JP2021169453A - キノンメチドアナログシグナル増幅 - Google Patents

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D Kelly Brian
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Abstract

【課題】新規キノンメチドアナログ前駆体、並びに生物学的試料中の１つ又は複数の標的を検出するためにそれを使用する方法及びキットを提供する。【解決手段】検出方法は、試料を検出プローブと接触させること、次に試料を、酵素を含む標識コンジュゲートと接触させることを含む。酵素は、検出可能標識を含むキノンメチドアナログ前駆体と相互作用して、反応性キノンメチドアナログを形成し、それが、生物学的試料に、標的の近位において又は標的に直接的に結合する。次に検出可能標識が検出される。幾つかの実施態様において、複数の標的を、酵素不活性化工程を必要とすることなく、異なる酵素と相互作用する複数のキノンメチドアナログ前駆体により検出することができる。【選択図】図１

Description

関連出願とのクロスリファレンス
本出願は、２０１４年２月２４日出願の米国特許仮出願第６１／９４３９４０号の先の出願日の利益を主張し、その全体が出典明示により本明細書に援用される。
本開示は、新規キノンメチドアナログ前駆体、並びにそれを含む方法及びキットの実施態様に関する。
免疫組織化学（ＩＨＣ）は、特定の抗原に特異的な抗体などの特異的結合部分を使用して、生物学的試料中において、タンパク質などの抗原を、検出する、局在化させる及び／又は定量化するプロセスを指す。ＩＨＣは、特定のタンパク質が組織試料内のどこに位置しているかを正確に特定する有意な利点を提供する。組織それ自体を検査する有効な方法でもある。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、核酸を検出する、局在化させる及び定量化するプロセスを指す。ＩＨＣとＩＳＨは両方とも、組織（例えば、新たに凍結され、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された）及び細胞学的試料などの様々な生物学的試料において実施することができる。標的の認識は、標的が核酸であっても抗原であっても関係なく、様々な標識（例えば、色素産生性、蛍光性、発光性、放射性）を使用して、検出することができる。存在度の低い細胞マーカーを確信的に検出する能力が診断目的のためにますます重要になっているので、臨床設定において標的をしっかりと検出し、位置を特定し、定量化するために、認識事象を増幅することが望ましい。例えば、単一の抗原検出事象に応答して数百又は数千の標識分子をマーカーの部位に沈着させることは、増幅を介して、認識事象を検出する能力を向上させる。
バックグランドシグナルの増加と共に明白になる非特異的シグナルなどの有害事象が、多くの場合、増幅に伴っている。バックグランドシグナルの増加は、低いが臨床的に有意な発現に関連することがある、かすかなシグナルを不明瞭にすることによって、臨床分析を妨げる。したがって、認識事象の増幅は望ましいことであるが、バックグランドシグナルを増加しない増幅方法が、極めて望ましい。１つのそのような方法は、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）であり、これは触媒レポーター沈着（ＣＡＲＤ）とも呼ばれている。米国特許第５５８３００１号は、検出可能標識シグナルを増幅する触媒レポーター沈着に依存する被分析物依存性酵素活性化系を使用して、被分析物を検出及び／又は定量化する方法を開示する。ＣＡＲＤ又はＴＳＡ法における酵素の触媒作用は、標識されたフェノール分子を酵素と反応させることによって向上される。ＴＳＡを利用する近代的な方法は、ＩＨＣ及びＩＳＨアッセイにより得られるシグナルを有効に増加し、同時に有意なバックグランドシグナルの増幅を生じない（例えば、チラミド増幅試薬に関する開示に関して、その全体が出典明示により本明細書に援用される、米国特許出願第２０１２／０１７１６６８号を参照すること）。これらの増幅手法における試薬は、臨床的に重要な標的に適用されて、以前は得ることができなかったしっかりとした診断能力を提供する（ＯＰＴＩＶＩＥＷ（登録商標）Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ ＡＺ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ．７６０−０９９）。
ＴＳＡは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とチラミドとの反応を利用する。Ｈ２Ｏ２の存在下、チラミドは、タンパク質において電子が豊富なアミノ酸残基と優先的に反応する、高反応性で短命のラジカル中間体に変換される。次に、共有結合した検出可能標識を、様々な色素産生可視化技術により及び／又は蛍光顕微鏡検査法により検出することができる。空間的及び形態的な文脈が高く評価されるＩＨＣ及びＩＳＨなどの固相イムノアッセイでは、寿命が短いラジカル中間体は、チラミドとタンパク質との共有結合を、生成部位に近接した組織にもたらし、離散した特異的なシグナルを提示する。ＣＡＲＤは、被分析物依存性レポーター酵素（ＡＤＲＥ）を使用して、多数の検出可能標識とタンパク質との共有結合を触媒することを広義に定義し、ＨＲＰに基づいたＴＳＡは、商業的に認められた手法である。この分野において代替的な増幅系が強く必要とされているにもかかわらず、代替的なＡＤＲＥ系は存在しない。
Ｂｏｂｒｏｗの米国特許第７２９１４７４号は、ヒドロラーゼに基づいたＣＡＲＤの使用を仮定している。特にＢｏｂｒｏｗは、活性プローブの２−ジフルオロメチルフェニル及びｐ−ヒドロキシマンデル酸を増幅試薬として使用できると仮説を立てている。２−ジフルオロメチルフェニル及びｐ−ヒドロキシマンデル酸は、Ｚｈｕ等（２００３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４４，２６６９−２６７２、Ｌｏ等（２００２）Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．，１，３５−４０、Ｃｅｓａｒｏ−Ｔａｄｉｃ等（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１，６７９−６８５、Ｊａｎｄａ等（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５，９４５−９４８、Ｈａｌａｚｙ等（１９９０）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８，３３０−３４４及びＢｅｔｌｅｙ等（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１，７７５−７７７に記載されていた。Ｂｏｂｒｏｗが示唆した構造には以下が含まれ、

Figure 2021169453
,
ここで、Ｙは、加水分解酵素により切断されうる部分であり、Ｌは、検出可能標識であり、Ｘは、連結基であり、Ｚは、ハロゲンであり、Ｒは、水素、アルキル又はハロゲンである。特定の実施態様において、Ｒは水素であり、Ｚ基はフッ素である。これらの構造は、Ｚｈｕ等（２００３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４４，２６６９−２６７２により開示された特定の構造の一般化である。特にＺｈｕ等は、以下の構造を既知のホスファターゼ阻害剤として記載している。

Figure 2021169453

これらのホスファターゼ阻害剤に基づいて、Ｚｈｕ等は、以下の活性プローブを開発した。

Figure 2021169453


Figure 2021169453


Figure 2021169453

Ｚｈｕは、タンパク質の活性に基づいたプロファイリングが、プロテオミクス研究における立証済みの強力なツールであり、それにより酵素タンパク質のサブクラスを選択的に特定できることを開示している。このように、Ｚｈｕは、活性ホスファターゼ酵素の存在をシグナルする活性プローブを開発した。Ｚｈｕの戦略は、異なるクラスの酵素と反応して、粗プロテオーム混合物において他の非反応性タンパク質と容易に区別される、プローブタンパク質共有結合複合体の形成をもたらす、特定のプローブを利用する。
Ｚｈｕ等は、リン酸２−ジフルオロメチルフェニルが、酸及びアルカリホスファターゼを含む広範囲の異なるホスファターゼに対する一般的なホスファターゼ阻害剤であることは既知であったと記述している。阻害は、ホスファターゼがリン酸エステル基の切断を触媒して、フッ化物イオンが離れた後、反応性中間体を生成することによって発生する。反応性中間体は、酵素の活性部位と反応して、蛍光団を酵素活性部位と共有結合させる。しかし、それを行うことによって、リン酸エステルを加水分解的に更に切断する酵素の能力も阻害する。
シグナル生成部分を基質に共有結合する増幅スキームに酵素阻害剤を使用することは、結合シグナルの生成が酵素の活性を破壊しうるので、自己制限的であると理解される。性能（例えば、代謝回転、特異性）の改善が酵素活性部位のより効率的な破壊をもたらすので、これらの試薬に向上を追求することは自滅的である可能性があることが、当該技術において認識されている。したがって、複数のシグナル生成部位に結合させることによりシグナル増幅を得るため、最初に複数の酵素を標的の近位に結合させる必要がある。したがって、Ｚｈｕ等及びＢｏｂｒｏｗにより開示された化合物は、ＩＨＣ又はＩＳＨの増幅系のための商業的に実現可能な検出試薬として開発されていない。
更に、記載された増幅手法は、今日まで蛍光化合物の沈着を可能にしている。蛍光画像化が多くの場合に実施されており、それは極めて感受性が高いからであり、非常に少ない数の蛍光分子の検出は、今や常套的である。しかし、この感受性は、暗視野画像化を使用して達成されており、これはある特定の実用的制限を有している。例えば、明視野一次染色（例えば、ヘマトキシリン及びエオシン染色）を同時発生的に観察することができず、蛍光シグナルを形態学的特徴と相関させることがより困難になる。蛍光に基づいた検出は、吸光度・反射率に基づいた手法（例えば、色素産生性に基づいた検出）より、常套的に１０００倍感受性が高いことが知られている。このように、蛍光検出に適切な方法論は、色素産生検出方法論として使用するには１０００倍の改善が必要である。酵素に基づいた検出系の性能を１０００倍増加することは、簡単なことではない。現在まで、チラミドに基づいた系のみがこの性能の増加に到達している。
しっかりとした試薬が利用可能であるが、バックグランドシグナルを増加することなく、しっかりとした増幅を生じる代替的シグナル増幅手法の必要性が存続している。更に、組織試料中において２つ以上の異なる標的の検出を増幅する方法が、望ましい。
本明細書に開示されているキノンメチドアナログ前駆体（ＱＭＰ）及びこれらのＱＭＰを使用する実施態様は、先行技術に開示されたものより実質的に優れた結果を提供する。ＱＭＰは、分子内において、キノンメチド生成及び求核種安定化機能から、検出可能標識機能を分離する。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織などの組織のＩＨＣ及び／又はＩＳＨ染色にＱＭＰを利用する方法の実施態様も、本明細書に開示されている。発明者たちが知る限りにおいて、これは前に成功裏に実証されていない。組織試料において１つ又は複数の異なる標的の検出を増幅するＱＭＰを使用する方法の実施態様は、以前に知られている非ＱＭＰ法と比較して改善されたシグナルの質及び低減されたオフターゲット染色を提供する。開示されている方法を使用して複数の標的を同時又は順次の何れかで検出するとき、標的を、色素産生若しくは蛍光に基づいた検出方法又はこれらの組み合わせにより検出することができる。
幾つかの実施態様において、ＱＭＰは、下記の式：

Figure 2021169453

又はその塩若しくは溶媒和物を有し、式中、Ｚは、Ｏ、Ｓ又はＮＲａであり、Ｒ１は、酵素認識基であり、又はＺＲ１は、酵素認識基であり、Ｒ８は、−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ３Ｒ４）、−Ｒ３Ｒ４又は−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ６）であり、Ｒ９、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素、ハロ、シアノ、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２、−Ｒ３Ｒ４であるか、又は２つの隣接基は、共に脂肪族環若しくはアリール環を形成し、Ｒ１０は、水素、ハロ、シアノ、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２、−Ｒ３Ｒ４、−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ６）であるか、又はＲ９若しくはＲ１１の一方と共に、脂肪族環若しくはアリール環を形成する。
また、式を参照すると、ＬＧは、脱離基であり、又はＺＲ１及びＬＧは、共にホスホジエステルを形成し、Ｒ３は、リンカー又は結合であり、Ｒ４は、検出可能標識であり、各Ｒ５は、独立して、水素、ハロ、シアノ、低級アルキル、低級ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、各Ｒ６は、独立して、水素、ハロ、シアノ、低級アルキル、低級ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、Ｒａは、水素又は脂肪族であり、各Ｒｃは、独立して、水素、アリール、脂肪族若しくはヘテロ脂肪族であるか、又は２つのＲｃ分子は、共にヘテロ脂肪族環を形成する。加えて、Ｒ８及びＲ１０の少なくとも一方は、ＬＧを含み、Ｒ８及びＲ１０の少なくとも一方は、Ｒ３Ｒ４を含み又はＲ３Ｒ４からなり、ＬＧがハロである場合、Ｒ５及びＲ６はハロではない。
ある特定の実施態様において、ＱＭＰは、以下：
Figure 2021169453
から選択される式を有する。
幾つかの実施態様において、Ｒ１又はＺＲ１は、ホスフェート、アミド、ニトロ、尿素、サルフェート、メチル、エステル、ベータラクタム又は糖である。Ｚは、Ｏであっても良く、及び／又はＺＲ１は、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＮＯ２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ、ＯＣＨ３若しくはそれらの塩であっても良い。幾つかの実施態様において、糖は、α−グルコース、β−グルコース、α−ガラクトース、β−ガラクトース、α−グルクロノース又はβ−グルクロノースである。
ＬＧは、ハロゲン化物、硫酸エステル、カルボキシレート、無機エステル、チオレート、アミン、アリールオキシ、アルコキシ又はヘテロアリールなどの任意の適切な脱離基でありうる。幾つかの実施態様において、ＬＧは、フッ化物、塩化物、アジド、酢酸エステル、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、フェノキシド、−ＯＳ（Ｏ）２ＣＨ３、−ＯＳ（Ｏ）２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＳ（Ｏ）２Ｃ６Ｈ５、−ＯＳ（Ｏ）２Ｃ６Ｈ４ＣＸ３、−ＯＣ６Ｈ５、−Ｎ２ ＋、−ＮＨ３ ＋、−ＮＣ５Ｈ５ ＋、−Ｏ−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｈ、−Ｎ（Ｒｂ）３ ＋又は１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）であり、ここで、各Ｘは、独立して、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードであり、各Ｒｂは、独立して、水素又は低級アルキルであるか、あるいは２つのＲｂ部分は、共にヘテロ脂肪族環を形成する。ある特定の実施態様において、ＬＧはＦである。
ある特定の開示されている方法の実施態様は、生物学的試料を、第１の標的に特異的な第１の検出プローブと接触させることを含む。生物学的試料を、第１の酵素を含む第１の標識コンジュゲートと接触させる。また生物学的試料を、第１の酵素認識基と第１の検出可能標識とを含む第１のＱＭＰと接触させる。第１の酵素は、第１の酵素認識基を切断し、それによって第１のＱＭＰを第１の反応性キノンメチドアナログ（ＱＭ）に変換し、これは、生物学的試料に、第１の標的の近位において又は第１の標的に直接的に共有結合する。生物学的試料を接触させることは、（ｉ）生物学的試料を、０超から１ｍＭの濃度などの所望のレベルの増幅を与えるのに有効な前駆体濃度で第１のＱＭＰと接触させること、（ｉｉ）生物学的試料を、７超から１４又は８超から１２のｐＨなどの拡散及び／若しくはオフターゲット染色を所望の量に低減するのに有効なｐＨで第１のＱＭＰと接触させること、（ｉｉｉ）生物学的試料を、塩化マグネシウムなどの塩の存在下、拡散及び／若しくはオフターゲット染色を所望の量に低減するのに有効な塩濃度、典型的には０．１Ｍから２Ｍ若しくは０．５Ｍから１．２５Ｍで第１のＱＭＰと接触させること、（ｉｖ）生物学的試料を、本明細書に開示されている化合物と接触させること、又は（ｖ）これらの任意の組み合わせを含む。次に第１の標的を、第１の検出可能標識を検出することによって検出する。この方法は、自動化されたプロセスであっても良い。
前駆体濃度は、色素産生染色では５０μＭから５００μＭ又は蛍光染色及びハプテン増幅では５０ｎＭから１０μＭであっても良い。
幾つかの例において、第１の標識コンジュゲートは、第１の酵素に結合した抗体を含む。抗体は、抗種又は抗ハプテン抗体であっても良い。第１の標識コンジュゲートは、第１の検出プローブと直接的又は間接的に会合しても良い。第１の検出プローブは、ハプテン又は抗種抗体を含んでも良く、第１の標識プローブは、対応する抗ハプテン又は第２の抗種抗体を含んでも良い。第１の酵素及び第１の酵素認識基は、相互作用してＱＭを形成する任意の適切な酵素及び酵素認識基でありうる。
第１の反応性ＱＭは、生物学的試料、第１の標識コンジュゲート、第１の検出プローブ又はこれらの組み合わせにおいて求核種と反応する。典型的な求核種には、アミノ酸、核酸残基又は炭水化物のアミノ、スルフヒドリル又はヒドロキシル基が含まれる。
第１のＱＭＰは、上記に開示された式又は代替的に下記：
Figure 2021169453
から選択される式又はその塩若しくは溶媒和物を有しても良い。これらの式に関して、Ｚ、ＬＧ、Ｒａ、Ｒｃ、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ９−Ｒ１２は、以前に定義された通りであり、Ｒ１３−Ｒ２９は、それぞれ独立してＲ９、Ｒ１１及びＲ１２の通りに定義され、Ｒ９−Ｒ２９の少なくとも一方は、Ｒ３Ｒ４を含む又はＲ３Ｒ４からなる。
この方法は、多重化された方法であっても良い。幾つかの実施態様において、第１の標的を検出することに加え、方法は、生物学的試料を、第２の標的に特異的な第２の結合部分と接触させることを更に含む。第２の標的を、第２の結合部分を介して第２の酵素により標識する。生物学的試料を第２の検出前駆体化合物と接触させ、それが第２の酵素と相互作用して、第２の検出化合物を第２の標的に直接的に又は第２の標的の近位において沈着させる。次に第２の検出化合物を検出する。第１の酵素及び第２の酵素は、典型的には異なる酵素である。第１及び第２の標的を対応する結合部分と接触させること、並びに／又は第１及び第２の検出化合物を検出することは、順次又は実質的に同時に起こっても良い。
ある特定の実施態様において、第１の酵素は、第１のＱＭＰと選択的に反応し、第２の酵素は、第２の検出前駆体化合物と選択的に反応する。特定の実施態様において、第１の酵素は、アルカリホスファターゼであり、第１の酵素認識基は、リン酸エステルである。第２の酵素は、ペルオキシダーゼでありうる。
幾つかの実施態様において、第２の検出前駆体化合物は、第２の酵素認識基と第２の検出可能標識とを含む第２のＱＭＰである。第２のＱＭＰは第２の酵素と相互作用して、生物学的試料に、第２の標的の近位において又は第２の標的に直接的に共有結合する第２のＱＭを形成する。第２の酵素は、第２の酵素認識基がβ−ガラクトシドの場合にβ−ガラクトシダーゼなどのように、典型的には第１と異なる酵素である。
当業者は、方法を、追加的な異なる標的の検出を含むように拡大できることを理解する。これは、生物学的試料を、標的に特異的な追加の結合部分と接触させること、結合部分を異なる酵素で標識すること、試料を、酵素のために選択された検出前駆体化合物と接触させること、及び検出化合物を検出することによって、達成することができる。
本明細書に開示されている染色増幅化合物を含むキットも、開示される。幾つかの実施態様において、キットは、酵素抗体コンジュゲート、ＱＭＰ、溶媒混合物及びｐＨ調整溶液を含む。溶媒混合物は、有機溶媒及び水性バッファーを含んでも良い。幾つかの実施態様において、有機溶媒はＤＭＳＯである。水性バッファーは、ｐＨ０からｐＨ５又はｐＨ１からｐＨ３のｐＨ範囲を有しても良い。幾つかの実施態様において、ｐＨ調整溶液は、ｐＨ８からｐＨ１２のｐＨ範囲を有する。特定の実施態様において、キットは、塩化マグネシウムなどの塩を含み、これは０．２５Ｍから１．５Ｍの濃度を有しても良い。幾つかの実施態様において、ＱＭＰは、本明細書に開示されている化合物であり、溶媒混合物は、ＤＭＳＯ及びｐＨ２のグリシンバッファーを含み、ｐＨ調整溶液は、ｐＨ範囲がｐＨ８からｐＨ１０のＴｒｉｓバッファーであり、並びに／又はキットは、塩化マグネシウムを０．５Ｍから１．２５Ｍの濃度で更に含む。
本発明の前述及び他の目的、特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態によってより明白になり、これは添付の図面を参照しながら進められる。
検出可能標識を含むＱＭＰを使用して標的を検出することを説明している概略図である。 例示的なＱＭＰを提供する表である。 例示的なＱＭＰを提供する表である。 検出可能標識を有するＱＭＰから、標的シグナルを増幅するキノンメチドへの、ホスファターゼ媒介変換を説明する図である。 生物学的組織中の標的検出を増幅する方法の１つの例示的な実施態様を説明する図である。 生物学的組織中の標的検出を増幅する方法の第２の例示的な実施態様を説明する図である。 Ｂｃｌ−６の扁桃組織における、ＰＥＧリンカーを有するＱＭＰ−ダブシル誘導体の染色強度の増加を説明する、２０×倍率の顕微鏡写真である。 Ｂｃｌ−６の扁桃組織における、ＰＥＧリンカーを有するＱＭＰ−Ｔａｍｒａ誘導体の染色強度の増加を説明する、２０×倍率の顕微鏡写真である。 Ｐａｎ−ケラチン（ＱＭ−ＰＥＧ８−ダブシル、黄色）及びＨｅｒ２（Ｔｙｒ−ＴＡＭＲＡ、紫色）の同時の抗体インキュベーション及び順次の色素産生検出を説明する、１０×倍率での乳房組織の二重明視野ＩＨＣアッセイの顕微鏡写真である。 ４０×倍率に拡大した図８（Ａ）の一部である。 ＣＤ８（Ｔｙｒ−ローダミン−１１０、栗色）、ＣＤ３（ＱＭ−Ｃｙ５、青色）、ＦｏｘＰ３（Ｔｙｒ−Ｔａｍｒａ、紫色）及びＰａｎ−ケラチン（ＱＭ−ＰＥＧ８−ダブシル、黄色）の順次検出を説明する、４０×倍率の扁桃組織における四重明視野ＩＨＣアッセイの顕微鏡写真である。 ＦＦＰＥ扁桃組織におけるＡＰに基づいたＱＭＰ（Ｋｉ６７、暗赤色、核）及びＨＲＰに基づいたＴＳＡ（Ｂｃｌ２、明緑色、膜）検出の両方を利用する蛍光二重アッセイの顕微鏡写真である。 ｐＨ７．５での乳房組織におけるＥ−カドヘリンのキノンメチド染色の顕微鏡写真である。 ｐＨ１０での乳房組織におけるＥ−カドヘリンのキノンメチド染色の顕微鏡写真である。 ｕｌｔｒａＶｉｅｗ ＤＡＢ（Ｂ）と比較した、モノフルオロ脱離基及び５−ニトロ−３−ピラゾールカルバミド（ニトロピラゾール）検出可能標識を有するＱＭＰ（Ａ）による、ＦＦＰＥ扁桃組織におけるＫｉ６７の機能的染色増幅を説明する顕微鏡写真である。 モノフルオロ脱離基及び５−ニトロ−３−ピラゾールカルバミド（ニトロピラゾール、ＮＰ）検出可能標識を有するＱＭＰ、続く抗ＮＰ抗体／アルカリホスファターゼコンジュゲート及びファストレッド染色（Ｂ）による、ＦＦＰＥ扁桃組織におけるＣＤ−１０の機能的染色（Ａ）又はＣＤ−１０の増幅（Ｂ）を説明する顕微鏡写真である。 モノフルオロ脱離基及び５−ニトロ−３−ピラゾールカルバミド（ニトロピラゾール、ＮＰ）検出可能標識を有するＱＭＰ、続く抗ＮＰ抗体／アルカリホスファターゼコンジュゲート及びファストレッド染色による、ＦＦＰＥ扁桃組織におけるＢｃｌ２の増幅（Ｃ）又はＦＦＰＥ乳房組織におけるＨｅｒ３の増幅（Ｄ）を説明する顕微鏡写真である。 モノフルオロ脱離基及びＴＡＭＲＡ検出可能部分（Ａ）、ＡＦ７００検出可能部分（Ｂ）又はニトロピラゾール検出可能部分を有するＱＭＰによる、続いて量子ドット（ＱＤ５２５）標識抗ニトロピラゾール抗体（Ｃ）による、ＦＦＰＥ扁桃組織におけるＢｃｌ２の機能的染色増幅を説明する顕微鏡写真である。 モノフルオロ脱離基及びダブシル検出可能部分（Ａ）又はＴＡＭＲＡ検出可能部分（Ｂ）を有するＱＭＰによる、ＦＦＰＥ扁桃組織におけるＫｉ６７の機能的染色増幅を説明する顕微鏡写真である。 モノフルオロ脱離基及びＣｙ５検出可能部分（Ｃ）又はローダミン１１０検出可能部分（Ｄ）を有するＱＭＰによる、ＦＦＰＥ扁桃組織におけるＫｉ６７の機能的染色増幅を説明する顕微鏡写真である。 ジフルオロ脱離基を有し、ビオチン検出可能標識とコンジュゲートしたＱＭＰ（Ｂ）と比較した、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ ３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ａ）によるホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）皮膚組織における上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の機能的染色増幅を説明する顕微鏡写真である。 ビオチン化ジフルオロＱＭ前駆体を使用したＡＰに基づいたＣＡＲＤ ＩＨＣ（ＦＦＰＥ扁桃組織におけるＢＣＬ６）、続く様々な濃度のＱＭ前駆体によるＤＡＢ検出を説明する顕微鏡写真である。 様々なｐＨでの染色結果を説明する、２０μＭのビオチン化ジフルオロＱＭ前駆体を使用したＡＰに基づいたＣＡＲＤ ＩＨＣ（ＦＦＰＥ扁桃組織におけるＢＣＬ６）、続くＤＡＢ検出の顕微鏡写真である。 様々なｐＨでの染色結果を説明する、２５０ｎＭのビオチン化モノフルオロＱＭ前駆体を使用したＡＰに基づいたＣＡＲＤ ＩＨＣ（ＦＦＰＥ扁桃組織におけるＢＣＬ６）、続くＤＡＢ検出の顕微鏡写真である。 ピリジン（Ｂ）、ＤＡＢＣＯ（Ｃ）又はトリフェニルアミン（Ｄ）脱離基を有し、ビオチン検出可能標識とコンジュゲートしたＱＭＰと比較した、ｕｌｔｒａＶｉｅｗコントロールによるＦＦＰＥ扁桃組織におけるＫｉ６７の最適な染色増幅（Ａ）を説明する顕微鏡写真である。 酢酸エステル脱離基（Ｃ）又はメトキシ脱離基（Ｄ）及びビオチン検出可能標識を有するＱＭＰと比較した、ｕｌｔｒａＶｉｅｗ ＤＡＢ（Ａ）及びモノフルオロ基とビオチン検出可能標識とを有するＱＭＰ（Ｂ）によるＦＦＰＥ扁桃組織におけるＫｉ６７の最適な機能的染色増幅を説明する顕微鏡写真である。 モノフルオロ脱離基、ビオチン検出可能標識及びそれらの構造が図２により提供されている、アニリンアミドリンカー（化合物７）（Ａ）、安息香酸アミドリンカー（化合物２１）（Ｂ）又はチラミドアミドリンカー（化合物１４）（Ｃ）を有するＱＭＰによる、ＦＦＰＥ扁桃組織におけるＢｃｌ２の機能的染色増幅を説明する顕微鏡写真である。 図１７（Ｂ）の顕微鏡写真を更に拡大したものである。 図１７（Ａ）の顕微鏡写真を更に拡大したものである。 Ｔｒｉｓによるモノフッ化ＱＭ前駆体からのＱＭ中間体の捕捉を説明する図である。 図２４において説明された反応による化合物のＨＰＬＣクロマトグラムである。 本明細書に開示されているＱＭＰの例示的な構造を提供する。 塩化マグネシウム濃度の増加を伴う、扁桃組織におけるＣＤ８染色の質の改善を説明する顕微鏡写真である。 β−ガラクトシダーゼ酵素による、並びにβ−ガラクトシド−ＱＭＰ−Ｃｙ５（１２５ｕＭ）と核ファストレッド（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ）ＣＳ（Ａ）、β−ガラクトシド−ＱＭＰ−Ｃｙ５（１２５ｕＭ）とヘマトキシリンＣＳ（Ｂ）及びβ−ガラクトシド−ＱＭＰ−Ｃｙ３（１００ｕＭ）とヘマトキシリンＣＳ（Ｃ）による、２０×倍率での扁桃組織におけるＫｉ−６７の機能的染色を説明する顕微鏡写真である。 同時抗体インキュベーション及び同時色素産生検出を使用する、ヘマトキシリン対比染色による扁桃組織におけるＢｃｌ−６（ホスホ−ＱＭ−ＰＥＧ８−ダブシル、黄色）及びＫｉ６７（β−Ｇａｌ−ＱＭ−Ｃｙ５、青色）の同時検出を説明する、二重明視野ＩＨＣアッセイの顕微鏡写真である。 同時抗体インキュベーション及び同時色素産生検出を使用する、ヘマトキシリン対比染色を用いる、ホスホ−ＱＭ−ＰＥＧ８−ダブシル、β−Ｇａｌ−ＱＭ−Ｃｙ５、Ｔｙｒ−Ｔａｍｒａによる乳房組織におけるＨｅｒ２、ＥＲ、ＰＲの同時検出を説明する、三重明視野ＩＨＣアッセイの顕微鏡写真である。 乳房組織におけるＨｅｒ２（ＨＲＰ ＤＡＢ、褐色）、ＰＲ（β−Ｇａｌ−ＱＭ−Ｃｙ５、青色）、ＥＲ（Ｔｙｒ−Ｔａｍｒａ、紫色）及びＫｉ６７（ホスホ−ＱＭ−ＰＥＧ８−ダブシル、黄色）の順次検出を説明する、四重明視野ＩＨＣアッセイの顕微鏡写真である。 乳房組織におけるＨｅｒ２（ＨＲＰ ＤＡＢ、褐色）、ＰＲ（β−Ｇａｌ−ＱＭ−Ｃｙ５、青色）、ＥＲ（Ｔｙｒ−Ｔａｍｒａ、紫色）及びＫｉ６７（ホスホ−ＱＭ−ＰＥＧ８−ダブシル、黄色）の順次検出を説明する、四重明視野ＩＨＣアッセイの第２の顕微鏡写真である。 ＱＭ緑色（ＰＥＧ８−ダブシル及びＣｙ５）による扁桃組織（Ａ）及びＭＣＦ−７異種移植片（Ｂ）における染色体１７動原体ＩＳＨの顕微鏡写真である。 ２つのＨＲＰに基づいた検出系及び２つのＡＰ ＱＭＰに基づいた検出系を使用した順次検出により染色した、４０×倍率でのＦＦＰＥ乳房組織における同じバイオマーカー（Ｈｅｒ２、Ｋｉ−６７、ＥＲ及びＰＲ）を示す４つの異なる染色プロトコールの顕微鏡写真である。 ２つのＨＲＰに基づいた検出系及び２つのＡＰ ＱＭＰに基づいた検出系を使用した順次検出により染色した、ＦＦＰＥ扁桃組織における５×倍率でのＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２０（又はＣＤ６８）及びＦｏｘＰ３の異なる染色プロトコール（Ａ−Ｂ又はＣ−Ｄ）の顕微鏡写真である。 １０×倍率でのオルト−及びパラ−ＱＭＰ−ＴａｍｒａによるＦＦＰＥ乳房組織におけるＥ−カドヘリンの機能的染色増幅を説明する顕微鏡写真である。
Ｉ．定義
別途示されない限り、技術用語は、従来の用法に従って使用される。分子生物学の一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ発行，２０００（ＩＳＢＮ ０１９８７９２７６Ｘ）、Ｋｅｎｄｒｅｗ等（編），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ発行，１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．発行，１９９５（ＩＳＢＮ ０４７１１８６３４１）、並びに他の類似した参考文献において見出すことができる。
本明細書に使用されるとき、単数形の用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から別途明示のない限り、複数の参照を含む。同様に、語「又は（ｏｒ）」は、文脈から別途明示のない限り、「及び（ａｎｄ）」を含むことが意図される。また、本明細書に使用されるとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。故に、「Ａ又はＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ Ａ ｏｒ Ｂ）」は、ＡかＢ又はＡ及びＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）ことを意味する。全てのヌクレオチドのサイズ又はアミノ酸のサイズ及び全ての分子量又は分子質量の値は、核酸若しくはポリヌクレオチド又は他の化合物を考慮すると近似値であり、記載中に提供されることが更に理解されるべきである。本明細書に記載されているものに類似又は同等の方法及び材料を、本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料が下記に記載されている。本明細書に記述される全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体が出典明示により援用される。競合する場合、用語の説明を含み、本明細書が支配する。加えて、材料、方法及び例は、説明のためだけであり、限定的であることを意図しない。
別途指示のない限り、構成成分、分子量、百分率、温度、時間、濃度などの量を表す全ての数字は、明細書又は特許請求の範囲に使用されるとき、用語「約」により修飾されていると理解されるべきである。したがって、暗示的であっても明示的であっても別途指示のない限り、設定される数値パラメーターは、探求される望ましい特性及び／又は標準的な試験条件／方法下での検出限界に応じて左右されうる近似値である。実施態様を、考察される先行技術と直接的及び明示的に区別するとき、実施態様の数字は、語「約」が引用されない限り、近似値ではない。
下記に提供される一般式では、置換基が示されない場合、当業者は、置換基が水素であることを理解する。原子に接続していないが、例えば環系の内部に伸びているように示されている結合は、そのような置換基の位置が変動することを示している。結合を介して描かれている曲線は、幾つかの追加の構造がその位置に結合することを示す。更に、１つ又は複数のキラル中心を有する化合物に立体化学が示されていない場合、全ての鏡像異性体及びジアステレオマーが含まれる。同様に、脂肪族又はアルキル基の列挙では、その構造異性体も全て含まれる。
本開示の様々な実施態様の検討を容易にするため、以下の特定の用語の説明を提供する。
脂肪族：実質的に炭水化物に基づいた化合物又はそのラジカル（例えばヘキサンラジカルではＣ６Ｈ１３）であり、アルカン、アルケン、アルキンが含まれ、それらの環状型が含まれ、直鎖及び分岐鎖の配置、並びに全ての立体及び位置異性体も更に含まれる。別途明確な記述のない限り、脂肪族基は、１から２５個の炭素原子、例えば、１から１５個、１から１０個、１から６個又は１から４個の炭素原子を含有する。用語「低級脂肪族」は、１−１０個の炭素原子を含有する脂肪族基を指す。「非置換脂肪族」と別途明確な参照のない限り、脂肪族基は、非置換又は置換の何れかでありうる。
アルキル：飽和炭素鎖を有する炭水化物基である。鎖は、環状、分岐又は非分岐であっても良い。低級アルキルという用語は、鎖が１−１０個の炭素原子を含むことを意味する。別途記述のない限り、アルキル基は、置換されていても、非置換であっても良い。
アルコキシ：式：−Ｏ−アルキルを有する基であり、式中、アルキルは本明細書に定義されている通りである。
アナログ：アナログは、親化合物と化学構造が異なる分子であり、例えば、ホモログ（アルキル鎖の長さが異なるなど、化学構造に一定数の差がある）、分子断片、１つ又は複数の官能基が異なる構造、イオン化の変化である。構造的アナログは、多くの場合、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（The Science and Practice of Pharmacology,第19版(1995),第28章）に記載されているものなどの技術との定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）を使用して見出される。
芳香族又はアリール：別途特定されていない限り６から１５個の環原子の、単一環（例えば、フェニル、ピリジル）又は少なくとも１つの環が芳香族である多重縮合環（例えば、キノリン、インドール、ベンゾジオキソールなど）を有する芳香族炭素環式又は複素環式基であり、但し、結合点はアリール基の芳香族部分の原子を介することが条件である。任意の芳香族環部分がヘテロ原子を含有する場合、基は、ヘテロアリールであり、そうでなければ、基は炭素環式アリール基である。アリール基は、単環式、二環式、三環式又は四環式であっても良い。別途記述のない限り、アリール基は、置換されていても、非置換であっても良い。
アリールオキシ：式：−Ｏ−アリールを有する基であり、式中、アリールは本明細書に定義されている通りである。
コンジュゲート：２つ以上の部分が直接的又は間接的に一緒に結合しているものである。例えば、第１の部分は、第２の部分と共有的又は非共有的に（例えば、静電気的に）結合していても良い。「リンカー」（２つの部分の間に位置する分子又は原子の一群）を使用するなどの間接的な結合が可能である。
コンジュゲート系：本明細書に使用されるとき、用語「コンジュゲート系」は、非局在化パイ電子を有する重複軌道（典型的には、ｐ軌道）を含む化合物を指す。典型的には、化合物は、交互単及び多重結合を含む。重複ｐ軌道は、隣接する重複ｐ軌道の間に単結合を架橋する。孤立対、ラジカル及びカルベニウムイオンは、系の一部でありうる。系は、環状、非環式又はこれらの組み合わせでありうる。例示的なコンジュゲート系には、ベンゼン、ピラゾール、イミダゾール、ピリジン、ピリミジン、ピロール、フラン、チオフェン、ナフタレン、アントラセン、インドール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイミダゾール及びプリンなどの芳香族化合物が含まれるが、これらに限定されない。
接触させる：２つ以上の部分の間に会合、特に直接的な物理的会合を、例えば、固体形態及び／又は液体形態の両方において可能にする配置（例えば、本明細書に開示されている組成物を含有する溶液などの組成物と接触する、スライドに固定されている生物学的試料などの生物学的試料の配置）である。
検出する：作用物質（シグナル又は特定の抗原、タンパク質若しくは核酸など）が、例えば試料中に存在するか又は不在であるかを決定することである。幾つかの例において、このことは、定量化及び／又は局在化、例えば細胞若しくは特定の細胞区画内での局在化を更に含むことができる。「検出すること」は、標的分子が生物学的試料中に存在するかを決定することなど、何かが存在するか又は存在しないかを決定する任意の方法を指す。例えば、「検出すること」は、視覚的又は機械的な装置を使用して、試料が特定の特徴を示すかを決定することを含むことができる。ある特定の例において、光学顕微鏡法及び他の顕微鏡手段を使用して、標的に結合した又は標的の近位に結合した検出可能標識を検出する。
検出可能標識：組織試料などの試料中の標的分子などの標的の存在及び／又は濃度を示す検出可能（視覚的に、電気的に又は他の方法により）シグナルを生じることができる分子又は材料である。標的に直接的に又は標的の近位において結合することができる分子にコンジュゲートさせると、検出可能標識を使用して、標的の位置を特定する及び／又は標的を定量化することができる。これによって、試料中の標的の存在及び／又は濃度を、検出可能標識により生じるシグナルの検出によって検出することができる。検出可能標識を直接的又は間接的に検出することができ、異なる分子にコンジュゲートされた幾つかの異なる検出可能標識を組み合わせて使用して、１つ又は複数の標的を検出することができる。別々に検出されうる複数の検出可能標識を、異なる標的に直接的に又は異なる標的の近位において結合する異なる分子にコンジュゲートさせて、試料中の複数の標的の検出を提供できる多重化されたアッセイを提供することができる。本明細書に使用されるとき、検出可能標識には、着色、蛍光性、リン光性及び発光性の分子及びハプテンが含まれる。
電子供与基：電子密度の幾つかをコンジュゲート系に供与できる原子又は官能基である。電子密度は、σ結合（誘導）を介して又はπ結合（共鳴）を介して供与されうる。幾つかの官能基は、一方の機構により供与基であり、他方の機構により求引基である。例示的な電子供与基には、−ＮＨ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ２、−ＯＨ、−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＲ、−Ｒが含まれるが、これらに限定されず、ここでＲは、低級アルキルなどのアルキル（例えば、メチル、エチル）である。
電子求引基：電子密度をコンジュゲート系から求引できる原子又は官能基である。電子密度は、σ結合（誘導）を介して又はπ結合（共鳴）を介して求引されうる。幾つかの官能基は、一方の機構により供与基であり、他方の機構により求引基である。例示的な電子求引基には、ハロ、ハロアルキル、−ＮＨ３ ＋、−ＮＯ２、−ＣＨ＝ＣＨ２、−ＣＮ、−ＳＯ３Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＮＲ３ ＋が含まれるが、これらに限定されず、ここでＲは、低級アルキルなどのアルキル（例えば、メチル、エチル）である。
ヘテロ脂肪族：１個又は複数の炭素がヘテロ原子に代えられている脂肪族化合物である。例示的なヘテロ原子には、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ又はＢが含まれるが、これらに限定されない。ヘテロ脂肪族部分は、置換されていても、非置換であっても良い。置換は、炭素原子であっても、ヘテロ原子であっても良い。
ヘテロアリール：少なくとも１個のヘテロ原子を有する、すなわち、環中の１個又は複数の炭素原子が、少なくとも１つの孤立電子対を有する原子、典型的には、窒素、酸素、リン、ケイ素又は硫黄に代えられている、芳香族化合物又は基である。別途記述のない限り、ヘテロアリール基は、置換されていても、非置換であっても良い。
無機エステル：無機酸及びアルコールから誘導されるエステルである。例示的な無機酸には、リン酸、硫酸、硝酸又はホウ酸が含まれるが、これらに限定されない。無機エステルには、硫酸エステル、リン酸エステル、硝酸エステル又はホウ酸エステル、例えばリン酸トリフェニルが含まれるが、これらに限定されない。
脱離基：異種溶解結合切断の際に１対の電子により排除される分子断片である。脱離基の他の用語は、核脱離である。脱離基は、アニオンであっても、中性分子であっても良い（脱離基が分子に結合した際に正荷電される場合、１対の電子により脱離するときに中性になる）。分子断片が脱離基になる能力（すなわち、その核移動能（ｎｕｃｌｅｏｆｕｇａｌｉｔｙ）又は核逃散能（ｎｕｃｌｅｏｆｕｇａｃｉｔｙ））は、その安定性と相関する。幾つかの状況において、例えば、脱離基が弱塩基性であるとき、脱離基が離れる能力は、脱離基のコンジュゲート酸のｐＫａと関連することがあり、ｐＫａが低いほど、常にとは限らないが多くの場合に、脱離基の良好な能力と相関する。当業者は、脱離基の相対的な核移動能を示す、例えば有機化学の教科書における容易に利用可能な表のことを認識している。
実質的非阻害性：ＱＭＰは、酵素の反応性部位と反応しないように酵素から拡散するキノンメチドを形成する場合、実質的に非阻害性である。実質的な非阻害性は、特定の酵素及びＱＭＰの機能性試験によって確立することができる。一般に、本明細書に記載されている染色が長時間（例えば、＞５分間）にわたって増加する場合、ＱＭＰは、実質的に非阻害性である。ＱＭＰが酵素を阻害する場合、染色の量は、経時的に又は更なるＱＭＰの添加によって増加しない。
求核種：化学反応の際に電子対を正荷電（又は部分的に正荷電）原子に供与して、化学結合を形成することができる化学種である。孤立電子対又は少なくとも１つのパイ結合を有するアニオン及び分子は、求核種として作用することができる。
オリゴヌクレオチド：ホスホジエステル結合により結合している、長さが約６個から約３００個のヌクレオチドの複数の結合ヌクレオチドである。本明細書に使用されるとき、オリゴヌクレオチドという用語は、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド（例えば、非天然に生じるＤＮＡ又はＲＮＡ配列）及びオリゴヌクレオチドアナログを指す。オリゴヌクレオチドアナログは、オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、非天然に生じる一部分を有する部分を指す。例えば、オリゴヌクレオチドアナログは、変更された糖部分などの非天然に生じる一部分又はホスホロチオエートオリゴヌクレオチドなどの糖間連結を含有することができる。天然に生じるポリヌクレオチドの機能的アナログは、ＲＮＡ又はＤＮＡに結合することができ、ペプチド核酸分子が含まれうる。
プローブ：試料中の別の物質を検出又は特定するために使用される物質である。本明細書に使用されるとき、プローブは、抗体、抗体断片、単離された核酸又は組織試料に存在する所望の標的、例えば、標的タンパク質若しくは核酸配列に特異的に結合することができる単離された合成オリゴヌクレオチドでありうる。プローブは、検出可能標識又はレポーター分子（例えば、ハプテン）を含んでも良い。
置換されている：典型的には水素原子の代わりに別の原子又は基、すなわち置換基が結合している、アリール若しくは脂肪族化合物又はそのラジカルなどの基本化合物である。例えば、置換されているアリール化合物又は置換基は、トルエンなど、アリール基剤の閉環に結合している脂肪族基を有することができる。ここでも、単なる例として、限定されることなく、長鎖炭水化物は、１個又は複数のハロゲン、ヒドロキシル若しくは＝Ｏなどの酸素、アリール基、環状基、ヘテロアリール基又は複素環基などの、結合している置換基を有することができる。
標的：その存在、位置及び／又は濃度が決定される分子である。例示的な標的には、組織試料に存在するタンパク質及び核酸配列が含まれる。
チオレート：式：−Ｓ−Ｒを有する部分であり、式中、Ｒは、アリール、脂肪族又はヘテロ脂肪族部分である。
ＩＩ．キノンメチドアナログ前駆体
Ａ．概観
本開示は、ＱＭ及びそれらの前駆体に関連する組成物、キット及び方法に関する。本開示のＱＭＰは、酵素に直接的に又は酵素の近位において結合できる反応性キノンメチドへのキノンメチド前駆体の酵素触媒変換を使用する、検出事象の増幅のために開発された。
キノンメチドは、対応するキノンのカルボニル酸素の１個がメチレン基（ＣＨ２）に代えられてアルケンを形成する、キノンアナログであり、下記に示されている。
Figure 2021169453
（例えば、キノンメチドに関する一般的開示が出典明示により本明細書に援用される、Rokita, Quinone Methides, April 2009, John Wiley & Sons, Inc.を参照すること）。
キノンメチドのメチレン部分は、適切な反応性求核種と反応する極めて反応性の高い求電子剤である。反応性求核種は、免疫組織化学用途における染色試薬酵素、酵素がコンジュゲートする抗体及び生物学的試料それ自体によって提供されうる。キノンメチドのｉｎ ｓｉｔｕでの生成は、標識が、マトリックス（例えば、組織）内に存在する求核残基に共有結合できるようにする。例示的な求核残基には、アミノ酸のアミノ、ヒドロキシル及びチオール基（例えば、リシン、チロシン、トレオニン、セリン及びシステイン）、並びに核酸のアミノ、カルボニル及びヒドロキシル基などの、反応性窒素、酸素及び硫黄含有基を含む生体分子が含まれる。
キノンメチド（ＱＭ）を形成することができる酵素基質を、潜在的な機構に基づいた、ヒドロラーゼ酵素の阻害剤として最初に調査した。例えば、ＱＭＰを、生物学的に不活性な硫酸化ステロイドから生物学的に活性なステロイドへの脱硫酸化を触媒する、ステロイドスルファターゼ（ＳＴＳ）の阻害について調査した。この手法によると、ＳＴＳにより生成されたＱＭは、ＳＴＳと反応して、例えば治療手法としてその活性を阻害する（酵素を阻害するＱＭの使用に関する開示が出典明示により本明細書に援用される、Ahmed等 ChemBioChem. 2009;10:1457）。
別の手法によると、Ｌｅｎｇｅｒ等は、キノンメチド（ＱＭ）トラップ（すなわち、活性に基づいたプロテオームプローブ）を使用する活性スルファターゼのプロファイリングを開示する。健康及び疾患における活性スルファターゼをプロファイルするため、スルファターゼに向けられた、活性に基づいたプロテオームツールである、キノンメチド（ＱＭ）トラップを、活性に基づいたプロテオームプローブ（ＡＢＰＰ）として評価した。Ｌｅｎｇｅｒ等により適用されたＱＭトラップの概念は、酵素阻害剤の酵素代謝回転に依存する反応性ＱＭ中間体のｉｎ ｓｉｔｕ生成を伴っていた。フルオロメチルフェノレートスルフェート基質を、ＱＭ前駆体として使用してＱＭを生成し、次にそれをフッ化物排除により自然に断片化させた。ＱＭを使用して、スルファターゼに保存された活性部位残基を捕捉し、代謝回転依存不活性化及び特異的タンパク質標識をもたらした。トラップを、スルファターゼに対して広範囲の反応性を有するように設計した（ＡＢＰＰへのＱＭトラップの使用に関する開示が出典明示により本明細書に援用される、Lenger等 Bioorg Med Chem. Jan 15, 2012; 20(2): 622-627）。
Ｌｅｎｇｅｒ等及びＡｈｍｅｄ等の手法は、酵素不活性が本実施態様の目的ではないので、本開示の技術に反している。そうではなく、酵素不活性化は、酵素が、ＱＭに基づいた標識の使用による検出を増幅するために使用されるときには、回避されるべきである。検出に使用されるとき、酵素活性の維持は、各酵素がより大きなシグナル伝達を生じることができるので望ましい。一般に、酵素の停止は、本明細書に記載されている増幅目的に反している。換言すると、ＱＭ前駆体は、酵素停止を回避するように選択及び／又は設計される。むしろＱＭ前駆体は、ＱＭが酵素の触媒部位から拡散できるように選択及び／又は設計される。酵素を不活性化しない間に、ＱＭは、適切な標的の標識をもたらすために、酵素に近接した求核種と十分に反応性があるべきである。
なお別の例において、Ｑｉｎｇ Ｓｈａｏ等による開示は、抗生物質耐性菌の蛍光画像化及び急速なスクリーニングにおけるベータラクタマーゼ活性の共有結合レポーターとしてのＱＭ前駆体の使用を記載した（細菌細胞全体の蛍光標識用のＱＭ標識の使用に関する開示が出典明示により本明細書に援用される、Shao, Q.; Zheng, Y.; Dong, X. M.; Tang, K.; Yan, X. M.; Xing, B. G. Chem-Eur J 2013, 19, 10903）。この手法によると、ＱＭは、ペニシリン及びセファロスポリン系抗生物質を破壊する天然に生じる細菌酵素である耐性関連ベータラクタマーゼにより活性化されうる、蛍光プローブとして使用される。開示されたＱＭプローブは、反応性キノンメチドの形成と共に、蛍光消光蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）基の切断を必要とし、それから抗生物質耐性菌に結合することができる。この手法は、活性内在性酵素に依存し、抗生物質耐性菌全体を非特異的に標識することを求める。更に、細菌細胞は溶液により染色された。この溶液染色は、溶液中の細胞濃度が細胞間の距離を決め、希釈を使用して細胞間の距離を増加できるので有利である。
本開示は、非内在性酵素を使用して、染色プロトコールに偽陰性を作り出すことを回避する。本明細書に開示されているＱＭＰは、酵素を阻害することなく酵素の近位に結合するように設計された（すなわち、ＱＭＰは、酵素に対して実質的に非阻害性である）。反応性ＱＭ化合物の長い距離の拡散はＱｉｎｇ Ｓｈａｏ等の手法には無関係であるが、本開示のＱＭ前駆体は、標的からの拡散距離を制限するために十分な反応性があるように選択及び／又は設計される。例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料が使用されるとき、反応性種の長距離拡散は、拡散した不鮮明な染色をもたらす。したがって、過度に安定した反応性ＱＭ化合物は、組織染色への使用に不適切である。本明細書に含まれる例は、過度に安定したＱＭ化合物反応性化合物を使用すると、この好ましくない染色結果をもたらすことを実証している。
Ｋｗａｎ等（蛍光的に標識されたＱＭ標識の使用に関する開示が出典明示により本明細書に援用される、Angew Chem Int Edit 2011, 50, 300）は、同族グリコシダーゼとの反応によりＱＭを生成するように修飾されたクマリングリコシドを利用する、蛍光植物組織学的染色を報告した。この報告は、生成部位から拡散が最小限である固相タンパク質の共有結合的標識におけるＱＭの潜在性を実証しており、このことは固相イムノアッセイにおいて不可避であり、現在のＴＳＡ技術において重要な特徴である。Ｋｗａｎ等により記載されたプローブの主要な制限は、各レポーター分子が、ＱＭ前駆体の機能性を含有するように合成的に修飾される必要性である。すなわち、植物細胞において目的の酵素を標識する際、クマリンは、キノンメチド生成種及び標識の両方になるように修飾された。この手法は、様々な標識の生成に相当な費用及び複雑性を加え、多くの検出可能標識（例えば、キノンメチド生成種を含むように修飾できない構造を有する検出可能標識）にとって不適切である。このように、Ｋｗａｎ等は、キノンメチド生成部分と検出可能標識を別個に有するＱＭ検出可能分子を記載していない。Ｋｗａｎ等は、以前に開発されたＱＭ前駆体が有効性の無いままに実現されたことも確立している。したがって、ＱＭ生成部分と検出可能標識を別個に含み、酵素を阻害しないＱＭをもたらすＱＭ前駆体化合物の必要性が、当該技術において依然として存続している。特にＫｗａｎ等は、（ジ）ハロメチルフェノールが分解し、それにより生成されたキノンメチドが反応するのに必要な時間が、多くの場合、試薬が活性部位から拡散し、水を含む他の利用可能な求核種と反応しうるのに十分に長いと結論付けている。更にＫｗａｎ等は、ジフルオロメチル部分を含むＱＭ前駆体化合物を開示し、加溶媒分解に対するジフルオロメチルＱＭ前駆体化合物の大きな安定性及び前駆体化合物から生成されたフルオロＱＭ化合物の大きな安定性に基づいて、モノフルオロメチル誘導体よりも優れていると記載している。
現在記載されているキノン前駆体及びこれを使用する方法は、検出可能標識及びキノンメチドの生成、並びに求核種安定化機能が分子内で分かれている一般化された手法を使用する。１つの手法は、ほぼあらゆる検出可能分子への単純なコンジュゲーションを可能にするアミン官能化リンカー基を含有する、単一のＱＭ前駆体足場を使用することである。１つの重要な実施態様は、ＦＦＰＥ組織へのＩＨＣなどの固相イムノアッセイに、ＣＡＲＤを適用することに関する。したがって、リン酸エステル基を使用して酵素切断認識基を例示することは、現在のイムノアッセイにおける同族の酵素アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の偏在性のため、当然の選択であった。
ここで図１を参照すると、ＩＨＣにおけるＡＰに基づいたＣＡＲＤの適用は、一次抗体（Ａｂ）１０２と試料とのインキュベーションから始まる。Ａｂ１０２は、目的の抗原１０４を認識する。次に試料を、典型的な抗種Ａｂ結合により一次Ａｂに結合する二次Ａｂ１０６と共にインキュベートする。二次抗体１０６を、酵素１０８により、例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）により標識する。次に検出可能に標識したＱＭ前駆体１１０を適用する。検出可能に標識したＱＭ前駆体１１０は、レポーター基１１２及び酵素認識基１１４（この例では、リン酸エステル）を含む。ＡＰは、リン酸エステル基を認識及び切断して、脱離基の放出及びＱＭの形成をもたらす。これらのＱＭは、生成部位に近接して固定化組織求核種と反応するか又は反応媒体中の求核種により停止される。次に、組織に共有結合している検出可能な分子は、ハプテンの場合では様々な視覚的技術の１つにより又は蛍光団の場合では蛍光顕微鏡法により検出される。
Ｂ．化合物
本明細書に使用されるとき、ＱＭＰは、酵素認識基と、脱離基と、結合であってもリンカー部分であっても良いリンカーを介して系に接続している検出可能標識とを含むコンジュゲート系を含む。コンジュゲート系は、芳香族系であっても良い。系は、酵素認識基が対応する酵素と相互作用し、脱離基が離れたとき、ＱＭをもたらすようにコンジュゲートしている。
酵素認識基は、特定の酵素との相互作用における適合性に基づいて選択される。例えば、ホスファターゼとの適切な相互作用では、酵素認識基は、コンジュゲート系に典型的には酸素、窒素又は硫黄を介して結合しているリン酸エステル（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）であり、ホスホジエステラーゼでは、酵素認識基は、ホスホジエステルであり、エステラーゼでは、エステルであり、アミダーゼ又はプロテアーゼでは、アミドであり、ニトロレダクターゼでは、ニトロ基であり、ウレアーゼでは、尿素基であり、スルファターゼでは、硫酸エステルであり、チトクロムＰ４５０酵素では、典型的にはアルコキシであり、ラクタマーゼでは、酵素認識基は、βラクタム含有部分であり、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ及びグルクロニダーゼでは、コンジュゲート系に酸素で結合している酵素適合糖（ｅｎｚｙｍｅ−ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｓｕｇａｒ）（例えば、アルファ又はベータグルコース、アルファ又はベータガラクトースなど）である。
脱離基及び検出可能標識、並びにリンカーは、コンジュゲート系の同じ置換基の一部であっても良く、幾つかの実施態様において、これらは、酵素認識基に隣接して又は酵素認識基のオルトに配置されている。
幾つかの実施態様において、染色増幅組成物は、式Ｉ又はＩＩ：
Figure 2021169453
I 又は II,
のＱＭＰを含み、式中、Ａは、１つ又は複数の環を有する環状コンジュゲート系、非環式コンジュゲート系又は環状と非環式の特徴の組み合わせを有するコンジュゲート系などのコンジュゲート系である。特定の実施態様において、コンジュゲート系Ａは、炭素環式アリール又はヘテロアリール環系などの置換又は非置換アリール環系である。ＺＲ１は、酵素認識基であるか、又はＲ１は、酵素認識基であり、Ｚは、Ｏ、Ｓ又はＮＲａであり、ここでＲａは、水素又は脂肪族、典型的にはアルキル、幾つかの実施態様では、低級アルキルである。ＬＧは、脱離基であり、−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ６）及び−Ｃ（Ｒ５）ＬＧ−部分は、ＱＭにアルケン（Ｃ＝Ｃ）官能基を形成することができる。Ｒ１がＺから切断されると、移行構造が形成され、これが再編成を行い、ＬＧを排除してＱＭを形成するように、Ｚ及びＬＧ含有部分はコンジュゲート系の相対的な位置に結合する。あるいは、−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ６）及びＲ１は、互いにオルトに位置し、共にホスホジエステルを形成し、ここでＬＧ−ＺＲ１は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−である。そのような実施態様において、ホスホジエステルがＺ及び−Ｃ（Ｒ５）（Ｒ６）−部分の両方から切断されると、キノンメチドが形成される。
また式Ｉ又はＩＩを参照すると、Ｒ５及びＲ６は、独立して、水素、ハロ、シアノ、低級アルキル、低級ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、ここで、Ｒｃは、独立して、水素、アリール、脂肪族若しくはヘテロ脂肪族であり、又は２つのＲｃ部分は、共にヘテロ脂肪族環を形成する。Ｒ３は、リンカー又は結合であり、Ｒ４は、検出可能標識である。
幾つかの実施態様において、ＬＧは、ハロゲン化物、アルコキシ、カルボン酸エステル、無機エステル、チオレート、アミン、カルボン酸エステル又はフェノキシドである。他の実施態様において、ＬＧは、フルオロ、クロロ、アジド、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、酢酸エステル、ピリジウム、ＤＡＢＣＯ（１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン）又はトリエチルアミンである。幾つかの実施態様において、−Ｃ（Ｒ５）ＬＧ又は−Ｃ（ＬＧ）Ｒ３−は、エポキシド環を形成し、ここでＬＧは、環中の酸素である。
幾つかの実施態様において、ＱＭＰは、式ＩＩＩ：

Figure 2021169453

III
を有し、式中、各Ｑは、独立して、炭素又はＯ、Ｎ若しくはＳから選択されるヘテロ原子であり、環は、アリール環又は他のコンジュゲート系など、ＱＭの形成を可能にするほどの十分なコンジュゲーションを有し、各Ｒ７は、独立して、ＺＲ１、ＬＧを含む部分、検出可能標識を含む部分、水素、孤立対、ハロ、シアノ、オキソ（＝Ｏ）、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であるか、又は２つの隣接Ｒ７基は、共に脂肪族環若しくはアリール環を形成し、ｍは、０又は１であり、Ｚ、Ｒ１、ＬＧ、Ｒａ及びＲｃは、式Ｉ及びＩＩにおいて以前に定義された通りである。また、式ＩＩＩを参照すると、少なくとも１つのＲ７は、ＺＲ１であり、少なくとも１つのＲ７は、ＬＧを含み、ＱＭＰは、少なくとも１つの検出可能標識を含む。幾つかの実施態様において、少なくとも１つのＲ７は、検出可能標識を含む。幾つかの実施態様において、ＬＧは、エポキシド環の酸素である。当業者は、各Ｒ７が原子価要件を満たすためにも選択されることを理解する。例えば、Ｑが酸素である場合、Ｒ７は、孤立対である。
幾つかの実施態様において、コンジュゲート系は、６員環であり、ＺＲ１及びＬＧ含有部分は、互いにオルト又はパラにある。
特定の実施態様において、ＱＭＰは、式ＩＶ：

Figure 2021169453

IV
を有し、式中、Ｚは、Ｏ、Ｓ又はＮＲａであり、Ｒ１は、酵素認識基であるか、又はＺＲ１は、酵素認識基であり、Ｒ８は、−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ３Ｒ４）、−Ｒ３Ｒ４又は−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ６）であり、Ｒ９、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素、ハロ、シアノ、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２、−Ｒ３Ｒ４であるか、又は２つの隣接する基は、共に脂肪族環若しくはアリール環を形成し、Ｒ１０は、水素、ハロ、シアノ、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２、−Ｒ３Ｒ４、−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ６）であるか、又はＲ９若しくはＲ１１の一方と、脂肪族環若しくはアリール環を形成し、各Ｒａは、独立して、水素又は脂肪族、典型的にはアルキル若しくは低級アルキルであり、ＬＧは、脱離基であり、又はＺＲ１及びＬＧは、共にホスホジエステルを形成し、Ｒ３は、結合又はリンカーであり、Ｒ４は、検出可能標識であり、各Ｒｃは、独立して、水素、アリール、脂肪族若しくはヘテロ脂肪族であり、又は２つのＲｃ部分は、共にヘテロ脂肪族環を形成し、各Ｒ５は、独立して、水素、ハロ、シアノ、低級アルキル、低級ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、各Ｒ６は、独立して、水素、ハロ、シアノ、低級アルキル、低級ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、ＬＧがハロである場合、Ｒ５及びＲ６は、ハロではない。また、式Ｖを参照すると、Ｒ８及びＲ１０の少なくとも一方は、ＬＧを含み、ＱＭＰは、少なくとも１つの−Ｒ３Ｒ４部分を含む。幾つかの実施態様において、Ｒ８−Ｒ１２の少なくとも１つは、Ｒ３Ｒ４を含み又はＲ３Ｒ４からなり、特定の実施態様において、Ｒ８及びＲ１０の少なくとも一方は、Ｒ３Ｒ４を含む又はＲ３Ｒ４からなる。
式ＩＶの幾つかの例示的なアナログには下記：
Figure 2021169453
が含まれ、式中、Ｒ１３−Ｒ２０は、それぞれ独立して、水素、ハロ、シアノ、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２、−Ｒ３Ｒ４であるか、又は２つの隣接基は、共に脂肪族環若しくはアリール環を形成し、Ｒ８−Ｒ２０の少なくとも１つは、Ｒ３Ｒ４を含む又はＲ３Ｒ４からなる。
式ＩＶの他の特定の例示的なアナログには下記：
Figure 2021169453
が含まれる。
ＬＧは、ハロゲン化物、アルコキシ、カルボン酸エステル、無機エステル、チオレート、アミン、カルボン酸エステル又はフェノキシドでありうる。他の例において、ＬＧは、フルオロ、クロロ、アジド、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、酢酸エステル、ピリジウム、ＤＡＢＣＯ（１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン）又はトリエチルアミンである。特定の実施態様において、ＬＧは、Ｆ、Ｃｌ、−ＯＳ（Ｏ）２ＣＨ３、−ＯＳ（Ｏ）２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＳ（Ｏ）２Ｃ６Ｈ５、−ＯＳ（Ｏ）２Ｃ６Ｈ４ＣＸ３、−ＯＣ６Ｈ５、−Ｎ２ ＋、−ＮＨ３ ＋、−ＮＣ３Ｈ５ ＋、−Ｏ−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｈ、−Ｎ（Ｒｂ）３ ＋又はＤＡＢＣＯであり、ここで、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり、各Ｒｂは、独立して、水素若しくは低級アルキルであるか、又は２つのＲｂ部分は、共にヘテロ脂肪族環を形成する。
幾つかの実施態様において、Ｒ３は、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２）ｎＳ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＮＨ−又は−Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２）ｎＮＨ−であり、ここで各ｎは、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２である。特定の実施態様において、Ｒ３は、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）５ＮＨ−、−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）６ＮＨ−、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ−、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）８−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）８ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２）６ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）４ＮＨ−である。Ｒ３は、トリアゾールを含んでも良く、幾つかの実施態様において、Ｒ３は、
Figure 2021169453
である。幾つかの実施態様において、−Ｃ（ＬＧ）Ｒ３又は−Ｃ（ＬＧ）Ｒ５−は、エポキシド環を形成する。
Ｒ４は、ハプテン、蛍光団、発光団又は色素原でありうる。特定の例において、−Ｒ４又はリンカー検出可能標識（−Ｒ３Ｒ４）は、脂肪族リンカーにより分子にコンジュゲートされたビオチン、ニトロピラゾール（ＮＰ）、ＰＥＧ−８リンカーなどのＰＥＧリンカーを有するＮＰ、ＴＡＭＲＡ、ＤＮＰ、ファストレッド、ＨＱ、ＰＥＧ−８リンカーなどのＰＥＧリンカーを有するＨＱ、ベンゾフラザン、Ｒｈｏｄ １１０、ＰＥＧ−８リンカーなどのＰＥＧリンカーを有するダブシル又はＣｙである。
幾つかの実施態様において、ＺＲ１は、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＳＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＮＲａＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒａ、−ＮＯ２、−ＮＲａ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｃ）２、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＯＲａ、−Ｏ−βラクタム含有部分、−Ｓ−βラクタム含有部分又は糖がアルファ若しくはベータグルコース、アルファ若しくはベータガラクトースなどの酵素適合糖である−Ｏ−糖、あるいはこれらの塩である。他の実施態様において、ＺＲ１及びＬＧは、共にホスホジエステルの−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−を形成する。
ある特定の実施態様において、ＬＧはＦであり、特定の実施態様において、ＬＧはＦであり、Ｒ５又はＲ５とＲ６は、Ｈである。
式ＩＶのある特定の実施態様において、Ｒ８及びＺＲ１は、共にホスホジエステルを形成し、式Ｖ：

Figure 2021169453

V
を有するＱＭＰをもたらし、式中、Ｒ５、Ｒ６及びＲ９−Ｒ１２は、式ＩＶにおいて以前に定義された通りであり、Ｒ９−Ｒ１２の少なくとも１つは、Ｒ３Ｒ４を含む又はＲ３Ｒ４からなる。特定の実施態様において、Ｒ１０は、Ｒ３Ｒ４を含む又はＲ３Ｒ４からなる。
式ＩＶのある特定の例示的な実施態様において、ＱＭＰは、
Figure 2021169453
から選択される。
式ＩＶの他の例示的な実施態様において、ＱＭＰは、
Figure 2021169453
から選択される。
上記の例において、Ｒ４は、ハプテン、蛍光団、発光団又は色素原などの検出可能標識である。当業者は、それぞれの場合に示されているＺＲ１、ＬＧ及びＲ３部分が、例示的な部分であり、本明細書に開示されている任意のＺＲ１、ＬＧ及びＲ３部分に代えられていても良いことを理解する。
幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＶの化合物は、
リン酸二水素２−（２−（（６−（アミノ）ヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
リン酸二水素２−（２−（（２−アミノエチル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
リン酸二水素１−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）ナフタレン−２−イル、
リン酸二水素２−（２−（（４−（アミノメチル）ベンジル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−６−（２−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェノキシ）−３，４，５−トリヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボン酸、
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロ−２−（２−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）アセトアミド、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−６−（２−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェノキシ）−３，４，５−トリヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボン酸、
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロ−２−（２−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）アセトアミド、
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロ−２−（２−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）アセトアミド、
（６Ｒ，７Ｒ）−７−アセトアミド−３−（（２−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェノキシ）メチル）−８−オキソ−５−チア−１−アザビシクロ［４．２．０］オクタ−２−エン−２−カルボン酸、
（６Ｒ，７Ｒ）−７−アセトアミド−３−（（（２−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル）チオ）メチル）−８−オキソ−５−チア−１−アザビシクロ［４．２．０］オクタ−２−エン−２−カルボン酸、
硫酸水素２−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロ−２−（２−メトキシフェニル）アセトアミド、
プロピオン酸フェニル２−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
リン酸二水素２−（２−（（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
リン酸二水素２−（１−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−２−フルオロ−１−オキソプロパン−２−イル）フェニル、
２−（２−アセトアミドフェニル）−Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロアセトアミド、
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロ−２−（２−ニトロフェニル）アセトアミド、
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロ−２−（２−ウレイドフェニル）アセトアミド、
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロ−２−（２−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）アセトアミド、
リン酸二水素２−（２−（（６−（２，６−ジアミノヘキサンアミド）ヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
リン酸二水素２−（（１−（２−アミノエチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）フルオロメチル）フェニル、又は
リン酸二水素２−（フルオロ（１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル）フェニル
から選択される少なくとも１つの検出可能標識及び部分を含む。
他の実施態様において、部分は、
リン酸二水素３−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）−［１，１’−ビフェニル］−４−イル、
リン酸二水素２−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）−４−（２−（４−ヒドロキシフェニル）アセトアミド）フェニル、
リン酸二水素２−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）−４−メトキシフェニル、
リン酸二水素２−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）−４−ニトロフェニル、
リン酸二水素４−アセトアミド−２−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
リン酸二水素４−（６−アミノヘキサンアミド）−２−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
リン酸二水素４−（６−アミノヘキサンアミド）−２−（フルオロメチル）フェニル、
リン酸二水素４−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）−２−（フルオロメチル）フェニル、
リン酸二水素４−（２−アミノエチル）−２−（フルオロメチル）フェニル、
リン酸二水素４−（６−アミノヘキサンアミド）−２−（１−フルオロエチル）フェニル、
リン酸二水素２−（６−アミノヘキサンアミド）−４−（１−フルオロエチル）フェニル、
リン酸二水素４−（６−アミノヘキサンアミド）−２−（２−（エチルアミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
リン酸二水素４−（６−アミノヘキサンアミド）−２−（２−（ブチルアミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
６−アミノ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−２−オキシド−４Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，３，２］ジオキサホスフィニン−６−イル）ヘキサンアミド、
リン酸二水素２−（６−アミノヘキサンアミド）−４−（２−（エチルアミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
リン酸二水素２−（６−アミノヘキサンアミド）−４−（２−（ブチルアミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、又は
リン酸二水素２−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）−４−（１−フルオロエチル）フェニルから選択され、
ここで検出可能標識は、ハプテン、蛍光団、発光団又は色素原であり、酵素認識基、脱離基及びリンカー部分は、例示的であり、本明細書に開示されている任意の酵素認識基、脱離基及びリンカー部分に代えられていても良い。
コンジュゲート環がフェニルである式ＩＩの他の例において、ＱＭＰは、式ＶＩ：

Figure 2021169453

VI
を有し、式中、Ｚ、ＬＧ、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒａ及びＲｃは、式ＩＶにおいて以前に定義された通りであり、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３及びＲ２４は、それぞれ独立して、水素、ハロ、シアノ、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２、−Ｒ３Ｒ４であるか、又は２つの隣接基は、共に脂肪族環若しくはアリール環を形成する。
ある特定の実施態様において、ＬＧはＦであり、特定の実施態様において、ＬＧはＦであり、Ｒ５及びＲ６、並びに／又はＲａは、水素である。
式ＶＩの幾つかの実施態様において、ＱＭＰは、下記構造を有する。

Figure 2021169453
式ＶＩの他の実施態様において、ＱＭＰは、下記：
Figure 2021169453
から選択される構造を有する。他の実施態様において、ＱＭＰは、以下：
Figure 2021169453
から選択される構造を有する。
上記の例の何れかにおいて、Ｒ４は、ハプテン、蛍光団、発光団又は色素原などの検出可能標識である。当業者は、それぞれの場合に示されているＺＲ１、ＬＧ及びＲ３部分が、例示的な部分であり、本明細書に開示されている任意のＺＲ１、ＬＧ及びＲ３部分に代えられていても良いことを理解する。
幾つかの例示的な実施態様において、式ＩＶの化合物は、
リン酸二水素４−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
リン酸二水素４−（２−（（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エチル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
リン酸二水素４−（１−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−２−フルオロ−１−オキソプロパン−２−イル）フェニル、
リン酸二水素４−（２−（（６−（２，６−ジアミノヘキサンアミド）ヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロ−２−（４−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）アセトアミド、
プロピオン酸フェニル４−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−６−（４−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェノキシ）−３，４，５−トリヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボン酸、
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロ−２−（４−（（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）アセトアミド、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｓ）−６−（４−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェノキシ）−３，４，５−トリヒドロキシテトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−カルボン酸、
（６Ｒ，７Ｒ）−７−アセトアミド−３−（（４−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェノキシ）メチル）−８−オキソ−５−チア−１−アザビシクロ［４．２．０］オクタ−２−エン−２−カルボン酸、
（６Ｒ，７Ｒ）−７−アセトアミド−３−（（（４−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル）チオ）メチル）−８−オキソ−５−チア−１−アザビシクロ［４．２．０］オクタ−２−エン−２−カルボン酸、
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロ−２−（４−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）アセトアミド、
硫酸水素４−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロ−２−（４−メトキシフェニル）アセトアミド、
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロ−２−（４−（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）フェニル）アセトアミド、
２−（４−アセトアミドフェニル）−Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロアセトアミド、
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロ−２−（４−ニトロフェニル）アセトアミド、
Ｎ−（６−アミノヘキシル）−２−フルオロ−２−（４−ウレイドフェニル）アセトアミド、
リン酸二水素４−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）−２−メトキシフェニル、
リン酸二水素４−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）−２−ニトロフェニル、
リン酸二水素２−アセトアミド−４−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
リン酸二水素２−（６−アミノヘキサンアミド）−４−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）フェニル、
リン酸二水素４−（２−（（６−アミノヘキシル）アミノ）−１−フルオロ−２−オキソエチル）−２−（２−（４−ヒドロキシフェニル）アセトアミド）フェニル、又は
リン酸二水素４−（３−（（６−アミノヘキシル）カルバモイル）オキシラン−２−イル）−２，６−ジメトキシフェニルから選択される少なくとも１つの検出可能標識及び部分を含み、
ここで検出可能標識は、ハプテン、蛍光団、発光団又は色素原であり、酵素認識基、脱離基及びリンカー部分は、例示的であり、本明細書に開示されている任意の酵素認識基、脱離基及びリンカー部分に代えられていても良い。
図２（Ａ）は、幾つかの追加の例示的なＱＭ前駆体を説明する表を提供する。
幾つかの実施態様において、化合物は、
リン酸二水素２−（フルオロメチル）−４−（６−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）フェニル、
リン酸二水素４−（６−（２−（（２，４−ジニトロフェニル）アミノ）アセトアミド）ヘキサンアミド）−２−（フルオロメチル）フェニル、
リン酸二水素２−（フルオロメチル）−４−（１−（５−ニトロ−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−１，２９−ジオキソ−５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６−オクタオキサ−２，３０−ジアザヘキサトリアコンタン−３６−アミド）フェニル、
リン酸二水素（Ｅ）−４−（６−（４−（（３−（（４−クロロ−２−メチルフェニル）カルバモイル）−２−ヒドロキシナフタレン−１−イル）ジアゼニル）ベンズアミド）ヘキサンアミド）−２−（フルオロメチル）フェニル、
リン酸二水素４−（６−（３’，６’−ビス（ジメチルアミノ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）ヘキサンアミド）−２−（フルオロメチル）フェニル、
リン酸二水素４−（６−（３’，６’−ジアミノ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボキサミド）ヘキサンアミド）−２−（フルオロメチル）フェニル、
１−（６−（（６−（（３−（フルオロメチル）−４−（ホスホノオキシ）フェニル）アミノ）−６−オキソヘキシル）アミノ）−６−オキソヘキシル）−３，３−ジメチル−２−（（１Ｅ，３Ｅ）−５−（（Ｚ）−１，３，３−トリメチルインドリン−２−イリデン）ペンタ−１，３−ジエン−１−イル）−３Ｈ−インドール−１−イウム塩化物、
リン酸二水素２−（メトキシメチル）−４−（６−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）フェニル、
酢酸ベンジル５−（６−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）−２−（ホスホノオキシ）、
１−（５−（６−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）−２−（ホスホノオキシ）ベンジル）ピリジン−１−イウム、
１−（５−（６−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）−２−（ホスホノオキシ）ベンジル）−１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン−１−イウム、
Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ−（５−（６−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）−２−（ホスホノオキシ）ベンジル）エタンアミニウム、
ジエチルカルバミン酸ベンジル５−（６−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）−２−（ホスホノオキシ）、
リン酸二水素２−（フルオロメチル）−４−（（５−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）ペンチル）カルバモイル）フェニル、又は
リン酸二水素２−（フルオロメチル）−４−（２−（５−（２−オキソヘキサヒドロ−１Ｈ−チエノ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル）ペンタンアミド）エチル）フェニル
から選択される。
式ＩＩの他の実施態様において、コンジュゲート環は、ヘテロアリール又は複素環である。例示的な、ヘテロアリール又は複素環には、ピラゾール、イミダゾール、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、ピロール、フラン、チオフェン、インドール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイミダゾール、チアゾール、オキサゾール、イミダゾール又はプリンが含まれるが、これらに限定されない。
コンジュゲート環がヘテロアリール又は複素環である式ＩＩの幾つかの例示的なアナログには、下記：
Figure 2021169453
が含まれ、ここで、Ｚ、Ｒ１及びＬＧは、式ＩＶに関して以前に定義された通りであり、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立して、水素、ハロ、シアノ、低級アルキル、低級ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、Ｒ２５−Ｒ２９は、それぞれ独立して、水素、ハロ、シアノ、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２、−Ｒ３Ｒ４であるか、又は２つの隣接基は、共に脂肪族環若しくはアリール環を形成し、各Ｒｃは、独立して、水素、アリール、脂肪族若しくはヘテロ脂肪族であり、又は２つのＲｃ部分は、共にヘテロ脂肪族環を形成し、Ｒ５、Ｒ６及びＲ２５−Ｒ２９の少なくとも１つは、Ｒ３Ｒ４を含む又はＲ３Ｒ４からなる。幾つかの実施態様において、ＬＧがハロであるとき、Ｒ５及びＲ６は、ハロではない。
式Ｉ−ＶＩの幾つかの実施態様において、Ｒ１が−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２であるとき、−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ６）は、−ＣＨ２Ｆ、ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＣＨ２Ｎ（Ｃ２Ｈ５）３ ＋、−ＣＨ２（ＮＣ５Ｈ５）＋又は−ＣＨ２（ＤＡＢＣＯ）＋であり、ここでＤＡＢＣＯは、１．４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンである。ある特定の実施態様において、−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ６）は、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２ＯＣＨ３又は−ＣＨ２ＯＣＯＣＨ３である。
ｉ）酵素認識基
酵素認識基は、酵素認識に適した任意の基から選択することができる。実例的な実施態様において、酵素認識基は、リン酸エステル、ホスホジエステル、アミド、ニトロ、尿素、硫酸エステル、メチル、エステル、アルファ又はベータグルコース、ベータラクタム、アルファ又はベータガラクトース、アルファ又はベータラクトース及びアルファ又はベータグルクロン酸から選択される。当業者は、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、プロテアーゼ、ニトロレダクターゼ、ウレアーゼ、スルファターゼ、チトクロムＰ４５０、アルファ又はベータグルコシダーゼ、アルファ又はベータラクタマーゼ、アルファ又はベータグルクロニダーゼ、アルファ又はベータガラクトシダーゼ、アルファ又はベータラクターゼによる認識に適した基など、使用される酵素に基づいて適切な酵素認識基を選択することができる。
下記に提供される実施態様は、特定のＱＭＰの例示的な酵素認識基を説明する。
Figure 2021169453
ここで図３（Ａ）
を参照すると、標的２０２を有する試料２００が抗体２０４と接触する。標的２０２は、抗体２０４と特異的に結合するように示されている。抗体２０４は、１つ又は複数の酵素２０６とコンジュゲートしている。ＱＭＰ２０８と接触すると、酵素２０６は、リン酸エステル基により例示される酵素認識基の、ＱＭＰ２０８からの切断を触媒して、フェノール中間体２１０を生じる。フェノールは、脱離基（ＬＧ）を排除して、ＱＭコンジュゲート２１２を生じる。ＱＭコンジュゲート２１２は、求核種と反応することができる反応性求電子剤である。
ここで図３（Ｂ）を参照すると、ＱＭコンジュゲート２１２は、説明されているように、アミン又はスルフヒドリル基などの、試料２００に存在する求核種と反応することができる。ＱＭコンジュゲート２１２と試料２００に共有的に結合している複合体２１４は、試料において求電子ＱＭコンジュゲートと求核基が反応すると形成される。酵素２０６は、抗体２０４を介して標的２０２の近位に配置されたので、検出可能標識２１６は、標的２０２の近位において試料２００に共有結合している。したがって、検出可能標識２１６を検出して、標的２０２の存在を特定することができる。この反応は、多くの複合体２１４が各標的において形成されるように繰り返し生じ、それによって、検出事象に関連するシグナルが増幅される。検出可能標識２１６は、適切な手段で検出されうるハプテン、蛍光団、発光団又は色素原など、そのことに有用な任意の化合物でありうる。酵素２０６は、標的２０２に直接的又は間接的に結合しうる。
ここで図３（Ｃ）を参照すると、当業者は、ＱＭコンジュゲート２１２と溶媒（例えば、水）との競合反応が非結合化合物２１８の形成をもたらしうることを理解する。非結合化合物２１８を洗い流すことができ、それによって試料の他の位置の無差別的な染色が低減される。
共有結合化合物２１４は、式ＶＩＩ又はＶＩＩＩ：
Figure 2021169453
VII 又は VIII
の一般構造を有し、式中、Ａ、Ｚ及びＲ３−Ｒ６は、以前に定義された通りである。
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ、ＡＬＫＰ）（ＥＣ３．１．３．１）は、ヌクレオチド、タンパク質及びアルカロイドを含む多くの種類の分子からのリン酸エステル基の除去に関与しているヒドロラーゼ酵素である。リン酸エステル基を除去するプロセスは、脱リン酸化と呼ばれる。名称が示唆しているように、アルカリホスファターゼ（塩基性ホスファターゼとも呼ばれる）は、アルカリ性環境下で最も有効である。アルカリホスファターゼは、利用可能な酵素に対して有利な幾つかの特質を有し、例えば、（１）アルカリホスファターゼは、１×１０９リットル／モル−秒の拡散律速限界に近似するｋｃａｔ／Ｋｍを有すること、（２）アルカリホスファターゼの最適ｐＨは、後に続くＱＭの反応に適したｐＨである９−１０であること、（３）アルカリホスファターゼは、大部分の酵素より良好に熱及び化学分解に抵抗する非常に安定した酵素であること、及び（４）アルカリホスファターゼは、適度に小さく、他の生物学的分子にコンジュゲートする方法が開発されていることが含まれる。
スルファターゼ（ＥＣ３．１．６）は、ステロイド、炭水化物及びタンパク質を含む多くの種類の分子における硫酸エステルの加水分解を触媒するエステラーゼ酵素である。これらは、翻訳後酸化により導入される特有の触媒アルデヒドを介して、硫酸エステルを加水分解的に切断する。スルファターゼは、全身にわたる広範囲の組織に分布されている。
グルコシドヒドロラーゼとしても知られているグリコシダーゼ（ＥＣ３．２．１）は、複合糖のグリコシド結合の加水分解を触媒する。これらは自然界における極めて一般的な酵素であり、Ｏ−及びＳ−グリコシドの両方の加水分解を触媒する。
リパーゼは、脂肪の加水分解を触媒する酵素である。これらは、エステラーゼ酵素のサブクラスであり、広範囲の生物体及び組織の種類に見出される。
β−ラクタマーゼ（ＥＣ３．５．２．６）は、加水分解機構によりβ−ラクタム環を開環する酵素である。これらは幾つかの細菌により産生され、ペニシリンなどのβ−ラクタム抗生物質に対して耐性をもたらしうる。
ｉｉ）脱離基
脱離基は、ＱＭＰが適切な酵素と接触したとき、脱離基として作用してキノンメチドを形成することができる任意の適切な基でありうる。幾つかの実施態様において、脱離基は、形式負電荷を有するアニオンとして離れることができる基である。他の実施態様において、脱離基は、ＱＭＰを離れる前に正電荷を有し、中性種として離れる。適した脱離基には、ハロゲン化物、アジド、硫酸エステル、カルボン酸エステル、無機エステル、チオレート、アミン、アリールオキシ、アルコキシ又はヘテロアリールが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施態様において、ＬＧは、フッ化物、塩化物、酢酸エステル、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、フェノキシド、−ＯＳ（Ｏ）２ＣＨ３、−ＯＳ（Ｏ）２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＳ（Ｏ）２Ｃ６Ｈ５、−ＯＳ（Ｏ）２Ｃ６Ｈ４ＣＸ３（ここでＸは、ハロである）、−ＯＣ６Ｈ５、−Ｎ２ ＋、−ＮＨ３ ＋、−ＮＣ５Ｈ５ ＋、−Ｏ−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｈ、−Ｎ（Ｒｂ）３ ＋であり、ここで各Ｒｂは、独立して、水素又は低級アルキルであるか、あるいは２つのＲｂ部分は、共にヘテロ脂肪族環又はＤＡＢＣＯを形成する。
ｉｉｉ）検出可能標識
図４及び５に示されているように、ＱＭＰは、試料中の標的の存在を決定するため、ハプテン、色素及び他の検出タグ（式Ｉ−ＶＩのＲ４）などの多くの異なる検出可能標識又はレポーター部分の使用を可能にするように合成される。適切な検出可能標識には、発光団（リン光体、蛍光団）、発色団及び／又はハプテンが含まれる。発光団は、リン光又は蛍光を含む発光が可能な化合物である。発光は、光子、荷電粒子又は化学変化の形態の励起エネルギーの吸収により引き起こされる化合物による光の放射である。蛍光団は、特定の波長の光を吸収し、より長い波長で光を再放射する蛍光化合物である。発色団は、可視光線を吸収することができる種である。好ましい発色団は、発色団が明視野照明を使用して可視化されうるように、十分な波長特異性を有する十分な量の可視光線を吸収することができる種である。ハプテンは、抗体と特異的に組み合わせることができるが、典型的には、担体分子との組み合わせを除いて、免疫原性であることが実質的に不可能である分子、典型的には小分子である。ある特定の発光団、蛍光団及び発色団も、ハプテンである。幾つかの例示的な検出可能標識が、図２（Ａ）に示されている。
網羅的ではないが、その全体が出典明示により本明細書に援用される国際公開第２０１２０２４１８５号は、現在利用可能な発光団及びハプテンに関する開示を提供する。検出可能標識の実施態様には、ピラゾール、特にニトロピラゾールなどのハプテン；ニトロフェニル化合物；ベンゾフラザン：トリテルペン；尿素及びチオ尿素、特にフェニル尿素、更により特定的にフェニルチオ尿素；ロテノン及び本明細書においてロテノイドとも呼ばれるロテノン誘導体；オキサゾール及びチアゾール、特にオキサゾール及びチアゾールスルホンアミド；クマリン及びクマリン誘導体；ポドフィロトキシン及びポドフィロトキシン誘導体により例示されるシクロリグナン；並びにこれらの組み合わせが含まれる。ハプテン、並びにその調製及び使用方法の実施態様は、米国特許第７６９５９２９号に開示されており、その全体が出典明示により本明細書に援用される。
例示的なハプテンには、ＢＤ（ベンゾジアゼピン）、ＢＦ（ベンゾフラザン）、ＤＡＢＳＹＬ（約４３６ｎｍのλｍａｘを有する４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホンアミド）、ＤＣＣ（７−（ジメチルアミノ）クマリン−３−カルボン酸）、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、ＤＮＰ（ジニトロフェニル）、ＨＱ（３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルバミド）、ＮＣＡ（ニトロケイ皮酸）、ＮＰ（ニトロピラゾール）、ＰＰＴ（ポドフィロトキシン）、Ｒｈｏｄ（ローダミン）、ＲＯＴ（ロテノン）及びＴＳ（チアゾールスルホンアミド）が含まれるが、これらに限定されない。他の適切なハプテンには、ビオチン及びフルオレセイン誘導体（ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＡＭＲＡ（テトラメチルローダミン）、テキサスレッド）が含まれるが、これらに限定されない。
適切な発色団には、クマリン及びクマリン誘導体が含まれる。例示的なクマリンに基づいた発色団には、ＤＣＣ及び２，３，６，７−テトラヒドロ−１１−オキソ−１Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ−［１］ベンゾピラノ［６，７，８−ｉｊ］キノリジン−１０−カルボン酸が含まれる。使用に適した別のクラスの色素産生部分には、約４２７ｎｍのλｍａｘを有するタートラジンなどのジアゾ含有色素原が含まれる。
なお他の実施態様において、発色団は、トリアリールメタン化合物であっても良い。例示的なトリアリールメタン発色団が下記に提供されている。
Figure 2021169453
例示的な環付加発色剤には、下記：
Figure 2021169453
テトラメチルローダミン（ＴＭＲ、ＴＡＭＲＡ及び反応性イソチオシアネート誘導体を含む）、ＱＳＹ７、ＱＳＹ９及びＱＳＹ２１色素などのジアリールローダミン誘導体などの他のローダミン誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
他の例示的な検出可能標識には、レゾルフィン、ＤＡＢ、ＡＥＣ、ＣＮ、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ファストブルー、フクシン、ＮＢＴ、ＡＬＫ ＧＯＬＤ、カスケードブルーアセチルアジド、ダポキシルスルホン酸／カルボン酸、ＤＹ−４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、カスケードイエロー、ピリジルオキサゾール（ＰｙＭＰＯ）、パシフィックブルー、ＤＹ−４１５、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、ＤＹＱ−４２５、６−ＦＡＭホスホラミダイト、ルシファーイエロー、ヨードアセトアミド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、ダブシル、ＮＢＤ塩化物／フッ化物、ＱＳＹ ３５、ＤＹ−４８５ＸＬ、Ｃｙ２、ＤＹ−４９０、オレゴングリーン４８８カルボン酸、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３ Ｃ３、ＤＹ−４８０ＸＬ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ３、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ５、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−Ｘ、ＤＹＱ−５０５、オレゴングリーン５１４カルボン酸、ＤＹ−５１０ＸＬ、ＤＹ−４８１ＸＬ、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ＤＹ−５２０ＸＬ、ＤＹ−５２１ＸＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ Ｃ３、エリスロシンイソチオシアネート、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホネフルオレセイン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、６−カルボキシ−２’，４，４’，５’７，７’−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０ Ｃ３、ＤＹ−５３０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ、ＤＹ−５５５、ＤＹＱ−１、ＤＹ−５５６、Ｃｙ３、ＤＹ−５４７、ＤＹ−５４９、ＤＹ−５５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、ＤＹ−５４８、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８ Ｃ３、ローダミンレッド−Ｘ、ＱＳＹ ７、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０ Ｃ３、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９ Ｃ３、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、ＤＹ−５９０、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１ Ｃ３、ＤＹ−５９１、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−Ｘ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、ＤＹ−５９４、カルボキシナフトフルオレセインＤＹ−６０５、ＤＹ−６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、ＤＹ−６１５、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０−Ｘ、エリオグラウシン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３５、ＤＹ−６３４、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３２、ＤＹ−６３３、ＤＹＱ−２、ＤＹ−６３６、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５−Ｘ、ＤＹ−６３５、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＤＹ−６４７、ＤＹ−６４８、ＤＹ−６５０、ＤＹ−６５４、ＤＹ−６５２、ＤＹ−６４９、ＤＹ−６５１、ＤＹＱ−６６０、ＤＹＱ−６６１、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ｃｙ５．５、ＤＹ−６７７、ＤＹ−６７５、ＤＹ−６７６、ＤＹ−６７８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、ＤＹ−６７９、ＤＹ−６８０、ＤＹ−６８２、ＤＹ−６８１、ＤＹＱ−３、ＤＹＱ−７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、ＤＹ−７０３、ＤＹ−７０１、ＤＹ−７０４、ＤＹ−７００、ＤＹ−７３０、ＤＹ−７３１、ＤＹ−７３２、ＤＹ−７３４、ＤＹ−７５０、Ｃｙ７、ＤＹ−７４９、ＤＹＱ−４及びＣｙ７．５が含まれる。
幾つかの実施態様において、検出可能標識は、ＰＥＧ部分などのリンカー部分を含む。ある特定の実施態様において、ＰＥＧ部分の付加は、染色強度を改善することができる。図６及び７は、それぞれＰＥＧリンカーを有するＱＭＰ−ダブシル及びＱＭＰ−Ｔａｍｒａ誘導体の染色強度の増加を説明する。図６は、リン酸エステル−ＱＭＰ−ダブシル（２５０ｕＭ）（図６（Ａ））、リン酸エステル−ＱＭＰ−ＰＥＧ４−ダブシル（２５０ｕＭ）（図６（Ｂ））及びリン酸エステル−ＱＭＰ−ＰＥＧ８−ダブシル（２５０ｕＭ）（図６（Ｃ））を使用した、扁桃組織におけるＢｃｌ−６染色の２０×倍率の顕微鏡写真を提供する。図６が示しているように、リン酸エステル−ＱＭＰ−ダブシル誘導体にＰＥＧリンカーを含めることは、ＰＥＧリンカーを有さないリン酸エステル−ＱＭＰ−ダブシル誘導体と比較して、染色強度を実質的に増加している（図６（Ａ）−６（Ｃ））。加えて、図６（Ｂ）及び６（Ｃ）は、ＰＥＧ４（図６（Ｂ））及びＰＥＧ８（図６（Ｃ））部分をリン酸エステル−ＱＭＰ−ダブシル誘導体に組み込んだときの染色強度の差を説明している。また、ＰＥＧ８部分は、ＰＥＧ４部分と比べて染色強度が増加している。
同様の結果が図７において示されており、リン酸エステル−ＱＭＰ−Ｔａｍｒａ誘導体へのＰＥＧリンカーの組み込みにより達成された染色強度の増加を説明している。図７は、リン酸エステル−ＱＭＰ−Ｔａｍｒａ（２５０ｕＭ）（図７（Ａ））、リン酸エステル−ＱＭＰ−ＰＥＧ４−Ｔａｍｒａ（２５０ｕＭ）（図７（Ｂ））及びリン酸エステル−ＱＭＰ−ＰＥＧ８−Ｔａｍｒａ（２５０ｕＭ）（図７（Ｃ））を使用した、扁桃組織におけるＢｃｌ−６染色の２０×倍率の顕微鏡写真を提供する。
図６及び７は、リンカーにＰＥＧを組み込むことが機能的染色の強度の増加をもたらすことを説明している。しかし、とりわけＰＥＧ８リンカーを有するＴａｍｒａ誘導体のシグナルの拡散の増加ももたらしうる（図７（Ｃ））。
式Ｉ−ＶＩＩＩを参照すると、特定の実施態様において、検出可能標識−Ｒ４又はリンカー検出可能標識（−Ｒ３Ｒ４）は、下記：
Figure 2021169453
である。他の特定の実施態様において、検出可能標識−Ｒ４又はリンカー検出可能標識（−Ｒ３Ｒ４）は、脂肪族リンカーを有するビオチン、ニトロピラゾール（ＮＰ）、ＰＥＧ−８リンカーを有するＮＰ、ＴＡＭＲＡ、ＤＮＰ、ファストレッド、ＨＱ、ＰＥＧ−８リンカーを有するＨＱ、ベンゾフラザン、Ｒｈｏｄ １１０、ＰＥＧ−８リンカーを有するダブシル又はＣｙ５である。量子ドット、ランタニドキレートポリマー、並びに／又は他のポリマーに基づいた色素及び蛍光を使用することもできる。
ｉｖ）リンカー
式Ｉ−ＶＩＩＩのＲ３リンカーに関して、任意の適切なリンカーを使用し、本明細書に開示されている色素原、ハプテン、蛍光団又は発光団などの検出可能な標識に結合することによって、本開示のコンジュゲートを形成することができる。有用なリンカーは、ホモ又はヘテロ二官能性の何れかでありうるが、より典型的にはヘテロ二官能性である。
単なる例として、限定することなく、第１の部類のリンカーには、１つ又は複数の不飽和部位を有する脂肪族炭化水素鎖又はアルキル鎖などの脂肪族化合物が含まれる。脂肪族鎖には、例として、限定されることなく、本明細書に開示されている検出可能標識への結合を促進する、カルボニル反応基、アミン反応基、チオール反応基、炭素反応基又は光反応基を含む末端官能基も、典型的に含まれる。鎖の長さは変わることができるが、典型的には実用的な上限の約３０個の原子を有する。約３０個を超える炭素原子の鎖連結は、より少ない鎖連結を有する化合物より有効性が低いことが証明されている。したがって、脂肪族鎖リンカーは、典型的には約１個の炭素原子から約３０個の炭素原子の鎖長さを有する。しかし、当業者は、特定のリンカーが３０個を超える原子を有し、ＱＭＰへの検出可能標識の連結に依然として効率的に作動し、コンジュゲートが依然として望ましく機能する場合、そのようなリンカーは、本開示の範囲内であることを理解する。
本開示の実施態様の実施に有用な第２の部類のリンカーは、アルキレンオキシドである。アルキレンオキシドは、エチレングリコールなどのグリコールを参照して本明細書に表される。当業者は、酸素原子の数が増加すると、化合物の親水性も増加しうることを理解する。したがって、適切なリンカーは、（−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）ｎの式を有することができ、式中、ｎは約２から約１５であるが、より典型的には、約２から約８である。
ある特定の開示された実施態様の実施に有用なヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーは、２００６年４月２８日出願の米国特許出願第１１／４１３７７８号、「ナノ粒子コンジュゲート」、２００６年４月２７日出願の米国特許出願第１１／４１３４１８号、「抗体コンジュゲート」及び２００６年１１月２１日出願の米国特許出願第１１／６０３４２５号、「分子コンジュゲート」を含む譲渡人の出願に記載されており、これらの出願は、全て、出典明示により本明細書に援用される。ヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーは、下記に開示されており、その使用は、検出可能標識へのチラミンの結合を参照して例示されている。
開示されているコンジュゲートと共に使用されるリンカーの１つの特定の実施態様は、下記：

Figure 2021169453

に示されている一般構造を有するヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールリンカーであり、ここで、Ａ及びＢは、異なる反応性基を含み、ｘは、２から１０（例えば、２、３又は４）の整数であり、ｙは、１から５０、例えば、３から２０又は４から１２などの２から３０の整数である。１個又は複数の水素原子を、ヒドロキシル基、アルコキシ基（例えば、メトキシ及びエトキシ）、ハロゲン原子（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、スルファト基、並びにアミノ基（一置換及びジアルキルアミノ基などの二置換アミノ基を含む）などの追加的な官能基で置換することができる。
リンカーのＡ及びＢは、独立して、カルボニル反応基、アミン反応基、チオール反応基、炭素反応基又は光反応基などの反応性官能基である。Ａ及びＢは、典型的には同じ反応性官能基ではない。カルボニル反応性基の例には、ヒドラジン誘導体及びアミンのような、アルデヒド及びケトン反応性基が含まれる。アミン反応性基の例には、ＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳ、イソチオシアン酸エステル、イソシアン酸エステル、アジ化アシル、塩化スルホニル、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、炭酸エステル、ハロゲン化アリール、イミドエステル、無水物などの活性エステルが含まれる。チオール反応性基の例には、非重合性マイケル受容体、ハロアセチル基、（例えば、ヨードアセチル）、ハロゲン化アルキル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル基、ビニルスルホン、ベンゾキノン、フルオロベンゼン基（例えば、テトラ及びペンタフルオロベンゼン基）などの、求核置換を受けうる芳香族基、ピリジルジスルフィド基などのジスルフィド基、並びにエルマン試薬により活性化されたチオールが含まれる。炭素反応性基の例には、クロロメチルなどのハロアルキル基が含まれる。光反応性基の例には、アジ化アリール及びハロゲン化されたアジ化アリールが含まれる。あるいは、Ａ及び／又はＢは、特定の種類の反応性基と反応する官能基でありうる。例えば、Ａ及び／又はＢは、導入された、そうでなければハプテン及び／又はチラミン若しくはチラミン誘導体に存在する対応する反応性基（例えば、それぞれ、アミン反応性基、チオール反応性基又はカルボニル反応性基）と反応するアミン基、チオール基又はカルボニル含有基でありうる。これらの種類の基のそれぞれの追加の例は、当業者に明らかである。１つの種類の反応性基を別のものに交換するための反応条件及び方法に関する更なる例及び情報は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６に提供されており、これは出典明示により本明細書に援用される。
幾つかの実施態様において、ヘテロ二官能性リンカーは、下記の式：

Figure 2021169453

を有し、式中、Ａ及びＢは、異なる反応性基であり、上記に記述された通りであり、ｘ及びｙは、上記に記述された通りであり、Ｘ及びＹは、追加のスペーサー基であり、例えば１から６個の炭素又は１から４個の炭素などの１から１０個の炭素を有し、任意選択的に１つ又は複数のアミド連結、エーテル連結、エステル連結などを含有するスペーサー基である。スペーサーＸ及びＹは、同一でありうる又は異なりうる、直鎖、分岐鎖又は環状（例えば、脂肪族若しくは芳香族環状構造）でありうる、非置換でありうる又は置換されうる。スペーサーの置換基でありうる官能基には、カルボニル基、ヒドロキシル基、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩ）原子、アルコキシ基（例えば、メトキシ及びエトキシ）、ニトロ基、並び硫酸エステル基が含まれる。
特定の実施態様において、ヘテロ二官能性リンカーは、下記の式：

Figure 2021169453

を有するヘテロ二官能性ポリエチレングリコールリンカーを含み、式中、ｎ＝１から５０であり、例えば、ｎ＝３から２０又はｎ＝４から１２などのｎ＝２から３０である。特定の実施態様において、ｎ＝４又は８である。
別の部類のリンカーは、アリールリンカーである。アリールリンカーは、フェニル、ピリジル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル又はチアゾリルなどの炭素環式又は複素環式の部分でありうる。ある特定の実施態様において、リンカーは、１，２，３−トリアゾールなどのトリアゾールである。アリール基は、炭素又はヘテロ原子の何れかを介して検出可能標識及び／又はＱＭＰ部分に結合することができる。例示的な実施態様において、トリアゾールは、アルキン及びアジド官能化検出可能標識を含むＱＭＰ部分又はアルキン及びアジド官能化ＱＭＰ部分を含む検出可能標識など、アジドとアルキンとの反応により形成される（例えば、実施例２、スキーム１１を参照すること）。アジド及び／又はアルキンは、本明細書に開示されているリンカー部分などのリンカー基を介して反応性部分に結合することができる又は共有結合を介して直接結合することができる。幾つかの実施態様において、アジド及び／又はアルキンは、アルキル鎖又は低級アルキル鎖などの脂肪族鎖を介して結合することができる。他の実施態様において、アジド及び／又はアルキンは、ポリアルキレングリコールリンカーを介して結合する。
幾つかの例示的なリンカーが、図２（Ａ）の第３パネル及び実施例に示されている。
ＩＩＩ．使用方法
開示されているＱＭ及びこれらの前駆体の実施態様は、標的の検出、例えば生物学的試料中の標的の検出に有用である。検出は、例えば、免疫組織化学技術及び／又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術を使用して実施することができる。
幾つかの実施態様において、組織内のバイオマーカーなどの標的が検出される。ある特定の実施態様において、組織は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である。当業者に理解されるように、「組織」は、本明細書に使用されるとき、子宮頸部細胞スメア、凍結組織、スライドガラス上の循環腫瘍細胞及び血液スメアを更に含むことができる。したがって、例えば、子宮頸部細胞スメアを、細胞学的調製物などに使用することができる。
ここで図３（Ａ）−（Ｃ）を参照しながら記載し、下記の実施例において更に詳述するように、幾つかの方法の実施態様は、標的２０２を含む試料２００（例えば、組織）を、抗体２０４と接触させることを含む。幾つかの実施態様において、標的は、酵素にコンジュゲートしていない一次抗体により検出することができ、二次抗体は、標的と会合した一次抗体を検出するために使用される。何れの手法においても、結果は、標的２０２に近接した酵素２０６の局在化である。図３の実施態様は、組織を、（ｉ）リン酸エステル又はホスホジエステル基及び（ｉｉ）検出可能標識又はレポーター２１６を含むＱＭＰコンジュゲート２０８と接触させることを更に含む。抗体として示されているが、任意の適切な結合部分を使用することができ、例えば、ハプテン標識核酸オリゴマーなどの核酸オリゴマー及び標的を認識し、標的に結合することができる抗体である。標的２０２を酵素２０６により標識することは、組織を、酵素２０６が連結する抗体２０４を含む酵素抗体コンジュゲートと接触させることを含んでも良い。抗体２０４は、標的を認識し、標的に特異的に結合することができる。ＱＭＰ２０８は、酵素２０６と相互作用してフェノール中間体２１０を形成し、これが再編成を行ってＱＭ２１２を形成し、これは、結合部分、酵素２０６、抗体２０４又は組織と反応して、検出可能標識２１６を標的２０２に直接的に又は標的２０２の近位において共有結合的に連結させる。次に検出可能標識２１６は、特定の検出可能標識に適切な方法を使用して検出される。
特定の実施態様において、ＱＭＰは、リン酸エステル又はホスホジエステル基を含み、酵素は、それぞれホスファターゼ又はホスホジエステラーゼであり、検出可能標識は、色素原、蛍光団、発光団又はハプテンである。幾つかの実施態様において、アルカリホスファターゼを、ホスファターゼ又はホスホジエステラーゼとして使用することができる。他の実施態様において、ＱＭＰは、β−ガラクトシドを含み、酵素は、β−ガラクトシダーゼであり、検出可能標識は、色素原、蛍光団、発光団又はハプテンである。
幾つかの実施態様において、抗体２０４は、図３（Ａ）に示されているように、標的２０２を認識し、標的２０２に直接結合する。他の実施態様において、抗体は、任意の特定の結合部分に間接的に結合しても良い。例えば、ハプテン標識抗結合部分抗体を最初に結合部分に結合させ、続いて抗ハプテン抗体酵素コンジュゲートに結合させても良い。
なお更なる実施態様は、ＱＭＰを含む免疫組織化学（ＩＨＣ）又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）増幅組成物を形成する方法を伴う。１つの例示的な実施態様は、コンジュゲート系（例えば、芳香族環系）において、炭素又は隣接炭素にそれぞれ共有結合しているリン酸エステル又はホスホジエステル基を切断する工程を含む。ＱＭＰがリン酸エステル基を含むとき、電子再編成は、リン酸エステル基のオルト又はパラにある炭素からの脱離基（ＬＧ）の排除をもたらす。反応は、ＱＭの形成に適した条件下で実施される。前駆体は、リンカーによりコンジュゲート系に結合した検出可能標識を更に含む。
幾つかの実施態様において、脱離基及び／又はＱＭＰコンジュゲートの濃度が何であるかは、標的検出（例えば、染色）特異性に影響を及ぼしうる。ＱＭの反応性は、ＱＭ形成の速度、したがってＬＧの脱離基の能力に少なくとも部分的に依存している。不十分なＬＧは、低いＱＭ形成速度を有することがあり、高いＱＭ安定性及び生成部位からの大きな拡散によって不十分な特異性をもたらす。幾つかの実施態様において、Ｒ５及び／又はＲ６が何であるかも、標的検出（例えば、染色）特異性に影響を与える。例えば、Ｒ５及び／又はＲ６のある特定の基（例えば、大型の基）は、ＱＭの、求核種と反応し、求核種に結合する能力を立体的に妨げることがある。
ある特定の実施態様において、脱離基がフッ化物（例えば、ＬＧ＝Ｆ）であるとき、拡大すると、染色領域がはっきりと良好に画定された境界線を有する特定の増幅されたＩＨＣ染色がもたらされ、優れた結果が得られた。特定の作動理論に束縛されることなく、フッ化物脱離基は、より反応性のあるＱＭＰを生じることができ、ＱＭへの急速な変換、続く標的の近位への結合をもたらす。反応性の少ないＱＭＰは、酵素認識基の切断と、脱離基の排除、続く求核部位へのＱＭの沈着及び結合との間の時間に標的から拡散しうる。加えて、ナノモルＱＭＰコンジュゲート濃度（例えば、１０ｎＭから１００ｎＭ）は、特異的染色を促進することができる。
更なる方法の実施態様は、試料を、本明細書に開示されている構造の化合物を含む免疫組織化学又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション増幅組成物と接触させること、及び増幅組成物を、検出を実施するのに適した条件下で試薬と接触させることを含む、免疫組織化学又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション増幅方法に関する。
なお他の実施態様は、組織試料中の２つ以上の異なる標的を検出する方法を伴う。１つの例示的な実施態様は、組織を、第１の標的に特異的な第１の結合部分及び第２の標的に特異的な第２の結合部分に接触させることを含む。第１の標的は、第１の結合部分を介して第１の酵素により標識され、第２の標的は、第２の結合部分を介して第２の酵素により標識される。次に組織を、（ｉ）酵素認識基及び（ｉｉ）検出可能標識を含むＱＭＰ、並びに第２の検出前駆体化合物（例えば、第２のＱＭＰ又は標識チラミド化合物）と接触させ、ＱＭＰは、第１の酵素と相互作用してＱＭを形成し、これは組織と反応して、検出可能標識を第１の標的に直接的に又は第１の標的の近位において共有結合的に連結し、第２の検出前駆体化合物は、第２の酵素と相互反応して、第２の検出化合物を第２の標的に直接的に又は第２の標的の近位において沈着させる。次に検出可能化合物が検出される。
有利には、まさに記載された方法において、第１の酵素及び第２の酵素は、異なる酵素である。例えば、第１の酵素は、ホスファターゼ又はホスホジエステラーゼであり、第２の酵素は、ペルオキシダーゼでありうる。ある特定の実施態様において、第１の酵素は、アルカリホスファターゼであり、第２の酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼである。また有利には、第１の酵素は、第２の検出前駆体化合物と相互作用して第２の検出化合物を第１の標的の近位に沈着させることはなく、及び／又は第２の酵素は、ＱＭＰと相互作用してＱＭを形成させることはない。換言すると、第１の酵素は、ＱＭＰと特異的に反応し、第２の酵素は、第２の検出前駆体化合物と特異的に反応する。例えば、第１の酵素は、ホスファターゼであり、第２の酵素は、β−ガラクトシダーゼでありうる。この例において、第１の酵素のホスファターゼは、β−ガラクトシダーゼを含むＱＭＰと反応せず、第２の酵素のβ−ガラクトシダーゼは、ホスファターゼを含むＱＭＰと反応しない。有利には、これらの方法は、酵素不活性化工程を含まない。
効率のため、実質的に同時に起こるように、組織を第１の標的に特異的な第１の結合部分と接触させ、組織を第２の標的に特異的な第２の結合部分と接触させることによって、２つ以上の標的増幅方法を実施しても良い。また第１及び第２の結合部分を、第１及び第２の酵素と実質的に同時に接触させても良い。加えて、組織を、ＱＭＰ及び第２の検出前駆体化合物と実質的に同時に接触させても良い。しかし当業者は、組織を、第１の結合部分、続いて第２の結合部分と順次に接触させても良く、その逆も同じであることを理解する。同様に、第１の標的を第１の酵素により標識することができ、続いて第２の標的を第２の酵素により標識することができ、その逆も同じである。また、組織を、ＱＭＰ、続いて第２の検出前駆体化合物と順次に接触させても良く、その逆も同じである。
図８は、同時の抗体インキュベーション、続く連続的色素産生検出の結果を説明する。図８では、Ｈｅｒ２は、ＨＲＰにコンジュゲートしたＧＡＲ抗体により検出され、Ｐａｎ−ケラチンは、ＡＰにコンジュゲートしたＧＡＭ抗体と接触する。チラミド−Ｔａｍｒａ及びＱＭＰ−ＰＥＧ８−ダブシルによる連続的検出の結果は、図８（Ａ）に示されている画像である。図９は、扁桃組織においてＣＤ８（Ｔｒｙ−ローダミン−１１０、栗色）、ＣＤ３（ＱＭＰ−Ｃｙ５、青色）、ＦｏｘＰ３（Ｔｙｒ−Ｔａｍｒａ、紫色）及びＰａｎ−ケラチン（ＱＭＰ−ダブシル、黄色）を検出する四重連続検出アッセイの結果を示す。
ある特定の実施態様において、２つの標的は、二重アッセイにおいて連続的に又は実質的に同時に検出される。検出前駆体は、例えば、異なる酵素認識基を含む２つのＱＭＰ又はＨＲＰに基づいたＴＳＡなどのＱＭＰ及び非ＱＭＰに基づいた検出方法でありうる。ある特定の実施態様において、二重アッセイは、アルカリホスファターゼ及びＨＲＰそれぞれとの反応のため、リン酸エステルを含むＱＭＰとチラミンとを含む。検出方法は、色素産生又は蛍光ＩＨＣである。図１０は、ＡＰに基づいたＱＭＰ及びＨＲＰに基づいたＴＳＡ検出の両方を利用するが、酵素死滅工程を用いない蛍光二重アッセイによる顕微鏡写真を提供する。他の実施態様において、二重アッセイは、リン酸エステルを含むＱＭＰとβ−ガラクトシドを含むＱＭＰとを含む。
三重アッセイを使用して、３つの標的を検出することができる。三重アッセイは、異なる酵素認識基を有する３つのＱＭＰ又はＱＭＰと、ＨＲＰに基づいたＴＳＡなどの他の検出方法との組み合わせを使用することができる。ある特定の実施態様において、三重アッセイは、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びＨＲＰそれぞれとの反応のため、リン酸エステルを含むＱＭＰと、β−ガラクトシドを含むＱＭＰと、チラミンとを含む。アッセイは、連続的なアッセイ又は実質的に同時のアッセイでありうる。幾つかの実施態様において、検出方法は、色素産生ＩＨＣである。
四重アッセイを使用して、４つの標的を検出することができる。四重アッセイは、異なる酵素認識基を有する４つのＱＭＰ又はＱＭＰと、ＨＲＰに基づいたＴＳＡなどの他の検出方法との組み合わせを使用することができる。幾つかの実施態様において、四重アッセイは、アルカリホスファターゼと反応するリン酸エステルを含むＱＭＰ、β−ガラクトシダーゼと反応するβ−ガラクトシドを含むＱＭＰの連続的な添加及びそれぞれＨＲＰと反応するチラミンの２つの連続的な添加を含む。他の実施態様において、四重アッセイは、アルカリホスファターゼと反応するリン酸エステルを含むＱＭＰ、β−ガラクトシダーゼと反応するβ−ガラクトシドを含むＱＭＰ、並びにそれぞれＨＲＰと反応するチラミン及びＤＡＢを含む。四重の検出方法は、色素産生ＩＨＣでありうる。
それぞれの検出工程について異なる酵素を使用する多重化アッセイでは、本記載のアッセイは、酵素死滅工程を必要とせず、それによって時間及び試薬の浪費を低減する。加えて、ＱＭ及びＴＳＡが組織の異なる反応性部位に結合するので、同時発現マーカーを、第１の検出工程が第２のための反応性部位を使い果たす可能性なしに明確に検出することができる。
幾つかの実施態様は、オリゴヌクレオチドを標識する方法に関する。オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されている（ｉ）酵素認識基及び（ｉｉ）検出可能標識を含むＱＭＰと組み合わされる。次に酵素（例えば、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼなど）を、組み合わせたオリゴヌクレオチドとＱＭＰに加える。酵素はＱＭＰから反応性ＱＭへの変換を触媒し、反応性ＱＭはオリゴヌクレオチドと共有結合して、標識されたオリゴヌクレオチドを形成する。幾つかの実施態様において、検出可能標識は、蛍光団などのハプテンである。１つの実施態様において、ＱＭＰは、リン酸エステル又はホスホジエステル基を含み、酵素は、アルカリホスファターゼである。幾つかの実施態様において、ＱＭＰは、遺伝子増幅を検出するためなどのＩＳＨ増幅アッセイに使用される。
ある特定の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、生物学的試料などの試料内の標的を認識することができ、標的に特異的に結合することができる検出プローブである。方法は、試料を、標識されたオリゴヌクレオチドと接触させ、それによって、標識されたオリゴヌクレオチドは標的に結合し、次に標識を検出することより標的を検出することを更に含むことができる。幾つかのオリゴヌクレオチド標識剤（例えば、アジリジニウムに基づいた試薬（例えば、Ｍｉｒｕｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））と対照的に、ハプテン又は蛍光団標識ＱＭＰのある特定の実施態様は、毒性がない。
ＱＭＰの機能性染色性能は、反応時間、温度、基質濃度、塩濃度及び反応媒体のｐＨを含む幾つかの要因に感受性がある。有効なｐＨは、８から１２又は９から１１などの７超から１４でありうる。ＱＭＰ濃度は、５０ｎＭから５００μＭ、５０ｎＭから１００μＭ又は１００ｎＭから１μＭなどの０超から１ｍＭ以上でありうる。色素産生染色に関するある特定の実施態様において、濃度は、１０μＭから７５０μＭ又は５０μＭから５００μＭである。蛍光団染色及び／又はハプテン増幅に関するある特定の実施態様において、濃度は、１０ｎＭから５０μＭ又は５０ｎＭから１０μＭである。これらの要因は、染色の強度及び拡散率の両方が予測可能に変更することを可能にする。しかし当業者は、染色条件も酵素と適合するべきであることを理解する。例えば、酵素の活性が実質的に低減される程度のバッファー、ｐＨ、補助因子などの変化は、ＱＭＰの染色性能に対して否定的な影響を有することがある。
ｐＨ効果の例が図１１及び１２により説明される。特定の理論に束縛されることなく、相対的に低いｐＨの７．５では、極小数のヒドロキシド求核種が反応媒体に存在した。結果は、長期間のＱＭ寿命であり、大きな拡散を伴った強力なシグナルをもたらした（図１１）。ｐＨを１０に増加すると、ヒドロキシド求核種の濃度が増加し、ＱＭの寿命を有効に減少させた。結果は、かなり少ない拡散を有する減少したシグナルであった（図１２）。
有効塩濃度は、０．１Ｍから２Ｍ、０．２５Ｍから１．５Ｍ又は０．５Ｍから１．２５Ｍなどの０超から少なくとも２Ｍでありうる。ある特定の実施態様において、塩濃度は約１Ｍである。塩は、酵素の補助因子として作用して、シグナル強度を改善する及び／又は染色の質を改善するのに有効な任意の塩でありうる。シグナルの質は、シグナルの局在化、離散及び／又は拡散低減における改善によって改善されうる。幾つかの実施態様において、塩は、塩化マグネシウム又は塩化ナトリウムである。
ＩＶ．キノンメチドアナログコンジュゲート
開示されているＱＭの実施態様を含むコンジュゲートも、本開示の範囲内である。幾つかの実施態様において、コンジュゲートは、別の基質、例えば、生物学的試料、オリゴヌクレオチド、抗体又は酵素に共有結合しているＱＭを含む。結合したＱＭは、式ＶＩＩ又はＶＩＩＩ：
Figure 2021169453
VII 又は VIII
の一般構造を有し、式中、Ａは、コンジュゲート系であり、Ｚは、Ｏ、Ｓ又はＮＲａであり、ここでＲａは、水素又は脂肪族、典型的にはアルキルであり、Ｒ３は、結合又はリンカーであり、Ｒ４は、検出可能標識であり、Ｒ５及びＲ６は、独立して、水素、ハロ、シアノ、低級アルキル、低級ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、ここで各Ｒｃは、独立して、水素、アリール、脂肪族若しくはヘテロ脂肪族であるか、又は２つのＲｃ部分は、共にヘテロ脂肪族環を形成する。ある特定の実施態様において、Ｒ４は、ハプテン、色素原、蛍光団又は発光団である。
Ｖ．自動化の実施態様
当業者は、ＱＭＰを使用する本明細書に開示されている方法の実施態様を自動化できることを理解する。Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．は、それぞれ出典明示により本明細書に援用される、米国特許第５６５０３２７号、同第５６５４２００号、同第６２９６８０９号、同第６３５２８６１号、同第６８２７９０１号及び同第６９４３０２９号、並びに米国特許出願公開第２００３０２１１６３０号及び同第２００４００５２６８５号を含む、自動化分析を実施する系及び方法を開示する多数の米国特許の譲渡人である。
ＶＩ．標的
本明細書に開示されているＱＭＰ及び方法の実施態様を使用して、多くの異なる生物学的標的を特定及び／又は定量化することができる。本開示の全体にわたって、参照が標的に対して行われるとき、標的は標的タンパク質でありうること、及びそのタンパク質と会合する任意のポリヌクレオチドを標的として使用できることも理解される。標的は、ウイルス、細菌などの病原体又はウイルスゲノムなどの細胞内寄生虫からのタンパク質又は核酸分子でありうる。例えば、標的タンパク質は、疾患と関連する（例えば、相関する、因果的に関係する、など）標的ポリヌクレオチドから産生されうる。ある特定の開示されている実施態様において、目的の標的（１つ又は複数）は、単一のヌクレオチド多形、プロモーターメチル化、ｍＲＮＡ発現、ｓｉＲＮＡ、特定のコピー数の変化、突然変異、ある特定の発現レベル、再編成又はこれらの組み合わせなどの遺伝子異常を含みうる特定の核酸配列でありうる。幾つかの実施態様において、標的は、血清、血漿及び／又は尿などの生物学的試料から得た可溶性タンパク質である。開示されている方法の幾つかの実施態様を使用して、同じ試料（例えば、同じ組織切片）からの同じ標的（例えば、ＨＥＲ２）のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を同時に検出及び定量化することができる。
開示されている方法を使用して、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲ）を検出することができる。マイクロＲＮＡは、翻訳抑制など遺伝子発現を負に調節する小型の非コードＲＮＡである。例えば、ｍｉＲ−２０５は、胚発生の際に組織再構成を促進するプロセスである上皮間葉移行（ＥＭＴ）を調節する。しかし、ＥＭＴは、腫瘍転移の初期工程である。ｍｉＲ−２０５などのマイクロＲＮＡの下方調節は、腫瘍進行における重要な工程でありうる。例えば、ｍｉＲ−２０５の発現は、幾つかの乳癌において下方調節される又は失われる。ｍｉＲ２０５を使用して、扁平上皮細胞及び非小細胞肺癌を層別化することもできる（J. Clin. Oncol., 2009, 27(12):2030-7）。他のマイクロＲＮＡは、血管新生シグナル伝達カスケードを調整することが見出されている。ｍｉＲ−１２６の下方調節は、例えば、血管新生及び炎症増加を介して癌の進行を悪化させうる。したがって、マイクロＲＮＡ発現レベルは、疾患状態の指標でありうる。
標的核酸配列は、サイズが実質的に変わりうる。限定されることなく、核酸配列は、様々な数の核酸残基を有することができる。例えば、標的核酸配列は、少なくとも約１０個の核酸残基又は少なくとも約２０個、３０個、５０個、１００個、１５０個、５００個、１０００個の残基を有することができる。同様に、標的ポリペプチドは、サイズが実質的に変わりうる。標的ポリペプチドは、典型的には、ペプチド特異的抗体に結合する少なくとも１つのエピトープ又はその断片を含む。幾つかの実施態様において、そのポリペプチドは、ペプチド特異的抗体に結合する少なくとも２つのエピトープ又はその断片を含むことができる。
特定の非限定例において、標的タンパク質は、新生物（例えば、癌）に関連する標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）により産生される。多数の染色体異常（転位及び他の再編成、増幅又は欠失を含む）が、Ｂ細胞及びＴ細胞白血病、リンパ腫、乳癌、結腸癌、神経癌などの新生物細胞、とりわけ癌細胞において特定されている。したがって幾つかの例において、標的分子の少なくとも一部は、試料中の細胞の少なくとも１つのサブセットにおいて増幅又は欠失した核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）により産生される。１つの例において、ゲノム標的核酸配列は、１つ又は複数の悪性腫瘍（例えば、ヒト悪性腫瘍）において重複される遺伝子（発癌遺伝子）を含むように選択される。発癌遺伝子は、幾つかのヒト悪性腫瘍に関与することが知られている。例えば、染色体の切断領域１８ｑ１１．２に配置するＳＴＹ遺伝子を伴う染色体再編成は、滑膜肉腫軟部組織腫瘍において一般的である。
例えば、ｃ−ｅｒｂＢ２又はＨＥＲ２／ｎｅｕとしても知られているＨＥＲ２は、細胞増殖の調節において役割を果たす遺伝子である（代表的なヒトＨＥＲ２ゲノム配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）受入番号ＮＣ＿００００１７、ヌクレオチド３５０９７９１９−３５１３８４４１により提供される）。遺伝子は、チロシンキナーゼファミリーのメンバーである１８５ｋＤａの膜貫通細胞表面受容体をコードする。ＨＥＲ２は、ヒト乳房、卵巣及び他の癌において増幅され、したがってＨＥＲ２遺伝子（又はＨＥＲ２遺伝子を含む１７番染色体の領域）を、ゲノム標的核酸配列として使用することができる。他の乳癌関連タンパク質には、エストロゲン受容体（ＥＲ）及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）が含まれる。
他の例において、悪性細胞において欠失している（失われている）腫瘍抑制遺伝子である核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）により産生される、標的タンパク質が選択される。例えば、染色体９ｐ２１に配置するｐ１６領域（Ｄ９Ｓ１７４９、Ｄ９Ｓ１７４７、ｐ１６（ＩＮＫ４Ａ）、ｐ１４（ＡＲＦ）、Ｄ９Ｓ１７４８、ｐ１５（ＩＮＫ４Ｂ）及びＤ９Ｓ１７５２を含む）は、ある特定の膀胱癌において欠失している。１番染色体（例えば、ＳＨＧＣ５７２４３、ＴＰ７３、ＥＧＦＬ３、ＡＢＬ２、ＡＮＧＰＴＬ１及びＳＨＧＣ−１３２２を包含する）の短腕の遠位領域、並びに１９番染色体（例えば、ＭＡＮ２Ｂ１、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ４４、ＣＲＸ、ＧＬＴＳＣＲ２及びＧＬＴＳＣＲ１を包含する）の動原体周囲領域（例えば、１９ｐ１３−１９ｑ１３）を伴う染色体欠失は、中枢神経系のある特定の固形腫瘍の特徴的な分子特性である。
前述の例は、説明目的のためだけに提示され、制限することは意図されない。新生物形質転換及び／又は増殖と相関する多数の他の細胞学遺伝子学的異常は、当業者に知られている。核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）により産生され、新生物形質転換と相関し、本開示の方法に有用である、標的タンパク質。
他の例において、標的タンパク質は、疾患又は状態に関連するウイルス又は他の微生物から選択される。細胞又は組織試料におけるウイルス又は微生物誘導標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）の検出は、生物体の存在の指標である。例えば、標的ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、発癌性若しくは病原性ウイルス、細菌又は細胞内寄生虫（例えば、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）及び他のマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）（種）、クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）及びランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、並びにトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）、タイレリア（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）及びバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）の種）のゲノムから選択されうる。幾つかの例において、標的タンパク質は、ウイルスゲノムの核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される。
ある特定の例において、標的タンパク質は、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）又はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ、例えばＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８）などの発癌性ウイルスの核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される。他の例において、核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される標的タンパク質は、呼吸器多核体ウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、コロナウィルス（例えば、ＳＡＲＳウイルス）、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などの病原性ウイルスからのものである。
ＶＩＩ．キット
実例的な実施態様において、キットは、本明細書に開示されているＱＭＰを含む組成物を含む。ある特定の実施態様において、キットは、ホスファターゼ抗体コンジュゲート又はホスホジエステラーゼ抗体コンジュゲートなどの１つ又は複数の酵素抗体コンジュゲートも含む。幾つかの例において、キットは、アルカリホスファターゼ／抗種抗体コンジュゲート又はアルカリホスファターゼ／抗ハプテン抗体コンジュゲートを含む。キットは、また、ｐＨ調整剤及び／又は酵素補助因子を含んでも良い。
幾つかの実施態様において、ＱＭＰは、ＤＭＳＯなどの有機溶媒中又は有機溶媒／水性バッファー混合物（水性バッファー１００％まで）中に貯蔵される。水性バッファー及び／又は貯蔵溶液は、ｐＨ０からｐＨ５又はｐＨ１からｐＨ３などの７未満のｐＨを有しても良く、ある特定の実施態様において、溶液は約２のｐＨを有する。貯蔵溶液は、また、塩化マグネシウム又は塩化ナトリウムなどの１つ又は複数の塩を含んでも良い。幾つかの実施態様において、塩の濃度は、０．２５Ｍから約１．５Ｍ、０．５Ｍから１．２５Ｍ又は約１Ｍなどの０超から２Ｍである。例示的な実施態様において、ＱＭＰ貯蔵溶液は、ＤＭＳＯと１０ｍＭのグリシンとのｐＨ２で塩化マグネシウムの濃度が１Ｍまでの混合物中にＱＭＰを含む。
幾つかの実施態様において、ｐＨ調整剤は、溶液のｐＨを、ＱＭＰの貯蔵に適したｐＨから、染色及び／又は増幅アッセイにおけるＱＭＰの有効な使用を可能にするのに適したｐＨに調整するために適した溶液である。貯蔵ｐＨは、ｐＨ０からｐＨ５であっても良く、ＱＭＰの有効な使用に適したｐＨは、ｐＨ８からｐＨ１２であっても良い。ある特定の実施態様において、ｐＨ調整剤は、０．５ＭのＴｒｉｓ溶液などのｐＨが約１０のＴｒｉｓ溶液又は０．２５ｍＭのＴｒｉｓ溶液などのｐＨが約８のＴｒｉｓ溶液を含む。
キットの色素原部分の例示的な選択肢には、
３つの分配−（ｉ）１００％の有機溶媒中のＱＭＰ、（ｉｉ）ｐＨ調整剤、（ｉｉｉ）酵素補助因子、
３つの分配−（ｉ）有機物／水性バッファーミックス（バッファー１００％まで）中のＱＭＰ、（ｉｉ）ｐＨ調整剤、（ｉｉｉ）酵素補助因子、並びに
２つの分配−（ｉ）有機物／水性バッファーミックス（バッファー１００％まで）＋酵素補助因子中のＱＭＰ、（ｉｉ）ｐＨ調整剤
が含まれるが、これらに限定されない。
当業者は、キット中では、酵素及び抗体コンジュゲートは、貯蔵中の不要な反応を防止するため、典型的には別々に貯蔵されることを理解する。
ＶＩＩＩ．実施例
以下の実施例は、ある特定の作用実施態様の特異的な特性及び一般的なプロトコールを説明するために提供される。本発明の範囲は、以下の実施例により例示される特性に限定されない。
実施例１
ＱＭＰの合成及び特徴決定
合成材料及び方法。ＮＭＲデータは、Ｔｏｐｓｐｉｎ（Ｂｒｕｋｅｒ）を稼働するＢｒｕｋｅｒ ４００ＭＨｚ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで収集した。化学シフトは、１Ｈ（ＣＤＣｌ３では７．２６ｐｐｍ、ＤＭＳＯ−ｄ６では２．５０ｐｐｍ、ＣＤ３ＯＤでは３．３１ｐｐｍ）及び１３Ｃ（ＣＤＣｌ３では７７．０ｐｐｍ、ＤＭＳＯ−ｄ６では３９．５１ｐｐｍ、ＣＤ３ＯＤでは４９．１５ｐｐｍ）の重水素化溶媒共鳴を参照した。化学シフトは、３１Ｐ（Ｈ３ＰＯ４では０ｐｐｍ）及び１９Ｆ（トリフルオロ酢酸では７６．５５ｐｐｍ）の外部基準を参照した。ＭＳデータは、Ｍａｓｓ Ｃｅｎｔｅｒ（ＪＥＯＬ）を稼働するＪＥＯＬ ＥＳＩ−ＴＯＦ（ＡｃｃｕＴＯＦ ＪＭＳ−Ｔ１００ＬＣ）により収集した。分取ＨＰＬＣは、Ｅｍｐｏｗｅｒ ３（Ｗａｔｅｒｓ）を稼働するＷａｔｅｒｓ Ｓｕｎｆｉｒｅカラム（分取Ｃ１８ ＯＢＤ １０μｍ ５０×２５０ｍｍ）を有するＷａｔｅｒｓ ２５３５により実施した。全ての化学薬品は、商業供給者から購入し、別途示されない限り、受け取ったままで使用した。
スキーム1
Figure 2021169453
化合物２。５−ニトロサリチルアルデヒド（１）（１０．０ｇ、５９．８ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ中でＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に懸濁し、続いてトリエチルアミン（１２．１ｇ、１２０ｍｍｏｌ）及びクロロリン酸ジエチル（１５．５ｇ、８９．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。次に反応混合物を０．５ＭのＨＣｌ（１００ｍＬ）で抽出し、有機層を収集し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。懸濁液を濾過し、濾液を収集し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により２つのバッチで精製して、化合物２を無色の粘性油状物（１５．４ｇ、収率８５％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.37 (s, 1H), 8.70 (dd, J = 8.4 Hz及び1.0 Hz, 1H), 8.42 (dd, J = 9.0 Hz及び2.8 Hz, 1H), 7.69 (dd, J = 9.0 Hz及び1.0 Hz, 1H), 4.28 (m, 4H), 1.37 (m, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 186.2, 156.64, 156.58, 129.9, 127.5, 127.4, 124.5, 122.1, 122.0, 65.7, 65.6, 16.1, 16.0;ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ１１Ｈ１５ＮＯ７Ｐ＋の計算値３０４．１、実測値３０３．７。
化合物３。化合物２（３．５０ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ中でＴＨＦ及びＭｅＯＨ（１：１、４０ｍＬ）の混合物に溶解し、続いてＮａＢＨ４（６５５ｍｇ、１７．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌した。次に溶液を０．５ＭのＨＣｌ（４０ｍＬ）で停止させ、得られた溶液をＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥した。懸濁液を濾過し、濾液を収集し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製して、化合物３を無色の粘性油状物（２．５５ｇ、収率７３％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.39 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.13 (dd, J = 9.0 Hz及び2.8 Hz, 1H), 7.38 (dd, J = 9.0 Hz及び1.0 Hz, 1H), 4.73 (s, 2H), 4.24 (m, 4H), 1.37 (m, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 152.6, 152.5, 145.1, 134.6, 134.5, 125.3, 124.3, 121.1, 121.0, 65.65, 65.59, 59.3, 16.12, 16.06;ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ１１Ｈ１７ＮＯ７Ｐ＋の計算値３０６．１、実測値３０５．７。
化合物４。化合物３（２．００ｇ、６．５５ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ中でＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶解し、続いてＰｄ／Ｃ（２００ｍｇ）を加えた。フラスコを密閉し、Ｈ２環境下で１６時間撹拌し、その時点で反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）で希釈した。次にへら先のセライトを加え、反応混合物を濾過した。濾液を収集し、溶媒を減圧下で除去して、無色の油状物を得た。油状物を、丸底フラスコ中でＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、続いてＤＭＡＰ（８０ｍｇ、０．６５５ｍｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（１．３８ｇ、７．２１ｍｍｏｌ）及びＮ−ｂｏｃ−アミノカプロン酸（１．６７ｇ、７．２１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌し、続いてＨ２Ｏ（２０ｍＬ）で停止させた。得られたエマルションをＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出し、有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥した。懸濁液を濾過し、濾液を収集し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製して、化合物４を無色の粘性油状物（２．０８ｇ、収率６５％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.90 (s, 1H), 7.64 (dd, J = 8.4 Hz及び2.4 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.04 (dd, J = 9.0 Hz及び1.0 Hz, 1H), 4.84 (br s, 1H), 4.55 (s, 2H), 4.41 (br s, 1H), 4.16 (m, 4H), 3.02 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.63 (m, 2H), 1.44-1.40 (m, 11H), 1.38-1.32 (m, 8H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 172.0, 156.1, 143.6, 143.5, 136.25, 133.01, 132.96, 121.3, 120.69, 120.67, 120.3, 79.0, 65.07, 65.01, 59.5, 40.3, 36.9, 29.6, 28.3, 26.2, 25.1, 16.0, 15.9;ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ２２Ｈ３７Ｎ２ＮａＯ８Ｐ＋の計算値５１１．２、実測値５１０．５。
化合物５。化合物４（６００ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）を、密閉シンチレーションバイアル中でＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解し、氷浴で０℃に冷却した。次にＤｅｏｘｏ−ｆｌｕｏｒ（登録商標）（三フッ化ビス（２−メトキシエチル）アミノ硫黄、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能、２９９ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を滴加し、反応容器を密閉した。反応混合物を０℃で１時間撹拌し、続いてＨ２Ｏ（１０ｍＬ）で停止させた。有機層を分離し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。懸濁液を濾過し、濾液を収集し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物を、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中０．０５％のＴＦＡ：ＡＣＮ）により精製して、化合物５を無色の粘性油状物（４２０ｍｇ、収率７０％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.69 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.44 (dd, J = 9.0及び0.8 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 9.0 Hz及び1.0 Hz, 1H), 5.38 (d, J = 76 Hz, 2H), 4.71 (br s, 1H), 4.18 (m, 4H), 3.06 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.29 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1.66 (m, 2H), 1.47-1.41 (m, 11H), 1.35-1.31 (m, 8H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 171.8, 156.1, 144.06, 144.01, 143.99, 143.94, 135.8, 127.74, 127.67, 127.57, 127.50, 121.3, 120.92, 120.85, 120.06, 80.5, 78.9, 64.9, 64.8, 40.4, 36.9, 29.7, 28.3, 26.3, 25.0, 16.02, 15.95;ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ２２Ｈ３７ＦＮ２Ｏ７Ｐ＋の計算値４９１．２、実測値４９１．５。
化合物６。化合物５（１４０ｍｇ、０．２８６ｍｍｏｌ）を、シンチレーションバイアル中でＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）に溶解し、続いて臭化トリメチルシリル（１３１ｍｇ、０．８５７ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器を密閉し、反応混合物を室温で１６時間撹拌し、この時点で反応をＭｅＯＨ（３ｍＬ）で停止させた。溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物を、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中０．０５％のＴＦＡ：ＡＣＮ）により直接精製して、化合物６を白色の固体（６１ｍｇ、収率６４％）として得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.68 (s, 1H), 7.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.49 (d, J = 48 Hz, 2H), 2.94 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.42 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 1.78-1.66 (m, 4H), 1.51-1.43 (m, 2H); 31P NMR (162 MHz, CD3OD) δ -4.83; 19F NMR (376 MHz, CD3OD) δ -77.5.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ１３Ｈ２１ＦＮ２Ｏ５Ｐ＋の計算値３３５．１、実測値３３４．７。１３Ｃ ＮＭＲは、低い可溶性及びシグナルの欠如によって決定されなかった。
化合物６へのコンジュゲーションの例：
化合物７。化合物６（５０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を、シンチレーションバイアル中でＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、続いてＮＨＳ−ビオチン（６０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（７６ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器を密閉し、室温で１６時間撹拌した。反応混合物を、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中０．０５％のＴＦＡ：ＡＣＮ）により直接精製して、化合物７を白色の固体（４６ｍｇ、収率５８％）として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.93 (s, 1H), 7.75 (t, J = 5.7 Hz, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.53 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.44 (d, J = 47.6 Hz, 2H), 4.36 - 4.24 (m, 1H), 4.17 - 4.06 (m, 1H), 3.09 (q, J = 6.0 Hz, 1H), 3.02 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 2.81 (dd, J = 12.4, 5.0 Hz, 1H), 2.57 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 2.28 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.03 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.67 - 1.18 (m, 12H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 171.8, 171.1, 162.7, 135.6, 120.7, 120.4, 119.7, 119.6, 80.5, 78.9, 61.0, 59.2, 55.4, 38.3, 36.2, 35.2, 29.0, 28.2, 28.0, 26.1, 25.3, 24.8. 31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ -5.21; 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -76.57.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）− Ｃ２３Ｈ３３ＦＮ４Ｏ７ＰＳ−の計算値５５９．２、実測値５５９．０。
スキーム2
Figure 2021169453
化合物９。Ｎ−ｂｏｃ−チラミン（１０．０ｇ、４２．１ｍｍｏｌ）８を、還流冷却器を備えた丸底フラスコ中でＣＨＣｌ３（８０ｍＬ）に溶解し、続いてＨ２Ｏ（４０ｍＬ）を加えた。次に粉末ＮａＯＨ（１６．８ｇ、４２１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を、油浴中で激しく撹拌しながら６０℃に加熱した。１時間後、ＮａＯＨの第２の部分（８．４ｇ、２１０ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を更に１時間続けた。１時間後、ＮａＯＨの第３の部分（８．４ｇ、２１０ｍｍｏｌ）を加え、撹拌を更に５時間続けた。次に反応混合物を０．５ＭのＨＣｌで抽出し、有機層を収集し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。懸濁液を濾過し、濾液を収集し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製して、化合物９をオフホワイトの低融点の固体（５．４３ｇ、収率４９％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.9 (s, 1H), 9.86 (s, 1H), 7.36 (d, J = 20 Hz, 2H), 6.94 (d, J = 20 Hz, 1H), 4.58 (br s, 1H), 3.34 (br s, 2H), 2.79 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.43 (s, 9H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 196.5, 160.3, 155.9, 137.6, 133.4, 130.4, 120.5, 117.8, 79.4, 41.7, 35.1, 28.4;ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）− Ｃ１４Ｈ１８ＮＯ４ −の計算値２６４．１、実測値２６４．１。
化合物１０。化合物９（２．００ｇ、７．５４ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ中でＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に懸濁し、続いてトリエチルアミン（１．５３ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）及びクロロリン酸ジエチル（１．９５ｇ、１１．３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で４時間撹拌した。次に反応混合物を０．５ＭのＨＣｌ（５０ｍＬ）で抽出し、有機層を収集し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。懸濁液を濾過し、濾液を収集し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製して、化合物１０を無色の粘性油状物（２．２０ｇ、収率７３％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.3 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.38-7.34 (m, 2H), 4.66 (br s, 1H), 4.21 (m, 4H), 3.32 (br s, 2H), 2.78 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.38-1.30 (m, 15H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 188.4, 155.7, 151.4, 151.3, 136.5, 136.0, 128.6, 127.10, 127.04, 121.17, 121.14, 79.2, 65.03, 64.97, 41.4, 35.3, 28.3, 16.02, 15.95;ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（２Ｍ＋Ｎａ）＋ Ｃ３６Ｈ５６Ｎ２ＮａＯ１４Ｐ２ ＋の計算値８２５．３、実測値８２５．３。
化合物１１。化合物１０（１．００ｇ、２．４９ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ中でＴＨＦ及びＭｅＯＨ（１：１、１０ｍＬ）の混合物に溶解し、続いてＮａＢＨ４（１４１ｍｇ、３．７４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３時間撹拌した。次に溶液を０．５ＭのＨＣｌ（１０ｍＬ）で停止させ、得られた溶液をＣＨ２Ｃｌ２（３×２５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥した。懸濁液を濾過し、濾液を収集し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製して、化合物１１を無色の粘性油状物（５４０ｍｇ、収率５３％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.29 (s, 1H), 7.14 (s, 2H), 4.65 (s, 2H), 4.60 (br s, 1H), 4.27 (m, 4H), 3.37 (br s, 2H), 2.80 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.39 (t, J = 6.8 Hz, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 155.8, 146.9, 146.8, 136.8, 133.04, 133.00, 131.4, 129.5, 121.12, 121.10, 79.3, 65.13, 65.07, 60.2, 41.6, 35.5, 28.4, 16.11, 16.04;ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ１８Ｈ３１ＮＯ７Ｐ＋の計算値４０４．２、実測値４０４．２。
化合物１２。化合物１１（２５０ｍｇ、０．６２０ｍｍｏｌ）を、密閉シンチレーションバイアル中でＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解し、氷浴で０℃に冷却した。次にＤｅｏｘｏ−ｆｌｕｏｒ（登録商標）（三フッ化ビス（２−メトキシエチル）アミノ硫黄、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能、１５１ｍｇ、０．６８２ｍｍｏｌ）を滴加し、反応容器を密閉した。反応混合物を０℃で１５分間撹拌し、続いてＨ２Ｏ（５ｍＬ）で停止させた。有機層を分離し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。懸濁液を濾過し、濾液を収集し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物を、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中０．０５％のＴＦＡ：ＡＣＮ）により精製して、化合物１２を無色の粘性油状物（１１０ｍｇ、収率４４％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.30-7.25 (m, 2H), 7.15 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.45 (d, J = 48 Hz, 2H), 4.70 (br s, 1H), 4.25-4.17 (m, 4H), 3.34 (br s, 2H), 2.78 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.42 (s, 9H), 1.34 (t, J = 6.8 Hz, 6H); 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δ 155.8, 146.91, 146.86, 146.84, 146.79, 136.0, 130.3, 129.7, 129.6, 127.6, 127.5, 127.4, 127.3, 119.9, 80.5, 79.2, 78.8, 64.82, 64.76, 41.6, 35.3, 28.2, 16.0, 15.9;ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ１８Ｈ３０ＦＮＯ６Ｐ＋の計算値４０６．２、実測値４０５．７。
化合物１３。化合物１２（１１０ｍｇ、０．２４７ｍｍｏｌ）を、シンチレーションバイアル中でＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）に溶解し、続いて臭化トリメチルシリル（ＴＭＳＢ）（１１３ｍｇ、０．７４０ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器を密閉し、反応混合物を室温で１６時間撹拌し、この時点で反応をＭｅＯＨ（１ｍＬ）で停止させた。溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物を、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中０．０５％のＴＦＡ：ＡＣＮ）により直接精製して、化合物１３を白色の固体（４５ｍｇ、収率７２％）として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.25 (d, J = 9.6 Hz, 2H), 7.17 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.38 (d, J = 48 Hz, 2H), 3.00 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.83 (t, J = 7.6 Hz, 2H); 31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ 0.22; 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -75.6.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）− Ｃ９Ｈ１２ＦＮＯ４Ｐ−の計算値２４８．０、実測値２４８．０。１３Ｃ ＮＭＲは、低い可溶性及びシグナルの欠如によって決定されなかった。
化合物１３への検出可能標識コンジュゲーションの例：
化合物１４。化合物１３（１５ｍｇ、０．０６０ｍｍｏｌ）を、シンチレーションバイアル中でＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、続いてＮＨＳ−ビオチン（２３ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１８ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器を密閉し、室温で１６時間撹拌した。反応混合物を、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中０．０５％のＴＦＡ：ＡＣＮ）により直接精製して、化合物１４を白色の固体（２５ｍｇ、収率８６％）として得た。1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.33-7.21 (m, 3H), 5.42 (d, J = 48 Hz, 2H), 4.52-4.49 (m, 1H), 4.31-4.28 (m, 1H), 3.43-3.40 (m, 2H), 3.19-3.17 (m, 1H), 2.96-2.92 (m, 1H), 2.83-2.79 (m, 2H), 2.72 (d, J = 13 Hz, 1H), 2.15 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.71-1.57 (m, 4H), 1.48-1.38 (m, 2H); 13C NMR (125 MHz, CD3OD) δ 176.3, 166.3, 149.15, 149.09, 149.04, 137.4, 131.4, 130.9, 130.8, 129.7, 129.6, 129.5, 129.4, 121.5, 81.8, 80.1, 63.6, 61.8, 57.1, 41.8, 41.2, 36.9, 35.8, 29.8, 29.6, 27.1; 31P NMR (162 MHz, CD3OD) δ -5.12; 19F NMR (376 MHz, CD3OD) δ -77.3.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）ー Ｃ１９Ｈ２６ＦＮ３Ｏ６ＰＳ−の計算値４７４．１、実測値４７４．０。
化合物１３への検出可能標識コンジュゲーションの追加の例が、スキーム３に示されている
スキーム3
Figure 2021169453
追加のＱＭＰは、スキーム４−１０に従って合成することができる。
スキーム4
Figure 2021169453
化合物１５を、ＴＨＦ及びメタノール中の水素化ホウ素ナトリウムで処理して、化合物１６を形成する。次に化合物１６を、最初に、ＤＭＦ中において１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）などのカルボジイミド架橋剤の存在下でＮ−ヒドロキシスクシンイミドにより処理して、活性化された酸を形成する（示されず）。次に、活性化された酸を、ＤＭＦ中においてトリエチルアミンなどの塩基の存在下で１−ＢＯＣペンタンジアミンと反応させて、化合物１７を形成する。次に化合物１７を、上記のスキーム２において化合物１０を作製するのに使用された方法により、ジクロロメタン中のクロロリン酸ジエチル及びトリエチルアミンと反応させて、化合物１８を形成する。次に化合物１８を、ジクロロメタン中のＤｅｏｘｏ−ｆｌｕｏｒ（登録商標）と反応させて、化合物１９を形成し、これを次に臭化トリメチルシリル（ＴＭＳＢ）と反応させて、脱保護アミン化合物２０を形成する。次に化合物２０をビオチンにコンジュゲートして、化合物２１を形成する。化合物１９、２０及び２１を作製する方法は、上記のスキーム２において化合物１２、１３及び１４に使用されたものと同じである。
スキーム5
Figure 2021169453
化合物２３。フェノール（２２）（７５．３ｇ、８００ｍｍｏｌ）、グリオキシル酸一水和物（９．２１ｇ、１００ｍｍｏｌ）、トリブチルアミン（１７．６ｇ、２２．６ｍＬ、９５ｍｍｏｌ）、Ａｌ２（ＳＯ４）３（３．３３ｇ、５ｍｍｏｌ）及びＨ２Ｏ（４ｍＬ）を丸底フラスコ中で合わせ、反応混合物を５０℃で８時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、続いて１ＭのＮａＯＨ（１００ｍＬ）を加え、１，２−ジクロロエタン（３×１００ｍＬ）で抽出した。次にＮａＯＨ層を、濃ＨＣｌの注意深い添加によりｐＨ＝２に酸性化した。得られた溶液をＥｔＯＡｃ（５×２００ｍＬ）で抽出した。有機物を収集し、合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥した。次に溶媒を減圧下で除去して、化合物２３を粘性の明褐色油状物（１３．４ｇ、収率８０％）として得た。
化合物２４。化合物２３（１２．０ｇ、７１．４ｍｍｏｌ）及びＮ−ｂｏｃ−ジアミノヘキサン（２３．２ｇ、１０７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１２５ｍＬ）に溶解し、続いてＨＯＢｔ（９６５ｍｇ、７．１４ｍｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（２０．５ｇ、１０７ｍｍｏｌ）及び最後にＤＩＥＡ（１３．８ｇ、１８．６ｍＬ、１０７ｍｍｏｌ）を連続して加えた。反応混合物をＮ２下で１６時間撹拌し、続いて減圧下でＤＭＦを約２５ｍＬに低減した。次に得られた混合物を１ＭのＨＣｌ（１００ｍＬ）で停止させ、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機物を収集し、合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｓｎａｐ ５０、ヘキサン：ＥｔＯＡｃの１：０から５：９５）により３つの別々の等しい部分で精製して、化合物２４を無色の粘性油状物（１６．０ｇ、収率６１％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋２Ｈ−ｂｏｃ）＋ Ｃ１４Ｈ２３Ｎ２Ｏ３ ＋の計算値２６７．２、実測値２６６．６。
化合物２５。化合物２４（１３．０ｇ、３５．５ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）に溶解し、Ｎ２下で氷浴により０℃に冷却した。次にトリエチルアミン（１０．８ｇ、１４．８ｍＬ、１０７ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。次にクロロリン酸ジエチル（６．７３ｇ、７．６９ｍＬ、３９．０ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴加した。反応混合物を氷浴から取り出し、Ｎ２下で４時間撹拌した。次に反応混合物を１ＭのＨＣｌ（２００ｍＬ）で停止させ、ＥｔＯＡｃ（３×２００ｍＬ）で抽出した。有機物を収集し、合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物をフラッシュクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｓｎａｐ ３４０、ヘキサン：ＥｔＯＡｃの１：０から５：９５）により精製して、化合物２５を無色の粘性油状物（１６．２ｇ、収率９１％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ２３Ｈ４０Ｎ２Ｏ８Ｐ＋の計算値５０３．５、実測値５０３．２。
化合物２６。化合物２５（１３．０ｇ、２５．９ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解し、続いてＮ２下で氷浴により−４０℃に冷却した。次にＤｅｏｘｏ−ｆｌｕｏｒ（登録商標）（６．０２ｇ、５．０１ｍＬ、２７．２ｍｍｏｌ）を、１５分間かけて滴加した。反応混合物を氷浴から取り出し、Ｎ２下で１時間撹拌した。次に反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で停止させ、続いてＣＨ２Ｃｌ２（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機物を収集し、合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物をフラッシュクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｓｎａｐ ３４０、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨの１：０から９２：８）により精製して、化合物２６を明黄色の粘性油状物（１１．５ｇ、収率８５％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋２Ｈ−ｂｏｃ）＋ Ｃ１８Ｈ３１ＦＮ２Ｏ５Ｐ＋の計算値４０５．２、実測値４０５．０。
化合物２７。化合物２６（１１．０ｇ、２１．８ｍｍｏｌ）を無水ＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）に溶解し、続いてＮ２下で氷浴により０℃に冷却した。次にＴＭＳＢｒ（１６．７ｇ、１４．３ｍＬ、１０９ｍｍｏｌ）を、１０分間かけて滴加した。次に反応混合物を氷浴から取り出し、Ｎ２下で１６時間撹拌した。反応混合物をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）で停止させ、溶液を減圧下で除去した。残留物を、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ１８、５０×２５０ｍｍ、４０ｍＬ／分、Ｈ２Ｏ中０．０５％のＴＦＡ：ＣＨ３ＣＮの４０分間かけて９９：１から５：９５）を使用して５つの等量で精製して、化合物２７を白色の固体（４．２０ｇ、収率５５％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ１４Ｈ２２ＦＮ２Ｏ５Ｐ＋の計算値３４９．３、実測値３４８．９。
化合物２７へのコンジュゲーションの例：化合物２８。５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン（５００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解し、続いてＤＭＡＰ（２１３ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）及び炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（３２７ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器を密閉し、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。次に化合物２７（４４６ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を加え、続いてＤＩＥＡ（７５０ｍｇ、１．０１ｍＬ、５．８０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をＭｅＯＨ（５ｍＬ）で希釈し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中０．０５％のＴＦＡ：ＡＣＮの４０分間かけて９９：１から５：９５）により精製して、化合物２８を暗紫色の固体（６２５ｍｇ、収率７１％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ３９Ｈ４３ＦＮ４Ｏ９Ｐ＋の計算値７６１．３、実測値７６１．３。
化合物２９は、化合物２１と同じ方法で作製され、化合物３０は、下記の化合物３７と同じ方法で作製される。
スキーム6
Figure 2021169453
化合物３２。４−ヒドロキシマンデル酸（３１）（１１．０ｇ、５９．１ｍｍｏｌ）及びＮ−ｂｏｃ−ジアミノヘキサン（１４１．１ｇ、６５．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１２５ｍＬ）に溶解し、続いてＨＯＢｔ（８００ｍｇ、５．９１ｍｍｏｌ）、ＥＤＡＣ（１７．０ｇ、８８．７ｍｍｏｌ）及び最後にＤＩＥＡ（１１．５ｇ、１５．４ｍＬ、８８．７ｍｍｏｌ）を連続して加えた。反応混合物をＮ２下で１６時間撹拌し、続いて減圧下でＤＭＦを約２５ｍＬに低減した。次に得られた混合物を１ＭのＨＣｌ（１００ｍＬ）で停止させ、ＥｔＯＡｃ（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機物を収集し、合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物を、フラッシュクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｓｎａｐ ５０、ヘキサン：ＥｔＯＡｃの１：０から５：９５）により３つの別々の等しい部分で精製して、化合物３２を無色の粘性油状物（１８．７ｇ、収率８６％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.28 (s, 1H), 7.07 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.81 (br s, 1H), 6.64 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 4.87 (s, 1H), 4.78 (br s, 1H), 4.57 (br s, 1H), 3.23-3.11 (m, 2H), 2.99-2.97 (m, 2H), 1.42-1.35 (m, 13H), 1.18 (br s, 4H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173.4, 162.7, 157.0, 128.2, 115.8, 79.4, 73.8, 40.34, 39.2, 36.5, 31.5, 29.7, 29.2, 28.4, 26.2, 26.1.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋２Ｈ−ｂｏｃ）＋ Ｃ１４Ｈ２３Ｎ２Ｏ３ ＋の計算値２６７．２、実測値２６６．６。
化合物３３。化合物３２（１８．５ｇ、５０．５ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）に溶解し、Ｎ２下で氷浴により０℃に冷却した。次にトリエチルアミン（２５．６ｇ、３５．２ｍＬ、２５３ｍｍｏｌ）を加え、１０分間撹拌した。次にクロロリン酸ジエチル（９．１５ｇ、７．６９ｍＬ、５３．０ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴加した。反応混合物を氷浴から取り出し、Ｎ２下で４時間撹拌した。次に反応混合物を１ＭのＨＣｌ（２００ｍＬ）で停止させ、ＥｔＯＡｃ（３×２００ｍＬ）で抽出した。有機物を収集し、合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物をフラッシュクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｓｎａｐ ３４０、ヘキサン：ＥｔＯＡｃの１：０から５：９５）により精製して、化合物３３を無色の粘性油状物（２２．６ｇ、収率８９％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.36 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.14 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.66 (br s, 1H), 4.85 (s, 1H), 4.64 (br s, 2H), 4.20-4.13 (m, 4H), 3.24-3.20 (m, 2H), 3.08-3.03 (m, 2H), 1.40-1.25 (m, 23H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 172.1, 156.1, 150.5, 150.4, 136.9, 128.1, 120.04, 119.99, 79.1, 73.2, 64.8, 64.71, 64.65, 40.1, 39.1, 29.8, 29.2, 28.4, 26.04, 25.98, 16.07, 16.00; 31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ -5.9.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ２３Ｈ４０Ｎ２Ｏ８Ｐ＋の計算値５０３．５、実測値５０３．２。
化合物３４。化合物３３（２１．５ｇ、４２．３ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解し、続いてＮ２下で氷浴により０℃に冷却した。次にＤｅｏｘｏ−ｆｌｕｏｒ（登録商標）（１０．４ｇ、８．６８ｍＬ、４７．１ｍｍｏｌ）を、１５分間かけて滴加した。反応混合物を氷浴から取り出し、Ｎ２下で１時間撹拌した。次に反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で停止させ、続いてＣＨ２Ｃｌ２（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機物を収集し、合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物をフラッシュクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｓｎａｐ ３４０、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨの１：０から９２：８）により精製して、化合物３４を明黄色の粘性油状物（１４．９ｇ、収率６９％）として得た。 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.36 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.17 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.81 (br s, 1H), 5.67 (d, 2H, J = 48 Hz), 4.73 (br s, 1H), 4.20-4.10 (m, 4H), 3.26-3.20 (m, 2H), 3.05-2.98 (m, 2H), 1.50-1.20 (m, 23H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 168.2, 168.0, 155.9, 151.28, 151.25, 151.21, 151.18, 131.7, 131.5, 128.03, 127.97, 119.95, 119.90, 91.9, 90.0, 78.7, 64.55, 64.48, 40.1, 38.7, 29.7, 29.1, 28.2, 26.07, 25.98, 15.90, 15.83; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ -175.5; 31P NMR (162 MHz, CDCl3) δ -6.0.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋２Ｈ−ｂｏｃ）＋ Ｃ１８Ｈ３１ＦＮ２Ｏ５Ｐ＋の計算値４０５．２、実測値４０５．０。
化合物３５。化合物３４（３．２０ｇ、６．３４ｍｍｏｌ）を無水ＣＨＣｌ３（２０ｍＬ）に溶解し、続いてＮ２下で氷浴により０℃に冷却した。次にＴＭＳＢｒ（４．８５ｇ、４．１９ｍＬ、３１．７ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴加した。次に反応混合物を氷浴から取り出し、Ｎ２下で１６時間撹拌した。反応混合物をＭｅＯＨ（２０ｍＬ）で停止させ、溶液を減圧下で除去した。残留物をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に取り、得られた混合物を、氷水（１００ｍＬ）の撹拌フラスコに滴加して、高粘度の白色沈殿物をもたらした。固体を真空濾過により収集し、冷水で洗浄した。得られた白色の固体を高真空下で乾燥させて、化合物３５を白色の固体（１．５０ｇ、収率６８％）を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.32 (t, 1H, J = 5.4 Hz), 8.17 (br s, 3H), 7.36 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.16 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 5.72 (d, 2H, J = 48 Hz), 3.13-3.07 (m, 2H), 2.29 (br s, 2H), 1.35-1.20 (m, 4H), 1.05-1.00 (m, 2H), 0.90-0.84 (m, 2H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 168.3, 168.1, 154.7, 129.6, 129.4, 127.23, 127.18, 91.4, 89.6, 38.3, 37.1, 28.6, 26.9, 25.5, 24.9;19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -174.2;31P NMR (162 MHz, DMSO-d6) δ -4.8.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ１４Ｈ２２ＦＮ２Ｏ５Ｐ＋の計算値３４９．３、実測値３４８．９。
化合物３５へのコンジュゲーションの例：化合物３６。５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン（５００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解し、続いてＤＭＡＰ（２１３ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）及び炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（３２７ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器を密閉し、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。次に化合物３５（４４６ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を加え、続いてＤＩＥＡ（７５０ｍｇ、１．０１ｍＬ、５．８０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をＭｅＯＨ（５ｍＬ）で希釈し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中０．０５％のＴＦＡ：ＡＣＮの４０分間かけて９９：１から５：９５）により精製して、化合物３６を暗紫色の固体（６２５ｍｇ、収率７１％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ３９Ｈ４３ＦＮ４Ｏ９Ｐ＋の計算値７６１．３、実測値７６１．３。
化合物３７。アミノ−ｐｅｇ８−酸（５１１ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）及びＤＩＥＡ（４４９ｍｇ、６０５μＬ、３．４７ｍｍｏｌ）の溶液に加え、続いて澄んだ溶液が観察されるまで超音波処理した。次に塩化ダブシル（７５０ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ）を１５分間かけて１０個の等しい部分で加えた。反応容器を密閉し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。次にＤＭＡＰ（２１２ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）を加え、続いて炭酸Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジル（３２７ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を１５分間かけて１０個の等しい部分で加えた。反応容器を密閉し、反応混合物を室温で１５分間撹拌した。次に化合物３５（４４６ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）を加え、続いてＤＩＥＡ（７５０ｍｇ、１．０１ｍＬ、５．８０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物をＭｅＯＨ（５ｍＬ）で希釈し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中０．０５％のＴＦＡ：ＡＣＮの４０分間かけて９９：１から５：９５）により精製して、化合物３７を暗橙色の粘性油状物（７３５ｍｇ、アミノ−ｐｅｇ８−酸に基づいて収率６０％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋２Ｈ）２＋ Ｃ４７Ｈ７４ＦＮ６Ｏ１６ＰＳ２＋の計算値５３０．２、実測値５３０．３。
スキーム7
Figure 2021169453
化合物３８。化合物３２（４．４９ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）に溶解し、続いてイミダゾール（２．０８ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）及びＴＢＳ−Ｃｌ（４．６１ｇ、３０．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器を密閉し、室温で４時間撹拌した。次に溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物をＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ（１０：１、２０ｍＬ）の混合物に取った。次にＤＢＵ（１．８７ｇ、１２．３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。次に反応混合物をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）及び１ＭのＨＣｌ（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を収集し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物をフラッシュクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｓｎａｐ ５０、ヘキサン：ＥｔＯＡｃの１：０から１：４）により精製して、化合物３８を無色の油状物（５．１０ｇ、収率８６％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.89 (br s, 1H), 7.06 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.01 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 6.54 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 4.95 (s, 1H), 4.62 (br s, 1H), 3.30-3.20 (m, 2H), 3.09-3.01 (m, 2H), 1.55-1.46 (m, 13H), 1.28 (s, 4H), 0.88 (s, 9H), 0.05 (s, 3H), -0.12 (s, 3H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173.3, 156.7, 130.5, 127.6, 115.6, 79.2, 75.6, 40.4, 38.8, 29.9, 29.5, 28.4, 26.3, 25.7, 18.1, -4.7, -5.3.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ２５Ｈ４５Ｎ２Ｏ５Ｓｉ＋の計算値４８１．３、実測値４８１．３。
化合物３９。化合物３８（１．７５ｇ、３．６４ｍｍｏｌ）、ＴＢＡＢｒ（２．３５ｇ、７．２８ｍｍｏｌ）及びアセトブロモ−α−Ｄ−ガラクトシド（２．９９ｇ、７．２８ｍｍｏｌ）を丸底フラスコ中で合わせ、ＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）に溶解した。次にＮａＯＨ（５ｗｔ％、１２ｍＬ）の水溶液を加え、反応混合物を室温で４時間激しく撹拌した。次に反応混合物をブライン（５０ｍＬ）で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機層を収集し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物をフラッシュクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｓｎａｐ ５０、ヘキサン：ＥｔＯＡｃの１：０から１：４）により精製して、化合物３９を無色の油状物（２．４５ｇ、収率８３％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.34 (dd, 2H, J = 8.8 Hz及び2.0 Hz), 6.93 (d, 2H, J = 8.8 Hz), 6.82-6.78 (m, 1H), 5.49-5.41 (m, 2H), 5.06 (dd, 1H, J = 14 Hz及び3.6 Hz), 5.03-5.00 (m, 2H), 4.55 (br s, 1H), 4.25-4.00 (m, 3H), 3.33-3.25 (m, 1H), 3.17-3.02 (m, 3H), 2.16 (s, 3H), 2.04 (s, 6H), 1.99 (s, 3H), 1.50-1.40 (m, 13H), 1.29 (br s, 4H), 0.91 (s, 9H), 0.06 (s, 3H), -0.06 (s, 3H);13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 171.9, 170.3, 170.2, 170.0, 169.3, 156.66, 156.64, 155.9, 134.86, 136.84, 127.34, 127.28, 116.7, 99.60, 99.57, 79.0, 75.1, 75.0, 70.92, 70.89, 70.8, 68.6, 66.8, 61.3, 40.3, 38.7, 29.9, 29.5, 28.4, 26.4, 26.3, 25.7, 20.7, 20.6, 20.5, 18.1, -4.8, -5.4.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ３９Ｈ６３Ｎ２Ｏ１４Ｓｉ＋の計算値８１１．４、実測値８１１．７。
化合物４０。化合物３９（２．１５ｇ、２．６５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）に溶解し、続いてＮ２でパージし、氷浴で０℃に冷却した。次にＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１Ｍ、２．６５ｍＬ、２．６５ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴加した。反応混合物をＮ２下において０℃で１５分間撹拌し、続いて飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２５ｍＬ）で停止させた。得られた懸濁液をＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機物を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物をフラッシュクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｓｎａｐ ５０、ヘキサン：ＥｔＯＡｃの１：０から１：９）により精製して、化合物４０を無色の油状物として得て、それを高真空に曝露すると白色の泡状物になった（１．５５ｇ、収率８４％）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.35 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.99 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.36 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 5.50-5.43 (m, 2H), 5.10 (dd, 1H, J = 10 Hz及び3.2 Hz), 5.05-4.98 (m, 2H), 4.57 (br s, 1H), 4.25-4.02 (m, 3H), 4.04 (br s, 1H), 3.30-3.20 (m, 2H), 3.21-3.03 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.05-2.00 (m, 9H), 1.53-1.33 (m, 13H), 1.32-1.20 (m, 4H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 172.1, 170.4, 170.2, 170.1, 169.4, 157.0, 156.1, 134.65, 134.63, 128.2, 117.2, 117.1, 99.62, 99.60, 79.2, 73.53, 73.49, 71.0, 70.8, 68.6, 66.8, 61.3, 40.0, 39.2, 29.8, 29.2, 28.4, 25.9, 20.70, 20.65, 20.64, 20.56.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ３３Ｈ４９Ｎ２Ｏ１４ ＋の計算値６９７．３、実測値６９７．５。
化合物４１。化合物４０（１．２２ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）を無水ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解し、続いてＮ２下で氷浴により０℃に冷却した。次にＤｅｏｘｏ−ｆｌｕｏｒ（登録商標）（４２６ｍｇ、３５５μＬ、１．９３ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴加した。反応混合物を氷浴から取り出し、Ｎ２下で１５分間撹拌した。次に反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍＬ）で停止させ、続いてＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍＬ）で抽出した。有機物を収集し、合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物をフラッシュクロマトグラフィー（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｓｎａｐ ５０、ヘキサン：ＥｔＯＡｃの１：０から１：９）により精製して、化合物４１を無色の油状物として得て、それを高真空に曝露すると白色の泡状物になった（８４０ｍｇ、収率６９％）。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.35 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.99 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.63 (br s, 1H), 5.69 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 5.50-5.41 (m, 2H), 5.08 (dd, 1H, J = 10 Hz及び3.6 Hz), 5.03 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 4.58 (br s, 1H), 4.23-4.01 (m, 3H), 4.04 (br s, 1H), 3.30-3.23 (m, 2H), 3.12-3.01 (m, 2H), 2.16 (s, 3H), 2.02-1.96 (m, 9H), 1.58-1.25 (m, 17H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 170.3, 170.1, 170.0, 169.3, 168.4, 168.2, 162.4, 157.62, 157.60, 157.57, 156.0, 129.94, 129.91, 129.75, 129.72, 128.31, 128.24, 128.18, 116.90, 116.89, 99.3, 92.27, 92.23, 90.40, 90.37, 79.0, 70.99, 70.98, 70.7, 68.5, 66.8, 61.3, 40.2, 38.9, 36.4, 31.2, 29.9, 29.3, 28.3, 26.2, 26.1, 20.62, 20.57, 20.48; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ -175.2, -175.6.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｎａ）＋ Ｃ３３Ｈ４７ＦＮ２ＮａＯ１３ ＋の計算値７２１．３、実測値７２１．２。
化合物４２。化合物４１（３００ｍｇ、０．４２９ｍｍｏｌ）をＴＥＡ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（１：８：１、２ｍＬ）の混合物に溶解し、室温で４時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、続いてＴＦＡ：ＣＨ２Ｃｌ２（１：１、５ｍＬ）の溶液を加えた。反応容器を密閉し、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物を、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中０．０５％のＴＦＡ：ＡＣＮの６０分間かけて９９：１から５：９５）により精製して、化合物４２を白色の固体（７５ｍｇ、収率４１％）として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.43 (t, 1H, J = 5.6 Hz), 7.67 (br s, 3H), 7.35 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.05 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 5.77 (d, 1H, J = 48 Hz), 5.18 (s, 1H), 4.95-4.80 (m, 2H), 4.67 (s, 1H), 4.53 (s, 1H), 3.70 (s, 1H), 3.60-3.25 (m, 7H), 3.20-3.05 (m, 2H), 1.55-1.38 (m, 4H), 1.37-1.20 (m, 4H); 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 168.8, 167.7, 158.0, 129.2, 129.0, 128.6, 128.5, 116.1, 100.6, 91.50, 91.45, 89.69, 89.63, 75.5, 73.3, 70.2, 68.1, 60.3, 38.8, 38.1, 28.7, 26.9, 25.7, 25.4; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ -170.4, -170.5.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ２０Ｈ３２ＦＮ２Ｏ７ ＋の計算値４３１．２、実測値４３１．１。
化合物４２へのコンジュゲーションの例：化合物４３。化合物４２（５ｍｇ、１２μｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解し、続いてトリエチルアミン（６ｍｇ、８μＬ、５８μｍｏｌ）及び最後にＣｙ５−ＮＨＳエステル（７ｍｇ、１２μｍｏｌ）を加えた。反応容器を密閉し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物をＭｅＯＨ（１ｍＬ）で希釈し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中０．０５％のＴＦＡ：ＡＣＮの４０分間かけて９９：１から５：９５）により直接精製して、化合物４３（ＴＦＡ塩）を青色の固体（８ｍｇ、収率６８％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ）＋ Ｃ５２Ｈ６８ＦＮ４Ｏ８ ＋の計算値８９５．５、実測値８９５．２。
Figure 2021169453
スキーム8
化合物４４。化合物３２（２００ｍｇ、０．５４６ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコ中でＥｔＯＡｃ（１ｍＬ）に溶解し、続いてトリエチルアミン（１６６ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ）及び塩化プロピオニル（５６ｍｇ、０．６００ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。次に反応混合物を０．５ＭのＨＣｌ（５ｍＬ）及びＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出し、有機層を収集し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。懸濁液を濾過し、濾液を収集し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃの１：０から１：９）により精製して、化合物４４を白色の固体（２１０ｍｇ、収率９１％）として得た。1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ 7.42 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.14 (br s, 1H), 7.06 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 5.34 (br s, 1H), 4.96 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 4.51 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 3.15 (q, 2H, J = 6.8 Hz), 2.97 (q, 2H, J = 6.8 Hz), 2.58 (q, 2H, J = 7.6 Hz), 1.42-1.30 (m, 13H), 1.29-1.12 (m, 7H); 13C NMR (101 MHz, CD3CN) δ 174.1, 173.0, 157.0, 151.6, 139.5, 128.8, 122.7, 78.98, 74.2, 41.0, 39.6, 30.7, 30.2, 28.7, 28.2, 27.07, 27.03, 9.36.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｎａ）＋ Ｃ２２Ｈ３４Ｎ２ＮａＯ６ ＋の計算値４４５．２、実測値４４５．２
化合物４５。化合物４４（２００ｍｇ、０．４７３ｍｍｏｌ）を、密閉シンチレーションバイアル中でＣＨＣｌ３（５ｍＬ）に溶解し、氷浴で０℃に冷却した。次にＤｅｏｘｏ−ｆｌｕｏｒ（登録商標）（１１０ｍｇ、０．４９７ｍｍｏｌ）を滴加し、反応容器を密閉した。反応混合物を０℃で１時間撹拌し、続いて０．５ＭのＨＣｌ（５ｍＬ）で停止させた。有機層を分離し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。懸濁液を濾過し、濾液を収集し、溶媒を減圧下で除去した。得られた残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃの１：０から１：９）により精製して、化合物４５を白色の固体（１５５ｍｇ、収率７７％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.39 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.04 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.81 (br s, 1H), 5.68 (d, 1H, J = 48 Hz), 4.77 (br s, 1H), 3.21 (q, 2H, J = 6.0 Hz), 3.00-2.95 (m, 2H), 2.52 (q, 2H, J = 7.6 Hz), 1.42-1.30 (m, 13H), 1.29-1.11 (m, 7H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ172.5, 168.1, 167.9, 155.9, 151.19, 151.17, 132.4, 132.2, 127.53, 127.47, 121.5, 91.9, 90.0, 78.6, 40.02, 38.65, 29.7, 29.1, 28.2, 27.4, 26.0, 25.9, 8.7;19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ -178.0.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｎａ）＋ Ｃ２２Ｈ３３ＦＮ２ＮａＯ５ ＋の計算値４４７．２、実測値４４７．１。
化合物４６。化合物４５（１００ｍｇ、０．２３６ｍｍｏｌ）を、シンチレーションバイアル中でＣＨ２Ｃｌ２：ＴＦＡの１：１混合物（１ｍＬ）に溶解した。バイアルを密閉し、室温で３０分間撹拌した。次に溶媒を減圧下で除去し、得られた残留物は、続く合成工程に適した純度であることが見出された。化合物４６を粘性油状物として得て、ＴＦＡ塩と決定された（１００ｍｇ、収率９７％）。少量の試料を、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中０．０５％のＴＦＡ：ＡＣＮの４０分間かけて９９：１から５：９５）により精製して、分析試料を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.42 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 7.09 (d, 2H, J = 7.6 Hz), 6.98 (br s, 1H), 5.72 (d, 1H, J = 48 Hz), 3.23 (br s, 2H), 2.57 (q, 2H, J = 7.6 Hz), 1.60-1.40 (m, 4H), 1.39-1.15 (m, 7H); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173.1, 169.0, 168.8, 151.52, 151.50, 132.5, 132.3, 128.0, 127.9, 121.9, 91.9, 90.1, 39.6, 38.7, 28.7, 27.6, 26.9, 25.5, 25.2, 8.9; 19F NMR (376 MHz, CDCl3) δ-177.5.ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋ Ｃ１７Ｈ２６ＦＮ２Ｏ３ ＋の計算値３２５．２、実測値３２５．２。
化合物４６へのコンジュゲーションの例：化合物４７。化合物４６（ＴＦＡ塩、１０ｍｇ、２３μｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解し、続いてトリエチルアミン（７ｍｇ、１０μＬ、６８μｍｏｌ）及び最後にＣｙ５−ＮＨＳエステル（１５ｍｇ、２５μｍｏｌ）を加えた。反応容器を密閉し、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物をＭｅＯＨ（１ｍＬ）で希釈し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ中０．０５％のＴＦＡ：ＡＣＮの４０分間かけて９９：１から５：９５）により直接精製して、化合物４７（ＴＦＡ塩）を青色の固体（１２ｍｇ、収率５８％）として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ（Ｍ）＋ Ｃ４９Ｈ６２ＦＮ４Ｏ４ ＋の計算値７８９．５、実測値７８９．１。
スキーム10
Figure 2021169453
レゾルフィンを、クロロホルム及び水中の水酸化ナトリウムで処理して、アルデヒド４８を形成する。次にアルデヒド４８を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの適切な還元剤の存在下で化合物２０と反応させて、化合物４９を形成する。
スキーム11
Figure 2021169453
アジドアルキン「クリック」化学による、１，２，３−トリアゾリルリンカーを含有するＱＭの合成
化合物５７は、スキーム１１に示されている反応順序により調製される。最初に、サリチルアルデヒド（５０）を、臭化エチニルマグネシウム（５１）と反応させて、化合物５２を得る。次に化合物５２を、クロロリン酸ジエチル（５３）及びＤｅｏｘｏｆｌｕｏｒ（登録商標）と順に反応させて、化合物５４を得る。化合物５４をＴＭＳＢｒで脱保護して、リン酸アリール５５を得る。最後に、化合物５５を末端アジド官能化レポーター分子（Ｎ３−Ｒ４、化合物５６）と反応させて、１，２，３−トリアゾリルリンカーを含有するＱＭレポーターコンジュゲート（５７）を得る。
実施例２
ＱＭＰを使用する標的検出
ＱＭＰの一般的免疫組織化学（ＩＨＣ）プロトコール。別途特定のない限り、全てのＩＨＣ染色実験は、ＶＥＮＴＡＮＡ ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴ自動組織染色プラットフォームにより実施し、これらのプラットフォームに使用された試薬は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ，ＵＳＡ、“Ｖｅｎｔａｎａ”）からのものであった。ポリクローナルヤギ抗ウサギ抗体、ヤギ抗マウス抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）は、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。
以下の共通の工程を実施した。（１）ＥＺ Ｐｒｅｐ洗剤溶液（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＶＭＳＩ）、＃９５０−１０１）による脱パラフィン（７５℃、２０分間）、（２）Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＶＭＳＩ ＃９５０−３００）による洗浄、（３）Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＶＭＳＩ ＃９５０−１２４）による抗原回収（１００℃、時間は目的の抗原に応じて決まる）、（４）洗浄（工程２と同じ）、（５）後に続くＨＲＰ検出工程のプロトコールのため、内在性ペルオキシダーゼを、ｉＶＩＥＷ阻害剤（ＶＭＳＩ，Ｅ２５３−２１８７）の使用により不活性化した（３７℃、４分間）、（６）洗浄（工程２と同じ）、（７）一次抗体（Ａｂ）インキュベーション（３７℃、時間は、一次抗体に応じて、８−３２分間）及び（８）洗浄（工程２と同じ）。後に続く全ての試薬インキュベーション工程は、工程（２）の洗浄によって別々に分けられた。
図４及び５に説明されているように、２つの実験染色プロトコールを使用した。一次抗体（抗標的抗体）インキュベーション及び洗浄の後には、ＡＰにコンジュゲートしたヤギポリクローナル抗種抗体を用いる二次抗体インキュベーションが続いた（３７℃、８分間）（図４）。一次抗体インキュベーション及び洗浄の後には、ニトロピラゾール（ＮＰ）によりハプテン標識されたヤギポリクローナル抗種抗体を用いる二次抗体インキュベーションが続いた（３７℃、８分間）。洗浄した後、ＡＰコンジュゲートマウス抗ＮＰモノクローナル抗体を加えた（３７℃、８分間）（図５）。
検出１−ＨＲＰ ＤＡＢ。ＡＰコンジュゲートとインキュベートした後、スライドをＳｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ洗浄液（ＶＭＳＩ ＃８６０−０１５）で洗浄した。ＱＭＰ試薬を１００ｍＭのＣＨＥＳ（３−シクロ−ヘキシルアミノ−エチルスルホン酸）、ｐＨ１０．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解した。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（ＶＭＳＩ ＃２５３−２１８２）、続く１００μＬのハプテン標識ＱＭＰの添加及び３７℃で１６分間のインキュベーションによって達成した。化合物２９は、この方法に使用できる例示的なハプテンＱＭＰである。沈着したハプテンを、続いてマウス抗ハプテンＨＲＰコンジュゲート（又はストレプトアビジンＨＲＰ）により結合させ（３７℃、８分間）、過酸化水素及びＤＡＢの添加（３７℃、８分間）によりＨＲＰから生じた褐色沈殿物によって可視化した。硫酸銅の添加（３７℃、４分間）により、ＤＡＢの色調を強めた。染色組織切片を、修飾メイヤーヘマトキシリン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＩＩ，ＶＭＳＩ ＃７９０−２２０８）により対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＶＭＳＩ ＃７６０−２０３７）と共にインキュベートした（３７℃、４分間）。次にスライドを、一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。図１３（Ａ）は、この方法により染色されたスライドの例示的な顕微鏡写真を示す。
検出２−ＡＰレッド。ＡＰコンジュゲートとインキュベートした後、スライドをＳｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ洗浄液で洗浄した。ＱＭＰ試薬を１００ｍＭのＣＨＥＳ、ｐＨ１０．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解した。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬのハプテン標識ＱＭＰの添加及び３７℃で１６分間のインキュベーションによって達成した。化合物２９は、この方法に使用できる例示的なハプテンＱＭＰである。沈着したハプテンを、続いてマウス抗ハプテンＡＰコンジュゲート（又はストレプトアビジンＡＰコンジュゲート）により結合させ（３７℃、８分間）、検出は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬのナフトールＡＳ−ＴＲリン酸エステル及び２００μＬのファストレッドＫＬの添加（３７℃、１６分間）により達成した。染色組織切片を、修飾メイヤーヘマトキシリンにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートした（３７℃、４分間）。スライドを洗剤水混合物ですすぎ、空気乾燥し、手作業によりカバーガラスで覆った。図１４（Ｂ）−１４（Ｄ）は、この方法により染色されたスライドの例示的な顕微鏡写真を示す。
検出３−量子ドット。ＡＰコンジュゲートとインキュベートした後、スライドをＳｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ洗浄液で洗浄した。ＱＭＰ試薬を１００ｍＭのＣＨＥＳ、ｐＨ１０．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解した。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬのハプテン標識ＱＭＰの添加及び３７℃で１６分間のインキュベーションによって達成した。化合物２９は、この方法に使用できる例示的なハプテンＱＭＰである。沈着したハプテンを、続いて、マウス抗ハプテン量子ドットコンジュゲート（又はストレプトアビジン量子ドットコンジュゲート）とのインキュベーション（３７℃、３２分間）により可視化した。スライドをＲｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。図１５Ｃは、この方法により染色されたスライドの例示的な顕微鏡写真を示す。
検出４−蛍光団。ＡＰコンジュゲートとインキュベートした後、スライドをクエン酸ナトリウムバッファー（ｓａｌｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）（ＳＳＣ、ＶＭＳＩ＃９５０−１１０）で洗浄した。ＱＭＰ試薬を２５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ１０．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解した。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬの蛍光団標識ＱＭＰ（濃度＜５０μＭ）の添加及び３７℃で１６分間のインキュベーションによって達成した。化合物２８は、この方法に使用できる例示的な蛍光団ＱＭＰである。スライドをＲｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。スライドを、適切なフィルターセットを使用する蛍光顕微鏡法により観察した。図１５Ａは、この方法により染色されたスライドの例示的な顕微鏡写真を示す。
検出５−色素産生ＱＭＰ。ＡＰコンジュゲートとインキュベートした後、スライドをＳＳＣで洗浄した。ＱＭＰ試薬を２５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ１０．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解した。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬの発色団標識ＱＭＰ（濃度＞５０μＭ）の添加及び３７℃で１６分間のインキュベーションによって達成した。化合物３０は、この方法に使用できる例示的な色素原ＱＭＰである。幾つかの場合において、染色組織切片を、修飾メイヤーヘマトキシリンにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートした（３７℃、４分間）。スライドを洗剤水混合物ですすぎ、次に一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。スライドを明視野顕微鏡法により観察した。図１６（Ａ）は、この方法により染色されたスライドの例示的な顕微鏡写真を示す。
実施例３
ジフルオロＱＭＰビオチンにより増幅されたＨＲＰ ＤＡＢ（図１７）
（ａ）ｕｌｔｒａＶｉｅｗコントロール（図１７（Ａ））。組織を一般手順に記載されたように脱パラフィンし、続いてＰｒｏｔｅａｓｅ １（ＶＭＳＩ ＃７６０−２０１８）により抗原を回収した（３７℃、８分間）。マウス抗ＥＧＦＲ抗体インキュベーション（３７℃、３２分間）及び洗浄の後には、ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギポリクローナル抗マウス抗体を用いる二次抗体インキュベーション（３７℃、８分間）が続いた。抗原を、過酸化水素及びＤＡＢの添加（３７℃、８分間）によりＨＲＰから生じた褐色沈殿物によって可視化した。硫酸銅の添加（３７℃、４分間）により、ＤＡＢの色調を強めた。染色組織切片を、修飾メイヤーヘマトキシリンにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートして（３７℃、４分間）、ヘマトキシリン色相を青色に変えた。次にこれらを一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。
（ｂ）ＱＭＰ増幅ＤＡＢ（図１７（Ｂ））。組織を一般手順に記載されたように脱パラフィンし、続いてＰｒｏｔｅａｓｅ １により抗原を回収した（３７℃、８分間）。マウス抗ＥＧＦＲ抗体インキュベーション（３７℃、３２分間）及び洗浄の後には、ＡＰにコンジュゲートしたヤギポリクローナル抗マウス抗体を用いる二次抗体インキュベーション（３７℃、１２分間）が続いた。ＡＰコンジュゲートとインキュベートした後、スライドをＳｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ洗浄液で洗浄した。ジフルオロＱＭＰビオチンを１００ｍＭのＣＨＥＳ、ｐＨ１０．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解して、最終濃度を１００ｎＭにした。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬのビオチン標識ＱＭＰの添加及び３７℃で１６分間のインキュベーションによって達成した。沈着したハプテンを、続いてストレプトアビジンＨＲＰコンジュゲートにより結合させ（３７℃、８分間）、過酸化水素及びＤＡＢの添加（３７℃、８分間）によりＨＲＰから生じた褐色沈殿物によって可視化した。硫酸銅の添加（３７℃、４分間）により、ＤＡＢの色調を強めた。染色組織切片を、修飾メイヤーヘマトキシリンにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートした（３７℃、４分間）。次にこれらを一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。
ＩＨＣ染色についてＱＭ前駆体を評価すると、脱離基が何であるかがＱＭＰの活性に影響を及ぼしたことが見出された。２つのリン酸エステル保護オルトＱＭ前駆体を、ベンジルモノフルオロ（スキーム１、化合物７）及びベンジルジフルオロ（化合物５８）の官能基を含有する４−ニトロサリチルアルデヒド出発材料に基づいて調製した。
Figure 2021169453
両方の化合物は、フッ化物を脱離基として利用するが、ジフルオロ化合物５８から誘導されるＱＭの反応性は、ジェミナルフッ素原子により提供される電子安定性に起因して、モノフルオロ７より顕著に低いはずである。事実、以前の報告は、幾つかのモノフルオロ前駆体から誘導されたＱＭが、酵素活性のプローブとして過剰な反応性があり、活性部位標識、続く酵素阻害をもたらしうることを示唆している。したがって、ジフルオロＱＭ前駆体化合物５８を、最初に、ＦＦＰＥ扁桃組織への核マーカーＢＣＬ６をモデル系として使用して、ＦＦＰＥ組織へのＩＨＣ染色性能について評価した。ビオチン標識ジフルオロＱＭ前駆体は、後に続くジアミノベンジジン（ＤＡＢ）検出を使用したビオチン可視化により明らかなように、試料に成功裏に結合した。図１８は、ｐＨ＝８．５でのＴｒｉｓバッファー中のジフルオロＱＭ前駆体の様々な濃度での検出レベルを説明する顕微鏡写真提供する（Ａ−ＤＡＢコントロール、Ｂ−１μＭ、Ｃ−１０μＭ及びＤ−２０μＭ）。加えて、２０μＭを超えるジフルオロＱＭ前駆体化合物５８のスライド上での濃度が利用されたとき、ＤＡＢコントロール試料と比較して、シグナルの有意な増幅が観察された。しかし、シグナル拡散の増加も全ての場合において観察され、顕著な望ましくないオフターゲット染色をもたらした。
ジフルオロＱＭ前駆体によるシグナルの拡散は、２つの動力学的要因の組み合わせによって生じうることが示唆された。（１）リン酸エステル基の切断後の脱離基放出及び後に続くＱＭ形成の速度、並びに（２）組織の求核種による又は反応媒体におけるＱＭ停止の速度。ジフルオロＱＭ前駆体化合物５８の場合では、ジェミナルフッ素原子が、両方の要因を減速したかもしれない安定化を提供し、標的部位からの許容されない拡散をもたらした。反応媒体のｐＨを増加することによって、ＱＭ形成と停止の両方の速度は加速され、より良好な染色結果をもたらしうると仮定された。（１）では、よりアルカリ性のｐＨが、リン酸エステルの切断後に脱プロトン化フェノールの集団を増加し、したがってフッ化物放出及びＱＭ形成を助長する。（２）では、ｐＨの増加が水及びバッファー（Ｔｒｉｓ）の両方からの利用可能な失活種の集団を増加し、ＱＭが、求核種と反応する前に標的から拡散できる距離を有効に減少する。
シグナル拡散に対するｐＨの効果を試験するため、ジフルオロＱＭ前駆体化合物５８をＡＰの作用範囲内の様々なｐＨレベルで前述のように沈着させた（７−１２であり、ｐＨ＝８．５及び１１に最大活性の２つの肩があった）。ＦＦＰＥ扁桃組織への核マーカーＢＣＬ６をモデルとして再び選択した。陽性染色が全てのｐＨ範囲にわたって観察されたが、全体的なシグナルと拡散の均衡が見られた。図１９（Ａ）−１９（Ｈ）は、様々なｐＨのＴｒｉｓバッファー中の２０μＭのＱＭ前駆体の検出レベルの顕微鏡写真を提供する。（Ａ）ＤＡＢコントロール、（Ｂ）ｐＨ＝７．０、（Ｃ）ｐＨ＝８．０、（Ｄ）ｐＨ＝８．５、（Ｅ）ｐＨ＝９．０、（Ｆ）ｐＨ＝１０．０、（Ｇ）ｐＨ＝１１．０、（Ｈ）ｐＨ＝１２．０。拡散は、ｐＨが増加すると減少するように思われる。ｐＨ７では、オンターゲット染色はほとんど観察されず、ほぼ均一のシグナルが組織切片全体にわたって見られた。ｐＨが上昇すると、オフターゲット染色は徐々に減少したが、全体的なシグナル拡散及びオフターゲット染色は、ｐＨ１２でも有意のままであった。増幅のレベルは、ｐＨが８．５に上昇したときのみに増加し、残りの範囲では徐々に減少した。この効果は、酵素活性と、反応媒体中のＱＭ失活種の集団との組み合わせに起因しうる。最適なＡＰ反応条件をはるかに下回るｐＨレベル（７．０）では、ＡＰの活性は減少し、低いシグナルをもたらした。ｐＨは増加したが（８．０−８．５）、ＴｒｉｓのほぼｐＫａ（８．１）のままであると、ＡＰの活性は、反応媒体中の失活種の集団より速く増加し、シグナルの有意な増加をもたらした。ｐＨを更に上昇させると（９−１０）、失活種集団が増加し、同時にＡＰ活性が減少し、シグナルの減少をもたらした。ＡＰはＴｒｉｓ中においてｐＨ１１で最大活性を有したが、染色強度に僅かな減少が観察され、それは、増加したＡＰ活性により克服できなかった過剰に多い失活種の集団に起因する可能性が最も高い（８．５から１１へのｐＨの上昇は、［Ｔｒｉｓ塩基］を約５０％増加し、ＡＰ活性はわずか約２０％しか増加しない）。ｐＨ範囲の上限であっても、ジフルオロＱＭ前駆体化合物５８からの拡散は、ＩＨＣの臨床的使用には依然として大きすぎたことが決定された。これは、ジフルオロに基づいたＱＭＰがＩＨＣ試薬としての使用に適していると示唆したＢｏｂｒｏｗの開示と対照的である。
より安定性の低いモノフルオロＱＭ前駆体７を利用することによって、拡散は上記に記載された理由によって低減されうることが示唆された。ＩＨＣ染色を、最初に典型的なＡＰ ＩＨＣ条件下（Ｔｒｉｓバッファー中ｐＨ８．５）でＦＦＰＥ扁桃組織に核マーカーＢＣＬ６を使用して広い濃度範囲にわたって実施して、モノフルオロＱＭ前駆体７の最適濃度を決定した（データ示されず）。驚くべきことに、ジフルオロＱＭ前駆体５８（２０μＭ）と比較したとき、はるかに低い濃度のモノフルオロＱＭ前駆体７（２５０ｎＭ）が、所望の増幅レベルを得るために必要であった。加えて、全体的な拡散は、ジフルオロＱＭ前駆体５８と比較して大きく低減されたが、幾らかの拡散及びオフターゲット染色がｐＨ＝８．５で依然として明白であった。拡散及びオフターゲット染色を低減する努力において、ｐＨ範囲（７−１２）をＴｒｉｓバッファーにおいて試験した（図２０Ａ−２０（Ｈ）：（Ａ）ＤＡＢコントロール、（Ｂ）ｐＨ＝７．０、（Ｃ）ｐＨ＝８．０、（Ｄ）ｐＨ＝８．５、（Ｅ）ｐＨ＝９．０、（Ｆ）ｐＨ＝１０．０、（Ｇ）ｐＨ＝１１．０、（Ｈ）ｐＨ＝１２．０）。低いｐＨ（７．０−８．０）では、有意な拡散が見られ、ジフルオロＱＭ前駆体５８において観察されたものと類似した染色を作り出した。しかし、拡散及びオフターゲット染色は、ｐＨが上昇すると、シグナル全体に許容されない減少を有することなく徐々に低減された。ｐＨ１０では、拡散及びオフターゲット染色はほぼ排除され、ＤＡＢコントロールに匹敵する特異性を伴った高レベルのシグナルを有する染色を生じた。ｐＨを更に１１−１２に増加すると、より鮮明な青色ヘマトキシリン対比染色により明白なように、僅かに綺麗になった染色をもたらした。しかし、シグナル全体の僅かな低減が、これらの高いｐＨレベルにおいて観察された。
実施例４
第四級アミン脱離基を有するＱＭＰビオチンにより増幅されたＨＲＰ ＤＡＢ（図２１）
（ａ）ｕｌｔｒａＶｉｅｗコントロール（図２１（Ａ））。組織を、一般手順に記載されたように脱パラフィンし、回収した。ウサギ抗Ｋｉ−６７抗体インキュベーション（３７℃、１６分間）及び洗浄の後には、ＨＲＰにコンジュゲートしたヤギポリクローナル抗ウサギ抗体を用いる二次抗体インキュベーション（３７℃、８分間）が続いた。抗原を、過酸化水素及びＤＡＢの添加（３７℃、８分間）によりＨＲＰから生じた褐色沈殿物によって可視化した。硫酸銅の添加（３７℃、４分間）により、ＤＡＢの色調を強めた。染色組織切片を、修飾メイヤーヘマトキシリンにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートして（３７℃、４分間）、ヘマトキシリン色相を青色に変えた。次にこれらを一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。
（ｂ）キノンメチドアナログ前駆体増幅ＤＡＢ（図２１（Ｂ）−（Ｄ））。組織を、一般手順に記載されたように脱パラフィンし、回収した。ウサギ抗Ｋｉ−６７抗体インキュベーション（３７℃、１６分間）及び洗浄の後には、ＡＰにコンジュゲートしたヤギポリクローナル抗ウサギ抗体を用いる二次抗体インキュベーション（３７℃、１２分間）が続いた。ＡＰコンジュゲートとインキュベートした後、スライドをＳｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ洗浄液で洗浄した。ピリジンＱＭＰビオチン（１００μＭ）（図２１（Ｂ））又はＤＡＢＣＯ ＱＭＰビオチン（１００μＭ）（図２１（Ｃ））又はトリエチルアミンＱＭＰビオチン（１００μＭ）（図２１（Ｄ））を、１００ｍＭのＣＨＥＳ、ｐＨ１０．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解して、最終濃度を１００ｎＭにした。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬのビオチン標識ＱＭＰの添加及び３７℃で１６分間のインキュベーションによって達成した。沈着したハプテンを、続いてストレプトアビジンＨＲＰコンジュゲートにより結合させ（３７℃、８分間）、過酸化水素及びＤＡＢの添加（３７℃、８分間）によりＨＲＰから生じた褐色沈殿物によって可視化した。硫酸銅の添加（３７℃、４分間）により、ＤＡＢの色調を強めた。染色組織切片を、修飾メイヤーヘマトキシリンにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートした（３７℃、４分間）。次にこれらを一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。
これらの結果は、コントロールと比較したとき、この用途におけるＬＧとしての第四級アミンの準最適性能を実証している。ピリジン、ＤＡＢＣＯ及びトリエチルアミンＱＭＰビオチン誘導体は、コントロールスライド（図２１（Ａ））と比較すると、全て、はるかに低い染色強度及び大きな拡散シグナルを示した（図２１（Ｂ）−（Ｄ））。
実施例５
様々な脱離基を有するＱＭＰビオチンにより増幅されたＨＲＰ ＤＡＢ（図２２）
（ａ）ｕｌｔｒａＶｉｅｗコントロール（図２２（Ａ））。実施例４（ａ）を参照すること。
（ｂ）ＱＭＰ増幅ＤＡＢ（図２２（Ｂ）−２２（Ｄ））。組織を、一般手順に記載されたように脱パラフィンし、回収した。ウサギ抗Ｋｉ−６７抗体インキュベーション（３７℃、１６分間）及び洗浄の後には、ＡＰにコンジュゲートしたヤギポリクローナル抗ウサギ抗体を用いる二次抗体インキュベーション（３７℃、１２分間）が続いた。ＡＰコンジュゲートとインキュベートした後、スライドをＳｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ洗浄液で洗浄した。モノフルオロＱＭＰビオチン（４００μＭ）（図２２（Ｂ））又は酢酸エステルＱＭＰビオチン（１００μＭ）（図２２（Ｃ））又はメトキシＱＭＰビオチン（１００μＭ）（図２２（Ｄ））を、１００ｍＭのＣＨＥＳ、ｐＨ１０．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解して、最終濃度を１００ｎＭにした。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬのビオチン標識ＱＭＰの添加及び３７℃で１６分間のインキュベーションによって達成した。沈着したビオチンを、続いてストレプトアビジンＨＲＰコンジュゲートにより結合させ（３７℃、８分間）、過酸化水素及びＤＡＢの添加（３７℃、８分間）によりＨＲＰから生じた褐色沈殿物によって可視化した。硫酸銅の添加（３７℃、４分間）により、ＤＡＢの色調を強めた。染色組織切片を、修飾メイヤーヘマトキシリンにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートした（３７℃、４分間）。次にこれらを一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。
２つの準最適及び１つの最適なＬＧがこの実施例に示されている。酢酸エステルＬＧを有するＱＭＰビオチン（図２２（Ｃ））は、弱い非常に拡散されたシグナルを生成し、メトキシＬＧを有するＱＭＰビオチンは、十分に分解されたシグナルを示すが、低い強度を有した（図２２（Ｄ））。ＱＭＰビオチンのモノフルオロＬＧ誘導体（図２２（Ｂ））は、コントロールスライド（図２２（Ａ））以上の強度を有する十分に分解されたシグナルを実証している。評価した全てのＬＧ基のうち、モノフルオロが最良の性能を提示する。
実施例６
異なるリンカーを有するＱＭＰビオチンにより増幅されたＨＲＰ ＤＡＢ（図２３）
組織を、一般手順に記載されたように脱パラフィンし、回収した。マウス抗Ｂｃｌ−２抗体インキュベーション（３７℃、１６分間）及び洗浄の後には、ＡＰにコンジュゲートしたヤギポリクローナル抗マウス抗体を用いる二次抗体インキュベーション（３７℃、１２分間）が続いた。ＡＰコンジュゲートとインキュベートした後、スライドをＳｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ洗浄液で洗浄した。モノフルオロＱＭＰビオチン（アニリンアミドを有する（図２３（Ａ））、安息香酸アミド（図２３（Ｂ））又はチラミドアミドリンカー（図２３（Ｃ））（１００ｎＭ）を、１００ｍＭのＣＨＥＳ、Ｈ１０．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解して、最終濃度を１００ｎＭにした。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬのビオチン標識ＱＭＰの添加及び３７℃で１６分間のインキュベーションによって達成した。沈着したビオチンを、続いてストレプトアビジンＨＲＰコンジュゲートにより結合させ（３７℃、８分間）、過酸化水素及びＤＡＢの添加（３７℃、８分間）によりＨＲＰから生じた褐色沈殿物によって可視化した。硫酸銅の添加（３７℃、４分間）により、ＤＡＢの色調を強めた。染色組織切片を、修飾メイヤーヘマトキシリンにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートした（３７℃、４分間）。次にこれらを一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。
この実験は、ＱＭＰビオチンの機能性染色性能に対する、穏やかな電子求引基（ＥＷＧ）及び電子供与基（ＥＤＧ）の繊細な効果を実証している。安息香酸アミドリンカー（化合物２１、図２１（Ａ））は、穏やかなＥＷＧであり、より多くの拡散、より少ない分解シグナルをもたらす。中性（アニリンアミド（化合物７、図２（Ａ）））又は穏やかなＥＤＧ（チラミドアミド（化合物１４、図２（Ａ）））である他のリンカーは、十分に分解したシグナルを生成する。強いＥＤＧ（例えば、メトキシ）又はＥＷＧ（例えば、ニトロ）による他の実験（ここに含まれない）は、染色性能に対してはるかに多くの有害作用を示す。このことは、ＱＭＰ中間体の反応性に対する電子の影響及び染色性能に対する効果を説明している。
実施例７
モノフルオロ−ＱＭＰ−ＮＰにより増幅されたＡＰファストレッド（図１４）
ファストレッドコントロール（図１４（Ａ））。組織を、一般手順に記載されたように脱パラフィンし、回収した。ウサギ抗ＣＤ−１０抗体インキュベーション（３７℃、１６分間）及び洗浄の後には、ニトロピラゾール（ＮＰ）によりハプテン標識されたヤギ抗ウサギポリクローナル抗体によるインキュベーション（３７℃、８分間）が続いた。洗浄した後、ＡＰコンジュゲートマウス抗ＮＰモノクローナル抗体を加えた（３７℃、１２分間）。検出は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬのナフトールＡＳ−ＴＲリン酸エステル及び２００μＬのファストレッドＫＬの添加（３７℃１６分間）によって達成した。染色組織切片を、修飾メイヤーヘマトキシリンにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートした（３７℃、４分間）。スライドを洗剤水混合物ですすぎ、空気乾燥し、手作業によりカバーガラスで覆った。
ＱＭＰ増幅ファストレッド（図１４（Ｂ）−１４（Ｄ））。組織を、一般手順に記載されたように脱パラフィンし、回収した。ウサギ抗ＣＤ−１０、マウス抗Ｂｃｌ−２又はマウス抗Ｈｅｒ３抗体インキュベーション（３７℃、３２分間）及び洗浄の後には、ニトロピラゾール（ＮＰ）によりハプテン標識されたヤギポリクローナル抗ウサギ又は抗マウス抗体によるインキュベーション（３７℃、８分間）が続いた。洗浄した後、ＡＰコンジュゲートマウス抗ＮＰモノクローナル抗体を、三次抗体として使用した（３７℃、１２分間）。ＡＰコンジュゲートとインキュベートした後、スライドをＳｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ洗浄液で洗浄した。モノフルオロＱＭＰ−ＮＰ（１００ｎＭ）を、１００ｍＭのＣＨＥＳ、ｐＨ１０．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解して、最終濃度を１００ｎＭにした。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬのＮＰ標識ＱＭＰの添加及び３７℃で１６分間のインキュベーションによって達成した。沈着したハプテンを、続いてマウス抗ハプテンＡＰコンジュゲートにより結合させ（３７℃、１２分間）、検出は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬのナフトールＡＳ−ＴＲリン酸エステル及び２００μＬのファストレッドＫＬの添加（３７℃、１６分間）により達成した。染色組織切片を、修飾メイヤーヘマトキシリンにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートした（３７℃、４分間）。スライドを洗剤水混合物ですすぎ、空気乾燥し、手作業によりカバーガラスで覆った。
この実施例は、いったんレポーター（この場合ではＮＰハプテン）が、ＱＭＰ方法論により沈着されると、ＤＡＢに代替する検出系も使用できることを実証している。この場合、抗ＮＰ ＡＰコンジュゲートを使用して、ＡＰファストレッド化学により標的を可視化している。図１４（Ｂ）は、コントロールスライド（図１４（Ａ））よりもシグナルに有意な増幅を示している。図１４（Ｃ）及び１４（Ｄ）は、通常は弱く可視化されるビオマーカーＢｃｌ２及びＨｅｒ３の強い強度での染色を示している。
実施例８
モノフルオロ−ＱＭＰ蛍光団及びモノフルオロ−ＱＭＰ−ＮＰにより増幅された量子ドット（図１５）
（ａ）ＱＭＰ蛍光団（図１５（Ａ）、１５（Ｂ））。組織を、一般手順に記載されたように脱パラフィンし、回収した。マウス抗Ｂｃｌ−２抗体インキュベーション（３７℃、１６分間）及び洗浄の後には、ニトロピラゾール（ＮＰ）によりハプテン標識されたヤギポリクローナル抗マウス抗体を用いる二次抗体インキュベーション（３７℃、８分間）が続いた。洗浄した後、ＡＰコンジュゲートマウス抗ＮＰモノクローナル抗体を加えた（３７℃、１２分間）。ＡＰコンジュゲートとインキュベートした後、スライドをＳｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ洗浄液で洗浄した。モノフルオロＱＭＰ−ＴＡＭＲＡ（図１５（Ａ））又はモノフルオロＱＭＰ−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００（図１５（Ｂ））を、１００ｍＭのＣＨＥＳ、ｐＨ１０．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解した。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬの蛍光団標識ＱＭＰの添加及び３７℃で１６分間のインキュベーションによって達成した。スライドをＲｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。スライドを、適切なフィルターセットを使用する蛍光顕微鏡法により観察した。
（ｂ）ＱＭＰ増幅量子ドット（図１５（Ｃ））。組織を、一般手順に記載されたように脱パラフィンし、回収した。マウス抗Ｂｃｌ−２抗体インキュベーション（３７℃、１６分間）及び洗浄の後には、ニトロピラゾール（ＮＰ）によりハプテン標識されたヤギポリクローナル抗マウス抗体を用いる二次抗体インキュベーション（３７℃、８分間）が続いた。洗浄した後、ＡＰコンジュゲートマウス抗ＮＰモノクローナル抗体を加えた（３７℃、１２分間）。ＡＰコンジュゲートとインキュベートした後、スライドをＳｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ洗浄液で洗浄した。モノフルオロＱＭＰ−ＮＰを１００ｍＭのＣＨＥＳ、ｐＨ１０．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解した。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬのＮＰ標識ＱＭＰの添加及び３７℃で１６分間のインキュベーションによって達成した。沈着したハプテンを、続いて、マウス抗ＮＰ量子ドット５２５コンジュゲートとのインキュベーション（３７℃、３２分間）により可視化した。スライドをＲｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。スライドを、適切なフィルターセットを使用する蛍光顕微鏡法により観察した。
蛍光団をＱＭＰ分子においてレポーターとして使用すると（図１５（Ａ）及び１５（Ｂ））、結果を、増幅された蛍光シグナルを生成する任意の更なる検出化学により可視化することができる。ＱＭＰ−ＮＰは、ストレプトアビジン量子コンジュゲートを使用して、蛍光的に検出することができる、このことは、実施例３−６に概説されているＨＲＰ／ＤＡＢ法と比較して、沈着したハプテンを検出する代替的な方法を提供する。このことは、ＱＭＰ方法論が、明視野及び暗視野（蛍光）増幅シグナルの両方を生成するために使用できること、並びに現存の検出化学と連動するように容易に適合されることを説明している。
実施例９
ＱＭＰ−ＮＰにより増幅されたＨＲＰ ＤＡＢ（図１３、２４−２５）
（ａ）ｕｌｔｒａＶｉｅｗコントロール（図１３（Ｂ）、図２４（Ａ）−２４（Ｂ）；２４（Ｂ）は黒色枠で区別された２４（Ａ）の領域をより高い倍率で示す）。実施例４（ａ）を参照すること。
（ｂ）ＱＭＰ増幅ＤＡＢ（図１３（Ａ）、図２５（Ａ）−２５（Ｂ）；２４（Ｂ）は黒色枠で区別された２５（Ａ）の領域をより高い倍率で示す）。組織を、一般手順に記載されたように脱パラフィンし、回収した。ウサギ抗Ｋｉ−６７抗体インキュベーション（３７℃、１６分間）及び洗浄の後には、ＡＰにコンジュゲートしたヤギポリクローナル抗ウサギ抗体を用いる二次抗体インキュベーション（３７℃、１２分間）が続いた。ＡＰコンジュゲートとインキュベートした後、スライドをＳｐｅｃｉａｌ Ｓｔａｉｎｓ洗浄液で洗浄した。モノフルオロＱＭＰ−ＮＰ（１００ｎＭ）を、１００ｍＭのＣＨＥＳ、ｐＨ１０．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解して、最終濃度を１００ｎＭにした。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬのＮＰ標識ＱＭＰの添加及び３７℃で１６分間のインキュベーションによって達成した。沈着したハプテンを、続いてマウス抗ＮＰ ＨＲＰコンジュゲートにより結合させ（３７℃、８分間）、過酸化水素及びＤＡＢの添加（３７℃、８分間）によりＨＲＰから生じた褐色沈殿物によって可視化した。硫酸銅の添加（３７℃、４分間）により、ＤＡＢの色調を強めた。染色組織切片を、修飾メイヤーヘマトキシリンにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートした（３７℃、４分間）。次にこれらを一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。
この実施例は、ＱＭＰ−ＮＰを使用するシグナルの増幅、続くＨＲＰ／ＤＡＢ検出を実証している。シグナル強度は大きいが、追加的なバックグランドは生成されず、シグナル局在化はコントロールスライドと同等である。
実施例１０
発色団検出可能標識部分を有するＱＭＰ（図１６）
発色団検出可能標識部分を有するＱＭＰ（図１６（Ａ）−１６（Ｄ））。組織を、一般手順に記載されたように脱パラフィンし、回収した。ウサギ抗Ｋｉ−６７抗体インキュベーション（３７℃、１６分間）及び洗浄の後には、ニトロピラゾール（ＮＰ）によりハプテン標識されたヤギポリクローナル抗ウサギによる二次インキュベーション（３７℃、８分間）が続いた。洗浄した後、ＡＰコンジュゲートマウス抗ＮＰモノクローナル抗体を加えた（３７℃、１２分間）。ＡＰコンジュゲートとインキュベートした後、スライドをＳＳＣで洗浄した。モノフルオロＱＭＰ−ＰＥＧ８−ダブシル（２５０μＭ）（図１６（Ａ））又はモノフルオロＱＭＰ−ＴＡＭＲＡ（２５０μＭ）（図１６（Ｂ））又はモノフルオロＱＭＰ−Ｃｙ５（２５０μＭ）（図１６（Ｃ））又はモノフルオロＱＭＰローダミン１１０（２５０μＭ）（図１６（Ｄ））を、２５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ１０．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解した。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬの適切なＱＭＰの添加及び３７℃で３２分間のインキュベーションによって達成した。染色組織切片を、修飾メイヤーヘマトキシリンにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートした（３７℃、４分間）。次にスライドを一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。
実施例２−９は、ＱＭＰレポーターを現存の検出化学（ＨＲＰ／ＤＡＢ及びＡＰ／ファストレッド）により、並びに蛍光により直接的に、可視化できることを実証した。この実施例は、大きな消衰係数を有する発色団がレポーター分子である場合、増幅ＱＭＰシグナルを明視野顕微鏡法により直接見ることができることを実証している。異なる吸収波長を有する発色団を選択することによって、広範囲の別々の色を作り出すことができる（図１６（Ａ）−（Ｄ））。複数の色素産生検出系を生成するために異なるレポーターを有する単一のコア分子（ＱＭＰ）を使用する能力は、多重適用において基本的に重要なものである。以前は、新たな色素産生検出系を生成するために、新たな化学を発明する必要があり、それぞれの酵素には異なる手法が必要であった。異なるレポーター分子及び／又は異なる酵素認識基を有する単一のＱＭＰコア分子を使用する能力は、多重明視野（及び蛍光）アッセイにおける新たなツールを提供する。
実施例１１
捕捉実験
染色及び停止の機構を探求するため、染色実験で利用したものと類似した条件下で、溶液相においてモノフルオロＱＭ前駆体７により形成されたＱＭ中間体を捕捉する試みを行った（図２６）。ＱＭ前駆体７をｐＨ１０のＴｒｉｓバッファーに溶解し、続いて触媒量のＡＰを加えた。反応の進行をＨＰＬＣ−ＭＳでモニターした（図２７）。１０分以内に、Ｔｒｉｓ付加物７−トリスへの完全な変換が観察された（図２７（Ｃ））。ＡＰの不在下では、反応は発生せず、所望の反応条件下での高レベルの安定性を示唆した（図２７（Ｂ））。これらの結果は、ＱＭ媒介染色の提案された機構を強く支持し、Ｔｒｉｓ塩基がＩＨＣ染色条件下での失活種の主な供給源であることを解明している。
追加の捕捉実験を実施して、リン酸エステル、ガラクトシド及び酵素認識基として酢酸エステルを含むＱＭ前駆体から、溶液中にキノンメチドを生成し、捕捉する能力を実証した。それぞれのＱＭ前駆体を、対応する酵素により溶液中で処理し、反応進行をＨＰＬＣ−ＭＳによりモニターした（データ示されず）。それぞれの基質を、同族酵素に適したｐＨ（アルカリホスファターゼでは１０、β−ガラクトシダーゼでは８．０及びリパーゼでは８．０）で２５０ｍＭのＴｒｉｓ溶液中で１ｍＭに希釈し、続いて溶液中の酵素の最終濃度が１ｍＭになるように同族酵素を加えた。反応を室温で３０分間インキュベートし、この時点でＨＰＬＣ−ＭＳを実施した。それぞれの場合において、Ｔｒｉｓ付加物が検出され、ＱＭが成功裏に形成されたことを実証した。
実施例１２
安定性
本開示の１つの態様は、活性化酵素との相互作用において反応が素早く進行すべきという点で、十分に不安定な化合物が好まれるが、この不安定性は、本明細書に記載されているように、意図される使用の範囲内で有用な組成物を作製する目的と均衡しなければならない。特に、自動ＩＨＣ及びＩＳＨにおける検出試薬としてのこれらの試薬の使用は、有意な期間にわたって試薬を貯蔵及び使用できる臨床医に輸送することができるように、試薬が容器内で十分に安定していることが必要である。この種類の組成物の関連する貯蔵寿命は、１２か月間、１８か月間、２４か月間又はそれ以上の安定性である。貯蔵条件は特定的でありうるが、臨床機器への試薬の使用は、多くの場合、試薬が十分な室温安定性を有することが必要となる。１つの実施態様において、本開示の組成物は、自動ＩＨＣ及びＩＳＨに適した安定性を有する。自動ＩＳＨ及びＩＨＣへの適合性は、絶対安定性を必要とせず、むしろ、試薬の使用が試薬の分解により悪影響を受けないように、確立された時間の後に実質的な量の化合物が残っていることに留意するべきである。
ここで図２８を参照すると、適切な安定性について試験された化合物の４つの構図が示されている。図２８（Ａ）は、ＴＡＭＲＡにコンジュゲートしたパラ二置換ＱＭＰであり、（Ｂ）は、ダブシルにコンジュゲートしたパラ二置換ＱＭＰであり、（Ｃ）は、ダブシルにコンジュゲートしたオルト二置換ＱＭＰであり、（Ｄ）は、Ｃｙ５にコンジュゲートしたオルト二置換ＱＭＰである。ここで表１を参照すると、図２８（Ａ）及び（Ｂ）に示されている化合物の常温（２０−２５℃）での水中安定性が示されている。ＱＭＰ色素コンジュゲートの分解は、色素が何であるかとは無関係であると思われる。特定の理論又は機構に限定されることなく、分解の主な様式は、水によるフッ化物の置き換えが、組織を染色する能力を有さない化合物を生成することであると理解された。スキーム１４は、代表的なＱＭＰのＡが加水分解によって、非染色化合物Ｂになることを示す。
スキーム14
Figure 2021169453
化合物は、素早く分解しすぎて、バッファーされていない水溶液に貯蔵できないことが見出された。特に、図２８（Ａ）のＱＭＰの約４２％及び図２８（Ｂ）のＱＭＰの約４４％のみが、１２日後に残っていることが観察された。試薬を自動染色液に使用し、新たに合成された試薬と比較して、シグナルが減少したことが確認された。
Figure 2021169453

加水分解の問題を回避するため、１つの解決策は、化合物を、無水の非求核有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ又は炭酸プロピレン）に貯蔵することであった。表１は、図２８（Ａ）及び（Ｂ）の化合物を３つの高温（３０、４５及び６０℃）で貯蔵した加速安定性試験のデータを示す。ここでも、異なる色素コンジュゲートの動作は、化合物のＱＭＰ部分が同一に保たれると、非常に類似している。高温では、異なる分解経路が観察された（スキーム１５）。特に、微量の水を有するＤＭＳＯ中の高温でのＱＭＰの分解は、フルオロ基及びリン酸エステルの両方を加水分解することが見出された。ＤＭＳＯ中に貯蔵したとき、ＱＭＰ材料を、使用時に近づいた染色バッファーで希釈した。幾つかの自動染色液は、試薬を調製する前希釈工程が可能であり、したがって、この手法は、化合物の意図される使用の範囲内で稼働できる様式で必要とされる長期間の安定性を提供することが理解される。
スキーム15
Figure 2021169453
これらの化合物の水性安定性を更に調査するため、図２８（Ａ）の化合物を３つの異なるバッファーに様々なｐＨで貯蔵した（表２を参照すること）。バッファー溶液のｐＨが低いと、活性染色化合物の貯蔵寿命を延ばすことが観察された。
Figure 2021169453
分解経路及び特徴を理解するため、溶媒系を、ＱＭＰ化合物の貯蔵寿命を延長する目的で設計した。本明細書のバッファーＡと呼ばれる、ＤＭＳＯと１０ｍＭのグリシンとの５０／５０混合物のバッファー（ｐＨ２．０）を含む溶媒系は、適切な安定性を示すことが発見された。表３は、化合物が異なる温度（２、２５、３７及び４５℃）で、ＤＭＳＯと１０ｍＭのグリシンとの５０／５０混合物のバッファー（ｐＨ２．０）に貯蔵された加速安定性試験のデータを示す。高温では、図３Ｃに記載されている分解経路が依然として観察された。しかし、通常の貯蔵条件（２−２５℃）では、ＱＭの分解速度は、１００％水性系と比較して低減されている。
Figure 2021169453
表３は、同じＤＭＳＯと１０ｍＭのグリシンとの５０／５０混合物のバッファー（ｐＨ２．０）中における代替的なＱＭＰ化合物（図２８（Ｃ）及び（Ｄ）に示されている）の安定性データも示す。初期データは、オルトＱＭＰがこれらの貯蔵条件下でパラＱＭＰよりも改善された安定性を有することを示している。
実施例１３−塩及び補助因子
マグネシウムは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）に必要な補助因子であり、したがって、ＡＰによるＱＭＰの代謝回転速度は、マグネシウムの濃度によって左右されることが予測される。しかし、染色の質に対するマグネシウム塩の濃度の驚くべき効果が発見された。ここでも、シグナル強度は、マグネシウムの補助因子としての役割によって、マグネシウムの濃度が増加すると改善されることが理解された。しかし、シグナルの質が改善されることは予測されなかった。特に、改善された質は、シグナル局在化、離散及び拡散低減であった。事実、これらの質は、より大きなシグナル強度が標的位置からにじみ出す可能性がある又はにじみ出るのを見ることができるようになる可能性があるので、マグネシウムの増加により実際に減少しうることが予測された。ここで図２９（Ａ）−２９（Ｂ）を参照すると、０．１２５Ｍの塩化マグネシウム（図２９（Ｂ））及び１．０５Ｍの塩化マグネシウム（図２９（Ａ））の単一変動要因を有する、ＱＭＰ−ＴＡＭＲＡを有するＣＤ８の存在により染色された扁桃組織の顕微鏡写真が示されている。顕微鏡写真及びその複写は、望むほど劇的に有意な差を示さないが、１．０５Ｍの塩化マグネシウム試料は、０．１２５Ｍのマグネシウム試料と比較して、はるかに良好な染色の質を示した。実例的な実施態様において、本開示の方法及び組成物は、約０．１Ｍ、０．２５Ｍ、０．５Ｍ、１．０Ｍ又は１．２５Ｍを超える、塩化マグネシウムなどの塩を含む。他の実施態様において、本開示の方法及び組成物は、約０．１Ｍから約２Ｍ、約０．２５Ｍから１．５Ｍ、約０．５Ｍから約１．２５Ｍ又は約１．０Ｍの塩化マグネシウムを含む。類似した効果も、ＮａＣｌ濃度に関して観察されたが、効果はそれほど大きくなかった。
塩化マグネシウム濃度研究と組み合わせた、この組み合わせデータは、少なくとも２つの構成成分が存在しうる現在のキット配置をもたらし、第１は、ｐＨ調整剤（０．５ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ１０．０）であり、第２は、有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）及び１０ｍＭのグリシン（ｐＨ２．０）と１．０Ｍまでの塩化マグネシウムとの組み合わせで処方されたＱＭＰである。
実施例１４
β−ガラクトシダーゼトリガー及び発色団レポーター部分を有するＱＭＰ（図３０）
組織を、一般手順に記載されたように脱パラフィンし、回収した。ウサギ抗Ｋｉ−６７抗体インキュベーション（３７℃、１６分間）及び洗浄の後には、ビオチンによりハプテン標識されたヤギポリクローナル抗ウサギによる二次インキュベーション（３７℃、８分間）が続いた。洗浄した後、β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）コンジュゲートストレプトアビジン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃Ｓ−９３１）を加えた（３７℃、３２分間）。β−Ｇａｌコンジュゲートとインキュベートした後、スライドをＳＳＣで洗浄した。モノフルオロβ−Ｇａｌ−ＱＭＰ−Ｃｙ５（１２５μＭ）（図３０（Ａ）−３０（Ｂ））又はβ−Ｇａｌ−ＱＭＰ−Ｃｙ３（１００μＭ）（図３０（Ｃ））を、２５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解した。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬの適切なβ−Ｇａｌ−ＱＭＰの添加及び３７℃で３２分間のインキュベーションによって達成した。染色組織切片を、修飾メイヤーヘマトキシリンにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ（３７℃、４分間）（図３０（Ｂ）−３０（Ｃ））又はＲｅｄ Ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ ＩＩ（ＶＭＳＩ ＃７８０−２２１８）（３７℃、４分間（図３０（Ａ））と共にインキュベートした。次にスライドを洗剤水混合物ですすぎ、一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。
β−ガラクトシダーゼは、以前は検出試薬として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＢＣＩＧ）を用いるＩＨＣ検出における酵素であった。しかし、１つの色のみが利用可能であり、一定しておらず、不十分な感受性しかなく、スライドの処理後に徐々に消失する（又は洗い流される）傾向がある。図３０（Ａ）−３０（Ｃ）の例は、アルコール脱水に感受性がなく、良好な感受性を有し、広範囲の色を生成するように容易に修飾できるβ−ガラクトシダーゼに基づいた色素産生ＩＨＣ検出系を示す。
実施例１５
ＡＰ及びβ−Ｇａｌ誘発性ＱＭＰの同時検出による二重染色（図３１）
組織を、一般手順に記載されたように脱パラフィンし、回収した。ウサギ抗Ｋｉ−６７抗体及びマウス抗Ｂｃｌ−６抗体とのインキュベーション（３７℃、１６分間）、並びに洗浄の後には、ビオチンにコンジュゲートしたヤギポリクローナル抗ウサギ抗体及びＡＰにコンジュゲートしたヤギポリクローナル抗マウス抗体を用いる二次抗体インキュベーション（３７℃、１２分間）が続いた。その後にスライドをβ−Ｇａｌコンジュゲートストレプトアビジンと共にインキュベートし（３７℃、３２分間）、続いてＳＳＣで洗浄した。ホスホ−ＱＭＰ−Ｃｙ５及びβ−Ｇａｌ−ＱＭＰ−Ｐｅｇ８−ダブシルを、２５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解して、最終濃度をそれぞれ２５０μＭにした。ＱＭＰ代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬのＱＭ混合物の添加及び３７℃で６０分間のインキュベーションによって達成した。染色組織切片を、修飾メイヤーヘマトキシリンにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートした（３７℃、４分間）。次にこれらを洗剤水混合物ですすぎ、一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。
多重アッセイに複数の酵素を使用する幾つかの利点は、アッセイ時間の全体的な低減及び酵素不活性下／溶出工程の低減である。この実施例は、両方の酵素検出が同時に実施される二重色素産生ＩＨＣ検出系を示す。この結果は、それぞれのＱＭＰの同族酵素への特異性及び検出が両方とも妨げられることなく生じるのに十分な結合部位が利用可能であることも実証している。
実施例１６
ＨＲＰ、ＡＰ及びβ−Ｇａｌ基質の同時検出による三重染色（図３２）
組織を、一般手順に記載されたように脱パラフィンし、回収した。ウサギ抗ＰＲインキュベーション（３７℃、１６分間）及び洗浄の後には、ビオチンにコンジュゲートしたヤギポリクローナル抗ウサギ抗体（３７℃、８分間）、その後にウサギ血清（３７℃、８分間）を用いる二次抗体インキュベーションが続いた。洗浄した後、ベンゾフラン（ＢＦ）標識ウサギ抗ＥＲ及びジニトロフェノール（ＤＮＰ）標識ウサギ抗ＨＥＲ２を、同時にインキュベートした（３７℃、１６分間）。次に３つの酵素コンジュゲート：β−Ｇａｌコンジュゲートストレプトアビジン、マウス抗ＢＦにコンジュゲートしたＨＲＰ及びマウス抗ＮＰにコンジュゲートしたＡＰを適用し（３７℃、３２分間）、続いてＳＳＣで洗浄した。β−Ｇａｌ−ＱＭＰ−Ｃｙ５及びホスホ−ＱＭＰ−ＰＥＧ８−ダブシルを、２５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解して、最終濃度をそれぞれ３００μＭにした。色素原代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬのＱＭＰ混合物、１００μＬのＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｐｕｒｐｌｅ（ＶＭＳＩ ＃７６０−２２９）及び１００μＬのＨ２Ｏ２（０．０１％）の添加、並びに３７℃で３２分間のインキュベーションによって達成した。染色組織切片を、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＩＩにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートした（３７℃、４分間）。次にこれらを洗剤水混合物ですすぎ、一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。
この実施例は、全ての酵素検出が同時に実施される三重色素産生ＩＨＣ検出系を示す。この結果は、それぞれのＱＭＰの同族酵素への特異性を裏付けている。ＱＭＰ検出が妨げられることなく生じるのみならず、ＨＲＰ／チラミド検出が依然として進行しうるという事実も、十分な結合部位が利用可能であることを示している。
実施例１７
ＨＲＰ（２回）、ＡＰ及びβ−Ｇａｌ基質の連続検出による四重染色（図３３−３４）
組織を、一般手順に記載されたように脱パラフィンし、回収した。ウサギ抗ＰＲインキュベーション（３７℃、１６分間）及び洗浄の後には、ビオチンにコンジュゲートしたヤギポリクローナル抗ウサギ抗体（３７℃、８分間）、その後にウサギ血清（３７℃、８分間）を用いる二次抗体インキュベーションが続いた。洗浄した後、ベンゾフラザン（ＢＦ）標識ウサギ抗ＥＲ、ＮＰ標識ウサギ抗Ｋｉ６７及びジニトロフェノール（ＤＮＰ）標識ウサギ抗ＨＥＲ２を、同時にインキュベートした（３７℃、１６分間）。マウス抗ＤＮＰにコンジュゲートしたＨＲＰを加え（３７℃、８分間）、過酸化水素及びＤＡＢの添加（３７℃、８分間）によりＨＲＰから生じた褐色沈殿物を介して、それを硫酸銅により更に色調を強めることによって可視化した。次にストレプトアビジンにコンジュゲートしたβ−Ｇａｌ、マウス抗ＢＦにコンジュゲートしたＨＲＰ及びマウス抗ＮＰにコンジュゲートしたＡＰを適用した（３７℃、３２分間）。ＨＲＰを、１００μＬのＤＩＳＣＯＶＥＲＹ Ｐｕｒｐｌｅ（ＶＭＳＩ ＃７６０−２２９）及び１００μＬのＨ２Ｏ２（０．０１％）の添加（３７℃、３２分間）により検出し、続いてＳＳＣで洗浄した。β−Ｇａｌ−ＱＭＰ−Ｃｙ５及びホスホ−ＱＭＰ−ＰＥＧ８−ダブシルを、２５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．０５％のＢｒｉｊ−３５に溶解して、最終濃度をそれぞれ３００μＭにした。色素原代謝回転は、１００μＬのＡＰ Ｅｎｈａｎｃｅｒ、続く１００μＬのＱＭ混合物の添加及び３７℃で３２分間のインキュベーションによって達成した。染色組織切片を、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＩＩにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートした（３７℃、４分間）。次にこれらを洗剤水混合物ですすぎ、一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。
実施例１８
色素産生ＩＳＨ（図３５（Ａ）−３５（Ｂ））
組織を、一般手順に記載されたように脱パラフィンし、続いてＣｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ２（ＶＭＳＩ ＃９５０−１２３）（９０℃、２８分間）で前処理し、Ｐｒｏｔｅａｓｅ ３（ＶＭＳＩ ＃７８０−４１４９）（３７℃、２０分間）で処理した。ＤＩＧ標識した１７番染色体プローブ（ＶＭＳＩ ＃７６０−１２２４）を組織に適用し、変性させ（８０℃、２０分間）、４４℃で６時間かけてハイブリダイズした。ＳＳＣによる７６℃での３回の厳密な洗浄の後、試料を、マウス抗ＤＩＧ抗体（３７℃、２０分間）、続いてＡＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（３７℃、２４分間）と共にインキュベートした。ホスホ−ＱＭＰ−ＰＥＧ８−ダブシル及びホスホ−ＱＭＰ−Ｃｙ５を、１：１のＤＭＳＯ：１０ｍＭグリシンのバッファー（ｐＨ２．０）に溶解して、最終濃度を、１２０μＭのＱＭＰ−ダブシル及び１ｍＭの塩化マグネシウムを有する３０μＭのＱＭＰ−Ｃｙ５にした。ＳＳＣで洗浄した後、２００μＬのｐＨ調整溶液（５００ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ１０．０）及び１００ｕＬのＱＭＰ混合物を加えた（３７℃、３２分間）。染色組織切片を、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ＩＩにより対比染色し（３７℃、４分間）、次にＢｌｕｒｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔと共にインキュベートした（３７℃、４分間）。次にこれらを洗剤水混合物ですすぎ、一連の段階的なエタノールで脱水し、キシレンで透徹し、手作業によりカバーガラスで覆った。
ＩＳＨ増幅では、オルトＱＭＰ化合物は、パラＱＭＰ化合物よりも良好な性能を示した。パラＱＭＰ化合物は、ＩＳＨシグナルを生成したが、強度は低く、染色された細胞の数（細胞適用範囲）は、一定ではなく、シグナルの質は最適ではなかった。オルトＱＭＰ化合物は、細胞適用範囲の増加及び分散が低減したはるかに良好なシグナル分解を有する強い強度のシグナルを生成した。
実施例１９
ＨＲＰ（２回）及びＡＰ（２回）の連続検出による四重染色（図３６）
図３６は、交換された及び／又は異なる色の組み合わせによる、同じバイオマーカー（ＦＦＰＥ乳房組織におけるＨｅｒ２（膜）、Ｋｉ−６７（核）、ＥＲ（核）及びＰＲ（核））を示す４つの異なる染色プロトコール（Ａ−Ｄ）の例を提供する（４０×倍率）。３つの核マーカー及び１つの膜マーカーであったので、幾つかプロトコールにおいてＤＡＢをＨｅｒ２膜染色に使用して、ＤＡＢと他の色との重複を回避することが可能であった。核検出のミックス（黄色、青色及び紫色）は、強度に応じて異なる色の組み合わせを生成した。
アッセイは、２つのＨＲＰに基づいた検出及び２つのＡＰ ＱＭＰに基づいた検出を使用したバイオマーカーの連続検出を含んだ。これは、開示されている検出系の柔軟性及び交換可能性を実証した。
実施例２０
ＨＲＰ（２回）及びＡＰ（２回）の連続検出による四重染色（図３７）
図３７は、交換された及び／又は異なる色の組み合わせによる、同じバイオマーカー（ＦＦＰＥ扁桃組織におけるＣＤ３（膜）、ＣＤ８（膜）、ＣＤ２０（膜）（又はＣＤ６８（膜））及びＦｏｘＰ３（核））を示す異なる染色プロトコール（Ａ−Ｂ又はＣ−Ｄ）の例を提供する（５×倍率）。２つのＨＲＰに基づいた検出及び２つのＡＰ ＱＭＰに基づいた検出を使用した連続検出を利用し、開示されている検出系の柔軟性及び交換可能性を更に実証した。
実施例２１
実施例１０に概説されたプロトコールに従って、乳房組織を、濃度５００μＭの化合物３６（図３８（Ａ））又は濃度４００μＭの化合物２８（図３８（Ｂ））の何れかを使用して、マウス抗Ｅカドヘリンモノクローナル一次抗体（Ｖｅｎｔａｎａ ＃７９０−４４９７）により染色した。両方とも同等の結果を与えることが予測されたが、驚くべきことに、化合物２８（オルトＱＭＰ）は、化合物３６（パラＱＭＰ）よりも良好な性能を示した。染色の質（シグナル局在化及び離散）は、両方の化合物で同じであったが、染色強度は、化合物３６より２０％低い濃度で使用しても、化合物２８の方が高かった。
オルトＱＭＰ化合物は、以前に記載された何れの化合物と比較しても、ＩＨＣ染色性能、ＩＳＨ染色性能における有意な改善及び改善された水性安定性を提供する。
開示されている発明の原理が適用されうる多くの可能な実施態様を考慮すると、実例実施態様は、本発明の単なる好ましい例であり、本発明の範囲を限定するものと受け止めるべきではないことが認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲により確定される。したがって、本発明は、全て特許請求の範囲及びその精神の範囲内にあることが主張される。

Claims (81)

  1. 下記の式：

    Figure 2021169453

    を有する化合物又はその塩若しくは溶媒和物［式中、
    Ｚは、Ｏ、Ｓ又はＮＲａであり、Ｒ１は、酵素認識基であり、又はＺＲ１は、酵素認識基であり、
    Ｒ８は、−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ３Ｒ４）、−Ｒ３Ｒ４又は−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ６）であり、
    Ｒ９、Ｒ１１及びＲ１２は、それぞれ独立して、水素、ハロ、シアノ、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２、−Ｒ３Ｒ４であるか、又は２つの隣接基は、共に脂肪族環若しくはアリール環を形成し、
    Ｒ１０は、水素、ハロ、シアノ、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２、−Ｒ３Ｒ４、−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ６）であるか、又はＲ９若しくはＲ１１の一方と、脂肪族環若しくはアリール環を形成し、
    ＬＧは、脱離基であり、又はＺＲ１及びＬＧは、共にホスホジエステルを形成し、
    Ｒ３は、リンカー又は結合であり、
    Ｒ４は、検出可能標識であり、
    各Ｒ５は、独立して、水素、ハロ、シアノ、低級アルキル、低級ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、
    各Ｒ６は、独立して、水素、ハロ、シアノ、低級アルキル、低級ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、
    Ｒａは、水素又は脂肪族であり、
    各Ｒｃは、独立して、水素、アリール、脂肪族若しくはヘテロ脂肪族であり、又は２つのＲｃ部分は、共にヘテロ脂肪族環を形成し、
    Ｒ８及びＲ１０の少なくとも一方は、ＬＧを含み、Ｒ８及びＲ１０の少なくとも一方は、Ｒ３Ｒ４を含み、
    ＬＧがハロである場合、Ｒ５及びＲ６はハロではない］。
  2. 下記の式：

    Figure 2021169453

    を有する、請求項１に記載の化合物。
  3. 下記：
    Figure 2021169453
    から選択される式を有する、請求項１に記載の化合物。
  4. Ｒ１又はＺＲ１が、ホスフェート、アミド、ニトロ、尿素、サルフェート、メチル、エステル、ベータラクタム、糖であるか、又はＬＧ及びＺＲ１が共にホスホジエステルを形成する、請求項１から３の何れか一項に記載の化合物。
  5. ＺがＯである、請求項４に記載の化合物。
  6. ＺＲ１が、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、ＮＯ２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、−ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ３、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＨ、ＯＣＨ３又はその塩である、請求項４に記載の化合物。
  7. 糖が、α−グルコース、β−グルコース、α−ガラクトシド、β−ガラクトシド、α−グルクロノース又はβ−グルクロノースである、請求項４に記載の化合物。
  8. βラクタムが、下記：

    Figure 2021169453
    ;
    であり、
    Ｒが、アルキルであり、
    Ｚが、Ｏ又はＳである
    請求項４に記載の化合物。
  9. ＬＧが、ハロゲン化物、硫酸エステル、カルボキシレート、無機エステル、チオレート、アミン、アリールオキシ、アルコキシ又はヘテロアリールである、請求項１から３の何れか一項に記載の化合物。
  10. ＬＧが、フッ化物、塩化物、アジド、酢酸エステル、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、フェノキシド、−ＯＳ（Ｏ）２ＣＨ３、−ＯＳ（Ｏ）２Ｃ６Ｈ４ＣＨ３、−ＯＳ（Ｏ）２Ｃ６Ｈ５、−ＯＳ（Ｏ）２Ｃ６Ｈ４ＣＸ３、−ＯＣ６Ｈ５、−Ｎ２ ＋、−ＮＨ３ ＋、−ＮＣ６Ｈ５ ＋、−Ｏ−アルキル、−ＯＣ（Ｏ）アルキル、−ＯＣ（Ｏ）Ｈ、−Ｎ（Ｒｂ）３ ＋又は１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンであり、
    各Ｘが、独立して、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードであり、
    各Ｒｂが、独立して、水素若しくは低級アルキルであり、又は２つのＲｂ部分が、共にヘテロ脂肪族環を形成する
    請求項１から３の何れか一項に記載の化合物。
  11. ＬＧがＦである、請求項１０に記載の化合物。
  12. Ｒ３が、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２）ｎＯ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２）ｎＳ−、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＮＨ、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２）ｎＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）ｎＮＨ−又は−Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２）ｎＮＨ−であり、ここで各ｎが、独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２である
    請求項１から３の何れか一項に記載の化合物。
  13. Ｒ３が、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）５ＮＨ−、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）５ＮＨ−、−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）６ＮＨ−、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）６ＮＨ−、−ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）８−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）４ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）８ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ２）６ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ３）（ＣＨ２）４ＮＨ−、
    Figure 2021169453
    である、請求項１から３の何れか一項に記載の化合物。
  14. Ｒ４が、色素原、蛍光団、発光団、ハプテン又はこれらの組み合わせである、請求項１から３の何れか一項に記載の化合物。
  15. Ｒ４が、
    Figure 2021169453
    である、請求項１４に記載の化合物。
  16. 下記：
    Figure 2021169453
    Figure 2021169453
    であり、
    Ｒ４が、色素原、蛍光団、発光団又はハプテンである、
    請求項１に記載の化合物。
  17. 下記：
    Figure 2021169453
    であり、
    Ｒ４が、色素原、蛍光団、発光団又はハプテンである、
    請求項１に記載の化合物。
  18. Ｒ４が、
    Figure 2021169453
    である、請求項１６又は１７に記載の化合物。
  19. 生物学的試料中の第１の標的を検出する方法であって、
    生物学的試料を、第１の標的に特異的な第１の検出プローブと接触させることと、
    生物学的試料を、第１の酵素を含む第１の標識コンジュゲートと接触させることと、
    生物学的試料を、第１の酵素認識基と第１の検出可能標識とを含む第１のキノンメチドアナログ前駆体と接触させることであって、ここで第１の酵素が第１の酵素認識基を切断し、それによって第１のキノンメチドアナログ前駆体を、第１の反応性キノンメチドアナログに変換し、これが、生物学的試料に、第１の標的の近位において又は第１の標的に直接的に共有結合し、生物学的試料を接触させることが、
    （ｉ）生物学的試料を、所望のレベルの増幅を与えるのに有効な前駆体濃度で第１のキノンメチドアナログ前駆体と接触させること、
    （ｉｉ）生物学的試料を、拡散及び／若しくはオフターゲット染色を所望の量に低減するのに有効なｐＨで第１のキノンメチドアナログ前駆体と接触させること、
    （ｉｉｉ）生物学的試料を、塩の存在下、拡散及び／若しくはオフターゲット染色を所望の量に低減するのに有効な塩濃度で第１のキノンメチドアナログ前駆体と接触させること、
    （ｉｖ）生物学的試料を、請求項１から１８の何れか一項に記載の化合物と接触させること、又は
    （ｖ）これらの任意の組み合わせ
    を含むことと、
    第１の検出可能標識を検出することによって、第１の標的を検出することと
    を含む方法。
  20. 生物学的試料を接触させることが、生物学的試料を請求項１から１８の何れか一項に記載の化合物と接触させることを含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 塩濃度が０．１Ｍから２Ｍである、請求項１９に記載の方法。
  22. 塩濃度が０．５Ｍから１．２５Ｍである、請求項２１に記載の方法。
  23. 塩が塩化マグネシウムである、請求項１９に記載の方法。
  24. 生物学的試料を、拡散及び／又はオフターゲット染色を所望の量に低減するのに有効なｐＨで第１のキノンメチドアナログ前駆体と接触させることを含む、請求項１９に記載の方法。
  25. ｐＨが７超から１４である、請求項２４に記載の方法。
  26. ｐＨが８から１２である、請求項２５に記載の方法。
  27. 生物学的試料を、所望のレベルの増幅を与えるのに有効な前駆体濃度で第１のキノンメチドアナログ前駆体と接触させることを含む、請求項１９に記載の方法。
  28. 前駆体濃度が０超から１ｍＭである、請求項２７に記載の方法。
  29. 前駆体濃度が５０ｎＭから１００μＭである、請求項２８に記載の方法。
  30. 前駆体濃度が１００ｎＭから１μＭである、請求項２９に記載の方法。
  31. 生物学的試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋組織を含む、請求項１９から３０の何れか一項に記載の方法。
  32. 自動化されたプロセスである、請求項１９から３０の何れか一項に記載の方法。
  33. 第１の検出プローブが、オリゴヌクレオチド、抗体又は抗体断片を含む、請求項１９から３０の何れか一項に記載の方法。
  34. 第１の検出プローブが、ハプテン標識オリゴヌクレオチドを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 第１の検出プローブが、オキサゾールハプテン、ピラゾールハプテン、チアゾールハプテン、ニトロアリールハプテン、ベンゾフランハプテン、トリテルペンハプテン、尿素ハプテン、チオ尿素ハプテン、ロテノイドハプテン、クマリンハプテン、シクロリグナンハプテン、ジニトロフェニルハプテン、ビオチンハプテン、ジゴキシゲニンハプテン、フルオレセインハプテン又はローダミンハプテンを含む、請求項１９から３０の何れか一項に記載の方法。
  36. 第１の標識コンジュゲートが、第１の酵素に結合した抗体を含む、請求項１９から３０の何れか一項に記載の方法。
  37. 抗体が、抗種又は抗ハプテン抗体である、請求項３６に記載の方法。
  38. 第１の標識コンジュゲートが、第１の検出プローブと会合する、請求項１９から３０の何れか一項に記載の方法。
  39. 第１の標識コンジュゲートが、第１の検出プローブと直接的に会合する、請求項３８に記載の方法。
  40. 第１の標識コンジュゲートが、第１の検出プローブと間接的に会合する、請求項３８に記載の方法。
  41. 第１の検出プローブが、第１の抗種抗体を含み、第１の標識プローブが、第２の抗種抗体を含む、請求項３６に記載の方法。
  42. 第１の検出プローブが、ハプテンを含み、第１の標識プローブが、抗ハプテン抗体を含む、請求項３６に記載の方法。
  43. 第１の酵素が、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、プロテアーゼ、ニトロレダクターゼ、ウレアーゼ、スルファターゼ、チトクロムＰ４５０、アルファグルコシダーゼ、ベータグルコシダーゼ、ベータラクタマーゼ、アルファグルクロニダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、アルファガラクトシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、アルファラクターゼ又はベータラクターゼである、請求項１９から３０の何れか一項に記載の方法。
  44. 第１の酵素認識基が、ホスフェート、ホスホジエステル、アミド、ニトロ、尿素、サルフェート、メチル、エステル、アルファグルコース、ベータグルコース、ベータラクタム、アルファガラクトシド、ベータガラクトシド、アルファラクトース、ベータラクトース、アルファグルクロノシド又はベータグルクロノシドである、請求項１９から３０の何れか一項に記載の方法。
  45. 第１の反応性キノンメチドアナログが、生物学的試料、第１の標識コンジュゲート、第１の検出プローブ又はこれらの組み合わせの内の求核部位と反応する、請求項１９から３０の何れか一項に記載の方法。
  46. 求核部位がアミノ酸又は核酸残基のアミノ、スルフヒドリル又はヒドロキシル基を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 第１のキノンメチドアナログ前駆体が、下記式：

    Figure 2021169453

    又はその塩若しくは溶媒和物を有し、
    Ｚが、Ｏ、Ｓ又はＮＲａであり、Ｒ１が、酵素認識基であり、又はＺＲ１が、酵素認識基であり、
    Ｒ８が、−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ３Ｒ４）、−Ｒ３Ｒ４又は−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ６）であり、
    Ｒ９、Ｒ１１及びＲ１２が、それぞれ独立して、水素、ハロ、シアノ、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２、−Ｒ３Ｒ４であるか、又は２つの隣接基が、共に脂肪族環若しくはアリール環を形成し、
    Ｒ１０が、水素、ハロ、シアノ、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２、−Ｒ３Ｒ４、−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ６）であるか、又はＲ９若しくはＲ１１の一方と、脂肪族環若しくはアリール環を形成し、
    ＬＧが、脱離基であり、又はＺＲ１及びＬＧが、共にホスホジエステルを形成し、
    Ｒ３が、結合又はリンカーであり、
    Ｒ４が、検出可能標識であり、
    各Ｒａが、独立して水素又は脂肪族であり、
    各Ｒｃが、独立して、水素、アリール、脂肪族若しくはヘテロ脂肪族であり、又は２つのＲｃ部分が、共にヘテロ脂肪族環を形成し、
    各Ｒ５が、独立して、水素、ハロ、シアノ、低級アルキル、低級ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、
    各Ｒ６が、独立して、水素、ハロ、シアノ、低級アルキル、低級ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、
    Ｒ８及びＲ１０の少なくとも一方が、ＬＧを含み、
    Ｒ８−Ｒ１２の少なくとも１つが、Ｒ３Ｒ４を含み、
    ＬＧがハロである場合、Ｒ５及びＲ６はハロではない、
    請求項１９に記載の方法。
  48. 第１のキノンメチド前駆体が、下記式：

    Figure 2021169453

    を有する、請求項４７に記載の方法。
  49. 第１のキノンメチドアナログ前駆体が、下記：
    Figure 2021169453
    Figure 2021169453
    から選択される構造を有し、
    Ｒ４が、色素原、蛍光団、発光団又はハプテンである、
    請求項４８に記載の方法。
  50. 第１のキノンメチドアナログ前駆体が、下記：
    Figure 2021169453
    から選択される式を有する、請求項４７に記載の方法。
  51. 第１のキノンメチドアナログ前駆体が、下記：
    Figure 2021169453
    から選択される構造を有し、
    Ｒ４が、色素原、蛍光団、発光団又はハプテンである
    請求項５０に記載の方法。
  52. 第１のキノンメチドアナログ前駆体が、下記：
    Figure 2021169453
    から選択される構造又はその塩若しくは溶媒和物を有し、
    Ｚが、Ｏ、Ｓ又はＮＲａであり、Ｒ１が、酵素認識基であり、又はＺＲ１が、酵素認識基であり、
    Ｒ９及びＲ１１−Ｒ２０が、それぞれ独立して、水素、ハロ、シアノ、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２、−Ｒ３Ｒ４であるか、又は２つの隣接基が、共に脂肪族環若しくはアリール環を形成し、
    Ｒ１０が、水素、ハロ、シアノ、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２、−Ｒ３Ｒ４、−Ｃ（ＬＧ）（Ｒ５）（Ｒ６）であるか、又はＲ９若しくはＲ１１の一方と、脂肪族環若しくはアリール環を形成し、
    ＬＧが、脱離基であり、又はＺＲ１及びＬＧが、共にホスホジエステルを形成し、
    Ｒ３が、結合又はリンカーであり、
    Ｒ４が、検出可能標識であり、
    各Ｒａが、独立して水素又は脂肪族であり、
    各Ｒｃが、独立して、水素、アリール、脂肪族若しくはヘテロ脂肪族であり、又は２つのＲｃ部分が、共にヘテロ脂肪族環を形成し、
    各Ｒ５が、独立して、水素、ハロ、シアノ、低級アルキル、低級ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、
    各Ｒ６が、独立して、水素、ハロ、シアノ、低級アルキル、低級ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、
    Ｒ８及びＲ１０の少なくとも一方が、ＬＧを含み、
    Ｒ９−Ｒ２０の少なくとも１つが、Ｒ３Ｒ４を含み、
    ＬＧがハロである場合、Ｒ５及びＲ６はハロではない、
    請求項１９に記載の方法。
  53. 第１のキノンメチドアナログ前駆体が、下記：
    Figure 2021169453
    から選択される式を有し、
    Ｚが、Ｏ、Ｓ又はＮＲａであり、Ｒ１が、酵素認識基であり、又はＺＲ１が、酵素認識基であり、
    Ｒ５及びＲ６が、それぞれ独立して、水素、ハロ、シアノ、低級アルキル、低級ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２であり、
    Ｒ２５−Ｒ２９が、それぞれ独立して、水素、ハロ、シアノ、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２、−Ｒ３Ｒ４であるか、又は２つの隣接基が、共に脂肪族環若しくはアリール環を形成し、各Ｒｃが、独立して、水素、アリール、脂肪族若しくはヘテロ脂肪族であり、又は２つのＲｃ部分が、共にヘテロ脂肪族を形成し、
    ＬＧが、脱離基であり、又はＺＲ１及びＬＧが、共にホスホジエステルを形成し、
    Ｒ３が、結合又はリンカーであり、
    Ｒ４が、検出可能標識であり、
    各Ｒａが、独立して水素又は脂肪族であり、
    各Ｒｃが、独立して、水素、アリール、脂肪族若しくはヘテロ脂肪族であり、又は２つのＲｃ部分が、共にヘテロ脂肪族環を形成し、
    Ｒ５、Ｒ６及びＲ２５−Ｒ２９の少なくとも１つが、Ｒ３Ｒ４を含み、
    ＬＧがハロである場合、Ｒ５及びＲ６がハロではない、
    請求項１９に記載の方法。
  54. 第１のキノンメチドアナログ前駆体が、下記式：

    Figure 2021169453

    又はその塩若しくは溶媒和物を有し、
    Ｚが、Ｏ、Ｓ又はＮＲａであり、Ｒ１が、酵素認識基であり、又はＺＲ１が、酵素認識基であり、
    ＬＧが、脱離基であり、
    Ｒ３が、結合又はリンカーであり、
    Ｒ４が、検出可能標識であり、
    Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、及びＲ２４が、それぞれ独立して、水素、ハロ、シアノ、脂肪族、アルコキシ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒｃ）２、アリール、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）アルキル、−Ｃ（Ｓ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏアルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｃ）２、−Ｒ３Ｒ４であるか、又は２つの隣接基が、共に脂肪族環若しくはアリール環を形成し、
    各Ｒａが、独立して水素又は脂肪族であり、
    各Ｒｃが、独立して、水素、アリール、脂肪族若しくはヘテロ脂肪族であり、又は２つのＲｃ部分が、共にヘテロ脂肪族環を形成する、
    請求項１９に記載の方法。
  55. 第１のキノンメチドアナログ前駆体が、下記：
    Figure 2021169453
    Figure 2021169453
    から選択され、
    Ｒ４が、ハプテン、蛍光団、発光団又は色素原から選択される
    請求項５４に記載の方法。
  56. 標的が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質又は核酸配列である、請求項１９に記載の方法。
  57. 多重化された方法である、請求項１９に記載の方法。
  58. 生物学的試料を、第２の標的に特異的な第２の結合部分と接触させることと、
    第２の標的を、第２の結合部分を介して第２の酵素により標識することと、
    生物学的試料を第２の検出前駆体化合物と接触させることであって、第２の検出前駆体化合物が第２の酵素と相互作用して、第２の検出化合物を第２の標的に直接的に又は第２の標的の近位において沈着させることと、
    第２の検出化合物を検出することと
    を更に含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 第１の酵素及び第２の酵素が異なる酵素である、請求項５８に記載の方法。
  60. 第１の酵素が、第１のキノンメチドアナログ前駆体と選択的に反応し、第２の酵素が、第２の検出前駆体化合物と選択的に反応する、請求項５８に記載の方法。
  61. 酵素不活性化工程を含まない、請求項５８に記載の方法。
  62. 第１の酵素が、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、プロテアーゼ、ニトロレダクターゼ、ウレアーゼ、スルファターゼ、チトクロムＰ４５０、アルファグルコシダーゼ、ベータグルコシダーゼ、ベータラクタマーゼ、アルファグルクロニダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、アルファガラクトシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、アルファラクターゼ又はベータラクターゼである、請求項５８に記載の方法。
  63. 第１の酵素がアルカリホスファターゼであり、第１の酵素認識基がホスフェートである、請求項５８に記載の方法。
  64. 第２の酵素がペルオキシダーゼである、請求項５８に記載の方法。
  65. 第２の検出前駆体化合物が、第２の酵素認識基と第２の検出可能標識とを含む第２のキノンメチドアナログ前駆体であり、第２のキノンメチドアナログ前駆体が第２の酵素と相互作用して、第２のキノンメチドアナログを形成し、それが、生物学的試料に、第２の標的の近位において又は第２の標的に直接的に共有結合し、第２の検出化合物を検出することが、第２の検出可能標識を検出することを含む、請求項５８に記載の方法。
  66. 第２の酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、第２の酵素認識基がβ−ガラクトシドである、請求項５８に記載の方法。
  67. 組織を、第１の標的に特異的な第１の結合部分と接触させること、及び組織を、第２の標的に特異的な第２の結合部分と接触させることが、実質的に同時に起こる、請求項５８から６６の何れか一項に記載の方法。
  68. 第１の標的を、第１の結合部分を介して第１の酵素により標識すること、及び第２の標的を、第２の結合部分を介して第２の酵素により標識することが、実質的に同時に起こる、請求項５８から６６の何れか一項に記載の方法。
  69. 組織を、第１の標的に特異的な第１の結合部分と接触させること、及び組織を、第２の標的に特異的な第２の結合部分と接触させることが、連続して起こる、請求項５８から６６の何れか一項に記載の方法。
  70. 第１の標的を、第１の結合部分を介して第１の酵素により標識すること、及び第２の標的を、第２の結合部分を介して第２の酵素により標識することが、連続して起こる、請求項５８から６６の何れか一項に記載の方法。
  71. 生物学的試料を、第３の異なる標的に特異的な第３の結合部分と接触させることと、
    第３の標的を、第３の結合部分を介して第３の酵素により標識することと、
    生物学的試料を第３の検出前駆体化合物と接触させることであって、第３の検出前駆体化合物が第３の酵素と相互作用して、第３の検出化合物を第３の標的に直接的に又は第３の標的の近位において沈着させることと、
    第３の検出化合物を検出することと
    を更に含む、請求項５８に記載の方法。
  72. 第１の酵素がアルカリホスファターゼであり、第１の酵素認識基がホスフェートであり、第２の酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、第２の検出前駆体化合物が、β−ガラクトシドを含む第２のキノンメチドアナログ前駆体であり、第３の酵素がペルオキシダーゼである、請求項７１に記載の方法。
  73. 酵素抗体コンジュゲートと、
    キノンメチドアナログ前駆体と、
    溶媒混合物と、
    ｐＨ調整溶液と
    を含む、キット。
  74. 溶媒混合物が、有機溶媒及び水性バッファーを含む、請求項７３に記載のキット。
  75. 有機溶媒がＤＭＳＯである、請求項７４に記載のキット。
  76. 水性バッファーが、ｐＨ０からｐＨ５のｐＨ範囲を有する、請求項７４に記載のキット。
  77. ｐＨ範囲が、ｐＨ１からｐＨ３である、請求項７６に記載のキット。
  78. ｐＨ調整溶液が、ｐＨ８からｐＨ１２のｐＨ範囲を有する、請求項７３に記載のキット。
  79. 塩化マグネシウムを０．２５Ｍから１．５Ｍの濃度で更に含む、請求項７３に記載のキット。
  80. キノンメチドアナログ前駆体が、請求項１から１８の何れか一項に記載の化合物である、請求項７３から７９の何れか一項に記載のキット。
  81. キノンメチドアナログ前駆体が、請求項１から１８の何れか一項に記載の化合物であり、
    溶媒混合物が、ＤＭＳＯ及びｐＨ２のグリシンバッファーを含み、
    ｐＨ調整溶液が、ｐＨ８からｐＨ１０のｐＨ範囲を有するＴｒｉｓバッファーであり、
    塩化マグネシウムを０．５Ｍから１．２５Ｍの濃度で更に含む、
    請求項７３に記載のキット。
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