連結して塩の形態で製造し、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体を完成した。製造した持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体が優れた生体利用率を有しながら、生体半減期及び血中濃度維持効果を確認し、優れた性ホルモン−依存性疾患の治療効果または性成熟抑制効果を確認して本開示を完成した。

このように製造された本開示の脂肪酸結合持続型ＧｎＲＨ誘導体及びこれを含む薬剤学的組成物などは、各種性ホルモン−依存性疾患の予防及び治療または性成熟抑制に用いられ得る。

本開示は、前記のような既存の徐放型製剤の問題に鑑みて創出されたものであり、循環半減期が２〜４分程度に過ぎないＧｎＲＨホルモン成分自体の生体内半減期を増加させるための持続型製剤であるとともに生体利用率が増加した製剤を開発しようとした。これにより、本開示の目的は、投薬容易性と増加した効能を有する持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体及びこれを含む薬剤学的組成物を提供することにある。

本開示の発明者は、天然型状態で循環半減期が２〜４分程度に過ぎない生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）の生体利用率と生体内半減期を増加させ得る誘導体を製造しようと努力した結果、脂肪酸と結合されたＧｎＲＨ誘導体である、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体または薬剤学的に許容可能なその塩を開発し、この増加した効能と生体内半減期を有することを確認して本開示を完成した。

本開示で増加した効能とは、天然型ＧｎＲＨと同一の濃度でさらに優れた性ホルモン関連疾患治療の効果を奏することを意味し、例えば、天然型ＧｎＲＨまたは市販されるＧｎＲＨ誘導体と同一の濃度で投与された時にさらに優れた前立腺癌または乳癌の死滅効果などを有することを意味する。

一方、ＧｎＲＨは、一般の濃度では生殖腺刺激ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）の分泌を促進したり排卵を促進したりする効果を奏するものの、高濃度では反対に、拮抗的阻害効果を奏する。これにより、前記とは反対に、性ホルモンにより悪化する疾患の進行を阻害したり、さらに性ホルモンにより依存的な疾患の改善及び治療に効果を奏する。

以下では、本開示によるＧｎＲＨ誘導体；脂肪酸と結合された前記ＧｎＲＨ誘導体である、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体または薬剤学的に許容可能なその塩；及びこれを含む薬剤学的組成物について詳細に説明する。

１．持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体
本開示は、一側面において、脂肪酸と結合された生殖腺ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）誘導体であり、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体または薬剤学的に許容可能なその塩に関するものであってもよい。

本開示において用語「生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）」は、視床下部の神経血管の末端で合成されて脳下垂体前葉性性腺刺激細胞に作用し、生殖腺刺激ホルモンである黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＬＨ）や濾胞刺激ホルモン（ｆｏｌｌｉｃｌｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＦＳＨ）の合成及び放出を促進する機能を有するホルモンである。ＧｎＲＨは、種別に異なる配列を有することができ、哺乳動物の天然型ＧｎＲＨは、下記配列番号１を有することができる。

[哺乳動物のＧｎＲＨ配列]
ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１）
本開示において用語「ＧｎＲＨ誘導体」は、ＧｎＲＨと構造的に類似するものの、体内で異なる方式で作用する物質を意味し得る。ＧｎＲＨ誘導体、特に作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）に該当する誘導体の初期投与時には、ＧｎＲＨ誘導体がＧｎＲＨ受容体に結合しながら濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）及び黄体ホルモン（ＬＨ）の体内合成と分泌を一定水準促進するようになる。しかし、ＧｎＲＨ誘導体の体内濃度が持続的に維持される場合には生殖腺刺激ホルモンが枯渇し、ＧｎＲＨ受容体が下向調節されて濾胞刺激ホルモン及び黄体ホルモンの合成と分泌がむしろ抑制される矛盾する効果（即ち、拮抗的阻害効果）を有するようになる。このような効果を通じて、性ホルモン依存性疾患の予防または治療に用いられ得、性成熟を抑制するのに用いられ得る。

本開示の一側面において、ＧｎＲＨ誘導体は、ＧｎＲＨ作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）であり、これはリュープロレリン（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、ゴセレリン（Ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、トリプトレリン（Ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）、ナファレリン（Ｎａｆａｒｅｌｉｎ）、ブセレリン（Ｂｕｓｅｒｅｌｉｎ）、ヒストレリン（Ｈｉｓｔｒｅｌｉｎ）、デスロレリン（Ｄｅｓｌｏｒｅｌｉｎ）、メテレリン（Ｍｅｔｅｒｅｌｉｎ）、ゴナドレリン（Ｇｏｎａｄｏｒｅｌｉｎ）及びこれらから変形された誘導体からなる群から選択されたものであってもよい。

本開示の一側面において、ＧｎＲＨ誘導体は、既存に存在するＧｎＲＨ作用剤と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の配列相同性を有するものであってもよい。

具体的には、本開示の一側面によるＧｎＲＨ誘導体は、天然型ＧｎＲＨ、リュープロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、ナファレリン、ブセレリン、ヒストレリン、デスロレリン、メテレリン、またはゴナドレリンと８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の配列相同性を有するものであってもよく、さらに具体的には、天然型ＧｎＲＨ（配列番号１）またはリュープロレリン（配列番号２）と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上の配列相同性を有するものであってもよい。

本開示の一側面において、ＧｎＲＨ誘導体は、リュープロレリンの最初のアミノ酸であるグルタミン酸を他のアミノ酸に置換した誘導体であってもよく、さらに具体的には、グルタミン酸をグルタミンに置換した誘導体であってもよい。

本開示の一側面において、ＧｎＲＨ誘導体は、配列番号２〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むか、このようなアミノ酸配列からなるものであってもよい。

本開示の一側面において、ＧｎＲＨ誘導体は、既存に存在していたＧｎＲＨやＧｎＲＨ誘導体に追加の変形を付加したものを意味し得る。

具体的には、本開示の一側面によるＧｎＲＨ誘導体は、脂肪酸と結合されたＧｎＲＨ誘導体である持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体または薬剤学的に許容可能なその塩であってもよい。さらに具体的には、前記脂肪酸は、ＧｎＲＨ誘導体のアミノ末端に結合されたものであってもよい。

本開示の一側面において、脂肪酸はＣ_６〜Ｃ_３０の飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸であってもよく、直鎖状または側鎖状であってもよい。具体的には、本開示の一側面において、脂肪酸はカプロン酸（ｃａｐｒｏｉｃ ａｃｉｄ）、エナント酸（ｅｎａｎｔｈｉｃ ａｃｉｄ）、カプリル酸（ｃａｐｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、ペラルゴン酸（ｐｅｌａｒｇｏｎｉｃ ａｉｃｄ）、カプリン酸（ｃａｐｒｉｃ ａｃｉｄ）、ウンデシル酸（ｕｎｄｅｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、ラウリン酸（ｌａｕｒｉｃ ａｃｉｄ）、ミリスチン酸（ｍｙｒｉｓｔｉｃ ａｃｉｄ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ）、ステアリン酸（ｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ）、アラキジン酸（ａｒａｃｈｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、ベヘン酸（ｂｅｈｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、リグノセリン酸（ｌｉｇｎｏｃｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、セロチン酸（ｃｅｒｏｔｉｃ ａｃｉｄ）、ミリストレイン酸（ｍｙｒｉｓｔｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、パルミトレイン酸（ｐａｌｍｉｔｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、リノレン酸（ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、アルファ−リノレン酸（ａｌｐｈａ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ、ＡＬＡ）、エイコサペンタエン酸（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ、ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ ａｃｉｄ、ＤＨＡ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＬＡ）、ガンマ−リノール酸（ｇａｍｍａ−ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＧＬＡ）、ジホモ−ガンマ−リノール酸（ｄｉｈｏｍｏ ｇａｍｍａ−ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＤＧＬＡ）、アラキドン酸（ａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＡＡ）、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、バクセン酸（Ｖａｃｃｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、エライジン酸（ｅｌａｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、エイコサン酸（ｅｉｃｏｓａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）及びエルカ酸（ｅｒｕｃｉｃ ａｃｉｄ）、ネルボン酸（ｎｅｒｖｏｎｉｃ ａｃｉｄ）の群から選択されたものであってもよいが、本開示の目的を達成できるものであれば制限されない。本開示において用語「ラウリン酸（ｌａｕｒｉｃ ａｃｉｄ）」は、ドデカン酸ともいい、炭素数１２個のノルマル鎖飽和脂肪酸であって、中性脂肪の構成成分である飽和脂肪酸である。これは構造が安定的で、母乳の重要構成物質の１つでもある。融点は４３．８℃で、室温で白色固体の形態で存在する。

本開示において用語「パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ）」は、炭素数１６個のノルマル鎖飽和脂肪酸であって、１つのカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）を有する疎水性の性質を有する炭化水素鎖のカルボキシルである。

本開示において用語「アラキジン酸（ａｒａｃｈｉｄｉｃ ａｃｉｄ、Ｃ２０）」または「エイコサン酸（Ｅｉｃｏｓａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）」は、炭素数２０個のノルマル鎖飽和脂肪酸である。融点は７５．５℃で、室温で白色結晶性固体の形態で存在する。

本開示の一側面による持続型ＧｎＲＨ誘導体は、脂肪酸結合を通じて、ｉ）腎臓への再吸収及び脂肪貯蔵の効率が促進され；ｉｉ）血清タンパク質との結合増加による保護効果を奏し；ｉｉｉ）類似体シリーズの疎水性を増進させる特性を通じて腎臓排出（Ｒｅｎａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を遅延させ；ｉｖ）脂質膜や生物学的膜への付着による放出期間増加及び薬効増加の効果を奏する。

パルミチン酸が付着されたデキサメタゾンパルミテートエマルジョンの抗炎症効果は、同等量のデキサメタゾン単一成分に比べて５．６倍増加することが知られている（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０１０：３６（１２））。脂肪酸を付けて持続型製剤化されて商業化された製品として、パリペリドンに脂肪酸を付加したインベガトリンザ（登録商標）（ＩＮＶＥＧＡ ＴＲＩＮＺＡ（登録商標））があり、前記デキサメタゾンに脂肪酸を付けたＬｉｐｏｔａｌｏｎ（登録商標）が存在する。

ホルモンや酵素などにパルミチン酸を結合させる場合、前記のような機序により体内半減期は増加することが知られているが、分子の疎水性増加により水溶解度が顕著に低くなり得、水溶性の環境で分子間で凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が起こったり、分子内でタンパク質の疎水性部位との疎水性結合などが起こったりし得る。従って、パルミチン酸のような脂肪酸を結合させると、製剤安定性に問題が生じたり、生体利用率が落ち得、有効成分であるタンパク質の効能が低下し得る。

このような側面で脂肪酸結合を通じて生体内半減期を増加させるものの、特定タンパク質の効能を低下させず、凝集を引き起こさない適切な製剤化戦略が必要である。

本開示において用語「薬剤学的に許容可能な塩」は、本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体の安定性、水溶解度の増加、生体利用率の増加などの目的のために用いられ得る薬剤学的に許容可能な塩を制限なく含む。

本開示の一側面において、薬剤学的に許容可能な塩は、無機酸、有機酸、アンモニウム塩、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩からなる群から選択され、他側面において、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、メタリン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、スルホン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩及びマグネシウム塩からなる群から選択され得る。

本開示の一側面において、脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体は、配列番号４〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むか、このようなアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで前記ＧｎＲＨ誘導体のアミノ末端に、ラウリン酸、パルミチン酸、またはアラキジン酸が結合することができ、前記薬剤学的に許容可能な塩がナトリウム塩または酢酸塩であってもよい。

本開示の一側面において、脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体は、配列番号３または４のアミノ酸配列を含むか、このようなアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで前記ＧｎＲＨ誘導体のアミノ末端にラウリン酸が結合でき、前記薬剤学的に許容可能な塩が酢酸塩であってもよい。

本開示の一側面において、脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体は、配列番号９または１０のアミノ酸配列を含むか、このようなアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで前記ＧｎＲＨ誘導体のアミノ末端にアラキジン酸が結合でき、前記薬剤学的に許容可能な塩が酢酸塩であってもよい。

２．脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体を含む薬剤学的組成物
本開示は、一側面において、本開示の一側面による持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体を有効成分として含む薬剤学的組成物に関するものであってもよい。

本開示の一側面において、薬剤学的組成物は、シクロデキストリンをさらに含み得、ここでシクロデキストリンは、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、またはγ−シクロデキストリンであってもよい。具体的にシクロデキストリンは、メチル−β−シクロデキストリンであってもよいが、本開示の目的を達成するためのものであれば、多様な種類のシクロデキストリンが用いられ得る。

本開示の一側面において、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体は、シクロデキストリンに包接した状態で存在し得る。この場合、脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体とシクロデキストリンが包接複合体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）を構成することができる。

本開示の一側面において、シクロデキストリンは、水に溶け難い活性成分と包接複合体を形成して水溶液中における安定化、溶解性改善及び徐放性などを実現できる物質である。従って、本開示の一側面において、薬剤学的組成物が持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体とシクロデキストリンの包接複合体を含むことにより、有効成分であるＧｎＲＨ誘導体の徐放性が向上する効果を奏することができる。

本開示でシクロデキストリンは、環状のデキストリン構造体であり、グルコースが環状のα−１、４グリコシド結合により連結され、（Ｃ_６Ｈ_１０Ｏ_５）ｎの分子式を有する非還元性のオリゴ糖を意味する。ここで、ｎ＝６、７、８の場合、それぞれをα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンと命名する。

本開示の一側面において、シクロデキストリンと有効成分である持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体間のモル比率は約７：１〜１：１、６：１〜１：１、または５：１〜１：１であってもよい。このような重量比において本開示の一側面による薬剤学的組成物は、優れた溶解度を示すことができる。

本開示の一側面において、薬剤学的組成物は、薬剤学的有効量の本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体を含み、追加で薬剤学的に許容される担体を含み得る。本開示において用語「薬剤学的有効量」は、本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体の効能または活性を達成するのに十分な量を意味し得る。

本開示の一側面において、薬剤学的組成物に含まれ得る薬剤学的に許容される担体は、製剤の際に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。

本開示の一側面において、薬剤学的組成物は、前記成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含み得る。

本開示の一側面において、薬剤学的組成物は、経口または非経口投与され得る。特に、注射剤の投与経路としては、皮下注射、筋肉注射のうちいずれの投与形態も可能であり、投与形態は、目的とする体内濃度調節の効果などを考慮して選択され得る。

本開示の一側面において、薬剤学的組成物は、注射剤、軟膏剤、ゲル剤、ローション剤、カプセル剤、錠剤、液剤、懸濁剤、噴霧剤、吸入剤、点眼剤、粘着剤、貼付剤であってもよく、具体的には、注射剤であってもよい。

本開示の一側面において、薬剤学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因により多様に処方され得る。本開示の一側面において、薬剤学的組成物の一般的な投与量は、成人を基準に、約０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。前記薬剤学的組成物には、本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体が約０．００１〜３０ｍｇ／ｍＬの範囲で含まれる。

本開示の一側面において、用語「約」は、具体的数値に含まれる製造工程上の誤差や本開示の技術的思想の範疇に入る若干の数値調整を含む意図で用いられた。例えば、用語「約」は、それが指す値の±１０％、一側面で±５％、さらに他の側面で±２％の範囲を意味する。本開示内容の分野において、値が具体的にさらに狭い範囲を要求するものとして言及されなければ、この水準の近似値が適切である。

本開示の一側面において、薬剤学的組成物は、本開示が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位用量の形態に製造されたり、または多用量容器内に入れて製造され得る。このとき、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液の形態やエキス剤（ｅｘｔｒａｃｔ）、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤を追加で含み得る。

本開示の一側面において、薬剤学的組成物は、性ホルモン−依存性疾患の予防または治療のために用いられ得、性成熟を抑制するために用いられ得る。前記性ホルモン−依存性疾患は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜症、子宮類線維腫、多嚢胞性卵巣症、真性性早熟症、多毛症、性腺刺激脳下垂体腺腫、睡眠時無呼吸症、過敏性大腸症候群、月経前症候群、良性前立腺肥大症及び不妊からなる群から選択され得るが、これに制限されない。

本開示の一側面において、薬剤学的組成物は、追加で従前に用いていた生分解性重合体と混合して用いる場合、顕著に優れた生体半減期を有することができる。これにより、本開示の一側面による薬剤学的組成物は、生分解性重合体をさらに含み得る。

本開示の一側面において、生分解性重合体は、薬物が身体を通じて腸管外に投与され得るようにしたり、本開示のＧｎＲＨ誘導体またはその塩を含有した重合体が特定部位に局所的に作用できるように投与され得るようにする。本開示で生分解性重合体は、Ｃｈａｓｉｎ Ｍなど（「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，１９９０）またはＤ．Ｗｅｓｃｍａｎなど（「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ」，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，１９９８）を参考にすることができるが、これに制限されない。

例えば、本開示の一側面において、生分解性重合体はＰＬＡ（ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、線状または分状ＰＬＧＡ（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ））、ＰＧＡ（ｐｏｌｙ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、またはヒドロゲルなどであってもよい。

本開示は、一側面において、本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩、またはこれらを含む薬剤学的組成物をヒトを含む哺乳類に投与することによって、性成熟を抑制する方法及び用途または性ホルモン関連症状及び疾患を予防したり治療する方法及び用途を追加で提供する。

本開示は、一側面において、性成熟を抑制したり、または性ホルモン関連症状及び疾患を予防したり治療するための、本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩の用途に関するものであってもよい。

本開示は、一側面において、性成熟を抑制したり、または性ホルモン関連症状及び疾患を予防したり治療するのに用いるための、本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩、またはこれらを含む薬剤学的組成物に関するものであってもよい。

本開示は、一側面において、性成熟を抑制したり、または性ホルモン関連症状及び疾患を予防したり治療するための薬剤学的組成物（または医薬（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ））の製造において、本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩の用途に関するものであってもよい。

本開示の一側面による新規の持続型脂肪酸結合生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）誘導体は、この優れた生体利用率及び増加した血中半減期を通じて、性ホルモン−依存性疾患の治療において医薬の投薬頻度や投薬量の減少などに大きく寄与すると期待される。特に、既存の、注射部位の残存感と痛みの副作用を有していたＧｎＲＨ徐放型製剤の短所を克服することができる。

また、本開示の一側面による持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体及びこれらを含む薬剤学的組成物は、既存の医薬物に比べて顕著に優れた性ホルモン−依存性疾患治療の効果を奏する。従って、これを通じて医薬の投薬頻度や投薬量の減少などに大きく寄与すると期待される。

本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体（実施例１、２、７及び８）とシクロデキストリンを含む薬剤学的組成物（実施例９、１０、１５及び１６）の懸濁液形成程度を肉眼で確認した写真である。 本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体（実施例３〜６）とシクロデキストリンを含む薬剤学的組成物（実施例１１〜１４）の懸濁液形成程度を肉眼で確認した写真である。 本開示の一側面による実施例及び比較例を前立腺癌細胞株であるＤＵ−１４５細胞株に処理した場合の、１％のメチル−β−シクロデキストリン陰性対照群に対する細胞生存率（％）を測定したグラフである。 本開示の一側面による実施例及び比較例を前立腺癌細胞株であるＰＣ３細胞株に処理した場合の、１％のメチル−β−シクロデキストリン陰性対照群に対する細胞生存率（％）を測定したグラフである。 本開示の一側面による実施例及び比較例を前立腺癌細胞株であるＬＮＣａＰ細胞株に処理した場合の、１％のメチル−β−シクロデキストリン陰性対照群に対する細胞生存率（％）を測定したグラフである。 非処理対照群とβ−シクロデキストリンを投与した対照群で卵巣を染色した後にスキャンして示したイメージである。 本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体（実施例１及び２）を含む薬剤学的組成物（実施例９及び１０）を投与した群で卵巣を染色した後にスキャンして示したイメージである。 本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体（実施例５及び６）を含む薬剤学的組成物（実施例１３及び１４）を投与した群で卵巣を染色した後にスキャンして示したイメージである。 本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体（実施例７及び８）を含む薬剤学的組成物（実施例１５及び１６）を投与した群で卵巣を染色した後にスキャンして示したイメージである。 本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体の生体半減期増加の効果を確認するために、対照群薬物（比較例１及び４）と本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体（実施例４及び６）を１２．５ｍｇ／ｋｇの量で単回皮下投与し、時間に応じた血中濃度を測定した動物（ラット）実験結果である。 本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体の生体半減期増加の効果を確認するために、対照群薬物であるリュープロレリン酢酸塩１日製剤（比較例１）と本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体（実施例４及び６）を１２．５ｍｇ／ｋｇの量で単回皮下投与し、時間に応じた血中濃度を測定した動物（ラット）実験結果である。 本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体の生体半減期増加の効果を確認するために、対照群薬物であるリュープロレリン酢酸塩デポ１ヶ月剤形（比較例４）と本開示の一側面によるＧｎＲＨ誘導体（実施例４及び６）を１２．５ｍｇ／ｋｇの量で単回皮下投与し、時間に応じた血中濃度を測定した動物（ラット）実験結果である。

以下、本開示の製造例及び実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、下記の製造例及び実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本開示の内容が下記の製造例及び実施例に限定されるものではない。

製造例１：生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）誘導体の製造
天然型哺乳動物のＧｎＲＨ配列は、下記の通りである。

[哺乳動物のＧｎＲＨ配列]
ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（配列番号１）
前記哺乳動物のＧｎＲＨ配列で６番目のＧｌｙをＤ−Ｌｅｕに置換し、１０番目のＧｌｙをｄｅｓ−Ｇｌｙ（デス−グリシン）に置換してエチルアミド基に切り替えたＬｅｕｐｒｏｌｉｄｅ（登録商標）を本開示の一側面による誘導体及び脂肪酸結合誘導体のバックボーン（ｂａｃｋ ｂｏｎｅ）として用いた。

[リュープロレリン配列]
ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号２）
前記リュープロレリン配列において１番目のアミノ酸であるグルタミン酸を維持した誘導体とこれをグルタミンに置換した誘導体を以下のような製造方法を通じて作った。参考までに、トリプトレリンの配列は、下記の通りである。

[トリプトレリン配列]
ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ_２（配列番号３）
（１）ＧｎＲＨ誘導体ペプチドの製造方法
誘導体ペプチドの合成は、一般のＦｍｏｃ／ｔＢｕ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法により合成され、アミノ酸のα−アミノ基が塩基に敏感なＦｍｏｃ（Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）基で保護されており、アミノ酸の側鎖（ｓｉｄｅ基）は、酸に敏感なグループで保護される。固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）は、次の段階を含んでＦｍｏｃの切断及びアミノ酸の結合の繰り返しを通じてペプチド鎖を順次付けていく。

ｉ）レジンにＦｍｏｃアミノ酸をローディング（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ｔｒｉｔｙｌ ｒｅｓｉｎ）；
ｉｉ）Ｆｍｏｃ−ＡＡ−レジン（２０％のピペリジン／ＤＭＦ）前記Ｆｍｏｃ保護基を除去；
ｉｉｉ）ＤＭＦ洗浄；
ｉｖ）活性化された上でアミノ酸を結合（ＤＩＣ／ＨＯＢｔ使用）；
ｖ）ＤＭＦ洗浄；
ｖｉ）上記ｉｉ）〜ｖ）の段階を繰り返し順次アミノ酸を結合；
ｖｉｉ）合成されたペプチドからレジンのみ除去（１．５％のＴＦＡ／ＤＣＭ）；
ｖｉｉｉ）レジンのみ除去されたペプチドのアミノ末端にエチルアミン（ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を結合（ＥＤＣ・ＨＣｌ／ＨＯＡｔ使用）；及び
ｉｘ）結合されたペプチドで保護化されたｓｉｄｅの全体を切断（９２．５％のＴＦＡ／２．５％のＴＩＳ／２．５％のＥＤＴ／２．５％のＨ_２Ｏ）。

前記製造方法で表２に記載された配列を有する物質を製造した。このように製造したＧｎＲＨ誘導体のアミノ末端にラウリン酸基、パルミチン酸基、またはアラキジン酸基を表２に記載された通りそれぞれ結合した。誘導体のアミノ末端に脂肪酸を付けるのは、一般アミノ酸を結合する方法と同一であった。このような比較例及び実施例のＧｎＲＨ誘導体は、エニジェン（株）に製造を依頼して得た。

（２）ＧｎＲＨ誘導体ペプチドの錠剤（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
前記ＴＦＡ切断後、ペプチドを島津（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）ＨＰＬＣ １０ＡＶＰシステムでＣ１８カラムを用いてＨＰＬＣ条件（Ａバッファ０．０５％のＴＦＡ／Ｈ_２Ｏ、Ｂバッファ０．０５のＴＦＡ／Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、流量率１ｍＬ／ｍｉｎ、波長２３０ｎｍ）の条件下で精製した。精製による各実施例の結果は表１に示し、これはエニジェン（株）に依頼して行ったものである。下記ＧｎＲＨ誘導体の実施例１（Ｌ１）、実施例３（Ｐ１）、実施例５（Ｐ３）及び実施例７（Ａ１）は、１番目のアミノ酸がグルタミン酸であり、実施例２（Ｌ２）、実施例４（Ｐ２）、実施例６（Ｐ４）及び実施例８（Ａ２）は、１番目のアミノ酸がグルタミンである（表２参照）。

ラウリン酸、パルミチン酸及びアラキジン酸は水に難溶性であり、融点がそれぞれ約４３．８℃、約６０℃及び約７５．５℃であるため、室温で固相を帯びている。従って、脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体の場合、水溶液に対する溶解度が低いと予測されるに伴い、塩化（Ｓａｌｔｉｎｇ）を追加で進めた。これにより、ナトリウム塩と酢酸塩の２種類の塩化を行い、下記比較例１〜３と実施例１〜８の脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体塩を製造した。このような比較例及び実施例は、エニジェン（株）に製造を依頼して得た。

製造例２：ＧｎＲＨ誘導体及びシクロデキストリンの包接複合体を含む薬剤学的組成物の製造
メチル−β−シクロデキストリン粉末（シグマアルドリッチ社；品目番号：Ｃ４５５５；分子量：１３０３．３１１ｇ／ｍｏｌ）を表３の量で１ｍＬの滅菌３次蒸溜水に溶かした。

１５ｍＬのコニカルチューブ（ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）に表３の量でＧｎＲＨ誘導体粉末を入れて、上で製造した表３のモル比率に該当するβ−シクロデキストリン水溶液１ｍＬを入れた後、低速回転機（ｒｏｔａｔｏｒ）を用いて室温で一夜混合した。その後、溶液が入っている１５ｍＬのチューブを簡単にスピンダウン（ｓｐｉｎ ｄｏｗｎ）して溶液を集めた後、１．５ｍＬのチューブに移して２次的に低速回転機（ｒｏｔａｔｏｒ）を用いて室温で一夜混合した。最終的に各有効成分が約１０ｍＭの濃度である薬剤学的組成物を得た。これを利用または希釈して下記の実験例で用いた。比較例１〜３の場合は、滅菌３次蒸溜水に２０ｍＭの濃度で製造して用いた。

このように製造した薬剤学的組成物を用いて、下記実験例を進めた。
[実験例１]脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体及びシクロデキストリン包接複合体の懸濁液評価
対照群として、製造例２と同一の方法でメチル−β−シクロデキストリン粉末１３ｍｇを１ｍＬの滅菌３次蒸溜水に溶かして１．５ｍＬのチューブに準備した（１０ｍＭの濃度）。

準備した対照群と、１．５ｍＬのチューブで最終的に混合して製造した実施例９〜１６を肉眼で観察し、これを１００００ｒｐｍで４０秒〜５０秒前後（１分以下）スピンダウンした後、同様に肉眼で観察して溶解度を評価した。実施例９、１０、１５及び１６の結果を図１に示し、実施例１１〜１４の結果を図２に示した。図１によると、ラウリン酸と結合させたＧｎＲＨ誘導体（実施例１及び２）を含む実施例９及び１０とアラキジン酸と結合させたＧｎＲＨ誘導体（実施例７及び８）を含む実施例１５及び１６は、スピンダウン前の観察時に有効成分（ＧｎＲＨ誘導体及びシクロデキストリンの包接複合体）が溶媒である滅菌蒸溜水に十分に分散して懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）として存在することが確認でき、これはスピンダウン後にも同一であった。

図２によると、パルミチン酸と結合させたＧｎＲＨ誘導体（実施例３〜６）を含む実施例１１〜１４も、スピンダウン前の観察時に有効成分（ＧｎＲＨ誘導体及びシクロデキストリンの包接複合体）が溶媒である滅菌蒸溜水に十分に分散して懸濁液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）として存在することが確認でき、これはスピンダウン後にも同一であった。

前記結果によると、本開示の一側面によるＧｎＲＨ誘導体とシクロデキストリンを含む薬剤学的組成物は、分散に優れた懸濁液として存在することが確認でき、このような特性により、持続型または徐放性製剤の効果と目的を達成することができる。

[実験例２]前立腺癌細胞株の生存率評価
ＧｎＲＨ誘導体は、乳癌、前立腺癌、子宮内膜症、真性性早熟症などの疾患治療の目的で臨床に適用される。従って、３種類の前立腺癌細胞株（ＤＵ−１４５、ＰＣ３及びＬＮＣａＰ細胞株）をＴ７５フラスコ内で適正量のＲＰＩＭ １６４０培養液（１０％のＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、１％の非必須アミノ酸（ｎｏｎ−ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）を含む）で培養し、３７℃、５％のＣＯ_２及び９５％の空気の条件の無菌細胞インキュベータを用いた。細胞株の生存率試験は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８、ＤＯＪＩＮＤＯ社の製品）を用いて進めた。各細胞株をＴ７５フラスコでトリプシン処理して分離した後、ＤＵ−１４５は１×１０^４細胞数／ｍＬ密度、ＰＣ３とＬＮＣａＰは１×１０^５の細胞数／ｍＬの密度で９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に移して１時間程度付着化（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）時間を持った。

その後、１００μＭ及び２００μＭの濃度で比較例１〜３と実施例９〜１６及び対照群を各細胞株に処理した。具体的には、細胞生存率に対する陰性対照群として１％のメチルβ−シクロデキストリンを用い、陽性対照群として０．１％のソジウムドデシルサルフェート（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ；ＳＤＳ）を用いた。４８時間の培養後、既存の培養液をなくし、１００μＬの新たな培養液と１０μＬのＣＣＫ−８溶液を各細胞株に処理した。処理４時間後、４５０ｎｍで吸光度を測定し、細胞生存率を確認した。測定した結果は、下表４〜表６、図３〜図５に示した。

表４〜表６及び図３〜図５によると、本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体（実施例１〜８）を含む薬剤学的組成物（実施例９〜１６）は、天然型ＧｎＲＨ（比較例１）と既に市販されているＧｎＲＨ誘導体（比較例２及び３）に比べて予想できなかった非常に優れた効果を奏することが確認できる。

具体的にＤＵ−１４５細胞株においては、陰性対照群と対比して、比較例１〜３は前立腺癌細胞株の生存率がほぼ同一であった。比較例３でのみ約９４％の細胞生存率を示した。一方、本開示の一側面による実施例は、陰性対照群と対比して最小約８０％〜最大約２５％の細胞生存率を示し、前立腺癌細胞株の生存率を顕著に減少させる効果を奏した。このような結果はいずれも統計的に有意味なものであった。

ＰＣ３細胞株において、比較例１〜３は、前立腺癌細胞生存率減少の効果が微小であった。比較例３のトリプトレリンのみが約９５％の細胞生存率を示しただけである。一方、本開示の一側面による実施例は、比較例と比べて非常に優れた細胞生存率減少の効果を奏し、特に実施例１２の場合には、陽性対照群と類似の水準に生存率減少の効果を奏した。

ＬＮＣａＰ細胞株において、処理濃度が２００μＭの場合、比較例１は約９３％、比較例２は約８５％、比較例３は約９０％の細胞生存率を示した。一方、本開示の一側面による実施例は、比較例と比べて非常に優れた細胞死滅効果を奏し、特に実施例１０は陽性対照群と類似の水準であって、実施例１６は陽性対照群より優れた死滅効果を奏した。

３種類の前立腺癌細胞株に対する試験結果によると、１番目のアミノ酸がグルタミン酸からグルタミンに置換された実施例２、４、６及び８を含む実施例１０、１２、１４及び１６は、１番目のアミノ酸が置換されていない実施例１、３、５及び７を含む実施例９、１１、１３及び１５に比べて同一濃度においてさらに優れた細胞死滅効果を奏した。これを通じて、１番目のアミノ酸の置換、脂肪酸との結合及び塩化により、本開示の一側面によるＧｎＲＨ誘導体が前立腺癌死滅に対する予想できなかった優れた効果を奏するという点を確認することができる。

[実験例３]卵巣の形態学的変化如何の評価
脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体の機能的特性維持及び卵巣の形態学的変化を確認するための実験を行った。

雌の９週齢ラットの首の後ろの皮下に、実施例９、１０、１３、１４、１５及び１６の薬剤学的組成物を１２．５ｍｇ／ｋｇの濃度で単回投与した。非処理対照群として何らの薬物も投与していない群と、陰性対照群としてメチル−β−シクロデキストリン３ｍｇを水溶液で投与した。各投与群の個体数は３匹である。

投与後２８日の時点でラットを剖検して卵巣を採取し、これをヘマトキシリン−エオシン染色した（Ｈ＆Ｅ染色）。染色した卵巣を観察して、卵巣の組織学的変化及び病理学的異常有無を確認した。

具体的には、下記のようにＨ＆Ｅ染色を行って卵巣を観察した。
１．ラットの剖検直後、選択した組織（卵巣）を１２時間以上固定液に入れて固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）した。

２．十分に固定された組織を水で洗浄して固定試薬を除去した。
３．パラフィンを組織に浸透させて包理（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）するために、卵巣組織を濃度差のあるアルコール（ｇｒａｄｅｄ ａｌｃｏｈｏｌ）を用いて脱水した。脱水（ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）は、低濃度のアルコール溶液から高濃度のアルコール溶液で徐々に処理した後、純粋な１００％アルコールとベンゼンで処理する過程で行われた。

４．有機溶媒であるベンゼンに溶解させたパラフィンを脱水された卵巣組織に浸透させた後、高温（６０℃）で液体状態の純粋なパラフィンで処理して完全に浸透させた。

５．パラフィン組織を適切な大きさに切った後、ミクロトームで４μｍに切断した。
６．ガラススライドに薄切した組織を載置し、組織のパラフィンをキシレンのような有機溶媒で除去した。

７．組織がついているスライドを高濃度のアルコールから低濃度のアルコール水溶液で処理し、含水（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）させた。

８．ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）水溶液で、細胞の核とその他酸性構造（ＲＮＡに豊んだ構造など）を青色で先に染色した。

９．エオシン（ｅｏｓｉｎ）で細胞と細胞外マトリックスの多くの物質を赤色で二次染色した。

１０．染色が終わった標本は、再度濃度差のあるアルコールを用いて脱水した後、樹脂（バルサム（ｂａｌｓａｍ）または合成樹脂）のような接着剤を用いてカバーグラス（ｃｏｖｅｒ ｇｌａｓｓ）をかぶせた。この過程を封入（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）という。

１１．前記過程が終われば、標本スライドをＳｃａｎＳｃｏｐｅ（登録商標）ＡＴスライドスキャナ（Ａｐｅｒｉｏ社）でスキャンしてイメージとして保存した後、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ（Ａｐｅｒｉｏ社）プログラムで分析した。スキャンしたイメージを図６〜図９に示した。

結果
ラットで発情周期は、発情休止期（ｄｉｅｓｔｒｕｓ）、発情前期（ｐｒｏｅｓｔｒｕｓ）、発情期（ｅｓｔｒｕｓ）及び発情後期（ｍｅｔｅｓｔｒｕｓ）の順に繰り返され、各時期に応じて卵巣は形態学的に変化するようになり、発情周期は略４日〜５日である。

ラットへのＧｎＲＨ作用剤投与時、卵巣で２次卵胞（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ）及び成熟卵胞（ｇｒａｆｆｉａｎ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ）の形成が減少するという点は知られていた（参照：Ｍｏｈａｍｍａｄｂｅｉｇｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ａｇｏｎｉｓｔ（Ｂｕｓｅｒｅｌｉｎ）Ｉｎｄｕｃｅｓ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｒａｔ Ｏｖａｒｉａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ，Ｊｕｌｙ ２０１６）。そこで本実験では、各処理群の卵巣イメージで２次卵胞と成熟卵胞を矢印で表示し、その数が減少するか否かを確認した。

図６によると、非処理対照群とメチル−β−シクロデキストリン投与群では、矢印で表示されたように２次卵胞または成熟卵胞が多数存在することが確認できた。一方、図７〜図９によると、本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体（実施例１、２、５、６、７及び８）を投与したラット群では、２次卵胞または成熟卵胞の数が減少したことが確認できる。このような実施例の誘導体投与群では、黄体（ｃｏｒｐｕｓ ｌｕｔｅｕｍ）の状態が多く観察され、原始卵胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ）または多層１次濾胞（Ｍｕｌｔｉｌａｍｉｎａｒ ｐｒｉｍａｒｙ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ）も多く形成されていないことが確認できた。

このような結果を通じて、本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体がラットで有効な効果を奏するという点が確認でき、具体的には、性成熟を抑制する効果があることが確認できる。

併せて、単回投与後２８日が経過した時点で観察したにも拘わらず、２次卵胞または成熟卵胞の数が減少したことから推察し、本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはこのような誘導体とシクロデキストリンの包接複合体が徐放性を示して持続型製剤として使用可能であるという点も確認することができた。

[実験例４]生体半減期増加率の測定
本発明者は、前記製造した脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体の生体半減期増加の効果を確認するために、動物実験（９週齢の雌ＳＤラット）を進めた。具体的には、リュープロレリン酢酸塩１日製剤（ｎ＝６）、リュープロレリン酢酸塩デポ（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ ｄｅｐｏｔ）１ヶ月剤形（３．７ｍｇ／ｍｏｎｔｈ；ｎ＝７）及び実施例４誘導体（ｎ＝６）または実施例６誘導体（ｎ＝６）を各群別のラットに１２．５ｍｇ／ｋｇの量で単回皮下投与し、時間に応じた血中濃度を測定した。必要な場合、溶媒はＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を用いた。ラットへの投与前、投与後の０．５時間、１時間、２時間、６時間、１日、３日、７日、１０日、１４日、２１日、及び２８日目にラットの尻尾の静脈から採血し、ＬＣ／ＭＳＭＳを用いて血中リュープロレリン及び実施例の誘導体の濃度を測定した。特定時点に濃度が約４ｎｇ／ｍＬに達した場合、その次の時点に測定を進めなかった。

前記実験結果を纏めると下記の通りである。下記表で数値単位はｎｇ／ｍＬである。

前記測定結果は、図１０〜図１２でグラフで示した。前記測定結果に基づき、半減期（ｔ_１／２）、クリアランス率（ＣＬ）、分布容積（Ｖｄ）、最大濃度到達時間（Ｔ_ｍａｘ）、投与後最大濃度（Ｃ_ｍａｘ）及び薬物に対する全身露出程度（ＡＵＣ_ｔ）を計算して薬物動力学的に分析した結果は、下記の通りである。

前記結果を通じて本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体がリュープロレリン（比較例１）より顕著に優れた生体半減期、クリアランス率、分布容積、全身露出程度（ＡＵＣ_ｔ）を有することを確認した。さらに、本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体が、物理的に混合された生分解性重合体を含む既存のリュープロレリン１ヶ月剤形（比較例４）と比較して類似の水準の半減期、クリアランス率及び全身露出程度（ＡＵＣ_ｔ）を有し、特に優れた分布容積と最大濃度到達時間が遅延され、最大濃度が減少することを確認した。これを通じて本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体が生体内で適切な濃度に長い期間維持されることが確認できた。

上で確認した本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体の優れた性質を考慮すると、本開示の脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体は、徐放性のために生分解性重合体をＧｎＲＨ誘導体と物理的に混合して用いていた既存の製品に比べてボリュームが顕著に減り、痛みなどの短所を克服することができ、このように物理的に混合された生分解性重合体が生体内に長い期間残存する副作用などを排除することができる。これは特に小児に用いる場合に有利な特徴である。また、本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体は優れた徐放性を示すに伴い、実験例２及び３で確認したように優れた前立腺癌の死滅効果を奏し、卵巣で２次卵胞または成熟卵胞の数を減少させて性成熟を抑制する効果を奏することができる。

一方、本開示の一側面による脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体を既存の製品に用いていた生分解性重合体と混合して用いると、既存のリュープロレリンのような薬物を用いた時より半減期が顕著に増加し、インプラント（ｉｍｐｌａｎｔ）のような侵襲的（手術的）方法で用いる薬程度に半減期が増加する効果を奏することができる（数ヶ月から１年）。

以上の説明から、本開示の属する技術分野の通常の技術者は、本開示がその技術的思想や必須特徴を変更せずに他の具体的な形態で実施され得ることを理解できる。これと関連し、以上で記述した実施例は全ての面で例示的なものであり、限定的なものではないことを理解すべきである。本開示の範囲は、前記詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、並びに、その等価概念から導き出される全ての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (32)

1. 脂肪酸と結合された生殖腺ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）誘導体であって、
   前記脂肪酸は、パルミチン酸でない、
   持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体または薬剤学的に許容可能なその塩。
2. 前記脂肪酸は、Ｃ_６〜Ｃ_３０の脂肪酸である、
   請求項１に記載の、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩。
3. 前記脂肪酸は、カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、リノレン酸、アルファ−リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノール酸、ガンマ−リノール酸、ジホモ−ガンマ−リノール酸、アラキドン酸、オレイン酸、バクセン酸、エライジン酸、エイコサン酸及びエルカ酸、ネルボン酸の群から選択されたものである、
   請求項２に記載の、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩。
4. 前記脂肪酸は直鎖状であって、ラウリン酸またはアラキドン酸である、
   請求項３に記載の、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩。
5. 前記脂肪酸はＧｎＲＨ誘導体のアミノ末端に結合されたものである、
   請求項１に記載の、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩。
6. 前記ＧｎＲＨ誘導体はＧｎＲＨ作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）である、
   請求項１に記載の、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩。
7. 前記ＧｎＲＨ作用剤は、リュープロレリン（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、ゴセレリン（Ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、トリプトレリン（Ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）、ナファレリン（Ｎａｆａｒｅｌｉｎ）、ブセレリン（Ｂｕｓｅｒｅｌｉｎ）、ヒストレリン（Ｈｉｓｔｒｅｌｉｎ）、デスロレリン（Ｄｅｓｌｏｒｅｌｉｎ）、メテレリン（Ｍｅｔｅｒｅｌｉｎ）及びゴナドレリン（Ｇｏｎａｄｒｅｌｉｎ）からなる群から選択されたものである、
   請求項６に記載の、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩。
8. 前記ＧｎＲＨ誘導体は、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むものである、
   請求項１に記載の、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩。
9. 前記薬剤学的に許容可能な塩は、無機酸、有機酸、アンモニウム塩、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩からなる群から選択されるものである、
   請求項１に記載の、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩。
10. 前記薬剤学的に許容可能な塩は塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、メタリン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、スルホン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩及びマグネシウム塩からなる群から選択されるものである、
    請求項９に記載の、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩。
11. 前記持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体が配列番号４、配列番号５、配列番号１０及び配列番号１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、
    請求項１に記載の、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩。
12. 前記持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体が配列番号５のアミノ酸配列を含む、
    請求項１１に記載の、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩。
13. 前記持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体が配列番号１１のアミノ酸配列を含む、
    請求項１１に記載の、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩。
14. 持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体またはその塩を有効成分として含む、
    請求項１〜１３のいずれか一項に記載の、性ホルモン−依存性疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
15. 前記性ホルモン−依存性疾患は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜症、子宮類線維腫、多嚢胞性卵巣症、真性性早熟症、多毛症、性腺刺激脳下垂体腺腫、睡眠時無呼吸症、過敏性大腸症候群、月経前症候群、良性前立腺肥大症及び不妊からなる群から選択されたものである、
    請求項１４に記載の、薬剤学的組成物。
16. 生分解性重合体をさらに含む、
    請求項１４に記載の、薬剤学的組成物。
17. 有効成分として脂肪酸と結合された生殖腺ホルモン放出ホルモン（ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；ＧｎＲＨ）誘導体である、持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体または薬剤学的に許容可能なその塩；及び
    シクロデキストリンを含む、
    性ホルモン−依存性疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
18. 前記脂肪酸はＣ_６〜Ｃ_３０脂肪酸である、
    請求項１７に記載の、薬剤学的組成物。
19. 前記脂肪酸はカプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、リノレン酸、アルファ−リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノール酸、ガンマ−リノール酸、ジホモ−ガンマ−リノール酸、アラキドン酸、オレイン酸、バクセン酸、エライジン酸、エイコサン酸及びエルカ酸、ネルボン酸の群から選択されたものである、
    請求項１８に記載の、薬剤学的組成物。
20. 前記脂肪酸は直鎖状であって、ラウリン酸、パルミチン酸またはアラキドン酸である、
    請求項１９に記載の、薬剤学的組成物。
21. 前記脂肪酸はＧｎＲＨ誘導体のアミノ末端に結合された、
    請求項１７に記載の、薬剤学的組成物。
22. 前記ＧｎＲＨ誘導体はＧｎＲＨ作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）である、
    請求項１７に記載の、薬剤学的組成物。
23. 前記ＧｎＲＨ作用剤は、リュープロレリン（Ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）、ゴセレリン（Ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、トリプトレリン（Ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）、ナファレリン（Ｎａｆａｒｅｌｉｎ）、ブセレリン（Ｂｕｓｅｒｅｌｉｎ）、ヒストレリン（Ｈｉｓｔｒｅｌｉｎ）、デスロレリン（Ｄｅｓｌｏｒｅｌｉｎ）、メテレリン（Ｍｅｔｅｒｅｌｉｎ）及びゴナドレリン（Ｇｏｎａｄｒｅｌｉｎ）からなる群から選択されたものである、
    請求項２２に記載の、薬剤学的組成物。
24. 前記ＧｎＲＨ誘導体は、配列番号２及び配列番号４〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むものである、
    請求項１７に記載の、薬剤学的組成物。
25. 前記薬剤学的に許容可能な塩は、無機酸、有機酸、アンモニウム塩、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩からなる群から選択されるものである、
    請求項１７に記載の、薬剤学的組成物。
26. 前記薬剤学的に許容可能な塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、メタリン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、スルホン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩及びマグネシウム塩からなる群から選択されるものである、
    請求項２５に記載の、薬剤学的組成物。
27. 前記持続型脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体が配列番号４〜配列番号１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、
    請求項１７に記載の、薬剤学的組成物。
28. 前記性ホルモン−依存性疾患は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜症、子宮類線維腫、多嚢胞性卵巣症、真性性早熟症、多毛症、性腺刺激脳下垂体腺腫、睡眠時無呼吸症、過敏性大腸症候群、月経前症候群、良性前立腺肥大症及び不妊からなる群から選択されたものである、
    請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の、薬剤学的組成物。
29. 前記シクロデキストリンは、メチル−β−シクロデキストリンである、請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の、薬剤学的組成物。
30. 前記脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体とシクロデキストリンが包接複合体として存在するものである、請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の、薬剤学的組成物。
31. 前記シクロデキストリンと脂肪酸結合ＧｎＲＨ誘導体のモル比率は７：１〜１：１である、請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の、薬剤学的組成物。
32. 生分解性重合体をさらに含む、請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の、
    薬剤学的組成物。

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