WO2020196946A1 - 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 - Google Patents

지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present disclosure relates to novel long-acting fatty acid-binding GnRH derivatives of gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) and pharmaceutical compositions comprising the same.
  • Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) or luteinizing hormone-releasing hormone is a hypothalamic neuronal hormone and is a kind of neurodendocrine peptide.
  • GnRH is synthesized at the neurovascular end of the hypothalamus and acts on anterior pituitary gonadotropin cells, and synthesis of luteinizing hormone (LH) or follicle stimulating hormone (FSH), which is a gonadotropin And can promote release.
  • LH luteinizing hormone
  • FSH follicle stimulating hormone
  • GnRH has an effect of stimulating the secretion of gonadotropin or promoting ovulation at normal concentrations, while contradictory antagonistic inhibitory effects occur in high concentration clinical trials.
  • hormone-dependent tumors such as Prostate cancer or breast cancer, and endometriosis, uterine fibroids, central precocious puberty, and It can be used for the treatment of adenomyosis.
  • GnRH or GnRH derivatives can be used in various sex hormone dependent diseases (Kumar P. and Sharma A, J Hum Reprod Sci, 2014; 7(3): pp170-174).
  • a GnRH derivative sustained release product called Lupron ® Depot is commercially available. This is a product that contains PLGA [poly(lactic-co-glycolic acid)] microspheres as a sustained-release ingredient using Leuprolide acetate, a GnRH derivative, as an active material. Since the above Lupron ® Depot uses a biodegradable polymer, the injection volume is increased, and it is administered in large doses to the muscles and subcutaneous.
  • the biodegradable polymer is not absorbed even after 1 month, so that a lump remains for several months, and sometimes even inflammation occurs.
  • This problem is due to the Lupron ® Depot product being administered after the biodegradable polymer is physically mixed with the GnRH derivative.
  • the biodegradable polymer and the GnRH derivative are physically mixed in this way, the biodegradable polymer surrounds the GnRH derivative in layers, and the biodegradable polymer surrounding the GnRH derivative is decomposed in vivo, and the GnRH derivative is released to exhibit a pharmacological effect.
  • the side effect of the biodegradable polymer remaining in the body for a long time in the process of decomposing them occurs.
  • sustained-release products are formulations for the purpose of releasing GnRH hormone into the blood slowly, and contain additional sustained-release substances to release the active substance in a sustained-release form. Accordingly, problems such as pain, residual sensation of the administered tissue, and drug stability due to an increase in the total drug dose occur. In particular, 23 to 30% of the patients who received the conventional product (Leuprolide Acetate) by injection complained of pain at the injection site (Lee PA et al., J. Clin, Endocrinol Metab, 2014).
  • U.S. Patent No. 9,694,051 discloses that a modified peptide conjugate increases serum half-life by conjugating an alkyl moiety to the amino terminal lysine (Lys) of some of the peptides of adrenomedullin. It has been shown that the serum half-life is increased through the conjugation of the alkyl moiety to the amino terminus of the peptide, but there is a difference in that it is for a peptide having a completely different function and sequence from that of GnRH, and the amino terminus that binds the alkyl moiety is lysine.
  • Lys amino terminal lysine
  • the inventors of the present disclosure are long-acting formulations for increasing the half-life in vivo of the GnRH hormone component itself and bioavailability, unlike sustained-release formulations that have disadvantages due to additional substances or formulations for sustained release. Efforts were made to develop the formulation. Specifically, by linking a fatty acid to a GnRH derivative having increased half-life in vivo of GnRH itself and preparing it in a salt form, a long-acting fatty acid-bound GnRH derivative was completed. The prepared long-acting fatty acid-binding GnRH derivative has excellent bioavailability, confirmed the effect of maintaining a living half-life and blood concentration, and confirming an excellent sex hormone-dependent disease treatment effect or a sexual maturation inhibitory effect.
  • the fatty acid-binding long-acting GnRH derivative of the present disclosure prepared as described above, and a pharmaceutical composition including the same may be used for the prevention and treatment of various sex hormone-dependent diseases or for inhibiting sexual maturation.
  • an object of the present disclosure is to provide a long-acting fatty acid-linked GnRH derivative having ease of administration and increased efficacy, and a pharmaceutical composition comprising the same.
  • the inventors of the present disclosure have tried to produce derivatives capable of increasing the bioavailability and half-life in vivo of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) having a circulation half-life of only 2 to 4 minutes in a natural state.
  • GnRH gonadotropin-releasing hormone
  • the increased efficacy means having a better sex hormone-related disease treatment effect at the same concentration as the native GnRH, for example, prostate cancer that is better when administered at the same concentration as the native GnRH or a commercially available GnRH derivative. Or it means having a breast cancer killing effect.
  • GnRH has an effect of promoting secretion of gonadotropin or ovulation at a general concentration, but contradictory antagonistic inhibitory effect at a high concentration.
  • it is effective in inhibiting the progression of diseases exacerbated by sex hormones, or further improving and treating diseases dependent on sex hormones.
  • GnRH derivatives according to the present disclosure.
  • the present disclosure may relate to a fatty acid-linked gonadotropin-releasing hormone (GnRH) derivative, a long-acting fatty acid-bound GnRH derivative, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • GnRH gonadotropin-releasing hormone
  • GnRH gonadotropin-releasing hormone
  • LH gonadotropin
  • FSH follicle stimulating hormone
  • GnRH derivative may refer to a substance that is structurally similar to GnRH, but acts in a different way in the body.
  • the GnRH derivative binds to the GnRH receptor and promotes the synthesis and secretion of follicle stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH) in the body to a certain level.
  • FSH follicle stimulating hormone
  • LH luteinizing hormone
  • the gonadotropin is depleted and the GnRH receptor is down-regulated, thereby inhibiting the synthesis and secretion of follicle stimulating hormone and progesterone (ie, antagonistic inhibitory effect). Will have. Through this effect, it can be used to prevent or treat sex hormone-dependent diseases, and can be used to inhibit sexual maturity.
  • the GnRH derivative is a GnRH agonist, which is Leuprolide, Goserelin, Tryptorelin, Nafarelin, Buserelin (Buserelin), histrelin (Histrelin), deslorelin (Deslorelin), meterelin (Meterelin), gonadreline (Gonadrelin) and may be selected from the group consisting of derivatives modified therefrom.
  • GnRH agonist is Leuprolide, Goserelin, Tryptorelin, Nafarelin, Buserelin (Buserelin), histrelin (Histrelin), deslorelin (Deslorelin), meterelin (Meterelin), gonadreline (Gonadrelin) and may be selected from the group consisting of derivatives modified therefrom.
  • the GnRH derivative may have a sequence homology of 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more with an existing GnRH agonist.
  • the GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure is a natural type GnRH, leuprolide, gosererin, tryptorerrin, naparerin, busererin, histrerin, deslorerin, metererin, or It may have a sequence homology of 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more with gonadreline, and more specifically, natural GnRH (SEQ ID NO: 1) or leuprolide (SEQ ID NO: Number 2) may have a sequence homology of 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more.
  • the GnRH derivative may be a derivative in which glutamic acid, which is the first amino acid of leuprolide, is substituted with another amino acid, and more specifically, it may be a derivative in which glutamic acid is substituted with glutamine.
  • the GnRH derivative may include or consist of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 2 to 11.
  • the GnRH derivative may mean that an additional modification is added to the existing GnRH or GnRH derivative.
  • the GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure may be a long-acting fatty acid-linked GnRH derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is a GnRH derivative combined with a fatty acid. More specifically, the fatty acid may be bonded to the amino terminal of the GnRH derivative.
  • the fatty acid may be a C 6 to C 30 saturated fatty acid or an unsaturated fatty acid, and may be a straight or branched chain.
  • the fatty acid is caproic acid, enanthic acid, caprylic acid, pelargonic acid, pelargonic acid, capric acid, unde Undecylic acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, arachidic acid, behenic acid ), lignoceric acid, cerotic acid, myristoleic acid, palmitoleic acid, linolenic acid, alpha-linolenic acid, ALA ), eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), linoleic acid (LA), gamma-linoleic acid (GLA), dihomo gamma- Linoleic acid (dihomo
  • lauric acid refers to Also known as dodecanoic acid, it is a normal chain saturated fatty acid having 12 carbon atoms, and is a saturated fatty acid that is a component of neutral fat. It has a stable structure and is also one of the important components of breast milk. The melting point is 43.8 °C, and it exists as a white solid at room temperature.
  • the term "palmitic acid” is a normal chain saturated fatty acid having 16 carbon atoms and is a carboxyl of a hydrocarbon chain having a hydrophobic property having one carboxyl group (-COOH).
  • the term "arachidic acid (C20)” or “Eicosanoic acid” is a normal chain saturated fatty acid having 20 carbon atoms. The melting point is 75.5 °C, and it exists as a white crystalline solid at room temperature.
  • the long-acting GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure is i) promotes renal resorption and fat storage efficiency through fatty acid binding; ii) exhibits a protective effect due to increased binding to serum proteins; iii) delaying renal clearance through the hydrophobic properties of the analog series; iv) It has the effect of increasing the release period and increasing the drug efficacy according to the adhesion to the lipid or biological membrane.
  • the term "pharmaceutically acceptable salt” refers to a pharmaceutically acceptable salt that can be used for the purpose of increasing the stability, water solubility, and bioavailability of the fatty acid-binding GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure. Include without limitation.
  • the pharmaceutically acceptable salt is selected from the group consisting of inorganic acids, organic acids, ammonium salts, alkali metal salts, and alkaline earth metal salts, and in another aspect, hydrochloride, hydrobromide, phosphate , Metaphosphate, nitrate, sulfate, acetate, sulfonate, benzoate, citrate, ethanesulfonate, fumarate, lactate, maleate, malate, succinate, tartrate, sodium salt, calcium salt, potassium salt , And may be selected from the group consisting of a magnesium salt.
  • the fatty acid-linked GnRH derivative may include or consist of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4 to 11.
  • lauric acid, palmitic acid, or arachidic acid may be bound to the amino terminal of the GnRH derivative, and the pharmaceutically acceptable salt may be a sodium salt or an acetic acid salt.
  • the fatty acid-linked GnRH derivative may include or consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4.
  • lauric acid may be bonded to the amino terminal of the GnRH derivative, and the pharmaceutically acceptable salt may be an acetic acid salt.
  • the fatty acid-linked GnRH derivative may include or consist of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or 10.
  • arachidic acid may be bound to the amino terminal of the GnRH derivative, and the pharmaceutically acceptable salt may be an acetic acid salt.
  • the present disclosure may relate to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a long-acting fatty acid-linked GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may further include cyclodextrin, wherein the cyclodextrin may be ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, or ⁇ -cyclodextrin.
  • the cyclodextrin may be methyl- ⁇ -cyclodextrin, but various types of cyclodextrin may be used if it is intended to achieve the object of the present disclosure.
  • the long-acting fatty acid-linked GnRH derivative may exist in a state encapsulated by cyclodextrin.
  • the fatty acid-binding GnRH derivative and cyclodextrin may form an inclusion complex.
  • cyclodextrin is a material capable of realizing stabilization in an aqueous solution, improved solubility, and sustained release by forming an inclusion complex with active ingredients that are difficult to dissolve in water. Accordingly, in one aspect of the present disclosure, the pharmaceutical composition may exhibit an effect of improving the sustained-release properties of the GnRH derivative as an active ingredient by including the inclusion complex of the long-acting fatty acid-binding GnRH derivative and the cyclodextrin.
  • cyclodextrin is a cyclic dextrin structure, and glucose is linked by a cyclic ⁇ -1,4 glycosidic bond, and refers to a non-reducing oligosaccharide having a molecular formula of (C 6 H 10 O 5 )n.
  • n 6, 7, and 8
  • each is referred to as ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, and ⁇ -cyclodextrin.
  • the molar ratio between cyclodextrin and the long-acting fatty acid-bonded GnRH derivative as an active ingredient is about 7:1 to 1:1, 6:1 to 1:1, or 5:1 to 1:1 days I can.
  • the pharmaceutical composition according to an aspect of the present disclosure may exhibit excellent solubility.
  • the pharmaceutical composition includes a pharmaceutically effective amount of a fatty acid-linked GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure, and may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically effective amount may mean an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the fatty acid-linked GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure.
  • the pharmaceutically acceptable carrier that may be included in the pharmaceutical composition is commonly used in the manufacture of a formulation, and lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, phosphoric acid Calcium, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil And the like, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like in addition to the above components.
  • the pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally.
  • any dosage form of subcutaneous injection or intramuscular injection may be used, and the dosage form may be selected in consideration of the effect of controlling a desired in vivo concentration.
  • the pharmaceutical composition may be an injection, an ointment, a gel, a lotion, a capsule, a tablet, a liquid, a suspension, a spray, an inhalant, an eye drop, an adhesive, or a patch, and specifically an injection.
  • the appropriate dosage of the pharmaceutical composition may include factors such as formulation method, mode of administration, patient's age, weight, sex, pathologic condition, food, administration time, route of administration, excretion rate and response sensitivity. It can be prescribed in various ways.
  • a typical dosage of the pharmaceutical composition may be in the range of about 0.001 to 100 mg/kg on an adult basis.
  • the pharmaceutical composition includes a fatty acid-linked GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure in the range of about 0.001 to 30 mg/mL.
  • the term “about” is used for the purpose of including an error in the manufacturing process included in the specific numerical value or a slight numerical adjustment that falls within the scope of the technical idea of the present disclosure.
  • the term “about” means a range of ⁇ 10% of the value it refers to, ⁇ 5% on one side, and ⁇ 2% on the other. In the field of this disclosure, an approximation of this level is appropriate unless the values are specifically stated to require a narrower range.
  • the pharmaceutical composition is formulated using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily carried out by a person having ordinary knowledge in the technical field to which the present disclosure belongs. It can be manufactured in unit dosage form or can be manufactured by putting it inside a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, syrup or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or a stabilizer.
  • the pharmaceutical composition may be used for preventing or treating sex hormone-dependent diseases, and may be used to inhibit sexual maturation.
  • the sex hormone-dependent diseases include prostate cancer, breast cancer, ovarian cancer, endometriosis, uterine fibroids, polycystic ovary, true precociousness, hirsutism, gonadotrophic pituitary adenoma, sleep apnea, irritable bowel syndrome, premenstrual syndrome, benign prostate. It may be selected from the group consisting of hypertrophy and infertility, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition when the pharmaceutical composition is additionally used in combination with a biodegradable polymer previously used, it may have a remarkably excellent biological half-life. Accordingly, the pharmaceutical composition according to an aspect of the present disclosure may further include a biodegradable polymer.
  • the biodegradable polymer can be administered so that the drug can be administered to the outside of the intestine through the body, or the polymer containing the GnRH derivative or salt thereof of the present disclosure can act locally on a specific site.
  • the biodegradable polymer may refer to Chasin M et al. ("Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems", New York, Marcel Dekker, 1990) or D. Wescman et al ("Handbook of Biodegradable Polymers", Taylor & Francis, 1998). However, it is not limited thereto.
  • the biodegradable polymer is PLA (poly-lactic acid), linear or branched PLGA (poly (lactic-co-glycolic acid)), PGA (poly-glycolic acid), hydro It may be a gel or the like.
  • the present disclosure provides a method and use for inhibiting sexual maturation or sex hormones by administering a fatty acid-binding GnRH derivative or a salt thereof according to an aspect of the present disclosure to a mammal, including a human, or a pharmaceutical composition comprising the same. Methods and uses for preventing or treating related symptoms and diseases are further provided.
  • the present disclosure may relate to the use of a fatty acid-linked GnRH derivative or salt thereof according to an aspect of the present disclosure for inhibiting sexual maturation, or preventing or treating sex hormone-related symptoms and diseases.
  • the present disclosure is a fatty acid-binding GnRH derivative or a salt thereof according to an aspect of the present disclosure, or a drug comprising the same, for use in inhibiting sexual maturation or preventing or treating sex hormone-related symptoms and diseases It may be related to the pharmaceutical composition.
  • the present disclosure is in the manufacture of a pharmaceutical composition (or medicament) for inhibiting sexual maturation or preventing or treating sex hormone-related symptoms and diseases, fatty acids according to one aspect of the present disclosure It may relate to the use of the bound GnRH derivative or salt thereof.
  • the novel long-acting fatty acid-linked gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) derivative according to an aspect of the present disclosure is administered as a drug in the treatment of sex hormone-dependent diseases through its excellent bioavailability and increased blood half-life. It is expected to greatly contribute to the reduction in frequency and dosage. In particular, it will be possible to overcome the shortcomings of GnRH sustained-release formulations that had side effects of pain and residual feeling of the injection site.
  • long-acting fatty acid-linked GnRH derivatives and pharmaceutical compositions comprising them according to an aspect of the present disclosure exhibit remarkably superior sex hormone-dependent disease treatment effects compared to conventional drugs. Therefore, it is expected that this will greatly contribute to the reduction in the frequency or dosage of medication.
  • Figure 1 shows the degree of suspension formation of a fatty acid-linked GnRH derivative (Examples 1, 2, 7 and 8) and a pharmaceutical composition containing cyclodextrin (Examples 9, 10, 15 and 16) according to an aspect of the present disclosure. This is a picture checked with the naked eye.
  • Example 2 is a photograph showing the degree of formation of a suspension of a fatty acid-bound GnRH derivative (Examples 3 to 6) and a pharmaceutical composition containing cyclodextrin (Examples 11 to 14) according to an aspect of the present disclosure.
  • FIG. 3 is a graph measuring cell viability (%) compared to 1% methyl- ⁇ -cyclodextrin negative control when the Examples and Comparative Examples according to an aspect of the present disclosure are treated with the prostate cancer cell line DU-145 cell line. .
  • 5 is a graph measuring cell viability (%) compared to 1% methyl- ⁇ -cyclodextrin negative control when the Examples and Comparative Examples according to one aspect of the present disclosure are treated with the LNCaP cell line, which is a prostate cancer cell line.
  • Figure 6 is an image showing the scan after staining the ovaries in the untreated control group and the control group administered with ⁇ -cyclodextrin.
  • Example 7 is an image showing a scan after staining the ovary in a group administered with a pharmaceutical composition (Examples 9 and 10) containing a fatty acid-linked GnRH derivative (Examples 1 and 2) according to an aspect of the present disclosure.
  • Example 8 is an image showing a scan after staining the ovary in a group to which a pharmaceutical composition (Examples 13 and 14) containing a fatty acid-linked GnRH derivative (Examples 5 and 6) was administered according to an aspect of the present disclosure.
  • Example 9 is an image showing a scan after staining an ovary in a group to which a pharmaceutical composition (Examples 15 and 16) containing a fatty acid-linked GnRH derivative (Examples 7 and 8) was administered according to an aspect of the present disclosure.
  • Example 10 is a control drug (Comparative Examples 1 and 4) and a fatty acid-binding GnRH derivative (Example 4 and 4) according to an aspect of the present disclosure in order to confirm the effect of increasing the biological half-life of the fatty acid-bound GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure. 6) was administered subcutaneously in an amount of 12.5 mg/kg once and the blood concentration was measured over time. This is the result of an animal (rat) experiment.
  • Example 11 is a fatty acid binding according to an aspect of the present disclosure with a daily formulation of leuprolide acetate (Comparative Example 1), which is a control drug, in order to confirm the effect of increasing the half-life of the fatty acid-bound GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure.
  • This is the result of an animal (rat) experiment in which the blood concentration of the GnRH derivatives (Examples 4 and 6) was administered subcutaneously at a single dose of 12.5 mg/kg over time.
  • Example 12 is a one-month formulation of leuprolide acetate depot (Comparative Example 4) and GnRH according to an aspect of the present disclosure in order to confirm the effect of increasing the half-life of the fatty acid-bound GnRH derivative according to one aspect of the present disclosure.
  • This is the result of an animal (rat) experiment in which the derivatives (Examples 4 and 6) were administered subcutaneously in an amount of 12.5 mg/kg once and the blood concentration was measured over time.
  • the native mammalian GnRH sequence is as follows.
  • the 6th Gly was substituted with D-Leu, and the 10th Gly was substituted with des-Gly (des-glycine), and Leuprolide ® converted to an ethylamide group was used as a derivative and fatty acid according to one aspect of the present disclosure. It was used as the backbone of the binding derivative.
  • sequence of treptorelin is as follows.
  • Derivative peptide synthesis is synthesized by the general Fmoc/tBu solid-phase peptide synthesis (SPPS) method, and the ⁇ -amino group of the amino acid is protected by a base-sensitive Fmoc (Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride) group, and the side chain of the amino acid is an acid-sensitive group.
  • SPPS general Fmoc/tBu solid-phase peptide synthesis
  • a material having the sequence shown in Table 2 was prepared by the above preparation method.
  • a lauric acid group, a palmitic acid group, or an arachidic acid group was each bonded to the amino terminal of the GnRH derivative thus prepared as shown in Table 2.
  • Attaching a fatty acid to the amino terminal of the derivative was the same as the method of attaching a general amino acid.
  • the GnRH derivatives of these Comparative Examples and Examples were obtained by requesting manufacture from Anygen.
  • Example 1 L1
  • Example 3 P1
  • Example 5 P3
  • Example 7 A1
  • the first amino acid is glutamic acid
  • Example 2 L2
  • Example 4 In P2
  • Example 6 P4
  • Example 8 A2
  • the first amino acid was glutamine (see Table 2).
  • Lauric acid, palmitic acid, and arachidic acid are poorly soluble in water and have a melting point of about 43.8°C, about 60°C, and about 75.5°C, respectively, so they have a solid phase at room temperature. Therefore, in the case of the fatty acid-bonded GnRH derivative, it was predicted that the solubility in the aqueous solution was low, and thus, salting was further performed. Accordingly, two types of chlorination of sodium salt and acetic acid salt were performed to prepare fatty acid-bonded GnRH derivative salts of Comparative Examples 1 to 3 and Examples 1 to 8 below. These comparative examples and examples were obtained by requesting manufacture from Anygen.
  • Methyl- ⁇ -cyclodextrin powder (Sigma-Aldrich; Item No.: C4555; Molecular Weight: 1303.311 g/mol) was dissolved in 1 mL of sterile tertiary distilled water in the amount shown in Table 3.
  • Example 9 Example 10
  • Example 12 Example 13
  • Example 14 Example 15
  • Example 16 GnRH derivative Comparative Example 1 Comparative Example 2 Comparative Example 3
  • Example 1 Example 2
  • Example 3 Example 4
  • Example 5 Example 6
  • Example 7 Example 8
  • Example 9 to 16 prepared by finally mixing in a 1.5 mL tube were visually observed, which were spin-down at 10,000 rpm for about 40 to 50 seconds (1 minute or less), and then observed with the naked eye. Thus, the degree of solubility was evaluated.
  • the results of Examples 9, 10, 15 and 16 are shown in Fig. 1, and the results of Examples 11 to 14 are shown in Fig. 2. According to FIG.
  • Examples 9 and 10 including GnRH derivatives (Examples 1 and 2) conjugated with lauric acid and Examples 15 and 16 including GnRH derivatives conjugated with arachidic acid (Examples 7 and 8) are , When observed before spin down, it can be seen that the active ingredient (inclusion complex of GnRH derivative and cyclodextrin) is well dispersed in sterile distilled water as a solvent and exists as a suspension, which is the same even after spin down.
  • Examples 11 to 14, including GnRH derivatives (Examples 3 to 6) conjugated with palmitic acid, are sterilized distilled water in which the active ingredient (inclusion complex of GnRH derivative and cyclodextrin) is a solvent when observed before spinning It can be confirmed that it is well dispersed and exists as a suspension, which is the same even after spin down.
  • the pharmaceutical composition containing the GnRH derivative and cyclodextrin according to one aspect of the present disclosure exists as an excellently dispersed suspension, and due to these characteristics, the effect and purpose of the sustained-release or sustained-release preparation Can be achieved.
  • GnRH derivatives are clinically applied for the treatment of diseases such as breast cancer, prostate cancer, endometriosis, and true precocious puberty. Therefore, 3 kinds of prostate cancer cell lines (DU-145, PC3, and LNCaP cell lines) were mixed in an appropriate amount of RPIM 1640 culture medium (10% FBS, penicillin/streptomycin, 1% non-essential amino acids) in a T75 flask. )), and a sterile cell incubator of 37° C., 5% CO 2 , and 95% air was used. The cell line viability test was conducted using Cell Counting Kit-8 (CCK-8, manufactured by DOJINDO).
  • DU-145 was 1 x 10 4 cells/mL density
  • PC3 and LNCaP was 1 x 10 5 cells/mL in a 96 well plate. The transfer took about 1 hour of attachment time.
  • Comparative Examples 1 to 3 Examples 9 to 16, and control were treated with each cell line at concentrations of 100 ⁇ M and 200 ⁇ M. Specifically, 1% methyl ⁇ -cyclodextrin was used as a negative control for cell viability, and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) was used as a positive control. After incubation for 48 hours, the existing culture solution was removed, and 100 ⁇ L of new culture solution and 10 ⁇ L of CCK-8 solution were treated to each cell line. After 4 hours of treatment, absorbance was measured at 450 nm to confirm the degree of cell viability. The measurement results are shown in Tables 4 to 6 and FIGS. 3 to 5 below.
  • Example 9 100 50.00 ⁇ 0.63 ⁇ 0.01 200 30.80 ⁇ 0.66 ⁇ 0.01
  • Example 10 100 36.40 ⁇ 6.64 ⁇ 0.01 200 25.40 ⁇ 3.96 ⁇ 0.01
  • Example 11 100 47.25 ⁇ 2.50 ⁇ 0.02 200 35.25 ⁇ 0.25 ⁇ 0.01
  • Example 12 100 36.75 ⁇ 1.11 ⁇ 0.01 200 33.50 ⁇ 0.50 ⁇ 0.01
  • Example 13 100 81.50 ⁇ 1.44 ⁇ 0.01 200 41.75 ⁇ 1.18 ⁇ 0.01
  • Example 14 100 38.50 ⁇ 0.29 ⁇ 0.01 200 32.00 ⁇ 0.71 ⁇ 0.01
  • Example 15 100 68.25 ⁇ 0.95 ⁇ 0.01 200 51.25 ⁇ 2.95 ⁇ 0.01
  • Example 16 100 50.25 ⁇ 3.35 ⁇ 0.01 200 39.00 ⁇ 2.27 ⁇ 0.01 Comparative Example 1 100 107.50
  • Example 9 100 41.00 ⁇ 4.36 ⁇ 0.02 200 39.00 ⁇ 4.73 ⁇ 0.02
  • Example 10 100 41.00 ⁇ 1.53 ⁇ 0.02 200 23.00 ⁇ 5.51 ⁇ 0.02
  • Example 11 100 65.60 ⁇ 1.69 ⁇ 0.01 200 29.80 ⁇ 2.54 ⁇ 0.01
  • Example 12 100 29.20 ⁇ 3.04 ⁇ 0.01 200 19.20 ⁇ 1.93 ⁇ 0.01
  • Example 13 100 99.60 ⁇ 5.84 N.S 200 104.60 ⁇ 3.52 N.S
  • Example 14 100 90.80 ⁇ 4.04 N.S 200 54.80 ⁇ 3.93 ⁇ 0.01
  • Example 15 100 72.50 ⁇ 5.33 ⁇ 0.02 200 63.75 ⁇ 5.56 ⁇ 0.02
  • Example 16 100 45.75 ⁇ 5.41 ⁇ 0.02 200 41.33 ⁇ 3.38 ⁇ 0.02 Comparative Example 1 100 105.44 ⁇ 1.76 N.S 200
  • Example 9 100 91.33 ⁇ 10.73 N.S 200 45.33 ⁇ 5.61 ⁇ 0.02
  • Example 10 100 28.33 ⁇ 3.18 ⁇ 0.02 200 22.33 ⁇ 2.33 ⁇ 0.02
  • Example 11 100 37.00 ⁇ 0.58 ⁇ 0.02 200 30.67 ⁇ 0.67 ⁇ 0.02
  • Example 12 100 29.67 ⁇ 1.20 ⁇ 0.02 200 30.33 ⁇ 0.88 ⁇ 0.02
  • Example 13 100 72.33 ⁇ 5.84 ⁇ 0.02 200 66.33 ⁇ 5.24 ⁇ 0.02
  • Example 14 100 33.00 ⁇ 1.53 ⁇ 0.02 200 30.33 ⁇ 0.67 ⁇ 0.02
  • Example 15 100 64.25 ⁇ 3.52 ⁇ 0.02 200 36.50 ⁇ 1.94 ⁇ 0.02
  • Example 16 100 18.25 ⁇ 0.63 ⁇ 0.02 200 18.50 ⁇ 0.50 ⁇ 0.02 Comparative Example 1 100 105.64 ⁇
  • a pharmaceutical composition comprising a fatty acid-bonded GnRH derivative (Examples 1 to 8) according to an aspect of the present disclosure is a natural GnRH (comparative It can be seen that it exhibits unexpected and very excellent effects compared to Example 1) and GnRH derivatives (Comparative Examples 2 and 3) on the market.
  • the survival rates of the prostate cancer cell lines were almost the same in Comparative Examples 1 to 3 compared to the negative control. Only in Comparative Example 3 showed a cell survival rate of about 94%.
  • the Examples according to an aspect of the present disclosure exhibited a cell survival rate of at least about 80% to about 25% at a maximum compared to the negative control, and showed the effect of remarkably reducing the survival rate of prostate cancer cell lines. All of these results were statistically significant.
  • Comparative Examples 1 to 3 had insignificant effect on reducing prostate cancer cell viability. Only tryptorelin of Comparative Example 3 showed a cell viability of about 95%. On the other hand, Examples according to an aspect of the present disclosure exhibited a very excellent cell viability reduction effect compared to the comparative examples, and in particular, Example 12 exhibited a survival rate reduction effect at a level similar to that of the positive control.
  • Comparative Example 1 showed a cell viability of about 93%, Comparative Example 2 about 85%, and Comparative Example 3 about 90%.
  • Examples according to an aspect of the present disclosure exhibited a very excellent apoptosis effect compared to the Comparative Examples, and in particular, Example 10 was at a level similar to that of the positive control, and Example 16 showed a killing effect superior to the positive control. Done.
  • Examples 10, 12, 14, and 16 including Examples 2, 4, 6 and 8 in which the first amino acid was substituted with glutamine from glutamic acid were the first amino acid.
  • Examples 9, 11, 13, and 15 including Examples 1, 3, 5, and 7 which were not substituted it showed a better cell killing effect at the same concentration.
  • the GnRH derivatives according to an aspect of the present disclosure exhibit unexpected and excellent effects on killing prostate cancer by substitution of the first amino acid, binding to fatty acids, and chlorination.
  • compositions of Examples 9, 10, 13, 14, 15 and 16 were administered once at a concentration of 12.5 mg/kg to the back of the neck of a female 9-week-old rat.
  • As an untreated control group no drug was administered, and 3 mg of methyl- ⁇ -cyclodextrin was administered as an aqueous solution as a negative control group.
  • the number of individuals in each administration group was three.
  • rats were autopsied to collect ovaries, which were stained with hematoxylin-eosin (H&E staining). The stained ovary was observed to confirm the histological changes and pathological abnormalities of the ovary.
  • H&E staining hematoxylin-eosin
  • the selected tissue (ovary) was placed in a fixative solution for at least 12 hours and fixed.
  • the sufficiently fixed tissue was washed with water to remove the fixing reagent.
  • the ovarian tissue was dehydrated using a graded alcohol having a difference in concentration. Dehydration was performed in the process of gradually treating from a low-concentration alcohol solution to a high-concentration alcohol solution, followed by treatment with pure 100% alcohol and benzene.
  • Paraffin dissolved in benzene, an organic solvent penetrated into the dehydrated ovarian tissue, and then treated with pure paraffin in a liquid state at high temperature (60°C) to completely penetrate.
  • the sliced tissue was placed on a glass slide, and the tissue paraffin was removed with an organic solvent such as xylene.
  • nucleus and other acidic structures (such as RNA-rich structures) of cells were first stained blue.
  • the sample was dehydrated again with alcohol with a difference in concentration, and then a cover glass was covered with an adhesive such as resin (balsam or synthetic resin). This process is called mounting.
  • sample slides were scanned with a ScanScope® AT slide scanner (Aperio), saved as an image, and analyzed with the ImageScope (Aperio) program.
  • the scanned images are shown in FIGS. 6 to 9.
  • estrus cycle is repeated in the order of estrus, proestrus, estrus, and metestrus, and the ovaries change morphologically according to each period, and the estrus cycle is approximately It is about 4 to 5 days.
  • FIG. 6 it was confirmed that a number of secondary follicles or mature follicles existed as indicated by the arrows in the untreated control group and the methyl- ⁇ -cyclodextrin administration group.
  • Figs. 7 to 9 it was confirmed that the number of secondary follicles or mature follicles decreased in the rat group administered with the fatty acid-binding GnRH derivative (Examples 1, 2, 5, 6, 7 and 8) according to an aspect of the present disclosure.
  • this example derivative-administered group a lot of corpus luteum state was observed, and it was confirmed that there were not many primordial follicles or multilaminar primary follicles.
  • the fatty acid-linked GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure exhibits an effective effect in rats, and specifically, it can be confirmed that it has an effect of inhibiting sexual maturation.
  • the fatty acid-binding GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure or the inclusion complex of such a derivative and cyclodextrin is sustained release. It was also confirmed that it can be used as a long-acting formulation.
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • Example 1 leuprolide acetate daily preparation
  • Comparative Example 4 (Leuprolide acetate 1-month formulation (3.75 mg))
  • Example 4 (P2; Pal_[Q1]GnRH)
  • Example 6 (P4; Pal_[Q1]GnRH_AcOH) Average Standard Deviation Average Standard Deviation Average Standard Deviation Average Standard Deviation 0 - - - - - - - - 0.5 hours 1020 177 133 54.1 11.8 4.362 6.51 2.30 1 hours 769 572 164 89.1 16.9 3.16 9.22 2.57 2 hours 228 267 93.0 51.5 29.1 4.97 18.6 2.83 6 hours 2.88 4.09 19.6 7.04 52.2 14.1 45.7 12.0 1 day - - 19.0 7.49 45.0 6.07 23.2 6.75 3 days - - 7.47 3.45 21.4 2.73 9.60 1.58 7 days - - 5.24 1.72 11.9 2.86 7.20 1.79 10 days - - 10.8 2.89 8.
  • the measurement results are graphed in FIGS. 10 to 12. Based on the above measurement results, half-life (t 1/2 ), clearance rate (CL), volume of distribution (Vd), time to reach maximum concentration (T max ), maximum concentration after administration (C max ), and systemic exposure to the drug.
  • t 1/2 half-life
  • CL clearance rate
  • Vd volume of distribution
  • T max time to reach maximum concentration
  • C max maximum concentration after administration
  • systemic exposure to the drug The results of pharmacokinetic analysis by calculating the degree (AUC t ) are as follows.
  • the fatty acid-binding GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure has a remarkably superior half-life, clearance rate, volume of distribution, and systemic exposure degree (AUC t ) than leuprolide (Comparative Example 1). Furthermore, the fatty acid-linked GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure has a similar level of half-life, clearance rate, and systemic as compared to the conventional leuprolide 1-month formulation (Comparative Example 4) containing a physically mixed biodegradable polymer. It has an exposure degree (AUC t ), and in particular, it was confirmed that the excellent distribution volume and the time to reach the maximum concentration were delayed, and the maximum concentration was decreased. Through this, it was confirmed that the fatty acid-bound GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure was maintained at an appropriate concentration in vivo for a long period of time.
  • the fatty acid-bonded GnRH derivative of the present disclosure has a volume compared to conventional products that physically mix a biodegradable polymer with a GnRH derivative for sustained release. This remarkably decreases, so that shortcomings such as pain can be overcome, and side effects such as physically mixed biodegradable polymers remaining in the living body for a long period of time can be excluded. This is particularly advantageous when used in children.
  • the fatty acid-bound GnRH derivative according to an aspect of the present disclosure exhibits excellent sustained-release properties, it exhibits excellent prostate cancer killing effect as confirmed in Experimental Examples 2 and 3, and reduces the number of secondary follicles or mature follicles in the ovary. It may have an effect of inhibiting sexual maturity.
  • the half-life is significantly increased compared to when a drug such as leuprolide is used, and implants (implant ), the half-life may increase as well as drugs used in an invasive (surgical) method (from months to 1 year).

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Abstract

본 개시는 일 측면에 있어서, 생식샘자극 호르몬 방출 호르몬(gonadotrophin-releasing hormone; GnRH)의 신규한 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 개시는 지방산 결합 GnRH 유도체의 우수한 생체 이용률, 증가한 혈중 반감기, 현저하게 우수한 성 호르몬-의존성 질환 치료 효과를 통해 성 호르몬-의존성 질환 치료에 있어 의약의 투약 빈도수나 투약량 감소 등에 크게 기여할 것으로 기대된다. 특히, 기존의 주사 부위의 잔존감과 통증의 부작용을 가지고 있던 GnRH 서방형 제제들의 단점을 극복할 수 있을 것이다.

Description

지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
본 개시는 생식샘자극 호르몬 방출 호르몬(gonadotrophin-releasing hormone; GnRH)의 신규한 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
생식샘자극 호르몬 방출 호르몬(gonadotrophin-releasing hormone; GnRH) 또는 황체형성 호르몬 방출 호르몬은 시상하부성 신경 호르몬으로 신경내 분비 펩타이드(neurodendocrine peptide)의 일종이다. 구체적으로, GnRH는 시상하부의 신경혈관 말단에서 합성되어 뇌하수체 전엽성 성선자극 세포에 작용하고, 생식샘 자극 호르몬인 황체형성호르몬(luteinizing hormone; LH)이나 여포자극호르몬(follicle stimulating hormone; FSH)의 합성 및 방출을 촉진할 수 있다. GnRH에 의해 합성 및 방출이 조절되는 황체형성호르몬이나 여포자극호르몬은 남성 및 여성 성 호르몬을 조절하고 생식 세포를 성숙시키는 역할을 한다.
GnRH는 일상적 농도에서는 생식샘 호르몬(gonadotropin) 분비를 촉진하거나 배란을 촉진하는 효과를 가지는 한편, 고농도 임상에서는 모순적으로 길항적 저해 효과가 발생하는 것이 알려져 있다. 고농도 투여를 통해서 호르몬-의존 종양인 전립선암(Prostate cancer)이나 유방암(Breat cancer) 치료에 사용될 수 있고, 자궁 내막증(Endometriosis), 자궁 섬유양(Uterine fibroids), 진성 성조숙증(Central precocious puberty), 및 자궁선근종(Adenomyosis) 등의 치료에 사용될 수 있다. GnRH 또는 GnRH 유도체들이 각종 성 호르몬 의존성 질환에 사용될 수 있음이 널리 알려져 있다 (Kumar P. 및 Sharma A, J Hum Reprod Sci, 2014; 7(3): pp170-174).
GnRH를 포함하는 기존 치료제로는 1개월 또는 3개월마다 주사하면 되는 기존 서방형 제품이 존재하며, 이는 생분해성 다핵성 저장형 마이크로캡슐(PLGA 또는 PLA)에 GnRH 작용제를 포함시킨 형태이다. 구체적으로, Lupron® Depot이라는 GnRH 유도체 서방화 제품이 시판되고 있다. 이는 GnRH 유도체인 류프로라이드 아세트산염(Leuprolide acetate)를 활성물질로 하여 PLGA [poly(lactic-co-glycolic acid)] 미립구를 서방성 성분으로 포함하는 제품이다. 위 Lupron®Depot는 생분해성 중합체를 사용하기 때문에 주사양도 많이 늘어나 근육 및 피하에 큰 용량으로 투여하는 특징을 가지고 있다. 이에 주사 부위에 동통이나 조직 손상이 수반되고 1개월이 지나도 생분해성 중합체가 다 흡수되지 않아 수개월 동안 덩어리(lump)가 남아있고, 때에 따라 염증까지 일어나는 문제가 발생한다. 이러한 문제는 Lupron® Depot 제품의 경우 생분해성 중합체가 GnRH 유도체와 물리적으로 혼합된 후에 투여되기 때문이다. 이렇게 생분해성 중합체와 GnRH 유도체가 물리적으로 혼합되면, 생분해성 중합체는 GnRH 유도체를 겹겹이 둘러싸게되고, 생체내에서는 GnRH 유도체를 둘러싼 생분해성 중합체가 분해되면서 GnRH 유도체가 방출되어 약리효과를 나타내게 된다. 다만 생분해성 중합체가 물리적으로 혼합되었기 때문에, 이들이 분해되는 과정에서 생분해성 중합체가 체내에 오래 잔존하게되는 부작용이 발생하게 되는 것이다.
추가로, 위 Lupron®Depot 등의 단점을 보완하기 위해 엘리가드주® 등이 추가로 개발되었으나, 초기 약물 방출 현상을 가지거나, 혼합 용액 상에서의 약물 안정성이 낮은 등 여전히 또 다른 단점을 가지고 있다. 이에, GnRH의 혈중 농도를 장기간 높게 유지하는 제제 또는 제형에 대한 개발 요구는 계속되고 있다.
기존 서방형 제품들은 GnRH 호르몬을 혈중에 서서히 방출하는 목적의 제제들로 유효 물질을 서방형으로 방출시키기 위한 추가적인 서방성 물질을 포함한다. 이에 따라 총 의약 투여량이 커지는 것에 따른 통증, 투여 조직의 잔존감, 약물 안정성이 낮아지는 등의 문제점이 발생한다. 특히, 기존 제품(Leuprolide Acetate)을 주사로 투여받은 사람들 중 23에서 30%에 달하는 환자가 주사 부위의 통증을 호소하였다(Lee PA et al., J. Clin, Endocrinol Metab, 2014).
한편, 미국등록특허 제9,694,051호는 아드레노메둘린(adrenomedullin)의 일부 펩타이드의 아미노 말단 리신(Lys)에 알킬 모이어티가 접합되어 변형되는 펩타이드 결합체가 혈청 반감기가 증가하는 것을 개시하고 있다. 알킬 모이어티를 펩타이드 아미노 말단에 접합하는 것을 통해 혈청 반감기가 증가하는 것을 보이고 있으나, GnRH와 전혀 상이한 기능과 서열의 펩타이드에 대한 것이고 알킬 모이어티를 결합하는 아미노 말단이 리신인 차이가 있다.
이러한 배경하에, 본 개시의 발명자들은 추가 물질이나 지속적 방출을 위한 제제 구성 등에 의한 단점들을 가진 서방형 제제와 달리 GnRH 호르몬 성분 자체의 생체 내 반감기 자체를 증가시키기 위한 지속형 제제이자 생체 이용률이 증가된 제제를 개발하고자 노력하였다. 구체적으로, GnRH 자체의 생체 내 반감기를 증가시킨 GnRH 유도체에 지방산을 연결하고 염 형태로 제조하여, 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체를 완성하였다. 제조한 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체가 우수한 생체 이용률을 가지며 생체 반감기 및 혈중 농도 유지 효과를 확인하고, 우수한 성 호르몬-의존성 질환의 치료 효과 또는 성 성숙 억제 효과를 확인하여 본 개시를 완성하였다.
이렇게 제조된 본 개시의 지방산 결합 지속형 GnRH 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물 등은 각종 성 호르몬-의존성 질환의 예방 및 치료 또는 성 성숙 억제에 사용될 수 있다.
본 개시는 위와 같은 기존 서방형 제제의 문제점을 감안하여 창출된 것으로, 순환 반감기가 2 내지 4분 정도에 불과한 GnRH 호르몬 성분 자체의 생체 내 반감기를 증가시키기 위한 지속형 제제이자 생체 이용률이 증가된 제제를 개발하고자 하였다. 이에 본 개시의 목적은 투약 용이성과 증가된 효능을 가지는 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 및 이를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 개시의 발명자는 천연형 상태에서 순환 반감기가 2 내지 4분 정도에 불과한 생식샘자극 호르몬 방출 호르몬(gonadotropin-releasing hormone; GnRH)의 생체 이용률과 생체 내 반감기를 증가시킬 수 있는 유도체를 제조하고자 노력한 결과, 지방산과 결합된 GnRH 유도체인, 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염을 개발하여, 이의 증가된 효능과 생체 내 반감기를 가지는 것을 확인하여 본 개시를 완성하였다.
본 개시에서 증가된 효능이란 천연형 GnRH와 동일한 농도에서 더 우수한 성 호르몬 관련 질환 치료 효과를 가지는 것을 의미하며, 예를 들어 천연형 GnRH 또는 시판되는 GnRH 유도체와 동일한 농도로 투여되었을 때 더 우수한 전립선암 또는 유방암 사멸 효과 등을 가지는 것을 의미한다.
한편, GnRH는 일반적 농도에서는 생식샘자극 호르몬(gonadotropin) 분비를 촉진하거나 배란을 촉진하는 효과를 가지나, 고농도에서는 모순적으로 길항적 저해 효과를 가진다. 이에 위와는 반대로 성 호르몬에 의해 악화되는 질환들의 진행을 저해하거나, 나아가 성 호르몬에 의해 의존적인 질환의 개선 및 치료에 효과를 가진다.
이하에서는 본 개시에 따른 GnRH 유도체; 지방산과 결합된 상기 GnRH 유도체인, 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염; 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 대해 상세하게 설명한다.
1. 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체
본 개시는 일 측면에 있어서, 지방산과 결합된 생식샘 호르몬 방출 호르몬(gonadotropin-releasing hormone; GnRH) 유도체인, 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염에 관한 것일 수 있다.
본 개시에서 용어, "생식샘자극 호르몬 방출 호르몬(gonadotropin-releasing hormone; GnRH)"은 시상하부의 신경혈관 말단에서 합성되어 뇌하수체 전엽성 성선자극 세포에 작용하고, 생식샘 자극 호르몬인 황체형성호르몬(luteinizing hormone; LH)이나 여포자극호르몬(follicle stimulating hormone; FSH)의 합성 및 방출을 촉진하는 기능을 가지는 호르몬이다. GnRH로는 종별로 다른 서열을 가질 수 있고, 포유동물 천연형 GnRH는 하기 서열번호 1을 가질 수 있다.
[포유동물 GnRH 서열]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly (서열번호 1)
본 개시에서 용어, "GnRH 유도체"는 GnRH와 구조적으로 유사하지만 체내에서 다른 방식으로 작용하는 물질을 의미할 수 있다. GnRH 유도체, 특히 작용제(agonist)에 해당하는 유도체의 초기 투여시에는 GnRH 유도체가 GnRH 수용체에 결합하면서 여포 자극 호르몬(FSH) 및 황체호르몬(LH)의 체내 합성과 분비를 일정 수준 촉진하게 된다. 그러나 GnRH 유도체의 체내 농도가 지속적으로 유지되는 경우에는 생식샘자극 호르몬이 고갈되고, GnRH 수용체를 하향 조절되어 여포 자극 호르몬 및 황체 호르몬의 합성과 분비가 오히려 억제되는 모순적인 효과(즉 길항적 저해 효과)를 지니게 된다. 이러한 효과를 통해 성 호르몬 의존성 질환들의 예방 또는 치료에 이용될 수 있고, 성 성숙을 억제하는데 이용될 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, GnRH 유도체는 GnRH 작용제(agonist)이고, 이는 류프로라이드(Leuprolide), 고세레린(Goserelin), 트립토레린(Triptorelin), 나파레린(Nafarelin), 부세레린(Buserelin), 히스트레린(Histrelin), 데스로레린(Deslorelin), 메테레린(Meterelin), 고나드레린(Gonadrelin) 및 이들로부터 변형된 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, GnRH 유도체는 기존에 존재하는 GnRH 작용제와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있다.
구체적으로, 본 개시의 일 측면에 따른 GnRH 유도체는 천연형 GnRH, 류프로라이드, 고세레린, 트립토레린, 나파레린, 부세레린, 히스트레린, 데스로레린, 메테레린, 또는 고나드레린과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로 천연형 GnRH(서열번호 1) 또는 류프로라이드(서열번호 2)와 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, GnRH 유도체는 류프로라이드의 첫 번째 아미노산인 글루탐산을 다른 아미노산으로 치환한 유도체일 수 있고, 더욱 구체적으로는 글루탐산을 글루타민으로 치환한 유도체일 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, GnRH 유도체는 서열번호 2 내지 11 으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, GnRH 유도체는 기존에 존재하던 GnRH나 GnRH 유도체에 추가적인 변형을 부가한 것을 의미할 수 있다.
구체적으로, 본 개시의 일 측면에 따른 GnRH 유도체는 지방산과 결합된 GnRH 유도체인 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 지방산은 GnRH 유도체의 아미노 말단에 결합된 것일 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 지방산은 C6 내지 C30의 포화 지방산 또는 불포화 지방산일 수 있으며, 직쇄형 또는 측쇄형일 수 있다. 구체적으로 본 개시의 일 측면에 있어서, 지방산은 카프로산 (caproic acid), 에난트산(enanthic acid), 카프릴산(caprylic acid), 펠라곤산(pelargonic aicd), 카프르산(capric acid), 운데실산(undecylic acid), 라우르산(lauric acid), 미리스트산(myristic acid), 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid), 아라키드산(arachidic acid), 베헨산(behenic acid), 리그노세르산(lignoceric acid), 세로트산(cerotic acid), 미리스트올레산(myristoleic acid), 팔미톨레산(palmitoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 알파-리놀렌산(alpha-linolenic acid, ALA), 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid, EPA), 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid, DHA), 리놀레산(linoleic acid, LA), 감마-리놀레산(gamma-linoleic acid, GLA), 디호모 감마-리놀레산(dihomo gamma-linoleic acid, DGLA), 아라키돈산(arachidonic acid, AA), 올레산(oleic acid), 바크센산(Vaccenic acid), 엘라이드산(elaidic acid), 에이코센산(eicosanoic acid), 및 에루스산(erucic acid), 네르본산(nervonic acid)의 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 본 개시의 목적을 달성할 수 있는 것이라면 제한되지 않는다.본 개시에서 용어, "라우르산(lauric acid)"은 도데칸산이라고도 하며 탄소수 12개의 노르말 사슬 포화 지방산으로, 중성지방의 구성성분인 포화 지방산이다. 이는 구조가 안정적이고 모유의 중요 구성 물질 중 하나이기도 하다. 녹는점은 43.8 ℃로 실온에서 흰색 고체의 형태로 존재한다.
본 개시에서 용어, "팔미트산(palmitic acid)"는 탄소수 16개의 노르말 사슬 포화 지방산으로 1개의 카르복시기(-COOH)를 가지는 소수성 성질을 가지는 탄화수소 사슬의 카르복실이다.
본 개시에서 용어, "아라키드산(arachidic acid, C20)" 또는 "에이코사노익 산(Eicosanoic acid)"은 탄소수 20개의 노르말 사슬 포화 지방산이다. 녹는점은 75.5 ℃로 실온에서 흰색 결정성 고체의 형태로 존재한다.
본 개시의 일측면에 따른 지속형 GnRH 유도체는 지방산 결합을 통해 i) 신장 재흡수 및 지방 저장 효율이 촉진되고; ii) 혈청 단백질과의 결합 증가에 따른 보호 효과를 나타내고; iii) 유사체 시리즈들의 소수성을 증진시키는 특성을 통해 신장 배출(Renal clearance)을 지연시키고; iv) 지질막이나 생물학적 막에의 부착에 따른 방출기간 증가 및 약효 증가의 효과를 지닌다.
팔미트산이 부착된 덱사메타손 팔미테이트 에멀젼의 항-염증 효과는 동등량의 덱사메타손 단일성분에 비해 5.6배 증가함이 알려져 있다(Peng et al., Drug Development and Industrial Pharmacy, 2010: 36(12)). 지방산을 붙여 지속형 제제화되어 상업화된 제품으로 팔리페리돈에 지방산을 붙인 인베가 트린자®(INVEGA TRINZA®)가 있으며, 위 덱사메타손에 지방산을 붙인 Lipotalon®이 존재한다.
호르몬이나 효소 등에 팔미트산을 결합시킬 경우, 상기와 같은 기작에 의해 체내 반감기는 증가하는 것이 알려져 있으나, 분자의 소수성 증가에 의해 수용해도가 현저히 낮아질 수 있고, 수용성 환경에서 분자들 간에 응집(aggregation)이 일어나거나 분자 내에서 단백질의 소수성 부위와의 소수성 결합 등이 일어날 수 있다. 따라서, 팔미트산과 같은 지방산을 결합시키면 제제 안정성에 문제가 생기거나, 생체 이용률이 떨어질 수 있고, 유효 성분인 단백질의 효능이 저하될 수 있다.
이러한 측면에서 지방산 결합을 통해 생체 내 반감기를 증가시키되, 특정 단백질의 효능을 저하시키지 않고 응집을 일으키지 않는 적절한 제제화 전략이 필요하다.
본 개시에서 용어, "약제학적으로 허용가능한 염"은 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체의 안정성, 수용해도 증가, 생체 이용률 증가 등의 목적을 위해 사용될 수 있는 약제학적으로 허용가능한 염을 제한없이 포함한다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 염은 무기 산, 유기 산, 암모늄염, 알칼리 금속염, 및 알칼리 토금속염,으로 이루어진 군에서 선택되고, 다른 측면에 있어서, 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 메타인산염, 질산염, 황산염, 아세트산염, 설폰산염, 벤조산염, 시트르산염, 에탄설폰산염, 푸마르산염, 락트산염, 말레산염, 말산염, 석신산염, 타르타르산염, 나트륨염, 칼슘염, 칼륨염, 및 마그네슘염으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 지방산 결합 GnRH 유도체는 서열번호 4 내지 11으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 여기서 상기 GnRH 유도체의 아미노 말단에 라우르산, 팔미트산, 또는 아라키드산이 결합할 수 있으며, 상기 약제학적으로 허용가능한 염이 나트륨염 또는 아세트산 염일 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 지방산 결합 GnRH 유도체는 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 여기서 상기 GnRH 유도체의 아미노 말단에 라우르산이 결합할 수 있고, 상기 약제학적으로 허용가능한 염이 아세트산 염일 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 지방산 결합 GnRH 유도체는 서열번호 9 또는 10의 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 여기서 상기 GnRH 유도체의 아미노 말단에 아라키드산이 결합할 수 있고, 상기 약제학적으로 허용가능한 염이 아세트산 염일 수 있다.
2. 지방산 결합 GnRH 유도체를 포함하는 약제학적 조성물
본 개시는 일 측면에 있어서, 본 개시의 일 측면에 따른 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체를 유효성분으로서 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것일 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 약제학적 조성물은 사이클로덱스트린을 더 포함할 수 있으며, 여기서 사이클로덱스트린은 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, 또는 γ-사이클로덱스트린일 수 있다. 구체적으로 사이클로덱스트린은 메틸-β-사이클로덱스트린일 수 있으나, 본 개시의 목적을 달성하기 위한 것이라면 다양한 종류의 사이클로덱스트린이 사용될 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체는 사이클로덱스트린에 포접된 상태로 존재할 수 있다. 이 경우 지방산 결합 GnRH 유도체와 사이클로덱스트린이 포접 복합체(inclusion complex)를 구성할 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 사이클로덱스트린은 물에 녹기 어려운 활성 성분들과 포접 복합체를 형성하여 수용액 중에서의 안정화, 용해성 개선 및 서방성 등을 실현할 수 있는 물질이다. 따라서 본 개시의 일 측면에 있어서, 약제학적 조성물이 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체와 사이클로덱스트린의 포접 복합체를 포함함으로써 유효성분인 GnRH 유도체의 서방성이 향상되는 효과를 나타낼 수 있다.
본 개시에서 사이클로덱스트린은 환상의 덱스트린 구조체이며 글루코스가 환상의 α-1,4 글리코시드 결합에 의해 연결되고, (C6H10O5)n의 분자식을 가지는 비환원성의 올리고당을 의미한다. 여기서 n=6, 7, 8 인 경우 각각을 α-사이클로덱스트린, β-사이클로덱스트린, 및 γ-사이클로덱스트린으로 명명한다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 사이클로덱스트린과 유효성분인 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 간의 몰비율은 약 7:1 내지 1:1, 6:1 내지 1:1, 또는 5:1 내지 1:1일 수 있다. 이러한 중량비에서 본 개시의 일 측면에 따른 약제학적 조성물은 우수한 용해도를 나타낼 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 약제학적 조성물은 약제학적 유효량의 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체를 포함하고, 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 개시에서 용어 "약제학적 유효량"은 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 의미할 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 제조시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 특히, 주사제 투여 경로로는 피하 주사, 근육 주사 중 어느 투여 형태도 가능하고, 투여 형태는 목적하는 체내 농도 조절 효과 등을 고려하여 선택될 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 약제학적 조성물은 주사제, 연고제, 겔제, 로션제, 캡슐제, 정제, 액제, 현탁제, 분무제, 흡입제, 점안제, 점착제, 또는 첩부제 일 수 있으며, 구체적으로 주사제 일 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 개시의 일 측면에 있어서, 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 약 0.001 내지 100 mg/kg 범위 내일 수 있다. 상기 약제학적 조성물에는 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체가 약 0.001 내지 30 mg/mL 범위로 포함된다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 용어 "약"은 구체적 수치에 포함되는 제조 공정상의 오차나 본 개시의 기술적 사상의 범주에 들어가는 약간의 수치 조정을 포함하는 의도로 사용되었다. 예를 들어, 용어 “약”은 그것이 지칭하는 값의 ±10％, 일 측면에서 ±5％, 또 다른 측면에서 ±2％의 범위를 의미한다. 이 개시 내용의 분야에 있어서, 값이 구체적으로 보다 좁은 범위를 요구하는 것으로 언급되지 않는다면 이 수준의 근사치가 적절하다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 약제학적 조성물은 본 개시가 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제(extract), 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 약제학적 조성물은 성 호르몬-의존성 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있고, 성 성숙을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 상기 성 호르몬-의존성 질환은 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁내막증, 자궁 유섬유종, 다낭포성 난소증, 진성 성 조숙증, 다모증, 성선자극 뇌하수체 선종, 수면 무호흡증, 과민성 대장증후군, 월경 전 증후군, 양성 전립선비대증 및 불임으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 약제학적 조성물은 추가적으로 기존에 사용하던 생분해성 중합체와 혼합하여 사용할 경우, 현저히 우수한 생체 반감기를 가질 수 있다. 이에 본 개시의 일 측면에 따른 약제학적 조성물은 생분해성 중합체를 추가로 포함할 수 있다
본 개시의 일 측면에 있어서, 생분해성 중합체는 약물이 신체를 통하여 장관외로 투여될 수 있도록 하거나, 본 개시의 GnRH 유도체 또는 그의 염을 함유한 중합체가 특정 부위에 국소적으로 작용할 수 있도록 투여될 수 있도록 한다. 본 개시에서 생분해성 중합체는 Chasin M 등 ("Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems", New York, Marcel Dekker, 1990) 또는 D. Wescman 등 ("Handbook of Biodegradable Polymers", Taylor ＆ Francis, 1998)를 참고할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 본 개시의 일 측면에 있어서, 생분해성 중합체는 PLA(poly-lactic acid), 선형 또는 분지형 PLGA(poly(lactic-co-glycolic acid)), PGA(poly-glycolic acid), 하이드로겔 등일 수 있다.
본 개시는 일 측면에 있어서, 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염, 또는 이들을 포함하는 약제학적 조성물을 인간을 포함한 포유류에게 투여함으로써, 성 성숙을 억제하는 방법 및 용도 또는 성 호르몬 관련 증상 및 질환을 예방하거나 치료하는 방법 및 용도를 추가로 제공한다.
본 개시는 일 측면에 있어서, 성 성숙을 억제하거나, 또는 성 호르몬 관련 증상 및 질환을 예방하거나 치료하기 위한, 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염의 용도에 관한 것일 수 있다.
본 개시는 일 측면에 있어서, 성 성숙을 억제하거나, 또는 성 호르몬 관련 증상 및 질환을 예방하거나 치료하는데 사용하기 위한, 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염, 또는 이들을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것일 수 있다.
본 개시는 일 측면에 있어서, 성 성숙을 억제하거나, 또는 성 호르몬 관련 증상 및 질환을 예방하거나 치료하기 위한 약제학적 조성물(또는 의약(medicament))의 제조에 있어서, 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염의 용도에 관한 것일 수 있다.
본 개시의 일 측면에 따른 신규한 지속형 지방산 결합 생식샘자극 호르몬 방출 호르몬(gonadotrophin-releasing hormone; GnRH) 유도체는 이의 우수한 생체 이용률 및 증가한 혈중 반감기를 통해, 성 호르몬-의존성 질환 치료에 있어 의약의 투약 빈도수나 투약량 감소 등에 크게 기여할 것으로 기대된다. 특히, 기존의 주사 부위의 잔존감과 통증의 부작용을 가지고 있던 GnRH 서방형 제제들의 단점을 극복할 수 있을 것이다.
또한 본 개시의 일 측면에 따른 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물은, 기존 의약품에 비하여 현저하게 우수한 성 호르몬-의존성 질환 치료효과를 나타낸다. 그러므로, 이를 통해 의약의 투약 빈도수나 투약량 감소 등에 크게 기여할 것으로 기대된다.
도 1은 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체(실시예 1, 2, 7 및 8)와 사이클로덱스트린을 포함하는 약제학적 조성물(실시예 9, 10, 15 및 16)의 현탁액 형성 정도를 육안으로 확인한 사진이다.
도 2는 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체(실시예 3 내지 6)와 사이클로덱스트린을 포함하는 약제학적 조성물(실시예 11 내지 14)의 현탁액 형성 정도를 육안으로 확인한 사진이다.
도 3은 본 개시의 일 측면에 따른 실시예 및 비교예를 전립선암 세포주인 DU-145 세포주에 처리한 경우, 1% 메틸-β-사이클로덱스트린 음성 대조군 대비 세포 생존율 (%)을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 개시의 일 측면에 따른 실시예 및 비교예를 전립선암 세포주인 PC3 세포주에 처리한 경우, 1% 메틸-β-사이클로덱스트린 음성 대조군 대비 세포 생존율 (%)을 측정한 그래프이다.
도 5는 본 개시의 일 측면에 따른 실시예 및 비교예를 전립선암 세포주인 LNCaP 세포주에 처리한 경우, 1% 메틸-β-사이클로덱스트린 음성 대조군 대비 세포 생존율 (%)을 측정한 그래프이다.
도 6은 비처리 대조군과 β-사이클로덱스트린을 투여한 대조군에서 난소를 염색한 후 스캔하여 나타낸 이미지이다.
도 7은 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체(실시예 1 및 2)를 포함하는 약제학적 조성물(실시예 9 및 10)을 투여한 군에서 난소를 염색한 후 스캔하여 나타낸 이미지이다.
도 8은 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체(실시예 5 및 6)를 포함하는 약제학적 조성물(실시예 13 및 14)을 투여한 군에서 난소를 염색한 후 스캔하여 나타낸 이미지이다.
도 9는 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체(실시예 7 및 8)를 포함하는 약제학적 조성물(실시예 15 및 16)을 투여한 군에서 난소를 염색한 후 스캔하여 나타낸 이미지이다.
도 10는 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체의 생체 반감기 증가 효과를 확인하기 위하여, 대조군 약물(비교예 1 및 4)과 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체(실시예 4 및 6)를 12.5 mg/kg의 양으로 단회 피하 투여하여 시간에 따른 혈중 농도를 측정한 동물(래트) 실험 결과이다.
도 11는 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체의 생체 반감기 증가 효과를 확인하기 위하여, 대조군 약물인 류프로라이드 아세트산염 1일 제제(비교예 1)와 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체(실시예 4 및 6)를 12.5 mg/kg의 양으로 단회 피하 투여하여 시간에 따른 혈중 농도를 측정한 동물(래트) 실험 결과이다.
도 12은 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체의 생체 반감기 증가 효과를 확인하기 위하여, 대조군 약물인 류프로라이드 아세트산염 데포 1개월 제형(비교예 4)과 본 개시의 일 측면에 따른 GnRH 유도체(실시예 4 및 6)를 12.5 mg/kg의 양으로 단회 피하 투여하여 시간에 따른 혈중 농도를 측정한 동물(래트) 실험 결과이다.
이하, 본 개시의 제조예 및 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 개시의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 생식샘자극 호르몬 방출 호르몬( gonadotrophin -releasing hormone; GnRH) 유도체의 제조
천연형 포유동물 GnRH 서열은 하기와 같다.
[포유동물 GnRH 서열]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly (서열번호 1)
위 포유동물 GnRH 서열에서 6번째 Gly를 D-Leu로 치환하였고, 10번째 Gly를 des-Gly(데스-글리신)으로 치환하고 에틸아마이드기로 전환시킨 Leuprolide®를 본 개시의 일측면에 따른 유도체 및 지방산 결합 유도체의 백본(back bone)으로 사용하였다.
[류프로라이드 서열]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt(서열번호 2)
위 류프로라이드 서열에서 1번째 아미노산인 글루탐산을 유지한 유도체와 이를 글루타민으로 치환한 유도체를 아래와 같은 제조방법을 통해 만들었다.
참고로 트렙토렐린의 서열은 아래와 같다.
[트렙토렐린 서열]
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2(서열번호 3)
(1) GnRH 유도체 펩타이드 제조 방법
유도체 펩타이드 합성은 일반적인 Fmoc/tBu 고체상 펩타이드 합성 (SPPS) 법에 의해 합성되며 아미노산의 α-아미노기가 염기에 민감한 Fmoc (Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride) 기로 보호되어 있고 아미노산의 측쇄(side 기)는 산에 민감한 그룹으로 보호된다. 고체상 펩타이드 합성(Solid Phase Peptide Synthesis)은 다음 단계를 포함하여 Fmoc 절단 및 아미노산 결합의 반복을 통해 펩타이드 사슬을 순차적으로 붙여 나간다.
① 레진에 Fmoc 아미노산을 로딩 (Fmoc-Pro-trityl resin);
② Fmoc-AA-레진 (20% 피페리딘/DMF) 상의 Fmoc 보호기의 제거;
③ DMF 세척;
④ 활성화된 다음 아미노산의 결합 (DIC/ HOBt 사용);
⑤ DMF 세척;
⑥ ② 내지 ⑤ 단계를 반복하여 순차적으로 아미노산 결합;
⑦ 합성된 펩타이드에서 레진만 제거 (1.5 % TFA/DCM);
⑧ 레진만 제거된 펩타이드의 아미노 말단에 에탈아민(ethylamine)을 결합 (EDC·HCl/HOAt 사용); 및
⑨ 결합된 펩타이드에서 보호화된 side의 전체 절단 (92.5 % TFA / 2.5 % TIS / 2.5 % EDT / 2.5 % H2O).
위 제조방법으로 표 2에 기재된 서열을 가지는 물질을 제조하였다. 이렇게 제조한 GnRH 유도체의 아미노 말단에 라우르산 기, 팔미트산 기, 또는 아라키드산 기를 표 2에 기재된 대로 각각 결합하였다. 유도체의 아미노 말단에 지방산을 붙이는 것은 일반 아미노산을 결합하는 법과 동일하였다. 이러한 비교예 및 실시예의 GnRH 유도체는 애니젠㈜에 제조를 의뢰하여 수득하였다.
(2) GnRH 유도체 펩타이드 정제 (purification)
위 TFA 절단 후, 펩타이드를 시마즈(Shimadzu) HPLC 10AVP 시스템에서 C18 컬럼을 사용하여 HPLC 조건 (A 버퍼 0.05% TFA/H2O, B 버퍼 0.05 TFA/Acetonitrile, 유량율 1 mL/min, 파장 230 nm) 조건 하에 정제하였다. 정제에 따른 각 실시예의 결과는 표 1에 나타내었으며, 이는 애니젠㈜에 의뢰하여 수행한 것이다. 아래 GnRH 유도체 실시예 1(L1), 실시예 3(P1), 실시예 5(P3), 및 실시예 7(A1)은 1번째 아미노산이 글루탐산인 것이고, 실시예 2(L2), 실시예4(P2), 실시예 6(P4), 및 실시예 8(A2)은 1번째 아미노산이 글루타민인 것이다(표 2 참조).
GnRH 유도체 순도 (%) MS
계산값 (Da) 측정 (Da)
실시예 1(L1) 98.4 1409.7 1409.6
실시예 2(L2) 99.0 1408.7 1409.0
실시예 3(P1) 98.2 1465.8 1465.7
실시예 4(P2) 98.2 1464.8 1464.9
실시예 5(P3) 98.1 1465.8 1465.5
실시예 6(P4) 98.3 1464.8 1464.0
실시예 7(A1) 98.9 1521.7 1521.1
실시예 8(A2) 98.8 1520.7 1520.9
라우르산, 팔미트산 및 아라키드산은 물에서 난용성이며 녹는점이 각각 약 43.8℃, 약 60 ℃, 및 약 75.5℃이므로 실온에서 고체상을 띄고 있다. 따라서 지방산 결합 GnRH 유도체의 경우 수용액에 대한 용해도가 낮을 것으로 예측됨에 따라, 염화(Salting)을 추가로 진행하였다. 이에 따라, 나트륨 염과 아세트산 염의 두 종류의 염화를 수행하여 아래 비교예 1 내지 3과 실시예 1 내지 8 의 지방산 결합 GnRH 유도체 염을 제조하였다. 이러한 비교예 및 실시예는 애니젠㈜에 제조를 의뢰하여 수득하였다.
유도체 백본/유도체 서열 및 염
비교예 1(GnRH) pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt (서열번호 1)
비교예 2(Leuprolide) pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt acetate salt(서열번호 2)
비교예 3(Triptorelin) pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt(서열번호 3)
실시예 1 Lauric acid-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt acetate salt(서열번호 4)
실시예 2 Lauric acid-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt acetate salt(서열번호 5)
실시예 3 Palmitic acid-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt sodium salt(서열번호 6)
실시예 4 Palmitic acid-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt sodium salt(서열번호 7)
실시예 5 Palmitic acid-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt acetate salt(서열번호 8)
실시예 6 Palmitic acid-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt acetate salt(서열번호 9)
실시예 7 Arachidic acid-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt acetate salt(서열번호 10)
실시예 8 Arachidic acid-Gln-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt acetate salt(서열번호 11)
제조예 2: GnRH 유도체 및 사이클로덱스트린의 포접 복합체를 포함하는 약제학적 조성물의 제조
메틸-β-사이클로덱스트린 분말(시그마알드리치 사; 품목번호: C4555; 분자량: 1303.311 g/mol)을 표 3의 양으로 1 mL의 멸균 3차 증류수에 녹였다.
15 mL 코니칼 튜브(conical tube)에 표 3의 양으로 GnRH 유도체 분말을 넣고, 위에서 제조한 표 3의 몰비율에 해당하는 β-사이클로덱스트린 수용액 1 mL를 넣은 뒤, 저속 회전기(rotator)를 이용하여 실온에서 밤새 혼합하였다. 그런 뒤, 용액이 들어있는 15 mL 튜브를 간단히 스핀 다운(spin down)하여 용액을 모은 후, 1.5 mL 튜브로 옮겨 2차적으로 저속 회전기(rotator)를 이용하여 실온에서 밤새 혼합하였다. 최종적으로 각 유효성분이 약 10 mM 농도인 약제학적 조성물을 수득하였다. 이를 이용 또는 희석하여 하기 실험예에서 사용하였다. 비교예 1 내지 3의 경우에는 멸균 3차 증류수에 20 mM의 농도로 제조하여 사용하였다.
약제학적 조성물(mg/1 mL)
실시예 9 실시예 10 실시예 11 실시예 12 실시예 13 실시예 14 실시예 15 실시예 16
GnRH 유도체 비교예1 비교예 2 비교예 3 실시예1 실시예2 실시예3 실시예4 실시예5 실시예6 실시예7 실시예8
24 mg 24 mg 24 mg 14 mg 14 mg 15 mg 15 mg 15 mg 15 mg 15 mg 15 mg
메틸-β-사이클로덱스트린 - - - 13 mg 13 mg 13 mg 65 mg 13 mg 65 mg 13 mg 13 mg
몰비율(사이클로덱스트린:GnRH 유도체) - - - 1:1 1:1 1:1 5:1 1:1 5:1 1:1 1:1
이렇게 제조한 약제학적 조성물을 이용하여 아래 실험예들을 진행하였다.
[ 실험예 1] 지방산 결합 GnRH 유도체 및 사이클로덱스트린 포접 복합체의 현탁액 평가
대조군으로서, 제조예 2와 동일한 방법으로 메틸-β-사이클로덱스트린 분말 13 mg을 1 mL의 멸균 3차 증류수에 녹여 1.5 mL 튜브에 준비하였다(10 mM 농도).
준비한 대조군과, 1.5 mL 튜브에서 최종적으로 혼합하여 제조한 실시예 9 내지 16을 육안으로 관찰하였으며, 이를 10,000 rpm에서 40초 내지 50초 내외(1분 이하) 동안 스핀 다운한 후, 마찬가지로 육안으로 관찰하여 용해도 정도를 평가하였다. 실시예 9, 10, 15 및 16의 결과를 도 1에 나타내고, 실시예 11 내지 14의 결과를 도 2에 나타내었다. 도 1에 따르면 라우르산과 결합시킨 GnRH 유도체(실시예 1 및 2)를 포함하는 실시예 9 및 10와 아라키드산과 결합시킨 GnRH 유도체(실시예 7 및 8)를 포함하는 실시예 15 및 16은, 스핀다 다운 전 관찰 시 유효성분(GnRH 유도체 및 사이클로덱스트린의 포접 복합체)이 용매인 멸균 증류수에 잘 분산되어 현탁액(suspension)으로 존재하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 스핀 다운 이후에도 마찬가지였다.
도 2에 따르면 팔미트산과 결합시킨 GnRH 유도체(실시예 3 내지 6)를 포함하는 실시예 11 내지 14도, 스핀 다운 전 관찰 시 유효성분(GnRH 유도체 및 사이클로덱스트린의 포접 복합체)이 용매인 멸균 증류수에 잘 분산되어 현탁액(suspension)으로 존재하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 스핀 다운 이후에도 마찬가지였다.
위 결과에 따르면 본 개시의 일측면에 따른 GnRH 유도체와 사이클로덱스트린을 포함하는 약제학적 조성물은 우수하게 분산된 현탁액으로 존재함을 확인할 수 있으며, 이러한 특성으로 인해 지속형 또는 서방성 제제의 효과와 목적을 달성할 수 있다.
[실험예 2] 전립선암 세포주의 생존율 평가
GnRH 유도체는 유방암, 전립선암, 자궁내막증, 진성 성조숙증 등의 질환 치료 목적으로 임상에 적용된다. 따라서, 3 종류의 전립선암 세포주(DU-145, PC3, 및 LNCaP 세포주)를 T75 플라스크 내에서 적정량의 RPIM 1640 배양액 (10 % FBS, 페니실린/스트렙토마이신, 1% 비필수아미노산(non-essential amino acids) 포함)으로 배양했으며, 37 ℃, 5% CO2, 및 95% 공기 조건의 무균 세포 배양기를 이용했다. 세포주의 생존율 시험은 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, DOJINDO사 제품)를 이용하여 진행했다. 각 세포주를 T75 플라스크에서 트립신 처리하여 분리한 후, DU-145는 1 x 104 세포수/mL 밀도, PC3와 LNCaP은 1 x 105 세포수/mL의 밀도로 96 웰 플레이트(well plate)에 옮겨 1시간 정도 부착화(attachment) 시간을 가졌다.
이후 100 μM 및 200 μM 농도로 비교예 1 내지 3과 실시예 9 내지 16 및 대조군을 각 세포주에 처리했다. 구체적으로 세포 생존율 대한 음성 대조군으로 1% 메틸 β-사이클로덱스트린를 사용하였으며 양성 대조군으로 0.1% 소듐 도데실 설페이트(Sodium dodecyl sulfate; SDS)를 사용하였다. 48 시간 배양 후, 기존 배양액을 없애고, 100 μL의 새로운 배양액과 10 μL의 CCK-8 용액을 각 세포주에 처리하였다. 처리 4시간 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율 정도를 확인하였다. 측정한 결과는 아래 표 4 내지 표 6, 도 3 내지 도 5에 나타내었다.
유도체 처리 농도 (μM) DU-145 세포주에서 1% 메틸-β-사이클로덱스트린 음성 대조군 대비 생존율 (%) 통계적 유의성
실시예 9 100 50.00 ± 0.63 < 0.01
200 30.80 ± 0.66 < 0.01
실시예 10 100 36.40 ± 6.64 < 0.01
200 25.40 ± 3.96 < 0.01
실시예 11 100 47.25 ± 2.50 < 0.02
200 35.25 ± 0.25 < 0.01
실시예 12 100 36.75 ± 1.11 < 0.01
200 33.50 ± 0.50 < 0.01
실시예 13 100 81.50 ± 1.44 < 0.01
200 41.75 ± 1.18 < 0.01
실시예 14 100 38.50 ± 0.29 < 0.01
200 32.00 ± 0.71 < 0.01
실시예 15 100 68.25 ± 0.95 < 0.01
200 51.25 ± 2.95 < 0.01
실시예 16 100 50.25 ± 3.35 < 0.01
200 39.00 ± 2.27 < 0.01
비교예 1 100 107.50 ± 2.56 현저하지 않음(not significant; N.S)
200 101.08 ± 3.26 N.S
비교예 2 100 99.42 ± 2.06 N.S
200 100.17 ± 3.07 N.S
비교예 3 100 100.92 ± 2.98 N.S
200 94.27 ± 3.47 N.S
양성대조군(0.1% SDS) 18.18 ± 2.32 < 0.01
유도체 처리 농도 (μM) PC3 세포주에서 1% 메틸-β-사이클로덱스트린 음성 대조군 대비 생존율 (%) 통계적 유의성
실시예 9 100 41.00 ± 4.36 < 0.02
200 39.00 ± 4.73 < 0.02
실시예 10 100 41.00 ± 1.53 < 0.02
200 23.00 ± 5.51 < 0.02
실시예 11 100 65.60 ± 1.69 < 0.01
200 29.80 ± 2.54 < 0.01
실시예 12 100 29.20 ± 3.04 < 0.01
200 19.20 ± 1.93 < 0.01
실시예 13 100 99.60 ± 5.84 N.S
200 104.60 ± 3.52 N.S
실시예 14 100 90.80 ± 4.04 N.S
200 54.80 ± 3.93 < 0.01
실시예 15 100 72.50 ± 5.33 < 0.02
200 63.75 ± 5.56 < 0.02
실시예 16 100 45.75 ± 5.41 < 0.02
200 41.33 ± 3.38 < 0.02
비교예 1 100 105.44 ± 1.76 N.S
200 100.11 ± 1.82 N.S
비교예 2 100 104.22 ± 3.15 N.S
200 104.11 ± 2.66 N.S
비교예 3 100 99.67 ± 3.17 N.S
200 95.44 ± 4.03 N.S
양성대조군(0.1% SDS) 15.11 ± 1.72 < 0.01
유도체 처리 농도 (μM) LNCaP 세포주에서 1% 메틸-β-사이클로덱스트린 음성 대조군 대비 생존율 (%) 통계적 유의성
실시예 9 100 91.33 ± 10.73 N.S
200 45.33 ± 5.61 < 0.02
실시예 10 100 28.33 ± 3.18 < 0.02
200 22.33 ± 2.33 < 0.02
실시예 11 100 37.00 ± 0.58 < 0.02
200 30.67 ± 0.67 < 0.02
실시예 12 100 29.67 ± 1.20 < 0.02
200 30.33 ± 0.88 < 0.02
실시예 13 100 72.33 ± 5.84 < 0.02
200 66.33 ± 5.24 < 0.02
실시예 14 100 33.00 ± 1.53 < 0.02
200 30.33 ± 0.67 < 0.02
실시예 15 100 64.25 ± 3.52 < 0.02
200 36.50 ± 1.94 < 0.02
실시예 16 100 18.25 ± 0.63 < 0.02
200 18.50 ± 0.50 < 0.02
비교예 1 100 105.64 ± 4.03 N.S
200 93.64 ± 4.20 N.S
비교예 2 100 99.22 ± 6.11 N.S
200 84.78 ± 6.16 N.S
비교예 3 100 92.89 ± 4.33 N.S
200 90.22 ± 4.03 N.S
양성대조군(0.1% SDS) 20.45 ± 1.58 < 0.01
표 4 내지 표 6 및 도 3 내지 도 5에 따르면 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체(실시예 1 내지 8)를 포함하는 약제학적 조성물(실시예 9 내지 16)은 천연형 GnRH(비교예 1)와 기존에 시판되는 GnRH 유도체(비교예 2 및 3)에 비하여 예상치 못한 매우 우수한 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
구체적으로 DU-145 세포주에서는, 음성 대조군과 대비하여 비교예 1 내지 3은 전립선암 세포주의 생존율이 거의 동일하였다. 비교예 3에서만 약 94%의 세포 생존율을 나타내었다. 반면 본 개시의 일 측면에 따른 실시예들은 음성 대조군과 대비하여 최소 약 80% 내지 최대 약 25%의 세포 생존율을 나타내었으며, 전립선암 세포주의 생존율을 현저히 감소시키는 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 모두 통계적으로 유의미한 것이었다.
PC3 세포주에서, 비교예 1 내지 3은 전립선암 세포 생존율 감소 효과가 미미하였다. 비교예 3의 트립토렐린만이 약 95%의 세포 생존율을 나타내었을 뿐이다. 반면 본 개시의 일 측면에 따른 실시예들은 비교예들과 비교하여 매우 우수한 세포 생존율 감소 효과를 나타내었으며, 특히 실시예 12의 경우에는 양성 대조군과 유사한 수준으로 생존율 감소 효과를 나타내었다.
LNCaP 세포주에서, 처리 농도가 200 μM인 경우 비교예 1은 약 93%, 비교예 2는 약 85%, 비교예 3은 약 90%의 세포 생존율을 나타내었다. 반면 본 개시의 일 측면에 따른 실시예들은 비교예들과 비교하여 매우 우수한 세포 사멸 효과를 나타내었으며, 특히 실시예 10은 양성 대조군과 유사한 수준이고 실시예 16은 양성 대조군보다 우수하게 사멸 효과를 나타내었다.
세 종류의 전립선암 세포주에 대한 실험 결과에 따르면, 1번째 아미노산이 글루탐산에서 글루타민으로 치환된 실시예 2, 4, 6 및 8를 포함하는 실시예 10, 12, 14, 및 16은 1번째 아미노산이 치환되지 않은 실시예 1, 3, 5, 및 7를 포함하는 실시예 9, 11, 13, 및 15에 비하여 같은 농도에서 더 우수한 세포 사멸 효과를 나타내었다. 이를 통해 1번째 아미노산의 치환, 지방산과의 결합, 및 염화에 의하여 본 개시의 일 측면에 따른 GnRH 유도체들이 전립선암 사멸에 대한 예상치 못한 우수한 효과를 나타낸다는 점을 확인할 수 있다.
[실험예 3] 난소 형태학적 변화 여부 평가
지방산 결합 GnRH 유도체의 기능적 특성 유지 및 난소의 형태학적 변화를 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
암컷 9주령 래트의 목 뒤의 피하에 실시예 9, 10, 13, 14, 15 및 16의 약제학적 조성물을 12.5 mg/kg의 농도로 단회 투여하였다. 비처리 대조군으로 아무런 약물도 투여하지 않은 군과, 음성 대조군으로 메틸-β-사이클로덱스트린 3 mg을 수용액으로 투여하였다. 각 투여군의 개체수는 3마리이다.
투여 후 28일 시점에 래트를 부검하여 난소를 채취하고, 이를 헤마톡실린-에오신 염색하였다(H＆E 염색). 염색한 난소를 관찰하여 난소의 조직학적 변화 및 병리학적 이상 유무를 확인하였다.
구체적으로 아래와 같이 H＆E 염색을 수행하고 난소를 관찰하였다.
1. 래트의 부검 직후, 선택한 조직(난소)을 12시간 이상 고정액에 넣어 고정(fixation)하였다.
2. 충분히 고정된 조직을 물로 세척하여 고정시약을 제거하였다.
3. 파라핀을 조직으로 침투시켜 포매(embedding)하기 위하여 난소 조직을 농도차가 있는 알코올(graded alcohol)을 이용하여 탈수하였다. 탈수(dehydration)는 저농도의 알코올 용액에서 고농도의 알코올 용액으로 점진적으로 처리한 후, 순수한 100% 알코올과 벤젠으로 처리하는 과정에서 이루어졌다.
4. 유기용매인 벤젠에 용해시킨 파라핀을 탈수된 난소 조직으로 침투시킨 다음, 고온(60℃)에서 액체 상태인 순수한 파라핀으로 처리하여 완전히 침투시켰다.
5. 파라핀 조직을 적당한 크기로 자른 후, 박절기에서 4 μm 로 절단하였다.
6. 유리 슬라이드에 박절된 조직을 올려놓고, 조직의 파라핀을 자일렌과 같은 유기용매로 제거하였다.
7. 조직이 붙은 슬라이드를 고농도의 알코올에서 저농도의 알코올 수용액으로 처리하여 함수(hydration)시켰다.
8. 헤마톡실린(hematoxylin) 수용액으로, 세포의 핵과 기타 산성 구조(RNA가 풍부한 구조 등)를 청색으로 먼저 염색하였다.
9. 에오신(eosin)으로 세포와 세포밖 바탕질의 많은 물질을 붉은색으로 이차 염색을 하였다.
10. 염색이 끝난 표본은 다시 농도차가 있는 알코올을 이용하여 탈수한 후 수지(발삼(balsam) 또는 합성수지)와 같은 접착제를 사용하여 커버글라스(cover glass)를 씌웠다. 이 과정을 봉입(mounting)이라고 한다.
11. 위 과장이 끝나면 표본 슬라이드를 ScanScope® AT 슬라이드 스캐너(Aperio 사)로 스캔하여 이미지로 저장한 후, ImageScope(Aperio 사) 프로그램으로 분석하였다. 스캔한 이미지를 도 6 내지 도 9에 나타내었다.
결과
래트에서 발정 주기는 발정 휴지기(diestrus), 발정 전기(proestrus), 발정기(estrus), 및 발정 후기(metestrus)의 순서로 반복되며, 각 시기에 따라 난소는 형태학적으로 변화하게되고 발정 주기는 대략 4일 내지 5일 정도이다.
래트에 GnRH 작용제 투여시, 난소에서 2차 난포(secondary follicles) 및 성숙 난포(graffian follicles)의 형성이 감소한다는 점은 알려져 있었다(참조: Mohammadbeigi et al., Short-term Administration of Gonadotropin-releasing Hormone Agonist (Buserelin) Induces Apoptosis in Rat Ovarian Developmental Follicles, July 2016). 이에 본 실험에서는 각 처리군의 난소 이미지에서 2차 난포와 성숙 난포를 화살표로 표시하여, 그 수가 감소하는지 여부를 확인하였다.
도 6에 따르면 비처리 대조군과 메틸-β-사이클로덱스트린 투여군에서는 화살표에 표시된 것처럼 2차 난포 또는 성숙 난포가 다수 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 도 7 내지 9에 따르면 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체(실시예 1, 2, 5, 6, 7 및 8)를 투여한 래트군에서는 2차 난포 또는 성숙 난포의 수가 감소한 것을 확인할 수 있다. 이러한 실시예 유도체 투여군에서는 황체(corpus luteum) 상태가 많이 관찰되며, 원시난포(primordial follicles) 또는 다층 1차 여포(Multilaminar primary follicles) 또한 많이 형성되어 있지 않은 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과를 통해 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체가 래트에서 유효한 효과를 나타낸다는 점을 확인할 수 있으며, 구체적으로 성 성숙을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있다.
더불어 단회 투여 후 28일이 경과한 시점에서 관찰하였음에도 2차 난포 또는 성숙 난포의 수가 감소한 것으로부터 미루어 보아, 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 이러한 유도체와 사이클로덱스트린의 포접 복합체가 서방성을 나타내어 지속형 제제로서 사용 가능하다는 점도 확인할 수 있었다.
[실험예 4] 생체 반감기 증가율 측정
본 발명자는 위 제조한 지방산 결합 GnRH 유도체의 생체 반감기 증가 효과를 확인하기 위하여, 동물 실험(9주령 암컷 SD 래트)을 진행하였다. 구체적으로 류프로라이드 아세트산염 1일 제제(n=6), 류프로라이드 아세트산염 데포(Leuprolide acetate depot) 1개월 제형(3.75 mg/month; n=7), 및 실시예 4 유도체(n=6) 또는 실시예 6 유도체(n=6)를 각 군별 래트에 12.5 mg/kg 양으로 단회 피하 투여하여 시간에 따른 혈중 농도를 측정하였다. 필요한 경우 용매는 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 사용하였다. 래트에 투여 전, 투여한 후 0.5시간, 1시간, 2시간, 6시간, 1일, 3일, 7일, 10일, 14일, 21일, 및 28일차에 래트의 꼬리 정맥으로부터 채혈하여, LC/MSMS를 이용해 혈중 류프로라이드 및 실시예 유도체의 농도를 측정하였다. 특정 시점에 농도가 약 4 ng/mL에 이르면 그 다음 시점에 측정을 진행하지 않았다.
위 실험 결과를 정리하면 하기와 같다. 하기 표에서 수치 단위는 ng/mL 이다.
시간 비교예 1(류프로라이드 아세트산염 1일 제제) 비교예 4 (류프로라이드 아세트산염 1개월 제형(3.75 mg)) 실시예 4(P2; Pal_[Q1]GnRH) 실시예 6(P4; Pal_[Q1]GnRH_AcOH)
평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차 평균 표준편차
0 - - - - - - - -
0.5시간 1020 177 133 54.1 11.8 4.362 6.51 2.30
1시간 769 572 164 89.1 16.9 3.16 9.22 2.57
2시간 228 267 93.0 51.5 29.1 4.97 18.6 2.83
6시간 2.88 4.09 19.6 7.04 52.2 14.1 45.7 12.0
1일 - - 19.0 7.49 45.0 6.07 23.2 6.75
3일 - - 7.47 3.45 21.4 2.73 9.60 1.58
7일 - - 5.24 1.72 11.9 2.86 7.20 1.79
10일 - - 10.8 2.89 8.18 2.83 8.20 3.80
14일 - - 15.1 5.01 4.35 1.67 4.58 1.88
21일 - - 4.73 4.15 - - 1.26 0.72
28일 - - 1.47 1.77 - - - -
상기 측정 결과는 도 10 내지 도 12으로 그래프로 나타내었다. 위 측정 결과를 바탕으로 반감기(t1/2), 클리어런스율(CL), 분포 용적(Vd), 최대 농도 도달 시간(Tmax), 투여 후 최대 농도(Cmax), 및 약물에 대한 전신 노출 정도(AUCt)를 계산하여 약물동력학적 분석한 결과는 아래와 같다.
비교예 1 비교예 4 실시예 4 실시예 6
t1/2 [일] 0.03 4.17 4.80 4.03
CL[(mg/kg)/(ng/mL)/일] 0.180 0.049 0.051 0.075
Vd[(mg/kg)/(ng/mL)] 0.007 0.296 0.351 0.436
Tmax [일] 0.02 0.04 0.25 0.25
Cmax [ng/mL] 1020.0 164.0 52.2 45.7
AUCt [ng/mL*d] 69.21 245.22 216.24 159.51
위 결과를 통해 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체가 류프로라이드(비교예 1)보다 현저히 우월한 생체 반감기, 클리어런스율, 분포 용적, 전신 노출 정도(AUCt)를 가지는 것을 확인하였다. 나아가, 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체가, 물리적으로 혼합된 생분해성 중합체를 포함하는 기존 류프로라이드 1개월 제형(비교예 4)와 비교하여 유사한 수준의 반감기, 클리어런스율, 및 전신 노출 정도(AUCt)를 가지며, 특히 우수한 분포 용적과 최대 농도 도달 시간이 늦어지고, 최대 농도가 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통해 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체가 생체 내에서 적절한 농도로 오랜 기간 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
위 확인한 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체의 우수한 성질을 고려할 때, 본 개시의 지방산 결합 GnRH 유도체는 서방성을 위해 생분해성 중합체를 GnRH 유도체와 물리적으로 혼합하여 사용하던 기존 제품에 비해 볼륨이 현저히 줄어들어 통증 등의 단점을 극복할 수 있고, 이렇게 물리적으로 혼합된 생분해성 중합체가 생체 내에 오랜 기간 잔존하는 부작용 등을 배제할 수 있다. 이는 특히나 소아에 사용하는 경우에 유리한 특징이다. 또한 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체는 우수한 서방성을 나타냄에 따라, 실험예 2 및 3에서 확인한 것처럼 우수한 전립선암 사멸 효과를 나타내고, 난소에서 2차 난포 또는 성숙 난포의 수를 감소시켜 성 성숙을 억제하는 효과를 나타낼 수 있다.
한편, 본 개시의 일 측면에 따른 지방산 결합 GnRH 유도체를 기존 제품에 사용하던 생분해성 중합체와 혼합하여 사용하게 되면 기존의 류프로라이드와 같은 약물을 사용했을 때 보다 반감기가 현저히 증가하여, 임플란트(implant)와 같은 침습적(수술적) 방법으로 사용하는 약 만큼이나 반감기가 증가하는 효과를 보일 수 있다(수개월에서 1년).
이상의 설명으로부터, 본 개시의 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시가 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 개시의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 개시의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (32)

  1. 지방산과 결합된 생식샘 호르몬 방출 호르몬(gonadotropin-releasing hormone; GnRH) 유도체이며,
    상기 지방산은 팔미트산이 아닌,
    지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지방산은 C6 내지 C30 지방산인,
    지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염.
  3. 제2항에 있어서, 상기 지방산은 카프로산, 에난트산, 카프릴산, 펠라곤산, 카프르산, 운데실산, 라우르산, 미리스트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 리그노세르산, 세로트산, 미리스트올레산, 팔미톨레산, 리놀렌산, 알파-리놀렌산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산, 리놀레산, 감마-리놀레산, 디호모 감마-리놀레산, 아라키돈산, 올레산, 바크센산, 엘라이드산, 에이코센산, 및 에루스산, 네르본산의 군으로부터 선택된 것인,
    지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염.
  4. 제3항에 있어서, 상기 지방산은 직쇄형이며, 라우르산 또는 아라키드산인,
    지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염.
  5. 제1항에 있어서, 상기 지방산은 GnRH 유도체의 아미노 말단에 결합된 것인,
    지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염.
  6. 제1항에 있어서, 상기 GnRH 유도체는 GnRH 작용제(agonist)인,
    지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염.
  7. 제6항에 있어서, 상기 GnRH 작용제는 류프로라이드(Leuprolide), 고세레린(Goserelin), 트립토레린(Triptorelin), 나파레린(Nafarelin), 부세레린(Buserelin), 히스트레린(Histrelin), 데스로레린(Deslorelin), 메테레린(Meterelin), 및 고나드레린(Gonadrelin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인,
    지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염.
  8. 제1항에 있어서, 상기 GnRH 유도체는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 10, 및 서열번호 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염.
  9. 제1항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 염은 무기 산, 유기 산, 암모늄염, 알칼리 금속염, 및 알칼리 토금속염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인,
    지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염.
  10. 제9항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 염은 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 메타인산염, 질산염, 황산염, 아세트산염, 젠젤설폰산염, 벤조산염, 시트르산염, 에탄설폰산염, 푸마르산염, 락트산염, 말레산염, 말산염, 석신산염, 타르타르산염, 나트륨염, 칼슘염, 칼륨염, 및 마그네슘염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인,
    지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염.
  11. 제1항에 있어서, 상기 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체가 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 10, 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는,
    지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염.
  12. 제11항에 있어서, 상기 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는,
    지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염.
  13. 제11항에 있어서, 상기 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체가 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는,
    지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 그의 염을 유효성분으로서 포함하는,
    성 호르몬-의존성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 성 호르몬-의존성 질환은 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁내막증, 자궁 유섬유종, 다낭포성 난소증, 진성 성 조숙증, 다모증, 성선자극 뇌하수체 선종, 수면 무호흡증, 과민성 대장증후군, 월경 전 증후군, 양성 전립선비대증 및 불임으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인,
    약제학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 생분해성 중합체를 추가로 포함하는,
    약제학적 조성물.
  17. 유효성분으로서 지방산과 결합된 생식샘 호르몬 방출 호르몬(gonadotropin-releasing hormone; GnRH) 유도체인, 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체 또는 약제학적으로 허용 가능한 그의 염; 및
    사이클로덱스트린을 포함하는,
    성 호르몬-의존성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 지방산은 C6 내지 C30 지방산인,
    약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 지방산은 카프로산, 에난트산, 카프릴산, 펠라곤산, 카프르산, 운데실산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산, 리그노세르산, 세로트산, 미리스트올레산, 팔미톨레산, 리놀렌산, 알파-리놀렌산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산, 리놀레산, 감마-리놀레산, 디호모 감마-리놀레산, 아라키돈산, 올레산, 바크센산, 엘라이드산, 에이코센산, 및 에루스산, 네르본산의 군으로부터 선택된 것인,
    약제학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 지방산은 직쇄형이며, 라우르산, 팔미트산 또는 아라키드산인,
    약제학적 조성물.
  21. 제17항에 있어서, 상기 지방산은 GnRH 유도체의 아미노 말단에 결합된,
    약제학적 조성물.
  22. 제17항에 있어서, 상기 GnRH 유도체는 GnRH 작용제(agonist)인,
    약제학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 GnRH 작용제는 류프로라이드(Leuprolide), 고세레린(Goserelin), 트립토레린(Triptorelin), 나파레린(Nafarelin), 부세레린(Buserelin), 히스트레린(Histrelin), 데스로레린(Deslorelin), 메테레린(Meterelin), 및 고나드레린(Gonadrelin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인,
    약제학적 조성물.
  24. 제17항에 있어서, 상기 GnRH 유도체는 서열번호 2 및 서열번호 4 내지 11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    약제학적 조성물.
  25. 제17항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 염은 무기 산, 유기 산, 암모늄염, 알칼리 금속염, 및 알칼리 토금속염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인,
    약제학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 염은 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 메타인산염, 질산염, 황산염, 아세트산염, 젠젤설폰산염, 벤조산염, 시트르산염, 에탄설폰산염, 푸마르산염, 락트산염, 말레산염, 말산염, 석신산염, 타르타르산염, 나트륨염, 칼슘염, 칼륨염, 및 마그네슘염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인,
    약제학적 조성물.
  27. 제17항에 있어서, 상기 지속형 지방산 결합 GnRH 유도체가 서열번호 4 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는,
    약제학적 조성물.
  28. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성 호르몬-의존성 질환은 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁내막증, 자궁 유섬유종, 다낭포성 난소증, 진성 성 조숙증, 다모증, 성선자극 뇌하수체 선종, 수면 무호흡증, 과민성 대장증후군, 월경 전 증후군, 양성 전립선비대증 및 불임으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인,
    약제학적 조성물.
  29. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린은 메틸-β-사이클로덱스트린인, 약제학적 조성물.
  30. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지방산 결합 GnRH 유도체와 사이클로덱스트린이 포접 복합체로 존재하는 것인, 약제학적 조성물.
  31. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린과 지방산 결합 GnRH 유도체의 몰비율은 7:1 내지 1:1인, 약제학적 조성물.
  32. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 생분해성 중합체를 추가로 포함하는,
    약제학적 조성물.
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