KR20130125569A

KR20130125569A - 활막액으로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법

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Publication number: KR20130125569A
Application number: KR1020120049198A
Authority: KR
Inventors: 조미라; 이재선; 박민정; 박미경; 이성희; 양은지
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2012-05-09
Filing date: 2012-05-09
Publication date: 2013-11-19

Abstract

본 발명은 활막액으로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법에 관한 것으로서, 자세하게는 면역질환에 걸린 개체의 활막액으로부터 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법; 분리된 상기 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물; 및 활막액 유래의 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 세포치료제에 관한 것이다. 본 발명에서 분리한 활막액 유래 중간엽 줄기세포는 면역질환 개체로부터 분리한 것으로서 이를 세포치료제의 용도로 사용할 경우 종래 문제가 되고 있는 이식거부반응과 같은 면역반응의 이상조절을 감소할 수 있어 보다 효과적이며 안전한 치료효과를 얻을 수 있다.

Description

활막액으로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법{Method of isolating mesenchymal stem cell derived from synovial fluid}

본 발명은 활막액으로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법 및 분리된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)는 자가 증식할 수 있고, 다양한 계통(lineages)로 분화할 수 있는 중복성(multipotent) 줄기 세포로서, 중간엽 전구 세포(mesenchymal progenitor cells)로 칭해지기도 한다. 중간엽 줄기 세포는 조건에 따라 뼈, 지방, 연골, 신경, 근육, 및 골수 기질 세포 등으로 분화될 수 있어 다양한 치료학적 효능을 갖는다. 중간엽 줄기 세포는 성인 줄기세포의 일종으로, 주로 골수로부터 분리되는 조혈모 줄기 세포와 함께 분리할 수 있는데, 부유 상태로 배양되는 특징을 갖는 조혈모 줄기세포와는 다르게 배양 접시 등에 부착되는 특징을 갖고 있다. 이러한 배양 조건에서 분리 및 배양되는 중간엽 줄기세포는 다양한 실험과 임상 등에 사용되어 왔다.

한편, 골수에서 중간엽 줄기세포를 얻는 것을 쉬인 일이지만 골수의 획득이 용이하지 않고, 타 인간 줄기세포 이식시 면역거부 반응이 발생하는 문제가 있으며, 나이가 듦에 따라 골수 유래 중간엽 줄기 세포의 분화 능력에 대한 활성도가 감소하여 분리할 수 있는 중간엽 줄기세포의 수가 공여자의 상태에 따라 많은 차이를 보이는 단점을 갖고 있다.

이에 최근에는 다양한 치료학적 용도를 갖는 중간엽 줄기세포를 골수 이외의 다른 부위로부터 분리 및 배양하려는 연구가 진행 중에 있는데, 이와 관련된 종래 기술을 살펴보면, 미국특허 제5,197,985호 및 제5,486,359호 등이 있는데, 여기에서는 사람의 골수로부터 중간엽 줄기세포를 분리 및 정제, 배양하는데 있어서 중간엽 줄기세포의 증식 방법을 개시하고 있다. 즉, 미국특허 제5,197,985호에서는 사람 골수-유래의 중간엽 줄기세포를 골 형성 세포로 분화시키는 방법으로서, 분화 없이 중간엽 세포 성장을 촉진하고 배양시 기질 표면으로 중간엽 줄기세포만의 선택적 흡착을 허용하는 인자를 포함하는 배지에 골수 시료를 첨가하는 것에 의해 골수 시료로부터 분리, 정제 및 배양 전개된 사람 골수-유래의 중간엽 줄기세포를 다공성 담체에 도입하고, 사람 간질 줄기세포를 골세포로 분화시키는데 필요한 인자를 포함하는 환경으로 이식하는 단계를 포함하는 방법을 개시하고 있다. 또한 미국특허 제5,486,359호에서는 하나 이상의 조직 타입(예를 들어 뼈, 연골, 근육 또는 골수 기질)으로 분화할 수 있는 분리된 사람 중간엽 줄기세포, 사람 중간엽 줄기세포를 분리, 정제 및 배양 전개하는 방법 및 이러한 세포의 특성과 용도, 특히 시약, 진단 및 치료적 용도에 대하여 개시하고 있다.

그러나 지금까지 연구된 결과에 의하면 아직까지 활막액으로부터 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양한 내용에 대해서는 보고된 바가 없다.

따라서 본 발명의 목적은 활막액으로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법으로 분리 및 배양된 활막액 유래의 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 방법으로 분리 및 배양된 활막액 유래의 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 세포치료제를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 칼슘 및 마그네슘 이온이 함유되지 않은 2.67mM KCl, 1.47mM KH₂PO₄, 137.93mM NaCl 및 8.06mM Na₂HPO₄-7H₂O를 포함하는 인산완충용액을 활막액에 첨가하고 원심분리하는 단계; 원심분리 후 상등액을 제거하고, 1~2mg/ml의 농도로 콜라겐분해효소가 포함된 혈청이 없는 DMEM 배지를 첨가한 다음, 37℃가 유지되는 진탕 배양기에서 교반하는 단계; 교반 후 1,000~1,300 rpm의 속도로 원심분리하고, 상등액을 제거한 다음 바닥에 남은 세포 펠렛에 혈청이 없는 DMEM 배지를 첨가하고 혼합한 다음, 1,000~1,300 rpm의 속도로 다시 원심분리하는 단계; 및 상등액을 제거하고 수득한 세포 펠렛은 소태아 혈청이 함유된 DMEM 배지로 현탁시킨 후 세포배양 디쉬에 분주하고, 37℃의 온도 5% 이산화탄소, 95%의 공기 및 99%의 습식이 유지되는 배양기에서 계대 배양하는 단계를 포함하는, 활막액으로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 3~6번 계대 배양한 세포일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 계대 배양은 10% 소태아혈청이 함유된 DMEM 배지로 37℃의 온도 5% 이산화탄소, 95%의 공기 및 99%의 습식이 유지되는 배양기에서 배양하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 활막액은 면역질환에 걸린 개체로부터 수득한 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 류마티스 관절염일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 분리 및 배양된 활막액 유래의 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 방법으로 분리 및 배양된 활막액 유래의 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명은 면역질환에 걸린 개체의 활막액으로부터 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하는 방법; 분리된 상기 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물; 및 활막액 유래의 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 세포치료제에 관한 것으로서, 본 발명에서 분리한 활막액 유래 중간엽 줄기세포는 면역질환 개체로부터 분리한 것으로서 이를 세포치료제의 용도로 사용할 경우 종래 문제가 되고 있는 이식거부반응과 같은 면역반응의 이상조절을 감소할 수 있어 보다 효과적이며 안전한 치료효과를 얻을 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에서 류마티스 관절염 환자의 활막액에 존재하는 중간엽 줄기세포의 분포 정도를 공초점 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 의해 류마티스 관절염 환자의 활막액으로부터 분리하여 3번째 계대 배양한 중간엽 줄기세포를 위상차 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 류마티스 관절염 환자의 활막액으로부터 분리하여 5번째 계대 배양한 중간엽 줄기세포에 대해 중간엽 줄기세포의 표시자인 CD44, CD105 및 CD90의 발현을 유세포 분석기를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 질환 치료를 위한 세포치료제로 각광을 받고 있는 중간엽 줄기세포를 종래 분리된 바 없었던 활막액으로부터 분리하는 방법을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에서 제공하는 상기 활막액으로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법은, 칼슘 및 마그네슘 이온이 함유되지 않은 2.67mM KCl, 1.47mM KH₂PO₄, 137.93mM NaCl 및 8.06mM Na₂HPO₄-7H₂O를 포함하는 인산완충용액을 활막액에 첨가하고 원심분리하는 단계; 원심분리 후 상등액을 제거하고, 1~2mg/ml의 농도로 콜라겐분해효소가 포함된 혈청이 없는 DMEM 배지를 첨가한 다음, 37℃가 유지되는 진탕 배양기에서 교반하는 단계; 교반 후 1,000~1,300 rpm의 속도로 원심분리하고, 상등액을 제거한 다음 바닥에 남은 세포 펠렛에 혈청이 없는 DMEM 배지를 첨가하고 혼합한 다음, 1,000~1,300 rpm의 속도로 다시 원심분리하는 단계; 및 상등액을 제거하고 수득한 세포 펠렛은 소태아 혈청이 함유된 DMEM 배지로 현탁시킨 후 세포배양 디쉬에 분주하고, 37℃의 온도 5% 이산화탄소, 95%의 공기 및 99%의 습식이 유지되는 배양기에서 계대 배양하는 단계를 포함한다.

관절이란 움직이는 두 뼈가 만나는 곳을 말하는데, 예를 들어 다리뼈 중 대퇴골이라고 하는 뼈는 위로는 골반이라고 하는 엉치뼈에 붙어 있고, 아래로는 각각 경골과 비골이라고 불리는 종아리뼈에 붙어 있다. 즉, 위 아래에 각각 관절이 있는 셈이다. 관절에서 서로 맞닿는 뼈의 부분은 충격을 흡수하도록 부드러운 연골로 되어 있고 관절은 활막이라고 하는 섬유막으로 안쪽이 싸여 있는데, 이 활막은 윤활유 역할을 하는 활막액을 분비하여 관절이 부드럽게 움직이도록 해준다.

또한, 활막 내에 존재하는 활막액층에는 T 임파구, B 임파구, 대식세포(macrophages) 들이 존재하며, 대식세포는 류마티스 관절염 발병초기에 많이 관찰되는 세포로서 주로 혈관 주변에 침윤된 T 세포와 인접하여 존재하며 이들 T 세포에 의해 자극되어 병태생리에 중요한 사이토카인, 주로 IL-1, TNF-a 등을 생성하고 MMP 등을 분비한다. TNF-a는 연골과 뼈의 흡수를 촉진하고 대식세포나 말초혈액의 단핵구에 TNF-a와 M-CSF 등을 분비하여 파골세포 분화를 유도하며, 최종적으로 관절 파괴에 관여한다고 보고된 바 있고, 또한 TNF-a는 섬유아세포형활막세포(FLS)에 작용하여 활막세포의 증식을 촉진함으로써 활막과형성(synovial hyperplasia)과 섬유화를 유도하며 류마티스 관절염에서 혈관 형성(angiogenesis)에 중요한 역할을 한다. 이와 같이, 염증성 관절염 발병부위의 연골조직 및 관련세포들은 면역체계의 상호반응을 통해 조절되고 있다.

한편, 본 발명자들은 면역질환의 치료제로서 줄기세포를 이용한 세포치료제의 개발을 위해 연구하던 중, 활막액 내에 줄기세포의 존재를 확인하고 이를 분리하여 세포치료제로 이용할 수 있음을 처음으로 규명하였다.

본 발명에서 제공하는 활막액으로부터 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법에 대해 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 본 발명에서 분리하는 중간엽 줄기세포는 활막액으로부터 분리되는 특징이 있는데, 바람직하게는 면역질환에 걸린 개체로부터 수득한 활막액일 수 있다.

이는 본 발명에서 제공하고자 하는 중간엽 줄기세포는 면역질환, 특히 자가면역질환을 치료할 수 있는 효과적인 세포치료제로서 면역질환에 걸린 개체 자신의 활막액으로부터 분리된 중간엽 줄기세포라는 점에도 큰 의미가 있는데, 이는 현재 사용되고 있는 세포치료제들은 정상조직 또는 정상세포의 것을 사용하고 있지, 질환에 걸린 개체의 것은 사용하지 않고 있지 않기 때문이며, 특히 질환에 걸린 개체의 세포는 일반적인 세포형태(즉, 정상개체의 세포와 동일한 형태의 세포)일지라도 다시 질병을 유발하는데 관여하고 있는 예도 보고되어 있어 세포의 특징에 따라 그 역할 규명은 필히 분석되어야 한다.

이러한 점에서 본 발명의 일실시예서는 자가면역질환 중, 류마티스 관절염에 걸린 환자로부터 수득한 활막액을 대상으로 중간엽 줄기세포를 분리하였다.

본 발명에 따른 상기 활막액으로부터 중간엽 줄기세포의 분리는, 먼저 자가면역질환에 걸린 개체의 활막액을 동량의 인산완충액과 함께 원심분리 튜브에 넣고 잘 혼합한 후, 원심분리 한다. 이때 상기 인산완충액은 칼슘 및 마그네슘 이온이 함유되지 않은 2.67mM KCl, 1.47mM KH₂PO₄, 137.93mM NaCl 및 8.06mM Na₂HPO₄-7H₂O를 함유하는 용액을 사용하며, 상기 원심분리는 중간엽 줄기세포 내에 존재하는 각종 유용한 단백질들의 활성이 유지되도록 4℃의 온도가 유지되는 조건 하에서 수행하고, 속도는 1300rpm에서 5분간 원심분리 한다.

이후 상등액은 제거하고 다시 상기 인산완충액을 첨가하여 잘 섞은 다음 위와 동일조건에서 원심분리를 수행한다.

이후, 상등액은 제거하고, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지를 이용하여 콜라겐분해효소 Ⅰ를 1mg/ml의 농도로 맞추고, 이 용액을 상기 상등액이 제거된 튜브에 첨가한 후, 재현탁한 다음, 37℃의 온도에서 1시간 동안 효소 반응 시킨다.

이때 상기 반응은 37℃가 유지되는 진탕 배양기에서 90rpm의 약한 속도로 교반하면서 수행한다. 또한, 상기 DMEM 배지는 당업계에서 판매하고 있는 DMEM 배지를 사용할 수 있는데, 구체적으로 25mM glucose, 1mM sodium pyruvate, 5.95g/L HEPES, 3.7g/L sodium bicarbonate 및 1mM MEM nonessential amino acid를 함유하고 있는 배지를 사용할 수 있다.

상기 반응이 완료되면, 다시 원심분리를 한 후, 상등액을 제거하여 세포 펠렛을 수득하고, 세포 펠렛에 혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지를 첨가하여 원심분리하며, 이러한 과정을 2~3회 반복 수행한다.

원심분리하여 상등액을 제거하고 수득한 펠렛은 20%의 소태아혈청이 함유된 DMEM를 이용하여 잘 풀어준 다음, 세포배양용 디쉬에 분주하고 37℃의 온도, 5% 이산화탄소, 95%의 공기 및 99%의 습식이 유지되는 배양기에서 2일 동안 배양한다.

상기 배양이 완료되면 세포들은 다시 새로운 배지로 교체하면서 1번째 계대 배양을 시작하는데, 계배 배양시에는 배양 배지를 10% 소태아혈청이 함유된 DMEM를 사용한다.

이러한 계대 배양은 순차적으로 일정시간 동안 배양 후 배지를 교체하는 과정을 반복적으로 수행할 수 있는데, 상기 일정시간은 3~4일 동안일 수 있다.

한편, 본 발명에서 제공하는 자가면역질환 치료 용도로 사용 가능한 활막액 유래 중간엽 줄기세포는 3~6번 계대 배양한 세포를 사용하는 것이 바람직한데, 이는 계대 배양 중에 많은 세포를 얻을 수 있고 계대 배양 과정에서 줄기세포의 증식형태가 안정화되기 때문이다.

이상과 같은 과정을 통해 수득한 중간엽 줄기세포에 대해 본 발명자들은 위상차 현미경 및 공초점 현미경을 통해 분리한 세포가 중간엽 줄기세포의 특징을 가지고 있는지 확인할 수 있었으며, 나아가 중간엽 줄기세포의 표시자인 CD44, CD105 및 CD90의 발현 여부를 유세포 분석기를 사용하여 관찰하였는데, 이들 표시자들 모두가 잘 발현되고 있음을 확인할 수 있었다.

그러므로 본 발명의 과정으로 분리 및 배양한 활막액 유래 중간엽 줄기세포는 이를 포함하는 조성물을 면역질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 "면역질환"은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환 등을 모두 포함할 수 있다.

또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다. 그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 "자가면역질환"이라고 한다.

또한, 본 발명에서 상기 "염증성 질환"이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

"이식편대숙주질환(graft-versus-host disease, GVHD)"은 동종이식 때 주입되는 공여자(供與者)의 말초 혈액이나 골수내의 T림프구를 환자의 몸에서 남의 것으로 인식하여 면역 반응이 일어나는 질환을 말한다. 즉, 수혈된 살아 있는 림프구에 의해 유발되며 면역 반응으로 인해 간 기능 이상, 피부 병변, 황달, 설사, 발열, 범혈구감소증 등의 증상이 나타나는 질환을 말한다.

본 발명에서 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 면역질환을 경감시킴.

(4) 면역질환의 재발을 예방함, 및

(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 활막액으로부터 분리된 중간엽 줄기세포를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 면역질환 개체 유래의 골수유래억제세포의 약학적으로 유효한 양은 1x10⁶~ 1x10⁷ 세포수/day/체중kg일 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 조성물은 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 분리 및 배양된 활막액 유래의 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 세포치료제를 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

활막액으로부터 중간엽 줄기세포의 분리

본 발명자들은 종래 연구된 바 없었던 활막액으로부터 세포치료제로 사용 가능한 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저 류마티스 관절염 환자의 활막액 30cc를 50ml 원심분리 튜브에 15ml씩 분주하여 담고, Ca² ⁺,Mg² ⁺이온이 포함되지 않은 인산완충액(2.67mM KCl, 1.47mM KH₂PO₄,137.93mMNaCl,8.06mMNa₂HPO₄-7H₂O)을 동량으로 같은 튜브에 첨가하여 활막액을 2배로 희석하여 섞었다. 이후 4℃ 냉장 상태가 유지되는 원심분리기를 이용하여 1300rpm에서 5분간 원심 분리하였고, 상등액을 파이펫을 이용하여 덜어내 버리고, 인산완충액을 각각 20ml씩 더 첨가한 다음 섞은 후 1300rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 이후 상등액을 다시 파이펫을 이용하여 제거한 후, 혈청이 섞이지 않은 DMEM 배지(25mM glucose, 1mM sodium pyruvate, 5.95g/L HEPES, 3.7g/L sodium bicarbonate, 1mM MEM nonessential amino acid)를 이용하여 1mg/ml 농도로 맞춰진 콜라겐분해효소 혼합액을 10ml씩 각 튜브에 넣고 잘 풀어준 다음, 37℃ 진탕 배양기에서 1시간 동안 90rpm의 약한 속도로 교반하였다. 이후, 1300rpm에서 5분간 원심분리하고 상등액을 제거한 다음, 세포 펠렛을 수득하고 이들을 혈청이 섞이지 않은 DMEM 배지 10ml을 첨가하여 잘 섞어준 다음 원심분리를 반복하였다.

이후 튜브 바닥으로부터 수득한 세포 펠렛을 20% 우태아혈청이 포함된 DMEM 배지 10ml로 잘 풀어준 다음, 150mm 세포배양전용 디쉬 2개에 각각 올려놓고 37℃, 5% 이산화탄소, 95% 공기, 99% 습식 인큐베이터에서 2일간 배양한 뒤, 배지를 새로 교환하였다. 교체된 배지를 이용한 첫 번째 계대배양 이후, 배양배지는 10% 소태아혈청이 포함된 DMEM 배지로 바꾸어 주었고, 이러한 과정을 반복하여 3-6번의 계대배양을 수행한 세포를 실험에 사용하였다. 이는 이렇게 계대 배양을 진행하는 동안 중간엽 줄기세포가 아닌 다른 세포는 살아남지 못해, 순수한 줄간엽 줄기세포만을 수득할 수 있기 때문이다.

< 실시예 2>

활막액 유래 중간엽 줄기세포의 확인

<2-1> 공초점현미경을 이용한 확인

활막액 유래의 줄기세포는 일반적으로 활막에서부터 관찰이 되므로, 상기 실시예 1의 방법으로 분리 및 배양한 세포가 활막 유래의 중간엽 줄기세포인지를 확인하기 위해 류마티스관절염 환자의 활막조직을 OCT compound에 넣고 만든 냉동 절편을 7mm 두께로 잘라 젤라틴으로 코팅된 슬라이드 글라스에 올려붙인 뒤, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)가 포함된 완충액으로 실온에서 고정하고, 인산완충액으로 세척한 다음 인산완충액으로 10배 희석된 정상염소의 혈청이 활막 조직의 비특이적 항체결합을 저해하도록 실온에서 1시간동안 처리하였다. 다음으로, 중간엽 줄기세포임을 나타내는 표지자이며 각 Phycoerythrin, PerCP의 형광물질이 표지된 CD44 및 CD90 항체를 사용하여 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, 실온에서 인산완충액으로 15분간 세척하여 잔여 항체를 제거한 다음 세포의 핵 형광염색제인 DAPI가 포함된 봉입제로 봉입한 다음 잠시 말린 뒤 공초점 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법으로 분리 및 배양한 세포는 CD44 및 CD90를 모두 발현하고 있는 활막 유래의 중간엽 줄기세포임을 확인할 수 있었다. 왼쪽 대조군은 각 항체에 대해 있을 수 있는 비특이적 결합에 의한 것인지 생쥐의 IgG1,k 항체를 사용하여 같은 방법으로 실험하였으나 나타나지 않았다.

<2-2> 위상차현미경을 이용한 확인

공초점현미경에 이어 본 발명자들은 위상차현미경을 통해 실시예 1에서 분리 및 배양한 세포들이 모두 동일한 중간엽 줄기세포의 표현형을 나타내는지 조사하였는데, 이때 관찰 대상인 세포는 3번 계대배양한 세포를 대상으로 수행하였으며, 관찰 결과는 도 2에 나타내었다.

<2-3> 유세포분석기를 통한 활막액 유래 중간엽 줄기세포의 표시자 발현 확인 유세포분석기를 이용하여 실시예 1에서 분리 및 배양한 세포가 중간엽 줄기세포인지 확인하기 위해, 먼저 실시예 1에서 5번째 계대 배양한 세포들을 배양용기로부터 분리한 후, 이들 세포를 중간엽 줄기세포의 표시자인 CD44, CD105 및 CD90에 대한 항체와 1시간 동안 반응시켰다. 이후 인산완충용액으로 세척한 다음, 유세포분석기를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 활막액으로부터 분리 및 배양한 세포가 CD44, CD105 및 CD90 항체에 대해 약 95.48%의 양성 발현을 나타내는 것으로 확인함으로써 이들 세포가 중간엽 줄기세포임을 알 수 있었다. 대조군은 각 항체에 대해 있을 수 있는 비특이적 결합에 의한 것인지 생쥐의 IgG1,k 항체를 사용하여 같은 방법으로 실험하였으나 나타나지 않았다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

칼슘 및 마그네슘 이온이 함유되지 않은 2.67mM KCl, 1.47mM KH₂PO₄, 137.93mM NaCl 및 8.06mM Na₂HPO₄-7H₂O를 포함하는 인산완충용액을 활막액에 첨가하고 원심분리하는 단계;
원심분리 후 상등액을 제거하고, 1~2mg/ml의 농도로 콜라겐분해효소가 포함된 혈청이 없는 DMEM 배지를 첨가한 다음, 37℃가 유지되는 진탕 배양기에서 교반하는 단계;
교반 후 1,000~1,300 rpm의 속도로 원심분리하고, 상등액을 제거한 다음 바닥에 남은 세포 펠렛에 혈청이 없는 DMEM 배지를 첨가하고 혼합한 다음, 1,000~1,300 rpm의 속도로 다시 원심분리하는 단계; 및
상등액을 제거하고 수득한 세포 펠렛은 소태아 혈청이 함유된 DMEM 배지로 현탁시킨 후 세포배양 디쉬에 분주하고, 37℃의 온도 5% 이산화탄소, 95%의 공기 및 99%의 습식이 유지되는 배양기에서 계대 배양하는 단계를 포함하는, 활막액으로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 방법.
제1항에 있어서,
상기 중간엽 줄기세포는 3~6번 계대 배양한 세포인 것을 특징으로 하는 활막액으로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 방법.
제2항에 있어서,
상기 계대 배양은 10% 소태아혈청이 함유된 DMEM 배지로 37℃의 온도 5% 이산화탄소, 95%의 공기 및 99%의 습식이 유지되는 배양기에서 배양하는 것을 특징으로 하는 활막액으로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 방법.
제1항에 있어서,
상기 활막액은 면역질환에 걸린 개체로부터 수득한 것임을 특징으로 하는 활막액으로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 방법.
제4항에 있어서,
상기 면역질환은 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 활막액으로부터 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 방법.
제1항의 방법으로 분리 및 배양된 활막액 유래의 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 면역질환은 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물.
제1항의 방법으로 분리 및 배양된 활막액 유래의 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 세포치료제.