CA3014034A1 - Peptides immunogenes et leur utilisation - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une méthode de criblage in vitrode peptides immunogènes d'intérêt capables de reconnaître des anticorps issus du sérum d'individus atteints de tuberculose active, ladite méthode comprenant : - la mise en contact de peptides du sérum issu de patients atteints de tuberculose active - la détection de la formation de complexes immuns à l'étape précédente, et - la sélection des peptides d'intérêt pour lesquels la valeur d'un ratio R est supérieure ou égale à 1,5, le ratio R étant la valeur de mesure de la formation de complexe immun sur la valeur de mesure obtenu à partir de l'échantillon contrôle.

Description

Peptides immunogènes et leur utilisation [1] La présente invention concerne des peptides immunogènes et leur utilisation, notamment dans le cadre du diagnostic de pathologies.

[2] Avec un tiers de la population mondiale infectée et un décès toutes les 20 secondes, la tuberculose (TB) reste une des maladies les plus meurtrières au monde.
Aucun test de diagnostic rapide, précis et validé selon les attentes des autorités de santé, et notamment de l'Organisation Mondiale pour la Santé (OMS) n'est commercialisé à ce jour, le test de référence nécessitant plusieurs semaines avant de donner un résultat.

[3] Aujourd'hui, les méthodes internationales de référence pour le diagnostic de la TB sont longues (jusqu'à 8 semaines pour la culture bactériologique), insuffisamment performantes, coûteuses et difficiles à mettre en oeuvre car elles utilisent des prélèvements pulmonaires, nécessitent un laboratoire de niveau de sécurité 3 ainsi que l'hospitalisation du malade.

[4] Pour la première fois de son histoire, l'OMS a publié en 2011 une recommandation de politique générale explicitement négative contre l'utilisation de la première génération commercialisée de tests sérologiques pour le diagnostic de la TB
(OMS 2011, commercial sérodiagnostic tests for diagnosis of TB:
policystatement).

[5] Plus d'un million de ces tests non validés cliniquement et avec de mauvaises performances étaient vendus chaque année dans le monde notamment dans les pays du Sud (Afrique, Asie) en profitant des faibles contraintes réglementaires locales. La quasi-totalité de ces tests utilisent les mêmes antigènes et ils n'ont jamais fait l'objet d'une validation clinique rigoureuse entrainant des performances très faibles avec un risque pour les patients.

[6] L'OMS ouvre ainsi la porte à une opportunité pour une nouvelle génération de tests satisfaisants à des critères stricts de qualité et de validation clinique.

[7] Au cours de l'infection latente, le bacille de la TB est contenu dans un macrophage qualifié de spumeux en raison de l'aspect microscopique de son cytoplasme saturé de vacuoles lipidiques. Mycobacteriumtuberculosis stocke les acides gras sous forme de triglycérides (TG) permettant l'entrée de la bactérie en phase de dormance (TB latente). Ces vacuoles lipidiques constituent une source de carbone pour la bactérie et sont utilisées par celle-ci pour la sortie de la dormance et sa réactivation (TB active). La réduction des niveaux de TG lors de la réactivation de la TB
coïncide avec l'augmentation de l'activité de certaines protéines dégradant les TG.
Certaines de ces protéines, jusqu'alors peu étudiées, semblent étroitement associées à la réactivation de la TB à partir des formes latentes et présentent donc un intérêt majeur pour l'identification précoce de la TB active ou pour le suivi des cas de TB
latente à

haut risque de développer la forme grave de la maladie.

[8] On connait de l'état de la technique la demande de brevet WO/2012/164088 qui enseigne une méthode de diagnostic de la tuberculose active basé sur des ELISpot B
utilisant des protéines lipases à activité lipolytique.

[9] Toutefois, une telle méthode, bien qu'efficace dans la cadre de la détection précoce de la tuberculose active ne peut être mise en oeuvre qu'avec un matériel lourd dans un laboratoire équipé, nécessite des compétences techniques spécifiqueset ne peut donc être utilisée simplement sur le terrain auprès des populations à
risque.

[10] Aussi, existe-t-il un besoin de fournir une méthode plus simple qui conserve un niveau de sensibilité de détection de la TB active au moins aussi bon que celui obtenu avec la méthode de la demande W0/2012/164088.

[11] Un des buts de l'invention est donc de fournir une méthode de diagnostic de la tuberculose active qui puisse être mise en oeuvre facilement en toute situation, et en particulier en l'absence de d'infrastructures hospitalières fortement équipées.

[12] Un autre but de l'invention est de déterminer les meilleurs candidats peptidiques permettant de mettre en oeuvre cette nouvelle méthode de diagnostic efficace et rapide.

[13] Aussi l'invention concerne une méthode de criblage in vitro d'au moins un peptide immunogène d'intérêt capable de reconnaitre au moins un anticorps issu du sérum d'individus atteints de tuberculose active, ledit au moins un peptide immunogène étant un peptide hydrophile issu d'une protéine hydrophobe, ladite protéine hydrophobe étant une protéine de paroi, ou sécrétées, de bactéries du genre Mycobacterium, ladite protéine hydrophobe présentant une activité lipolytique, ladite méthode comprenant les étapes suivantes:
+ la mise en contact d'au moins un peptide hydrophile issu d'au moins une protéine hydrophobe avec - successivement au moins deux pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée, pour permettre la formation de complexes immuns entre lesdits anticorps et lesdits peptides à cribler, et - au moins un échantillon contrôle issu d'un individu n'étant pas atteint de tuberculose, + ,la détection de la formation de complexes immuns à l'étape précédente, + une première sélection des peptides d'intérêt pour lesquels la valeur d'un ratio R est supérieure ou égale à 1,5 pour au moins un des pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée, le ratio R étant la valeur normalisée de mesure de la formation de complexe immun, par rapport aux bruits de fond respectifs des sérums et des composants utilisés pour détecter les complexes immuns, sur, ou divisé par, la valeur de mesure normalisée obtenue à partir de l'échantillon issu d'un individu sain par rapport aux bruits de fond respectifs des sérums et des composants utilisés pour détecter les complexes immuns.

[14] L'invention repose sur la constatation surprenante faite par les inventeurs selon laquelle certains peptides issus de protéines déterminées sont de très bons candidats pour mettre en oeuvre une méthode de diagnostic de la tuberculose active, tout en proposant une sensibilité et une efficacité de détection de la pathologie à un niveau élevé.

[15] Le diagnostic proposé par l'invention peut être réalisée chez l'homme mais aussi chez les animaux.

[16] Ci-après, la tuberculose sera désignée de manière uniforme "la tuberculose ou T B)>.

[17] Dans l'invention, les termes "protéine hydrophobe présentant une activité

lipolytique" sont utilisés pour désigner une enzyme à activité lipolytique et comprennent, phospholipases A, 6, C ou D, et les lipases, notamment de triglycérides lipases, des lipases ou des diglycérides, de monoglycérides lipases.

[18] Durant l'infection, Mycobacteriumtuberculosis accumule des corps d'inclusion intracellulaires chargés de lipides dont les lipides sont probablement issus de la dégradation de la membrane cellulaire de l'hôte. On dispose désormais de fortes évidences supportant le fait que les acides gras représentent une source de carbone durant la dormance. Mycobacteriumtuberculosis stocke des acides gras sous la forme de triacylglycérol (TAG) lors de son entrée dans le stade non réplicatif persistant (état latent). De plus, des granulomes contenant des macrophages spumeux qui sont des cellules contenant dans leur cytoplasme une grande quantité de lipides neutres entourés de phospholipides ont été trouvés. Ces corps lipidiques sont induits par l'internalisation de la bactérie et par conséquent fournissent une source de carbone pour la survie et la réactivation du pathogène. Plus généralement, ces découvertes supportent le fait que les enzymes impliquées dans la dégradation des lipides peuvent assumer des fonctions physiologiques importantes et peuvent participer à
l'extraordinaire capacité de survie et à laréactivation de Mycobacteriumtuberculosis à
partir des cellules infectées. La dégradation des lipides de l'hôte par Mycobacteriumtuberculosis est probablement réalisée par des enzymes lipolytiques, telles que les lipases et les phospholipases, comprenant la famille des enzymes cutinases.

[19] Les lipases sont des protéines solubles dans l'eau ayant une activité
lipolytique appartenant au groupe des estérases et catalysant l'hydrolyse de substrats insolubles dans l'eau comme les liaisons ester du triacylglycérol et des phospholipides.

[20] Dans ce contexte, la réaction catalytique de lipolyse implique différents processus à l'interface et dépend étroitement de la structure des substrats lipidiques présents dans les émulsions huile dans, eau, les bicouches membranaires, les monocouches, les micelles et les vésicules. Le processus catalytique peut être décrit comme une étape réversible d'adsorption/désorption des lipases ayant lieu à
l'interface huile/eau, suivie par la formation d'un complexe enzyme/substrat à l'interface et la libération des produits de lipolyse. Parmi les lipases de M. tuberculosis identifiées, 24 ont été classées dans la famille des enzymes appelée "famille Lip". Toutefois, cette classification est seulementbasée sur la présence de la séquence consensus GXSXG
qui est caractéristique des estérases et des membres de la famille des hydrolases possédant des feuillets a/6.

[21] Dans l'invention, la méthode de détection de peptides immunogènes repose donc sur la mise à profit des propriétés des protéines à activité lipolytique (qui permettent de détecter la tuberculose active) tout en s'affranchissant de la difficulté de travailler avec des protéines entières, qui peuvent être difficiles à
manipuler et/ou couteuses et complexe à produire.

[22] En effet, il est particulièrement pertinent de trouver de petits fragments immunogènes desdites protéines à activité lipolytiques, puisque celles-ci sont des protéines membranaires (insérées dans la bicouche lipidique) et sont par conséquent hydrophobes, ou tout simplement car il s'agit de protéines dégradant les lipides, donc hydrophobes.

[23] Par protéine hydrophobe , en entend dans l'invention une protéine qui est considérée, dans sa globalité comme présentant peu d'affinité pour les solutions aqueuses et qui sera peu à même de se dissoudre dans un liquide aqueux.

[24] Les protéines sont composés d'acides aminés qui peuvent être polaires (hydrophiles) ou hydrophobes. Lorsque la protéine est synthétisée, elle adopte une conformation tridimensionnelle spécifique liée à son activité ou sa fonction de sorte que les acides aminés éloignés les uns des autres dans la séquence peuvent se retrouver à
proximité dans l'espace. Si au cours du repliement d'une protéine, l'ensemble des acides aminés polaires se retrouvent à l'intérieur d'une poche qui est entourée d'acides aminés hydrophobes, la protéine entière sera alors considérée comme hydrophobe, ceci même si la proportion d'acides aminés hydrophiles est plus importante que celle des acides aminés hydrophobes.

[25] De la même manière, une protéine sera considérée comme hydrophile, si sa conformation tridimensionnelle est telle que la majorité des acides aminés présents à la surface de la protéine sont hydrophiles.

[26] La notion d'hydrophilie et d'hydrophobicité d'une protéine sont bien connus de l'homme du métier. Il est d'ailleurs possible pour l'homme du métier, à partir de la séquence primaire d'une protéine de déterminer son profil hydrophilie/hydrophobicité
en prédisant sa structure et son indice d'hydrophobicité.

[27] Dans l'invention on appelle peptide hydrophile issu d'une protéine hydrophobe)> un fragment de ladite protéine hydrophobe, telle que définie ci-dessus, dont les propriétés sont d'être facilement soluble et stable dans un liquide aqueux, c'est-à-dire dans l'eau ou des solvants polaires.

[28] Pour prédire les peptides hydrophiles à cribler selon l'invention à
partir de protéines hydrophobes, il est notamment possible de se baser sur la solubilité
desdits peptides. Les séquences possédant de nombreux résidus basiques sans résidus acides intercalant (balance acide/basique) peuvent être difficiles à
solubiliser. De ce fait, une balance est déterminée afin d'analyser la solubilité de chacune des séquences peptidiques qui seront susceptibles d'être immunogènes après criblage.

[29] Il est donc important de choisir les peptides dont la balance acide/basique Bab est la plus grande, selon la formule :
Bab = Aaa-Bbb OU
Aaa = (Na/N)x100 avec Na = le nombre de résidu d'acides aminés acides dans la séquence et N = le nombre d'acides aminés, et Bbb = (NbiN)X1 00 avec Na = le nombre de résidu d'acides aminés basiques dans la séquence et N = le nombre d'acides aminés.

[30] La solubilité peut aussi être prédite en comptabilisant le nombre de résidus chargés et en ajoutant les extrémités terminales libres du peptide.
Théoriquement, au moins une charge tous les 5 résidus est requise pour obtenir une solubilité
minimale. Il faut par ailleurs éviter un enchainement de plus de 3 à 4 résidus hydrophobes.
L'hydrophobicité à pH 6.8 permet de vérifier la solubilité du peptide dans un tampon aqueux. Cette valeur permet de vérifier la compatibilité avec les tampons de couplage lors de l'étape de conjugaison à la protéine porteuse.

[31] On notera que l'hydrophobicité à pH=6,8 correspond à la valeur de l'hydrophobicité de chacun des acides aminés à pH= 6,8 sur le nombre total d'acides aminés du peptide considéré.

[32] Il peut notamment être avantageux de vérifier, avant de tester leur immunogénicité que les peptides à cribler sont par exemple i) flexibles, c'est-à-dire non contraints spatialement, c'est à dire avec des épitopes libres d'accès pour les éventuels anticorps par rapport à la structure globale du peptide, ii) s'ils sont retrouvés dans des motifs protéiques conservés ou des structures secondaires (hélices, feuillets 6) ce qui diminuerait leur spécificité, iii) s'ils sont retrouvés dans des régions exposées sur la protéine entière dont ils dérivent. L'homme du métier pourra également trouver d'autres caractéristiques appropriées qui pourraient compléter son choix de peptides potentiellement immunogènes.

[33] Une fois les peptides hydrophiles identifiés, leur immunogénicité est alors testée selon le procédé suivant :
1- chaque peptide est mis en contact avec au moins deux pools de sérums, les sérums étant issus de patients atteints de TB active confirmée cliniquement, et 2- en parallèle avec un échantillon contrôle issus d'un individu sain, qui n'est pas atteint de tuberculose, notamment active, c'est-à-dire un individu qui n'a jamais été en contact avec la tuberculose ou un patient qui est en phase latente de la tuberculose (et n'a donc pas développé de tuberculose active).

[34] L'objectif est de déterminer si les peptides testés sont capables de former des complexes immuns avec au moins un anticorps contenu dans lesdits pools de sérums d'individus atteints de TB active, ce qui signifie que les peptides sont potentiellement immunogènes.

[35] Les potentiels complexes immuns sont détectés selon des méthodes classiques qui consistent à marquer et identifier la présence d'un complexe immun en détectant la partie constante des anticorps qui ont potentiellement interagi avec les peptides à
cribler au moyen d'immunoglobuline spécifiques des parties constantes des anticorps couplées à des marqueurs permettant une quantification.

[36] Une méthode de laboratoire classique de détection de ces complexes immuns consiste en un test ELISA (Enzyme-linkedImmunoSorbentAssay). Cette méthode de détection peut aussi être adaptée sur différents supports solides pour faciliter l'identification des complexes immuns en dehors des laboratoires.

[37] Afin de déterminer lesquels des peptides sont intéressant, un ratio R est calculé, le ratio R étant la valeur normalisée de mesure de la formation de complexe immun, par rapport aux bruits de fond respectifs des sérums et des composants utilisés pour détecter les complexes immuns, sur, ou divisé par, la valeur de mesure normalisée obtenue à partir de l'échantillon issu d'un individu sain par rapport aux bruits de fond respectifs des sérums et des composants utilisés pour détecter les complexes immuns.

[38] Cela signifie que la formule suivante est appliquée :
R(Vp + e ¨ VBIanc) ¨ (Vs + e ¨ VBIanc) = _______________________________________________________ (Vp + n ¨ VBIanc) ¨ (Vs + n ¨ VBIanc) où:
- Vp+e correspond à la valeur mesurée lors de la détection d'un complexe immun lorsque le peptide (p) est mis en contact avec le sérum de patient atteint de TB
active (e), - Vs+e correspond à la valeur mesurée lors de la détection d'un complexe immun lorsque le solvant du peptide (s) est mis en contact avec le sérum de patient atteint de TB active (e), - Vp+n correspond à la valeur mesurée lors de la détection d'un complexe immun lorsque le peptide (p) est mis en contact avec le sérum d'un individu sain (n), - Vs correspond à la valeur mesurée lors de la détection d'un complexe immun le solvant du peptide (s) est mis en contact avec le sérum d'un individu sain (n), et - VBIanc correspond à la valeur mesurée lors de la détection d'un complexe immun à en l'absence de sérum quel qu'il soit, de peptide et de solvant.

[39] Les valeurs sont dites normalisées, puisque pour chaque mesure, il est tenu compte du potentiel bruit de fond de chaque matériel biologique : le sérum (on compare les sérums positifs avec le sérum d'un individu sain), le peptide (on compare le peptide avec son solvant)...

[40] Quelle que doit la méthode utilisée pour obtenir le ratio R, si pour un peptide déterminé le ratio tel que calculé ci-dessus est supérieur ou égal à 1,5, le peptide sera considéré comme particulièrement intéressant et susceptible de détecter efficacement des anticorps marqueurs de la TB active. A contrario, si le ratio R est inférieur à 1,5 il ne sera pas retenu.

[41] Dans l'invention, comme cela a été mentionné ci-dessus, chaque peptide est mis en contact avec au moins deux pools de sérums. On utilise dans une première approche un pool ou mélange de plusieurs sérums issus de patients distincts chacun atteints d'une TB active cliniquement établie (résultats de culture microbiologique positive ¨ test clinique de référence). Ces pools permettent de disposer d'un mélange de sérums et ainsi d'augmenter la diversité d'anticorps susceptibles d'être détectés.

[42] On utilise des pools indépendants, c'est-à-dire des mélanges de sérums qui n'ont pas les mêmes origines. Par exemple, si un premier pool comprend 4 sérums venant de 4 individus différents, un second pool indépendant comportera plusieurs sérums dont aucun ne sera en commun avec l'un au moins des sérums du premier pool.

[43] Avantageusement, comme il est mentionné plus haut, les complexes immuns entre le peptide et les anticorps contenus dans les pools sont quantifiés par immunodétection en utilisant des immunoglobulines couplées à un agent de détection.
Il est par exemple possible, selon le marqueur utilisé de mesurer la densité
optique DO.
Selon le marqueur utilisé, l'homme du métier saura déterminer la meilleure méthode de quantification des complexes immuns.

[44] Dans l'invention, les peptides préférés sont ceux qui ont un ratio R
supérieur à
1,5 pour la totalité des pools des au moins deux pools de sérums. Bien évidemment, seront également intéressants les peptides qui ont un ratio R supérieur ou égal à 1,5 pour un pool des au moins deux pools de sérum. Par contre, ne seront pas sélectionnés les peptides pour lesquels les ratios R, quel que soit le pool considéré des au moins deux pools de sérum, sont inférieurs à 1,5.

[45] Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode de criblage susmentionnée, comprenant en outre les étapes suivantes :
- la mise en contact des peptides sélectionnés à la première étape de sélection avec chacun des sérum individuels composants lesdits pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée, pour permettre la formation de complexes immuns entre lesdits anticorps et lesdits peptides à cribler, - la détection de la formation de complexes immuns à l'étape précédente, et - une seconde sélection des peptides d'intérêt pour lesquels la valeur du ratio R est supérieure ou égale à 1,5 pour avec chacun des sérums individuels composants lesdits pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée.

[46] Avantageusement, une fois qu'un peptide a été identifié selon le procédé
susmentionné, il est également avantageux de procéder à un second test de réactivité
avec individuellement chacun des sérums composant les au moins deux pools. Un tel double criblage confirme la sélection, et permet d'éliminer éventuellement des peptides sélectionnés qui ne reconnaitraient que des anticorps surreprésentés dans l'un des sérums des pools.

[47] Tout comme lors du premier criblage, on mesure le ratio R selon la formule susmentionnée, et les peptides pour lesquels le ratio R est supérieur ou égal à 1,5 sont retenus comme étant des peptides les plus performants, c'est-à-dire les peptides qui ont une bonne affinité pour des anticorps spécifiques de la tuberculose active (TB
active).

[48] Avantageusement, l'invention concerne la méthode susmentionnée dans laquelle lors de la première sélection, seuls sont sélectionnés les peptides pour lesquels la valeur d'un ratio R est supérieure ou égale à 1,5 pour au moins deux des pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée.

[49] Il est bien évidemment particulièrement intéressant et avantageux de sélectionner les peptides pour lesquels, lors du premier criblage en pool, le ratio R est supérieur ou égal à 1,5, pour chacun desdits au moins deux pools, et pour lesquels le ratio R pour chacun desdits sérums composant lesdits au moins deux pools supérieur ou égal à 1,5.

[50] Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode telle que définie ci-dessus, dans laquelle les peptides hydrophiles sont identifiés par bioinformatique, sur la base de leur hydrophilie apparente.

[51] Comme il a été discuté ci-dessus, différents critères peuvent être utilisés pour déterminer les peptides hydrophiles potentiels qui doivent être testés pour déterminer leur immunogénicité selon le procédé de l'invention. Cette sélection de peptide peut être réalisée par informatique en estimant différents critères pertinents pour l'homme du métier, tels que l'hydropathie, la stabilité, la solubilité, la structure secondaire, l'accessibilité du peptide dans la protéine entière, la flexibilité... L'homme du métier saura choisir le ou les critères les plus pertinents pour déterminer si le peptide est considéré comme hydrophile au sens de l'invention et s'il doit être criblé
selon le procédé susmentionné.

[52] Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode susmentionnée, dans laquelle les peptides hydrophiles ont une taille de 15 à
25 acides aminés.

[53] Les peptides qui a cribler dans l'invention sont des peptides de taille moyenne présentant une talle de 15 à 25 acides aminés, c'est-à-dire ayant 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 acides aminés naturels.

[54] Ces peptides peuvent également être modifiés sur un ou plusieurs résidus d'acides aminés, par exemple en protégeant certains résidus tels que les résidus cystéine Il est possible d'ajouter sur ces peptides d'autres groupes chimiques en N-terminal ou C-terminal facilitant leur manipulation et leur utilisation dans un test rapide (greffage au support, présentationépitopique, conformation, etc). Ces groupes peuvent être par exemple la Biotine, protéine carrier)> soluble type BSA, thiol ou NH2 à
condition que celle-ci soit absente de la séquence peptidique d'intérêt.

[55] Avantageusement, l'invention concerne la méthode décrite précédemment dans laquelle les complexes immuns sont détectés par immunodétection à l'aide d'anticorps marqués dirigés contre la partie constante des immunoglobulines.

[56] L'invention concerne également au moins un peptide hydrophile, destiné à
détecter la tuberculose active dans un échantillon sanguin de patient, susceptible d'être obtenu ou criblé par la méthode telle que définie ci-dessus.

[57] En outre, l'invention concerne un peptide susceptible d'être criblé par la méthode susmentionnée, pour son utilisation dans le cadre du diagnostic de la tuberculose active chez un individu.

[58] L'invention concerne en outre au moins un peptide hydrophile, comprenant de 15 à 25 acides aminés, issu d'une protéine hydrophobe, ladite protéine hydrophobe étant une protéine de paroi de bactéries du genre Mycobacterium, ladite protéine hydrophobe présentant une activité lipolytique.

[59] L'invention concerne aussi un peptide un peptide hydrophile, comprenant de 15 à 25 acides aminés, issu d'une protéine hydrophobe, ladite protéine hydrophobe étant une protéine de paroi de bactéries du genre Mycobacterium, ladite protéine hydrophobe présentant une activité lipolytique, pour son utilisation dans le cadre du diagnostic de la tuberculose active chez un individu

[60] Comme cela a été évoqué précédemment, les peptides criblés par la méthode susmentionnée sont particulièrement avantageux pour mettre en oeuvre une méthode de diagnostic de la tuberculose active chez des individus. En effet, puisque ces peptides sont sélectionnés sur leur capacité de détecter des anticorps présents spécifiquement dans le sérum de patients atteints de la tuberculose active, ils seront particulièrement efficaces pour déterminer le statut sérologique d'un individu vis-à-vis de la tuberculose.

[61] Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne un peptide hydrophile, tel que défini ci-dessus, ledit peptide étant représenté par l'une quelconque des séquences suivantes : SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 30.

[62] Par peptides de séquence SEQ ID NO: 1 à SEQ ID NO: 30 on entend dans l'invention les peptides de sequences suivantes : SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO :
12 , SEQ ID NO : 13 , SEQ ID NO : 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ ID NO : 16 , SEQ
ID
NO: 17 , SEQ ID NO : 18 , SEQ ID NO : 19 , SEQ ID NO : 20 , SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 22 , SEQ ID NO : 23 , SEQ ID NO : 24 , SEQ ID NO : 25 , SEQ ID NO
:
26 , SEQ ID NO : 27 , SEQ ID NO : 28 , SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30.

[63] Les peptides les plus avantageux de l'invention sont les peptides de séquence :
SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5, qui ont des ratios R très supérieurs à 1,5 pour quatre pools indépendants de sérums.

[64] Les peptides SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO :

, SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO : 13 , SEQ ID
NO
: 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ ID NO : 16 , SEQ ID NO : 17 , SEQ ID NO : 18 et SEQ
ID NO : 19 sont également intéressants dans la mesure où les ratios R sont supérieurs à 1,5 pour 3 sur 4 sérums testés.

[65] L'invention concerne aussi avantageusement une composition comprenant au moins un des peptides choisis parmi les peptides de sequences suivantes : SEQ
ID NO
: 1, SEQ ID NO : 2 , SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO
:
6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO
:
11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO : 13 , SEQ ID NO : 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ
ID
NO: 16 , SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 18 , SEQ ID NO: 19 , SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22 , SEQ ID NO : 23 , SEQ ID NO : 24 , SEQ ID NO
:

25 , SEQ ID NO : 26 , SEQ ID NO : 27 , SEQ ID NO : 28 , SEQ ID NO : 29 et SEQ
ID NO : 30, pour son utilization dans le cadre du diagnostic de la tuberculose active chez un individu.

[66] Avantageusement, l'invention concerne une composition pour son utilisation susmentionnée, comprenant au moins un des peptides choisis parmi les peptides de séquences suivantes : SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO :

4 et SEQ ID NO: 5.

[67] Avantageusement, l'invention concerne une composition pour son utilization susmentionnée, comprenant au moins un des peptides choisis parmi les peptides de sequences suivantes : SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO
: 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 , SEQ ID
NO :
9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID NO : 13 , SEQ ID

NO: 14 , SEQ ID NO: 15 , SEQ ID NO: 16 , SEQ ID NO: 17 , SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19.

[68] L'invention concerne par ailleurs une méthode de diagnostic in vitro chez un individu susceptible d'être atteint de la tuberculose active, ladite méthode comprenant :
- une étape de mise en contact d'un échantillon sanguin dudit individu avec au moins un peptide hydrophile tel que défini ci-dessus, et - une étape de détection d'un complexe immun entre au moins un anticorps dudit échantillon sanguin et lesdits peptides.

[69] Dans un autre aspect, l'invention concerne une méthode de diagnostic de la tuberculose active chez un individu comprenant une étape de mise en contact d'un échantillon sanguin, notamment du sérum, dudit individu avec au moins un peptide choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID NO : 1 , SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO
:
3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO
:
8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID
NO
: 13 , SEQ ID NO : 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ ID NO : 16 , SEQ ID NO : 17 , SEQ

ID NO : 18 , SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20 , SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23 , SEQ ID NO : 24 , SEQ ID NO : 25 , SEQ ID NO : 26 , SEQ ID NO
:
27 , SEQ ID NO : 28 , SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30, et une étape de détection d'au moins un complexe immun entre au moins un anticorps dudit échantillon sanguin et ledit au moins un peptide.

[70] L'invention concerne en outre un kit de diagnostic de la tuberculose active, comprenant :
- au moins un peptide hydrophile tel que défini ci-dessus, et - des moyens d'identification de complexes immuns entre au moins un anticorps issus d'un échantillon sanguin d'un individu et ledit au moins un peptide.

[71] Dans le kit de l'invention, le dit au moins un peptide est notamment un peptide choisi parmi les peptides des sequence SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:

3 , SEQ ID NO : 4 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO : 6 , SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO
:
8 , SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO : 10 , SEQ ID NO : 11 , SEQ ID NO : 12 , SEQ ID
NO
: 13 , SEQ ID NO : 14 , SEQ ID NO : 15 , SEQ ID NO : 16 , SEQ ID NO : 17 , SEQ

ID NO : 18 , SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20 , SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23 , SEQ ID NO : 24 , SEQ ID NO : 25 , SEQ ID NO : 26 , SEQ ID NO
:
27 , SEQ ID NO : 28 , SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO : 30.

[72] Par moyens de détection de complexes immuns, on peut prévoir des immunoglobulines reconnaissant spécifiquement la partie constante des anticorps, en particulier des anticorps humains, lesdites immunoglobulines pouvant être notamment couplés avec des fluorochromes, avec des enzymes, ... L'homme du métier sait quels types d'immunoglobulines marquées sont appropriés pour réaliser un tel kit et permettre la détection de complexes immuns.

[73] Avantageusement, l'invention concerne un kit tel que défini ci-dessus, comprenant moyens d'identification de complexes immuns entre au moins un anticorps issus d'un échantillon sanguin d'un individu sont disposés sur un support de type chromatographique. D'autres formats tels que les billes magnétiques ou les electricsensors sont également utilisables.

[74] Dans un aspect avantageux de l'invention, il est prévu un kit de détection de la tuberculose active sous la forme d'un kit portable, utilisable dans toutes les situations et dans toutes les situations, en déposant une goutte de sang. Un tel kit est un kit de détection rapide, en seulement quelques minutes. Un exemple d'un tel kit portable est illustré à la figure 1.

[75] Avantageusement, l'invention concerne le kit susmentionné, comprenant en outre au moins un contrôle positif. Qu'il s'agisse d'un kit à utiliser dans un laboratoire, et surtout d'un kit portable, il est particulièrement pertinent de disposer d'un contrôle positif, c'est-à-dire d'un sérum issu d'un ou plusieurs patients dont la tuberculose active est ou a été confirmée cliniquement.

[76] La possibilité de diagnostiquer la TB active de manière simple, fiable et rapide à
partir de sang veineux ou capillaire est un succès médical et économique au moins identique à celui des tests rapides pour la détection d'autres infections (VIH
par exemple). Même si la spécificité du test n'est pas optimale, une bonne valeur prédictive négative permet à un test de ce type un très large usage en première ligne pour le dépistage de la maladie et l'orientation vers un test de confirmation. Le développement d'un test rapide pour le dépistage ou le diagnostic de la TB active contribue très significativement à la réalisation des objectifs fixés par l'OMS pour l'éradication de la tuberculose.

[77] Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne le kit susmentionné, dans lequel ledit au moins un peptide hydrophile est couplé à
des nanobilles magnétiques.

[78] Le couplage des peptides de l'invention à des nanobilles magnétiques permet d'obtenir des résultats similaires à un test immunologique ELISA classique, avec une quantité moindre de peptides et surtout en moins de 10 minutes (contre environ 2 h pour un ELISA classique). L'avantage d'un tel couplage est qu'il limite les temps de lavages nécessaires pour éliminer les interactions non spécifiques, car les complexes immuns sont isolés par magnétismes grâces aux billes sur lesquels ils se sont formés.

[79] L'invention concerne en outre un peptide hydrophile tel que défini ci-dessus, notamment un peptide consistant essentiellement en ou consistant en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO : 1 à 30, pour son utilisation dans le cadre du diagnostic de la tuberculose active chez un individu.

[80] Comme mentionné ci-dessus, les peptides spécifiques de l'invention sont très appropriés pour détecter des anticorps dirigés contre des peptides de Mycobactrium tuberculosis, et donc pour permettre de poser un diagnostic de tuberculose active chez un individu.

[81] L'invention sera mieux comprise à la lumière des figures et des exemples suivants :

[82] Légende des figures

[83] La figure 1 représente un exemple de kit portable selon l'invention

[84] La figure 2 représente un schéma représentatif du mode de réalisation de la figure 1.

[85] La figure 3 est une représentation schématique du résultat visuel obtenu lors d'un diagnostic positif de la tuberculose active (++) ou lors d'un diagnostic négatif (-). T
désigne le marquage significatif de la positivité de l'échantillon, et T+
indique le témoin positif de la réaction. La flèche indique le sens de migration.

[86] Les figures 4 à 7 montrent des histogrammes de la réactivité des peptides testés sous la forme d'index (ratio R selon l'invention).

[87] La figure 8 montre un histogramme la réactivité des peptides C2, C12, M3, et G9 (respectivement représentés par les séquences SEQ ID NO : 1 à 5) sous forme d'index (ratio R selon l'invention). Les barres représentent les 4 pools testés pour chacun des peptides

[88] La figure 9 représente un histogramme montrant la comparaison des résultats obtenus entre la technique ELISA classique (colonnes en gris foncé) et la technologie nanobilles (colonne en gris clair), en utilisant le peptide SEQ ID NO : 3. Les échantillons 1. et 2. correspondent à des contrôles positifs, les échantillons 3. et 4.
correspondent à
des échantillons négatifs, les échantillons 5. à 7. correspondent à des sera de patients et l'échantillon 8. correspond à un échantillon annoncé comme négatif.

[89] La figure 10 représente un histogramme montrant la comparaison des résultats d'évaluation de 19 sera humains (13 positifs avec une TB active, échantillons 1 à 27, et 6 négatifs non infectés, échantillons Neg1 à Neg6) entre la version paillasse)>
(colonnes noires) du laboratoire et la version transportable du prototype mis au point (colonnes grises)

[90] La figure 11 représente un histogramme montrant la moyenne des signaux obtenus pour l'analyse de 20 échantillons testés en simple aveugle (15 positifs et 5 négatifs) sur le prototype transportable optimisé. Les échantillons positifs sont les n 1, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 19, 20. Les échantillons négatifs sont les n 2, 6, 9, 13, 18.

[91] La figure 12 représente un histogramme montrant l'évaluation de la stabilité du couplage nanobilles magnétiques-peptides candidats diagnostic au cours du temps, sur des échantillons négatifs (Neg6) ou positifs (Pos1). L'histogramme représente ici l'évaluation de deux échantillons de sérum de patient (un négatif et un positif) avec la même technique sur nanobilles magnétiques en utilisant le même peptide (M3) greffé à
différents intervalles de temps sur les nanobilles. Les deux sera ont été
analysés avec le peptide greffé et testé le 24/11/2016 (histogramme de droite pour chacun des deux patients) comparativement avec le même peptide greffé le 12/09/2017 et testé
le 30/11/2016 et le 01/12/2016 (deux premiers histogrammes pour chacun des deux patients). Il apparait une diminution du signal au cours du temps pour ce peptide qui pourrait être expliquée par une instabilité des peptides en solution ou un manque de reproductibilité du greffage.

[92] Si l'on se réfère à la figure 1, le kit de diagnostic de la tuberculose active selon l'invention est constitué d'un dispositif comprenant une cassette 1, comprenant trois fenêtres 2 ; 3 ; 4 permettant respectivement de détecter la réactivité d'un échantillon avec un contrôle positif, de détecter la réactivité d'un échantillon avec au moins un peptide selon l'invention, et de déposer un échantillon de sérum à tester. La cassette 1 recouvre un réservoir comprenant, positionné sous la fenêtre 4, - un support d'échantillon 5 permettant la filtration macromoléculaire de l'échantillon déposé (sang, sérum, plasma humain) et permettant le contrôle de la matrice (force ionique, vitesse d'absorption...), - un support de conjugaison 6 comprenant des anticorps de détection dirigé
contre les anticorps susceptibles d'être contenus dans l'échantillon a tester, et couplé à un traceur tel que de l'or colloïdal, du latex, du carbone.

[93] Positionné sous les fenêtres 3 et 2 se trouve positionné une membrane 7 de nitrocellulose, de nylon, ou de polyfluorure de vinylidène (PVDF) sur la quelle est fixée, sous la forme d'une ligne, au moins un peptide selon l'invention (sous la fenêtre 3) et une ligne d'albumine bovine biotinylée (sous la fenêtre 2).

[94] Le réservoir comprend en outre, juxtaposé à la membrane 7, un support absorbant 8 dont la fonction est de servir de réservoir de liquide résiduel et stabilisation de la vitesse de migration.

[95] La figure 2 représente le dispositif de la figure 1 en utilisation. Dans un premier temps, un échantillon biologique (notamment du sang ou du sérum) est déposé
sur le support d'échantillon 5 via la fenêtre 4. Sous l'effet de la capillarité
générée par un support absorbant 8 et un tampon de migration spécifique facilitant la capillarité, le contenu de l'échantillon est progressivement et a vitesse constante, transféré
vers le support de conjugaison 6, où les anticorps de l'échantillon biologique sont alors capables de se coupler avec les anticorps de détection.

[96] Toujours sous l'effet de la capillarité, le contenu de l'échantillon migre du support de conjugaison 6 vers la membrane 7. Lors de leur passage sur la ligne de peptide selon l'invention, les anticorps dirigés contre le peptide de l'invention sont immobilisés par réaction immunologique, le reste de l'échantillon continuant de migrer. Il en est de même pour la ligne de contrôle.

[97] Comme l'indique la figure 3, lorsque l'échantillon à tester comprend des anticorps dirigés contre les peptides de l'invention qui ont été déposés sur le membrane 7, ceux-ci sont immobilisés et s'accumulent, et grâce au couplage avec des anticorps marqués, il est possible de voir apparaitre une ligne indicatrice de la réactivité, au niveau de la zone de test T.

[98] Exemples

[99] Exemple 1 ¨ identification des peptides à cribler

[100] A partir des 25 protéines recombinantes de la famille des enzymes lipolytiques, les inventeurs ont réalisé un criblage d'épitopes afin de hiérarchiser in silico plus de 800 peptides en fonction de différentes caractéristiques : hydrophobicité, structure secondaire, etc. Ce classement leur a permis de sélectionner les 200 candidats qui rassemblent les caractéristiques les plus prometteuses pour faire du diagnostic de la tuberculose active. L'immunogénicité de chacun des 200 peptides a ensuite été
évaluée dans un test ELISA pour faire le criblage de ces peptides. A partir des résultats obtenus sur des pools de patients, les 30 meilleurs candidats ont été
conservés pour la suite des évaluations techniques.

[101] A l'aide d'un algorithme informatique et à partir des séquences génétiques fournies, les principales caractéristiques des protéines candidates diagnostiques ont été identifiées et un classement des meilleurs peptides potentiels a été
établi. Au total, les inventeurs ont obtenu une liste de 833 peptides chevauchants de 15 acides aminés classés en 4 groupes (1, 2, 3 et bad ) en fonction de leur immunogénicité
théorique in silico (avec 1 le meilleur et bad le plus mauvais). Les informations concernant les 200 peptides testés sont indiquées dans le tableau 1 suivant :

Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0 o ,-.
LipC (Rv0220) C2 71-85aa ,-.

LipC (Rv0220) C12 321-335aa Coà

1 LipM (Rv2284) M3 131-145aa Rv2349c (PLCC) V5 351-365aa LipG (Rv0646c) G9 141-155aa Lip0 (Rv1426c) 07 301-315aa Rv2301 Z1 31-45aa Rv1984 E8 101-115aa Rv3452 D7 191-205aa CNNGDPICSDGNRWR 9 , , Rv3452 D1 1-15aa , ' Rv2351c (PLCA) P2 91-105aa AGVTIPFRLDTTRGP 11 .. ' .. =, , LipT (Rv2045c) T9 481-495aa 2 LipW (Rv0217c) W3 81-95aa LipW (Rv0217c) W5 181-195aa LipW (Rv0217c) W7 211-225aa Rv0183 B15 251-265aa so n LipC (Rv0220) C14 61-75aa LipC (Rv0220) C18 221-235aa VDKFGGDRNFIAVAG 18 ol Rv1984 E5 31-45aa o u, LipC (Rv0220) C6 141-155aa QLLDVWRRKDMPTKP 20 =

--, Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0 o ,-, LipC (Rv0220) C7 241-255aa ,-, Rv3452 D5 161-175aa Coà

Rv2301 Z3 161-175aa LipF (Rv3487c) F7 1-15aa Rv0183 B6 271-285aa LipG (Rv0646c) G3 51-65aa Rv2351c (PLCA) P6 341-355aa Rv2350c (PLCB) S13 501-512aa LipT (Rv2045c) T6 451-465aa RVSNEVQRRWRCFSQ 29 .
, LipC (Rv0220) C20 281-295aa DRSTPERARFVDFLE 30 .
eo .
, , 3 Rv0183 B1 1-15aa MWAEKSPRRSSAGSR 31 .

, Rv0183 B16 281-295aa LipC (Rv0220) Cl 1-15aa LipC (Rv0220) C10 301-315aa LipC (Rv0220) C4 111-125aa LipC (Rv0220) C24 361-375aa so n LipC (Rv0220) C3 101-115aa LipC (Rv0220) C5 121-135aa ALRHRRYVHRRRVLY 38 ol LipC (Rv0220) C21 331-345aa o u, LipC (Rv0220) C19 261-275aa EGSDTSVDAVVGIYG 40 ' --, Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0 I.) o Rv3452 D9 91-105aa ,-.
Rv1984 E2 E2 91-105aa Coà

Rv1984 E9 201-217aa Rv1984 El 41-55aa LipF (Rv3487c) F12 131-145aa Lipl (Rv1400c) 11 1-15aa Rv3802c K5 71-85aa Lip0 (Rv1426c) 03 121-135aa Lip0 (Rv1426c) 06 271-285aa TPNDPRFQPGFEQVD 49 .
, Rv2351c (PLCA) P9 501-512aa TPVRGTPSGLCS
50 . .
(70µ

Rv2351c (PLCA) P3 101-115aa , LipQ (Rv2485c) Q6 201-215aa ICVSINYSKSPRCTW 52 .

LipQ (Rv2485c) Q9 341-355aa LipQ (Rv2485c) Q10 401-415aa LipQ (Rv2485c) Q4 151-165aa LipQ (Rv2485c) Q8 331-345aa so LipR (Rv3084) R3 121-135aa EEMAAVYTRLLDDGL 57 n ol Rv2350c (PLCB) S7 261-275aa Rv2350c (PLCB) S3 91-105aa o u, Rv2350c (PLCB) S8 281-295aa PLDFAADVRNNRLPK 60 =

--, Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0 o Rv2350c (PLCB) S4 101-115aa ,-, LipT (Rv2045c) (Rv2045c) T4 431-445aa Coà

LipT (Rv2045c) T2 31-45aa LipT (Rv2045c) T7 461-475aa LipU (Rv1076) U1 71-85aa Rv1755c (PLCD) X6 271-280aa LipY (Rv3097c) Y1 221-235aa bad Rv0183 B12 161-175aa Rv0183 B10 131-145aa DFDTLVGIATREYPG 69 , Rv0183 B8 81-95aa r ' Rv0183 B14 241-255aa GRALLQVGETMPRRA 71 ' , Rv0183 B7 11-25aa Rv0183 B17 301-315aa Rv0183 B11 141-155aa Rv0183 B2 61-75aa Rv0183 B13 211-225aa so n Rv0183 B9 121-135aa Rv0183 B5 261-275aa PLLVLHGTDDRLI PI 78 ol Rv0183 B3 101-115aa o u, Rv0183 B4 111-125aa GHGRSGGKRVLVRD I 80 =

--, Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0 o LipC (Rv0220) C22 341-355aa ,-.
LipC (Rv0220) (Rv0220) C15 81-95aa Coà

LipC (Rv0220) C13 11-25aa LipC (Rv0220) C8 251-265aa LipC (Rv0220) C16 131-145aa LipC (Rv0220) C9 271-285aa LipC (Rv0220) C11 311-325aa LipC (Rv0220) C17 201-215aa LipC (Rv0220) C23 351-365aa AVSRSQVGYLELPGA 89 .
, LipC (Rv0220) C25 371-385aa LLDGARTGPTAHAIA 90 , N, Rv3452 D6 181-195aa , Rv3452 D2 51-65aa EVVFARGTGEPPGLG 92 .

Rv3452 D8 41-55aa Rv3452 D3 71-85aa Rv3452 D10 151-165aa Rv3452 D4 101-115aa so Rv1984 E3 81-95aa ASD DYRASAS N GS D D 97 n ol Rv1984 E4 21-35aa Rv1984 E6 51-65aa o u, Rv1984 E7 71-85aa S I GVYAVNYPASD DY 100 =

--, Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0 I.) o Li pF (Rv3487c) F13 151-165aa VRAAAAKNMVDGRPE

,-.
.1-Li pF (Rv3487c) F11 101-115aa Coà

Li pF (Rv3487c) F4 241-255aa Li pF (Rv3487c) F1 71-85aa Li pF (Rv3487c) F2 161-175aa Li pF (Rv3487c) F5 251-265aa Li pF (Rv3487c) F14 231-245aa Li pF (Rv3487c) F8 31-45aa Li pF (Rv3487c) F10 81-95aa PEQIVLAGDSAGGYL 109 .
, Li pF (Rv3487c) F3 171-185aa LDHIESSLPPTLIHV 110 .
N, N.) Li pF (Rv3487c) F6 261-277aa , Li pF (Rv3487c) F9 61-75aa GMALDDCHDAYQWLR
112 .

Li pG (Rv0646c) G5 171-185aa Li pG (Rv0646c) G2 11-25aa Li pG (Rv0646c) G4 61-75aa Li pG (Rv0646c) G7 291-301aa GELTRNFSEAG

so Li pG (Rv0646c) G11 191-205aa GSPAYPIPEDQVRAE 117 n ol Li pG (Rv0646c) G1 1-15aa Li pG (Rv0646c) G10 181-195aa o u, Li pG (Rv0646c) G8 71-85aa ERHRPGQPLATRLVR 120 =
.1---, Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0 I.) o LipG (Rv0646c) G6 281-295aa ,-.

LipH (Rv1399c) H1 41-55aa Coà

Lipl (Rv1400c) 13 41-55aa Lipl (Rv1400c) 12 31-45aa Rv3451 J3 91-105aa Rv3451 J2 41-55aa Rv3451 J5 191-205aa Rv3451 J1 1-15aa Rv3451 J4 161-175aa VFGNPSNRAGGSLSS 129 .
, Rv3451 J7 251-262aa TAAPAPESLHGR
130 . .

GO
Rv3451 J6 221-235aa , Rv3802c K6 131-145aa HNPLTTDNQMSYNDS 132 .

Rv3802c K9 251-265aa Rv3802c K8 211-225aa RQQGVGNQVPPSPRG

Rv3802c K4 61-75aa Rv3802c K2 31-45aa so Rv3802c K7 181-195aa AGDVASDIGNGRGPV 137 n ol Rv3802c K1 1-15aa Rv3802c K3 51-65aa o u, LipM (Rv2284) M2 121-135aa SAGLWRRPAGGGTAK
140 =

--, Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0 o ,-.
LipM (Rv2284) M4 141-155aa ,-.
LipM (Rv2284) (Rv2284) M5 271-285aa Coà

LipM (Rv2284) M1 111-125aa LipN (Rv2970c) N3 281-295aa LipN (Rv2970c) N2 271-285aa LipN (Rv2970c) Ni 111-125aa Lip0 (Rv1426c) 05 211-225aa Lip0 (Rv1426c) 08 321-335aa Lip0 (Rv1426c) 04 161-175aa ANLADIWRRRDLPRD 149 .
, Lip0 (Rv1426c) 02 61-75aa ALRRGRRGDFGGLKG
150 , N, e.
Lip0 (Rv1426c) 01 1-15aa , Rv2351c (PLCA) P8 411-425aa SQLKLIRARFGVPVP 152 .

Rv2351c (PLCA) P1 1-15aa Rv2351c (PLCA) P7 351-365aa Rv2351c (PLCA) P5 251-265aa Rv2351c (PLCA) P4 221-235aa so LipQ (Rv2485c) Q2 131-145aa GPHRRYAAQTSDIPY 157 n ol LipQ (Rv2485c) Q1 101-115aa LipQ (Rv2485c) Q7 261-275aa o u, LipQ (Rv2485c) Q3 141-155aa SDIPYGPGGRENLLD 160 =

--, Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0 o ,-.
LipQ (Rv2485c) Q5 161-175aa ,-.
LipR (Rv3084) (Rv3084) R1 1-15aa Coà

LipR (Rv3084) R5 241-255aa LipR (Rv3084) R2 41-55aa LipR (Rv3084) R7 291-308aa LipR (Rv3084) R4 131-145aa LipR (Rv3084) R6 251-265aa Rv2350c (PLCB) S5 221-235aa Rv2350c (PLCB) S10 401-415aa RGPLMVHDTFDHTST 169 .
, Rv2350c (PLCB) S12 491-505aa PFPQSMPTQETAPTR 170 , n, Rv2350c (PLCB) S6 251-265aa , Rv2350c (PLCB) S9 361-375aa GTPGEFVTVPDIDSV 172 .

Rv2350c (PLCB) S2 51-65aa Rv2350c (PLCB) Si 41-55aa Rv2350c (PLCB) S11 451-465aa LipT (Rv2045c) T5 441-455aa so LipT (Rv2045c) Ti 1-15aa VALESATVGSMHERT 177 n ol LipT (Rv2045c) T3 401-415aa LipT (Rv2045c) T10 491-505aa o u, LipT (Rv2045c) T8 471-485aa D DWPAYTQ D D RAVLV 180 =

--, Protéines Peptides Position des AA
Séquences peptidiques SEQ ID NO: 0 o ,-.
LipU (Rv1076) U3 281-297aa ,-.

LipU (Rv1076) U2 201-215aa Coà

Rv2349c (PLCC) V4 251-265aa Rv2349c (PLCC) V7 401-415aa Rv2349c (PLCC) V1 71-85aa Rv2349c (PLCC) V6 361-375aa Rv2349c (PLCC) V2 191-205aa Rv2349c (PLCC) V8 451-465aa Rv2349c (PLCC) V3 241-255aa LGGLNDTSLSRNGYV 189 .
, LipW (Rv0217c) W1 41-55aa MSRTPPDIEVLTLES 190 , N, C
LipW (Rv0217c) W6 191-205aa , LipW (Rv0217c) W2 51-65aa LipW (Rv0217c) W4 91-105aa Rv1755c (PLCD) X4 251-265aa Rv1755c (PLCD) X1 131-145aa Rv1755c (PLCD) X3 171-185aa so Rv1755c (PLCD) X5 261-275aa PQIMPTQETTPTRGI 197 n ol Rv1755c (PLCD) X2 141-155aa Rv2301 Z2 61-75aa o u, Rv2301 Z4 171-185aa IELCHGDDPVCHPAD 200 =

--, ce Tableau 1 : Liste des 200 peptides testés

[102] Afin de déterminer l'immunogénicité des peptides, ceux-ci sont testés par le test ELISA suivant :

[103] Les peptides sont fixés sur une plaque Maxisorp (high binding):
Incubation toute la nuit à 4 C, concentration de la protéine en pg/ml de 20 à 50.

[104] Les puits sont rincés avec 300pL de tampon phosphate salin (PBS)

[105] Les puits)> sont bloqués pendant 2h à température ambiante (19 C-25 C)avec 200pL d'albumine sérique bovine (BSA) 2% et 0.01% de Tween 20

[106] Les puits sont rincés avec 300pL de PBS

[107] Ondépose 100pL de sérums de patients atteints de TA active dilués au 1/100ième en solution de blocage et on incube 1h à 37 C

[108] Faire 3 lavages (300pL) PBS-Tween 20 (0,05%)

[109] On ajoute 100pL d'anticorps conjugué à la peroxydase, dilué au 1/20 000 en solution de blocage et on incube 1h à 37 C

[110] Faire 3 lavages (300pL) PBS-Tween 20 (0.05%)

[111] On ajoute 100pL de substrat 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) et incube 20min à l'obscurité

[112] On déposer 50pL d'acide sulfurique à 1N

[113] On lit au spectrophotomètre à 450 nm la quantité de TMB convertie par la peroxydase (indicatif de la formation d'un complexe immun entre les peptides et les anticorps contenus dans le sérum).

[114] Les figures 4 à 7 représentent des histogrammes montrant le ratio R
(Index) des différents peptides testés.

[115] La figure 8 montre la réactivité des peptides les plus prometteurs C2, C12 M3, V5 et G9 (respectivement représentés par les séquences SEQ ID NO: 1 à 5).

[116] Exemple 2 ¨ réactivité des 4 peptides sur des échantillons de patients individuels différents des pools utilisés pour le criblage

[117] Afin de confirmer que les peptides sectionnés sont bien capables de diagnostiquer la tuberculose active, les inventeurs ont testé la réactivité de 4 peptides (M3 : SEQ ID NO : 3 ; C12 : SEQ ID NO : 2 ; C2 : SEQ ID NO : 1 et 07 : SEQ ID
NO :
6).

[118] Le tableau suivant montre les résultats obtenus avec le sérum de 16 patients Patient M3 C12 C2 07 #1 +++ +++ +++ +++
#2 +++ +++ + +1-#3 +++ +1_ +1- +1-#4 +++ +++ +1_ +
#5 +++ + + +1-#6 +++ + +1- +++
#7 +++ +++ +1- +1-#8 +++ +1- +++ +++
#9 +++ +++ +1- _ #10 +++ +++ +++ +++
#11 + +/- +/- -#12 + +/- +/- +/-#13 + + +/- -#14 +/- + + +
#15 +/- - +/- -#16 - +++ --

[119] +++ : très fortement positif ; + : positif ; +/- : valeur positive limite ; -: négatif.

[120] Les résultats montrent que parmi les 5 meilleurs candidats identifiés, 3 (M3, C2, C12) détectent la grande majorité des individus atteints de TB active testés (soit 94%), confirmant les résultats obtenus avec les pools de patients. En revanche les performances diagnostiques de 07 sont plus faibles avec moins de 70% de sensibilité
pour l'identification des cas de TB active sur ces patients testés.

[121] Exemple 3 ¨ Comparaison de la réactivité des peptides selon le nombre de pools d'échantillons utilisés

[122] Dans le but d'évaluer la réactivité des peptides et de sélectionner les plus prometteurs pour le test de diagnostic de la Tuberculose active, les inventeurs ont évalué l'immunogénicité de chacun des peptides sur plusieurs pools différents d'échantillons. Ceux avec une réactivité pour tous les pools testés ont été
sélectionnés comme les meilleurs candidats. Le tableau ci-dessous représente un exemple de peptides testés avec deux pools différents d'échantillons positifs.
Peptides DO Pool négatif Ratio Pool positif 1 Ratio Pool positif 2 D7 0,303 1,7 1,7 C4 0,077 -0,3 1,8 B4 0,408 0,9 1,0

[123] Les peptides pour lesquels un ration de 1,5 a été retrouvé ont été
sélectionnés à

l'issue du screening et font partie des meilleurs candidats diagnostiques pour la TB
active. Parmi l'ensemble des peptides testés, certains ont un ration > 1,5 pour les deux pools de patients (exemple D7) alors que d'autres sont positifs pour un des deux pools (exemple C4) ou sont négatifs pour les deux pools (exemple B4). Le screening des peptides a été affiné ensuite en utilisant des échantillons de patients individuels infectés ou non par la TB active.

[124] Exemple 3 ¨ méthode alternative de détection de la tuberculose

[125] A la suite de la preuve de concept en ELISA faite par les inventeurs, des tests lateral flow ont été mis au point en intégrant les meilleurs peptides candidats diagnostic pour la Tuberculose, décrits dans l'invention. Ces résultats n'ont pas été
suffisamment bons pour répondre aux attentes du cahier des charges et du targeted product profile de l'OMS. Les inventeurs ont donc préféré mettre de côté cette stratégie lateral flow pour chercher une alternative plus performante.

[126] Les inventeurs ont développé une technologie sur nanobilles magnétiques, permettant d'améliorer significativement les performances du test ELISA, sans lavages et en quelques minutes seulement. Cette stratégie est pertinente dans l'optique de miniaturiser les éléments existants actuels pour proposer une solution de diagnostic rapide de laboratoire, ainsi qu'un futur test Point-of-Care. La technologie nanobilles a été développée sur une version de paillasse au laboratoire, non délocalisable.
Il s'agit de la version initiale du test. Les premiers tests réalisés avec cette version montraient qu'en couplant les nanobilles magnétiques avec les meilleurs peptides candidats diagnostiques de l'invention, et en utilisant une stratégie de détection des anticorps dans le sérum de patients, les inventeurs obtenaient des résultats au moins aussi bons que les résultats d'ELISA mais avec une quantité moindre de peptides et surtout en moins de 10 minutes (contre environ 2 h pour un ELISA classique). Un exemple des résultats pour un des 5 meilleurs peptides est illustré en figure 9.

[127] Les inventeurs ont donc poussé les expérimentations et après des tests d'optimisation (dilution des sera, test en combinaison de peptides, choix de l'anticorps de détection, contrôle du bruit de fond, etc) les inventeurs ont identifié le meilleur peptide à utiliser parmi les 5 meilleurs candidats. En parallèle, un prototype transportable a été développé et les inventeurs ont testé 19 échantillons (13 patients avec une TB active et 6 négatifs pour la maladie). Les résultats de la figure 10 montrent que ce prototype transportable permet d'obtenir des résultats au moins aussi bons que ceux obtenus avec le système de paillasse précédemment mis au point par les inventeurs, permettant ainsi de discriminer clairement les patients positifs des patients négatifs.

[128] Enfin les derniers tests réalisés sur 20 autres échantillons ont évalué
en simple aveugle la capacité du prototype transportable à discriminer les patients avec une TB
active de ceux non infectés (figure 11) confirmant les performances du test intégrant la combinaison de peptides candidats diagnostiques avec la technologie sur nanobilles dans sa version transportable.

[129] Des tests de reproductibilité ont aussi été réalisés et ne montrent pas de variation. La stabilité du couplage nanobille-peptide peut être améliorée car une diminution progressive dans le temps du signal du test a été observée (figure 12).

[130] Le prototype transportable montre donc des résultats très encourageants.

[131] L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation présentés et d'autres modes de réalisation apparaîtront clairement à l'homme du métier.

Claims (11)

REVENDICATIONS

1. Méthode de criblage in vitro d'au moins un peptide immunogène d'intérêt capable de reconnaitre au moins un anticorps issu du sérum d'individus atteints de tuberculose active, ledit au moins un peptide immunogène étant un peptide hydrophile issu d'une protéine hydrophobe, ladite protéine hydrophobe étant une protéine de paroi, ou sécrétées de bactéries du genre Mycobacterium, ladite protéine hydrophobe présentant une activité
lipolytique, ladite méthode comprenant les étapes suivantes:
- la mise en contact d'au moins un peptidehydrophile issud'au moins une protéine hydrophobe avec - successivement au moins deux pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée, pour permettre la formation de complexes immuns entre lesdits anticorps et lesdits peptides à cribler, et - au moins un échantillon contrôle issu d'un individu n'étant pas atteint de tuberculose, - ladétection de la formation de complexes immuns à l'étape précédente, - une première sélection des peptides d'intérêtpour lesquels la valeur d'un ratio R est supérieure ou égale à 1,5 pour au moins un des pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée, le ratio R étant la valeur normalisée (de mesure de la formation de complexe immun surla valeur de mesure normalisée obtenue à partir de l'échantillon issu d'un individu sain.

2. Méthode de criblage selon la revendication 1, comprenant en outre les étapes suivantes :
- la mise en contact des peptides sélectionnés à la première étape de sélection avec chacun des sérum individuels composants lesdits pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée, pour permettre la formation de complexes immuns entre lesdits anticorps et lesdits peptides à cribler, - la détection de la formation de complexes immuns à l'étape précédente, et - une seconde sélection des peptides d'intérêt pour lesquels la valeur du ratio R est supérieure ou égale à 1,5 pour avec chacun des sérums individuels composants lesdits pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée.

3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle lors de la première sélection, seuls sont sélectionnés les peptides pour lesquels la valeur d'un ratio R est supérieure ou égale à 1,5 pour au moins deux des pools indépendants de sérums issus de patients atteints de tuberculose active confirmée.

4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans laquelle les peptides hydrophiles ont une taille de 15 à 25 acides aminés.

5. Peptide hydrophile, comprenant, ou consistant en 15 à 25 acides aminés, issu d'une protéine hydrophobe, ladite protéine hydrophobe étant une protéine de paroi ou sécrétée de bactéries du genre Mycobacterium, ladite protéine hydrophobe présentant une activité lipolytique,

6. Peptide hydrophile, selon la revendication 6, ledit peptide étant représenté
par l'une quelconque des séquences suivantes : SEQ IS NO : 1 à SEQ ID
NO 30, notamment par l'une quelconque des séquences suivantes : SEQ IS
NO : 1 à SEQ ID NO :5.

7. Méthode de diagnostic in vitro chez un individu susceptible d'être atteint de la tuberculose active, ladite méthode comprenant :
- une étape de mise en contact d'un échantillon sanguin dudit individu avec au moins un peptide hydrophile tel que défini dans l'une quelconque des revendications 5 ou 6, et - une étape de détection d'un complexe immun entre au moins un anticorps dudit échantillon sanguin et lesdits peptides.

8. Kit de diagnostic de la tuberculose active, comprenant :
- au moins un peptide hydrophile tel que défini dans l'une quelconque des revendications 5 ou 6, et - des moyens d'identification de complexes immuns entre au moins un anticorps issus d'un échantillon sanguin d'un individu et ledit au moins un peptide.

9. Kit de diagnostic selon la revendication 8, comprenant moyens d'identification de complexes immuns entre au moins un anticorps issus d'un échantillon sanguin d'un individu sont disposés sur un support de type chromatographique.

10. Kit de diagnostic selon la revendication 8, dans lequel ledit au moins un peptide hydrophile est couplé à des nanobilles magnétiques.

11. Peptide hydrophile, tel que défini à la revendication 5 ou 6, pour son utilisation dans le cadre du diagnostic de la tuberculose active chez un individu.