CN106606501B - 连翘苷元在制备预防或治疗系统性红斑狼疮药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明请求保护连翘苷元用于制备预防或治疗系统性红斑狼疮药物的用途，属于医药领域。本发明所述连翘苷元为从传统中药连翘中提取得到的中药单体，动物试验显示，其对于系统性红斑狼疮具有很好的治疗效果，且其治疗系统性红斑狼疮的效果显著优于连翘提取物和连翘苷。连翘苷元治疗系统性红斑狼疮作用疗效确切、副作用低，有广阔的医疗应用前景。

Description

连翘苷元在制备预防或治疗系统性红斑狼疮药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种连翘苷元的医药用途，具体涉及连翘苷元在制备预防或治疗系统性红斑狼疮药物中的医药用途。

背景技术

系统性红斑狼疮(SLE)是一种严重危害人类健康的自身免疫性疾病，在我国人群的患病率接近千分之一，全国患病总人数高达100万。迄今为止，国内外尚无特异的有效治疗手段。

系统性红斑狼疮(SLE)是一种临床表现复杂多样，累及多系统、多脏器的自身免疫性疾病。其病因目前仍不完全清楚，可能是在遗传因素的基础上，受环境因素刺激，促发异常的免疫应答，持续产生大量的致病性自身抗体和免疫复合物，免疫复合物广泛沉积于组织器官，从而引发相应的病理损害。SLE的免疫应答异常可以出现在多个方面和多个水平，并与许多细胞因子密切相关。自身免疫系统调节功能失调、细胞因子网络失衡是SLE及狼疮性肾炎(LN)发生、发展的重要因素。

系统性红斑狼疮目前尚无根治办法，很多患者需要长期甚至终身治疗。西医治系统性红斑狼疮多采用激素的疗法，激素治系统性红斑狼疮具有卓著的疗效，但激素具有相当大的副作用，长期大量的使用激素不利于患者的身心健康，不仅如此，激素的减停极有可能导致病情加重。中医治系统性红斑狼疮多采用中药调剂的办法，中药调剂治系统性红斑狼疮虽具有卓著疗效，但疗效仅停留在缓解症状侧面上，很难从根本上对系统性红斑狼疮进行治疗，中医治系统性红斑狼疮是一个长期的过程，一般坚持治疗半年后才看到疗效。因此，目前系统性红斑狼疮的治疗方法都存在一定局限性。因此，寻找一种新的有效药物来治疗系统性红斑狼疮患者有非常重要的意义。

连翘，又名旱莲子(《药性论》)、大翘子(《新修本草》)，为木犀科植物连翘Forsythia suspense(Thunb.Vahl)的干燥果实。味苦微寒，归肺、心、小肠经，具有清热解毒、消肿散结的功效，主治痈疽、乳痈、丹毒、风热感冒、湿病初起、高热烦渴、神昏发斑、热淋尿闭。连翘的化学成分复杂多样，其中主要是苯乙醇及其苷、C₆-C₂天然醇、木脂素，此外还有黄酮、五环三萜、生物碱等。

连翘苷元(phillygenin)为从木犀科植物连翘中提取的木脂素类化合物单体。1977年，Nishibe Sansei等人分离得到phillyrin连翘苷，phillygenin连翘苷元，(+)-pinoresinol右旋松脂酚(NISHIBEI S,CHIBA M,HISADA S.Studies on the ChineseCrude Drug“Forsythiae Fructus”I.Constituents of Forsythiae Fruits on theMarket[J].Yakugaku Zassh,i 1977,97(10):1134-1137.)。药理实验研究表明连翘苷元具有多种药理活性。

Chen CC等研究了从连翘果实中提取分离得到的连翘苷元对低密度脂蛋白氧化抑制作用，结果表明，连翘苷元的抗氧化潜力比对照组(普罗布考)更强，是普罗布考的7.9倍，且有后遗效应，给药3h之后，仍保留71％的抑制活性(Chen CC，Chen HY，Shiao MS，eta1.Inhibition of low density lipoprotein oxidation by tetrahydrofurofuranlignans from Forsythia suspense and Magnolia coco[J].Planta Med，1999，65:709)。毛威通过MTT比色法研究了连翘苷、连翘苷元、表松脂素对人胃癌细胞株SGC7901的生长抑制作用，结果发现连翘苷元和表松脂素对人胃癌细胞株SGC7901的生长有一定的抑制作用，而连翘苷的抑制作用不明显(毛威.连翘化学成分及其抗肿瘤活性的研究[D].武汉：湖北中医学院，2009)。中国专利申请CN101537046A公开了一种连翘苷元的制备方法，并公开了连翘苷元的降血脂和抗氧化活性。

发明内容

本发明提供了一种新的预防或治疗系统性红斑狼疮的药物，该药物以连翘苷元为药物活性成分。连翘苷元为从中药连翘中提取的一种中药单体，现有技术表明其具有多种治疗活性，因此本发明涉及连翘苷元的一种新的医药用途，即连翘苷元在制备预防或治疗系统性红斑狼疮药物中的用途。

本发明所述的连翘苷元在制备预防或治疗系统性红斑狼疮药物中的用途。本发明药效实施例显示，连翘苷元对于系统性红斑狼疮均具有很好的治疗效果，对狼疮鼠尿蛋白、血 清抗ds-DNA抗体水平、生化指标及肾脏病理改变有不同程度的改善。连翘苷元用于系统性红斑狼疮动物模型的治疗时效果优于连翘苷或连翘提取物。

上述所述的医药用途中，连翘苷元可以制备成合适的药物剂型口服给药或注射给药，其适用对象可以为人或其他恒温动物。当适用对象为人时，连翘苷元的用量优选为0.001mg/kg·d～50mg/kg·d，进一步优选为0.01mg/kg·d～10mg/kg·d。对于本发明预防或治疗系统性红斑狼疮的药物的给药时间和给药次数需要根据病情的具体诊断结果而定，这在本领域技术人员掌握的技术范围之内。例如，将对小鼠预防或治疗系统性红斑狼疮的治疗方案应用于人身上，所用药物对人的有效剂量可以通过该药物对小鼠的有效剂量进行换算，这对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。

上述所述的医药用途中，根据动物病情以及用药部位可以将连翘苷元制备成合适的药物制剂以方便用药，如连翘苷元可以开发成口服制剂、舌下含服制剂或注射制剂方便患者的使用，其中所述口服制剂可以为片剂、胶囊剂或微乳制剂，优选为片剂；所述舌下含服制剂为含有连翘苷元并适用舌下给药的药物制剂，优选为其舌下含片；所述注射制剂可以为其注射液、注射微乳等，优选为注射液。当连翘苷元制备成注射液时，药物可接受的载体可以为注射用水、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸、甘油、乙醇、丙二醇等。上述所述连翘苷元注射液还可以根据药物的性质加入适宜的附加剂，如渗透压调节剂、pH值调节剂、增溶剂、治疗氧剂、抑菌剂、乳化剂、助悬剂等，其中所述增溶剂为聚乙二醇400、吐温-80中的任意一种或两种。

上述药物制剂的制备方法均可采用本领域技术人员制备该种剂型常规使用制备方法制得。上述药物制剂中，每一制剂单位中含有连翘苷元的含量为0.001mg～50mg。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

1、本发明所述的连翘苷元具有显著的预防或治疗系统性红斑狼疮的作用。本发明实施例显示本发明的连翘苷元对系统性红斑狼疮具有显著的治疗作用。本发明的实施例显示本发明的连翘苷元对上述疾病的治疗效果优于连翘提取物和连翘苷。

2、本发明所述连翘苷元是从传统中药连翘中提取得到的天然中药单体，其对人体毒副作用低，可以显著提高患者的用药安全性和用药依从性，进而大幅度改善了系统性红斑狼疮患者的治疗效果和生活质量。

具体实施方式

为了使本领域技术人员充分了解本发明，以下通过具体的实施例进一步说明本发明， 但本领域技术人员应该知晓，本发明实施例并不以任何方式限制本发明。

实施例1连翘苷元注射液

制备工艺：将处方量的丙二醇和乙醇混合均匀，加入连翘苷元，搅拌溶解，加入处方量的0.9％氯化钠溶液，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。

实施例2连翘苷元注射液

制备工艺：向处方量的PEG-400加入连翘苷元，搅拌溶解，加入0.9％氯化钠溶液至10L，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。

实施例3连翘苷元注射液

制备工艺：将处方量的乙醇和吐温-80混合均匀，加入连翘苷元，搅拌溶解，加入注射用水至10L，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。

实施例4连翘苷元注射液

连翘苷元 0.01g

乙醇 3.3L

注射用水 加至10L

制备工艺：将处方量的乙醇加入连翘苷元，搅拌溶解，加入注射用水至10L，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。

实施例5片剂的制备

制备工艺:将连翘苷元和辅料微晶纤维素、羧甲基淀粉钠混合均匀，加入适量的淀粉浆制软材，然后过16目筛制粒。湿颗粒在60℃干燥，干颗粒过20目筛整粒，筛出干粒中的细粉，与硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混匀，压片，每片约200mg，即得。

实施例6连翘苷元舌下含片

制备工艺：上述组分烘干、粉碎过筛预处理后混匀直接压片制得。

实施例7连翘苷元舌下含片

制备工艺：将主药及各辅料成分烘干、粉碎过筛预处理，将主药与糖分、乳糖、羧甲基纤维素钠混匀，以纯水作为粘合剂将混匀的物料制备软材，过20目筛制粒并于60℃下干燥制备干颗粒，将硬脂酸镁加入到上述干颗粒总混，压片即得。

实施例8微乳浓缩物

制备工艺：称取处方量中链脂肪酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油EL-40、1，2-丙二醇、无水乙醇，混合后搅拌均匀，然后加入连翘苷元溶解，也可以超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，即为连翘苷元微乳浓缩物。上述微乳浓缩物可进一步稀释用于注射或口服。

实施例9微乳浓缩物

制备工艺：称取处方量PEG-2-硬脂酸酯、吐温-20、1-己醇、PEG3350混合后搅拌均匀，然后加入连翘苷元溶解，也可以超声波处理以加速溶解，得澄清浓缩液，即为连翘苷元微 乳浓缩物。上述微乳浓缩物可以根据用药需要进行进一步稀释用于患者注射给药或口服给药。

实施例10连翘苷元对MRL/lpr狼疮鼠作用的实验研究

1.动物分组及给药

MRL/lpr狼疮样小鼠，SPF级，50只，雌性，20周龄，体重(35.6±6.2)g；C57BL/6小鼠，10只，雌性，8周龄，体重(21.5±1.5)g。

MRL/lpr狼疮样小鼠按体重随机分为5组，每组10只，分别为模型对照组、连翘提取物组(按照专利申请CN101085043B实施例2制备工艺制备得到连翘提取物)、连翘苷组、连翘苷元低剂量组、连翘苷元高剂量组。

各组分别给予下述药物：

C57BL/6组(正常对照组):等体积的生理盐水，灌胃给药

模型对照组：等体积的生理盐水，灌胃给药

连翘提取物组：30mg/kg连翘提取物，灌胃给药

连翘苷组：30mg/kg连翘苷，灌胃给药

连翘苷元低剂量组：0.1mg/kg连翘苷元，灌胃给药

连翘苷元高剂量组：2.5mg/kg连翘苷元，灌胃给药

连续饲养用药50d。给药期间仔细观察小鼠的一般情况。实验前(0d)、实验中(25d)和结束时(50d)分3次取眼眶后静脉血，留取血清冻存备测抗ds-DNA抗体；用代谢笼每次收集24h尿液，用于24h尿蛋白定量测定。实验结束后予以麻醉处死动物，取小鼠右肾，用4％甲醛固定，用于组织病理学检查。

2.实验方法及数据处理

2.1给药期间观察小鼠的一般情况，如小鼠的食欲、毛发的变化、活动等。

2.224h尿蛋白质定量测定：治疗前、中、后3次分别用代谢笼收集24h小鼠的尿液，用考马斯亮蓝染色法测定尿液中蛋白质的量。

2.3外周血抗ds-DNA抗体的检测采用酶联免疫吸附分析(ELISA)法，按照说明书操作。

2.4肾脏病理4％甲醛固定的肾组织，常规脱水、石蜡包埋，切片厚2～4μm，行HE染色，封片，光学显微镜下观察肾脏病理形态。Leica光学显微镜观察。在200倍视野下观察、测量。病理观察及半定量评分标准参照有关报道(任强，岑国栋，高永翔.雷公藤多苷诱导大鼠肾细胞凋亡的NF-кB信号转导通路机制研究[J].成都中医药大学学报，2011，34(2): 39-44)。

1分：小球基底膜及间质轻度增生；小管上皮细胞轻度水肿，少量管型；小灶性坏死，少量炎细胞浸润；2分：小球基底膜及间质增生较明显；弥漫性小管上皮细胞中度水肿，较多管型；明显炎细胞浸润；3分；小球基底膜及间质明显增生；弥漫性小管上皮细胞重度水肿，大量管型；弥漫性炎细胞浸润。

2.5数据统计与分析

数据以表示，采用SPSS15.0软件进行方差分析。

3.结果与讨论

(1)一般情况观察

实验开始前，各组小鼠饮食、活动、体质量无差别，外表皮毛润泽。随着时间推移，各组小鼠皮毛渐变枯，并有脱落，状态不佳，体质量下降，腋下淋巴结肿大明显等。

干预治疗25d时，各组小鼠开始出现活动减少，迟缓，皮毛脱落逐渐增多，并出现死亡现象等。干预治疗50d后，动物死亡情况如下；模型对照组2只，连翘提取物组2只，连翘苷组2只，连翘苷元低剂量组1只。

(2)24h尿蛋白质定量比较

药物干预前各组小鼠24h尿蛋白质定量之间比较均无显著性差异；与C57BL/6对照组相比较均有显著性差异，说明造模成功。

连翘苷元各剂量组能够显著降低狼疮鼠24h尿蛋白质含量，与连翘提取物组相比，具有极显著性差异，表明连翘苷元治疗系统性红斑狼疮的效果优于连翘提取物。连翘苷元各剂量组能够显著降低狼疮鼠24h尿蛋白质含量，与连翘苷组相比，具有显著性或极显著性差异，表明连翘苷元治疗系统性红斑狼疮的效果优于连翘苷。见表1。

表1连翘苷元对MRL/lpr狼疮鼠24h尿蛋白质的影响

与模型对照组相比，^#P<0.05，^##P<0.01；

与连翘提取物组相比，^Ω<0.05，^ΩΩP<0.01；

与连翘苷组相比，^&P<0.05，^&&P<0.01。

(3)血清抗ds-DNA抗体水平比较

药物干预前各组小鼠血清抗ds-DNA抗体水平均无统计学差异，说明各组之间有可比性，与C57BL/6组相比有显著性差异，说明模型建立正确。

连翘苷元各剂量组能够显著降低血清抗ds-DNA抗体水平，与连翘提取物组相比，具有极显著性差异，表明连翘苷元治疗系统性红斑狼疮的效果优于连翘提取物。连翘苷元各剂量组能够显著降低血清抗ds-DNA抗体水平，与连翘苷组相比，具有极显著性差异，表明连翘苷元治疗系统性红斑狼疮的效果优于连翘苷。见表2。

表2连翘苷元对MRL/lpr狼疮鼠血清抗ds-DNA抗体水平的影响

与模型对照组相比，^#P<0.05，^##P<0.01；

与连翘提取物组相比，^Ω<0.05，^ΩΩP<0.01；

与连翘苷组相比，^&P<0.05，^&&P<0.01。

(4)小鼠肾脏病理变化

模型对照组呈现典型自发狼疮样肾炎的病理改变，可见毛细血管内皮细胞增生，大量的炎症细胞浸润，并有肉芽肿的形成，病变程度最为严重。连翘提取物组可见少数毛细血管内皮细胞轻度增生，部分毛细血管腔稍显狭窄，炎症细胞浸润以血管和血管壁较为明显；连翘苷组血管纤维素样坏死，肉芽肿形成，管周炎症细胞大量浸润，聚集成团；连翘苷元低剂量组少量血管周围炎症细胞浸润，小灶性聚集成团；连翘苷元高剂量组炎症细胞浸润，血管腔内红细胞渗出。各组MRL/lpr狼疮鼠的肾脏病理结果的具体数据见表3。

与模型对照组相比，连翘苷元给药组肾脏病理改变程度有所减轻，连翘提取物组、连翘苷组亦能减轻狼疮鼠的肾脏病理改变程度，连翘苷元减轻肾脏病理改变的效果优于连翘提取物、连翘苷。

表3连翘苷元对MRL/lpr狼疮鼠肾病理组织学半定量评分的影响

与模型对照组相比，^#P<0.05，^##P<0.01；

与连翘提取物组相比，^Ω<0.05，^ΩΩP<0.01；

与连翘苷组相比，^&P<0.05，^&&P<0.01。

实施例11连翘苷元对灭活的Con A活化淋巴细胞诱导SLE的治疗作用

系统性红斑狼疮(SLE)是一种多种因素互相作用下以T、B淋巴细胞异常活化产生大量自身抗体，临床表现多样，常造成多系统损害为特征的慢性自身免疫性疾病。患者体内产生大量的自身ANA,其中抗ds-DNA抗体及抗Sm抗体为该病的致病性抗体和主要血清学标志。随着病情的发展，这些自身抗体与抗原结合形成免疫复合物，沉积于肾小球基底膜和广泛小血管周围，引起肾小球肾炎和多系统受累。通过模拟自身抗体的产生过程，诱导试验动物产生自身抗体，可制备与人SLE发病机制和损伤极为相似的动物模型。

根据文献报道，活化的小鼠淋巴细胞作为自身抗原，免疫同系小鼠，均成功地诱导产生了包括IgG类抗dsDNA抗体在内的多种ANA，可制备SLE模型；未活化的淋巴细胞则不能够诱导机体产生自身抗体，故不能用于SLE模型的制备，活化使淋巴细胞核抗原发生了改变是诱导SLE的原因。本试验采用与文献报道相同的方法，通过提取并活化F0代Balb/c小鼠淋巴细胞皮下注射免疫F1代Balb/c小鼠成功构建了SLE模型。

1.动物分组及给药

8周龄Balb/c小鼠F0代雌雄各24只，用于F1代小鼠繁殖，购买于北京维通利华试验动物技术有限公司。

8周龄Balb/c小鼠F1代由本中心饲育组自F0代饲养繁殖，自繁殖的Balb/c小鼠F1代五组中选取雄30只、雌45只用于本试验。

共分五组(正常对照组、模型对照组、连翘苷元高剂量组、连翘苷元中剂量组、连翘苷元低剂量组)，雄30只，每组6只；雌45只，每组9只。

各组分别给予下述药物：

正常对照组:等体积的羧甲基纤维素，皮下注射

模型对照组：等体积的羧甲基纤维素，皮下注射

连翘苷元低剂量组：0.3mg/kg连翘苷元，皮下注射

连翘苷元中剂量组：1mg/kg连翘苷元，皮下注射

连翘苷元高剂量组：3mg/kg连翘苷元，皮下注射

共造模6次，前四次每周一次，后两次隔一周加强一次。每次于造模前两天，取F0代Balb/c小鼠8只(雌雄各4只)，收集胸腺、脾脏，分离淋巴细胞，刀豆蛋白活化48h，收集活化的淋巴细胞，0.3％戊二醛灭活，除正常对照组外，其余组别多点皮下注射所得灭活的Con A活化淋巴细胞，2*107/只。于第6次造模后给药2周，之后解剖取材，取血，300ul，加入抗凝管中，其余血液加入促凝管中，制备血清，血清保存于-20度冰箱。

2.实验方法及数据处理

2.124h尿蛋白质定量测定治疗前、中、后3次分别用代谢笼收集24h小鼠的尿液，用考马斯亮蓝染色法测定尿液中蛋白质的量。

2.2外周血抗ds-DNA抗体的检测采用酶联免疫吸附分析(ELISA)法，按照说明书操作。

2.3检测生化指标：测定尿素氮和肌酐。

3.结果与讨论

(1)血清抗ds-DNA抗体水平比较

模型组与正常组比较(P＝0.02)，说明试验造模成功。连翘苷元各剂量组能够显著降低血清抗ds-DNA抗体水平，表明连翘苷元对系统性红斑狼疮具有很好的治疗效果。试验结果见表1。

表1连翘苷元对灭活的Con A活化淋巴细胞诱导SLE小鼠血清抗ds-DNA抗体水平的影响

⁺与正常组比，⁺P<0.05，⁺⁺P<0.05；*与模型组比，*P<0.05，**P<0.01。

(2)24h尿蛋白质定量比较

连翘苷元各剂量组能够显著降低狼疮鼠24h尿蛋白质含量。见表2。

表2连翘苷元对灭活的Con A活化淋巴细胞诱导SLE小鼠24h尿蛋白质的影响

⁺与正常组比，⁺P<0.05，⁺⁺P<0.05；*与模型组比，*P<0.05，**P<0.01。

(3)生化相关指标统计

通过对生化指标的分析发现，连翘苷元可以提高SLE小鼠血液白蛋白水平，减少体内白蛋白的丢失。连翘苷元可以降低狼疮肾炎的尿素氮和肌酐水平，改善肾炎症状，改善SLE小鼠氮质血症。见表3。

表3连翘苷元对灭活的Con A活化淋巴细胞诱导SLE小鼠氮质血症的影响

⁺与正常组比，⁺P<0.05，⁺⁺P<0.05；*与模型组比，*P<0.05，**P<0.01。

本试验采用与文献报道相同的方法，通过提取并活化F0代Balb/c小鼠淋巴细胞皮下注射免疫F1代Balb/c小鼠成功构建了SLE模型。血常规、血生化、组织病理学等试验结果均符合人SLE及狼疮肾炎的临床表现。ELISA试剂盒检测血清中dsDNA抗体Ig G类抗双链DNA抗体，模型组明显升高，说明试验造模成功，用药后明显降低，说明药物可显著抑制机体自身抗体的产生。实验研究表明本发明的连翘苷元对系统性红斑狼疮具有很好的治疗作用。

Claims (6)

1.连翘苷元在制备预防或治疗系统性红斑狼疮药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述连翘苷元的人用给药量为0.001 mg/kg·d~50mg/kg·d。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述连翘苷元的人用给药量为0.01mg/kg·d~10mg/kg·d。

4.如权利要求1-3任一所述的用途，其特征在于所述连翘苷元制备为口服制剂、舌下含服制剂或注射制剂。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述连翘苷元的口服制剂、舌下含服制剂或注射制剂的每一制剂单位中连翘苷元的含量为0.001mg~50mg。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述口服制剂为片剂、胶囊剂或微乳制剂，所述注射制剂为注射液或注射微乳。