JP2021506969A

JP2021506969A - アトピー性皮膚炎、脱毛、傷または皮膚しわ改善用化粧料組成物および薬学組成物

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Publication number: JP2021506969A
Application number: JP2020552653A
Authority: JP
Inventors: オー，チャン・テク; リム，ミン・ジュ; キム，チョム・ヨン; パク，ソン・キュ; リー，ジョン・フン; チャン，ミン・ジュン; キム，ス・エ; リム，ス・ファン; キム，ボム・ジュン; バク，ドン・ホ; クォン，テ・リン; ナ，ジュン・テ
Original assignee: Green Cross Wellbeing Corp
Current assignee: GC Wellbeing Corp
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2021-02-22
Also published as: EP3725296A4; WO2019117633A1; EP3725296A1; CN111712227A; US20200384082A1; KR102014467B1; KR20190071432A

Abstract

【課題】アトピー性皮膚炎、脱毛、傷または皮膚しわ改善用化粧料組成物および薬学組成物を提供する。【解決手段】ナチュラルキラー細胞の分泌物を含むアトピー性皮膚炎、脱毛、傷または皮膚しわ改善用化粧料組成物および薬学組成物。【選択図】図８

Description

本発明は、アトピー性皮膚炎、脱毛、傷または皮膚しわ改善用化粧料組成物および薬学組成物に関する。

免疫システムを構成する細胞の中で、特にナチュラルキラー細胞（natural killer cell；ＮＫ細胞）は、抗原による事前感作なしで腫瘍細胞、バクテリア、細胞内寄生生物またはウイルスに感染した宿主細胞を除去する機能を果たし、不適切な骨髄移植を拒否し、Ｔ細胞の免疫反応を調節するなど、生体内の免疫系の防御機構の第一線で働く行動細胞である。

このＮＫ細胞は、その様々な機能の中でも特に癌細胞を選択的に殺傷する能力を有することが判明し、多くの関連研究が行われている。癌患者の場合には、末梢血のＮＫ細胞の数や活性が健常者よりも低下しており、動物実験ではＮＫ細胞活性が低下すると癌発生及び癌転移のリスクが増加することが示された。

また、ＮＫ細胞は、宿主に感染した病原菌又は癌細胞に対抗するための先天性免疫反応と、サイトカインの分泌による後天性免疫反応に重要な役割を果たす。ＮＫ細胞が標的細胞の殺傷に使用する主なメカニズムは、パーフォリン（perforin）及びグランザイムＢ（granzyme B）のような細胞障害性顆粒を免疫シナプスにより標的細胞に分泌することである。分泌されたパーフォリンは標的細胞壁に穴をあけ、穴を介して標的細胞内に入ったグランザイムが標的細胞の細胞死（apoptosis）を誘導する。

このように、ＮＫ細胞は、細胞が悪性に変化する発癌過程や、ウイルス感染初期の防御機構で決定的な役割を果たすことが確認されたが、前記ＮＫ細胞そのものではない、その分泌物質などに関する研究、その新たな用途などに関する研究は不十分な状況にある。

本発明は、アトピー性皮膚炎、脱毛、傷または皮膚しわ改善用化粧料組成物を提供することを目的とする。

また、本発明は、アトピー性皮膚炎、脱毛、傷または皮膚しわの予防又は治療用薬学組成物を提供することを目的とする。

１．ナチュラルキラー細胞の分泌物を含むアトピー性皮膚炎、脱毛、傷または皮膚しわ改善用化粧料組成物。

２．前記項目１において、前記ナチュラルキラー細胞の分泌物は、ＩＬ−２、ＴＩＭＰ２、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ及びＩＬ−１０からなる群より選択される少なくとも一つを含む組成物。

３．前記項目１において、前記ナチュラルキラー細胞の分泌物は、ナチュラルキラー細胞を培養し、それを分離精製し、残存する培養液から得られたものである組成物。

４．前記項目３において、前記培養は、播種細胞を支持細胞、支持細胞刺激因子および成長因子を含む培地中で培養することである組成物。

５．前記項目４において、前記播種細胞は、ナチュラルキラー細胞に分化できるヒト由来の細胞である組成物。

６．前記項目５において、前記ヒト由来の細胞は、末梢血、末梢血白血球細胞、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、濃縮された（enriched）ナチュラルキラー細胞、分離されたナチュラルキラー細胞、臍帯血、造血幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群より選択される少なくとも一つである組成物。

７．前記項目４において、前記成長因子は、インターロイキンである組成物。
８．ナチュラルキラー細胞の分泌物を含むアトピー性皮膚炎、脱毛、傷または皮膚しわ改善用薬学組成物。

９．前記項目８において、前記ナチュラルキラー細胞の分泌物は、ＩＬ−２、ＴＩＭＰ２、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡ及びＩＬ−１０からなる群より選択される少なくとも一つを含む組成物。

１０．前記項目８において、前記ナチュラルキラー細胞の分泌物は、ナチュラルキラー細胞を培養し、それを分離精製し、残存する培養液から得られたものである組成物。

１１．前記項目１０において、前記培養は、播種細胞を支持細胞、支持細胞刺激因子および成長因子を含む培地中で培養することである組成物。

１２．前記項目１１において、前記播種細胞はナチュラルキラー細胞に分化できるヒト由来の細胞である組成物。

１３．前記項目１２において、前記ヒト由来の細胞は、末梢血、末梢血白血球細胞、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、濃縮された（enriched）ナチュラルキラー細胞、分離されたナチュラルキラー細胞、臍帯血、造血幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群より選択される少なくとも一つである組成物。

１４．前記項目１１において、前記成長因子は、インターロイキンである組成物。

本発明に係る分泌物は、アトピー性皮膚炎、脱毛、傷または皮膚しわの改善に関連する様々な因子の増加、発現レベルの向上効果に優れる。これにより、それを含む本発明の化粧料組成物は、前記症状の改善効果に優れ、薬学組成物は、前記疾患の予防または治療効果に優れる。

図１は、ＮＫ−ＣＭとＮＫ培地の繊維芽細胞増殖能の差の評価結果である。図２は、ＮＫ−ＣＭのＨＤＦ−Ｎ細胞の細胞移動能、細胞増殖能の評価結果である。図３は、ＮＫ−ＣＭのコラーゲン生成能の評価結果である。図４は、ＮＫ−ＣＭ処理による角質形成細胞の細胞生存率の確認結果である。図５は、ＮＫ−ＣＭ処理による外根鞘細胞（ＯＲＳ）の細胞生存率の確認結果である。図６は、ＨａＣａＴ細胞内親炎症性サイトカインの発現とＮＫ−ＣＭとの関係を示すものである。図７は、ＨＭＣ−１細胞内親炎症性サイトカインの発現とＮＫ−ＣＭとの関係を示すものである。図８は、ＮＫ conditioned−medium（ＮＫ−ＣＭ）の成分分析結果である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のアトピー性皮膚炎、脱毛、傷または皮膚しわ改善用化粧料組成物は、ナチュラルキラー細胞の分泌物を含む。

ナチュラルキラー細胞（Natural killer cell、NK cell）は、免疫反応の一翼を担うリンパ球系細胞で、健常者の血液中に約１０〜１５％ほど存在し、非自己（nonself）と反応したときに高い殺傷能を有する。各種のウイルスに感染した細胞や細菌の浸透、あるいは異常な細胞の生成において、ＮＫ細胞は非特異的にすぐに反応して異物を除去する。このことから、ナチュラルキラー細胞は、免疫抗癌剤としての適用のために研究されている。

ところで、本発明者らは、前記ナチュラルキラー細胞そのものではなく、ナチュラルキラー細胞の分泌物が、前記用途とは異なるアトピー性皮膚炎、脱毛、傷または皮膚しわの改善に効果があることを発見し、本発明を考案した。

本発明に係るナチュラルキラー細胞の分泌物は、ＩＬ−２（interleukin−2）、ＴＩＭＰ２（metallopeptidase inhibitor 2）、ＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（platelet−derived growth factor−AA）及びＩＬ−１０（interleukin−10）からなる群より選択される少なくとも一つを含むことができる。

本発明に係るナチュラルキラー細胞の分泌物に含まれる前記成分のうち、ＩＬ−２、ＴＩＭＰ２は、しわの改善に関連する因子、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡは、脱毛の改善に関連する因子、ＩＬ−２、ＩＬ−１０は、アトピーの改善に関連する因子である。

本発明に係るナチュラルキラー細胞の分泌物は、例えば、ナチュラルキラー細胞を培養し、それを分離精製し、残存する培養液から得ることができ、残存する培養液そのものを使用することもできるが、これらに限定されるものではない。

以下の動物細胞培養培地及び下記成分は、通常、細胞の成長に役立つ成分、細胞を安定化させる成分であり、これは、細胞の成長に影響を与える。これらの成分が変わると、細胞の成長程度が変わり得るが、細胞の分泌成分はその影響を受けない。下記例は、一実施形態に過ぎず、それに制限されるものではない。

ナチュラルキラー細胞の培養には、当分野で公知の通常の動物細胞培養培地を制限なく使用することができ、例えば、ＣｅｌｌＧｒｏ培地（Cellgenix）、ＡＩＭ−Ｖ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＸＶＩＶＯ２０、ＲＰＭＩ１６４０などが挙げられる。

ナチュラルキラー細胞の培養は、播種細胞を培養してナチュラルキラー細胞を得ること、又はナチュラルキラー細胞を培養することを含むことができる。

播種細胞（seed cell）は、適切な培養によりナチュラルキラー細胞に増殖できる細胞を意味し、具体的には、ナチュラルキラー細胞に分化できるヒト由来の細胞であってもよい。例えば、末梢血、末梢血白血球細胞、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、濃縮された（enriched）ナチュラルキラー細胞、分離されたナチュラルキラー細胞、臍帯血、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞からなる群より選択される一つ以上を使用できるが、これらに限定されるものではない。

播種細胞の培養は、ナチュラルキラー細胞の培養を促進するための成分をさらに含む培地で行われてもよい。

前記培養促進のための成分は、例えば支持細胞、支持細胞刺激因子、成長因子等であってもよい。

支持細胞とは、分裂増殖ができないようにしたが、代謝活性があるため、様々な代謝物質を生産して目的のナチュラルキラー細胞の増殖を助ける細胞である。

支持細胞（feeder cell）としては、ナチュラルキラー細胞の増殖を助けるものであれば制限なく使用可能であり、例えば、遺伝子が導入された動物細胞株（cell line）や、各種のサイトカインや化合物が処理された末梢血白血球細胞（ＰＢＬ）、自己又は他人の末梢血白血球細胞（ＰＢＬ）、Ｔ−ｃｅｌｌ、Ｂ−ｃｅｌｌ、単核球（monocyte）、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞等が挙げられ、具体例としては、自己末梢血白血球細胞（ＰＢＬ）及びＣＤ４（＋）Ｔ細胞の少なくとも一つを使用できるが、これらに限定されるものではない。

支持細胞は、不活性化して使用することにより安全性を確保できる。不活性化の方法としては、当分野で公知の通常の方法を用いてもよく、例えば、ガンマ線（gamma−ray）を照射する方法を用いることができる。このような不活性化した支持細胞（feeder cell）は、分離されたＴ−細胞（purified T cell）を含む。

支持細胞刺激因子としては、例えば抗−ＣＤ３抗体を使用することができる。
抗−ＣＤ３抗体とは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と結合して抗原認識複合体を形成する分子群であるＣＤ３抗原に特異的に結合する抗体であり、ＣＤ３分子はＴＣＲと結合して抗原認識信号を細胞内に伝える役割を担当する。

本発明で使用可能な抗−ＣＤ３抗体は、ＣＤ３に結合する特性を有する抗体であれば制限されず、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１及びＨＩＴ３ａからなる群より選択されるものが望ましいが、これらに限定されない。抗−ＣＤ３抗体は、例えば０．１〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲で含むことができるが、これに限定されるものではない。

成長因子としては、例えばサイトカインが挙げられる。
サイトカインは、成長因子であり、インターロイキン類から選択される一つ以上のものが望ましいが、これに限定されるものではない。

インターロイキンは、リンパ球や単球及びマクロファージなどの免疫担当細胞が生産するタンパク質性の生物活性物質の総称で、インターロイキンとしては、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）及びインターロイキン−２１（ＩＬ−２１）からなる群より選択される１つ以上を使用することが好ましく、特にＩＬ−２を使用することが好ましいが、これに限定されるものではない。本発明に属する技術分野における通常の知識を有する者にとって、他のサイトカインも本発明の目的に合致する限り制限なく利用可能なことは自明である。サイトカインは、例えば１０〜２０００Ｕ／ｍｌの範囲で含むことができるが、これに限定されるものではない。

また、ここに血清または血漿とリンパ球の増殖を支持する追加の増殖因子を添加して培養してもよい。培地に添加する血清または血漿の種類は特に限定されず、市販の各種動物由来のものを使用できるが、ヒト由来として本人由来のものがより好ましい。例えば、ＰＢＭＣからリンパ球を増殖させるサイトカインの組み合わせや、リンパ球の増殖を刺激するレクチン類などを添加するなど、当業者に知られている方法を用いることができる。

また、培地は血清または血漿とリンパ球の増殖を支持する追加の増殖因子をさらに含んでいてもよく、血清または血漿そのものを含んでいてもよい。培地に添加する血清または血漿の種類は特に限定されず、市販の各種動物由来のものを使用できるが、ヒト由来として本人由来のものが好ましく、例えば、ヒトＡＢ血清（Human AB serum）又は自己血漿（auto plasma）であってもよい。

本発明に係る分泌物を含む化粧料組成物の場合、前記有効成分に加えて、化粧料組成物に通常使用される成分を含むことができ、例えば抗酸化剤、安定化剤、可溶化剤、ビタミン、顔料及び香料などの通常の助剤、そして担体を含む。

本発明の化粧料組成物は、当分野で通常製造される如何なる剤形にも製造可能であり、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、パック、マッサージクリーム及びスプレーなどに剤形化できるが、これらに限定されるものではない。より詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー又はパウダーの剤形に製造することができる。

本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などを用いることができる。

本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、可溶化剤または油濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、またはソルビタンの脂肪酸エステルがある。

本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天またはトラカントなどを用いることができる。

本発明の剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーが用いられ、特にスプレーである場合には、さらにクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含むことができる。

本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどを用いることができる。

本発明の化粧料組成物が石鹸、界面活性剤含有クレンジング剤形または界面活性剤非含有クレンジング剤形である場合には、皮膚に塗布したあと、拭き取ったり、取り外したり、水で洗い流したりすることもできる。具体的には、前記石鹸としては、液状石鹸、粉石鹸、固形石鹸及びオイル石鹸があり、前記界面活性剤含有クレンジング剤形としては、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、クレンジングタオル及びクレンジングパックがあり、前記界面活性剤非含有クレンジング剤形としては、クレンジングクリーム、クレンジングローション、クレンジングウォーター及びクレンジングゲルがあるが、これらに限定されるものではない。

また、本発明は、ナチュラルキラー細胞の分泌物を含むアトピー性皮膚炎、脱毛、傷または皮膚しわ改善用薬学組成物を提供する。

ナチュラルキラー細胞の分泌物は、前述した範囲内のものであってもよい。
本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含み、退行性神経疾患の予防及び治療用の医薬製剤に製剤化することができる。

前記担体、賦形剤および希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート及び鉱物油が挙げられる。

本発明の薬学組成物は、医薬製剤に製造するために、通常の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤、または滅菌注射溶液の剤形に製剤化することができる。一般的に、製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、そのような固形製剤は、前記薬学組成物に、少なくとも１以上の賦形剤、例えば、澱粉、カルシウムカーボネート、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調製することができる。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用できる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、耐溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、一般的に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、さまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用される。坐剤の基剤としては、ウィテプゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイーン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用できる。

本発明の薬学組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重によって異なるが、一般的には０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの量、好ましくは１〜３０ｍｇ／ｋｇの量を１日１回ないし数回に分けて投与することができる。また、その投与量は、投与経路、疾患の程度、性別、体重、年齢、健康状態、食物、投与時間、投与方法、排泄率などによっても増減する。したがって、前記投与量は、どのような局面でも本発明の範囲を限定するものではない。

本発明の薬学組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路で投与することができる。投与のすべての方式は予想可能であり、例えば、皮膚塗布、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内注射によって投与することができる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明することとする。
実施例．ナチュラルキラー細胞の分泌物の取得
１．ナチュラルキラー細胞の分泌物の取得
１−１．ＣＤ３（−）ＰＢＭＣ播種細胞の用意
健康ドナーから採取したＰＢＭＣにＰＢＳ（phosphate buffered saline、LONZA、17−516Q）を１：１の割合で加え、１５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。ＰＢＭＣペレットを１０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬでＭＡＣＳランニングバッファ（running buffer、２％ＦＢＳと２ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に懸濁し、自動細胞計数装置を用いて細胞数を測定した。

ＣＤ３（＋）細胞を除去した（depletion）播種細胞を得るために、５〜１０×１０^７ｃｅｌｌｓを５０ｍＬチューブに移した後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。５〜１０×１０^７ｃｅｌｌｓのＰＢＭＣ細胞に４００〜８００μＬのＭＡＣＳランニングバッファと１００〜２００μＬのＣＤ３磁気ビーズ（Miltenyi biotech、130050101）を入れ、４℃で２０分間反応した。１０倍以上のＭＡＣＳランニングバッファを入れて洗浄した後、１３５０ｒｐｍ、４℃で７分間遠心分離し、最終的に１〜２ｍＬのＭＡＣＳランニングバッファに懸濁した。ＶａｒｉｏＭＡＣＳ（Miltenyi Biotech）にＣＳカラム（column、Miltenyi Biotech、130‐041‐305）を取り付けて細胞を分離し、カラムを３回洗浄して細胞を回収した。自動細胞計数装置を用いて細胞数を測定した。細胞は、凍結培地に懸濁し、１バイアル（vial）あたり１〜２×１０^７ｃｅｌｌｓを凍結して液体窒素に保管した。

培養開始日に凍らせておいたＣＤ３（−）ＰＢＭＣを３７度の水槽で解凍して５０ｍＬチューブに移し、０．６％ＡＣＤ（Citrate−dextrose solution、Sigma−Aldrich、C3821）、０．２％ＦＢＳ（Fetal serum bovine）と２ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ACD−A PBS buffer）で１０倍懸濁し、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。ＣＤ３（−）ＰＢＭＣをＣｅｌｌＧｒｏＳＣＧＭ培地（Cellgenix、20802‐0500）に懸濁し、細胞数を測定した。ＣＤ３（−）ＰＢＭＣ播種細胞を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに合わせてＣｅｌｌＧｒｏＳＣＧＭ培地に懸濁した。

１−２．支持細胞の用意
末梢血ＰＢＭＣ支持細胞は、ＰＢＳ（phosphate buffered saline、LONZA、17‐516Q）を１：１の割合で加え、１５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。ＰＢＭＣペレットを１０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬでＭＡＣＳランニングバッファ（running buffer、２％ＦＢＳと２ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に懸濁し、自動細胞計数装置を用いて細胞数を測定した。ＰＢＭＣ支持細胞は、凍結培地に懸濁し、１バイアル（vial）あたり１×１０^８ｃｅｌｌｓを凍結して液体窒素に保管した。

培養開始日に凍らせておいたＰＢＭＣ支持細胞を３７℃の水槽で解凍して５０ｍＬチューブに移し、１０倍のＡＣＤ−ＡＰＢＳバッファで懸濁した後、１２００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。細胞数を測定した後、ＣｅｌｌＧｒｏＳＣＧＭ培地で５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで懸濁し、ガンマ線照射装置で２０００ｃＧｙで照射して不活性化する。

１−３．ナチュラルキラー細胞の培養および培養液の回収
ナチュラルキラー細胞の培養時、ＣｅｌｌｇｒｏＳＣＧＭ培地に５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（Proleukin Injection、韓国ノバルティス）、１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３（eBioscience、16‐0037‐85）と１〜２％ドナー血漿を入れて培養培地を用意する。培養０日目にＣＤ３（−）ＰＢＭＣ播種細胞とガンマ線照射された支持細胞とを１：５の割合で混ぜた後、総細胞数を基準に２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで細胞濃度を合わせて、３７℃のインキュベーターで４〜５日間静置培養した。

培養４〜５日目に同量の培養培地（ＣｅｌｌｇｒｏＳＣＧＭ＋５００ＩＵＩＬ−２＋１体積％ドナー血漿）を入れ、さらに２〜３日間静置培養した。培養７日目に培養０日目と同様な方法で培養中の細胞を１：５の割合の支持細胞株、５００ＩＵ／ｍＬＩＬ−２、１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３、そして１体積％ドナー血漿を入れ、総細胞数を基準に１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで細胞濃度を合わせて再刺激を行った後、３日間静置培養した。その後、２〜３日間隔で細胞数を測定し、０．５〜１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように培養培地を追加して２０〜２１日まで培養した。

培養２０〜２１日に培養中の細胞を１Ｌ遠心分離用チューブに移した後、１５００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。遠心分離後に上層液を回収し、それをＮＫｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ−ｍｅｄｉａと命名した。

そして、前記ＣｅｌｌｇｒｏＳＣＧＭ培地に５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（Proleukin Injection、韓国ノバルティス）、１０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３（eBioscience、16‐0037‐85）と１〜２％ドナー血漿を加えた培養培地をＮＫ細胞培地と命名した。

実験例１．ＮＫ−ＣＭの細胞増殖能の評価
ヒト繊維芽細胞におけるＮＫ細胞培地とＮＫ−ＣＭの増殖能の差異を評価するために、セルカウンティングキット−８（ＣＣＫ−８）を用いて細胞増殖能を測定した。

単一細胞で懸濁されているヒト繊維芽細胞（ＨＤＦ−Ｎ）を９６ウェルプレートに５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌを分注し、３７℃で培養した。その後、２４時間飢餓状態を維持した後、ＮＫ細胞培地とＮＫ−ＣＭを処理して２４、４８時間追加培養した。細胞の増殖能を測定するために、セルカウンティングキット−８反応液をｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが除外された培地に１／１０希釈し、それを各ウェル当たり１００μＬずつ処理して１時間反応させた後、ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Model 680、BIO−RAD）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度で測定した。陽性対照群として、１０％ＦＢＳが添加された培地を使用した。各群の細胞増殖率はＮＫ細胞培地（Ｍ）と比較して百分率（％）で計算した。その結果を図１に示す。

図１に示すように、２４時間でＮＫ−ＣＭの場合、ＮＫ細胞培地と比較して全ての濃度において相対的に高い増殖能を示し、濃度依存的に増加した。４８時間でＮＫ−ＣＭの場合、ＮＫ細胞培地と比較して２．５％の濃度では差異がなかったが、５％の濃度では７％、１０％の濃度では最大３７％増殖能が増加することを確認することができた。これは、ＮＫ細胞培地よりもＮＫ−ＣＭの方が細胞にさらに高い増殖効果を有することを意味する。

実験例２．ＮＫ−ＣＭの細胞増殖能の評価
ヒト繊維芽細胞におけるＮＫ−ＣＭの細胞移動能及び傷の回復能を評価するために、セルスクラッチアッセイ（Cell scratch assay）方法を用いて測定した。

ＨＤＦ−Ｎ細胞を１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｉｎｓｅｒｔｓで６０ｍｍｄｉｓｈの底のｉｂｉｄｉカルチャーインサート（μ−Dish 35mm、high Culture−Inserts； Thistle Scientific Ltd、UK）中に分注したあと、細胞培養条件で２４時間培養した。その後、チャンバー（chamber）を除去し、試料を適当な濃度で培地に希釈した後に細胞に処理し、細胞培養条件で４８時間追加培養した。２４、４８時間後、電子顕微鏡（Eclipse TS100、Nikon Instruments Inc.、NY、USA）により細胞の移動能を撮影した。

図２（Ａ）に示すように、２４、４８時間で対照群と比較して、ＮＫ−ＣＭ処理群において、濃度が増加するほど細胞移動能および傷の回復能が大幅に増加することを確認した。

ＮＫ−ＣＭの増殖能を評価するために、ＨＤＦ−Ｎ細胞に２．５、５、１０％で処理した後、２４、４８時間でセルカウンティングキット−８（ＣＣＫ−８）を用いて測定した。

図２（Ｂ）、（Ｃ）に示すように、２４、４８時間においてＮＫ−ＣＭ処理群と対照群を比較して、細胞増殖能が濃度依存的に増加することを確認した。特に最高濃度であるＮＫ−ＣＭ１０％の場合には、２４時間で最大１．６倍、４８時間で２倍増加する結果が得られた。これは、ＮＫ−ＣＭがＨＤＦ−Ｎ細胞の移動能および傷の回復能を増加させ、細胞の増殖能を向上させることにより、しわ改善効果があることを意味する。

実験例３．ＮＫ−ＣＭのコラーゲン生成能の評価
ＮＫ−ＣＭのプロコラーゲン（procollagen）合成能を調べるために、毒性を示さない濃度２．５、５、１０％で処理した後、２４時間でプロコラーゲンの合成能を評価した。

ＨＤＦ−Ｎ細胞を２４ウェルプレートに２．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注し、２４時間培養した。その後、培地を除去し、２４時間の間に細胞の飢餓状態を維持した後、ＮＫ−ＣＭをメディアサプリメント（media supplement）のない培地に希釈して細胞に処理した。２４時間後、培養された細胞の培地を回収し、プロコラーゲンｔｙｐｅ−１ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＩＰ）ＥＩＡｋｉｔ（TAKARA、MK101）を用いてプロコラーゲンの量を測定した。底に付着している細胞は、１ＮＮａＯＨで溶解して総タンパク質量を測定し、一定のタンパク質あたりのプロコラーゲン合成量を求めた。各群は、ＮＫ細胞培地（Ｍ）と比較して百分率（％）で計算した。その結果を図３（Ａ）に示す。

図３（Ａ）に示すように、陽性対照群として使用したＴＧＦ−β（１０ｎＭ）を処理した場合、対照群に比べてプロコラーゲンの合成が１．７倍増加した。ＮＫ培養液を処理したとき、対照群と比較してプロコラーゲンの合成がすべての濃度において約３．４倍増加し、統計的に有意な結果が得られた。

ヒト繊維芽細胞において、ＮＫ細胞培養液を用いて、ウェスタンブロット（Western blot）分析法によりコラーゲンタンパク質の発現変化を測定した。

ＨＤＦ−Ｎ細胞を１００ｍｍプレートに２．０×１０^６ｃｅｌｌｓで分注し、２４時間培養した。その後、培地を除去し、２４時間の間に細胞の飢餓状態を維持した後、試験物質をメディアサプリメントのない培地に希釈して細胞に処理した。２４時間培養後に培地を除去し、ＤＰＢＳで洗浄した後、ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒを用いて細胞を溶解し、１２，０００ｒｐｍで４℃で２０分間遠心分離して得られた上澄液でタンパク質を定量した。定量したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動した後、ＰＶＤＦメンブレン（membrane）でゲル（gel）のタンパク質をブロッティングした。５％ＢＳＡでブロッキング（blocking）した後、１次抗体と４℃で２４時間反応させ、２次抗体を１時間反応させた。その後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝溶液で１０分間３回洗浄し、ＥＣＬｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて、タンパク質の発現程度を確認した。その結果を図３（Ｂ）に示す。

図３（Ｂ）に示すように、対照群と比較してＮＫ−ＣＭ処理群でコラーゲンＩ、ＩＩＩの発現が効果的に増加することを確認した。これはＮＫ−ＣＭがヒト繊維芽細胞のコラーゲンの合成及び発現を誘導し、しわ改善効果があることを意味する。

実験例４．ＮＫ−ＣＭ処理による角質形成細胞の細胞生存率の確認
細胞生存率の測定方法の１つであるセルカウンティングキット−８（ＣＣＫ−８）を用いて、一般的な状況における角質形成細胞に対するＮＫ−ＣＭの効果を確認した。

単一細胞で懸濁されているＨａＣａＴ細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり１×１０^４個の細胞をシーディング（seeding）した後、３７℃で２４時間、ＣＯ_２培養器中で培養した。培養後、それぞれを次のように処理した：細胞培養液１００ｕＬを基準に１００％ＮＫ−ＣＭ添加量を最高濃度に設定し、１／２希釈で最終的に１２８倍希釈した濃度までＨａＣａＴ細胞に２４時間処理した。次に、ＣＣＫ−８溶液を各々の濃度でＮＫ−ＣＭ処理されたＨａＣａＴ培地と１:１０の割合で希釈した後、３７℃で１時間、ＣＯ_２培養器中で培養した。

その後、分光光度計（spectrophotometer）を用いて波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。このとき、リファレンス（reference）は４５０ｎｍとした。各群の細胞生存率は、対照群（Ｃｏｎ）と比較して百分率（％）で計算した。その結果を図４に示す。

ＮＫ−ＣＭによるＨａＣａＴ細胞の死滅を測定した結果、濃度が増加するほど細胞生存率が増加することを確認した。これは、ＮＫ−ＣＭが１００％まで細胞に対する毒性がなく、細胞成長効果を持つことを意味する。

実験例５．ＮＫ−ＣＭ処理による外根鞘細胞（ＯＲＳ）の細胞生存率の確認
細胞生存率の測定方法の１つであるセルカウンティングキット−８（ＣＣＫ−８）を用いて、一般的な状況における角質形成細胞に対するＮＫ−ＣＭの効果を確認した。

単一細胞で懸濁されているＯＲＳ細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり１×１０^４個の細胞をシーディング（seeding）した後、３７℃で２４時間、ＣＯ_２培養器中で培養した。培養後、それぞれを次のように処理した：細胞培養液１００ｕＬを基準に１００％ＮＫ−ＣＭ添加量を最高濃度に設定し、１／２希釈で最終的に４倍希釈した濃度までＯＲＳ細胞に２４時間処理した。次に、ＣＣＫ−８溶液を各々の濃度でＮＫ−ＣＭ処理されたＯＲＳ培地と１:１０の割合で希釈した後、３７℃で１時間、ＣＯ_２培養器中で培養した。

その後、分光光度計（spectrophotometer）を用いて波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。このとき、リファレンス（reference）は４５０ｎｍとした。各群の細胞生存率は、対照群（Ｃｏｎ）と比較して百分率（％）で計算した。その結果を図５に示す。

ＮＫ−ＣＭによるＯＲＳ細胞の死滅を測定した結果、濃度が増加するほど細胞生存率が増加することを確認した。これは、ＮＫ−ＣＭが１００％まで細胞に対する毒性がなく、結論として、毛包組織の主要な構成細胞の１つである外根鞘細胞の成長に役立つことを意味する。

実験例６．ＨａＣａＴ細胞内親炎症性サイトカインの発現とＮＫ−ＣＭ処理との関係
ＲＴ−ＰＣＲ（Real time−Polymerase Chain Reaction）を用いて、細胞内親炎症性サイトカインの分泌に関与するメッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA、mRNA）の発現量を測定することにより、炎症誘発状況におけるＮＫ−ＣＭの役割を確認した。

ＨａＣａＴ細胞を１２−ウェルプレートにウェル当たり１×１０^５細胞をシーディングした後、ＮＫ−ＣＭ５０％または１００％を２時間処理した。親炎症性サイトカインの発現を増加させて炎症状態を誘導するために、組換えタンパク質ＴＮＦ−ａｌｐｈａ（５０ｎｇ／ｍＬ）を２４時間処理した。その後、試薬が含まれている全ての培地をウォッシュアウトした後、１ｍＬＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＲＮＡ分離試薬（Invitrogen、USA）と混合した。前記混合溶液を氷上で３０分間インキュベートした後、４００μＬのｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ１をそれぞれ加えて５分間反応した。１６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上層透明液を分離して入れた後、イソプロピルアルコールを上層液と同量添加して５分間反応した後、１６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿分離されたパレット（palette）を７０％アルコールを添加して３回洗浄した。最後に、４時間乾燥した後、Ｐｕｒｉｆｉｅｄｗａｔｅｒ５０ｕＬに希釈してｍＲＮＡサンプルを得た。

得られたサンプルは、PrimeScriptTM RT master mix（Takara、Japan）を用いて合成された二本鎖ＤＮＡ（cDNA）で構成された。ｍＲＮＡサンプル２０ｕＬに5X PrimeScriptTM RT master mix ５ｕＬを加え、３７℃で２０分、８５℃で１０秒間加熱し、合成されたＤＮＡ二重らせん構造を得た。

特定の遺伝子の増幅には、ＣＦＸ−９６（Bio−Rad、USA）を用いた。すべての遺伝子を増幅するのに用いられるＰＣＲ条件は、９５℃で１０分、９５℃で３０秒、６０℃で１５秒を４０サイクルで行った。発現データは、定量化の方法であるΔＣｔを用いてサイクル閾値（Ｃｔ）から算出した。ＧＡＰＤＨを用いて、それぞれ標準化を実施した。対照群に対して相対値で表記した。その結果を図６に示す。

図６に示すように、ＴＮＦ−ａｌｐｈａが処理された集団において、親炎症性サイトカインの一種であるＴＳＬＰ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ＩＬ−８、ＩＬ−１７ａとＩＬ−３１のｍＲＮＡレベルが大幅に高くなった。これは、ＴＮＦ−ａｌｐｈａの細胞処理は、一般状態の集団に比べて炎症性サイトカインの発現を増加させることを意味する。しかし、ＮＫ−ＣＭが５０％または１００％処理された集団では、親炎症性サイトカインの発現量を大幅に減少させる結果が得られた。これはＴＮＦ−ａｌｐｈａによる親炎症性サイトカインの発現の上昇をＮＫ−ＣＭが抑制し、結論としてＮＫ−ＣＭがＨａＣａＴ細胞において抗炎症効果があることを意味する。

実験例７．ＨＭＣ−１細胞内親炎症性サイトカインの発現とＮＫ−ＣＭ処理との関係
ＲＴ−ＰＣＲ（Real time−Polymerase Chain Reaction）を用いて、細胞内親炎症性サイトカインの分泌に関与するメッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA、mRNA）の発現量を測定することにより、炎症状況におけるＮＫ−ＣＭの役割を確認した。

ヒト由来の肥満細胞であるＨＭＣ−１細胞を６ウェルプレートにウェル当たり２×１０^６細胞をシーディングした後、ＮＫ−ＣＭ５０％または１００％を２時間処理した。細胞脱顆粒を誘導して炎症状況を誘導するために、ＰＭＡＣ [PMA（25nM）+ A23187（1uM）]を処理し、１２時間培養した。

試薬が含まれている全ての培地をウォッシュアウトした後、１ｍＬＴＲＩｚｏｌ（登録商標）ＲＮＡ分離試薬（Invitrogen、USA）と混合した。前記混合溶液を氷上で３０分間インキュベートした後、４００μＬのｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ１をそれぞれ加えて５分間反応した。１６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上層透明液を分離して入れた後、イソプロピルアルコールを上層液と同量添加して５分間反応した後、１６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。沈殿分離されたパレット（palette）を７０％アルコールを添加して３回洗浄した。最後に、４時間乾燥した後、Ｐｕｒｉｆｉｅｄｗａｔｅｒ５０ｕＬに希釈してｍＲＮＡサンプルを得た。

特定の遺伝子の増幅には、ＣＦＸ−９６（Bio−Rad、USA）を用いた。すべての遺伝子を増幅するのに用いられるＰＣＲ条件は、９５℃で１０分、９５℃で３０秒、６０℃で１５秒を４０サイクルで行った。発現データは、定量化の方法であるΔＣｔを用いてサイクル閾値（Ｃｔ）から算出した。ＧＡＰＤＨを用いて、それぞれ標準化を実施した。対照群に対して相対値で表記した。その結果を図７に示す。

図７に示すように、ＰＭＡＣが処理された集団において、親炎症性サイトカインの一種であるＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦとＭＣＰ３のｍＲＮＡレベルが大幅に高くなった。これは、ＰＭＡＣの細胞処理は、一般状態の集団に比べて脱顆粒が誘導され、炎症性サイトカインの発現を増加させることを意味する。しかし、ＮＫ−ＣＭが５０％または１００％処理された集団では、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦの３種の親炎症性サイトカインの発現量を大幅に減少させる結果が得られた。さらに、ＭＣＰ３の発現量は、５０％処理では減少しなかったが、高濃度の１００％では大幅に減少したことを確認した。これは、ＰＭＡＣ処理による親炎症性サイトカインの発現がＮＫ−ＣＭ処理によって抑制され、結論として、ＮＫ−ＣＭがＨＭＣ−１の脱顆粒による炎症反応を抑制することにより、抗炎症効果があることを意味する。

実験例８．ＮＫ−ＣＭの成分分析
ＮＫｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ−ｍｅｄｉａ（NK−CM）の成分を分析するために、ｈｕｍａｎＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＡｎｔｉｂｏｄｙＡｒｒａｙＣ１、ｈｕｍａｎｃｙｔｏｋｉｎｅａｒｒａｙＣ５、ｈｕｍａｎｃｈｅｍｏｋｉｎｅａｒｒａｙＣ１ｋｉｔ（Raybiotech、USA）を用いて分析した。

ＮＫ細胞培地とＮＫ−ＣＭを回収し、Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ社が提供する各製品のプロトコル説明方法に基づいて分析を行い、マイクロアレイ（microarray）に基づいた結果を図８にグラフで示す。

図８に示すように、ＮＫ培養液と比較してＮＫ−ＣＭにおいて、アトピー性皮膚炎に関連する因子であるＩＬ−２、ＩＬ−１０が増加したことを確認した。また、毛髪成長に関連する因子であるＰＤＧＦ−ＡＡ、ＶＥＧＦが増加し、傷の回復に関連する因子であるＴＩＭＰ−２の発現レベルが向上したことを確認した。ＮＫ細胞の成長および増殖により培地に排出される様々な因子を含むＮＫ−ＣＭにおいて、アトピー性皮膚炎、毛髪成長および皮膚しわに関する項目が増加したことは、ＮＫ−ＣＭが抗アトピー、脱毛及びしわの改善に貢献できることを意味する。

Claims

ナチュラルキラー細胞の分泌物を含むアトピー性皮膚炎、脱毛、傷または皮膚しわ改善用化粧料組成物。
前記ナチュラルキラー細胞の分泌物は、ＩＬ−２、ＴＩＭＰ２、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＩＬ−１０からなる群より選択される少なくとも一つを含む、請求項１に記載の組成物。
前記ナチュラルキラー細胞の分泌物は、ナチュラルキラー細胞を培養し、それを分離精製し、残存する培養液から得られたものである、請求項１に記載の組成物。
前記培養は、播種細胞を支持細胞、支持細胞刺激因子および成長因子を含む培地中で培養することである、請求項３に記載の組成物。
前記播種細胞は、ナチュラルキラー細胞に分化できるヒト由来の細胞である、請求項４に記載の組成物。
前記ヒト由来の細胞は、末梢血、末梢血白血球細胞、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、濃縮された（enriched）ナチュラルキラー細胞、分離されたナチュラルキラー細胞、臍帯血、造血幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項５に記載の組成物。
前記成長因子は、インターロイキンである、請求項４に記載の組成物。
ナチュラルキラー細胞の分泌物を含むアトピー性皮膚炎、脱毛、傷または皮膚しわ改善用薬学組成物。
前記ナチュラルキラー細胞の分泌物は、ＩＬ−２、ＴＩＭＰ２、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＩＬ−１０からなる群より選択される少なくとも一つを含む、請求項８に記載の組成物。
前記ナチュラルキラー細胞の分泌物は、ナチュラルキラー細胞を培養し、それを分離精製し、残存する培養液から得られたものである、請求項８に記載の組成物。
前記培養は、播種細胞を支持細胞、支持細胞刺激因子および成長因子を含む培地中で培養することである、請求項１０に記載の組成物。
前記播種細胞は、ナチュラルキラー細胞に分化できるヒト由来の細胞である、請求項１１に記載の組成物。
前記ヒト由来の細胞は、末梢血、末梢血白血球細胞、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、濃縮された（enriched）ナチュラルキラー細胞、分離されたナチュラルキラー細胞、臍帯血、造血幹細胞および誘導多能性幹細胞からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１２に記載の組成物。
前記成長因子は、インターロイキンである、請求項１１に記載の組成物。