JP2002531411A

JP2002531411A - Ｇｎｒｈ−ｉｉを含んで成る制御放出製剤

Info

Publication number: JP2002531411A
Application number: JP2000584909A
Authority: JP
Inventors: クイ，スティーブ; アキンサンヤ，カレン; ヘイワード，アマンダ
Original assignee: フェリングベスローテンフェンノートシャップ
Priority date: 1998-12-03
Filing date: 1999-12-02
Publication date: 2002-09-24
Also published as: PL348575A1; MXPA01005543A; IL143496A0; NO20012636D0; ZA200104530B; EP1140133A1; BR9915943A; NZ511984A; GB9826662D0; NO20012636L; CN1332635A; AU1573200A; GB2344287A; KR20010089538A; EE200100293A; AU770676B2; TR200102273T2; WO2000032218A1; SK7552001A3; CZ20011893A3

Abstract

(57)【要約】治療的ペプチド又はその塩の制御放出のための医薬製剤であって、このペプチドが配列ピロＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ¹ −Ｇｌｙ−Ｘａａ² −Ｘａａ³−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂（ここで、Ｘａａ¹ はＨｉｓ又はＴｙｒであり、Ｘａａ² はＴｒｐ又はＬｅｕであり、そしてＸａａ³ はＴｙｒ又はＡｒｇである。但し、Ｘａａ¹ がＴｙｒであり、そしてＸａａ² がＬｅｕの場合は、Ｘａａ³はＡｒｇではない）を有し、そして更に医薬として許容される生物分解性ポリマーを含んで成る医薬製剤。本製剤は骨及び前立腺の障害の処置に使用されうる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は延長した期間に及んで治療剤を放出する医薬製剤に関する。

【０００２】本発明の背景視床下部−下垂体−性腺の軸の生理学に対する研究は、ゴナドトロピン放出ホ
ルモン（ＧｎＲＨ、他に黄体形成ホルモン放出ホルモン、ＬＨＲＨとして知られ
ている）の、鍵となる制御ホルモンとしての認識をもたらした。ＧｎＲＨは視床
下部によって放出され、そして黄体形成ホルモン（ＬＨ）及びろ胞刺激ホルモン
（ＦＳＨ）の放出を刺激するために下垂体に働く。ごく最近、ＧｎＲＨに対して
相同性を有するペプチドが同定された（Ｗｈｉｔｅｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５３０５−３０９，１９９８）。こ
のペプチドはＧｎＲＨ−IIと称された。２つのペプチドの配列を次の様に比較す
る。ＧｎＲＨピロＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａ
ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ （配列番号５）ＧｎＲＨ−II ピロＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ （配列番号６）

【０００３】「ＧｎＲＨ−II」の名称は、多少誤解を招く。この新規ペプチドは別の遺伝子
生成物であり、そしてその組織分布においてＧｎＲＨと明らかに異なる。ＧｎＲ
Ｈ−IIは、ＬＨ及びＦＳＨの内因性の放出剤として働かない様である。ＧｎＲＨ
−IIについての生理学的な役割に対する明白な証拠が存在していなかったので、
治療剤としてこのペプチドを用いる実際的な観点に注意が払われてこなかった。

【０００４】本発明の要約我々は、ＧｎＲＨ−IIが多くの器官の機能において重要な役割を有することを
見出した。例えば、それは骨形成に影響を与え、そしてそれは前立腺の上皮細胞
の増殖を調節する。従って、我々はこの薬剤及びその類似体が、有用に臨床的な
状況において輸送されうる手段を熟考し、そしてこの目的を達成するのに適当な
製剤を提供することが本発明の目的である。本発明に従う製剤は、それが制御さ
れる速さで体循環に放出される貯蔵物内に前記ペプチドを維持するための、生物
分解性ポリマーの使用に依存する。これらの製剤は２つの鍵となる因子、生物学
的に活性なペプチド及び生物分解性ポリマーを含んで成る。前記の生物学的に活
性なペプチドは、配列ピロＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ¹ −Ｇｌｙ−Ｘａａ² −Ｘａａ³
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ （配列番号７）（ここで、Ｘａａ¹ はＨｉｓ又はＴｙｒであり、Ｘａａ² はＴｒｐ又はＬｅｕであり、そしてＸａａ³ はＴｙｒ又はＡｒｇである。但し、Ｘａａ¹ がＴｙｒであり、そしてＸａａ² がＬｅｕである場合には、Ｘ
ａａ³ はＡｒｇではない）に従うデカペプチドである。前記ポリマーはいずれか
の医薬として許容される生物分解性ポリマー、並びに好ましくはグリコール酸及
び乳酸のコポリマーである。本発明は更に、ヒトの病態の処置のための製剤の使
用を含んで成る。

【０００５】本発明の説明本明細書で使用する場合、アミノ酸に関する略語はそれらの常用の意味を持ち
、そして天然のＬ−異性体（アキラルなアミノ酸、グリシンを除く）を示す。

【０００６】第１の観点において、本明細書で開示した発明は制御される速さで及び延長さ
れる期間（すなわち、少なくとも１日、好ましくは数日、及び更に好ましくは少
なくとも１週の期間）、特に骨及び前立腺の疾患の処置のために治療的ペプチド
を放出する医薬製剤を含んで成る。前記の治療的ペプチドは、配列ピロＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ¹ −Ｇｌｙ−Ｘａａ² −Ｘａａ³
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ （７）（ここで、Ｘａａ¹ はＨｉｓ又はＴｙｒのいずれかであり、Ｘａａ² はＴｒｐ又
はＬｅｕのいずれかであり、そしてＸａａ³ はＴｙｒ又はＡｒｇのいずれかであ
り、但し、Ｘａａ¹ がＴｙｒであり、そしてＸａａ² がＬｅｕの場合、Ｘａａ³
はＡｒｇではない）に従うデカペプチドである。好ましくは、Ｘａａ¹ はＨｉｓ
であり、Ｘａａ² はＴｒｐであり、そしてＸａａ³ はＴｙｒである。前記ペプチ
ドが酸（例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸、塩酸、リン酸など）と塩
を形成しうることは認識されるだろう。前記の塩が医薬として許容される酸で形
成される限り、それらは本発明の範囲に含まれる。

【０００７】前記製剤の第２の必須な成分は生物分解性の、医薬として許容されるポリマー
である。前記ポリマーは当業界で知られている。それらはホモポリマー（すなわ
ち単一なモノマーのポリマー）又はコポリマー（すなわち、２又はそれ以上の異
なるモノマーから形成されるもの）のいずれかであってもよい。適当なモノマー
は、カルボン酸のアミノ及びヒドロキシ誘導体を含む。本発明の好ましい態様に
おいて、前記ポリマーはヒドロキシアシルモノマー単位、及び更に好ましくはα
−ヒドロキシアシル単位から成る。最も好ましくは、前記ポリマーはポリグリコ
ール酸、ポリ乳酸、又はグリコール酸及び乳酸のコポリマーである。前記ポリマ
ーは以下の化学構造

【化１】（ここで、Ｒはポリグリコール酸において水素であり、ポリ乳酸においてメチル
であり、そして前記コポリマーにおいて無作為に水素又はメチルである）を有す
る。

【０００８】本発明の製剤を製造する２つの相補的な方法を特徴づけることができる。前記
ペプチドは前記ポリマーのマトリックス内に組み込まれるか、又は更に好ましく
は前記ポリマーによってカプセルに封入されるか、そのいずれかでありうる。こ
の２つ目の場合において、封入されるペプチドは固体又は溶液中、そのいずれで
もよい。前記ペプチドにとって固体であることが好ましい。

【０００９】この製剤は骨の成長の障害（年齢関連性の骨粗鬆症、閉経期後のホルモン状態
に関連する骨粗鬆症、原発性及び二次性上皮小体亢進症、無為の骨粗鬆症、糖尿
病に関連する骨粗鬆症並びに糖質コルチコイド関連骨粗鬆症を含む）及び前立腺
の成長の障害（前立腺肥大症及び前立腺ガンを含む）を含む、ヒトの病態の処置
において有用である。

【００１０】第２の観点において、本明細書に開示した本発明は、骨若しくは前立腺の成長
の障害に苦しむ、又はその様な苦しみの危険があるとみなされる個体の処置のた
めの方法を含んで成る。この処置方法は、前記の個体への治療的に有効な量の製
剤の投与を含んで成り、これは活性な主役として、配列ピロＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ¹ −Ｇｌｙ−Ｘａａ² −Ｘａａ³
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ （７）に従うペプチド又は医薬として許容されるその塩（ここで、Ｘａａ¹，Ｘａａ²
及びＸａａ³ は上文で定義した通りである）、及び第２成分として、医薬として
許容される生物分解性ポリマーを含み、この製剤は前記ポリマーが侵食されると
きに前記ペプチドを体循環に放出する。前記の処置方法は、前記製剤の単回投与
を含んで成ってもよいが、一連の繰り返しの投与を含んで成ることが多い。投与
の頻度は１日当たり１回から１ヶ月当たり１回であってもよい。各投与量中の活
性ペプチドの量は、投与計画及び投与経路に依存するだろう。通常、それは１ミ
リグラム（１mg）〜１グラム（１ｇ）の間であるだろう。管理している医師は、
関連していると当業界で通常みなされるパラメーターに依存して正確な投与量を
決定するだろう。前記製剤は筋肉内又は皮下注射によって投与される。

【００１１】本発明の組成物の活性な因子を含んで成るペプチドは、当業界で通常知られて
いる方法によって、製造されうる。例えば、前記ペプチドは固相合成によって製
造されうる。これは、次の計画に従い、樹脂が結合した中間体への、アミノ酸残
基の経時的な添加を含む。

【００１２】１．樹脂が結合した最初の中間体の形成ＰＧ−Ａａａ−ＯＨ＋ＦＧ−Ｒｅｓ−ＰＧ−Ａａａ−Ｌ−ＲｅｓＡａａ＝アミノ酸ＰＧ＝保護基ＦＧ＝官能基Ｒｅｓ＝ポリマー樹脂Ｌ＝リンカー基（−Ｏ−又は−ＮＨ−）２．脱保護ＰＧ−Ａａａ−Ｌ−Ｒｅｓ−Ｈ−Ａａａ−Ｌ−Ｒｅｓ３．鎖の伸長ＰＧ−Ｂｂｂ−ＯＨ＋Ｈ−Ａａａ−Ｌ−Ｒｅｓ−ＰＧ−Ｂｂｂ−Ａａａ
−Ｌ−Ｒｅｓ４．必要に応じて段階２及び３を繰り返すＰＧ−Ｂｂｂ−Ａａａ−Ｌ−Ｒｅｓ−−−ＰＧ−Ｎｎｎ−．．．−Ｂｂ
ｂ−Ａａａ−Ｌ−Ｒｅｓ５．開裂／脱保護ＰＧ−Ｎｎｎ−．．．−Ｂｂｂ−Ａａａ−Ｌ−Ｒｅｓ−Ｈ−Ｎｎｎ−．
．．−Ｂｂｂ−Ａａａ−ＯＨ（又は−ＮＨ₂)

【００１３】段階１において、保護アミノ酸は官能基化した樹脂と反応する。保護基（ＰＧ
）は最も一般的にはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）又は９−フル
オレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）である。前記の樹脂上の官能基（
ＦＧ）は、一般的にクロロアルキル基、ヒドロキシル基又はアミン基である。Ｆ
Ｇがクロロアルキル又はヒドロキシル基である場合、リンカー基（Ｌ）は酸素原
子（−Ｏ−）である。ＦＧがアミン基である場合、Ｌは−ＮＨ−である。

【００１４】段階２において、前記保護基（ＰＧ）はα−アミノ基から除去される。ＰＧが
Ｂｏｃである場合、これは前記樹脂を酸、例えばトリフルオロ酢酸又は塩化水素
でジクロロメタン中で処理することによって達成されうる。ＰＧがＦｍｏｃであ
る場合、脱保護は、前記樹脂を塩基、例えばピペリジンで処理することによって
達成されうる。

【００１５】段階３において、ペプチド鎖は１つのアミノ酸残基によって伸長される。保護
アミノ酸は段階２で遊離したアミノ基に結合する。この変換を達成するための多
くの試薬は、当業界で知られている。１つの組み合わせは、ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド（ＤＣＣ）及びヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）である
。通常、塩基も必要であるだろう。適当な塩基はトリエチルアミン及びＮ，Ｎ−
ジイソプロピルエチルアミンを含む。溶媒は、通常ジクロロメタン、ジメチルホ
ルムアミド、又はこれらの混合物であるだろう。

【００１６】前記アミノ酸（Ａａａ−Ｎｎｎ）の側鎖が反応基（例えばアミノ基、カルボン
酸基、ヒドロキシル基）を含むならば、これらは保護が必要だろう。側鎖のため
に選択した保護基は、通常α−アミノ基から保護基（ＰＧ）を除去するのに必要
な条件下で適当なものである。ＰＧがＦｍｏｃであるならば、側鎖を保護する基
は、ｔｅｒｔ−ブチルの化学に簡便的に基づくことがある。一方、ＰＧがＢｏｃ
であるならば、側鎖を保護する基はフルオロメチルの化学に基づくことがある。
当業界で知られている他の保護基も使用されうる。

【００１７】段階４において、脱保護／鎖の伸長の周期は、所望のペプチド配列が構築され
るまで繰り返される。

【００１８】段階５において、完全なペプチドは樹脂から遊離される。保護基は開裂の前又
は後のいずれかに側鎖から除去される。Ｌが−ＮＨ−である場合、遊離するペプ
チドはしばしばＣ末端側が遊離している酸であり、そして第２の段階はＣ末端側
のアミドを形成するために必要である。

【００１９】前記ペプチドは液相合成によって製造されることもあり、そしてこれは、大量
の材量が必要な場合に更に都合が良いことがある。

【００２０】前記製剤に必要なポリマーは、通常当業界で公知である。既に述べた様に、前
記製剤は前記ポリマーのマトリックス中で、前記ペプチドの単純な分散の形態を
取ることがあり、あるいは前記ペプチドは、前記ポリマーを用いてマイクロカプ
セルに封入されうる。前記分散は前記ペプチド（固体として）と前記ポリマーと
を均一に混合し、そして固体群を形成するために混合物を加圧することで調製さ
れうる。適当に凝集性の組成物を達成するために、結合剤を混合物に加えること
が必要なこともある。前記の群は、続いて生物学的に適合性の液体（例えば水又
は等張性の食塩水）及び注射液中での懸濁に適当な粒子を与えるためにすりつぶ
されることがある。

【００２１】マイクロカプセルに封入した製剤は、固体ペプチド（粉末として）又は前記ペ
プチドの溶液、及び特に水溶液のいずれかから製造されうる。前記ポリマーは、
最初に適当な有機溶媒中で溶解される。前記ペプチドは、続いてこの溶液に加え
られ、そして混合物は、前記ペプチドを有機層中に分散させるために激しく撹拌
される。第２の有機溶媒が引き続いて加えられる。この第２の溶媒は、有機層中
での前記ポリマーの溶解度を低下させるために選択される。前記ポリマーは、固
体ペプチドの粒子の周り（又は分散水溶液の液滴の周り）にコーティングを形成
する様に溶液から現れる。生じたマイクロカプセルは、続いて有機溶媒の残りを
除去するために、洗浄することによって固められる。それらは、続いて直ちに投
与に適した液体中で懸濁される。

【００２２】上文の一般的な記述は、次のいくつかの例において更に精巧に仕上げられる。
これらは本発明のある観点を例示することが意図される。それらはあらゆる方法
において限定することを意図していない。

【００２３】例例１−ＧｎＲＨ−IIの合成１Ａ．樹脂が結合した保護ペプチドの製造ピロＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｈｉ
ｓ（Ｂｏｍ）−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
−ＯｒｅｓこのペプチドはＢｏｃ−Ｇｌｙ−エステル化したＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（
６０ｇ，１mmol／ｇ）から出発して、標準的な固相法を用いて製造した。合成は
、各作業に３００mlの合計の溶媒及び試薬の体積を用いて、手動の合成器で行っ
た。標準的な脱保護／洗浄／カップリングのプロトコールは表１に要約する。

【表１】

【００２４】ベンゾトリアゾリルエステルは、合成を通じて活性化エステルとして使用した
。これらは１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１当量）及びジシクロヘキシル
カルボジイミド（１当量）との反応によって、相当の保護アミノ酸から製造した
。（樹脂の置換性能に関して）使用した量を表２に列記する。

【表２】

【００２５】最後のカップリングの後、前記樹脂をジクロロメタン（３×３Ｌ）で洗浄し、
そして減圧下で、＋４０℃で恒量まで乾燥させた。

【００２６】アミノ酸解析：提示した配列と一致

【００２７】１Ｂ．開裂及び脱保護ピロＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ （６）例１Ａで製造したペプチド樹脂を、圧力容器中のリネンのバッグ内に据えた。
前記容器は、気体のアンモニアで４ａｔｍの最終圧力まで充填した。７２時間後
、過剰なアンモニアを排出し、そして前記樹脂を酢酸（３×１００mL）及びエタ
ノール（３×１００mL）で抽出した。一緒の抽出物を窒素で脱気し、炭素上の１
０％パラジウムを加え、そして混合物を水素雰囲気のもとで撹拌した。反応が完
了したとき（ＨＰＬＣによって判定）、前記混合物を濾過し、そして濾液を蒸発
させた。残査を逆層ＨＰＬＣで精製し、表題の化合物を与えた。

【００２８】例２−ペプチドのマイクロカプセルへの封入５０／５０の乳酸／グリコール酸の比率を有するコポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸、グリ
コール酸）が使用される。スターラーを備えた反応容器中のジクロロメタン（１
００mL）中のこのポリマー（３．７ｇ）の溶液に、ＧｎＲＨ−IIアセテート（０
．１５ｇ、酢酸中で例１のペプチドを溶解し、そして生じた溶液を凍結乾燥する
ことで製造した）を加える。混合物は５００回転／分で撹拌し、続いてシリコン
オイル（ＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ３６０ＭｅｄｉｃａｌＦｌｕｉｄ（商標
）４５ｇ）を１０分以上加える。前記混合物は、続いてカプリル−カプリン酸ト
リグリセリド（Ｍｉｇｌｙｏｌ（商標）８１２，３．３Ｌ）に弱い噴出で導入さ
れ、同時に連続して１０００回転／分で撹拌される。添加が完了し、撹拌が１時
間続けられたとき、前記のマイクロカプセルが濾過によって回収され、イソプロ
パノールで２回洗浄され、そして最終的に乾燥される。

【００２９】例３−ＧｎＲＨ−II及び類似体の骨形成細胞集団に対するｉｎｖｉｔｒｏで
の効果の解析（ａ）ヒト骨芽細胞は、当業界で知られている標準的な方法に従う整形手術（
Ｎｉｌｓｓｏｎｅｔａｌ．，１９９５）由来のガン性の骨から単離した。骨
の外植片を小さい骨のかけらに切り刻み、そして続いてダルベッコ改変イーグル
培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２（１：１Ｇｉｂｃｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｕ．Ｋ）中
で広範囲に洗浄した。これらの骨芽細胞様細胞、マウス骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ
１細胞及びヒトクローナル骨肉腫細胞系ＭＧ−６３（石灰化していない）及びＳ
ａＯｓ−２（石灰化していない骨肉腫）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ，Ｇｉ
ｂｃｏ）、フンギゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（５００mg／ｌ）、硫酸ゲンタマ
イシン（５０mg／ｌ）、Ｌ−グルタミン（２mM）及びｌ−アスコルビン酸（１０
０mg／ｌ）を添加したＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）中で、加湿したＣＯ₂ チャン
バー中で３７℃で培養した。

【００３０】（ｂ）ヒト骨髄ストロマ細胞は、リン酸緩衝塩溶液中ですすいだ骨のフラグメ
ントから単離した。骨髄細胞を回収し、そしてＦｉｃｏｌｌＨｙｐａｑｕｅの
カラムを介して遠心した（ＫｉｍｂｌｅｅｔａｌＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３１９５９−１９６７，１９９４）。界面の細胞をペレット化し、計
数し、そして７５cm² フラスコに播種した。前記細胞を加湿したＣＯ₂ チャンバ
ー中で３７℃でインキュベートし、そして培地を毎週交換した。コンフルエント
のとき、前記細胞をトリプシンＥＤＴＡを用いて採集し、そして１０％ウシ胎児
血清（ＦＣＳ，Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００Ｕ／ml）、ストレプトマイシ
ン（１００mg／ml）、フンギゾン及びＬ−グルタミン（２mM）を添加したα−最
小必須培地中に再播種した。

【００３１】（ｃ）全ての細胞が、ＧｎＲＨ−Ｉ及びＧｎＲＨ−IIの添加の４８時間前に血
清を不足していた。細胞を４８時間、１２穴プレート中の１０％のチャコールで
ストリップした血清を含むフェノールレッド無しの（フェノールレッドのエスト
ロゲン様効果を避けるため）ＤＭＥＭ中に据えた。ＧｎＲＨ−Ｉ及びＧｎＲＨ−
II及び前記ペプチドの類似体の用量依存効果は、１０^-9〜１０^-6Ｍに及ぶ最終濃
度でのペプチドの添加の後に研究された。１mMジブチリルｃＡＭＰをコントロー
ルとして使用した。前記細胞は２４時間毎に交換される前記ペプチドと、２４，
４８及び９６時間インキュベートした。

【００３２】（ｄ）細胞の増殖に対する前記ペプチドの効果を評価するために、[³Ｈ］チミ
ジンを１ｍＣｉ／mlで更に２４時間加え、そして[³Ｈ］チミジンの取り込みを決
定した。放射性同位体の取り込みは、シンチレーションカウンターを用いて決定
し、そして結果は cpm／全タンパク質のmgとして計算した。

【００３３】（ｅ）骨芽細胞の分化マーカーの発現も決定した（ＴｉｎｔｕｔＹｅｔ
ａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７３７５４７−５３，１９９８）。全Ｒ
ＮＡは処置前の複数の段階で、ペプチドの添加の２４，４８，７２及び９６時間
後に単離した。Ｉ型プロコラーゲン、オステオポンチン及び２８ＳＲＮＡ（内
部標準として使用した）の発現はノーザンブロット解析によって決定した。アル
カリホスファターゼ、マトリックスＧＬＡタンパク質、オステオクラスチン及び
ＧＡＰＤＨ（内部標準として）は、各遺伝子のために設計した特異的プライマー
を用いるＲＴ−ＰＣＲによって決定した。

【００３４】本発明のペプチドは，１００μＭ以下の濃度で有意な効果をもたらした。

【００３５】例４−ＧｎＲＨ−II及び類似体の破骨細胞集団に対するｉｎｖｉｔｒｏでの
効果の解析（ａ）破骨細胞前駆体のヒトクローン細胞系（ＦＬＧ２９．１）は、破骨細胞
の分化のｉｎｖｉｔｒｏモデルとして使用した（ＧａｔｔｅｉＶｅｔａ
ｌ．，ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈＤｉｆｆｅｒ７７５３−６３，１９９６）
。更に、ＦＬＧ２９．１及び骨芽細胞（Ｓａｏｓ−２）の共培養物は、移動性、
粘着性、細胞化学的、形態学的、及び生化学的変化について評価された。ＧｎＲ
Ｈ−Ｉ及びＧｎＲＨ−II及び前記ペプチドの類似体の用量依存の効果は、１０^-9 〜１０^-6Ｍに及ぶ最終濃度でのＦＬＧ２９．１培養物及び共培養物への添加の後
に研究した。副甲状腺ホルモンをコントロールとして加えた。プレ破骨細胞の分
化の増強（又は阻害）（大きな多核性成分への融合）及び多くの他の因子を測定
した（Ｏｒｌａｎｄｉｎｉｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＲｅｓ，２８１３３−４２，１９９５）。これらは：１．ＦＬＧ２９．１細胞中での酒石酸耐性酸性ホスファターゼのポジティブ染色２．Ｓａｏｓ−２細胞で発現したアルカリ性ホスファターゼの活性の低下３．ＦＬＧ２９．１細胞における成熟破骨細胞の典型的な超微細形態の出現４．顆粒球−マクロファージコロニ−刺激因子の培養培地中への放出５．細胞増殖に対する前記ペプチドの効果を評価するために、[³Ｈ］チミジンを
１ｍＣｉ／mlで更に２４時間添加し、そして[³Ｈ］チミジンの取り込みを上述し
た様に決定したこと、を含む。

【００３６】（ｂ）ヒトの骨のフラグメントから抽出した骨髄細胞は、当業界で知られてい
る標準的な技術を用いて、多核化した破骨細胞を産生するために、１０nM １．
２５−（ＯＨ)₂ビタミンＤ₃ の存在下で７日間培養した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ
ｅｔａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ１２２１４７３−１４８２，１９８８
）。培養培地（α−ＭＥＭ）を除去し、そして抗生物質及び、ＧｎＲＨ−Ｉ、Ｇ
ｎＲＨ−II又は類似体を含む１０％のチャコールでストリップした、熱不活性化
したＦＣＳを添加した、新鮮なフェノールレッド無しの培地と交換し、そして培
養を更に２４時間維持した。浮遊細胞を採集し、そして破骨細胞を酒石酸耐性酸
性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の発現、破骨細胞の分化マーカーのために染色し
た（Ｈｕｇｈｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１１３２−１１３５
，１９９６）。

【００３７】１．細胞は酒石酸及び２％ナフトールＡＳ−ＢＩリン酸塩（２０mg／mlでエチ
レングリコールモノメチルエーテルに溶解した）を含む、pH４．７−５．０の０
．２Ｍ酢酸緩衝液中で、１５分間３７℃でインキュベートした。前記細胞は、続
いて０．１％塩化パラロザノイリン（ｐａｒａｒｏｓａｎｏｉｌｉｎｅ）（等量
の４％硝酸ナトリウムと５分間室温で混合することによってヘキサゾタイズした
（ｈｅｘａｚｏｔｉｓｅｄ）もの）を有する、前記と同一の緩衝液及び酒石酸の
濃度から成る第２溶液に、３７℃で１０分間移した。この処理は、ＴＲＡＰを発
現している細胞において赤い細胞質の染色をもたらす。ハリスのヘマトキシリン
は、核の対比染色として使用した。

【００３８】２．アポトーシスの多核化した破骨細胞は、ＴＲＡＰの強力な染色、付随して
いる生存可能なＴＲＡＰポジティブ細胞以上に大きいサイズによって同定した。
アポトーシスの確認は、アクリジンオレンジ染色を用いて行った。生存可能な破
骨細胞は、９５％エタノール中での固定化及びＴＲＡＰのヘマトキシリン染色の
後に計数し、そしてアポトーシスの破骨細胞は各培養穴中の多核化した破骨細胞
（生存可能かつアポトーシス）の合計数のパーセンテージとして表した。

【００３９】本発明のペプチドは、１００μＭ以下の濃度で有意な効果をもたらした。

【００４０】例５−骨芽細胞及び破骨細胞集団におけるＧｎＲＨｍＲＮＡの発現解析全ＲＮＡは、上文に記載した様に培養した細胞：１．ガン性の骨から単離した、骨芽細胞様細胞２．マウス骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞３．ＭＧ−６３（石灰化していない）４．ＳａＯＳ−２（石灰化している骨肉腫）５．ヒト骨髄ストロマ細胞６．ヒトＦＬＧ２９．１破骨前駆細胞７．骨髄細胞から生じた多核化した破骨細胞、から抽出した。

【００４１】ＧｎＲＨ−１及びＧｎＲＨ−２の発現は、配列番号１〜４に概説したＰＣＲプ
ライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。生じたｃＤＮＡの完全性は
、アクチン増幅の相対的なレベルを評価することによって決定した。

【００４２】例６−卵巣を切除したラットにおける骨塩量に対するＧｎＲＨ−IIの効果（ａ）雌の成体（８週齢、２００〜２１５ｇ）のＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅ
ｙラットは、両方の卵巣を切除された（ＯＶＸ）。動物は、処置を開始する前に
、輸送後４週間保った。Ｐｕｒｉｎａのラット飼料（１．００％カルシウム、０
．６１％亜リン酸）及び水が適宜提供された。各研究は６種の体重に適合させた
集団（ｎ＝８／集団）から成る。

【００４３】（ｂ）処置はＯＶＸの４週後に開始した。４週間後、基準線のコントロールＯ
ＶＸ集団をと殺した（集団Ａ）。残りの集団は、１日１回溶媒（集団Ｂ）、の１
μｇ／kg体重（集団Ｃ）、１０μｇ／kg体重（集団Ｄ）、１００μｇ／kg体重（
集団Ｅ）のＧｎＲＨ−II、及び８０μｇ／kg体重（集団Ｆ）のｈＰＴＨ（１−３
４）で注射した。

【００４４】（ｃ）全てのラットを４日ごとに秤量し、そして投与量を平均の集団体重の増
加に対して５０ｇに調整した。ラットは、薬剤による処置後、１０，１９及び２
６日目に石灰化表面を標識するのに、それぞれ２％重炭酸ナトリウム塩溶液中の
カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）（３０mg／kg）又はテトラサイクリン（３０mg／
kg）の交互の皮下注射を受けた。骨塩量は、二重エネルギーＸ線吸光光度法（ｄ
ｕａｌｅｎｅｒｇｙｘ−ｒａｙａｂｓｏｒｐｔｏｍｅｔｒｙ，ＤＥＸＡ）
で評価した。２８日目に、血清カルシウムレベルが市販のキットを用いる比色ア
ッセイによって決定された。

【００４５】（ｄ）ＯＶＸの成功は、部検での卵巣組織の検出不可能及び子宮角の著しい萎
縮の観察によって確認した。両脚は、臀部の位置から解体された。左の脛骨及び
大腿骨は過剰な筋肉及び軟部組織の洗浄がされ、そして７０％エタノールに据え
られた。右の脛骨の骨幹端の前方隆起をレーザーメスで削り、骨髄をむき出しに
した。右の大腿骨及び脛骨の両方を続いて２４時間１０％リン酸緩衝液−ホルマ
リンに据え、そして７０％エタノールに移した。

【００４６】毎日１０及び１００μｇ／kgのＧｎＲＨ−II並び８０μｇ／kgのＰＴＨで２８
日間処置した、卵巣を切除した動物は高カルシウム血症と診断された。結果を図
１に示す。

【００４７】例７−正常なラットの骨及びヒトの骨のパラフィン切片におけるＧｎＲＨ−II
の細胞局在性（ａ）凍結し、そして／あるいはパラフィンに包埋したヒト及びラットの骨の
切片は、大きさに依存して３〜３６時間固定化し（室温で３〜５時間、続いて４
℃で約２４時間）、そして続いて石灰質が除かれるまでpH７．３の０．１ＭＴ
ｒｉｓ＋５％ＥＤＴＡ（１２．１１ｇ＋５０ｇＥＤＴＡ）に浸漬した。

【００４８】（ｂ）切片は、続いて標準的な技術を用いる抗体染色（ウサギポリクローナル
抗ＧｎＲＨ−II抗体）の処理にかけた。

【００４９】ＧｎＲＨ−IIの染色は成長板で血小板、巨核球において観察された（特に増殖
している軟骨細胞）。多少の染色が、骨形成細胞、特に活動的な骨芽細胞及び新
規な類骨においても見られた。

【００５０】例１は本発明のペプチドの調製を示し、これは続いて例２に例示した様に調製
されうる。例３〜７の注目のペプチドの生物学的活性を示す。本発明の範囲は、
これらの例によっていずれかの方法に限定されることを意図されない。特に、こ
れらのペプチドの様々な制御放出製剤が前記ポリマー並びに／あるいは前記ペプ
チド及びポリマーの組み合わせの物理学的性質を変えることで製造されうること
が理解されるだろう。しかし、これらの変更は等しい生物学的特性を有する製剤
を与え、そして特許請求の範囲に定義した様に本発明の範囲内であることが意図
される。

【表３】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、卵巣を切除したラットにおける血清カルシウム濃度に対するＧｎＲＨ
−IIの投与量増大の効果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/00 Ａ６１Ｐ 19/10 19/10 Ｃ０７Ｋ 14/59 ＺＮＡ // Ｃ０７Ｋ 14/59 ＺＮＡＡ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者アキンサンヤ，カレンイギリス国，サウザンプトンエスオー18 １ジージェイ，ビッターンパーク，マックナーテンロード 38 (72)発明者ヘイワード，アマンダイギリス国，ケンブリッジシービー４１エーダブリュ，チェスタートンホールクレセント 15 Ｆターム(参考） 4C076 AA61 BB15 BB16 CC17 CC26 DD46 EE24A EE27 FF21 FF63 4C084 AA02 BA01 BA08 BA17 BA23 CA35 DB09 MA05 MA38 MA66 NA12 ZA812 ZA972 ZC022 4H045 AA30 BA15 CA40 DA45 EA20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】治療的ペプチド又はその塩の制御放出のための医薬製剤であ
って、このペプチドが配列ピロＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ¹ −Ｇｌｙ−Ｘａａ² −Ｘａａ³
−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ （ここで、Ｘａａ¹ はＨｉｓ又はＴｙｒであり、Ｘａａ² はＴｒｐ又はＬｅｕであり、そしてＸａａ³ はＴｙｒ又はＡｒｇである。但し、Ｘａａ¹ がＴｙｒであり、そしてＸａａ² がＬｅｕの場合は、Ｘａａ³
はＡｒｇではない）を有し、そして更に医薬として許容される生物分解性ポリマ
ーを含んで成る医薬製剤。
【請求項２】前記ペプチドが、ピロＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ₂ である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】前記ポリマーがカルボン酸のヒドロキシ誘導体のポリマー、
又は前記誘導体のコポリマーである、請求項１に記載の製剤。
【請求項４】前記ポリマーがグリコール酸のポリマー、乳酸のポリマー、
又は乳酸及びグリコール酸のコポリマーである、請求項３に記載の製剤。
【請求項５】前記ペプチドが前記ポリマーによってマイクロカプセルに封
入される、請求項１に記載の製剤。
【請求項６】ヒトの医学的な症状の処置のための方法であって、治療とし
て有効な量の請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドの制御放出製剤の、
前記の処置を必要とする個体への投与を含んで成る方法。