CZ20011893A3

CZ20011893A3 - Farmaceutický prostředek, způsob léčby zdravotního stavu, pouľití peptidu

Info

Publication number: CZ20011893A3
Application number: CZ20011893A
Authority: CZ
Inventors: Steve Qi; Karen Akinsanya; Amanda Hayward
Original assignee: Ferring Bv
Priority date: 1998-12-03
Filing date: 1999-12-02
Publication date: 2002-05-15
Also published as: AU1573200A; HUP0104943A3; NO20012636L; KR20010089538A; GB9826662D0; EE200100293A; AU770676B2; SK7552001A3; CA2353798A1; BR9915943A; CN1332635A; PL348575A1; TR200102273T2; WO2000032218A1; EP1140133A1; MXPA01005543A; NZ511984A; HUP0104943A2; HRP20010421A2; ZA200104530B

Description

Předkládaný vynález se vztahuje k farmaceutickému prostředku, který vypouští terapeutické činidlo v prodlouženém časovém období.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Studie fysiologie osy hypothalamus - podvěsek mozkový - gonády vyvrcholily zjištěním, že gonadotropiny uvolňující hormon (GnRH, jinak známý jako luteinizační hormon uvolňující hormon, LHRH) je klíčovým regulačním hormonem. GnRH je uvolňován hypothalamem a působí na podvěsek mozkový, aby stimuloval uvolňování luteinizačního hormonu (LH) a folikuly stimulujícího hormonu (FSH). V poměrně nedávné době byl identifikován peptid s homologií k GnRH (White a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95, 305-309, 1998). Tento peptid byl pojmenován GnRH-Π. Sekvence obou dvou peptidů jsou porovnány níže.

GnRH pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (SEQ I.D. No.5)

GnRH-II pyroGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH₂ (SEQ I.D. No.6)

Název „GnRH-II„ je určitém smyslu zavádějící. Nový peptid je odděleným genovým produktem a je jasně odlišitelným od GnRH ve své distribuci v tkáni. Zdá se být nepravděpodobné, že by GnRH-Π působil jako endogenní látka uvolňující LH a FSH. Protože zde nebyl předložen jasný důkaz fysiologické role pro GnRH-II, tak nebyla věnována žádná pozornost praktickým aspektům použití tohoto peptidu coby terapeutického činidla.

PODSTATA VYNALEZU

My jsme nyní zjistili, že GnRH-II hraje důležitou roli ve íungování řady orgánů. Například GnRHII má vliv na osteogenezi a moduluje proliferaci epiteliálních buněk předstojné žlázy. Z tohoto důvodu jsme rozvažovali o prostředku, kterým by toto činidlo a jeho analogy mohlo být vhodně dopravováno v klinické praxi a to je předmětem předkládaného vynálezu jak zajistit vhodné prostředky pro dosažení tohoto cíle. Prostředky podle předkládaného vynálezu se opírají o použití biodegradovatelného polymeru, který udržuje peptid v depu, ze kterého je pak peptid uvolňován • · ·· · · ···· · 9· • · · · · · · ···· • · · · · · 9 99 » ······· · · 9· ··· ··· ··· ······ ·· · _e do krevního oběhu daného systému při kontrolované rychlosti. Tyto prostředky zahrnují dva klíčové prvky, biologicky aktivní peptid a biodegradovatelný polymer. Biologicky aktivním peptidem je dekapeptid, který odpovídá následující sekvenci:

pyroGlu-His-Trp-Ser-Xaa^!-Gly-Xaa²-Xaa³-Pro-Gly-NH₂ (SEQ I D. No. 7) kde Xaa¹ je His nebo Tyr,

Xaa²je Trp nebo Leu, a

Xaa³ je Tyr nebo Arg, což zajišťuje, že když Xaa¹ je Tyr a Xaa² je Leu, pak Xaa³ není Arg. Polymerem je jakýkoliv farmaceuticky akceptovatelný biodegradovatelný polymer, a vhodněji kopolymer kyselin glykolové a mléčné. Předkládaný vynález dále zahrnuje použití prostředků pro léčbu lidských chorob.

Tak, jak jsou použity zde, mají zkratky týkající se aminokyselin jejich konvenční významy a označují přírodní L-izomer (kromě chirální aminokyseliny glycinu).

Na první pohled předkládaný vynález tak, jak je popsán zde, zahrnuje farmaceutický prostředek, který uvolňuje terapeutický peptid kontrolovanou rychlostí a v prodlouženém časovém období (to znamená v časovém období přinejmenším jednoho dne, vhodněji po dobu několika dnů, a nejvhodněji po dobu přinejmenším jednoho týdne) zvláště pro léčbu chorob kostí a předstojnc žlázy. Terapeutickým peptidem je dekapeptid podle sekvence:

pyroGlu-His-Trp-Ser-Xaa¹-Gly-Xaa²-Xaa³-Pro-Gly-NH₂ (SEQ I.D. No.7) kde Xaa¹ je buď His nebo Tyr, Xaa² je buď Trp nebo Leu, a Xaa³ je buď Tyr nebo Arg, což zajišťuje, že když Xaa¹ je Tyr a Xaa²je Leu, pak Xaa³ není Arg. Vhodněji Xaa¹ je His, Xaa²je Trp a Xaa³ je Tyr. Bude ukázáno, že takovýto peptid může tvořit sole s kyselinami (například s kyselinou octovou, kyselinou trifluoroctovou, kyselinou benzoovou, kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou fosforečnou a podobně). V tom smyslu, že takovéto sole jsou tvořeny s farmaceuticky akceptovatelnými kyselinami, jsou začleněny v rámci předkládaného vynálezu. Druhou hlavní složkou prostředku je biodegradovatelný, farmaceuticky akceptovatelný polymer. Takovéto polymery jsou známé ze stavu techniky. Mohou to být buď homopolymery (to znamená polymery tvořené jedním monomerem) nebo kopolymery (to znamená polymery tvořené ze dvou • · ····· · · · · • · · ··· ··· ·· ···· ·· · ·· ··· nebo více odlišných monomerů). Vhodné monomery zahrnují aminoderiváty a hydroxyderiváty karboxylových kyselin. V upřednostňované části předkládaného vynálezu je polymer složen z hydroxyacylových monomerních jednotek a ještě vhodněji z α-hydroxyacylových jednotek. Nejvhodněji je polymerem polyglykolové kyseliny, polymléčné kyseliny nebo kopolymer glykolové kyseliny a mléčné kyseliny. Takovýto polymer má následující chemickou strukturu:

kde R je vodík u polyglykolové kyseliny, methyl u polymléčné kyseliny a náhodně vodík nebo methyl u kopolymeru.

Dvě komplementární metody pro přípravu prostředku podle předkládaného vynálezu mohou být rozlišeny. Peptid může být buď začleněn do matrice polymeru nebo, vhodněji, může být polymerem opouzdřen. V tomto druhém případě mže být peptid, který je opouzdřen, buď v pevném stavu nebo kapalném stavu. Je upřednostňováno, aby peptid byl v pevném stavu.

Tento prostředek je užitečný při léčbě lidských chorob, včetně poruch růstu kostí (což zahrnuje s věkem spojené osteoporózy a osteoporózy spojené s post-menopausálním hormonálním stavem, primární a sekundární hyperparatyreózu, nepoužívanou osteoporózu, osteoporózu spojenou s cukrovkou a osteoporózou spojenou s glukokortikoidy) a růstu prostaty (což zahrnuje benigní hyperplazii prostaty a rakovinu prostaty).

Z druhého pohledu zahrnuje předkládaný vynález tak, jak je popsaný zde, způsob léčby jednotlivce trpícího chorobami kostí nebo růstu předstojné žlázy, nebo je zvažován být použit při riziku takového utrpení. Tento způsob léčby zahrnuje podávání zmíněnému jedinci terapeuticky účinného množství prostředku, který obsahuje jako aktivní hlavní složku, peptid podle následující sekvence:

pyroGlu-His-Trp-Ser-Xaa^I-Gly-Xaa²-Xaa³-Pro-Gly-NH₂ (SEQ I.D. No.7) nebo farmaceuticky akceptovatelnou sůl tohoto peptidu, kde Xaa¹, Xaa² a Xaa³ jsou takové, jak je definováno výše, a jako druhou složku farmaceuticky akceptovatelný biodegradovatelný polymer, jehož složení umožňuje uvolňování peptidu do krevního oběhu systému tak, jak je ·· ·· ·· ···· · · ···· ·· · ··· • · ····· · · · · • · * · · · ··· ·· ···· ·· · ·· ··· polymer postupně narušován. Způsob léčby může zahrnovat jedno podání prostředku, ale pravděpodobnější je, že bude zahrnovat postupně opakovaná podávání. Frekvenci podávání může být od jedenkrát denně až po jedenkrát za měsíc. Množství aktivního peptidu v dávce bude záviset na dávkovacím plánu a rychlosti podávání. Obecně to bude mezi jedním miligramem (1 mg) a jedním gramem (1 g). Ošetřující lékař určí přesnou dávku v závislosti na parametrech obvykle zvažovaných ve stavu techniky tak, aby byla odpovídající. Prostředek je podáván buď intramuskulárně nebo podkožní injikací.

Peptidy, které zahrnují aktivní činidla v prostředcích podle předkládaného vynálezu, mohou být připraveny způsoby, které jsou obecně známé ve stavu techniky. Například peptidy mohou být připraveny syntézou na pevné fázi. To zahrnuje následné přidávání aminokyselinových zbytků k intermediátu, který je vázaný na pryskyřici, podle následující strategie.

1. Vytvoření prvního intermediátu vázaného na pryskyřici:

PG-Aaa-OH + FG-Res - PG-Aaa-L-Res

Aaa = aminokyselina

PG = chránící skupina

FG = funkční skupina

Res = polymerní pryskyřice

L = vazebná skupina (-O- nebo -NH-)

2. Odstranění chránící skupiny

PG-Aaa-L-Res - H-Aaa-L-Res

3. Prodloužení řetězce

PG-Bbb-OH + H-Aaa-L-Res - PG-Bbb-Aaa-L-Res

4. Opakování kroků 2 a 3 pokud je to nezbytné

PG-Bbb-Aaa-L-Res---PG-Nnn-...-Bbb-Aaa-L-Res

5. Odštěpení/odstranění chránící skupiny

PG-Nnn-...-Bbb-Aaa-L-Res - H-Nnn-...-Bbb-Aaa-OH (nebo -NH₂) ·· ·· ······ ·· · ···· ·· · · · · · ·· ···· · · · • · ····· · · · · *) · · · ··· · · · • · · 9 · · 9 9 9 · · · · 9

V kroku jedna je chráněná aminokyselina ponechána reagovat s pryskyřicí, na které je navázána funkční skupina. Chránící skupinou (PG) je nejčastěji /erí-butyloxykarbonyl (Boc) nebo 9-fluoenylmethyloxykarbonyl (Fmoc). Obvykle je funkční skupinou na pryskyřici (FG) chloralkylová skupina, hydroxylová skupina nebo aminová skupina. Když FG je chloralkylem nebo hydroxylovou skupinou, pak je vazebnou skupinou (L) kyslíkový atom (-O-). Když FGje aminoskupinou, L je -NH-.

V druhém kroku je odstraněna chránící skupina (PG) z α-aminoskupiny. Když PG je Boc, toto může být dokončena působením na pryskyřici kyselinami takovými, jako je trifluoroctová kyselina nebo kyselina chlorovodíková v dichlormethanu, Když PG je Fmoc, odstranění chránící skupiny může být dokončeno působením na pryskyřici zásadami takovými, jako je piperidin.

V třetím kroku je prodloužen peptidový řetězec o jeden aminokyselinový zbytek. Chráněná aminokyselina je spojena s aminoskupinou, která byla zbavena ochrany v kroku dvě. Mnoho činidel je známo ze stavu techniky pro dosažení této konverze. Jednou z kombinací je dicyklo-hexylkarbodiimid (DCC) a hydroxybenzotriazol (HOBt). Obecně bude také potřebná zásada. Vhodné zásady zahrnují triethylamin a Ν,Ν-diisoropylethylamin. Rozpouštědlem bude obvykle dichlormethan, dimethylformamid nebo směsi těchto látek.

Pokud boční řetězce aminokyselin (Aaa - Nnn) obsahují reaktivní skupiny (například aminoskupiny, skupiny karboxylových kyselin, hydroxylové skupiny), pak bude potřeba tyto skupiny chránit. Chránící skupiny vybrané pro boční řetězce jsou obecně takové, které jsou stabilní za podmínek, které jsou vyžadovány k odstranění chránící skupiny (PG) z a-aminoskupiny. Pokud PG je Fmoc, pak mohou být chránící skupiny bočního řetězce vhodně založeny na tert-butylové chemii. Na druhou stranu pokud PG je Boc, pak mohou být chránící skupiny bočního řetězce založeny na fluorenylmethylové chemii. Další chránící skupiny známé ze stavu techniky mohou být také použity.

V kroku čtyři je opakován cyklus odstranění chránící skupiny/prodloužení řetězce tak dlouho, dokud nebyla vytvořena požadovaná peptidová sekvence.

V pátém kroku je dokončený peptid odštěpen od pryskyřice. Chránící skupiny jsou odstraněny z bočních řetězců buď před nebo až po odštěpení. Když L je -NH-, je odštěpený peptid ve formě C-koncového amidu. Když L je -0-, je odštěpený peptid často kyselinou bez C-konce a je vyžadován druhý krok, aby došlo k vytvoření C-koncového amidu.

Peptidy mohou být také připravovány syntézou ve fázi roztoku a toto může být mnohem vhodnější, pokud jsou potřeba větší množství materiálu.

·· ·· ·· ···· ·· · ·*·· ·♦ · ···· ·· · · · · ··· _x ······· ····

D ··· · · · · · · ········· ·····

Polymery vyžadované pro prostředek jsou obecně dobře známé ze stavu techniky. Jak bylo uvedeno dříve, prostředek může nabývat formy jednoduché disperze peptidu v matrici polymeru nebo může být obalen mikro-obalem polymeru. Disperze může být připravena smícháním peptidu (jako pevné látky) a polymeru do homogenního stavu, a pak stlačením směsi tak, aby se vytvořila pevná hmota. Může být nezbytné přidat vazebné činidlo do směsi z důvodu dosažení vhodného kohezního prostředku. Hmota může být pak rozmělněna tak, aby vznikly částice vhodné pro suspendování v biologicky kompatibilní kapalině (takové jako je voda nebo izotonický roztok chloridu sodného) a injikaci.

Obalené prostředky v mikro-obalech mohou být připraveny buď z peptidu v pevném stavu (takovém jako je prášek) nebo z roztoku, a zvláště pak vodného roztoku, peptidu Polymer je nejdříve rozpuštěn ve vhodném organickém rozpouštědle. Peptid je pak přidán do tohoto roztoku a směs je aktivně míchána tak, aby vznikla disperze peptidu v organické fázi. Pak je přidáno druhé organické rozpouštědlo. Toto druhé rozpouštědlo je vybráno tak, aby redukovalo rozpustnost polymeru v organické fázi. Polymer vypadává z roztoku tak, aby vytvořil obal okolo částic pevného peptidu (nebo okolo kapiček, které jsou dispergované ve vodném roztoku). Výsledné mikrokapsle jsou pak ztvrzeny omýváním, aby došlo k odstranění zbytků organických rozpouštědel. Mikrokapsle pak jsou připravené k tomu, aby mohly být suspendovány ve vhodné kapalině pro podávání.

Výše popsaný obecný popis je dále rozpracován níže v řadě příkladů. Příklady jsou zamýšleny k tomu, aby ilustrovaly jisté aspekty předkládaného vynálezu. Nejsou však zamýšleny, aby vynález v žádném z přístupů omezovaly.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Na obrázku 1 je ukázán účinek zvýšených dávek GnRH-II na koncentrace vápníku v séru u krys, kterým byly odstraněny vaječníky.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Příklad 1

Syntéza GnRH-II

A. Příprava chráněného peptidu vázaného na pryskyřici ·· ·· ·♦ φφφφ ·· ·

Φ Φ φ Φ Φ Φ · φφφφ • · ΦΦΦΦ φφφ • · Φ Φ Φ φ φ Φ φ φ φ

Φ Φ Φ ΦΦΦ φφφ • · ΦΦΦΦ ΦΦ · φφ ΦΦΦ pyroGlu-His(Bom)-Trp(CHO)-Ser(Bzi)-His(Bom)-Gly-Trp(CHO)-Tyr(Bzl)-Pro-Gly-Ores

Tento peptid byl připraven za použití standardních metod na pevné fázi s tím, že se začínalo na Boc-Gly-esterifikované Merrifieldově pryskyřici (60 g, 1 mmol/g). Syntéza byla provedena na manuálním syntetizačním zařízení s celkovými objemy rozpouštědla a činidla 300 ml pro každou operaci. Standardní protokol pro odstranění chránící skupiny/omývání/vazebnou reakci je shrnut v tabulce 1.

Tabulka 1

krok	činidlo	čas (min)	počet operací
odstranění Boc	HC1/DCM*	60	1
omývání	DCM	2 až 4	3
neutralizace	10% DIPEA/DCM	4	2
omývání	DCM	2 až 4	1
vazebná reakce	aktivovaný ester	60 až 120**	1 až 2
omývání	DCM	2 až 4	3
* plynný chlorovodík byl probubláván přes suspenzi pryskyřice v DCM ** úplnost reakce byla určena negativním hydrazinovým testem

Benzotriazolylové estery byly použity jako aktivované estery procházející syntézou. Byly připraveny z odpovídajících chráněných aminokyselin reakcí s 1-hydroxybenzotriazolem (1 ekvivalent) a dicyklohexylkarbodiimidem (1 ekvivalent). Použitá množství (ve vztahu k substituční kapacitě pryskyřice) jsou uvedena v tabulce 2.

Tabulka 2

cyklus č.	aminokyselinový derivát	molární přebytek
1	Boc-Pro-OH	1,8
2	Boc-Tyr(Bzl)-OH	1,8
3	Boc-Trp(CHO)-OH	1,8
4	Boc-Gly-OH	1,8
5	Boc-His(Bom)-OH	1,8

• * ··· ·

6	Boc-Ser(Bzl)-OH	2,0
7	Boc-Trp(CHO)-OH	2,0
8	Boc-His(Bom)-OH	2,0
9	PyroGlu-OH	2,0

Poslední vazebnou reakci následovalo omytí pryskyřice dichlormethanem (3 x 3 1) a sušení za podmínek redukovaného tlaku při + 40 °C do konstantní hmotnosti.

Analýza aminokyselin: konzistentní s předpokládanou sekvencí

B. Štípání a odstraňování chránících skupin pyroGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH₂ (SEQ I.D. No.6)

Peptid-pryskyřice připravená v příkladu 1A byla umístěna v plátěném pytlíku do tlakové komůrky Komůrka byla pak naplněna plynným amoniakem do konečného tlaku 4 atmosfér. Po 72 h byl přebytek amoniaku odpuštěn a pryskyřice byla extrahována kyselinou octovou (3 x 100 ml) a ethanolem (3 x 100 ml). Z kombinovaných extraktů byl odstraněn vzduch dusíkem, bylo přidáno 10% paladium (na uhlíku) a směs byla míchána v atmosféře vodíku. Když byla reakce dokončena (jak bylo zkontrolováno na HPLC), byla směs filtrována a filtrát byl odpařen. Zbytek byl přečištěn na HPLC s reverzní fází, aby byla získána požadovaná sloučenina.

Příklad 2

Obalení peptidu mikro-obalem

Byla použita kopoly(D,L-mléčná kyselina, glykolová kyselina) v poměru 50/50 s mléčnou kyselinou/glykolovou kyselinou. Do roztoku tohoto polymeru (3,7 g) v dichlormethanu (100 ml) v reakční komůrce vybavené míchadlem byl přidán GnRH-II acetát (0,15 g, připravený rozpuštěním peptidu z příkladu 1 v kyselině octové a lyofilizací výsledného roztoku). Směs byla míchána při 500 otáčkách/minutu, a pak byl po 10 minutách přidán silikonový olej (Dow Corning 360 Medical Fluid®, 45 g). Směs je pak zavedena jako tenký proud do triglyceridu kyseliny kaprylové-kaprinové (Miglyol® 812, 3.3L) za stálého míchání při 1000 otáčkách/minutu. Když je přidávání dokončeno, míchání pokračuje po dobu 1 hodiny, a pak jsou mikrokapsle shromážděny za pomoci filtrace, dvakrát omyty isopropanolem a nakonec vysušeny.

·· ·· ·* ···· ·· · «··· · · · · · · · • · ···· · · · _n ······· · · · · y · · · · · · ···

Λ ·· ···· <· < ·· ···

Příklad 3

Analýza účinků GnRH-II a analogů na osteogenní buněčné populace in vitro.

a) Lidské osteoblasty byly izolovány z kosti zasažené rakovinou ortopedickým chirurgickým zákrokem (Nilsson a spol. 1995) podle standardních postupů známých ze stavu techniky. Kostní vzorky byly nasekány na malé kostní Štěpy a pak kvalitně omyty v modifikovaném Eagle médiu od společnosti Dulbecco (DMEM)/F12 (1:1 Gibco, Paisley, U.K.). Tyto buňky jako osteoblasty, myší osteoblastické MC3T3-E1 buňky a lidské klonální osteosarkomové buněčné linie MG-63 (ne-mineralizující) a SaOS-2 (mineralizující osteosarkom) byly kultivovány vDMEM:F12, 1:1 médiu s přídavkem 10% zárodečného telecího séra (FCS, Gibco), fúngizonu (500 mg/1), síranu gentamycinu (50 mg/1), L-glutaminu (2mM) a I-askorbové kyseliny (100 mg/1) ve zvlhčené CO2 komůrce při 37 °C.

b) Lidské buňky stromatu kostní dřeně byly izolovány z kostních fragmentů opláchnutých v roztoku chloridu sodného, který byl pufrovaný fosfátem. Buňky kostní dřeně byly shromážděny a stočeny přes kolonu od společnosti Ficol Hypaque (Kimble a spol., J. Clin. Invest., 93, 19591967, 1994). Buňky na fázovém rozhraní byly shloučeny, spočítány a vysety do 75 cm² lahví. Buňky byly inkubovány ve zvlhčené CO₂ komůrce při 37 °C a médium bylo jednou týdně vyměňováno. Při sbíhání byly buňky sklizeny za použití trypsinu EDTA a opětovně vysety v aminimálním esenciálním médiu (α-MEM) doplněném o 10% zárodečné telecí sérum (FCS, Gibco), penicilín (100 U/ml), streptomycin (100 mg/ml), fungizon a L-glutaminu (2mM).

c) Všechny buňky byly vyhladověny na sérum po dobu 48 hodin před přídavkem GnRH-I a GnRH-II. Buňky byly umístěny v DMEM médiu bez červeného fenolu (z důvodu vyhnutí se účinkům červeného fenolu, které jsou podobné účinkům estrogenu), které obsahovalo 10% sérum, po dobu 48 hodin ve 12 jamkových destičkách. Účinky GnRH-I a GnRH-II a analogických peptidů v závislosti na dávce byly studovány poté, co byly peptidy přidány v konečných koncentracích, které se pohybovaly v rozmezí od 10'⁹ do 10’⁶. lmM dibutyryl cAMP byl použit jako kontrola. Buňky byly inkubovány po dobu 24, 48 a 96 hodin s tím, že peptid byl znovu přidán každých 24 hodin.

d) Aby bylo možné určit účinky peptidů na proliferaci buněk, byl přidán [³H]thymidin při mCi/ml po dobu dalších 24 hodin a začlenění [³H]thymidinu bylo určeno. Začlenění

• · · φ φ φ φ φ · φ φ · φ φ· φ *♦ φφφφ φ φ φ φ φ φφ φ radioizotopu bylo určeno za použití scintilačního počítacího zařízeni a výsledky byly spočítány jako cpm/mg celkového proteinu.

e) Exprese osteoblastických diferenčních značek byla také určena (Tintut Y. a spol., J. Biol. Chem., 273, 7547-53, 1998). Celková RNA byla izolována při několika stupních, před zahájením pokusu, a po 24, 48, 72 a 96 hodinách po přídavku peptidů. Exprese prokolagenu typ I, osteopontinu a 28S RNA (použitá jako interní kontrola) byla určena analýzou Northern blot. Alkalická fosfatáza, protein matrix GLA, osteoklastin a GAPDN (použit jako interní kontrola) byly určeny pomocí RT-PCR za použití specifických primerů vytvořených pro každý gen.

Peptidy podle předkládaného vynálezu působily významné účinky při koncentracích pod 100 μΜ.

Příklad 4

Analýza účinků GnRH-II a analogů na populace osteoklastu in vitro.

a) Lidské klonální buněční linie osteoklastických prekursorů (FLG 29.1) byly použity jako in vitro model pro osteoklastickou diferenciaci (Gattei V. a spol., Cell Growth Differ, 7, 753-63, 1996). Kromě toho spolu-kultury FLG 29.1 a osteobastických buněk (Saos-2) byly vyhodnoceny na migrační, adhezívní, cytochemické, morfologické a biochemické změny. Účinky GnRH-I a GnRHII a peptidových analogů v závislosti na dávce byly studovány poté, co byly přidány konečné koncentrace, které se pohybovaly v rozmezí od 10'⁹ do ΙΟ'⁶ M, do FLG 29.1 kultur a do spolukultur. Parathyroidní hormon byl přidán jako kontrola. Zastavení (nebo inhibice) diferenciace preosteoklastů (fuze do větších multijaderných elementů) a řada dalších faktorů byla měřena (Orlandini a spol., Cell Tissue Res., 281, 33-42, 1995). Toto zahrnuje:

1. Pozitivní barvení tartarát-rezistentní kyselé fosfatázy v FLG 29.1 buňkách.

2. Snížení aktivity alkalické fosfatázy exprimované v Saos-2 buňkách.

3. Objevení se typických ultra-strukturních rysů u zralých osteoklastů v FLG 29.1 buňkách.

4. Vypuštění stimulačního faktoru granulocytových makrofágů do kultivačního média.

5. Aby bylo možné určit účinky peptidů na proliferaci buněk, byl přidán [³H]thymidin při mCi/ml po dobu dalších 24 hodin a začlenění [³H]thymidinu bylo určeno, jak je popsáno výše.

····

b) Buňky kostní dřeně získané z lidských kostních fragmentů byly kultivovány v přítomnosti 10 nM 1,25-(OH)₂ vitamínem D₃ po dobu sedmi dnů, aby došlo k vytvoření multijaderných osteoklastů za použití standardních technik známých ze stavu techniky (Takahashi a spol., Endocrinol, 122, 1473-1482, 1988). Kultivační médium (α-MEM) bylo odstraněno a nahrazeno čerstvým médiem prostým červeného fenolu a doplněným antibiotiky a 10% tepelněinaktivovaným FCS obsahujícím GnRH-I, GnRH-II nebo analogy a kultury byly udržovány po dobu dalších 24 hodin. Plovoucí buňky byly shromážděny a osteoklasty obarveny pro zjištění exprese tartarát-rezistentní kyselé fosfatázy (TRAP), což je značka osteoklastové diferenciace (Hughes a spol., Nat. Med., 2, 1132-1135, 1996).

1. Buňky byly inkubovány v 0,2 M acetátovém pufru, pH 4,7 až 5,0, obsahujícím kyselinu tartarovou a 2% naftol AS-BI fosfát (rozpuštěný do koncentrace 20 mg/ml v ethylenglykol-monoethyletheru) po dobu 15 minut při 37 °C. Buňky byly pak přeneseny do druhého roztoku, který byl složen ze stejného pufru a koncetrace tartarové kyseliny s 0,1% pararosanilinchloridem (hexazotizován mícháním se stejným objemem 4% dusičnanu sodného po dobu 5 minut při pokojové teplotě) po dobu 10 minut při 37 °C. Tato úprava způsobuje červenou cytoplazmatickou barvu v buňkách exprimujících TRAP. Harrisův hematoxylin byl použit jako jaderná proti-barva.

2.Apoptotické multijaderné osteoklasty byly silnou expresí TRAP, větší velikosti než doprovází životaschopné TRAP-pozitivní buňky. Potvrzení apoptózy bylo provedeno za použití akridinové oranžové barvy. Životaschopné osteoklasty byly spočítány po fixaci v 95% ethanolu a TRAP hematoxylinovém obarvení a apoptotické osteoklasty byly vyjádřeny jako procento celkového počtu multijaderných osteoklastů (životaschopných a apoptotických) v každé kultivační jamce.

Peptidy podle předkládaného vynálezu působily významné účinky při koncentracích pod

100 μΜ.

Příklad 5

Expresní analýza GnRH mRNA v osteogenní a osteoklastních buněčných populacích

Celková RNA byla extrahována z buněk kultivovaných jak je popsáno výše:

1. buňky jako osteoblasty, izolované z rakovinné kosti

2. myší osteoblastické MC3T3-E1 buňky ·* ♦· ΦΦ Φ · ♦ Φ ν· · φ φ φ φ φ φ φ · · <· φ ♦ · · · φ · · ·« • · ΦΦ··· · · ·· ··· φφφ φ ·· φ« φφφφ ·· · ♦ ♦··♦

3. MG-63 (ne-mineralizující)

4. SaOS-2 (mineralizující sarkom)

5. lidské buňky stromatu kostní dřeně

6. lidské FLG 29.1 osteoklastní prekurzorové buňky

7. multijaderné osteoklasty vytvořené z kostní dřeně

Exprese GnRH-I a GnRH-II byla určena metodou RT-PCR za použití PCR primerů naznačených v SEQ I.D. No 1 až 4. Integrita vytvořené cDNA byla určena stanovením relativní hladiny amplifíkace aktinu.

Příklad 6

Účinek GnRH-II na minerální hustotu kosti u krys, jimž byly odstraněny vaječníky

a) U dospělých samic (8 staré týdnů, 200 až 215 g) Sprague Dawley krys byly oboustranně odstraněny vaječníky (OVX). Zvířata byla držena 4 týdny po dodávce před tím, než byla zahájena léčba. Čistá krysí strava (1,00% vápník, 0,61% fosfor) a voda byly zajištěny dle libosti. Každá studie se skládá z 6 hmotnostně párovaných skupin (n = 8/skupinu).

b) Léčba začala 4 týdny po OVX. Po 4 týdnech byla základní kontrolní OVX skupina utracena (skupina A). Zbývající skupiny byly injikována jednou denně nosičem (skupina B), lng/kg tělesné hmotnosti (skupina C), 10 ůg/kg tělesné hmotnosti (skupina D), 100 μg/kg tělesné hmotnosti (skupina E) látky GnRH-II a 80 μβ/kg tělesné hmotnosti (skupina F) látky hPTH(l-34).

c) Všechny krysy byly váženy každý čtvrtý den a dávky byly upraveny pro 50 g nárůstek v průměrné hmotnosti skupiny. Krysy dostávaly střídavě podkožní injekce kalceinu (30 mg/kg) nebo tetracyklinu (30 mg/kg) v 2% uhličitan sodný v roztoku chloridu sodného, podle pořadí značených mineralizačních povrchů ve dnech 10, 19 a 26, což bylo následováno léčbou s lékem.

Kostní minerální hustota byla určena duální energetickou rentgenovou absorptometrií DEXA). 28. den byly určeny hladiny vápníku v séru kolorimetrickým testem za použití komerčního kitu.

d) Úspěch OVX byl určen při nekropsii úbytkem detekovatelnosti tkáně vaječníků a pozorováním značené atrofie děložních rohů. Obě končetiny byly vykloubeny v kyčlích. Levá holení kost a stehenní kost byly očištěny od přebytečných svalů a měkké tkáně a umístěny do 70% ethanolu. Dřívější vyvýšenina na metafyze pravé kosti holení byla oholena břitvou, sotva odhalující kostní • · · • · « «4 ·>«« ♦

*

dřeň. Obě, pravá stehenní kost i kost holení, byly pak umístěny do 10% formalin, který byl pufrován fosfátem, po dobu 24 hodin a pak přemístěny do 70% ethanolu.

Zvířata, u nichž byly odstraněny vaječníky, a která byla léčena denně 10 a 100 pg/kg látky GnRH-II a 80 μβ/kg PTH po dobu 28 dnů, vykázala hyperkalcemii. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 1.

Příklad 7

Buněčná lokalizace GnRH-II v parafínových oblastech u normální krysí kosti a lidské kosti

a) Zmražené a/nebo v parafinu ukotvené lidské a krysí kostní oblasti byly fixovány po dobu 3 až 36 hodin v závislosti na velikosti (3 až 5 hodin při pokojové teplotě, pak přibližně 24 hodin při 4 °C) a pak namočeny v 0,1 M Tris + 5% EDTA (12,11 g + 50 g EDTA) pH 7,3 dokud se z nich neodstranil vápník.

b) Oblasti pak byly podrobeny obarvováni protilátkami (králičí polyklonální anti-GnRH-II protilátky) za použití standardních technik.

Obarvení GnRH-11 bylo pozorováno na mističkách, megakatyocyty na růstových miskách (zvláště proliferující chondrocyty). Některé obarvení bylo také pozorováno u kosti-tvořících buněk, zvláště u aktivních osetoblastů právě tak, jako u nového osteoidu.

Příklad 1 demonstruje přípravu peptidů podle předkládaného vynálezu, který může pak být formulován jako ilustrativní v příkladu 2. Příklady 3 až 7 demonstrují biologickou aktivitu peptidů podle předkládaného vynálezu. Rámec předkládaného vynálezu není zamýšlen být jakkoliv omezen pouze na tyto příklady. Kromě toho bude konkretizováno, že řada různých prostředků s kontrolovaným uvolňováním těchto peptidů může být připravena s použitím různých polymerů a/nebo fyzikálních vlastností kombinace peptidů a polymeru. Nicméně tyto variace umožňují prostředky s ekvivalentními biologickými vlastnostmi a jsou považovány za takové, že spadají do rámce předkládaného vynálezu, jak je definováno v následujících patentových nárocích.

	• ·	• to	• to	····		toto	«
	« ·	• > to		•	•	•	··
	•		« ·	•	•	•	•	•
14	•	•	to toto	«	to ·	to	•	•
•	•	• ·	•	•	•	•	•
to ·	····	··	•		» to	• toto

SEQ I.D. No.: 1 až 4 odkazované v příkladu 5 mají následující sekvenci:

CTG	CAG	CTG	CCT	GAA	GGA	C	(1)
GGG	CGG	GGC	GGG	GCT	CTC	G	(2)
ATT	CTA	CTG	ACT	TGG	TGC	GTG	(3)
GGA	ATA	TGT	GCA	ACT	TGG	TGT	(4)

• · • · · · ·· · ···· • · ···· · ·· • · ··*·· · · ·« ··· ··· · ·· •· ···· ·· · ·· ···

Claims

1. Farmaceutický prostředek pro kontrolované uvolňování léčebného peptidu nebo solí tohoto peptidu vyznačující se tím, že peptid má sekvenci pyroGlu-His-T rp- S er-Xaa¹ -Gly-Xaa²-Xaa³ -Pro-Gly-NH₂ kde Xaa¹ je His nebo Tyr,

Xaa²je Trp nebo Leu, a

Xaa³ je Tyr nebo Arg, což zajišťuje, že když Xaa¹ je Tyr a Xaa² je Leu, pak Xaa'' není Arg, a kde tento prostředek dále zahrnuje farmaceuticky akceptovatelný biodegradovatelný polymer.

2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že peptidem je pyroGlu-His-Trp-Ser-His-Gly-Trp-Tyr-Pro-Gly-NH₂.

3. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že polymerem je polymer hydroxy derivátů karboxylových kyselin nebo kopolymer takovýchto derivátů.

4. Farmaceutický prostředek podle nároku 3 vyznačující se tím, že polymerem je polymer glykolové kyseliny, polymer mléčné kyseliny nebo kopolymer kyselin mléčné a glykolové.

5. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 vyznačující se tím, že peptid je obalen mikro-obalem polymeru.

6. Způsob léčby lidského zdravotního stavu vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje podávání léčebně účinného množství prostředku s kontrolovaným uvolňováním peptidu podle jakéhokoliv z předchozích nároků osobě, která potřebuje takovouto léčbu.

7. Farmaceutický prostředek podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že tento prostředek je určen pro léčbu nebo pro ochranu před poruchami růstu kostí nebo růstu předstojné žlázy.

·· ♦ · · · · · · · · · · ···· ·· · ···· ·· ···· · · · ♦ · ♦···· · · · · „ ·········

I * ········»«····

8. Použití peptidu nebo jeho solí, jak je definováno v nárocích 1 nebo 2, společně s farmaceuticky akceptovatelným biodegradovatelným polymerem vyznačují se tím, že je určen pro přípravu léku s kontrolovaným uvolňováním pro léčbu nebo ochranu před poruchami růstu kostí nebo růstu předstojné žlázy.

9. Použití podle nároku 8 vyznačující se tím, že zmíněný polymer je polymerem hydroxy derivátů karboxylových kyselin nebo kopolymerem takovýchto derivátů nebo je polymerem glykolové kyseliny, polymerem mléčné kyseliny nebo kopolymerem kyselin mléčné a glykolové.

10. Použití podle nároků 8 a 9 vyznačující se tím, že zmíněné poruchy jsou vybrány z s věkem spojené osteoporózy, osteoporózy spojené s post-menopausálním hormonálním stavem, primární a sekundární hyperparatyreózu, nepoužívanou osteoporózu, osteoporózu spojenou s cukrovkou, osteoporózou spojenou s glukokortikoidy, benigní hyperplazie prostaty a rakoviny prostaty.

11. Farmaceutický prostředek podle nároku 7 vyznačující se tím, že je určen pro léčbu nebo ochranu před zmíněnými poruchami vybranými z s věkem spojené osteoporózy, osteoporózy spojené s post-menopausálním hormonálním stavem, primární a sekundární hyperparatyreózu, nepoužívanou osteoporózu, osteoporózu spojenou s cukrovkou, osteoporózou spojenou s glukokortikoidy, benigní hyperplazie prostaty a rakoviny prostaty.

12. Způsob léčby nebo ochrany před lidskými poruchami růstu kostí nebo růstu předstojné žlázy vyznačující se tím, že zahrnuje způsob podávání léčebně účinného množství prostředku podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5 osobě, která potřebuje takovouto léčbu.

13. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že zmíněné poruchy jsou vybrány z s věkem spojené osteoporózy, osteoporózy spojené s post-menopausálním hormonálním stavem, primární a sekundární hyperparatyreózu, nepoužívanou osteoporózu, osteoporózu spojenou s cukrovkou, osteoporózou spojenou s glukokortikoidy, benigní hyperplazie prostaty a rakoviny prostaty.