CN109908162B - 一种用于治疗抑郁症的药物组合物及其制剂和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于治疗抑郁症的组合物，所述组合物包括槲皮素，金丝桃苷，山柰酚和异槲皮苷，各组分的重量份为：槲皮素1～25重量份，金丝桃苷1～25重量份，山柰酚1～30重量份，异槲皮苷1～25重量份。本发明还提供包括所述组合物的药物组合物及其制备方法。此外，本发明还提供了所述组合物及药物组合物在制备治疗抑郁的药物中的应用。

Description

一种用于治疗抑郁症的药物组合物及其制剂和医药用途

技术领域

本发明属于医药学领域，具体涉及一种包括黄酮类单体化合物的药物组合物及其制剂，以及它们在抗抑郁症上的医药用途。

背景技术

抑郁症(Depression),又称抑郁障碍，是一种慢性、反复性发作的情感精神性疾病，以显著而持久的心境或情绪低落为主要临床特征，常伴有焦虑、思维迟缓、妄想或幻觉、注意力和记忆力下降和睡眠障碍等症状。迄今，抑郁症的病因还不清楚，一般认为生物、心理与社会环境诸多方面因素参与了抑郁症的发病过程。

据统计，全球抑郁症患者发病率高达21％，约15％的患者伴有自杀倾向。世界卫生组织(WHO)预测抑郁症将会在2020年成为继高血压病之后第二大临床慢性疾病，被认为是精神病学中的“感冒”。据调查显示，在中国仅有5％的抑郁症患者接受过治疗，大部分患者由于缺乏对抑郁症的认知，未能及时诊治，导致病情恶化。随着生活节奏加快，生活的工作压力增大，抑郁症已成为严重危害人类健康的常见疾病之一。

药物是目前抑郁症最主要的治疗手段。目前临床上常用的抗抑郁药包括选择性5-羟色胺(5-HT)重摄取抑制剂(SSRIs)、5-HT/去甲肾上腺素(NE)双重重摄取抑制剂(SNRIs)、三环类(TCAs)和单胺氧化酶抑制剂(MAOIs)等化学类药物。但是已经上市的抗抑郁化学药物大多存在起效延迟(3～8周)、不良反应多、有效率低(50％～70％)、复发率高(35％～60％)、价格昂贵等亟待解决的问题。临床已经反映出的不良反应包括胃肠道症状(恶心、腹泻、胃出血、消化不良)，肝毒性，体重增加及代谢异常，心血管问题(心率、QT间期延长、高血压、体位性低血压)，泌尿系统症状(尿潴留、尿失禁)，性功能障碍，低钠血症，骨质疏松及骨折风险，出血，中枢神经系统紊乱(癫痫阈降低、锥体外系副作用、认知障碍)，泌汗，睡眠障碍，情感症状(情感平淡、心境转相、反常反应)，眼部症状(青光眼、白内障)，高泌乳素血症。因此，为寻求更安全、有效、低毒、经济的抗抑郁药，越来越多的研究者将目光投向资源丰富的天然植物。

现有的天然植物来源的抗抑郁药物多为中草药提取物，是多种不同化合物的混合物，成分复杂，造成服用量大，患者依从性差。

现有技术中已经报道了从中草药提取物中分离纯化得到的多种单体化合物，尤其是黄酮类护化合物能够治疗或缓解抑郁症，如：张彦等在《金丝桃苷对慢性不可预知温和刺激大鼠抑郁行为的影响》(中国新药与临床杂志，2017，36(3):150-156)中报道金丝桃苷10mg/kg和15mg/kg能显著逆转慢性温和不可预知应激(CUMS)大鼠抑郁样行为。再如，陈箐筠等报道了槲皮素对皮质酮损伤的PC12细胞有明显的保护作用，提示有抗抑郁作用(陈箐筠，干信，槲皮素对皮质酮损伤的PC12细胞的保护作用[J],化学与生物工程,2009,26(1):47-49)。公开号CN101152201A(公开日2008年4月2日)的中国发明专利申请公开了异槲皮苷预防和/或治疗抑郁症的医药用途。然而，张利斌等报道了异槲皮苷在0.3mg/kg的剂量下能够显著缩短小鼠强迫游泳不动时间和小鼠悬尾不动时间，但是随着剂量的增加，小鼠抑郁症状反而加重，表现为强迫游泳不动时间和悬尾不动时间延长，甚至超过了模型组(张利斌，张晓庆，等，异槲皮苷抗抑郁作用实验研究[J],药学实践杂志,2011,29(4):272-273,290)。异槲皮苷对抑郁的治疗作用似乎与剂量有关。王佳等报道山柰酚50mg/kg具有显著抗大鼠抑郁作用，可能通过提高前额叶皮质部位NE、DA、5-HT递质水平达到抗抑郁作用(王佳，谢健，等，山柰酚对乳腺癌抑郁模型大鼠的抗抑郁作用研究[J]，中国现代应用药学，2016，33(3)：277-281)。

由于抑郁症的发生发展机制至今还不明确，现有治疗药物又存在着诸多缺点，巨大临床需求和有限的治疗手段之间的矛盾急需解决。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种包括数个黄酮类单体化合物的药物组合物及其制剂。所述药物组合物通过组成成分之间的协同作用，达到了确切的抗抑郁效果。

为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种用于治疗抑郁症的组合物，所述组合物包括槲皮素，金丝桃苷，山柰酚和异槲皮苷，各组分的重量份为：

槲皮素1～25重量份，金丝桃苷1～25重量份，山柰酚1～30重量份，异槲皮苷1～25重量份。

优选的，所述组合物，所述各组分的重量份为：

槲皮素1～20重量份，金丝桃苷1～20重量份，山柰酚1～25重量份，异槲皮苷1～20重量份。

更优选的，所述组合物，所述各组分的重量份为：

槲皮素1～15重量份，金丝桃苷2～12重量份，山柰酚2～15重量份，异槲皮苷为1～10重量份。

进一步优选的，所述组合物，所述各组分的重量份为：

槲皮素1～12重量份，金丝桃苷2～12重量份，山柰酚2～10重量份，异槲皮苷为1～8重量份。

最优选的，所述组合物中，各组分的重量份为：

槲皮素5重量份，金丝桃苷5重量份，山柰酚3～7重量份，异槲皮苷6重量份

还优选的，本发明所述组合物由槲皮素，金丝桃苷，山柰酚和异槲皮苷组成。

本发明的另一个目的在于提供一种用于抗抑郁症的药物组合物，包括上述的组合物。

优选的，所述药物组合物，上述组合物作为唯一活性成分。

优选的，所述药物组合物还可以包括药学上可以接受的辅料。

优选的，所述药物组合物为临床上可以接受的口服制剂或非口服制剂。

所述口服制剂选自散剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、滴丸剂、微丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆剂和口腔速溶膜剂中的一种或多种。

所述片剂选自片剂口服普通片、含片、舌下片、口腔贴片、咀嚼片、分散片、泡腾片、速释片、缓释片、控释片和肠溶片中的一种或多种。

所述非口服制剂选自注射剂、冻干粉针和大容量输液剂中的一种或多种。

本发明还提供上述药物组合物的制备方法，包括，按照重量份取槲皮素、金丝桃苷、山柰酚和异槲皮苷，加入或不加入药学上可以接受的辅料，按照本领域常规的方法，制备成临床上可以接受的制剂。

本发明还有一个目的在于提供所述组合物、所述药物组合物或按照上述制备方法制备得到的药物组合物在制备治疗抑郁症的药物中的应用。

本发明还提供述组合物、所述药物组合物或按照上述制备方法制备得到的药物组合物，和具有抗抑郁作用的活性成分或者包括所述具有抗抑郁作用的活性成分的制剂在制备治疗抑郁症的药物中的应用。所述具有抗抑郁作用的活性成分选自5-羟色胺(5-HT)重摄取抑制剂(SSRIs)、5-HT/去甲肾上腺素(NE)双重重摄取抑制剂(SNRIs)、三环类(TCAs)和单胺氧化酶抑制剂(MAOIs)中的一种或多种。

上述的组合物或者上述的药物组合物，用于治疗抑郁症时，施用的对象是哺乳动物，更优选为人。

本发明还提供一种治疗抑郁症的方法，包括将有效剂量的上述组合物或上述药物组合物给予有需要的哺乳动物，优选为有需要的人。

当给药对象是人时，人的体重70kg，上述的组合物或上述的药物组合物的每日剂量，以所述组合物的总质量计，不低于80mg。

本发明的说明书中，上述药学上可以接受的辅料，包括但不限于：

稀释剂：例如选自淀粉、糊精、预胶化淀粉、乳糖、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙、氧化镁、碳酸镁、氢氧化铝凝胶、β-环糊精、甘露醇、山梨醇、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟甲基纤维素钠中的一种或多种。

粘合剂：例如选自蒸馏水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素、羟丙甲纤维素中的一种或多种。

润滑剂：例如选自十二烷基硫酸镁、聚乙二醇、微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉中的一种或多种。

崩解剂：例如选自淀粉(玉米、马铃薯)、微晶纤维素、海藻酸、海藻酸钠、离子交换树脂、泡腾酸-碱系统、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、低取代羟丙基纤维素、部分α化淀粉和微晶纤维素中的一种或多种。

成膜材料：明胶、虫胶、阿拉伯胶、琼脂、淀粉、糊精、PVA05-88、PVA17-88和乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)中的一种或多种。

矫味剂：例如选自糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、甜菊苷以及香精类中的一种或多种。

注射用溶剂：例如选自注射用水、麻油、茶油、花生油、玉米油、橄榄油、棉籽油、豆油、蓖麻油及桃仁油、油酸乙酯、苯甲酸苄酯、丙二醇、聚乙二醇400、二甲基乙酰胺(DMA)、乙醇和甘油中的一种或多种。

本文中所述的“重量份”表示的是各组分之间的相对的质量配比关系，而不是真实的质量单位。

虽然现有技术已经对本发明所述组合物中的各个单体化合物的抗抑郁作用有过报道，如金丝桃苷对大鼠10mg/kg和15mg/kg表现出抗抑郁作用，而5mg/kg则没有作用(张彦，祝晨蔯，金丝桃苷对慢性不可预知温和刺激大鼠抑郁行为的影响[J],中国新药与临床杂志，2017，36(3):150-156)。槲皮素在细胞水平上可以保护皮质酮损伤的PC12细胞(陈箐筠，干信，槲皮素对皮质酮损伤的PC12细胞的保护作用[J],化学与生物工程,2009,26(1):47-49)。异槲皮苷0.3mg/kg时对小鼠有抗抑郁作用(中国发明专利申请，公开号CN101152201A，公开日2008年4月2日；张利斌，张晓庆，等，异槲皮苷抗抑郁作用实验研究[J],药学实践杂志,2011,29(4):272-273,290)。山柰酚50mg/kg的剂量对大鼠具有显著抗抑郁作用(王佳，谢健，等，山柰酚对乳腺癌抑郁模型大鼠的抗抑郁作用研究[J]，中国现代应用药学，2016，33(3)：277-281)。按照体表面积系数换算，则按照该文献报道，山柰酚抗抑郁作用对小鼠的剂量为75mg/kg。但是尚未见报道包括上述各单体的组合物的抗抑郁症作用。

本发明的研究发现，槲皮素5.0mg/kg、金丝桃苷5.0mg/kg、山柰酚7.0mg/kg和异槲皮苷6.0mg/kg分别单独给药，对慢性温和不可预测应激(CUMS)造成的小鼠抑郁行为仅有弱的改善，与模型组比较没有显著性差异。值得注意的是，金丝桃苷5.0mg/kg和山柰酚7.0mg/kg换算成大鼠剂量，分别为：金丝桃苷3.3mg/kg，山柰酚4.67mg/kg，低于前述文献报道的有效抗大鼠抑郁的剂量(分别的，金丝桃苷10mg/kg，山柰酚50mg/kg)；异槲皮苷6.0mg/kg的剂量，根据文献报道(张利斌，张晓庆，等，异槲皮苷抗抑郁作用实验研究[J],药学实践杂志,2011,29(4):272-273,290)将会加重小鼠的抑郁行为，虽然本发明的研究发现该剂量的异槲皮苷对小鼠抑郁有轻微的改善作用。而上述各单体组成的组合物高剂量(槲皮素5.0mg/kg+金丝桃苷5.0mg/kg+山柰酚7.0mg/kg+异槲皮苷6.0mg/kg)、组合物低剂量(槲皮素2.5mg/kg+金丝桃苷2.5mg/kg+山柰酚3.5mg/kg+异槲皮苷3.0mg/kg)却令人意想不到地表现出显著的抗抑郁作用：连续给药4周后，抑郁小鼠的行为学和各项生化指标都发生了明显逆转，与正常对照组比较没有显著性差异(P＞0.05)。说明本发明的组合物，各个单体之间并不是简单的作用叠加，而是存在着协同作用。基于此，本发明为临床治疗抑郁症提供了一种新的治疗选择。

附图说明

以下参照附图，对本发明作详细的说明。

图1示出的是实施例12中糖水偏爱实验的结果。图中，^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.模型对照组；^###P＜0.01vs.正常对照组；^$P<0.05vs.各单体化合物组。

图2示出的是实施例12中敞箱实验的结果；其中图2A示出的是小鼠水平运动得分，图2B示出的是小鼠垂直运动得分。图中，^*P<0.05,^***P<0.001vs.模型对照组；^###P＜0.01vs.正常对照组；^$P<0.05vs.各单体化合物组。

图3示出的是实施例12中垂尾实验的结果。图中，^*P<0.05,^***P<0.001vs.模型对照组；^###P＜0.01vs.正常对照组；^$P<0.05vs.各单体化合物组。

图4示出的是实施例12中小鼠强迫游泳实验的结果，图中，^*P<0.05,^***P<0.001vs.模型对照组；^###P＜0.001vs.正常对照组；^$P<0.05vs.各单体化合物组。

图5示出的是实施例12中CUMS小鼠血清皮质酮和促肾上腺皮质激素水平的测定结果；其中，图左侧示出的血清皮质酮水平测定结果，图右侧示出的是血清促肾上腺皮质激素水平测定结果。图中，^*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs.模型对照组；^###P＜0.01vs.正常对照组；^$P<0.05vs.各单体化合物组。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中，部分试剂和仪器购买情况如下：

槲皮素、山柰酚、异槲皮苷、金丝桃苷：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

实施例1一种抗抑郁的组合物

一种抗抑郁的组合物，组成为(其中，10g＝1重量份)：

槲皮素10g，金丝桃苷20g，山柰酚20g，异槲皮苷50g。

本实施例所述的抗抑郁的组合物通过如下方法制备：按照质量数，取各单体组分，混合均匀，即得。

实施例2一种抗抑郁的组合物

一种抗抑郁的组合物，组成为(其中，1g＝1重量份)：

槲皮素22g，金丝桃苷22g，山柰酚15g，异槲皮苷13g。

本实施例所述的抗抑郁的组合物通过如下方法制备：按照质量数，取各单体组分，混合均匀，即得。

实施例3一种抗抑郁的组合物

一种抗抑郁的组合物，组成为(其中，15g＝1重量份)：

槲皮素30g，金丝桃苷40g，山柰酚15g，异槲皮苷15g。

本实施例所述的抗抑郁的组合物通过如下方法制备：按照质量数，取各单体组分，混合均匀，即得。

实施例4一种抗抑郁的组合物

一种抗抑郁的组合物，组成为(其中，10g＝1重量份)：

槲皮素40g，金丝桃苷30g，山柰酚20g，异槲皮苷10g。

本实施例所述的抗抑郁的组合物通过如下方法制备：按照质量数，取各单体组分，混合均匀，即得。

实施例5一种抗抑郁的组合物

一种抗抑郁的组合物，组成为(其中，5g＝1重量份)：

槲皮素60g，金丝桃苷20g，山柰酚15g，异槲皮苷5g。

本实施例所述的抗抑郁的组合物通过如下方法制备：按照质量数，取各单体组分，混合均匀，即得。

实施例6一种抗抑郁的组合物

一种抗抑郁的组合物，组成为(其中，20g＝1重量份)：

槲皮素100g，金丝桃苷100g，山柰酚140g，异槲皮苷120g。

本实施例所述的抗抑郁的组合物通过如下方法制备：按照质量数，取各单体组分，混合均匀，即得。

实施例7一种抗抑郁的组合物

一种抗抑郁的组合物，组成为(其中，1g＝1重量份)：

槲皮素5g，金丝桃苷5g，山柰酚3g，异槲皮苷6g。

本实施例所述的抗抑郁的组合物通过如下方法制备：按照质量数，取各单体组分，混合均匀，即得。

实施例8一种抗抑郁的组合物

一种抗抑郁的组合物，组成为(其中，1g＝1重量份)：

槲皮素5g，金丝桃苷5g，山柰酚4g，异槲皮苷6g。

本实施例所述的抗抑郁的组合物通过如下方法制备：按照质量数，取各单体组分，混合均匀，即得。

实施例8一种抗抑郁的组合物

一种抗抑郁的组合物，组成为(其中，1g＝1重量份)：

槲皮素5g，金丝桃苷5g，山柰酚5g，异槲皮苷6g。

本实施例所述的抗抑郁的组合物通过如下方法制备：按照质量数，取各单体组分，混合均匀，即得。

实施例9一种抗抑郁的组合物

一种抗抑郁的组合物，组成为(其中，1g＝1重量份)：

槲皮素5g，金丝桃苷5g，山柰酚6g，异槲皮苷6g。

本实施例所述的抗抑郁的组合物通过如下方法制备：按照质量数，取各单体组分，混合均匀，即得。

实施例10一种抗抑郁的口服普通片剂

按照实施例1～9中任意的质量配比，制备组合物1kg，加入本领域常规的片剂的辅料，按照本领域常规的方法制备成口服普通片剂。

实施例11本发明所述组合物的体外抗抑郁作用

(1)试验药物：

组合物：实施例1～5制备的组合物，分别命名为组合物1，组合物2，组合物3，组合物4和组合物5。

单体化合物：槲皮素、山柰酚、金丝桃苷、异槲皮苷。

试验中的药物均采用100％DMSO配制成1000×储存液，使用时用细胞培养液DMEM稀释成所需浓度的工作液，且DMSO浓度不超过0.1％。溶剂为含0.1％DMSO的DMEM培养液。

(2)试验材料和仪器

PC12细胞(大鼠来源，中科院细胞库)、皮质酮(Sigma公司)、DMEM高糖培养基(Gibco公司)、澳洲胎牛血清(Gibco公司)、马血清(Gibco公司)、噻唑蓝(MTT，Sigma公司)、二甲基亚砜DMSO(Sigma公司)、细胞培养箱(Thermo公司)、酶标仪(Bio-rad公司)。

(3)神经细胞皮质酮损伤模型的建立

细胞培养至对数生长期，用含5％胎牛血清、10％马血清的DMEM培养基(含青霉素钠200kU/L，链霉素100mg/L，pH 7.4)重悬细胞，调细胞密度为1×10⁵个/mL.细胞接种于96孔板中，各孔加入100μL细胞液，置于37℃、CO₂培养箱中贴壁孵育24h，待细胞长满孔底后即开始实验。细胞血清剥夺1h后，加入不同浓度的皮质酮(0,25,50,100,200,400μM)，作用24h后，用MTT法检测细胞活力，利用酶标仪在570nm处测定各组细胞吸光度A值。以对照组平均吸光度为100％，以各处理组吸收度值与对照组的比值计算存活力，选择皮质酮的最佳造模浓度。

(4)组合物浓度选择

参照以往文献报道，仅槲皮素(0.125～32μM)和金丝桃苷(0.625～10μM)采用过皮质酮诱导PC12细胞损伤的抑郁细胞模型，山柰酚和异槲皮苷未见报道。结合前期预实验，为体现组合物配比优势，本实施例选择槲皮素浓度为0.1～0.6μM，金丝桃苷0.20～0.40μM，其他单体化合物的浓度根据相应质量配比进行换算。各组合物中单体化合物的浓度组成见表1。

表1 各组合物中单体化合物的浓度组成(μM)

注：由于不同实验条件，不同试剂及造模浓度不同，组合物或单体具体药效作用存在一定的浓度的差异范围。

(5)各试验药物对皮质酮损伤细胞存活力

将细胞以为1×10⁵个/ml接种于96孔板(100μl/孔)，正常培养24h后加入不同浓度试验药物孵育2h后，除正常对照孔外，其余各孔加入造模浓度皮质酮，继续孵育24h。收集细胞上清液用于检测乳酸脱氢酶(LDH)活性变化，MTT法检测96孔板内细胞存活率，酶标仪570nm检测各孔吸光度值。以对照组平均吸光度为100％，以各处理组吸收度值与对照组的比值计算存活力和LDH的变化情况。

结果

如表2所示，与正常对照组相比，模型组即皮质酮单独处理后，PC12细胞的存活率出现显著性降低(P<0.001)；与皮质酮组相比，单体化合物槲皮素、山柰酚、金丝桃苷和异槲皮苷在浓度范围内的最高浓度几乎不改变细胞的存活率，差异不具有统计学意义(P>0.05)；不同单体化合物配伍的组合物对皮质酮损伤的细胞存活率均有不同程度地提高，且作用具有显著性统计学意义(P<0.05)，其中组合物2的作用最为显著，细胞存活率达到97.35％以上(P<0.001)。

表2 各组合物及其单体对皮质酮诱导PC12损伤的作用

注：槲皮素、金丝桃苷、山柰酚、异槲皮苷单一用药所选用的浓度均为其在某一组合物中的最高浓度；组合物中单体化合物浓度的排列顺序依次为槲皮素、金丝桃苷、山柰酚、异槲皮苷；^###P<0.001vs.皮质酮组；^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.皮质酮组。

实施例12本发明组合物抗抑郁作用研究

1.实验动物

C57小鼠，雄性，80只，体重18～22g。实验动物许可证号：SCXK(粤)2011-0015；实验前小鼠适应饲养环境一周，所有小鼠饲养在温度21±2℃的普通级实验动物房，并遵循昼夜节律。小鼠可自由摄食饮水。

2.实验药物与仪器

槲皮素、山柰酚、异槲皮苷、金丝桃苷、实施例6制备的组合物(以下简称“组合物”)；羧甲基纤维素钠。

小鼠开场敞箱、电子分析天平(德国Sartrious公司)、冷冻型台式大容量高速离心机5810(德国EPPENDORF公司)、Victor3多功能酶标仪(美国PerkinElmer公司)、超声组织破碎仪(美国Sonic公司)、DYY-Ⅲ型电泳仪(北京六一仪器厂)、垂直板电泳槽(美国Bio-Rad公司)、WD-9405型水平摇床(北京六一仪器厂)、荧光/化学发光成像系统(美国Sonic公司)、Mill-Q超纯水系统(美国Millipore公司)、ECl发光液(Invitrogen公司，美国)；

脱脂奶粉(广州斯佳生物科技有限公司)；PVDF膜(Milipore公司，美国)；X线感光胶片(Kodak公司，日本)；

皮质酮(CORT)酶联免疫分析试剂盒(美国Enzo公司)；ACTH酶联免疫分析试剂盒(美国phoenix pharmaceuticals公司)。

3.实验造模与分组给药

实验前适应环境一周，所有小鼠可自由获得食物和水，并遵循昼夜节律，在温度恒定的清洁级环境中饲养，每日人工抚摸，以适应人工操作。适应环境一周后根据小鼠的体重及糖水偏爱实验结果将小鼠分为两组：正常对照组10只、慢性温和不可预测应激(CUMS)组70只，分组后开始进行应激。应激造模方式有：夹尾1min、昼夜颠倒24h、鼠笼倾斜24h、4℃冰水游泳5min、束缚1h、湿笼24h、强迫游泳15min、饮水剥夺24h、食物剥夺24h、电击足底、频闪应激、独笼应激，合笼应激等。在实验开始、应激后第3周进行糖水偏爱实验用以判定造模是否成功，若抑郁症模型未成功，将顺延CUMS应激的时间。造模成功后将模型组分为1)CUMS模型组(溶剂Veh+CUMS)、2)槲皮素组(5.0mg/kg+CUMS)、3)金丝桃苷组(5.0mg/kg+CUMS)、4)山柰酚组(7.0mg/kg+CUMS)、5)异槲皮苷组(6.0mg/kg+CUMS)、6)组合物组高剂量组(槲皮素5.0mg/kg+金丝桃苷5.0mg/kg+山柰酚7.0mg/kg+异槲皮苷6.0mg/kg)、7)组合物组低剂量组(槲皮素2.5mg/kg+金丝桃苷2.5mg/kg+山柰酚3.5mg/kg+异槲皮苷3.0mg/kg)，每组10只小鼠。给药4周后进行行为学测试。

所有药物均采用0.5％羧甲基纤维素钠溶液溶解配制，除正常对照组和CUMS组小鼠给予0.5％羧甲基纤维素钠溶液外，其余给予相应药物，采取灌胃给药方式，给药体积为0.1ml/10g体重。

4.实验方法

4.1糖水偏爱实验

实验前，小鼠训练适应1％(w/v)糖水：每笼放置两瓶1％糖水溶液，24h后其中一瓶1％糖水换成纯水，放置24h。适应后，小鼠禁水禁食24h，进行糖水偏爱实验。实验中，每只小鼠自由饮用两瓶水，一瓶为25ml 1％糖水，另一瓶为25ml纯水，实验开始之前称量每瓶水的重量。2h后，测量剩余的重量，得出糖水和纯水的消耗量(g)。用糖水消耗量与总液体消耗量(糖水消耗量+纯水消耗量)之比表示糖水偏爱度，该实验贯穿于实验的整个过程。

4.2敞箱实验

敞箱实验主要用于测试小鼠自发活动能力以排除药物中枢兴奋作用干扰实验结果。实验在一个底部为25cm×25cm，高为20cm的黑色木箱中进行，底面为25个正方格。给药后1h，小鼠放入中央方格，适应5min，拿出。每换一只小鼠，用75％酒精擦洗一遍以去除前一只小鼠残留气味的影响。评价试验给药1h，摄像记录5min内小鼠穿越格子数(四爪均进入方格内方可计数，为水平运动得分)、后肢直立次数(两前爪腾空或攀附箱壁，为垂直运动得分)。

4.3悬尾实验

用胶布将小鼠尾(距尾尖1cm处)粘住后固定于悬尾支架上，使小鼠成倒悬体位，两侧以隔板挡开小鼠视线，使之不互相干扰。摄像记录5min内小鼠的累计不动时间。小鼠“不动”的判定标准为停止挣扎，身体呈垂直倒悬状态，静止不动。

4.4强迫游泳实验

将小鼠逐一放入高20cm、直径12cm、水深10cm的圆形游泳缸中进行强迫游泳6min，摄像记录后4min小鼠的累计不动时间。小鼠“不动”的判定标准为在水中停止挣扎，呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动以保持头部漂浮水面。4.5ELISA检测小鼠血清皮质酮和促肾上腺皮质激素的水平

小鼠行为学实验结束后摘眼眶内静脉采血，抗凝管中静置10min后，8500r/min离心15min，分离血清，-80℃冰箱保存备用。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测小鼠血清中皮质酮(Cort)和促肾上腺皮质激素(ACTH)水平。

5.数据分析及统计

用SPSS软件分析数据，方差分析(One-Way ANOVA)。经方差齐性检验，若方差齐性则组间两两比较采用Bonferronic法；若方差不齐将采用Welch法进行分析，多重比较采用Dunnett’s T3法。P＜0.05为存在显著性差异，具有统计学意义。

6.实验结果

6.1 CUMS小鼠糖水偏爱实验

结果见图1。

与正常对照组比较，模型组(Veh+CUMS)小鼠糖水偏爱度显著降低(P<0.001)，说明小鼠抑郁造模成功。与模型组比较，组合物高、低剂量连续灌胃给药后均显著升高小鼠糖水偏爱度(分别的，P<0.001,P<0.01)，而槲皮素(5.0mg/kg)、金丝桃苷(5.0mg/kg)、山柰酚(7.0mg/kg)和异槲皮苷(6.0mg/kg)各组虽然能一定程度上提高CUMS小鼠的糖水偏爱度，但作用均无统计学意义(P＞0.05)。与各单体化合物组比较，组合物高、低剂量升高CUMS小鼠糖水偏爱度的作用具有统计学意义(P<0.05)。该结果提示，在蔗糖饮水实验上，设定剂量的槲皮素、山柰酚、金丝桃苷和异槲皮苷没有抗抑郁作用，组合物高、低剂量有显著抗抑郁作用。因此，在蔗糖饮水实验上，组合物有优效抗抑郁作用，作用显著强于各单体化合物。

6.2 CUMS小鼠敞箱实验

结果见图2。

与正常对照组比较，模型组小鼠在敞箱实验中水平活动次数和垂直活动次数均显著性减少(P<0.001)，提示抑郁症模型建立成功，自主活动减少。与模型组比较，组合物高低剂量、各单体化合物均能显著性增加小鼠的水平活动次数(P<0.05)，但组合物的效果更加显著(P<0.001)(见图2A)；组合物高、低剂量能显著性增加小鼠的垂直活动次数(P<0.05)，而各单体增加小鼠垂直活动次数的作用不显著(见图2B)。与各单体化合物比较，组合物高、低剂量增加小鼠水平活动次数和垂直活动次数的作用都具有统计学意义(P<0.05)。该结果提示，组合物在敞箱实验上抗抑郁作用明显优于各单体化合物。

6.3 CUMS小鼠悬尾实验

结果见图3。

与正常对照组比较，模型组小鼠在悬尾实验中不动时间显著性增加(P<0.001)，说明造模成功，CUMS小鼠出现抑郁样症状。

与模型组比较，组合物高、低剂量和金丝桃苷连续给药均能显著性减少悬尾不动时间(分别为P<0.01，P<0.05)；其它各单体药物虽然能够减少小鼠的悬尾不动时间，但是与模型组比较没有显著性差异(P＞0.05)。与金丝桃苷组相比，组合物高、低剂量组减少CUMS小鼠悬尾不动时间作用更大，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

该结果提示，组合物在小鼠悬尾实验上抗抑郁作用明显优于各单体化合物。

6.4 CUMS小鼠强迫游泳实验

结果见图4。

与正常对照组比较，模型组小鼠在强迫游泳实验中不动时间极显著性增加(P<0.001)，说明造模成功，CUMS小鼠出现抑郁样症状。

与模型组比较，组合物高、低剂量连续给药均能显著性减少强迫游泳不动时间(分别的，P<0.001，P<0.01)；其它单体药物虽然能够减少强迫游泳不动时间，但是与模型组比较没有统计学差异(P＞0.05)。与各单体化合物比较，组合物高、低剂量减少CUMS小鼠不动时间作用更大，差异具有统计学意义(P<0.05)。

该结果提示，组合物在小鼠强迫游泳实验上抗抑郁作用明显优于各单体化合物。

6.5 CUMS小鼠血清皮质酮和促肾上腺皮质激素的水平

结果见图5。

与正常对照组相比，模型组小鼠血清皮质酮水平极显著升高(P<0.001)；与模型组比较，组合物高、低剂量均能极显著或显著性减少血清皮质酮(分别为P<0.001，P<0.01)；其它各单体药物虽然能够降低血清皮质酮水平，但是与模型组比较没有显著性差异(P＞0.05)。与各单体化合物组相比，组合物高、剂量减少CUMS小鼠血清皮质酮更为显著，差异具有统计学意义(P<0.05)(见图5的左侧)。

与正常对照组相比，模型组小鼠血清皮质酮水平极显著升高(P<0.001)；与模型组相比，组合物高、低剂量能显著降低促肾上腺素皮质激素的水平(P＜0.01)，其它各单体药物虽然能够降低促肾上腺素皮质激素水平，但是与模型组比较没有显著性差异(P＞0.05)与各单体化合物组相比，组合物高、剂量减少CUMS小鼠血清皮质酮更为显著，差异具有统计学意义(P<0.05)(见图5的右侧)。

该结果提示，组合物降低抑郁小鼠血清中皮质酮和促肾上腺皮质激素的作用显著优于各单体化合物。

6.6结论

在本实施例中，以慢性温和不可预测应激(CUMS)成功建立小鼠抑郁模型。在此基础上考察了本发明的组合物和组成所述组合物的各单体化合物对小鼠行为学和生化指标的影响。结果显示，本发明的组合物高、低剂量能够完全逆转抑郁小鼠的各项行为，包括糖水偏爱、自主运动次数、悬尾不动时间和强迫游泳不动时间；而且能够降低抑郁引起的血清皮质酮和促肾上腺皮质激素水平。与此相对的，除了金丝桃苷(5.0mg/kg)在某几项指标上显示出一定的抗抑郁作用外，其它的槲皮素(5.0mg/kg)、山柰酚(7.0mg/kg)和异槲皮苷(6.0mg/kg)都没有表现出抗抑郁作用。因此，本发明的组合物具有确切的抗抑郁作用，且高、低剂量作用均强于平行剂量的各个单体化合物。这也说明，各个组分之间存在协同作用，而非简单的作用叠加。

总之，本发明提供了一种新的具有显著抗抑郁的组合物，从而有望为临床治疗抑郁症提供了一种的新选择。而且组成本发明组合物的各单体化合物的安全性好，鲜有毒副作用的报道，尤其适合需要长期服药的抑郁症患者。

Claims (6)

1.一种用于治疗抑郁症的组合物，所述组合物由槲皮素，金丝桃苷，山柰酚和异槲皮苷组成，各组分的重量份为：

槲皮素1～12重量份，金丝桃苷2～12重量份，山柰酚2～10重量份，异槲皮苷为1～8重量份。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，各组分的重量份为：

槲皮素5重量份，金丝桃苷5重量份，山柰酚3～7重量份，异槲皮苷6重量份。

3.一种用于抗抑郁症的药物组合物，包括权利要求1或2所述的组合物，且权利要求1或2所述的组合物作为唯一活性成分。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可以接受的辅料。

5.根据权利要求3或4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为临床上可以接受的口服制剂或非口服制剂；

所述口服制剂选自散剂、普通口服片剂、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、滴丸剂、微丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆剂和口腔速溶膜剂中的一种或多种；

所述非口服制剂选自注射剂、冻干粉针和大容量输液剂中的一种或多种。

6.权利要求3至5中任一项所述的药物组合物的制备方法，包括按照重量份取槲皮素、金丝桃苷、山柰酚和异槲皮苷，加入或不加入药学上可以接受的辅料，按照本领域常规的方法，制备成临床上可以接受的制剂。

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