JP2019511708A - 免疫原性ペプチド及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、活動性結核に罹患した個体の血清に由来する抗体を認識することが可能な該当する免疫原性ペプチドをスクリーニングするインビトロ方法であって、該方法は、・− 活動性結核に罹患した患者に由来する血清のペプチドを接触させること、・− 前のステップの免疫複合体の形成を検出すること、及び・− Ｒ比の値が１．５以上となる該当するペプチドを選択すること、を含み、Ｒ比が対照試料から得られた測定値に対する免疫複合体の形成の測定値である、インビトロ方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、特に病理を診断する上での、免疫原性ペプチド及びその使用に関する。

結核（ＴＢ）は、世界の人口の３分の１が感染し、２０秒ごとに１人が死亡するため、依然として世界中で最も死亡率の高い疾患の１つとされる。現在のところ、健康機関、特に世界保健機関（ＷＨＯ）の予測により確証された迅速かつ精密な診断試験は存在せず、参考試験は、結果を得るのに数週間を要する。

今日、ＴＢを診断するための国際的参考法は、肺試料を使用し、セキュリティーレベル３の検査室及び患者の入院を必要とするため、長期間で（細菌培養に最大８週間）、性能が低く、高価で、実施が困難である。

２０１１年に歴史上初めて、ＷＨＯが、ＴＢの診断のために市場に出た第一世代の血清学的試験の使用に関する、明白にネガティブな一般的方策提言を発表した（ＷＨＯ ２０１１、ＴＢの診断に関する市販の血清診断試験：方策表明(commercial serodiagnostic tests for diagnosis of TB:policy statement))。

臨床的に確証されておらず、性能が乏しいこれらの試験の１００万を超える数が、毎年世界中で、特に南半球（アフリカ、アジア）の国々で、地域的規制が弱いことを利用して販売されている。これらの試験のほぼ全てが、同じ抗原を利用しており、それらは、厳格な臨床的確証を受けていないため、患者のリスクに関する性能が非常に低い。

したがってＷＨＯは、厳密な品質及び臨床的確証規準に適う新世代の試験を得ようと門戸を開いた。

潜在性感染の間、結核菌はマクロファージに含まれるが、該マクロファージは脂質性液胞が飽和した細胞質を顕微鏡観察で認めるため泡沫状と言われる。結核菌(Mycobacterium tuberculosis)は、脂肪酸をトリグリセリド（ＴＧ）の形態で貯蔵して、細菌を休眠期に入れることができる（潜在性ＴＢ）。これらの脂質性液胞は、細菌の炭素供給源となり、細菌によって、休眠期を離れて再活性化されるのに用いられる（活動性ＴＢ）。ＴＢの再活性化の際のＴＧレベルの減少が、特定タンパク質の活性上昇によるＴＧの分解と同時に起こる。これまで比較的研究の少なかったこれらのタンパク質の一部は、潜在性形態からのＴＢの再活性化に密接に連携すると思われ、それゆえ活動性ＴＢを早期に同定すること、又は該疾患の重篤形態を発症するリスクが高い潜在性ＴＢ症例をモニタリングすることに大きな関心が寄せられている。

特許出願ＷＯ／２０１２／１６４０８８（特許文献１）は、最新技術を知らせており、脂質分解活性を有するリパーゼタンパク質を用いてＥＬＩＳｐｏｔ Ｂに基づき活動性結核を診断するための方法を教示している。

しかしそのような方法は、活動性結核の早期検出に効果的であるが、設備のある検査室の重厚な設備でしか実行され得ず、特殊な技術的スキルを必要とし、それゆえリスクのある集団がいる現場で早期に使用することはできない。

それゆえ、出願ＷＯ／２０１２／１６４０８８の方法で得られるのと少なくとも同程度に良好な活動性ＴＢ検出感度レベルを保持するより簡便な方法を提供することが求められている。

国際特許出願ＷＯ／２０１２／１６４０８８号明細書

それゆえ本発明の一目的は、全ての状況で容易に実行することができ、特に高度の設備を備えた病院施設を利用することなく、活動性結核を診断するための方法を提供することである。
本発明の別の目的は、この新しい迅速かつ効果的な診断方法を実行させる最良のペプチド候補を決定することである。

それゆえ本発明は、活動性結核に罹患した個体の血清に由来する少なくとも１種の抗体を認識することが可能な該当する(of interest)少なくとも１種の免疫原性ペプチドをスクリーニングするインビトロ方法であって、前述の少なくとも１種の免疫原性ペプチドが、疎水性タンパク質に由来する親水性ペプチドであり、前述の疎水性タンパク質が、マイコバクテリウム属の細菌の壁のタンパク質であるか、又は該細菌から分泌され、前述の疎水性タンパク質が、脂質分解活性を有し、前述の方法が、以下のステップ：
＋ 少なくとも１種の疎水性ペプチドから生じた少なくとも１種の親水性ペプチドを、
− 連続で、前述の抗体と前述のスクリーニングされるペプチドとの免疫複合体の形成を可能にする、確認された活動性結核に罹患した患者に由来する少なくとも２つの独立した血清プールと、
− 結核に罹患していない個体に由来する少なくとも１種の対照試料と、
に接触させるステップと、
＋ 前のステップにおける免疫複合体の形成を検出するステップと、
＋ 確認された活動性結核に罹患した患者に由来する独立した血清のプールの少なくとも１つについてＲ比の値が１．５以上となる、該当するペプチドの第一の選択を実行するステップと、
を含み、
該Ｒ比は、
血清と、免疫複合体を検出するために用いられた成分との各バックグランドノイズと比較した免疫複合体形成の正規化測定値の、
健常な個体に由来する試料から得られた正規化された測定値の、血清と、免疫複合体を検出するために用いられた成分との各バックグランドノイズと比較した値に対する、すなわちこの値で割った比である、
インビトロ方法に関する。

本発明は、決定されたタンパク質に由来する特定のペプチドが、病理を高レベルで検出するための感度及び有効性を提示しながら、活動性結核を診断するための方法を実行するための非常に良好な候補になる、という本発明者らにより行われた驚くべき観察に基づく。

本発明により提案された診断は、ヒト及び動物で実施され得る。

本明細書では以後、結核は、均一に「結核」又は「ＴＢ」と称される。

本発明において、用語「脂質分解活性を有する疎水性タンパク質」は、脂質分解活性を有する酵素を指すために用いられ、ホスホリパーゼＡ、Ｂ、Ｃ又はＤ、及びリパーゼ、特にトリグリセリドリパーゼ、リパーゼ又はジグリセリド、モノグリセリドリパーゼを包含する。

感染の際、結核菌は、脂質が充填された細胞内封入体を蓄積するが、その脂質は、おそらく宿主の細胞膜の分解により発生する。その上、脂肪酸が休眠期の炭素供給源であるという事実を裏づける強力な証拠を有する。結核菌は、非反復性の持続的段階（潜伏期）に入ると、脂肪酸をトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）の形態で貯蔵する。さらに、リン脂質に取り囲まれた多量の中性脂肪を細胞質内に含有する細胞である泡沫状マクロファージを含む肉芽腫が見出されている。これらの脂質体は、細菌のインターナリゼーションによって導入され、それにより病原体の生存及び再活性化のために炭素供給源を提供する。より一般的にこれらの発見は、脂質の分解に関与する酵素が著しい生理学的機能を担い得、感染細胞から得られた結核菌の並外れた生存能力及び再活性化に関与し得る、という事柄を裏づけている。結核菌による宿主の脂質の分解は、おそらくクチナーゼ酵素のファミリーなど、リパーゼ及びホスホリパーゼなどの脂質分解酵素により実施される。

リパーゼは、脂質分解活性を有する水溶性タンパク質であり、エステラーゼの群に属し、トリアシルグリセロール及びリン脂質のエステル結合のように、水に不溶性の基質の加水分解を触媒する。

この状況において、該脂質分解触媒反応は、界面での異なるプロセスを必要とし、水中油エマルジョン、膜二重層、ミセル及び小胞の中に存在する脂質基質の構造に密接に依存する。該触媒プロセスは、油／水界面で起こるリパーゼの吸着／脱離と、その後の界面での酵素／基質複合体の形成及び脂質分解産物の放出という可逆的ステップとして記載することができる。同定された結核菌リパーゼのうち、２４種が、「Ｌｉｐファミリー」と呼ばれる酵素ファミリーに分類された。しかしこの分類は、エステラーゼと、α／βホールドを有するヒドロラーゼファミリーのメンバーとの特徴であるＧＸＳＸＧコンセンサス配列の存在のみに基づく。

それゆえ本発明において、免疫原性ペプチドを検出するための方法は、操作が困難になり、及び／又は生成を高価で複雑にする可能性がある全タンパク質での作業の困難さを排除しながら、脂質分解活性（これは活動性結核を検出することを可能にする）を有するタンパク質の特性を利用することに基づく。

事実、前述のタンパク質が、膜タンパク質（脂質二重層に挿入された）であり、それゆえ疎水性であるため、又は単に脂質を分解するタンパク質であり、それゆえ疎水性であるため、脂質分解活性を有する前述のタンパク質の小さな免疫原性フラグメントを見出すことが、特に適切である。

本発明において、「疎水性タンパク質」は、全体として水性溶液への親和性をほとんど有さないと見なされ、水性液に溶解する能力をほとんど有さない、タンパク質を指す。

タンパク質は、極性（親水性）又は疎水性であり得るアミノ酸で構成される。該タンパク質が、合成される時、配列内の互いに離れたアミノ酸が、空間的に互いに接近して見出され得るように、該タンパク質は、活性又は機能に関係して特異的三次元構造をとる。タンパク質のフォールディングの際、極性アミノ酸の全てが、疎水性アミノ酸に取り囲まれたポケットの中に見出されれば、親水性アミノ酸の割合が、疎水性アミノ酸よりも高い場合であっても、該全タンパク質は疎水性と見なされるであろう。

同様に、タンパク質表面に存在するアミノ酸の大部分が親水性になるような、タンパク質の三次元構造であれば、該タンパク質は親水性と見なされるであろう。

タンパク質の親水性及び疎水性の観念は、当業者に周知である。タンパク質の一次配列から、その構造及び疎水性指数を予測することにより親水性／疎水性プロファイルを決定することもまた、当業者に可能である。

本発明において、「疎水性タンパク質に由来する親水性ペプチド」は、先に定義された前述の疎水性タンパク質のフラグメントを指し、その特性は、水性液、即ち水又は極性溶媒に容易に可溶性であり安定している。

疎水性タンパク質から本発明によりスクリーニングされる親水性ペプチドを予測するために、特に前述のペプチドの溶解度のみに基づくことが可能である。多くの塩基性残基を有し、介在する酸残基を含まない（酸／塩基平衡）配列は、溶解が困難になり得る。その結果、スクリーニング後に免疫原性になり得るペプチド配列それぞれの溶解度を分析するために、平衡が決定される。

それゆえ、式：
Ｂ_ａｂ＝Ａ_ａａ−Ｂ_ｂｂ
（式中、
Ａ_ａａ＝（Ｎ_ａ／Ｎ）×１００、Ｎ_ａ＝配列内のアミノ酸の酸性残基の数、Ｎ＝アミノ酸の数、及び
Ｂ_ｂｂ＝（Ｎ_ｂ／Ｎ）×１００、Ｎ_ａ＝配列内の塩基性アミノ酸残基の数、Ｎ＝アミノ酸の数）
を用いて酸／塩基平衡Ｂ_ａｂが最大になるようなペプチドを選択することが、重要となる。

溶解度は、電荷を帯びた残基の数をカウントし、それにペプチドの遊離末端を相加することによっても予測され得る。理論的には、５残基ごとに少なくとも１電荷が、最小溶解度を得るのに必要となる。３より多く４までの疎水性残基の連結を回避する必要もある。ｐＨ６．８での疎水性により、水性緩衝液中のペプチドの溶解度の検証が可能になる。この値により、キャリアタンパク質へのコンジュゲーションステップの間の、連結緩衝液との相溶性を検証することが可能になる。

ｐＨ６．８での疎水性が、検討されるペプチドのアミノ酸総数に対するｐＨ６．８でのアミノ酸それぞれの疎水性の値に対応することに、留意されたい。

特に、免疫原性を試験する前に、スクリーニングされるペプチドが、例えばｉ）フレキシブルである、即ち空間的に拘束されない、即ちペプチドの一般構造に比較して任意の抗体に自由に接近し得るエピトープを有すること、ｉｉ）それらが、特異性を低下させるような、保持されたタンパク質のパターン又は二次構造（ヘリックス、βフォールディング）で配置されているか否か、ｉｉｉ）それらが、誘導される全タンパク質の露出した領域に見出されるか否か、を検証することが有利になり得る。当業者は、潜在的に免疫原性のペプチドの選択を完全にし得る他の適当な特徴を見出すこともできる。

親水性ペプチドが同定されたら、その後、以下の方法を利用して、免疫原性を試験する：
１− 各ペプチドを、臨床的に確認された活動性ＴＢに罹患した患者に由来する少なくとも２つの血清プールと接触させ、
２− 並行して、結核、特に活動性結核に罹患していない健常個体、即ち結核と接触したことのない個体、又は結核の潜伏期にある（つまり活動性結核を発症していない）患者に由来する対照試料でも行う。

この目的は、被験ペプチドが、活動性ＴＢに罹患した個体からの前述の血清プールに含まれる少なくとも１種の抗体と免疫複合体を形成することが可能であるか否か、つまりペプチドが潜在的に変異原性であることを決定することである。

潜在的な免疫複合体は、定量を可能にするマーカーと連結した抗体の一定部分の特異的免疫グロブリンを用いて、スクリーニングされるペプチドと潜在的に相互作用した抗体の
該一定部分を検出する、という免疫複合体の存在をマーキング及び同定することからなる伝統的な方法により検出される。

これらの免疫複合体を検出するための伝統的な検査法は、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）試験からなる。この検出方法は、検査室の外部での免疫複合体の同定を容易にするために、異なる固体基板上でも適合させることができる。

どのペプチドが該当するかを決定するために、Ｒ比を計算するが、該Ｒ比は、
血清と、免疫複合体を検出するために用いられた成分との各バックグランドノイズと比較した免疫複合体形成の正規化測定値の、
健常な個体に由来する試料から得られた正規化された測定値の、血清と、免疫複合体を検出するために用いられた成分との各バックグランドノイズと比較した値に対する、すなわちこの値で割った比である。

これは、以下の式が適用されることを意味する：
（式中、
Ｖｐ＋ｅは、ペプチド（ｐ）が活動性ＴＢ（ｅ）に罹患した患者の血清と接触した時の、
免疫複合体の検出の際に測定された値に対応し、
Ｖｓ＋ｅは、ペプチドの溶媒（ｓ）が活動性ＴＢ（ｅ）に罹患した患者の血清と接触した時の、免疫複合体の検出の際に測定された値に対応し、
Ｖｐ＋ｎは、ペプチド（ｐ）が健常個体（ｎ）の血清と接触した時の、免疫複合体の検出の際に測定された値に対応し、
Ｖｓは、ペプチドの溶媒（ｓ）が健常個体（ｎ）の血清と接触している免疫複合体の検出の際に測定された値に対応し、
ＶＢｌａｎｃは、いずれかの血清、ペプチド及び溶媒の非存在下での免疫複合体の検出の際に測定された値に対応する）。

各測定で、各生体材料、即ち血清（陽性血清を健常個体の血清と比較する）、ペプチド（ペプチドを溶媒と比較する）などの潜在的バックグランドノイズが考慮されているため、該値は正規化されていると言われる。

Ｒ比を得るために用いられる方法に関係なく、決定されたペプチドについて、先に計算された比率が１．５以上であれば、該ペプチドは、特に興味深く、活動性ＴＢのマーカー抗体を効果的に検出することが可能であると見なされる。逆に、Ｒ比が１．５未満であれば、そのＲ比は用いられないであろう。

本発明では、先に述べられた通り、各ペプチドを、少なくとも２つの血清プールと接触させる。最初のアプローチでは、各々が臨床的に立証された活動性ＴＢ（陽性微生物培養の生成物−参考臨床試験）を有する別々の患者に由来する複数の血清のプール又は混合物を用いる。これらのプールにより、血清混合物を有すること、つまり検出され得る抗体の多様性を増大させることが可能になる。

独立したプール、即ち同じ起源を有さない血清の混合物が、用いられる。例えば、第一のプールが、異なる４個体から得られた血清４種を含む場合、第二の独立したプールは、第一のプールの血清の少なくとも１つと共通しない複数の血清を含むことになる。

有利には先に述べられた通り、ペプチドとプールに含まれる抗体との免疫複合体は、検出薬と連結された免疫グロブリンを用いる免疫検出により定量される。例えば、用いられるマーカーによるが、光学密度ＯＤを測定することが可能である。用いられるマーカーによるが、当業者は、免疫複合体を定量するための最良の方法を決定する方法を認識しているであろう。

本発明において、好ましいペプチドは、少なくとも２つの血清プールのうちのプールの全てで１．５よりも大きなＲ比を有するものである。もちろん、少なくとも２つの血清プールのうちの１つのプールに対して１．５以上のＲ比を有するペプチドもまた、該当するであろう。逆に、少なくとも２つの血清プールのうち検討されるプールに関係なくＲ比が１．５未満であるペプチドは、選択されないであろう。

１つの有利な実施形態において、本発明は、以下のステップ：
− 第一の選択ステップで選択されたペプチドを、確認された活動性結核に罹患した患者に由来する前述の独立した血清プールを構成する個々の血清それぞれと接触させて、前述の抗体と前述のスクリーニングされるペプチドとの免疫複合体を形成させるステップと、
− 前のステップにおける免疫複合体の形成を検出するステップと、
− 確認された活動性結核を有する患者の前述の独立した血清プールを構成する個々の血清それぞれでＲ比の値が１．５以上となる、該当するペプチドの第二の選択を実行するステップと、
をさらに含む、上述のスクリーニング方法に関する。

有利には、ペプチドが、上述の方法を利用して同定されたら、少なくとも２つのプールを構成する血清それぞれで個別に第二の反応性試験を実行することも有利である。そのような二重スクリーニングによって、選択を確認し、プールの血清のうちの１つで大きな比率を占める抗体のみを認識する選択されたペプチドを潜在的に排除することが可能になる。

第一のスクリーニングの際と同様に、Ｒ比は、上述の式に従って測定され、Ｒ比が１．５以上のペプチドが、最良に機能するペプチド、即ち活動性結核（活動性ＴＢ）の特異的抗体に強い親和性を有するペプチドであるとして選択される。

有利には本発明は、第一の選択の際に、確認された活動性結核に罹患した患者に由来する独立した血清プールの少なくとも２つについてＲ比の値が１．５以上となるペプチドのみが選択される、上述の方法に関する。

もちろん、プールでの第一のスクリーニングの際に、前述の少なくとも２つのプールのそれぞれでＲ比が１．５以上になるペプチド、及び前述の少なくとも２つのプールを構成する前述の血清のそれぞれでＲ比が１．５以上になるペプチドを選択することが、特に興味深く、かつ有利になる。

別の有利な実施形態において、本発明は、親水性ペプチドがそれらの見かけの親水性に基づいて生物情報学により同定される、先に定義された方法に関する。

先に議論された通り、異なる基準（クライテリア）を用いて、本発明の方法により免疫原性を決定するために試験されなければならない潜在的親水性ペプチドを決定することができる。このペプチド選択は、ハイドロパシー、安定性、溶解度、二次構造、全ペプチド中の該ペプチドのアクセシビリティー、フレキシビリティーなど、当業者ごとに異なる適合規準を推定することによる情報学により、実施され得る。当業者は、ペプチドが本発明の意味において親水性と見なされるかどうか、そして前述の方法を利用してスクリーニングされるべきかどうかを決定するための最も適切な基準（又は複数の基準）を選択する方法を認識しているであろう。

別の有利な実施形態によれば、本発明は、親水性ペプチドが１５〜２５アミノ酸のサイズを有する、上述の方法に関する。

本発明でスクリーニングされるペプチドは、１５〜２５アミノ酸の平均サイズを有する、即ち１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５の天然アミノ酸を有する、ペプチドである。

これらのペプチドはまた、１つ又は複数のアミノ酸残基で修飾され得る。例えば、システインＩＩ残基などの特定の残基を保護することにより、これらのペプチド上で、他のＮ−末端又はＣ−末端化学基を付加し、それにより迅速な試験（基板へのグラフティング、エピトープ提示、コンフォメーションなど）での操作及び使用をより容易にすることができる。これらの基は、例えばビオチン、ＢＳＡの可溶性「キャリア」タンパク質、チオール又はＮＨ２タイプであり得る（該当するペプチド配列中に存在しないのであれば）。

有利には本発明は、免疫複合体が免疫グロブリンの一定部分に対する標識抗体を用いて免疫検出により検出される、先に記載された方法に関する。

本発明はまた、上記の方法を用いて獲得又はスクリーニングすることが可能な、患者の血液試料中の活動性結核を検出することを意図した少なくとも１種の親水性ペプチドに関する。

さらに本発明は、個体の活動性結核を診断する上で使用するための、上述の方法を用いてスクリーニングすることが可能なペプチドに関する。

本発明はさらに、疎水性タンパク質に由来する、１５〜２５のアミノ酸を含む少なくとも１種の親水性ペプチドであって、前述の疎水性タンパク質が、マイコバクテリウム属の細菌壁タンパク質であり、前述の疎水性タンパク質が、脂質分解活性を有する、少なくとも１種の親水性ペプチドに関する。

本発明はまた、個体における活動性結核を診断する上で使用するための、疎水性タンパク質に由来する１５〜２５のアミノ酸を含む親水性ペプチドであって、前述の疎水性タンパク質が、マイコバクテリウム属の細菌壁タンパク質であり、前述の疎水性タンパク質が、脂質分解活性を有する、親水性ペプチドに関する。

これまで述べられた通り、上述の方法を利用してスクリーニングされたペプチドは、個体における活動性結核を診断するための方法を実施するために特に有利である。事実、これらのペプチドは、活動性結核に罹患した患者の血清中に特異的に存在する抗体を検出する能力について選択されるため、該ペプチドは、結核に関して個体の血清学的状況を決定する際に特に効果的である。

１つの有利な実施形態において、本発明は、以下の配列：配列番号１〜配列番号３０のいずれか１つにより表される、上記で定義された親水性ペプチドに関する。

本発明において、配列番号１〜配列番号３０は、以下の配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０を指す。

本発明の最も有利なペプチドは、４つの独立した血清プールで１．５よりも有意に大きいＲ比を有する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５のペプチドである。

Ｒ比が被験血清４つのうち３つで１．５より大きくなる限り、ペプチド配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号１９もまた興味深い。

本発明はまた、有利には、個体における活動性結核を診断する上で使用するための、以下の配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０を有するペプチドのうちから選択されるペプチドの少なくとも１種を含む組成物に関する。

有利には本発明は、以下の配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５を有するペプチドのうちから選択されるペプチドの少なくとも１種を含む、前述の使用のための組成物に関する。

有利には本発明は、以下の配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９を有するペプチドのうちから選択されるペプチドの少なくとも１種を含む、前述の使用のための組成物に関する。

本発明はまた、活動性結核に罹患している可能性のある個体を診断するインビトロ方法であって、
− 前述の個体の血液試料を、先に定義された少なくとも１種の親水性ペプチドと接触させるステップと、
− 前述の血液試料の少なくとも１種の抗体と前述のペプチドとの免疫複合体を検出するステップと、
を含む、インビトロ方法に関する。

別の態様によれば、本発明は、前述の個体からの血液試料、特に血清を、配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０を有するペプチドのうちから選択される少なくとも１種のペプチドと接触させるためのステップと、
前述の血液試料の少なくとも１種の抗体と前述の少なくとも１種のペプチドとの少なくとも１種の免疫複合体を検出するためのステップと、
を含む、個体における活動性結核を診断するための方法に関する。

本発明はさらに、
− 先に定義された少なくとも１種の親水性ペプチドと、
− 個体の血液試料に由来する少なくとも１種の抗体と、前述の少なくとも１種のペプチドと、の間の免疫複合体を同定するための手段と、
を含む、活動性結核を診断するためのキットに関する。

本発明によるキットにおいて、前述の少なくとも１種のペプチドは、特に配列：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０を有するペプチドのうちから選択されるペプチドである。

免疫複合体を検出するための手段は、抗体、特にヒト抗体の一定部分を特異的に認識し、特に蛍光色素、酵素などと連結することが可能である、免疫グロブリンを提供することを含み得る。当業者は、どのタイプの標識免疫グロブリンがそのようなキットを製造するのに、そして免疫複合体の検出を実施するのに適するかを認識している。

有利には本発明は、クロマトグラフィータイプの基質上に配列された、個体の血液試料に由来する少なくとも１種の抗体の間の免疫複合体を同定するための手段を含む、先に定義されたキットに関する。磁気ボール又は「エレクトロセンサー」などの他の形式もまた、使用され得る。

本発明の１つの有利な態様によれば、キットは、血液の液滴を付着させることにより全ての状況で使用可能になる可搬式キットの形態で活動性結核を検出するために提供される。そのようなキットは、２、３分しかかからない迅速検出キットである。そのような可搬式キットの例が、図１に示される。

有利には本発明は、少なくとも１種の陽性対照をさらに含む、前述のキットに関する。それが、検査室で用いられるキットを含むか、又はとりわけ可搬式キットを含むか、に関係なく、陽性対照、即ち活動性結核が存在する、又は活動性結核が臨床的に確認されている１人又は複数の患者に由来する血清を有することが特に適切である。

静脈血又は毛細管血から活動性ＴＢを簡便に、合理的に、かつ迅速に診断する可能性は、他の感染（例えば、ＨＩＶ）を検出するための迅速な試験と少なくとも同等な医療的及び経済的成功である。該試験の特異性は、最適でないが、良好な予測陰性値により、疾患をスクリーニングして確認試験への方向づけを提供するための非常に広範なファーストライン使用の試験が可能になる。活動性ＴＢのスクリーニング又は診断のための迅速な試験の開発は、結核の根絶のためにＷＨＯにより設定された目的の適合に極めて著しく貢献する。

別の有利な実施形態において、本発明は、前述の少なくとも１種の親水性ペプチドが磁気ナノシェルと連結されている、上述のキットに関する。

本発明によるペプチドと磁気ナノシェルとの連結により、伝統的なＥＬＩＳＡ免疫試験と類似の結果を、より少量のペプチドで、とりわけ１０分未満で（伝統的なＥＬＩＳＡでのおよそ２時間に対し）得ることができる。免疫複合体は、それらが形成されるシェルのおかげで磁気により単離されるため、そのような連結の利点は、非特異的相互作用を排除するために必要となる洗浄時間が抑制されることである。

本発明はさらに、個体における活動性結核を診断する上で使用するための、先に定義された親水性ペプチド、特に配列：配列番号１〜３０のいずれか１つから本質的になる、又はそれからなる親水性ペプチドに関する。

先に述べられた通り、本発明の特異的ペプチドは、結核菌ペプチドに対する抗体を検出するのに、つまり個体において活動性結核の診断を可能にするのに非常に適する。

本発明は、以下の図及び実施例を参照すればより良好に理解されよう。

本発明による例示的な可搬式キットを示す。

図１の実施形態の代表的な図を示す。

活動性結核の陽性診断（＋＋）又は陰性診断（−）で得られた視覚的結果の略図である。Ｔは、試料の陽性の顕著な表示を表し、Ｔ＋は、反応の陽性対照を示す。矢印は、移動方向を示す。

指数形態（本発明によるＲ比）の被験ペプチドの反応性のヒストグラムを示す。 同上。 同上。 同上。

指数形態（本発明によるＲ比）のペプチドＣ２、Ｃ１２、Ｍ３、Ｖ５及びＧ９（それぞれ配列：配列番号１〜５により示される）の反応性のヒストグラムを示す。バーは、ペプチドそれぞれについて試験された４つのプールを示す。

ペプチド：配列番号３を用いて伝統的なＥＬＩＳＡ技術（暗灰色の棒）とナノシェル技術（明灰色の棒）との、得られた結果の比較を示すヒストグラムを表す。試料１及び２は、陽性対照に対応し、試料３及び４は、陰性対照に対応し、試料５〜７は、患者の血清に対応し、試料８は、陰性と告知され試料に対応する。

検査室からの「実験台」バージョン（黒色の棒）と、開発された試作品の「可搬式」バージョン（灰色の棒）と、の１９種のヒト血清（試料１〜２７の活動性ＴＢの陽性１３種、及び試料Ｎｅｇ１〜Ｎｅｇ６の非感染の陰性６種）の評価結果の比較を示すヒストグラムを表す。

最適化された可搬式試作品により一重盲検で試験された試料２０種（１５種の陽性及び５種の陰性）の分析で得られたシグナルの平均を示したヒストグラムを示す。陽性試料は、１、３、４、５、７、８、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１９、２０番である。陰性試料は、２、６、９、１３、１８番である。

陰性（Ｎｅｇ６）又は陽性（Ｐｏｓ１）試料で磁気ナノシェル−診断候補ペプチド連結物の経時的な安定性の評価を示したヒストグラムを表す。このヒストグラムは、ナノシェルで異なる時間間隔でグラフトされた同じペプチド（Ｍ３）を用いた、磁気ナノシェルでの同じ技術による２種の患者血清試料（陰性１種及び陽性１種）の評価を示す。両者で、グラフトされて２０１６年１１月２４日に試験されたペプチドを、２０１７年９月１２日にグラフトされて、２０１６年１１月３０日及び２０１６年１２月１日（患者２名それぞれの最初の２つのヒストグラム）に試験された同じペプチドと比較して分析した。このペプチドで経時的なシグナルの減少が認められ、それは溶液中のペプチドの不安定性、又はグラフティングの再現性の欠如により説明され得る。

図１を参照すると、本発明による活動性結核を診断するためのキットは、試料と陽性対照との反応性を検出すること、試料と本発明による少なくとも１種のペプチドとの反応性を検出すること、及び試験される血清の試料を付着させること、を可能にする、それぞれ３つのウィンドウ２、３、４を含むカセット１を含むデバイスで構成される。カセット１は、ウィンドウ４より下に配置された、
− 該付着された試料（血液、血清、ヒト血漿）の高分子ろ過を行い、マトリックス（イオン強度（ｉｏｎｉｃ ｆｏｒｃｅ）、吸収速度など）のモニタリングを可能にする、試料基板５と、
− 試験される試料中に含有され、かつ、コロイド金、ラテックス、カーボンなどのトレーサーと連結され得る抗体に対する検出抗体を含むコンジュゲーション基板６と、
を含むリザーバーを覆っている。

ウィンドウ３及び２の下に配置されるのが、ラインの形態の本発明による少なくとも１種のペプチド（ウィンドウ３の下）及びビオチン化ウシアルブミン（ウィンドウ２の下）のラインが固定されたニトロセルロース、ナイロン又はフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）で作製された膜７である。

リザーバーは、膜７と並置された吸収基板８をさらに含み、吸収基板８の機能は、残留液リザーバーとして働くこと、及び移動速度の安定化のためにある。

図２は、使用の際の図１のデバイスを示す。最初に生体試料（特に血液又は血清）を、ウィンドウ４を介して試料基板５に付着させる。吸収基板８により生じた毛細管現象、及び該毛細管現象を促進する特異的移動緩衝液の効果の下、試料の内容物が、一定速度で徐々にコンジュゲーション基板６へ移行し、その後、生体試料の抗体が、検出抗体と連結することが可能になる。

さらに毛細管現象の効果の下で、試料の内容物が、コンジュゲーション基板６から膜７へ移動する。それらが、本発明によるペプチドラインを通過すると、本発明のペプチドに対する抗体が免疫反応により固定され、試料の残りは移動し続ける。同じことが、対照ラインにもあてはまる。

図３に示される通り、試験される試料が、膜７に付着されている本発明のペプチドに対する抗体を含む場合、該ペプチドは固定及び蓄積され、標識された該抗体との連結により、試験ゾーンＴで、反応の指示ラインの出現を認めることができる。

［実施例１］ − スクリーニングされるペプチドの同定

本発明者らは、脂質分解酵素のファミリーにおける２５種の組換えタンパク質から、８００種を超えるペプチドをコンピュータにより異なる特徴：疎水性、二次構造などに基づいて階層化するために、エピトープスクリーニングを実施した。このランキングにより、活動性結核の診断のための最も有望な特徴をそろえた２００種の候補を選択することができた。次に２００種のペプチドそれぞれの免疫原性を、これらのペプチドのスクリーニングのためのＥＬＩＳＡ試験で評価した。患者プールで得られた結果から、３０種の最良候補が、連続の技術的評価のためにとり置かれた。

コンピュータアルゴリズムを使用し、提供された遺伝子配列から、診断候補タンパク質の主な特徴を同定して、最良の潜在的ペプチドの分類を確立した。全てにおいて、本発明者らは、コンピュータでの理論的免疫原性に基づき４群（１、２、３及び「ｂａｄ」）（１は最も良く、「ｂａｄ」は最も悪い）に分類された１５種のアミノ酸による８３３種の重複ペプチドのリストを得た。被験ペプチド２００種に関する情報を、以下の表１に示す：

ペプチドの免疫原性を決定するために、ペプチドを以下のＥＬＩＳＡ試験を用いて試験する。

ペプチドをＭａｘｉｓｏｒｐ（高結合）プレートに固定する：４℃で一晩インキュベーション、タンパク質濃度２０〜５０μｇ／ｍｌ。

ウェルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）３００μＬですすぐ。

「ウェル」を、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００μＬ及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０により周囲温度（１９℃〜２５℃）で２時間ブロックする。

ウェルをＰＢＳ ２００μＬですすぐ。

ブロッキング溶液で１／１００に希釈された活動性ＴＡに罹患した患者の血清１００μＬを付着させて、３７℃で１時間インキュベートする。

（３００μＬ）ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ２０（０．０５％）で３回の洗浄を実施する。

ペルオキシダーゼをコンジュゲートされた抗体１００μＬを添加して、ブロッキング溶液で１／２０，０００に希釈し、３７℃で１時間インキュベートする。

（３００μＬ）ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ２０（０．０５％）で３回の洗浄を実施する。

３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）１００μＬを添加して、暗所で２０分間インキュベートする。

１Ｎ硫酸 ５０μＬを付着させる。

分光光度計を４５０ｎｍで使用して、ペルオキシダーゼにより変換されたＴＭＢの量（ペプチドと、血清に含有される抗体との免疫複合体の形成を示す）を読み取る。

図４〜７は、異なる被験ペプチドのＲ比（指数）を示したヒストグラムを示す。

図８は、最も有望なペプチドＣ２、Ｃ１２、Ｍ３、Ｖ５及びＧ９（それぞれ配列：配列番号１〜５により示される）の反応性を示す。

［実施例２］ − スクリーニングに用いられたプール中の異なる個々の患者からの試料に対するペプチド４種の反応性

断片化されたペプチドが、実際に活動性結核を診断し得ることを確認するために、本発明者らは、ペプチド４種(Ｍ３：配列番号３、Ｃ１２：配列番号２、Ｃ２：配列番号１及びＯ７：配列番号６)の反応性を試験した。

以下の表は、患者１６名の血清で得られた結果を示す。

＋＋＋：極度な陽性； ＋：陽性； ＋／−：低い陽性値； −：陰性

この結果から、最良の同定された候補５種のうち３種（Ｍ３、Ｃ２、Ｃ１２）が、活動性ＴＢに罹患した被験個体の大部分（又は９４％）を検出し、患者プールで得られた結果が確認されることが示される。逆に、Ｏ７の診断性能はより低く、これらの被験患者での活動性ＴＢの症例の同定について７０％未満の感度である。

［実施例３］ − 用いられた試料のプール数によるペプチドの反応性の比較

ペプチドの反応性を評価すること、及び活動性結核診断試験に最も有望なものを選択することを目的として、本発明者らは、複数の異なる試料プールでペプチドそれぞれの免疫原性を評価した。被験プールの全てについて反応性を有するものを、最良の候補として選択した。以下の表は、３種の被験ペプチドと、異なる２種の陽性試料プールとの実施例を示す。

比率１．５が見出されたペプチドを、スクリーニング終了時に選択し、活動性ＴＢの最良の診断候補の１つとする。被験ペプチド全てのうち、一部は、両方の患者プールで１．５を超える比率を有し（例Ｄ７）、その他は、２つのプールの一方で陽性（例Ｃ４）又は両方のプールで陰性である（例Ｂ４）。次に、ペプチドのスクリーニングを、活動性ＴＢにより感染されている、又は感染されていない個々の患者の試料を用いることにより精査した。

［実施例３］ − 結核を検出するための別の方法

本発明者らにより実施されたコンセプトのＥＬＩＳＡ立証法に続いて、本発明に記載された最良の結核診断候補ペプチドを統合することにより、ラテラルフロー試験を開発した。これらの結果は、本仕様（スペシフィケーション）の予測及びＷＨＯの目的生成物のプロファイルを満たすほど十分に良好ではなかった。それゆえ本発明者らは、このラテラルフロー方策を取り止めて、より良好な性能の別法を模索することを選択した。

本発明者らは、磁気ナノシェルでの技術を開発し、それによりＥＬＩＳＡ試験の性能を著しく改善し、洗浄をなくしてわずか２、３分以内で実施することができた。この方策は、既存の構成要素を小型化して迅速な検査室診断解決法及び今後のポイントオブケア試験を提案するという見通しに適合する。ナノシェル技術は、検査室の実験台バージョンで開発されており、現場から持ち出すことができない。これは、初期試験バージョンである。このバージョンで実施された最初の試験は、磁気ナノシェルを本発明の最良の診断候補ペプチドと組み合わせることにより、そして患者血清中の抗体を検出するための方策を用いることにより、本発明者らがＥＬＩＳＡの結果と少なくとも同程度に良好な結果を、より少量のペプチドで、とりわけ１０分未満で（伝統的なＥＬＩＳＡでのおよそ２時間に対して）得たことを示している。最良のペプチド５種のうち１種の結果の例を、図９に示す。

それゆえ本発明者らは、実験を押し進め、最適化試験（血清の希釈、組み合わせでのペプチドの試験、検出抗体の選択、バックグランドノイズの制御など）の後に、本発明者らは、最良の候補５種のうちから用いられる最良ペプチドを同定した。並行して、可搬式試作品を開発して、本発明者らは１９種の試料を試験した（活動性ＴＢの患者１３名及び当該疾患について陰性の患者６名）。図１０の結果から、この可搬式試作品により本発明者らにより過去に開発された実験台システムで得られた結果と少なくとも同程度に良好な結果を得ることができ、こうして陽性患者と陰性患者を明白に識別し得ることが示される。

最後に、他の試料２０種で実施された直近の試験で、活動性ＴＢの患者と感染していない患者とを識別する可搬式試作品の能力を一重盲検により評価し（図１１）、診断候補ペプチドと、可搬式ナノシェルによる技術との組み合わせを統合した試験の性能を確認した。

再現性試験も実施したが、いずれの変動も示されていない。試験シグナルの経時的に緩徐な低下が観察されたため（図１２）、ナノシェル−ペプチド連結物の安定性を改善することが可能である。

それゆえ、可搬式試作品は、非常に期待の持てる結果を示す。

本発明は、示された実施形態に限定されず、他の実施形態が、当業者に明白に案出されるであろう。

Claims (11)

1. 活動性結核に罹患した個体の血清に由来する少なくとも１種の抗体を認識することが可能な該当する少なくとも１種の免疫原性ペプチドをスクリーニングするインビトロ方法であって、前記少なくとも１種の免疫原性ペプチドが、疎水性タンパク質に由来する親水性ペプチドであり、前記疎水性タンパク質が、マイコバクテリウム属の細菌の壁のタンパク質であるか、又は前記マイコバクテリウム属の細菌から分泌され、前記疎水性タンパク質が、脂質分解活性を有し、
   前記方法が、以下のステップ：
   − 少なくとも１種の疎水性タンパク質から生じた少なくとも１種の親水性ペプチドを、
   − 連続で、前記抗体と前記スクリーニングされるペプチドとの免疫複合体の形成を可能にする、確認された活動性結核に罹患した患者に由来する少なくとも２つの独立した血清プールと、
   − 結核に罹患していない個体に由来する少なくとも１種の対照試料と、
   に接触させるステップと、
   − 前のステップにおける免疫複合体の前記形成を検出するステップと、
   − 確認された活動性結核に罹患した患者に由来する独立した血清のプールの少なくとも１つについてＲ比の値が１．５以上となる、該当するペプチドの第一の選択を実行するステップと、
   を含み、
   前記Ｒ比が、前記健常な個体に由来する試料から得られた正規化された測定値に対する、免疫複合体の前記形成の正規化された測定値である、スクリーニング方法。
2. 以下のステップ：
   − 前記第一の選択ステップで選択された前記ペプチドを、確認された活動性結核に罹患した患者に由来する前記独立した血清プールを構成する個々の血清それぞれと接触させて、前記抗体と前記スクリーニングされるペプチドとの免疫複合体を形成させるステップと、
   − 前のステップにおける免疫複合体の前記形成を検出するステップと、
   − 確認された活動性結核を有する患者の前記独立した血清プールを構成する個々の血清それぞれでＲ比の値が１．５以上となる、該当するペプチドの第二の選択を実行するステップと、
   をさらに含む、請求項１に記載にスクリーニング方法。
3. 前記第一の選択の際に、確認された活動性結核に罹患した患者に由来する独立した血清プールの少なくとも２つについて、Ｒ比の値が１．５以上となるペプチドのみが選択される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記親水性ペプチドが、１５〜２５アミノ酸のサイズを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 疎水性タンパク質に由来する１５〜２５のアミノ酸を含む、又は前記アミノ酸からなる、親水性ペプチドであって、前記疎水性タンパク質が、マイコバクテリウム属の細菌の壁のタンパク質であるか、又は前記マイコバクテリウム属の細菌から分泌され、前記疎水性タンパク質が、脂質分解活性を有する、親水性ペプチド。
6. 以下の配列：配列番号１〜配列番号３０のいずれか１つ、特に以下の配列：配列番号１〜配列番号５のいずれか１つにより表される、請求項６に記載の親水性ペプチド。
7. 活動性結核に罹患している可能性のある個体を診断するインビトロ方法であって、
   − 前記個体の血液試料を、上記で定義された少なくとも１種の親水性ペプチドと接触させるステップと、
   − 前記血液試料の少なくとも１種の抗体と前記ペプチドとの免疫複合体を検出するステップと、
   を含む、インビトロ方法。
8. − 請求項５又は６のいずれか１項に定義された少なくとも１種の親水性ペプチドと、
   − 個体の血液試料に由来する少なくとも１種の抗体と、前記少なくとも１種のペプチドと、の間の免疫複合体を同定するための手段と、
   を含む、活動性結核を診断するためのキット。
9. クロマトグラフィータイプの基質上に配列された、個体の血液試料に由来する少なくとも１種の抗体との間の免疫複合体を同定するための手段を含む、請求項８に記載の診断キット。
10. 前記少なくとも１種の親水性ペプチドが、磁気ナノシェルと連結されている、請求項８に記載の診断キット。
11. 個体における活動性結核を診断する上で使用するための、請求項５又は６に記載の親水性ペプチド。