JP2020524674A

JP2020524674A - イソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、およびショウマの使用

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Publication number: JP2020524674A
Application number: JP2019569899A
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Inventors: 輝曾; 憲波王; 鏐▲ルアン▼ 朱; 蕊李
Original assignee: 首都医科大学附属北京地壇医院
Priority date: 2017-06-13
Filing date: 2018-06-13
Publication date: 2020-08-20
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Abstract

本発明は、自己免疫疾患の治療薬または機能性健康食品の調製における、イソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、およびショウマの使用を提供する。本発明は、イソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、およびショウマを含む、自己免疫疾患のためのまたは炎症性サイトカインの抑制のための医薬組成物を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、医薬分野に関し、具体的には、自己免疫疾患の治療薬または機能性健康食品の調製における、イソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、およびショウマの使用に関する。

自然免疫細胞とＴリンパ球の活性化は自己免疫疾患の重要な発病のメカニズムであり、典型的な疾患は自己免疫性肝炎と関節リウマチである。これらの疾患は一般的に複数種の病原性因子によって身体を刺激し、身体の免疫機能障害を引き起こして発病する。身体の免疫を調節するという観点からの新薬や健康食品の開発はこれらの疾患を治療するための突破口である。そのため、我が国の伝統的な医薬資源基づいて免疫調節薬または機能性健康食品を開発することは幅広い見通しがある。

イソフェルラ酸はショウマなどの生薬抽出物の中の主な単一活性成分であり、化学名は３−ヒドロキシ−４−メトキシケイ皮酸であり、ケイ皮酸またはカフェ酸−４−メチルエーテルとも呼ばれ、化学式はＣ_１０Ｈ_１０Ｏ_４であり、抗酸化作用、血糖降下作用を有する。

本発明の一つの目的は、イソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、およびショウマの使用を提供することにある。

本発明は、自己免疫疾患の治療薬または機能性健康食品の調製における、イソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、およびショウマの使用を提供する。

上記使用において、前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである。

本発明は、さらに、炎症性サイトカインを抑制するための薬物または機能性健康食品の調製における、イソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、およびショウマの使用を提供し、前記炎症性サイトカインはＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ−ＣＳＦの中の１種または複数種を含む。

上記使用において、前記炎症性サイトカインは、複数の細菌やウイルスの感染によって引き起こされる疾患、例えば、肝炎、肺炎、敗血症、インフルエンザ、麻疹、単純ヘルペスなどに関し、また、複数の自己免疫疾患、例えば、関節リウマチ、全身性血管炎、強皮症、多発性脳脊髄炎などに関し、イソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、およびショウマはいずれも上記疾患を予防、緩和、治療するための薬物または機能性健康食品として使用することができる。

そのうち、前記イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物はショウマ煎出液であってもよく、それはショウマの根、茎および髭根を煎じて調製される。

そのうち、前記イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物はショウマ総フェノール酸の抽出物であってもよく、そのうち主にイソフェルラ酸、フェルラ酸、カフェ酸などを含む。

上記使用において、前記薬物はイソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、またはショウマを活性成分とするほか、医薬上許容される担体を含んでもよい。医薬上許容される担体は賦形剤、結合剤、潤滑剤、充填剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、着色剤、矯味剤、防腐剤などを含むがこれらに限らない。前記薬物は医薬分野における既存のありふれた剤形に調製されることができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤などの経口剤形および注射剤、凍結乾燥剤などの非経口剤形を含むがこれらに限らない。

上記使用において、前記機能性健康食品はイソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、またはショウマを活性成分とするほか、ありふれた添加物を加えることができ、栄養素、ビタミン、ミネラル、香味料、着色剤、粘着付与剤、ｐＨ調整剤、安定剤などを含むがこれらに限らない。前記機能性健康食品は単独で使用することができ、既存の薬物または健康食品と同時に使用することもできる。

本発明の二つ目の目的は、自己免疫疾患の治療薬の調製における、イソフェルラ酸またはイソフェルラ酸を含有する生薬抽出物的医薬組成物、またはショウマを含有する漢方薬組成物の使用を提供することにある。

そのうち、前記イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物はショウマ煎出液であってもよく、それはショウマの根、茎、および髭根を煎じて調製される。

そのうち、前記イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物はショウマ総フェノール酸の抽出物であってもよく、そのうち主にイソフェルラ酸、フェルラ酸、カフェ酸などを含有する。

上記使用において、前記医薬組成物は活性成分に加え、医薬上許容される担体を含んでいてもよく、賦形剤、結合剤、潤滑剤、充填剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、着色剤、矯味剤、防腐剤などを含むがこれらに限らない。前記医薬組成物は単独で使用することができ、既存の自己免疫疾患の治療薬と同時に使用することもでき、それは医薬分野における既存のありふれた剤形に調製されることができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤などの経口剤形および注射剤、凍結乾燥剤などの非経口剤形を含むがこれらに限らない。

上記使用において、前記漢方薬組成物は、ショウマと、他の生薬成分、例えば、トウキ、サイコ、チンピなどとから調製される配合薬であってもよい。前記漢方薬組成物は単独で使用することができ、既存の自己免疫疾患の治療薬と同時に使用することもでき、それは漢方薬分野における既存のありふれた剤形に調製されることができ、煎薬、薬酒、薬茶、薬露、丸剤、散剤、軟膏剤、エリキシル剤、錠剤、トローチ剤などを含むがこれらに限らない。

本発明の三つ目の目的は、医薬組成物を提供することにある。本発明により提供される医薬組成物は自己免疫疾患を治療するための医薬組成物であってもよく、それはイソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物またはショウマを活性成分とする。

上記医薬組成物において、前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである。

本発明により提供される医薬組成物は炎症性サイトカインを抑制するための医薬組成物であってもよく、それはイソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物またはショウマを活性成分とする。前記炎症性サイトカインはＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ−ＣＳＦの中の１種または複数種を含む。

上記医薬組成物において、活性成分に加え、医薬上許容される担体を含んでいてもよく、賦形剤、結合剤、潤滑剤、充填剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、着色剤、矯味剤、防腐剤などを含むがこれらに限らない。前記医薬組成物は単独で使用することができ、既存の自己免疫疾患の治療薬と同時に使用することもでき、それは医薬分野における既存のありふれた剤形に調製されることができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤などの経口剤形および注射剤、凍結乾燥剤などの非経口剤形を含むがこれらに限らない。

本発明では、コンカナバリンＡ（ＣｏｎｃａｎａｖａｌｉｎＡ、ＣｏｎＡ）のモデル動物実験から、イソフェルラ酸およびイソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、医薬組成物などがコンカナバリンＡによる急性免疫性肝損傷に対して保護作用を有し、自己免疫性肝炎モデル動物の生存率、肝機能レベル、肝臓の病理学的損傷および炎症性サイトカインの分泌能を著しく改善ことがわかり、それは自己免疫性肝炎を治療または緩和するための薬物または健康食品の調製に用いられることができると考えられる。

本発明では、さらに、コラーゲン誘発関節炎（Ｃｏｌｌａｇｅｎｉｎｄｕｃｅｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＣＩＡ）モデル動物の実験から、イソフェルラ酸およびイソフェルラ酸を含有する漢方薬（例えばショウマ）がＣＩＡによる多発性関節損傷に対して保護作用を有し、ＣＩＡモデル動物の発病率、平均関節炎指数を著しく低下させ、骨の構造的損傷を改善し、抗ＩＩ型コラーゲン抗体および複数の炎症性サイトカインの分泌を抑えることが分かり、それは確実な抗関節炎作用を有することが示され、関節リウマチ症状を治療、緩和するための薬物または健康食品の調製に用いられることができると考えられる。

本発明により、さらにイソフェルラ酸およびイソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、医薬組成物などがＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ−ＣＳＦなどをはじめとする複数の炎症性サイトカインを同時に抑える作用を有することが認められ、そのため複数の炎症性サイトカインなどによる炎症などの疾患の治療または改善に用いられることができると考えられる。

要するに、本発明はイソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、医薬組成物、漢方薬組成物などの新しい使用を提供し、それが広範な免疫抑制作用を有するため、自己免疫疾患の治療薬または機能性健康食品における応用領域を開拓し、化学合成や抽出によってイソフェルラ酸を得て使用することができるだけでなく、ショウマ抽出物またはショウマを含有する漢方薬の配合薬を直接使用することもでき、簡単に調製でき、原料の由来が広範であり、コストが低く、高い市場応用価値を有する。

実験例１の各群マウスの生存率に関する図表である。実験例２の各群モデルマウスの肝組織の顕微鏡写真（ＨＥ染色）である。実験例３における各群のマウスの足趾関節の写真である。実験例６の各群マウスの右後肢膝関節、足首関節および足趾関節のＭｉｒｃｏ−ＣＴ画像である。

以下、調製例と実験例により、本発明を更に詳しく説明し、それによって本発明の特徴や利点をより明らかになる。しかし、調製例と実験例は本発明の理解を助けるためのものであり、本発明の範囲は本文に記載される調製例と実験例に限定されるものではない。

以下の調製例と実験例に記載される実験方法は特に断りがない限り、いずれも従来の方法である。使用される材料、試薬などは、別段の指示がない限り、市販で入手することができる。

（調製例１：薬剤の調製）
ショウマは同仁堂前門本社から購入される。ショウマ１２ｇを取って蒸留水に１〜２時間浸漬し、強火で１０分煎じてから、弱火で１時間煎じ、７５ｍＬまで濃縮し、換算後のショウマ煎出液の濃度は約０．１６ｇ／ｍＬであり、５ｍＬの遠心チューブに入れ、−２０℃で保存する。

ショウマ、トウキ、サイコ、チンピはいずれも同仁堂前門本社から購入される。ショウマ１２ｇとトウキ６ｇ、サイコ１２ｇ、チンピ１２ｇを配合する。煎じ方は前記のとおりであり、７５ｍＬまで濃縮し、濃度が約０．５６ｇ／ｍＬであり、５ｍＬの遠心チューブに分注し、−２０℃で保存してショウマ配合群の用に供する。

（調製例２：ショウマ総フェノール酸の抽出）
参考文献（黄貴平、李存玉、李紅陽、支興蕾、李賀敏、劉蘭平、彭国平、『ショウマにおけるフェノール酸類成分の抽出プロセスの最適化（升麻中○酸類成分提取工芸優選）』、遼寧中医薬大学学報、２０１４年、４：５０−５２）の方法に従ってショウマ総フェノール酸の抽出を行う（訳注：丸括弧で示した前述の参考文献の正式名称は本来は簡体字表記、「○」は、フェノールを意味する一文字の中国語で、「酉」の左に「分」である。）。ショウマ煎出液７５ｍＬを取り、９５％エタノールを加えて１０００ｍＬとし、１晩放置し、上澄液を分離する。上澄液を減圧蒸留してエタノールと余剰水を十分に除去し、７５ｍＬまで濃縮し、ショウマのアルコール抽出物が得られる。室温条件下で、有機溶媒酢酸エチルを用いて５回抽出し、攪拌・抽出し、遠心して上澄液が得られ、さらに５％炭酸ナトリウムで抽出し、希塩酸で溶液をｐＨ３に調整し、同量の酢酸エチルで５回抽出し、減圧回収してから、ショウマ総フェノール酸の抽出物が得られ、正確に７５ｍＬとする。イソフェルラ酸、フェルラ酸およびカフェ酸の標準品（いずれも天津一方科技有限公司から購入される）を対照とし、ＨＰＬＣ法によって各成分の含有量を確認し、その結果を表１に示す。

表１：３種の主要フェノール酸類成分の含有量

（実験例１：ＣｏｎＡ肝炎モデルマウスの生存率に対する作用）
試験材料：ＣｏｎＡはＳｉｇｍａ社から購入される。イソフェルラ酸は天津一方科技有限公司から購入される。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
割り当て：Ｃ５７ＢＬ／６マウス５０匹、雄、１８−２０ｇ、１日間順応飼育してから、以下の５群にランダムに割り当てる（各群１０匹）：ＣｏｎＡモデル群、ショウマ配合群、ショウマ群、ショウマ総フェノール酸群およびイソフェルラ酸群。
モデル動物の作製および投与処置：ＣｏｎＡ粉末１５０ｍｇを秤量し、滅菌ＰＢＳ４０ｍＬを加えて溶解し、室温下で時々軽く振盪しながら１〜２時間放置し、低温超音波によって溶解を促進し（毎回５分以下）、過度の発泡を避けるように注意する。完全に溶解してから、正確に５０ｍＬとし、濃度が３ｍｇ／ｍＬになるように調製し、０．４５μｍのフィルタで加圧濾過する。２５ｍｇ／ｋｇに従ってマウスに単回静脈内注射し、各マウス１００μＬ注射する。ＣｏｎＡモデル群は蒸留水２５０μＬを強制経口投与する。ショウマ配合群は調製例１のショウマ配合煎出液２５０μＬを強制経口投与し、生薬の投与量は７ｇ／ｋｇである。ショウマ群は調製例１のショウマ煎出液２５０μＬを強制経口投与し、生薬の投与量は２ｇ／ｋｇである。ショウマ総フェノール酸群は調製例２のショウマ総フェノール酸抽出液２５０μＬを強制経口投与し、生薬の投与量は３００ｍｇ／ｋｇである。イソフェルラ酸群はイソフェルラ酸水溶液２５０μＬを強制経口投与し、投与量は５ｍｇ／ｋｇである。動物の９６時間以内の死亡率を観察する。

結果を図１示す。ＣｏｎＡモデル群では４−６時間後から死亡するマウスが観察され始め、２４時間以内に死亡するマウスが比較的集中し、その後死亡率が低下し、４８−９６時間以内はほぼ安定する。ＣｏｎＡモデル群の生存率は２０％であり、薬物処置後のマウス生存率が上昇し、ショウマ配合群の生存率は９０％（ＣｏｎＡモデル群に比べると、＊＊、ｐ＜０．０１）、ショウマ群の生存率は８０％（ＣｏｎＡモデル群に比べると、＊＊、ｐ＜０．０１）、ショウマ総フェノール酸群の生存率は６０％（ＣｏｎＡモデル群に比べると、＊、ｐ＜０．０５）、イソフェルラ酸群の生存率は６０％（ＣｏｎＡモデル群に比べると、＊、ｐ＜０．０５）である。生存率についてはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ統計解析により、各薬物処置群はモデル群に比べ有意な差が認められる。これらの結果により、ショウマ配合薬、ショウマ抽出物、ショウマ総フェノール酸、およびイソフェルラ酸はいずれもＣｏｎＡ肝炎モデルマウスの生存率を向上させることができると考えられる。

（実験例２：ショウマおよびその抽出物による肝臓炎症への治療作用）
試験材料および動物は実験例１と同様である。
割り当て：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、雄、１８−２０ｇ、１日間順応飼育してから、以下の６群にランダムに割り当てる：正常対照群、ＣｏｎＡモデル群、ショウマ配合群、ショウマ群、総フェノール酸群、およびイソフェルラ酸群。
モデル動物の作製および投与処置：正常対照群を除き、ＣｏｎＡ１５ｍｇ／ｋｇの投与量に応じてマウスに単回静脈内注射する。各投与群の投与量は実験例１と同様である。
（１）各投与群の薬物がＣｏｎＡモデルマウス血清中のＡＬＴ、ＡＳＴに対する作用を調べる。各群８匹ずつＣｏｎＡ注射１０ｈ後麻酔下で屠殺し、末梢血を採取して血清を分離し、ＡＬＴ、ＡＳＴを測定する。
（２）各投与群の薬物がＣｏｎＡモデルマウス肝臓の病理的損傷に対する作用を調べる。各群３匹ずつをＣｏｎＡ注射１０時間後麻酔下で屠殺し、肝臓左葉を摘出し、約５ｍｍ^３のサイズで切り、１０％ホルマリン溶液に浸し、脱水、透徹・パラフィン浸透、包埋、薄切、伸展、染色を行ってから観察する；
（３）各投与群の薬物によるＣｏｎＡモデルマウスの血清サイトカインの分泌への作用を調べる。各群６匹ずつをＣｏｎＡ注射３時間後末梢血を採取し且つ血清を分離し、サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、およびＭＣＰ−１の分泌能を測定する。ＣｏｎＡ注射１０時間後血清を分離し、サイトカインＩＦＮ−γの分泌能を測定する。

結果（１）：薬物によるＣｏｎＡ肝炎モデルマウス血清中のＡＬＴとＡＳＴへの作用
結果を表２に示す。ＣｏｎＡ肝損傷モデル群は正常群に比べＡＬＴ、ＡＳＴに有意差が認められる（＊＊＊、ｐ＜０．００１）。各投与群のＡＬＴ、ＡＳＴはいずれも顕著に低下し、ＣｏｎＡモデル群に比べ統計的有意差が認められる（＃、ｐ＜０．０５；＃＃、ｐ＜０．０１；＃＃＃、ｐ＜０．００１）。ショウマ漢方薬の配合薬、ショウマ抽出物、ショウマ総フェノール酸およびイソフェルラ酸はいずれもＣｏｎＡマウスの肝損傷を軽減できることが示唆される。

表２：ショウマ配合薬、ショウマ抽出物、ショウマ総フェノール酸、およびイソフェルラ酸によるＣｏｎＡ肝炎モデルマウス血清中のＡＬＴおよびＡＳＴへの作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
注：＊はＣｏｎＡ群が正常対照群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。＃は投与群がＣｏｎＡ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１、＃＃＃はｐ＜０．００１を表す。

結果（２）：薬物によるＣｏｎＡ肝炎モデルマウス肝臓の病理学的損傷への作用
結果を図２に示す。ＣｏｎＡモデル群マウスの肝細胞が広範囲な変性を呈し、肝小葉の構造に乱れが認められ、肝細胞の中心静脈が著しく拡張し、中心静脈および肝類洞が著しく充血し、ないし肝細胞の大きなシート状壊死巣、大量の免疫細胞浸潤が認められる。ショウマ配合薬、ショウマ抽出物、ショウマ総フェノール酸、およびイソフェルラ酸群マウスは、ＣｏｎＡ群に比べ、肝細胞の変性や壊死が減少し、肝細胞のシート状壊死巣が著しく軽減し、免疫細胞の浸潤が減少することが認められる。

結果（３）：ＣｏｎＡ肝炎モデルマウスの血清サイトカインへの作用
結果を表３に示す。ＣｏｎＡ群は、正常群に比べ、自然免疫細胞により分泌されるＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６およびＴリンパ球により分泌されるＩＦＮ−γが有意に増加し、統計学的有意差が認められる（＊＊＊、ｐ＜０．００１）。各投与群はいずれも血清サイトカインＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γの分泌能を著しく低下させることができる（＃、ｐ＜０．０５；＃＃、ｐ＜０．０１；＃＃＃、ｐ＜０．００１）。

表３：ＣｏｎＡ肝炎モデルマウスの血清サイトカインの分泌への作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
注：＊はＣｏｎＡ群が正常対照群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。＃は投与群がＣｏｎＡ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１、＃＃＃はｐ＜０．００１を表す。

（実験例３：イソフェルラ酸、ショウマによるＣＩＡ関節炎モデルマウスの関節炎指数への作用）
試験材料：ウシＩＩ型コラーゲン酢酸溶液、完全フロイントアジュバントはＣｈｏｎｄｒｅｘ社から購入される。イソフェルラ酸は天津一方科技有限公司から購入される。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
割り当て：Ｃ５７ＢＬ／６マウス２４匹、雄、１８−２０ｇ、１日間順応飼育してから、以下の４群にランダムに割り当てる：正常対照群とＣＩＡモデル群、ｎ＝５；ショウマ群とイソフェルラ酸群、ｎ＝７。
モデル動物の作製および投与処置：２ｍｇ／ｍＬウシＩＩ型コラーゲン酢酸溶液を調製し、１晩放置してからウシＩＩ型コラーゲン酢酸溶液２ｍＬを取り、完全フロイントアジュバント２ｍＬとよく混ぜ乳化させ（氷上操作）、調製されるウシＩＩ型コラーゲン乳剤の最終濃度は１ｍｇ／ｍＬである。各マウスに０．１ｍＬを皮内注射する。初回免疫２１日目から、２１日間の２回目の免疫を行い、２回目の免疫の０日目から、ＣＩＡモデル群は蒸留水２５０μＬを強制経口投与し、ショウマ群は調製例１のショウマ煎出液２５０μＬを強制経口投与し、生薬の投与量は２ｇ／ｋｇである。イソフェルラ酸群はイソフェルラ酸水溶液２５０μＬを強制経口投与し、投与量は５ｍｇ／ｋｇであり、３日ごとに強制経口投与し、２１日間連続飼育する。
関節評価法によって動物を評価し（０−４段階）、評価の根拠は関節の赤みや腫れの程度および関節の腫脹と変形の状況である。０点：赤みや腫れがない。１点：赤みがあるが腫れがない。２点：関節に軽度の赤みや腫れがある。３点：関節に中程度の赤みや腫れがある。４点：関節に重度の赤みや腫れがあり且つ機能障害を伴う。四肢は別々にスコア付けされ、四肢のスコアの合計が当該マウスの関節炎指数である。最高点は１６点である。点数が高ければ高いほど、関節症状が深刻になる。

結果を表４に示す。２回目の免疫の３日目、ＣＩＡモデル群マウスに赤みや腫れおよび軽度の腫脹が認められ、関節炎指数の平均値は０．５７であり、疾患の持続時間の延長に伴い、関節炎指数が徐々に上昇し、１５日目、足首と足趾の関節に重度の腫脹があり、関節表面に充血が認められ、後肢で体重を支えることができず、平均関節炎指数は最高値８．４３になり且つプラトー期に達する。イソフェルラ酸群、ショウマ群の平均関節炎指数はそれぞれ４．４３と５．７１であり、平均関節炎指数を著しく低下させ、ＣＩＡモデル群に比べ有意差が認められる。

表４：イソフェルラ酸、ショウマによるＣＩＡ関節炎モデルマウスの関節炎指数への作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
注：＊はＣＩＡ群が正常対照群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。＃は投与群がＣｏｎＡ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１を表す。

図３は、正常群、ＣＩＡモデル群、および投与群マウスの前後足趾関節の腫脹の写真を示す。写真から、ＣＩＡ関節炎モデルマウスの足首の関節が著しく腫脹し、イソフェルラ酸群およびショウマ群マウスの関節腫脹が著しく軽減することが分かる。これらの結果により、イソフェルラ酸、ショウマはいずれもＣＩＡ関節炎モデルマウスの関節の赤みや腫れおよび機能障害を改善できると考えられる。

（実験例４：イソフェルラ酸およびショウマによるＣＩＡモデルマウスの体重への作用）
試験材料と動物は実験例３と同様である。
モデル動物の作製および投与処置：実験例３と同様である。マウスの２回目の免疫の２１日目、体重を測る。

結果を表５に示す。各投与群では、マウス体重の平均値に有意差が認められない。これらの結果により、イソフェルラ酸およびショウマはＣＩＡ関節炎モデルマウスの体重に影響を与えないと考えられる。

表５：イソフェルラ酸およびショウマによるＣＩＡ関節炎モデルマウスの体重への作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）

（実験例５：イソフェルラ酸およびショウマによるＣＩＡモデルマウスの臓器指数への作用）
試験材料と動物は実験例３と同様である。
モデル動物の作製および投与処置：実験例３と同様である。マウスの２回目の免疫の２１日目、麻酔下で屠殺し、脳、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、精巣を摘出する。６ウェルプレートに入れる。各マウスの臓器をそれぞれ１つのウェルに入れ、体重を迅速に測り、臓器指数を評価する。

結果を表６に示す。摘出された臓器において、免疫臓器である脾臓を代表として計算する。ＣＩＡモデルマウス群は、正常群に比べ、平均臓器指数が上昇するが、イソフェルラ酸群およびショウマ群は、ＣＩＡモデルマウス群に比べ、平均臓器指数に有意な差が認められない。これらの結果により、イソフェルラ酸およびショウマがＣＩＡモデルマウスの平均脾臓指数に影響を与えないと考えられる。

表６：イソフェルラ酸およびショウマによるＣＩＡ関節炎モデルマウスの臓器指数への作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）

（実験例６：イソフェルラ酸およびショウマによるＣＩＡ関節炎モデルマウスの治療に関する実験）
試験材料と動物は実験例３と同様である。抗ＩＩ型コラーゲン抗体ＥＬＩＳＡキットはＣｈｏｎｄｒｅｘ社から購入され、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ＆Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ３６−ＰｌｅｘＭｏｕｓｅＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ（商標）Ｐａｎｅｌ１Ａサイトカインおよびケモカイン検出キットはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社から購入される。
モデル動物の作製および投与処置：各投与群の投与量は実験例３と同様である。２回目の免疫の２１日目、マウスに麻酔をかける。
（１）Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ技術を用いて各投与群の薬物によるＣＩＡモデルマウスの関節構造への作用を調べる。各群からマウスを３匹ずつ取って首の骨を折って処置してから、直ちに右後肢を切り、４％中性ホルマリンで固定する。２−３日間固定してから、生体動物画像診断システムでＭｉｃｒｏ−ＣＴスキャンを行う。採集部位：マウス右後肢脛骨骨端プレートの上の区域のデータを採集する。３群のデータを採集する。サイズ選択：脛骨骨端プレートの上の部位（０．２５＊０．２５＊０．２５）；骨測定指標のデータを採集する：骨密度、骨体積、骨体積分率および骨梁の数。
（２）各投与群薬物によるＣＩＡモデルマウスの血清抗ＩＩ型コラーゲン抗体の含有量への作用を調べる。各群７匹、末梢血を採取し且つ血清を分離し、ＥＬＩＳＡで抗ＩＩ型コラーゲン抗体を測定する。
（３）各投与群薬物によるＣＩＡモデルマウスの血清と関節組織のサイトカインの分泌への作用を調べる。各群７匹、末梢血を採取し且つ血清を分離し、多因子により血清サイトカイン：ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ−ＣＳＦの分泌能を測定する；右後肢膝を採取し、関節と足趾などを液体窒素内で急速凍結し、均質化後にタンパク質を抽出し、多因子により組織サイトカインＩＬ−９、ＩＬ−１８およびＭＩＰ−２の分泌能を測定する。

結果（１）：Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ技術を用いて各投与群薬物によるＣＩＡモデルマウスの関節構造への作用を調べる。
結果を図４に示す。ＣＩＡモデルマウスの足首の関節構造がぼやけ、骨粗鬆が認められ延いてはひどく破壊し、投与群の関節構造にさまざまな程度の破壊が認められるが、その程度がモデル群より著しく軽く、特に骨の破壊程度がモデル群より著しく軽く、ショウマ群の骨侵食破壊の程度が最も軽く、イソフェルラ酸群がそれに続く。

表７に示すように、ＣＩＡ群マウスは、正常群に比べ、骨密度、骨体積、骨体積分率および骨梁数はいずれも低下し、イソフェルラ酸およびショウマ群は、ＣＩＡモデル群に比べ、骨測定指標が著しく上昇する。これらの結果により、イソフェルラ酸およびショウマは関節破壊を効果的に抑制・緩和できると考えられる。

表７：イソフェルラ酸およびショウマによるＣＩＡ関節炎モデルマウスの骨損傷への作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
注：＊はＣＩＡ群が正常対照群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。＃は投与群がＣＩＡ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１を表す。

結果（２）：薬物によるＣＩＡモデルマウスの血清抗ＩＩ型コラーゲン抗体の含有量への作用。
結果を表８に示す。ＣＩＡ群は、正常群に比べ、抗ＩＩ型コラーゲン抗体の分泌が顕著に上昇し、統計学的有意差が認められる（＊＊＊、ｐ＜０．０００１）。イソフェルラ酸群およびショウマ群はいずれも血清抗ＩＩ型コラーゲン抗体の分泌能を顕著に低下することができる（＃＃＃、ｐ＜０．０００１）。

表８：イソフェルラ酸およびショウマによるＣＩＡ関節炎モデルマウスの血清抗ＩＩ型コラーゲン抗体の含有量への作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
注：＊はＣＩＡ群が正常対照群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。＃は投与群がＣＩＡ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃＃＃はｐ＜０．００１を表す。

結果（３）：薬物によるＣＩＡモデルマウスの血清および関節組織のサイトカインの分泌への作用。
結果を表９に示す。イソフェルラ酸群は、ＣＩＡ群に比べ、血清サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ケモカインＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、Ｅｏｔａｘｉｎ、およびコロニー刺激因子Ｇ−ＣＳＦの分泌能が顕著に低下し、統計学的有意差が認められる。それと同時に、関節組織ＩＬ−１８、ＩＬ−９とＭＩＰ−２の分泌能が顕著に低下し、統計学的有意差が認められる。これらの結果により、イソフェルラ酸群はいずれも血清と関節組織の複数の炎症性サイトカインの分泌能を顕著に低下させることができると考えられる。

表９：イソフェルラ酸によるＣＩＡ関節炎モデルマウスの血清および関節組織のサイトカインへの作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
注：＃は投与群がＣＩＡ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１、＃＃＃はｐ＜０．００１を表す。

（実験例７：イソフェルラ酸およびショウマによるＣＩＡ関節炎モデルマウスの顆粒球の割合への作用）
試験材料と動物：ＣＤ４８ＰＥとＣＤ１１ｂＦＩＴＣ抗体はいずれもＢＤＰＨａｒｍｉｎｇｅｎ社から購入される。赤血球溶解バッファー（ＲＢＣＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ）は米国Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入される。その他の試薬はいずれも実験例３と同様である。
モデル動物の作製および投与処置：各投与群の投与量は実験例３と同様である。２回目の免疫の２１日目、マウスに麻酔をかける。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
骨髄単細胞懸濁液の調製：Ｃ５７ＢＬ／６マウス麻酔後、マウスの両側大腿骨と脛骨を分離し、２ｍＬシリンジを使用してＰＢＳを吸引し骨髄細胞をフローチューブに流し込み、ピペットで繰り返し吸引・排出し、骨髓単細胞懸濁液とする。４００メッシュの濾過用網で骨髄をフローチューブに濾過し、遠心分離して上澄液を除去し、室温下でＲＢＣＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ２ｍＬを加えて１５分溶解してから、遠心分離して上澄液を除去し、骨髓細胞が得られ、ＰＢＳ１ｍＬを加えて再懸濁し、ピペットで繰り返し吸引・排出して均一になるように混合し、１００μＬを吸引してフローチューブに入れ、表面染色を行う。
脾臓単細胞懸濁液の調製：Ｃ５７ＢＬ／６マウス麻酔後、マウスの脾臓を分離し、脾臓をＰＢＥＢ４ｍＬの入った小さな皿に置き、スライドガラスの粗い面で脾臓を研磨し、４００メッシュの濾過用網で脾臓細胞をフローチューブに濾過し、遠心分離して上澄液を除去し、ＲＢＣＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ２ｍＬを加えて室温下で１５分溶解してから、遠心分離して上澄液を除去し、脾臓細胞が得られる。そしてＰＢＳ１ｍＬを加えて再懸濁し、ピペットで繰り返し吸引・排出して均一になるように混合し、１００μＬを吸引してフローチューブに入れ、表面染色を行う。
表面染色：抗体ＣＤ４８−ＰＥ０．５μＬ、ＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ１μＬを加え、遮光、４℃下で１５分インキュベートしてから、ＰＢＥＢ２ｍＬを加えて遠心分離し、上澄液を除去する。フローサイトメーターＢＤＣａｌｉｂａｒを使用してＣＤ４８⁻ＣＤ１１ｂ^＋陽性顆粒球の割合を測定する。

結果を表１０に示す。骨髓と脾臓において、ＣＩＡ関節炎モデルマウスの顆粒球の割合がいずれも上昇し、イソフェルラ酸群はいずれも骨髓と脾臓における顆粒球の割合を低下させることができる。ショウマ群は脾臓顆粒球の割合を低下させることができ、統計学的有意差が認められる。これらの結果により、イソフェルラ酸およびショウマはＣＩＡ関節炎モデルマウスの顆粒球の割合を低下させることができると考えられる。

表１０：イソフェルラ酸およびショウマによるＣＩＡ関節炎モデルマウスの顆粒球の割合への作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
注：＃は投与群がＣＩＡ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１を表す。

（実験例８：イソフェルラ酸およびショウマによるＣＩＡ関節炎モデルマウスの顆粒球とＮＫ細胞との増殖能への作用
試験材料と動物：ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ、ＮＫ１．１−ＡＰＣ抗体、Ｋｉ６７−ＰＥ抗体、細細胞内染色キットＩｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＦｉｘａｔｉｏｎ＆ＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒＳｅｔはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入される。ＣＤ４８ＰＥ、ＣＤ１１ｂＦＩＴＣ、およびＢ２２０−ＦＩＴＣ抗体はいずれもＢＤＰＨａｒｍｉｎｇｅｎ社から購入される。その他の必要な試薬はいずれも実験例７と同様である。
モデル動物の作製および投与処置：各投与群の投与量は実験例３と同様である。２回目の免疫の２１日目、マウスに麻酔をかける。
動物：Ｃ５７ＢＬ／６マウス、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入される。
フローサイトメーターで脾臓においてＫｉ−６７を発現する細胞の増殖能を測定する。脾臓単細胞懸濁液２本を調製し、それぞれＣＤ４８⁻ＣＤ１１ｂ^＋陽性顆粒球とＣＤ３⁻ＮＫ１．１^＋Ｂ２２０⁻ＮＫ細胞の増殖能の測定に用いられ、脾臓単細胞懸濁液の調製は実験例７と同様である。
表面染色ステップは実験例７と同様である。
細胞内染色：表面染色後、細胞内染色を行う。１）細胞固定透過処理液ＦｉｘａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ１００μＬを加え、室温遮光下で、４０分固定透過処理する。２）ＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ１ｍＬを加えて２回洗浄し、上澄液を除去する。３）Ｋｉ−６７−ＰＥ抗体１μＬを加えて室温遮光下で４０分放置する。４）ステップは２）のステップと同様である。５）フローサイトメーターＢＤＣａｌｉｂａｒでＣＤ４８⁻ＣＤ１１ｂ^＋陽性顆粒球においてＫｉ−６７を発現する細胞の割合およびＣＤ３⁻ＮＫ１．１^＋Ｂ２２０⁻ＮＫ細胞においてＫｉ−６７を発現する細胞の割合を測定する。

結果を表１１に示す。ＣＩＡ関節炎モデルマウスは、正常マウスに比べ、骨髓、脾臓中の顆粒球の増殖能および脾臓中のＮＫ細胞の増殖能が上昇し、イソフェルラ酸群の増殖能が顕著に低下し、有意差が認められる。ショウマ群は、ＣＩＡ関節炎モデルマウスに比べ、骨髓中の顆粒球と脾臓中のＮＫ細胞増殖能が顕著に低下し、有意差が認められる。これらの結果により、イソフェルラ酸およびショウマはＣＩＡ関節炎モデルマウスの顆粒球とＮＫ細胞との増殖能を低下させることができると考えられる。

表１１：イソフェルラ酸およびショウマによるＣＩＡ関節炎モデルマウスの顆粒球とＮＫ細胞との増殖能への作用（ＭＥＡＮ±ＳＥＭ）
注：＃は投与群がＣＩＡ群に比べ統計学的有意差が認められることを表し、＃はｐ＜０．０５、＃＃はｐ＜０．０１を表す。

要約すれば、ショウマ配合薬、ショウマ抽出物、ショウマ総フェノール酸、およびイソフェルラ酸はいずれも肝炎モデルマウスの生存率を著しく上昇させ、肝機能を改善し、肝臓の病理学的損傷を軽減し、炎症性サイトカインの放出を抑え、著しい肝保護作用を有する。

イソフェルラ酸およびショウマはいずれもＣＩＡ関節炎モデルマウスの発病率を大幅に低下させ、ＣＩＡ関節炎の平均指数を低下させ、関節の腫脹を軽減し、骨の侵食や破壊を軽減し、抗ＩＩ型コラーゲン抗体の含有量を低下させ、炎症性サイトカインの放出を広範囲に抑え、顆粒球、ＮＫ細胞の割合と増殖能を低下させ、広範囲な免疫抑制作用を有する。

それに、イソフェルラ酸、ショウマ抽出物、ショウマなどは顕著な炎症性サイトカイン抑制作用を有する。

特に断りがない限り、本発明で使われる用語はいずれも本分野の当業者が一般的に理解する意味と同様の意味を有するものとする。

本発明にかかる実施形態は例示のみを目的として提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本分野の当業者は本発明の範囲から逸脱せずに様々な置換、変更、および改良を行うことができ、そのため、本発明は上記の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって決定される。

［付記］
［付記１］
自己免疫疾患の治療薬または機能性健康食品の調製における、イソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、およびショウマの使用。

［付記２］
前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである、付記１に記載の使用。

［付記３］
ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ−ＣＳＦの中の１種または複数種を含む炎症性サイトカインを抑制するための薬物または機能性健康食品の調製におけるイソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、およびショウマの使用。

［付記４］
自己免疫疾患の治療薬の調製における、イソフェルラ酸またはイソフェルラ酸を含有する生薬抽出物を含有する医薬組成物、またはショウマを含有する漢方薬組成物の使用。

［付記５］
前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである、付記４に記載の使用。

［付記６］
前記イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物はショウマ煎出液またはショウマ総フェノール酸の抽出物である、付記１から５のいずれか１つに記載の使用。

［付記７］
イソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、またはショウマを活性成分とする、自己免疫疾患を治療するための医薬組成物。

［付記８］
前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである、付記７に記載の医薬組成物。

［付記９］
炎症性サイトカインを抑制するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、イソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、またはショウマを活性成分とし、前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ−ＣＳＦの中の１種または複数種を含む、医薬組成物。

［付記１０］
前記イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物はショウマ煎出液またはショウマ総フェノール酸の抽出物である、付記７から９のいずれか１つに記載の医薬組成物。

Claims

自己免疫疾患の治療薬または機能性健康食品の調製における、イソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、およびショウマの使用。
前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである、請求項１に記載の使用。
ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ−ＣＳＦの中の１種または複数種を含む炎症性サイトカインを抑制するための薬物または機能性健康食品の調製におけるイソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、およびショウマの使用。
自己免疫疾患の治療薬の調製における、イソフェルラ酸またはイソフェルラ酸を含有する生薬抽出物を含有する医薬組成物、またはショウマを含有する漢方薬組成物の使用。
前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである、請求項４に記載の使用。
前記イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物はショウマ煎出液またはショウマ総フェノール酸の抽出物である、請求項１から５のいずれか１項に記載の使用。
イソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、またはショウマを活性成分とする、自己免疫疾患を治療するための医薬組成物。
前記自己免疫疾患は自己免疫性肝炎または関節リウマチである、請求項７に記載の医薬組成物。
炎症性サイトカインを抑制するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、イソフェルラ酸、イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物、またはショウマを活性成分とし、前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、Ｅｏｔａｘｉｎ、Ｇ−ＣＳＦの中の１種または複数種を含む、医薬組成物。
前記イソフェルラ酸を含有する生薬抽出物はショウマ煎出液またはショウマ総フェノール酸の抽出物である、請求項７から９のいずれか１項に記載の医薬組成物。