JP2020143146A

JP2020143146A - ＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互作用をターゲットとする、血液癌を治療するための組成物および方法

Info

Publication number: JP2020143146A
Application number: JP2020095230A
Authority: JP
Inventors: ウォン，シー・ワイ・ジーン; Y Jean Wang C; ディック，ジョン; Dick John; ダンスカ，ジェイン; Danska Jayne; ジン，リキン; Liqing Jin; テオチャリデス，アレクサンドレ; Theocharides Alexandre; ラジャクマー，スジーサ; Rajakumar Sujeetha
Original assignee: Hospital for Sick Children HSC; University of Health Network
Current assignee: Hospital for Sick Children HSC; University of Health Network
Priority date: 2009-05-15
Filing date: 2020-06-01
Publication date: 2020-09-10
Also published as: HUE065432T2; JP2016029043A; SI2429574T1; EP2429574B1; WO2010130053A1; JP6091891B2; US20240084399A1; JP2019011347A; CN107252476A; HRP20240362T1; PL2995315T3; JP2012526729A; PL2429574T3; EP4311863A2; EP4311863A3; AU2010246872B2; AU2010246872A1; EP2995315A1; JP6254124B2; DK2995315T3

Abstract

【課題】血液癌、特にヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するための薬剤の提供。【解決手段】血液癌を治療するために、ＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互作用を調節すること、およびそのための組成物を提供する。いくつかの態様において、血液癌、好ましくはヒト急性骨髄性白血病を治療するための方法、ならびにそのためのＳＩＲＰαポリペプチド、断片および融合タンパク質の使用を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、米国仮出願第６１／１７８，５５３号に優先権を請求する。
発明の分野
本発明は、血液癌、特にヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するために、ＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互作用をターゲットとすること、およびそのための化合物に関する。

造血幹細胞移植における移植失敗は、ヒト白血球抗原のドナー−宿主遺伝的同一性にかかわらず起こり、さらなる要因が移植を調節していることが示唆される。近年、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）異種移植モデルを用いて、ＮＯＤバックグラウンドが同等の免疫不全関連突然変異を持つ他の系統よりもより優れた造血移植を可能にすることが見出された（Ｔａｋｅｎａｋａ，Ｋ．らＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｉｎＳｉｒｐａｍｏｄｕｌａｔｅｓｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，１３１３−１３２３（２００７））。Ｓｉｒｐａアレルの多型が同定され、そして該多型が、分析したマウス系統間の移植の相違に関与していることが示された。ＮＯＤバックグラウンドは、ヒト移植に最適の支持を与えるが、Ｓｉｒｐａの他の多型を持つマウス（すなわち、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄｌ３．ＳＣＩＤ）には移植不能である。マウスおよびヒトにおいて、ＳｉｒｐａはリガンドＣＤ４７と相互作用するＳＩＲＰαタンパク質をコードする。造血系において、ＳＩＲＰαは主に、マクロファージ、樹状細胞、および顆粒球上で見出されるが、ＣＤ４７は、大部分の造血細胞上に存在する（Ｍａｔｏｚａｋｉ，Ｔ．，Ｍｕｒａｔａ，Ｙ．，Ｏｋａｚａｗａ，Ｈ．＆Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｈ．ＦｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｔｈｅＣＤ４７−ＳＩＲＰａｌｐｈａｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ．ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．１９，７２−８０（２００９））。ネズミＳｉｒｐａアレルは、ＣＤ４７と相互作用する細胞外免疫グロブリンＶ様ドメインにおいて、非常に多型性である。３７の関連しない正常ヒト対照の配列を決定し、そして４つの多型が同定されたことから、Ｓｉｒｐａアレルが、マウスにおけるように、ヒトにおいて多型性であることが示唆される（Ｔａｋｅｎａｋａら、上記）。

多くの研究によって、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）クローンは、階層的に組織され、そして白血病開始細胞（ＡＭＬ−ＬＳＣ）によって維持されることが示されてきている（Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｃ．＆Ｄｉｃｋ，Ｊ．Ｅ．Ｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓ：ｌｅｓｓｏｎｓｆｒｏｍｌｅｕｋｅｍｉａ．ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５，４９４−５０１（２００５））。しかし、ＡＭＬ−ＬＳＣの運命を支配する分子制御因子に関してはほとんど知られていない。ＣＤ４７は、大部分のヒトＡＭＬ試料において発現されているが、白血球性芽球上の発現レベルは多様である。ＣＤ４７発現は、正常ＨＳＣに比較して、ヒトＡＭＬＬＳＣ上でより高い（Ｍａｊｅｔｉ，Ｒ．ら，ＣＤ４７ｉｓａｎａｄｖｅｒｓｅｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｆａｃｔｏｒａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｙｔａｒｇｅｔｏｎｈｕｍａｎａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ１３８，２８６（２００９））。より高いＣＤ４７発現は、ＡＭＬにおいて、独立の劣った予後因子であることが示されてきている（Ｍａｊｅｔｉら、上記）。ヒトＡＭＬを移植された免疫不全マウスを、ＣＤ４７に対して向けられたモノクローナル抗体を用いて処置すると、ネズミ骨髄における白血病性移植の減少が生じる（Ｍａｊｅｔｉら、上記）。しかし、ＣＤ４７はまた、ＳＩＲＰγにも、そしてインテグリンβ３サブユニットにも結合するため、この影響がＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用の破壊を通じて特に仲介されているかどうかは、明らかでない（Ｍａｔｏｚａｋｉら、上記）。

Ｔａｋｅｎａｋａ，Ｋ．らＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｉｎＳｉｒｐａｍｏｄｕｌａｔｅｓｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，１３１３−１３２３（２００７）Ｍａｔｏｚａｋｉ，Ｔ．，Ｍｕｒａｔａ，Ｙ．，Ｏｋａｚａｗａ，Ｈ．＆Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｈ．ＦｕｎｃｔｉｏｎｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｔｈｅＣＤ４７−ＳＩＲＰａｌｐｈａｓｉｇｎａｌｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ．ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．１９，７２−８０（２００９）Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｃ．＆Ｄｉｃｋ，Ｊ．Ｅ．Ｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓ：ｌｅｓｓｏｎｓｆｒｏｍｌｅｕｋｅｍｉａ．ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ．１５，４９４−５０１（２００５））Ｍａｊｅｔｉ，Ｒ．ら，ＣＤ４７ｉｓａｎａｄｖｅｒｓｅｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｆａｃｔｏｒａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｔｉｂｏｄｙｔａｒｇｅｔｏｎｈｕｍａｎａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ１３８，２８６（２００９）

１つの側面にしたがって、ヒトＳｉｒｐαおよびヒトＣＤ４７の間の相互作用を調節する工程を含む、血液癌を治療するための方法を提供する。好ましくは、ヒトＳｉｒｐαおよびヒトＣＤ４７の間の相互作用は、ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインへの結合が可能なポリペプチドの療法的有効量を投与することによって調節される。

さらなる側面にしたがって、血液癌を治療するための化合物の使用であって、該化合物が、ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインに結合することによって、ヒトＳｉｒｐαおよびヒトＣＤ４７の間の相互作用を調節可能なポリペプチドを含む、前記使用を提供する。

さらなる側面にしたがって、血液癌を治療するための薬剤調製における化合物の使用であって、該化合物が、ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインに結合することによって、ヒトＳｉｒｐαおよびヒトＣＤ４７の間の相互作用を調節可能なポリペプチドを含む、前記使用を提供する。

好ましい側面において、ポリペプチドは、可溶性ヒトＳｉｒｐα、またはそのＣＤ４７結合性断片を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドはヒトＳｉｒｐαの細胞外ドメインである。

１つの態様において、ポリペプチドはＳｉｒｐα−Ｆｃ融合タンパク質であり、そして好ましくは配列番号１３である。
さらなる側面にしたがって、ヒトにおいて、血液癌に対する生存に影響を及ぼす遺伝子多型を決定する方法であって：
ａ）血液癌を有する複数のヒト由来のＳｉｒｐα遺伝子を配列決定し；
ｂ）複数のヒト内のＳｉｒｐα遺伝子のヌクレオチド相違を決定し；そして
ｃ）生存とヌクレオチド相違を相関させて、関連多型を決定する
工程を含む、前記方法を提供する。

さらなる側面において、血液癌に対する生存の可能性を予後決定する方法であって：
ａ）レシピエント由来のＳｉｒｐα遺伝子を配列決定し；そして
ｂ）本明細書に記載する関連多型が存在するかどうかを決定する
工程を含む、前記方法を提供する。

いくつかの態様にしたがって、ヒトＳｉｒｐαおよびヒトＣＤ４７の間の相互作用を調節可能なポリペプチドは：
ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のＣＤ４７結合性断片からなるポリペプチドであって、該断片が、配列番号１の残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６の少なくとも１つを含む、前記ポリペプチド；および
ｃ）ポリペプチドの長さ７アミノ酸ごとに、最大１つのアミノ酸挿入、欠失または置換を含む、ａ）およびｂ）のポリペプチドの１つのＣＤ４７結合性変異体であって、配列番号１の残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６の少なくとも１つを含む、前記変異体からなる群より選択される。

別の態様にしたがって、ヒトＳｉｒｐαおよびヒトＣＤ４７の間の相互作用を調節可能なポリペプチドは：
ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列のＣＤ４７結合性断片からなるポリペプチド；および
ｃ）ポリペプチドの長さ７アミノ酸ごとに、最大１つのアミノ酸挿入、欠失または置換を含む、ａ）およびｂ）のポリペプチドの１つのＣＤ４７結合性変異体；
ここで：
ｉ．ポリペプチドにおいて、配列番号２の３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６位の残基の少なくとも１つが、配列番号１の対応する残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６で置換されているか；または
ｉｉ．ポリペプチドにおいて配列番号２の残基１２９および１３０の少なくとも１つが欠失している
からなる群より選択される。

別の態様にしたがって、ヒトＳｉｒｐαおよびヒトＣＤ４７の間の相互作用を調節可能なポリペプチドは：
ａ）配列番号４〜７からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号４〜７からなる群より選択されるアミノ酸配列のＣＤ４７結合性断片からなるポリペプチド；および
ｃ）ポリペプチドの長さ７アミノ酸ごとに、最大１つのアミノ酸挿入、欠失または置換を含む、ａ）およびｂ）のポリペプチドの１つのＣＤ４７結合性変異体
からなる群より選択される。

さらなる側面にしたがって、血液癌、好ましくは白血病、そしてさらに好ましくはヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療するための薬学的組成物であって、有効量の本明細書記載のポリペプチドおよび薬学的に許容されうるキャリアーを含む、前記薬学的組成物を提供する。

好ましい側面において、血液癌は、好ましくは、ＣＤ４７＋提示癌細胞または腫瘍を含
む。

本発明の好ましい態様のこれらの特徴および他の特徴は、付随する図への参照が行われる、以下の詳細な説明において、より明らかであろう：
図１は、ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３遺伝子座を所持するＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤ）が、ヒトＡＭＬ−ＬＳＣによる再増殖を支持しないことを示す。Ｙ軸は、４人の患者由来の初代ＡＭＬ細胞を注射した７〜８週後、ＮＯＤ．ＳＣＩＤ（ＮＳ）およびＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤ（Ｉｄｄ）マウスの注射右大腿（ＲＦ）、非注射部位の骨髄（ＢＭ）、または脾臓（Ｓｐｌ）におけるヒト移植の割合を示す。３ｘ１０^６細胞を、静脈内（ＩＶ）または大腿内（ＩＦ）注射のいずれかによって、各マウス内に導入した。同じ患者試料を移植されたマウスを同じ形の記号で示す。図２（Ａ）は、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤマウスにおけるＡＭＬ細胞のホーミング欠陥を示す。致死量以下で照射したＮＯＤ．ＳＣＩＤおよびＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤ（ＩＤＤ）マウスに初代ＡＭＬ細胞をｉ．ｖ．注射した１６時間後のＢＭまたは脾臓における、フローサイトメトリーによって決定されるヒトＣＤ４５＋移植の割合。各ドット、正方形または三角形は、単一のマウスに相当する。バーは平均±ＳＥＭを示す。図２（Ｂ）は、ＡＭＬ−ＬＳＣ機能が、自然免疫細胞によって抑制されていることを示す。抗ネズミＣＤ１２２抗体で前処置したＮＯＤ．ＳＣＩＤまたはＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤ（ＩＤＤ）マウス内に、異なる白血病サブタイプおよび細胞遺伝学的マーカーを持つ１０人のＡＭＬ患者由来の初代細胞をｉ．ｆ．移植した。７〜８週後、注射右大腿（ＲＦ）、非注射骨髄（ＢＭ）、または脾臓（ＳＰ）におけるヒト移植の割合を決定した（Ｙ軸）。未処置マウスに比較して（図１）、ＩＤＤマウスにおける白血病性移植の抑制は、抗ＣＤ１２２での前処置によって減少する。図３は、マウス異種移植中のヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の移植に対するマウス自然免疫の影響を示す。Ａ）ＮＯＤ．ＳＣＩＤまたはＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤにおけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージ（Ｍφ）集団の調節。マウスＮＫ細胞およびマクロファージの表面表現型を示す。図３は、マウス異種移植中のヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の移植に対するマウス自然免疫の影響を示す。Ｂ）マクロファージ枯渇後のＮＯＤ．ＳＣＩＤまたはＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤ（Ｉｄｄ）におけるヒトＡＭＬ細胞の移植。図は採取した臓器中のヒト白血病細胞の割合を示す。図４は、ヒトＡＭＬ細胞に関するｉｎｖｉｔｒｏ食作用アッセイを示す。Ａ）ＣＦＳＥ標識ヒトＡＭＬ細胞をＮＯＤ．ＳＣＩＤまたはＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤマウス・マクロファージと同時インキュベーションした。２時間後、マクロファージを採取し、そしてフローサイトメトリーによって、ＣＦＳＥに関して陽性であるＦ４／８０＋マウス・マクロファージの割合を決定した。Ｂ）蛍光活性化細胞分取によってＣＦＳＥ＋／Ｆ４／８０＋細胞を分取し、そして共焦点顕微鏡を用いて視覚化した。Ｃ）マクロファージにおいてアクチン重合を阻害することによって食作用を阻害するサイトカラシンＤで、共培養を前処理した。Ｄ）示すように、未処理またはサイトカラシンＤ処理ＣＦＳＥ＋／Ｆ４／８０＋マウス・マクロファージにおけるヒトＣＤ４５の発現。図５は、ヒトＳＩＲＰα（Ｖ２）融合タンパク質のｉｎｖｉｔｒｏプレインキュベーションが、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス骨髄（ＢＭ）および脾臓内への初代ＡＭＬ細胞のホーミングを遮断することを示す。Ａ）ネズミ抗ヒト抗体を用いたフローサイトメトリーによって、ＢＭおよび脾臓におけるヒトＣＤ４４＋ＡＭＬ細胞の割合を測定した。各記号は、異なるマウスに相当する。Ｂ）［回収されたＡＭＬ細胞総数］／［注射されたＡＭＬ細胞総数］ｘ１００として、ＮＯＤ．ＳＣＩＤＢＭおよび脾臓へのＡＭＬ細胞のホーミング効率を計算した。図６は、ヒトＳｉｒｐα融合タンパク質（ｈＳｉｒｐα−Ｆｃ）でのｉｎｖｉｔｒｏ処理が、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおける初代ＡＭＬ細胞の再増殖能を減少させることを示す。バーは、ｈＣＤ４５＋細胞の平均割合を示す。図７は、ｉｎｖｉｖｏヒトＳｉｒｐα融合タンパク質（ｈＳｉｒｐα−Ｆｃ）処置が、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおける初代ＡＭＬ細胞の移植を減少させることを示す。染色細胞をフローサイトメトリーによって分析して、ｈＣＤ４５＋細胞の割合に基づいて、各マウスにおける移植レベルを決定した。バーは、各群におけるｈＣＤ４５＋ヒト細胞の平均割合を示す。示すＰ値は、ＰＢＳ処置に比較したｈＳｉｒｐα−Ｆｃ処置に関するものである。図８は、ＷＯ０９／０４６５４１に開示されるネズミＳＩＲＰαのタンパク質配列並列を例示する。ＢＭ由来マクロファージから調製したｃＤＮＡを、ＮＯＤおよびＮＯＲマウスからＳｉｒｐα転写物をＰＣＲ増幅するためのテンプレートとして用いた。Ｂ６マウス配列は、ＥｎｓＥＭＢＬデータベースに由来する。図８は、ＷＯ０９／０４６５４１に開示されるネズミＳＩＲＰαのタンパク質配列並列を例示する。ＢＭ由来マクロファージから調製したｃＤＮＡを、ＮＯＤおよびＮＯＲマウスからＳｉｒｐα転写物をＰＣＲ増幅するためのテンプレートとして用いた。Ｂ６マウス配列は、ＥｎｓＥＭＢＬデータベースに由来する。図９は、ＷＯ０９／０４６５４１に開示されるネズミおよびヒトＳＩＲＰα ＩｇＶドメインのタンパク質配列並列を例示する。（ａ）ＢＭマクロファージから調製したｃＤＮＡを、ＮＯＤおよびＮＯＲマウスからＳｉｒｐα転写物をＰＣＲ増幅するためのテンプレートとして用いた。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）、ＢＡＬＢ／ｃおよび１２９／Ｓｖ配列をＥｎｓＥＭＢＬおよびＮＣＢＩデータベースから得た。白抜きの囲みは、ＳＩＲＰαのＸ線結晶構造で同定されるｂプリーツシートに相当し、そしてＩｇ重鎖可変領域中の類似の領域に対応する。マウス系統間で多様であるアミノ酸を陰で示す。Ｂ６を親配列として用いた。（ｂ）ヒトＨａｐＭａｐ第１期リリース由来の３７人の個体のゲノムＤＮＡから、ＩｇＶドメインを含有するＳＩＲＰαのエクソン３をＰＣＲ増幅した。白抜きの囲み領域は、（ａ）におけるものと同じ特徴に相当し、Ｖ１が親配列として働く。

以下の説明において、多くの特定の詳細を示して、本発明の完全な理解を提供する。しかし、本発明は、これらの特定の詳細を伴わずに実施可能であることが理解される。
本出願者らは、ＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用が異種移植モデルにおけるヒトＡＭＬ−ＬＳＣのホーミングおよび移植を調節することを示す。ＣＤ４７またはＳＩＲＰαのいずれかのターゲティングを通じたＣＤ４７−ＳＩＲＰαシグナル伝達の中断は、患者において、ＡＭＬ−ＬＳＣなどの癌幹細胞を含む、ＣＤ４７＋血液癌細胞および腫瘍の根絶のための潜在的な療法アプローチである。

本明細書において、「癌幹細胞」は、腫瘍および血液癌で見られる癌細胞であって、例えばＡＭＬでは白血病幹細胞（ＡＭＬ−ＬＳＣ）と称され、バルク腫瘍細胞とは生物学的に別個であり、そして幹細胞に関連する特徴を所持し、特に、自己再生し、そして増殖し、そして特定の癌試料中で見られるすべての細胞タイプを生じさせる能力を所持する、癌細胞を指す。

本明細書において、「保存的アミノ酸置換」は、特定の共通の特性に基づくアミノ酸のグループ化を指す。個々のアミノ酸の間に共通の特性を定義する機能的な方法は、相同生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の標準化された頻度を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．およびＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。こうした分析にしたがって、アミノ酸群は、群内のアミノ酸が互いに優先的に交換され、そしてしたがってタンパク質構造全体に対する影響が大部分、互いに似ている場合と定義
されることも可能である（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．およびＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ．，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。この方式で定義されるアミノ酸群の例には：
（ｉ）ＧｌｕおよびＡｓｐ、Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる荷電群、
（ｉｉ）Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる正荷電群、
（ｉｉｉ）ＧｌｕおよびＡｓｐからなる負荷電群、
（ｉｖ）Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐからなる芳香族群、
（ｖ）ＨｉｓおよびＴｒｐからなる窒素環群、
（ｖｉ）Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなる巨大脂肪族非極性群、
（ｖｉｉ）ＭｅｔおよびＣｙｓからなるわずかに極性の群、
（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、ＧｌｎおよびＰｒｏからなる小残基群、
（ｉｘ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＭｅｔおよびＣｙｓからなる脂肪族群、ならびに
（ｘ）ＳｅｒおよびＴｈｒからなる小ヒドロキシル群
が含まれる。

上に示す群に加えて、各アミノ酸残基は、それ自体の群を形成可能であるし、そして個々のアミノ酸によって形成される群は、当該技術分野に一般的に用いられるそのアミノ酸に関する１文字および／または３文字略語によって簡単に称されてもよい。

本明細書において、細胞、例えば癌幹細胞および好ましくはヒト急性骨髄性白血病幹細胞を「移植する」ことは、幹細胞を、例えば注射によって動物内に入れ、ここで細胞がｉｎｖｉｖｏで持続することを意味する。これは、癌幹細胞が、例えば増殖する能力によって、容易に測定可能である。

本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関する「断片」は、参照遺伝子の損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ポリペプチド配列および構造、またはヌクレオチド配列および構造の一部のみからなるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。ポリペプチド断片には、天然ポリペプチドのＣ末端欠失および／またはＮ末端欠失が含まれてもよく、あるいは断片は分子の内部部分に由来してもよい。同様に、ポリヌクレオチド断片には、天然ポリヌクレオチドの３’および／または５’欠失が含まれてもよいし、あるいは断片は分子の内部部分に由来してもよい。

本明細書において、「融合タンパク質」は、複合ポリペプチド、すなわち、通常または天然には単一のアミノ酸配列に一緒に融合されていない、２つの（またはそれより多い）別個の異種ポリペプチドで構成される単一の連続アミノ酸配列を指す。したがって、これらの配列が、天然に見出される単一のアミノ酸中の同じ立体配置中にともに見出されない限り、２つの完全に別個のアミノ酸配列、あるいは２つの類似のまたは同一のポリペプチド配列を含有する単一のアミノ酸配列が、融合タンパク質に含まれてもよい。一般的に、組換え核酸法を用いて、すなわち、融合体が本発明のポリペプチドをコードするセグメントおよび異種ポリペプチドをコードするセグメントを含む、組換え遺伝子融合産物の転写および翻訳の結果として、または当該技術分野に周知の化学合成法によるかのいずれかで、融合タンパク質を調製することも可能である。融合タンパク質はまた、融合タンパク質の構成ポリペプチド間にリンカーポリペプチドも含有してもよい。用語「融合構築物」または「融合タンパク質構築物」は、一般的に、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを指すよう意味される。１つの態様において、融合タンパク質は、Ｉｇ分子の部分に融合した本明細書記載のポリペプチドである。融合タンパク質のＩｇ部分には、免疫グロブリン定常領域、例えばヒトＣγ１ドメインまたはＣγ４ドメイン（例えば、ヒトＩｇＣγ１またはヒトＩｇＣγ４のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域（例えばＣａｐｏｎら，米国特許第５，１１６，９６４号；第５，５８０，７５６号；第５，８４４，０９５号等を参照されたい））が含まれてもよい。１つの好ましい態様において、Ｉｇ融合タンパク質には、免疫グロブリン定常領域（例えばＦｃ領域）にカップリングされた、本明細書記載のポリペプチドが含まれる。

ポリペプチドがＦｃドメインにカップリングしている態様において、Ｆｃドメインは、任意の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ_１またはＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ４）から選択可能である。望ましくは、選択したＦｃドメインを修飾して（例えばＦｃ受容体との結合に関して非常に重要な残基でのアミノ酸置換（単数または複数）によって）、ｉｎｖｉｖｏでのＦｃ受容体への結合を減少させるかまたは防止する（すなわち、修飾Ｆｃドメインは、好ましくは、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを含む新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）以外の結合性内因性Ｆｃ受容体に対するアフィニティ減少を示す）。同様に、望ましくは、選択したＦｃドメインを修飾して、エフェクター機能を改変する、例えば、補体結合を減少させ、そして／または補体依存性細胞傷害性を減少させるかまたは無効にする。こうした修飾は、例えば、一連の突然変異体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４Ｆｃドメイン、ならびにそのＦｃγＲ結合特性を設計し、そして記載している、Ｃｌａｒｋおよび同僚らによって広範囲に記載されている（その内容が本出願に援用される、Ａｒｍｏｕｒら、１９９９；Ａｒｍｏｕｒら、２００２）。例えば、Ｗｉｎｔｅｒらによって、ＵＳ５，６２４，８２１および５，６４８，２６０にさらに詳細に報告されるように、２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２位より選択される位の１以上のアミノ酸を置換して、エフェクターリガンド、例えばＦｃ受容体または補体のＣ１構成要素に対するアフィニティを改変してもよい。また、例えばＵＳ６，１９４，５５１に記載されるように、３２９、３３１および３２２位の１以上のアミノ酸を置換して、Ｃ１ｑ結合を改変し、そして／またはＣＤＣを減少させるかまたは無効にしてもよい。１つの特に好ましい修飾Ｆｃドメインにおいて、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ_１に由来し（Ｗｉｎｅｓら、２０００）、そしてアミノ酸２３４および／または２３５、すなわちＬｅｕ^２３４および／またはＬｅｕ^２３５でのアミノ酸修飾を含む。これらのロイシン残基は、Ｆｃ受容体がＦｃドメインと会合する場所である、ＩｇＧ_１の低部ヒンジ領域内にある。ロイシン残基の一方または両方を置換するかまたは欠失させて、Ｆｃ受容体会合（すなわち結合）を取り除くかまたは防止してもよい；例えば、Ｌｅｕ^２３４およびＬｅｕ^２３５の一方または両方をアラニン（すなわちＬ２３４Ａおよび／またはＬ２３５Ａ）または別の適切なアミノ酸（単数または複数）で置換してもよい（Ｗｉｎｅｓら、２０００）。

他の態様において、１以上のアミノ酸修飾、通常はアミノ酸置換の形の修飾を取り込む、例えば残基２５２で修飾を取り込んで例えばＴｈｒを導入し、残基２５４で修飾を取り込んで例えばＳｅｒを導入し、そして／または残基２５６で修飾を取り込んで例えばＰｈｅを導入することによって、融合タンパク質の半減期を改善する。さらに他の修飾を行って、半減期を改善してもよく、例えばＣＨ１またはＣＬ領域を改変して、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループ中に見られるものなどのサルベージ受容体モチーフを導入することによってもよい。こうした改変は、例えば、ＵＳ５，８６９，０４６およびＵＳ６，１２１，０２２に記載される。

ＵＳ６１９４５５１に記載されるように、３２９、３３１および３２２位で定常領域アミノ酸を改変することによって、Ｃ１ｑ結合改変、または補体依存性細胞傷害性減少を導入することも可能である。ＷＯ９４／０２９３５１に記載されるように、定常領域の２３１および２３９位に置換を導入することによって、抗体が補体を固定する能力をさらに改変してもよい。

本明細書において、「血液癌」は、血液の癌を指し、そしてこれには、とりわけ、白血病、リンパ腫および骨髄腫が含まれる。「白血病」は、感染と戦う際に無効である多すぎ
る白血球が作製され、したがって血液を構成する他のパーツ、例えば血小板および赤血球が締め出される、血液の癌を指す。白血病の症例は、急性または慢性として分類されることが理解される。白血病の特定の型は、例えば、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄増殖性障害／新生物（ＭＰＤＳ）；および骨髄異形成症候群であってもよい。「リンパ腫」は、とりわけ、ホジキンリンパ腫、無痛性および侵襲性両方の非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および濾胞性リンパ腫（小細胞および大細胞）を指してもよい。骨髄腫は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、および軽鎖またはベンス−ジョーンズ骨髄腫を指してもよい。

用語「ＣＤ４７＋」は、本発明のポリペプチドによる結合に関してターゲティングされる細胞の表現型に関連して用いられる。ＣＤ４７＋である細胞は、アフィニティリガンドとしてＣＤ４７抗体を用いたフローサイトメトリーによって同定可能である。ＣＤ４７表現型に関して調べる細胞には、特に、ＣＤ４７＋癌細胞を宿すると推測される被験体から採取した血液試料を含む、標準的腫瘍生検試料が含まれてもよい。

本明細書記載の用語「マクロファージ脱抑制」または「マクロファージの脱抑制」は、マクロファージの役割、活性および／または効果の脱抑制、阻害の除去、増加または開始を指す。

本明細書において、「薬学的に許容されうるキャリアー」は、生理学的に適合するあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を意味する。薬学的に許容されうるキャリアーの例には、１以上の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムが含まれることが好ましいであろう。薬学的に許容されうるキャリアーは、薬理学的剤の保存期間または有効性を増進させる、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤などの補助物質を少量含んでもよい。

本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」は交換可能に用いられ、そしてタンパク質、タンパク質断片、修飾タンパク質、アミノ酸配列および合成アミノ酸配列を意味する。ポリペプチドはグリコシル化されていてもされていなくてもよい。

本明細書において、「予後」は、被験体における臨床的転帰を予測するかまたは同定することを意味する。予後には、疾患進行の徴候を提供する工程が含まれ、そしてまた疾患または状態による死の可能性の徴候を提供する工程も含まれる。

本明細書において、「療法的有効量」は、必要な投薬量および特定の期間で、望ましい療法的結果を達成するのに有効な量を指す。個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに薬理学的剤が該個体において望ましい反応を誘発する能力などの要因にしたがって、薬理学的剤の療法的有効量は多様でありうる。療法的有効量はまた、薬理学的剤のいかなる毒性のまたは有害な効果よりも、療法的に有益な効果が上回るものである。

さらなる側面にしたがって、血液癌を治療するための化合物の使用であって、該化合物が、ヒトＣＤ４７の細胞外ドメインに結合することによって、ヒトＳｉｒｐαおよびヒト
ＣＤ４７の間の相互作用を調節可能なポリペプチドを含む、前記使用を提供する。

いくつかの態様において、ポリペプチドは、可溶性ヒトＳｉｒｐα、またはその断片を含み、好ましくは該ポリペプチドはヒトＳｉｒｐαの細胞外ドメインである。
いくつかの態様において、ポリペプチドは第二のタンパク質、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分に融合している。好ましくは、生じる融合タンパク質は配列番号１３である。

いくつかの態様において、調節はマクロファージの脱抑制を生じる。
いくつかの態様において、血液癌は白血病であり、好ましくは、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、および骨髄異形成症候群より選択され、好ましくはヒト急性骨髄性白血病である。

他の態様において、血液癌は、ホジキンリンパ腫、無痛性および侵襲性両方の非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫（小細胞および大細胞）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、巨細胞骨髄腫、重鎖骨髄腫、および軽鎖またはベンス−ジョーンズ骨髄腫より選択されるリンパ腫または骨髄腫である。

現在、ＡＭＬにおけるＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互作用の中断が、ＡＭＬ細胞のホーミング、移植および遊走障害を生じることが示されている。これらの影響は、宿主骨髄微小環境におけるマクロファージによる自然免疫監視の改善を通じて仲介される。この療法的アプローチは、骨髄微小環境ニッチを占める他の血液癌に有効である可能性が高い。

ＷＯ０９／０６５５４１は、ＳＩＲＰαにおける多型によって、ＮＯＤマクロファージがヒト造血を支持する能力の相違が生じることを記載する。ＷＯ０９／０６５５４１に記載されるＳＩＲＰαのタンパク質配列並列を、図８および９としてここに再現する。ＮＯＤおよびＮＯＲマウスからＳｉｒｐα転写物をＰＣＲ増幅するためのテンプレートとして、ＢＭ由来マクロファージから調製されるｃＤＮＡを用いた。ＮＯＤおよびＮＯＲ間のＳｉｒｐαコーディング配列の比較によって、２４アミノ酸の相違が明らかになり、これらのうち２０は分子の細胞外ＩｇＶ様ドメイン中にあり、ここで、ＮＯＤ配列はＮＯＲおよびＢ６に比較して、１８の置換および２つの欠失を示す。ＮＯＤおよびＮＯＲまたはＢ６間のＳｉｒｐαのＮ末端ＩｇＶ様ドメインにおけるこの観察される変動は、Ｂ６、ＢＡＬＢ／ｃおよび１２９／Ｓｖ株の間で、この領域中で先に報告されたもの（Ｓａｎｏ，
Ｓ．ら（１９９９）ＢｉｏｃｈｅｍＪ３４４Ｐｔ３，６６７−７５）よりもより広範囲である。

ＷＯ０９／０６５５４１は、さらに、ＳＩＲＰαにおける多型によって、ヒトＣＤ４７に対する結合の相違が生じることをさらに記載する。ＷＯ０９／０６５５４１は、ヒトＨａｐＭａｐゲノムプロジェクトより、３７の関連しない正常コーカソイド（ＣＥＵ）、アフリカ系（ＹＲＩ）、中国人（ＣＨＢ）および日本人（ＪＰＴ）個体由来のＳＩＲＰα ＩｇＶドメインの配列決定を記載し、そして本明細書において図９に再現する、１８アミノ酸での組み合わせた変動を反映する、４つの別個のＳＩＲＰα ＩｇＶアレルを同定した。出願者らは、予測されるＣＤ４７結合残基で、そしてＳＩＲＰα ＩｇＶドメインの同じ下位領域において、ＮＯＲアレルからＮＯＤを区別する、ヒトアレル変動を観察した。ＷＯ０９／０６５５４１は、さらに、ＮＯＤ由来ＳＩＲＰα ＩｇＶドメインへのヒトＣＤ４７結合が非常に高く、そしてヒト幹細胞の移植を予測し、そしてこの効果はＣＤ４７−ＳＩＲＰαシグナル伝達を通じて仲介されることをさらに解説する。

したがって、ヒトにおいて、血液癌に対する生存に影響を及ぼす遺伝子多型を決定する方法であって：
ａ）血液癌を有する複数のヒト由来のＳｉｒｐα遺伝子を配列決定し；
ｂ）複数のヒト内のＳｉｒｐα遺伝子のヌクレオチド相違を決定し；そして
ｃ）生存とヌクレオチド相違を相関させて、関連多型を決定する
工程を含む、前記方法を提供する。

いくつかの態様において、ヌクレオチド相違は、好ましくは：
ａ）配列番号２の３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６位の残基の少なくとも１つの、配列番号１の対応する残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６での置換；または
ｂ）配列番号２の残基１２９および１３０の少なくとも１つの欠失
の少なくとも１つのアミノ酸相違を生じる。

さらに、いくつかの態様にしたがって、ヒトＳｉｒｐαおよびヒトＣＤ４７の間の相互作用を調節可能なポリペプチドは：
ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列のＣＤ４７結合性断片からなるポリペプチドであって、該断片が、配列番号１の残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６の少なくとも１つを含む、前記ポリペプチド；および
ｃ）ポリペプチドの長さ７アミノ酸ごとに、最大１つのアミノ酸挿入、欠失または置換を含む、ａ）およびｂ）のポリペプチドの１つのＣＤ４７結合性変異体であって、配列番号１の残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６の少なくとも１つを含む、前記変異体からなる群より選択される。

好ましくは、ポリペプチドはＣＤ４７結合性断片であり、そして配列番号１の以下それぞれの両端の数字を含めて、残基５０〜５７、６３〜７１、７４〜８０、８８〜９２、９５〜１００、１０３〜１０９、１１４〜１２５または１２８〜１４１の間の領域の少なくとも１つにおける少なくとも３つの連続アミノ酸を含む。

別の態様にしたがって、ヒトＳｉｒｐαおよびヒトＣＤ４７の間の相互作用を調節可能なポリペプチドは：
ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ｂ）配列番号２のアミノ酸配列のＣＤ４７結合性断片からなるポリペプチド；および
ｃ）ポリペプチドの長さ７アミノ酸ごとに、最大１つのアミノ酸挿入、欠失または置換を含む、ａ）およびｂ）のポリペプチドの１つのＣＤ４７結合性変異体；
ここで：
ｉ．ポリペプチドにおいて、配列番号２の３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６位の残基の少なくとも１つが、配列番号１の対応する残基３１、３２、３４、３７、７４、７７、８３、８４、８６、８７、９０、９１、９６、１００、１０２、１１４、１１８、１２６で置換されているか；または
ｉｉ．ポリペプチドにおいて配列番号２の残基１２９および１３０の少なくとも１つが欠失しているからなる群より選択される。

好ましくは、ポリペプチドはＣＤ４７結合性断片であり、そして配列番号２の以下それぞれの両端の数字を含めて、残基５０〜５７、６３〜７１、７４〜８０、８８〜９２、９５〜１００、１０３〜１０９、１１４〜１２５または１２８〜１４３の間の領域の少なくとも１つにおける少なくとも３つの連続アミノ酸を含む。

好ましくは、ポリペプチドはＣＤ４７結合性断片であり、そして配列番号４、６および７のいずれか１つの以下それぞれの両端の数字を含めて、残基２４〜３１、３７〜４５、４８〜５４、６２〜６６、６９〜７４、７７〜８３、８８〜９９または１０２〜１１６の間；あるいは配列番号５の以下それぞれの両端の数字を含めて、残基２４〜３１、３７〜４５、４８〜５４、６２〜６６、６９〜７４、７７〜８３、８８〜９９または１０２〜１１５の間の領域の少なくとも１つにおける少なくとも３つの連続アミノ酸を含む。

いくつかの態様において、アミノ酸挿入、欠失または置換は、保存的アミノ酸置換である。他の態様において、アミノ酸挿入、欠失または置換はない。
いくつかの態様において、ポリペプチドはＣＤ４７結合性断片であり、そして長さ６〜３０アミノ酸の間であり、そしてさらに好ましくは、長さ８〜２８アミノ酸の間、長さ１０〜２６アミノ酸の間、長さ１２〜２４アミノ酸の間、長さ１４〜２２アミノ酸の間である。

いくつかの態様において、ポリペプチドは第二のポリペプチド、好ましくはＩｇＧのＦｃ部分に融合する。１つの態様において、ポリペプチドはＳｉｒｐα−Ｆｃ融合タンパク質であり、そして好ましくは配列番号１３である。

本発明の利点は、以下の実施例によってさらに例示される。実施例および本明細書に示す特定の詳細は、例示目的のみのために提示され、そして本発明の請求項に対する限定と見なされてはならない。

マウス
ＯｎｔａｒｉｏＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（カナダ・トロント）で、ＮＯＤ
／ＬｔＳｚ−Ｐｒｄｋｃ^{ｓｃ／ｓｃ}（ＮＯＤ．ＳＣＩＤ）（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．ら
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｄｅｆｅｃｔｓｉｎｉｎｎａｔｅａｎｄａｄａｐｔｉｖｅ
ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄｍｉｃｅ．ＪＩｍｍｕｎｏｌ１５４，１８０−１９１（１９９５））を無菌条件下で飼育し、そして維持した。ＨｏｓｐｉｔａｌｆｏｒＳｉｃｋＣｈｉｌｄｒｅｎ（オンタリオ州トロント）で、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３マウスを特定病原体未感染またはバリア条件下で維持した。ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３マウスをＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに交雑させることによって、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤマウスを生成し、その後、Ｉｄｄ１３およびＳＣＩＤ遺伝子座の両方で、ホモ接合性が達成されるまで、マーカー補助遺伝子型決定によって兄弟姉妹交配をスクリーニングした（Ｔａｋｅｎａｋａら、上記）。

ヒト造血細胞のマウスへの移植
インフォームドコンセントを得た後、ヒト実験委員会によって認可された手法にしたがって、原発性または続発性ＡＭＬ患者から、末梢血細胞を得た。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上で分離した後、低密度細胞（１．０７７ｇ／ｍｌ）を収集し、そして次いで、１０％ジメチルスルホキシドを含有するＦＣＳ中で凍結保存した。

８〜１０週齢のマウスを^１３７Ｃｓ γ照射装置から、２７５ｃＧｙの致死量以下で２４時間照射した後、ヒト細胞を移植した。移植の７〜８週後、マウスを屠殺し、そしてヒトＣＤ４５^＋細胞の存在に関するフローサイトメトリー分析によって、ヒト細胞移植に関してネズミＢＭおよび脾臓を評価した。大腿内移植されたマウスにおいて、注射大腿および残りの骨（非注射大腿、脛骨）を別個に分析した。いくつかの実験において、照射後、２００μｇの抗ネズミＣＤ１２２で腹腔内投与によってマウスを前処置した。

フローサイトメトリー
フローサイトメトリーには、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ）を用いた。マウスにおけるヒト細胞移植の分析のため、マウス骨髄から収集した細胞を、フィコエリトリン−Ｃｙ７コンジュゲート化抗ヒトＣＤ４５（ＨＩ．３０；ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。

Ｉ型ＴＭベクターへのヒトＳＩＲＰＶ１およびＶ２クローニング
ＳＩＲＰα変異体１および２の完全ＩｇＶドメインを得るために、ＸｈｏＩ含有順方向プライマー、ＢｇｌＩＩ含有逆方向プライマー、およびＰｈｕｓｉｏｎホットスタートＩＩ高忠実度ポリメラーゼを用いて、５ｘＨＦ緩衝液中、ｐＵＣ５７プラスミド中のヒトＳＩＲＰα変異体１および２ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。

ｐＵＣ５７ＳＩＲＰαベクターを、ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩでの制限消化に供した。ｐＩＮＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ１をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、そしてＰｒｏｍｅｇａ^ＴＭのＬｉｇａＦａｓｔ迅速ＤＮＡ連結系を用いて、ＳＩＲＰα挿入物をｐＩＮＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ１に連結した。

生じたｐＩＮＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ４−Ｆｃ１−ヒトＳＩＲＰαベクターを、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＯｎｅＳｈｏｔＴＯＰ１０コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。
トランスフェクション
プラスミドＤＮＡおよびフェクチンを適切な体積のＯｐｔｉＭｅＭ中で希釈し、そして混合した。空気中８％ＣＯ_２の加湿大気を含む３７℃インキュベーターで、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ２９３−Ｆ細胞をトランスフェクションした。細胞または培地をトランスフェクション４〜６日後に採取した。
タンパク質採取
Ｆｃタンパク質を２９３Ｆ培養から採取した。培養を回転させ、そして上清を収集し、そしてＰＥＳ０．４５μｍフィルター、次いでＰＥＳ０．２２μｍフィルターを通じてろ過した。〜３５００ｘｇで１０〜２０分間、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−７０ｍＬ遠心分離フィルターを用いて上清を濃縮し、そしてＧカラム中、４℃で溶出させた。１ＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．０中でタンパク質を収集した。遠心分離によって試料をさらに脱塩し、そしてＰＢＳ中に再懸濁した。

実施例１
初代ヒトＡＭＬにおけるＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用の関連性を調べるため、本発明者らは、３人のＡＭＬ患者由来の初代細胞を、ＮＯＤ．ＳＣＩＤおよびＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤ（Ｉｄｄ）マウス内に静脈内（ｉ．ｖ．）移植した。ＡＭＬ試料はいずれもＩｄｄマウスに移植不能であり、一方、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおける頑強な移植が観察され（図１）、正常ヒトＨＳＣで以前得られたデータが裏付けられた。同じ試料を大腿内（ｉ．ｆ．）移植すると、６匹のＩｄｄマウスのうち２匹が、注射大腿における移植を示したが、他の骨または脾臓には移植は見られなかった（図１）。

実施例２
本発明者らは、次に、ネズミＣＤ１２２に対して向けられる抗体で前処置して、宿主ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびある程度のマクロファージを枯渇させたマウスに、ｉ．ｆ．移植を行った。ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス（４３匹／４３匹、１００％）で試験した１０すべてのＡＭＬ試料に関して、注射大腿における移植が観察され、そして興味深いことに、４２匹のＩｄｄマウスのうち３１匹（７４％）（試験したＡＭＬ試料の８／１０）で移植が観察された（図２Ｂ）が、移植レベルは、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに比較して、Ｉｄｄマウスでより低かった。抗ＣＤ１２２前処置を伴わずに得られた結果とは対照的に、非注射骨における移植は、８匹／４２匹のＩｄｄマウス（１９％、試験したＡＭＬ試料の２／１０）において検出可能であり、一方、予期されるように、大部分の移植されたＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスは遊走を支持した（３８匹／４３匹、８３％、試験したＡＭＬ試料の１０／１０）。しかし、非注射骨における移植レベルは、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに比較して、Ｉｄｄにおいて有意により低かった。さらに、ＡＭＬ−ＬＳＣは、Ｉｄｄマウスの脾臓で再増殖不能であった。この研究で最適に移植されるＡＭＬ試料を用いて行ったホーミングアッセイによって、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに比較して、Ｉｄｄには重度のホーミング欠陥があることが明らかになった（図２Ａ）。

実施例３
本発明者らは、マウス異種移植におけるヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の移植に対するマウス自然免疫の影響を研究した。図３Ａは、ＮＯＤ．ＳＣＩＤまたはＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤにおけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージ（Ｍφ）集団の調節を示す。マウスＮＫ細胞およびマクロファージの表面表現型を示す。マクロファージはＳｉｒｐαを発現するが、ＮＫ細胞はこれを発現しない（左のパネル）。ＣＤ１２２（主にＮＫ細胞上で発現される）に対する抗体またはクロドロン酸の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射でマウスを処置した。ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおいてヒト造血細胞の移植を改善することが示されてきているＣＤ１２２抗体処置は、迅速なＮＫ細胞枯渇を導くが、マウス・マクロファージを減少させない（上部右パネル）。ビスホスホネートであるクロドロン酸での処置はアポトーシスおよびマクロファージの効率的な枯渇を導く（図３Ａの下部右パネル）。

図３Ｂは、マクロファージ枯渇後のＮＯＤ．ＳＣＩＤまたはＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤ（Ｉｄｄ）におけるヒトＡＭＬ細胞の移植を示す。致死量以下で照射したマウスを、ＰＢＳ（対照）またはクロドロン酸（ＣＬ）で４８時間、ｉ．ｐ．処置した後、ヒトＡＭＬ細胞を大腿内移植した。移植８週間後にマウスを屠殺するまで、毎週、クロドロン酸処置を続けた。マウスの注射骨髄、非注射骨髄、脾臓および末梢血を採取し、そしてヒト特異的マーカーを用いたフローサイトメトリーによって、ヒト白血病移植を評価した。図は、採取した臓器中のヒト白血病細胞の割合を示す。ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに比較して、ＰＢＳ処置対照Ｉｄｄマウスの注射大腿では、移植が減少し、そして他の部位には移植が見られず；クロドロン酸処置後、Ｉｄｄマウスのすべての部位で移植が観察された。これらの発見は、ＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互作用がＡＭＬ移植には非常に重要であり、そしてＩｄｄマウスにおけるＡＭＬ細胞移植の減少は、マクロファージによって仲介されるという仮説を支持する。

実施例４
ヒトＡＭＬ細胞に関するｉｎｖｉｔｒｏ食作用アッセイを行った。ＣＦＳＥ標識ヒトＡＭＬ細胞をＮＯＤ．ＳＣＩＤまたはＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤマウス・マクロファージと同時インキュベーションした。２時間後、マクロファージを採取し、そしてフローサイトメトリーによって、ＣＦＳＥに関して陽性であるＦ４／８０＋マウス・マクロファージの割合を決定した。マウス・マクロファージがＣＦＳＥ陽性であることによって、ヒトＣＦＳＥ＋ＡＭＬ細胞の貪食が示唆される（図４Ａ）。ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤ−ＡＭＬ共培養は、ＮＯＤ．ＳＣＩＤ−ＡＭＬ共培養に比較して、より高い割合のＣＦＳＥ＋／Ｆ４／８０＋を、一貫して示した。これによって、ＡＭＬ細胞上のＣＤ４７およびマウス・マクロファージ上のＳｉｒｐα間の相互作用の欠如が、ＡＭＬ細胞の食作用増加を生じることが示唆される。

蛍光活性化細胞分取後、共焦点顕微鏡を用いて、ＣＦＳＥ＋／Ｆ４／８０＋細胞を視覚化した。図４Ｂは、マクロファージによって貪食されたＣＦＳＥ＋細胞を含む１つの参考情報視野を示す。

マクロファージにおけるアクチン重合を阻害することによって食作用を阻害するサイトカラシンＤで、共培養を前処理した。サイトカラシンＤ処理は、ＣＦＳＥ＋／Ｆ４／８０＋細胞の割合を有意に減少させた（図４Ｃ）。

図４Ｄは、示すように、未処理またはサイトカラシンＤ処理ＣＦＳＥ＋／Ｆ４／８０＋マウス・マクロファージにおけるヒトＣＤ４５の発現を示す。ヒトＣＤ４５が低発現であることから、ヒトＡＭＬ細胞がマウス・マクロファージ中に貪食されたことが示唆され、これはヒト抗体が、貪食された細胞には結合不能であるためである。これらの結果は、未処理ＣＦＳＥ＋／Ｆ４／８０＋細胞の大部分が、ヒトＡＭＬ細胞を取り込んだマクロファージである（ＣＤ４５陰性）ことを裏付ける。総合すると、これらの発見は、ＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互作用が、ＡＭＬ細胞がマクロファージによる自然免疫攻撃を逃れるために非常に重要であることを示唆する。

実施例５
実施例５は、ヒトＳＩＲＰα（Ｖ２）融合タンパク質のｉｎｖｉｔｒｏプレインキュベーションが、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス骨髄（ＢＭ）および脾臓への初代ＡＭＬ細胞のホーミングを遮断することを立証する。ＡＭＬＰｔ９６０１から採取された初代細胞を、ＩＭＤＭ＋１５％ＢＩＴ中、５０μｇ／ｍｌの濃度のヒトＳＩＲＰα−Ｆｃ融合タンパク質を含みまたは含まずに、３７℃で２時間インキュベーションした。融合タンパク質を含み（ｈＳＩＲＰα−Ｆｃ）または含まずに（未処理）インキュベーションした細胞を採取し、そして致死量以下で照射したＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに静脈内移植した。移植１６時間後、マウスを屠殺し、そしてＢＭおよび脾臓から細胞を採取した。

ネズミ抗ヒト抗体を用いたフローサイトメトリーによって、ＢＭおよび脾臓におけるヒ
トＣＤ４４＋ＡＭＬ細胞の割合を測定した。ヒトＳＩＲＰα−Ｆｃとのｉｎｖｉｔｒｏインキュベーションによって、未処理群に比較して、ＢＭ（Ｐ＝０．０２）および脾臓（Ｐ＝０．０１８）の両方において、ヒトＣＤ４４＋ＡＭＬ細胞の割合が有意に減少した（図５Ａ−各記号は異なるマウスに相当する）。

［回収されたＡＭＬ細胞総数］／［注射されたＡＭＬ細胞総数］ｘ１００として、ＮＯＤ．ＳＣＩＤＢＭおよび脾臓へのＡＭＬ細胞のホーミング効率を計算した。ヒトＳＩＲＰα−Ｆｃ処理は、有意にＮＯＤ．ＳＣＩＤＢＭへの（Ｐ＝０．０３６）、そしてまた脾臓への（ＮＳ）ＡＭＬ細胞のホーミング効率を減少させた（図５Ｂ）。

実施例６
実施例６は、ヒトＳｉｒｐα融合タンパク質（ｈＳｉｒｐα−Ｆｃ）でのｉｎｖｉｔｒｏ処理が、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおいて初代ＡＭＬ細胞が再増殖する能力を減少させることを示す。Ｐｔ９０１８１（未分類ＡＭＬ）由来の初代ＡＭＬ細胞を、ＩＭＤＭ＋１５％ＢＩＴ中、５０μｇ／ｍｌの濃度のｈＳｉｒｐα−Ｆｃを含みまたは含まずに、３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を採取し、そして致死量以下で照射したＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス内に、マウスあたり２．７ｘ１０^６細胞を大腿内移植した。移植４週間後、マウスを屠殺し、そして抗ヒト抗体で染色するため、注射大腿（ＲＦ）および非注射大腿（ＢＭ）から細胞を採取した。フローサイトメトリーによって染色細胞を分析して、ｈＣＤ４５＋細胞の割合に基づいて、各個々のマウスにおける移植レベルを決定した（図６）。バーは、ｈＣＤ４５＋細胞の平均割合を示す。ｈＳｉｒｐα−ＦｃでのＡＭＬ細胞のプレインキュベーションによって、未処理対照に比較して、ＲＦ（Ｐ＝０．００１６）およびＢＭ（Ｐ＝０．０１）両方のＡＭＬ移植レベルが有意に減少した。

実施例７
実施例７は、ｉｎｖｉｖｏヒトＳｉｒｐα融合タンパク質（ｈＳＩｒｐα−Ｆｃ）処置によってＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおける初代ＡＭＬ細胞の移植が減少することを立証する。致死量以下で照射したＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスに、患者０２８５由来の初代ＡＭＬ細胞（ＦＡＢＭ２）を大腿内注射した。移植１０日後に開始して、マウスあたり２００μｇ（８ｍｇ／ｋｇ）の用量で、３回／週、７用量のｈＳｉｒｐα−Ｆｃを腹腔内投与した。次いで、マウスを屠殺し、そして抗ヒト抗体で染色するため、注射大腿（ＲＦ）、非注射大腿（ＢＭ）および脾臓から細胞を採取した。染色細胞をフローサイトメトリーによって分析して、ｈＣＤ４５＋細胞の割合に基づいて、各マウスにおける移植レベルを決定した（図７）。バーは、各群におけるｈＣＤ４５＋ヒト細胞の平均割合を示す。示すＰ値は、ＰＢＳ処置に比較したｈＳｉｒｐα−Ｆｃ処置に関するものである。ｈＳｉｒｐα−Ｆｃで処置すると、分析したすべての組織において、ＡＭＬ移植レベルが劇的に減少した。ＢＭおよび脾臓におけるＡＭＬ細胞がほとんど検出不能なレベルに顕著に減少することから、ｈＳｉｒｐα−Ｆｃが、注射大腿から他の造血部位へのＡＭＬ幹細胞遊走を完全に阻害することが示唆される。
考察
本明細書において、本発明者らは、ヒトＡＭＬ−ＬＳＣが、ＮＯＤ．ＮＯＲ−Ｉｄｄ１３．ＳＣＩＤマウスにおいて、有意に減少した移植能を有することを示しており、これは、正常造血細胞で得られたデータと一致する。本発明者らの結果は、ＡＭＬを移植したマウスの抗ＣＤ４７処置で得られたもの（Ｍａｊｅｔｉら、上記）と一致し、そしてＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用の減弱（Ｉｄｄマウスにおけるようなもの）がＡＭＬ−ＬＳＣ機能を損なうという仮説を支持する。この影響は、抗ＣＤ１２２処置を通じたＮＫ細胞およびマクロファージの枯渇によって幾分回復し、注射大腿における移植、およびいくつかの場合には他の骨への遊走を可能にする。これは、ｉｎｖｉｖｏでの抗白血病活性の少なくともある程度が、自然免疫系の細胞、特にＳＩＲＰαを発現しているマクロファージによって仲介可能であることを示唆する。本発明者らの発見によって、ＡＭＬ細胞がマクロファージによる自然免疫攻撃を逃れるには、ＳＩＲＰα−ＣＤ４７相互作用が非常に重要であることがさらに示唆される。ＣＤ４７またはＳＩＲＰαのいずれかのターゲティングを通じたＣＤ４７−ＳＩＲＰαシグナル伝達の中断は、白血病幹細胞、好ましくはＡＭＬ−ＬＳＣなどの血液癌細胞の根絶のための療法的アプローチである。本発明者らは、ヒトＳＩＲＰα（Ｖ２）融合タンパク質が、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス骨髄（ＢＭ）および脾臓への初代ＡＭＬ細胞のホーミングを遮断し、そしてＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおいて初代ＡＭＬ細胞の再増殖能を減少させることを立証する。特に、本発明者らは、ｉｎｖｉｖｏヒトＳｉｒｐα融合タンパク質（ｈＳｉｒｐα−Ｆｃ）処置が、ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスにおける初代ＡＭＬ細胞の移植を減少させることを立証する。

本発明の好ましい態様が記載されてきているが、当業者は、本発明の精神または付随する請求項の範囲から逸脱することなく、変動を行うことが可能であると理解するであろう。本明細書に開示するすべての文書は、本明細書に援用される。

Claims

ヒトＳｉｒｐαの細胞外ドメインまたはその断片であって、免疫グロブリン定常領域に融合したものを含む、ＣＤ４７＋である癌細胞又は腫瘍を治療するための薬剤。