CN111712227A

CN111712227A - 用于缓解特应性皮炎、脱发和创伤或者减少皮肤皱纹的化妆品组合物和药物组合物

Info

Publication number: CN111712227A
Application number: CN201880089365.2A
Authority: CN
Inventors: 吴畅泽; 林玟姝; 金点溶; 朴宣奎; 李宗勋; 张珉廷; 金修爱; 林洙焕; 金凡峻; 朴东浩; 权泰隣; 罗正泰
Original assignee: Green Cross Wellbeing Corp
Current assignee: GC Wellbeing Corp
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-09-25
Also published as: KR20190071432A; EP3725296A1; EP3725296A4; KR102014467B1; US20200384082A1; WO2019117633A1; JP2021506969A

Abstract

本发明涉及化妆品组合物和药物组合物，其包含自然杀伤细胞的分泌物，从而具有增加与特应性皮炎、脱发、和创伤减轻或皮肤皱纹减少有关的各种因子并且改善这些因子的表达水平的优异效果，从而对症状具有优异的缓解作用。

Description

用于缓解特应性皮炎、脱发和创伤或者减少皮肤皱纹的化妆品组合物和药物组合物

技术领域

本发明涉及用于改善特应性皮炎、脱发、创伤或皮肤皱纹的化妆品组合物和药物组合物。

背景技术

在形成免疫系统的细胞中，特别是自然杀伤细胞(NK细胞)是在体内免疫系统防御机制的前沿起作用的细胞，从而起到如下作用：在不通过抗原预先致敏的情况下除去肿瘤细胞、细菌、细胞间寄生虫或病毒感染的宿主细胞，排斥不适当的骨髓移植，并且调节T细胞的免疫应答。

具体地，在NK细胞的此类各种功能中，由于已经发现其选择性地杀死癌细胞的能力，因此进行了许多相关研究。在癌症患者的情况下，与正常受试者相比，外周血中的NK细胞的数量或活性降低。在动物实验中，发现随着NK细胞活性的降低，罹患癌症和癌症转移的风险增加。

另外，NK细胞在针对宿主感染的病原体或癌细胞的固有免疫应答以及通过细胞因子分泌的获得性免疫应答中起重要作用。在本文中，使用NK细胞杀死靶细胞的主要机制是通过免疫突触将例如穿孔素和粒酶B(granzymeB)等溶细胞颗粒(cell-lytic granule)分泌至靶细胞中。分泌的穿孔素在靶细胞壁中形成孔，并且通过该孔进入靶细胞的粒酶B可以诱导靶细胞的凋亡。

因此，发现NK细胞在其中细胞转化为恶性细胞的肿瘤发生中和在病毒感染的早期阶段的防御机制中发挥关键作用。然而，对除NK细胞自身以外的分泌物质(即分泌物)、其新用途等的研究仍然是不充分的。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的是提供用于改善特应性皮炎、脱发、创伤或皮肤皱纹的化妆品组合物。

此外，本发明的另一目的是提供用于预防或治疗特应性皮炎、脱发、创伤或皮肤皱纹的药物组合物。

用于解决问题的方案

1.一种化妆品组合物，其用于改善特应性皮炎、脱发、创伤或皮肤皱纹，其包括自然杀伤细胞的分泌物。

2.根据以上1的组合物，其中自然杀伤细胞的分泌物包括选自由IL-2、TIMP2、VEGF、PDGF-AA和IL-10组成的组中的至少一种。

3.根据以上1的组合物，其中自然杀伤细胞的分泌物是从培养自然杀伤细胞、然后将其分离和纯化之后残留的残余培养液中获得的。

4.根据以上3的组合物，其中培养包括在包含饲养细胞、饲养细胞刺激因子和生长因子的培养基中培养种子细胞。

5.根据以上4的组合物，其中种子细胞是具有分化成自然杀伤细胞的潜力的人源细胞。

6.根据以上5的组合物，其中人源细胞选自由外周血、外周血白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、富集的自然杀伤细胞、分离的自然杀伤细胞、脐带血、造血干细胞和诱导性多能干细胞组成的组。

7.根据以上4的组合物，其中生长因子是白介素。

8.一种药物组合物，其用于改善特应性皮炎、脱发、创伤或皮肤皱纹，其包括自然杀伤细胞的分泌物。

9.根据以上8的组合物，其中自然杀伤细胞的分泌物包括选自由IL-2、TIMP2、VEGF、PDGF-AA和IL-10组成的组中的至少一种。

10.根据以上8的组合物，其中自然杀伤细胞的分泌物是从培养自然杀伤细胞、然后将其分离和纯化之后残留的残余培养液中获得的。

11.根据以上10的组合物，其中培养包括在包含饲养细胞、饲养细胞刺激因子和生长因子的培养基中培养种子细胞。

12.根据以上11的组合物，其中种子细胞是具有分化成自然杀伤细胞的潜力的人源细胞。

13.根据以上12的组合物，其中人源细胞选自由外周血、外周血白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、富集的自然杀伤细胞、分离的自然杀伤细胞、脐带血、造血干细胞和诱导性多能干细胞组成的组。

14.根据以上11的组合物，其中生长因子是白介素。

发明的效果

根据本发明，该分泌物在增加与特应性皮炎、脱发、创伤或皮肤皱纹的改善有关的各种因子方面、以及在提高表达水平方面是优异的。因此，包括该分泌物的本发明的化妆品组合物在改善上述症状方面是优异的，并且药物组合物在预防或治疗上述疾病方面是优异的。

附图说明

图1是示出NK-CM和NK培养基之间的成纤维细胞增殖能力的差异的评价结果的图。

图2是示出关于NK-CM的HDF-N细胞的细胞迁移能力和细胞增殖能力的评价结果的图。

图3是示出NK-CM的胶原产生能力的评价结果的图。

图4是示出关于通过NK-CM处理的角质形成细胞的细胞活力的监测结果的图。

图5是示出关于通过NK-CM处理的外根鞘(ROS)细胞的细胞活力的监测结果的图。

图6是示出HaCaT细胞中促炎细胞因子的表达与NK-CM之间的关系的图。

图7是示出HMC-1细胞中促炎细胞因子的表达与NK-CM之间的关系的图。

图8是示出NK条件培养基(NK-CM)的组分分析的结果的图。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本发明。

用于改善特应性皮炎、脱发、创伤或皮肤皱纹的本发明的化妆品组合物可以包括自然杀伤细胞的分泌物。

自然杀伤细胞(NK细胞)是在免疫应答中起作用的淋巴样细胞，其存在于约10％至15％的正常血液中，并且当它们与非己抗原(non-self antigen)反应时具有高的杀伤能力。在感染各种病毒、细菌浸润的细胞的产生中或者在异常细胞的产生中，NK细胞非特异性地反应并且立即清除异物。因此，已经研究了自然杀伤细胞作为免疫抗癌剂的应用。

然而，发明人发现，除了自然杀伤细胞本身以外的、由自然杀伤细胞分泌的分泌物对特应性皮炎、脱发、创伤和皮肤皱纹有效果，这不同于以上应用，并且基于以上发现设计和完成了本发明。

根据本发明的自然杀伤细胞的分泌物可以包括选自由白介素-2(IL-2)、金属肽酶抑制剂2(TIMP2)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子-AA(PDGF-AA)和白介素-10(IL-10)组成的组中的至少一种。

在根据本发明的自然杀伤细胞的分泌物中包含的以上组分中，IL-2和TIMP2是与皱纹改善有关的因子，VEGF和PDGF-AA是与脱发改善有关的因子，并且IL-2和IL-10是与特应性皮炎改善有关的因子。

根据本发明的自然杀伤细胞的分泌物可以例如从培养自然杀伤细胞、然后将其分离和纯化之后残留的残余培养液中获得，或者可以直接使用残余培养液，但不限于此。

在下文中，动物细胞培养基和以下组分可以包括通常有助于细胞的生长或者正常地使细胞稳定并且影响细胞的生长的组分。尽管细胞生长的程度会取决于这些组分而变化，但是细胞的分泌组分不会因此受到影响。以下实例仅是一个实施方案，并且不限于此。

自然杀伤细胞可以使用本领域已知的常规动物细胞培养基来培养而没有限制，并且所述动物细胞培养基可以包括例如CellGro培养基(Cellgenix)、AIM-V培养基、RPMI1640培养基、XVIVO 20、和RPMI1640等。

自然杀伤细胞的培养可以包括培养种子细胞以获得自然杀伤细胞、或者培养自然杀伤细胞。

如本文所用，术语“种子细胞”意指能够通过适当的培养而增加为自然杀伤细胞的细胞，并且具体地，它可以是具有分化成自然杀伤细胞的潜力的人源细胞。本文所用的细胞可以包括选自例如由外周血、外周血白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、富集的自然杀伤细胞、分离的自然杀伤细胞、脐带血、造血干细胞和诱导性多能干细胞组成的组中的至少一种，但不限于此。

种子细胞的培养可以在补充有用于促进自然杀伤细胞的培养的组分的培养基中进行。

用于促进培养的组分可以包括例如饲养细胞、饲养细胞刺激因子和生长因子等。

饲养细胞是不允许分裂和增殖的细胞，然而，由于代谢活性，它产生多种代谢产物来帮助自然杀伤细胞的增殖。

本文使用的饲养细胞可以是任何一种，只要其可以支持自然杀伤细胞的增殖就没有限制，并且可以包括例如其中已导入基因的细胞系、用各种细胞因子或化合物处理的外周血白细胞(PBL)、外周血白细胞(PBL)、T细胞、B细胞、单核细胞和CD4(+)T细胞等。对于具体实例，可以使用自体外周血白细胞(PBL)和CD4(+)T细胞中的至少一种，但不限于此。

使用在失活状态下的饲养细胞，可以确保安全性。作为使其失活的方法，可以使用本领域已知的常规方法。例如，可以使用伽马射线的照射。此类失活的饲养细胞可以包括分离的T细胞(或纯化的T细胞)。

作为饲养细胞刺激因子，例如，可以使用抗CD3抗体。

如本文所用，术语“抗CD3抗体”意指与作为结合至T细胞受体(TCR)的分子基团的CD3抗原特异性结合以形成抗原识别复合物的抗体，其中CD3分子与TCR结合并且将抗原识别信号呈递到细胞中。

可用于本发明的抗CD3抗体不受限制，只要它是对CD3具有结合性的抗体即可，并且优选选自由OKT3、UCHT1和HIT3a组成的组，但不限于此。可以例如以0.1至100ng/ml的量包括抗CD3抗体，但不限于此。

生长因子可以包括例如细胞因子。细胞因子是生长因子，并且优选为选自白介素中的一种或多种，但不限于此。

白介素是一个通用术语，其表示由例如淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞等免疫感受态细胞(immune-competent cell)产生的蛋白质物质和生物活性物质。本文中可使用的白介素的实例可以包括选自由白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)和白介素-21(IL-21)组成的组中的至少一种。特别地，优选使用IL-2而没有限制。此外，本领域技术人员将认识到，也可以使用其它细胞因子而没有限制，只要它们满足本发明的目的即可。可以以例如10至2000U/ml的量包含细胞因子，但不限于此。

此外，可以添加血清或血浆以及支持淋巴细胞的增殖的其它增殖因子，然后进行培养。添加至培养基的血清或血浆的种类没有特别限制，但是可以包括任意商购可得的源自动物的血清或血浆，优选源自人的血清或血浆，并且更优选地，源自个体自身的血清或血浆。例如，可以添加用于使来自PBMC的淋巴细胞增殖的细胞因子和用于刺激淋巴细胞增殖的凝集素等的组合，并且也可以使用本领域技术人员已知的其它方法。

此外，培养基可以进一步包括血清或血浆以及支持淋巴细胞的增殖的其它增殖因子，或者可以包括血清或血浆本身。添加至培养基的血清或血浆的种类没有特别限制，但是可以包括任意商购可得的源自动物的血清或血浆，优选源自人的血清或血浆，并且更优选地，源自个体自身的血清或血浆。例如，可以使用人AB血清或自体血浆。

关于包括根据本发明的分泌物的化妆品组合物，可以包括除上述活性成分以外的、在通常的化妆品组合物中使用的组分。例如，可以包括常规的补充剂，例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料和芳族香精，以及载体。

可以将本发明的化妆品组合物制成本领域通常生产的任何制剂，并且例如可以以如下形式配制：溶液、悬浮液、乳剂、糊剂、凝胶、霜剂、润肤露(lotion)、粉剂、皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉饼、乳液粉底、蜡粉底、面膜、按摩霜、喷雾剂等，但不限于此。更具体地，可以将组合物制成任何制剂，例如软化美肤水(softening beauty wash)、滋养美肤水、营养霜、按摩霜、精华、眼霜、清洁霜(cleansing cream)、清洁泡沫(cleansing foam)、卸妆水(cleansing water)、面膜、喷雾剂或粉剂。

当本发明的制剂是糊剂、霜剂或凝胶时，可以使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、或氧化锌等作为载体组分。

当本发明的制剂是溶液或乳剂时，使用溶剂、增溶剂或乳化剂作为载体组分。例如，可以使用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、1,3-丁二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脱水山梨醇脂肪酸酯。

当本发明的制剂是悬浮液时，可以使用如下物质作为载体组分：例如水、乙醇或丙二醇等液体稀释剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯脱水山梨醇酯等助悬剂，微晶纤维素，偏氢氧化铝，膨润土，琼脂，或黄蓍胶等。

当本发明的制剂是粉剂或喷雾剂时，可以使用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末作为载体组分。特别地，在喷雾剂的情况下，组合物可以进一步包含抛射剂(propellant)，例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲基醚。

当制剂是含表面活性剂的清洁剂时，可以使用脂肪族醇硫酸盐、脂肪族醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉鎓衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰氨基甜菜碱、脂肪族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、或乙氧基化甘油脂肪酸酯等作为载体组分，但不限于此。

当本发明的化妆品组合物为皂、含表面活性剂的清洁制剂或不含表面活性剂的清洁制剂时，可以将其施用于皮肤，然后擦去、剥离或者用水洗涤。具体地，皂可以是液体皂、皂粉、固体皂或油皂；含表面活性剂的清洁制剂可以是清洁泡沫、卸妆水、清洁巾(cleansing towel)和清洁面膜；并且不含表面活性剂的清洁制剂可以是清洁霜、洁肤露(cleansing lotion)、卸妆水和清洁凝胶，但不限于此。

另外，本发明提供用于改善特应性皮炎、脱发、创伤或皮肤皱纹的药物组合物，其包括自然杀伤细胞的分泌物。

自然杀伤细胞的分泌物可以在上述范围内。

可以将本发明的药物组合物配制成用于预防和治疗退行性神经系统疾病的药物制剂，其包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

载体、赋形剂和稀释剂可以包括例如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。

可以根据常规方法将本发明的药物组合物制成例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂等口服制剂，外用制剂，栓剂或无菌注射溶液型制剂。通常，在制剂的情况下，可以通常使用稀释剂或者例如填充剂、增量剂(extender)、粘合剂、润湿剂(humectant)、崩解剂、和表面活性剂等赋形剂来制备制剂。用于口服给药的固体制剂可以包括例如片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、和胶囊剂等。可以通过将药物组合物与至少一种赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、和明胶等混合来制备固体制剂。除了简单的赋形剂以外，还可以使用例如硬脂酸镁和滑石等润滑剂。口服使用的液体制剂的实例可以包括助悬剂、口服液、乳剂、和糖浆剂等。除了例如水和液体石蜡等本领域通常使用的稀释剂以外，还可以使用各种赋形剂，例如润湿剂(wetting agent)、甜味剂、香料、防腐剂等。用于肠胃外给药的制剂可以包括无菌水溶液剂、非水溶液剂、助悬剂、乳剂、冻干制剂、和栓剂等。助悬剂的实例可以包括丙二醇、聚乙二醇、例如橄榄油等植物油、和例如油酸乙酯等可注射的酯等。栓剂基质的实例可以包括维比索尔(witepsol)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂脂、和甘油明胶等。

本发明的药物组合物的剂量可以根据患者的年龄、性别和体重而变化，但是通常在0.1至100mg/kg、优选1至30mg/kg的范围内，其可以一天一次给药或者以分开的剂量一天几次给药。剂量也可以根据给药途径、疾病程度、性别、体重、年龄、健康状况、饮食、给药时间、给药方法、和排泄率等而增加或减少。因此，该剂量不旨在以任何方式限制本发明的范围。

本发明的药物组合物可以以各种途径给药至哺乳动物，例如大鼠、小鼠、家畜、和人等。可以预期所有给药方式，例如可以使用皮肤施用、口服、直肠或者静脉内、肌内、皮下、子宫内或脑内注射来进行给药。

在下文中，将参照实施例详细描述本发明。

实施例：获得自然杀伤细胞分泌物

1.获得自然杀伤细胞分泌物

1-1.CD3(-)PBMC种子细胞的制备

将PBS(磷酸盐缓冲盐水，LONZA，17-516Q)以1:1的比例添加至从健康供体获得的PBMC，然后在1500rpm和4℃下离心10分钟。将PBMC团块以10×10⁶个细胞/mL悬浮在MACS运行缓冲液(包含2％FBS和2mM EDTA的PBS)中，并且使用自动细胞计数器确定细胞计数。

为了获得耗尽CD3(+)细胞后的种子细胞，将5～10×10⁷个细胞转移至50mL管中，并且在1200rpm和4℃下离心10分钟。将400至800μL的MACS运行缓冲液和100至200μL的CD3磁珠(Miltenyi Biotech，130050101)添加至5～10×10⁷个细胞的PBMC细胞中，然后在4℃下反应20分钟。在用大于10倍的MACS运行缓冲液洗涤后，将产物在1350rpm和4℃下离心7分钟，并且悬浮在最终1至2mL MACS运行缓冲液中。通过安装在VarioMACS(MiltenyiBiotech)上的CS柱(Miltenyi Biotech，130-041-305)分离细胞，并且将柱洗涤3次以回收细胞。使用自动细胞计数器确定细胞计数。将细胞悬浮在冻存培养基(freezing medium)中，并且将每小瓶1～2×10⁷个细胞冷冻并且贮存在液氮中。

在培养当天，将冷冻的CD3(-)PBMC在37℃的水浴中解冻，转移至50mL管中，并且悬浮于包含0.6％ACD(柠檬酸盐-右旋糖溶液，Sigma-Aldrich，C3821)、0.2％胎牛血清(FBS)和2mM EDTA的10倍的PBS(ACD-A PBS缓冲液)中，然后在1200rpm和4℃下离心10分钟。将CD3(-)PBMC悬浮在CellGro SCGM培养基(Cellgenix，20802-0500)中并且确定细胞计数。将CD3(-)PBMC种子细胞以1×10⁶个细胞/mL悬浮在CellGro SCGM培养基中。

1-2.饲养细胞的制备

对外周血PBMC饲养细胞以1:1的比例添加PBS(磷酸盐缓冲盐水，LONZA，17-516Q)，并且在1500rpm和4℃下离心10分钟。将PBMC团块以10×10⁶个细胞/mL悬浮在MACS运行缓冲液(包含2％FBS和2mM EDTA的PBS)中，并且使用自动细胞计数器确定细胞计数。将PBMC饲养细胞悬浮在冻存培养基中，并且将每小瓶1×10⁸个细胞冷冻并且贮存在液氮中。

在培养当天，将冷冻的PBMC饲养细胞在37℃的水浴中解冻，转移至50mL管中，悬浮于10倍的ACD-A PBS缓冲液中，然后在1200rpm和4℃下离心10分钟。将细胞计数，然后以5×10⁶个细胞/mL悬浮在CellGro SCGM培养基中，并且通过在伽马射线照射器中用2000cGy照射来灭活。

1-3.自然杀伤细胞的培养和培养液的回收

当培养自然杀伤细胞时，通过将500IU/mL的IL-2(Prolactin Injection，Novartis Korea)、10ng/mL的OKT-3(eBioscience，16-0037-85)和1％至2％的供体血浆添加至CellGro SCGM培养基来制备培养基。在培养的第0天，将CD3(-)PBMC种子细胞和伽马射线照射的饲养细胞以1:5的比例混合，并且基于细胞总数将细胞浓度调整为2×10⁶个细胞/mL，然后在37℃的培养箱中静置培养4至5天。

在培养的第4天至第5天，添加相同量的培养基(Cellgro SCGM+500IU IL-2+1vol％供体血浆)，并且进一步进行静置培养2至3天。在培养的第7天，将以与培养的第0天相同的方式培养下的细胞以1:5的比例、在500IU/mL的IL-2、10ng/mL的OKT-3和1vol％供体血浆的条件下接种到饲养细胞系中，基于细胞总数将细胞浓度调整为1×10⁶个细胞/mL，并且再次刺激，然后静置培养3天。然后，以2至3天的间隔确定细胞计数，并且进一步添加培养基以达到0.5～1×10⁶个细胞/mL的浓度，并且培养20至21天。

在培养的第20天至21天，将培养下的细胞转移至1L离心管中，并且在1500rpm和4℃下离心10分钟。离心后，回收上清液并且将其命名为NK条件培养基。

然后，将500IU/mL的IL-2(Prolactin Injection，Novartis Korea)、10ng/ml的OKT-3(eBioscience，16-0037-85)和1％至2％的供体血浆添加至Cellgro SCGM培养基中以制备命名为NK细胞培养基的培养基。

实验例1.NK-CM的细胞增殖能力的评估

为了评估人成纤维细胞在NK细胞培养基和NK-CM之间的增殖能力的差异，使用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)来确定细胞增殖能力。

将作为单细胞悬浮的人成纤维细胞(HDF-N)以5×10³个细胞/孔接种在96孔板中，并且在37℃下培养。在使细胞保持饥饿24小时后，分别用NK细胞培养基和NK-CM处理细胞，然后进一步培养24和48小时。为了确定细胞增殖能力，将细胞计数试剂盒-8反应物在无补充培养基(supplement-free medium)中以1/10稀释，然后将稀释的反应物以每孔100μl施加至孔，并且反应1小时。通过ELISA酶标仪(680型，BIO-RAD)测量产物在450nm处的吸光度。作为阳性对照，使用补充有10％FBS的培养基，并且将各组的细胞增殖率计算为相对于NK细胞培养基(M)的百分比(％)。其结果示于图1。

如图1所示，当在24小时将NK-CM与NK细胞培养基比较时，在所有浓度下均显示相对高的增殖能力，并且证实增殖能力的增加取决于浓度。在48小时，与NK细胞培养基相比，NK-CM在2.5％浓度下没有显示显著性差异，但是在5％浓度下，增殖能力增加7％，并且在10％浓度下，增殖能力最高增加37％。该结果意味着，与NK细胞培养基相比，NK-CM对细胞具有更高的增殖效果。

实验例2.NK-CM的细胞增殖能力的评估

使用细胞划痕实验来评估和确定人成纤维细胞在NK-CM中的细胞迁移和创伤恢复能力。

将HDF-N细胞以1.0×10⁴个细胞/插件(insert)接种在60mm培养皿(μ-Dish 35mm，High Culture-Inserts；Thistle Scientific Ltd，UK)的底部的ibidi培养插件中，并且在细胞培养条件下培养24小时。除去室(chamber)后，将样品在培养基中以合适的浓度稀释，并且将细胞用稀释的样品处理并且在细胞培养条件下培养48小时。24和48小时后，通过电子显微镜(Eclipse TS100，Nikon Instruments Inc.，NY，USA)拍摄细胞的迁移能力。

如图2(A)所示，可以看出，与对照相比，在24和48小时，随着NK-CM处理组中的浓度增加，细胞迁移能力和创伤恢复能力显著提高。

为了评估NK-CM的增殖能力，用2.5％、5％、10％的NK-CM处理HDF-N细胞，然后使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)在24和48小时测量。

如图2(B，C)所示，可以看出，当在24和48小时比较NK-CM处理组和对照时，细胞增殖能力取决于浓度而增加。特别地，最大浓度为10％的NK-CM分别在24小时增加1.6倍和在48小时增加2倍。该结果表明，NK-CM通过提高HDF-N细胞的细胞迁移能力和创伤恢复能力并且增强细胞增殖能力而具有皱纹改善功效。

实验例3.NK-CM的胶原产生能力的评估

为了评估NK-CM的前胶原(procollagen)合成能力，将NK-CM处理为具有2.5％、5％和10％的无毒浓度，然后在24小时评估前胶原合成能力。

将HDF-N细胞以2.0×10⁴个细胞/孔的密度接种在24孔板中，然后培养24小时。在除去培养基并且使细胞保持饥饿24小时后，将NK-CM在无培养基添加剂的培养基中稀释，然后施用于细胞。24小时后，收集培养基，然后使用前胶原1型c肽(PIP)EIA试剂盒(TAKARA，MK101)测量前胶原的量。将沉积至底部的细胞溶解在1N NaOH中以测量总蛋白含量，并且确定每种蛋白的前胶原产生量。将各组计算为相对于NK细胞培养基(M)的百分比(％)，并且其结果示于图3(A)。

如图3(A)所示，当使用用作阳性对照的TGF-β(10nM)处理时，与对照相比，前胶原产生增加1.7倍。当用NK培养液处理时，与对照相比，在所有浓度下前胶原产生均增加约3.4倍，并且获得了统计学上显著的结果。

在人成纤维细胞中使用NK细胞培养液通过免疫印迹分析确定胶原蛋白表达的变化。

将HDF-N细胞以2.0×10⁶个细胞接种在100mm板上，并且培养24小时。在除去培养基并且使细胞保持饥饿24小时后，将试验物质在无培养基添加剂的培养基中稀释并且施用于细胞。培养24小时后，除去培养基，将细胞用DPBS洗涤，用裂解缓冲液裂解，并且在12,000rpm和4℃下离心20分钟以获得上清液，然后对上清液中的蛋白进行定量。将经定量的蛋白在SDS-PAGE上进行电泳，然后将凝胶蛋白用PVDF膜转印。在用5％BSA封闭后，使细胞与一抗在4℃下反应24小时，然后与二抗反应1小时。然后，将细胞用TBS-T缓冲液洗涤3次，持续10分钟，并且使用ECL检测溶液观察蛋白表达水平。其结果示于图3(B)。

如图3(B)所示，与对照相比，在NK-CM处理组中胶原I和III的表达有效地增加。该结果表明，NK-CM诱导胶原合成和人成纤维细胞的表达，从而提供改善皱纹的功效。

实验例4.通过NK-CM处理的角质形成细胞的细胞活力的确认

使用作为用于测量细胞活力的方法之一的细胞计数试剂盒-8(CCK-8)，确定在正常状态下NK-CM对角质形成细胞的作用。

将以单个细胞悬浮的HaCaT细胞以1×10⁴个细胞/孔接种在96孔板中，并且在37℃的CO₂培养箱中培养24小时。培养后，如下进行各处理：以100μL细胞培养液为基础，将100％NK-CM的添加量设定为最高浓度，然后以1/2稀释的方式稀释至128倍的最终稀释度；并且用稀释的NK-CM处理HaCaT细胞24小时。然后将CCK-8溶液用各浓度的经NK-CM处理的HaCaT培养基以1:10稀释，并且在37℃的CO₂培养箱中培养1小时。

然后，使用分光光度计测量在450nm的波长处的吸光度。此时，将基准设定为450nm。将各组的细胞活力计算为相对于对照(Con)的百分比(％)。其结果示于图4。

作为测量通过NK-CM的HaCaT细胞的死亡的结果，证实了细胞活力随着NK-CM浓度增加而增加。这意味着甚至100％NK-CM对细胞也没有细胞毒性，从而具有细胞生长作用。

实验例5.通过NK-CM处理的外根鞘(ORS)细胞的细胞活力的确认

将以单个细胞悬浮的ORS细胞以1×10⁴个细胞/孔接种在96孔板中，并且在37℃的CO₂培养箱中培养24小时。培养后，如下进行各处理：以100μL细胞培养液为基础，将100％NK-CM的添加量设定为最高浓度，然后以1/2稀释的方式稀释至4倍的最终稀释度；并且用稀释的NK-CM处理ORS细胞24小时。随后，将CCK-8溶液用各浓度的经NK-CM处理的ORS培养基以1:10的比例稀释，然后在37℃的CO₂培养箱中培养1小时。

然后，使用分光光度计测量在450nm的波长处的吸光度。此时，将基准设定为450nm。将各组的细胞活力计算为相对于对照(Con)的百分比(％)。其结果示于图5。

作为测量通过NK-CM的ORS细胞的死亡的结果，证实了细胞活力随着NK-CM浓度增加而增加，并且甚至100％NK-CM对细胞也没有细胞毒性。因此，这意味着NK-CM有助于作为主要构成细胞(constitutive cell)之一的ORS细胞的生长。

实验例6.HaCaT细胞中的促炎细胞因子与NK-CM处理之间的关系

通过借助实时聚合酶链反应(RT-PCR)测量参与细胞内促炎细胞因子分泌的信使RNA(mRNA)的表达水平来确认NK-CM在炎症诱导状态中的作用。

将HaCaT细胞以1×10⁵个细胞/孔接种在12孔板中，用50％或100％NK-CM处理2小时，然后用重组蛋白TNF-α(50ng/mL)处理24小时，以增加促炎细胞因子的表达并且最终诱发炎症状态。在洗去所有包含试剂的培养基后，将经处理的产物与1mL

RNA分离试剂(Invitrogen，USA)混合。将混合溶液在冰上温育30分钟，并且向其中添加400μL氯仿1，随后反应5分钟。接着，以16,000rpm进行离心20分钟。在分离和收集上层澄清溶液(即上清液)后，以与上清液相同的量添加异丙醇，并且使其反应5分钟，然后以16,000rpm离心10分钟。将沉淀的团块用70％的酒精洗涤3次。最后，在干燥4小时后，将产物在50μL纯净水中稀释以获得mRNA样品。

使用PrimeScript^TM RT预混液(Takara，Japan)合成包含双链DNA(cDNA)的所得样品。将5μL的5×PrimeScript^TM RT预混液添加至20μL的mRNA样品中，并且在37℃下加热20分钟，然后在85℃下加热10秒，从而获得合成的DNA双螺旋结构。

使用CFX-96(Bio-Rad，USA)扩增特定的基因。用于所有基因的扩增的PCR条件包括：95℃持续10分钟；95℃持续30秒；和60℃持续15秒，进行40次循环。根据定量方法，使用ΔCt由循环阈(Ct)值计算表达数据。此外，使用GAPDH进行标准化。将所得数据表示为相对于对照的相对值。其结果示于图6。

如图6所示，可以看出，在TNF-α处理组中，例如TSLP、IL-6、TNF-α、IL-8、IL-17a和IL-31等促炎细胞因子的mRNA水平显著增加。这意味着，与正常状态下的群体相比，使用TNF-α的细胞处理会增加炎症细胞因子的表达。然而，结果显示，在50％或100％NK-CM处理组中，NK-CM显著地降低促炎细胞因子的表达。这表明NK-CM可以抑制由于TNF-α引起的促炎细胞因子的表达，因此，NK-CM对HaCaT细胞具有抗炎作用。

实验例7.HMC-1细胞中的促炎细胞因子的表达与NK-CM处理之间的关系

通过借助实时聚合酶链反应(RT-PCR)测量参与细胞内促炎细胞因子分泌的信使RNA(mRNA)的表达水平来确认NK-CM在炎症状态中的作用。

将人源肥大细胞(即HMC-1细胞)以2×10⁶个细胞/孔接种在6孔板中，用50％或100％NK-CM处理2小时，用PMAC[PMA(25nM)+A23187(1μM)]处理，以诱导细胞脱粒(degranulation)并且最终诱发炎症状态，然后培养12小时。

在洗去所有包含试剂的培养基后，将经处理的产物与1mL

使用CFX-96(Bio-Rad，USA)扩增特定的基因。用于所有基因的扩增的PCR条件包括：95℃持续10分钟；95℃持续30秒；和60℃持续15秒，进行40次循环。根据定量方法，使用ΔCt由循环阈(Ct)值计算表达数据。此外，使用GAPDH进行标准化。将所得数据表示为相对于对照的相对值。其结果示于图7。

如图7所示，可以看出，在PMAC处理组中，例如TNF-α、IL-8、GM-CSF和MCP3等促炎细胞因子的mRNA水平显著增加。这意味着，与正常状态下的群体相比，使用PMAC的细胞处理会诱导脱粒并且最终增加炎症细胞因子的表达。然而，结果显示，在50％或100％NK-CM处理组中，NK-CM显著地降低三种促炎细胞因子(即TNF-α、IL-8和GM-CMF)的表达。另外，可以看出，MCP3的表达水平通过50％NK-CM处理没有降低，但是通过作为高浓度的100％NK-CM处理而大大降低。这表明NK-CM可以抑制由于PMAC处理引起的促炎细胞因子的表达，因此，NK-CM可以抑制由于HMC-1的脱粒而引起的炎症应答，从而具有抗炎作用。

实施例8.NK-CM组分的分析

为了分析NK条件培养基(NK-CM)的组分，使用人类生长因子抗体芯片(HumanGrowth Factor Antibody Array)C1、人类细胞因子芯片C5和人类趋化因子芯片C1试剂盒(Raybiotech，USA)进行分析。

收集NK细胞培养基和NK-CM，然后根据由Raybiotech提供的各产品的方案描述方法进行分析。基于微芯片结果，在图8中用图显示分析结果。

如图8所示，可以看出，与NK培养液相比，在NK-CM中与特应性皮炎有关的因子IL-2和IL-10增加。此外，与毛发生长有关的因子PDGF-AA和VEGF增加，并且与创伤恢复有关的因子TIMP-2的表达水平提高。这意味着，由于在包括不同因子(通过NK细胞通过生长和增殖排泄到培养基中)的NK-CM中与特应性皮炎、毛发生长和皮肤皱纹有关的项目(item)增加，因此NK-CM可以有助于改善抗特应性(anti-atopy)、脱发和皱纹。

Claims

1.一种化妆品组合物，其用于改善特应性皮炎、脱发、创伤或皮肤皱纹，所述化妆品组合物包括自然杀伤细胞的分泌物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述自然杀伤细胞的分泌物包括选自由IL-2、TIMP2、VEGF、PDGF-AA和IL-10组成的组中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述自然杀伤细胞的分泌物是从培养自然杀伤细胞、然后将其分离和纯化之后残留的残余培养液中获得的。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述培养包括在包含饲养细胞、饲养细胞刺激因子和生长因子的培养基中培养种子细胞。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述种子细胞是具有分化成自然杀伤细胞的潜力的人源细胞。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述人源细胞选自由外周血、外周血白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、富集的自然杀伤细胞、分离的自然杀伤细胞、脐带血、造血干细胞和诱导性多能干细胞组成的组。

7.根据权利要求4所述的组合物，其中所述生长因子是白介素。

8.一种药物组合物，其用于改善特应性皮炎、脱发、创伤或皮肤皱纹，所述药物组合物包括自然杀伤细胞的分泌物。

9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述自然杀伤细胞的分泌物包括选自由IL-2、TIMP2、VEGF、PDGF-AA和IL-10组成的组中的至少一种。

10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述自然杀伤细胞的分泌物是从培养自然杀伤细胞、然后将其分离和纯化之后残留的残余培养液中获得的。

11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述培养包括在包含饲养细胞、饲养细胞刺激因子和生长因子的培养基中培养种子细胞。

12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述种子细胞是具有分化成自然杀伤细胞的潜力的人源细胞。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述人源细胞选自由外周血、外周血白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、富集的自然杀伤细胞、分离的自然杀伤细胞、脐带血、造血干细胞和诱导性多能干细胞组成的组。

14.根据权利要求11所述的组合物，其中所述生长因子是白介素。