FR2976081A1 - Methode de diagnostic de la tuberculose active - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne une méthode pour le diagnostic in vitro de la tuberculose active comprenant une étape de mise en contact de lymphocytes d'un patient suspecté d'être atteint de la tuberculose active avec au moins une protéine de mycobactéries, ladite protéine étant une enzyme ayant une activité lipolytique, et une étape de détection de la présence de lymphocytes spécifiques activés.
Description
Méthode de diagnostic de la tuberculose active L'invention concerne une méthode de diagnostic de la tuberculose active. La tuberculose humaine (TB) est une infection bactérienne hautement contagieuse qui est transmise entre personnes par voies aériennes. Elle est généralement transmise par le contact d'une personne infectée qui tousse ou parle. La maladie TB est causée lorsque la bactérie se multiplie à l'intérieur de l'organisme, causant des dommages tissulaires et d'organes. Sans traitement, la moitié des personnes infectées mourront. La plupart des gens connaissent la TB en tant que maladie des poumons. Toutefois, la totalité des maladies TB ne sont pas pulmonaires. Environ 40% des cas de TB apparaissent à un autre endroit dans l'organisme. Ceci survient lorsque la bactérie est transmise en dehors des poumons. Dans ces cas, la TB extra pulmonaire est plus difficile à diagnostiquer puisque les patients ne présentent pas les signes normaux et les symptômes associés à la TB pulmonaire.
La maladie TB peut se déclarer dans les ganglions lymphatiques, le cerveau, les os, les reins ou d'autres organes. Il existe deux formes de l'infection TB : la TB active, aussi connue comme la maladie TB, et l'infection TB latente (LTBI) Une personne qui est infectée par la TB peut ne pas nécessairement développer la maladie. Certains peuvent contrôler l'infection, mais sont incapables d'en débarrasser complètement leurs organismes. Dans ces cas, l'infection persiste, se trouvant dans un état inactif dans des granulomes. Cela a souvent été décrit comme LTBI. Les personnes avec LTBI ne présentent généralement aucun signe des symptômes TB, aussi cela peut passer inaperçu. LTBI peut un jour se développer en maladie active, souvent quand le système immunitaires des individus est affaibli. En effet, les personnes saines qui sont infectées par la TB latente ont environ 10% de risques de conversion en maladie active chaque année tout au long de leur vie. Ainsi, la TB active est généralement considérée comme une réactivation de la mycobactérie sous sa forme latente. Puisque cette infection latente peut devenir active à n'importe quel moment, elle est généralement suivie, mais pas nécessairement traitée. Par opposition, la TB active qui est la forme critique de la maladie et facilement transmise à d'autres individus, peut être -rapidement traitée avec jusqu'à quatre antibiotiques durant plusieurs mois. Par conséquent, la distinction entre la TB active et latente reste essentielle pour l'accès au soin des patients infectés.
Vaccination Un vaccin anti tuberculinique efficace serait une avancée majeure darls-le contrôle de la TB, mais actuellement un tel vaccin n'existe pas. Le vaccin BCG est utilisé dans plusieurs pays et bien qu'il soit considéré comme offrant une protection contre l'infection TB chez les enfants il est considéré comme offrant des bénéfices réduits chez les adultes (environ 50% de protection). De plus, les personnes vaccinées par le BCG et les individus infectés avec une mycobactérie non tuberculeuse (mycobactérie différente de M. tuberculosis) peuvent produire un résultat positif au test tuberculinique cutané (TST), même s'ils ne sont pas infectés. Ce sont les deux causes les plus communes de faux positifs au TST et elles peuvent conduire à un traitement non nécessaire de la LTBI.
Aussi, il existe un besoin de fournir une méthode de diagnostic avec une sensibilité optimale et qui différencie correctement le patient ayant une TB active.
Diagnostic de la TB active La TB active peut être difficile à diagnostiquer, en particulier chez les enfants, qui ont un système immunitaire faible ou chez ceux ayant une TB extra pulmonaire. En plus des examens médicaux, les tests suivants sont utilisés pour déterminer si un patient est atteint de TB active : le test tuberculinique cutané (TST), La radiographie de la poitrine (X-ray), la microscopie des frottis d'expectoration (SSM), la culture, et la PCR (GeneXpert®). - le test tuberculinique cutané (TST)- Le TST existe depuis près de lOOE ans. Une suspension comprenant des protéines de TB est injectée dans le derme dans la partie inférieur du bras. Le site d'injection est examiné par un professionnel expérimenté 2 à 3 jours après. Si la personne a la TB, l'organisme reconnait les protéines qui ont été injectées et répond en formant une bosse où les protéines de TB ont été injectées. - L'efficacité du TST varie et peut être affectée par une précédente vaccination contre la TB (BCG), une infection à bactéries non tuberculeuses, un système immunitaire faible et par d'autres maladies ou traitement médicaux. - Radidgraphie de la poitrine et tomodensitométrie Les radiographies de la poitrine sont utilisées pour vérifier des anomalies des poumons qui sont les signes et les symptômes de la maladie TB dans les poumons. Bien que la radiographie de la poitrine puisse suggérer que la maladie TB est présente, la radiographie de la poitrine seule ne peut diagnostiquer définitivement une infection TB dans les poumons ou n'importe où ailleurs dans l'organisme. - la microscopie des frottis d'expectoration (SSM) Il s'agit d'un test de laboratoire simple qui examine un frottis de bactéries en utilisant un microscope. Ce test identifie également les bactéries non TB, aussi il ne peut pas toujours distingues entre TB et autres infections. Il est communément utilisé pour diagnostiquer la maladie TB car il peut rapidement déterminer si une personne est infectée. Cependant, il peut parfois donner un résultat négatif même chez des patients -atteint de TB, aussi un résultat négatif ne peut être fiable. - la culture Les techniques de culture peuvent être utilisées pour faire croitre les bactéries TB vivantes. Il s'agit d'une méthode standard de référence pour détecter la TB active tant qu'un échantillon de bactéries TB peut être obtenu. La TB peut être cultivée à partir d'une variété d'échantillons. Ce test peut également fournir des informations sur les antibiotiques qui pourront être efficace dans le traitement de l'infection. Un inconvénient majeur de ce test est le temps d'obtention des résultats (2 à 12 semaines) et la nécessité de répéter les expériences sur des échantillons similaires du même patient pour obtenir un résultat positif (c'est-à-dire une faible sensibilité). - le Système GeneXpert® Le Système GeneXpert® est une plateforme de diagnostic close et automatisée qui permet l'identification m oléculaire de M tuberculosis ainsi que la résistance à la rifampicine.I1 fournit des résultats à partir de frottis d'échantillons non traités et nécessite une formation technique limitée pour les opérateurs. Ce test a plusieurs limites telles que la durée de vie limitée des cartouches de diagnostic, certaines restrictions de température et d'humidité, la nécessité de fournir de l'électricité, le besoin d'un entretien ét-d'une calibration annuels pour chaque machine, le coût de la
4 machine et chaque test TB ainsi que le besoin de multiplier les tests pour augmenter la sensibilité.
D'autres tests ont été développés utilisant des échantillons sanguins pour diagnostiquer la TB active. Pour illustration, les documents suivants peuvent être cités : La demande internationale WO 2009/129521 décrit l'utilisation d'épitopes spécifiques de protéines mycobactériennes afin d'identifier spécifiquement les patients atteints de la TB active. Trois protéines ont été identifiées comme présentant des épitopes efficaces : PTRP, PE-PGRS51 et LipC. Zhang et al., Clin Microbiol Infect 2007; 13: 139-145, décrivent que l' immunoréactivité comparative de Rv3425, ESAT-6 et CFP-10 distinguait clairement les sujets sains des patients TB. Par ailleurs, Zhang et al. décrivent qu'une réponse négligeable par des anticorps était obtenue dans le groupe contrôle sain vacciné par le BCG ce qui suggère que Rv3425, ESAT-6 et CFP-10 peuvent être utilisées pour le diagnostic de l'infection à m tuberculosis, même dans des régions géographiques où la vaccination BCG est utilisée en routine. Cependant, aucune des méthodes décrites dans l'état de la technique ne permettent au praticien de déterminer rapidement après la réactivation de la bactérie, la TB active chez un patient, avec une faible quantité de résultats faux-positifs. Par conséquent, l'invention se propose de résoudre les inconvénients précédents.
Un des buts de l'invention est de fournir une nouvelle méthode efficace pour détecter précocement la réactivation de mycobactérie,, Un autre but de l'invention est de fournir une méthode efficace pour distinguer la TB active de la LTBI. Un autre but de l'invention est de fournir un kit pour mettre en oeuvre la méthode selon l'invention.
L'invention concerne une méthode de diagnostic in vitro de la TB active, comprenant une étape de mise en contact de lymphocytes d'un patient suspecté d'avoir la TB active avec au moins une protéine mycobactérienne, ladite protéine étant une enzyme ayant une activité lipolytique, et - une étape de détection de la présence de lymphocytes activés. L'invention concerne également une méthode pour le diagnostic in vitro de la tuberculose active, comprenant : une étape de mise en contact d'un échantillon de lymphocytes B purifiés d'un patient suspecté d'être atteint de la tuberculose active avec au moins une protéine de mycobactéries, ladite protéine ayant une activité lipolytique et étant capable d'hydrolyser les lipides ayant une chaine carbonée comprenant au moins 12 carbones, ledit échantillon étant dépourvu de sérum ou de n'importe quel composé susceptible de contenir des anticorps solubles - une étape d'incubation pendant un temps déterminé pour permettre aux lymphocytes B p urifies de s écréter de s anticorps s pécifiques di rigés c ontre 1 adite enzyme ayant une activité lipolytique, et - une étape de détection de la présence d'un complexe immun comprenant lesdits anticorps et ladite enzyme ayant une activité lipolytique. L'invention est basée sur la constatation inattendue faite par les Inventeurs que les enzymes mycobactériennes exprimant une activité lipolytique sont de puissants candidats pour la mise en oeuvre d'une méthode spécifique permettant de discriminer la tuberculose active de la tuberculose latente.
Le diagnostic proposé par l'invention peut être mis en oeuvre chez l'homme mais aussi chez `l animal. Ci- après, la tuberculose sera uniformément écrite « tuberculose » ou « TB ». Dans l'invention, le terme "lipase" est utilisé pour désigner une enzyme ayant une activité lipolytique et inclut les phospholipases A, B, C ou D, et les lipases incluant les triglycérides lipases, les diglycérides lipases ou les monoglycérides lipases. Durant l'infection, Mycobacterium tuberculosis accumule des corps d'inclusion intracellulaires chargés de lipides dont les lipides sont probablement issus de la dégradation de la membrane cellulaire de l'hôte. On dispose désormais de fortes évidences supportant le fait que les acides gars représentent une source de carbone durant la dormance. Mycobacterium tuberculosis stocke des acides gras sous la forme de triacylglycérol (TAG) lors de son entrée dans le stade non réplicatif persistant (état latent). De plus, des granulomes contenant des macrophages spumeux qui sont des cellules contenant dans leur cytoplasme une grande quantité de lipides
6 neutres entourés de phospholipides ont été trouvés. Ces corps lipidiques sont induits par l'internalisation de la bactérie et par conséquent fournissent une source de carbone pour la survie et la réactivation du pathogène. Plus généralement, ces découvertes supportent le-fait que les enzymes impliquées dans la dégradation des lipides peuvent assumer des fonctions physiologiques importantes et peuvent participer à l'extraordinaire capacité de survie et à la réactivation de Mycobacterium tuberculosis à partir des cellules infectées. La dégradation des lipides de l'hôte par Mycobacterium tuberculosis est probablement réalisée par des enzymes lipolytiques, telles que les lipases et les phospholipases, comprenant la famille des enzymes cutinases. Les lipases sont des protéines solubles dans l'eau ayant une activité lipolytique appartenant au groupe des estérases et catalysant l'hydrolyse de substrats insolubles dans l'eau comme les liaisons ester du triacylglycérol et des phospholipides [Alberghina, et al. (1991) Lipases: Structure, Mechanism, and Genetic Engineering, Vol. 16, VCH, Weinheim, Fed. Rep. Ger.; Wooley, P., and Petersen, S. B. (1994) Lipases: their structure, biochemistry and applications, Cambridge University Press, Cambridge; Brockerhoff, H., and Jensen, R. G. (1974) Lipolytic Enzymes, Academic Press, New York; Borgstrôm, B., and Erlanson, C. (1984) Lipases, Elsevier, Amsterdam]. Dans ce contexte, la réaction catalytique de lipolyse implique différents processus à l'interface et dépend étroitement de la structure des substrats lipidiques présents dans les émulsions huile dans eau, les bicouches membranaires, les monocouches, les micelles et les vésicules [Aloulou, et al. (2006) Biochim. Biophys. Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids 1761, 995-1013]. Le processus catalytique peut être décrit comme une étape réversible d'adsoption/désorption des lipases ayant lieu à l'interface huile/eau, suivie par la formation d'un complexe enzyme substrat à l'interface et la libération des produits de lipolyse. [Verger, R., et al. (1973) J. Biol. Chem. 248, 4023-4034; Panaitov, I., and Verger, R. (2000) Enzymatic reactions at interfaces: Interfacial and temporal organization of enzymatic lipolysis, In Physical Chemistry of Biological Interfaces (Baszkin, A., and Norde, W, Eds), pp 359-400, Marcel Dekker, Inc, New York, Basel]. Parmi les lipases de M. tuberculosis identifiées, 24 ont été classées dans la famille des enzymes appelée "famille Lip". Toutefois, cette classification est seulement basée sur la présence de la séquence consensus GXSXG qui est caractéristique des
7 estérases et des membres de la famille des feuilles a/13 hydrolase. Cette classification ne permet pas la distinction entre les enzymes lipolytiques (lipase) et non lipolytiques (estérase). Par exemple, LipH [Canaan, S. et al. (2004) Eur. J. Biochem. 271, 3953-3961], LipF [Zhang, M et al. (2005) Protein Expr Purif 42, 59-66] et LipC (voir l'exemple 1) ont été clonées et caractérisées mais aucune hydrolyse des chaines longues des triglycérides (TG) n'a été détectée. Au contraire, les Inventeurs ont démontré que les lipases "vraies", c'est à dire des protéines ayant une activité d'hydrolyse des chaînes longues, sont utiles pour le diagnostic de la TB active, sans réaction croisée avec les échantillons TB latents. Cela inclut les lipases vraies appartenant à la famille Lip, et n'importe quelle autre lipase vraie qui n'appartient pas à la famille Lip [Côtes K et al. (2007) Biochem J. 408(3), 417-427]. Les Inventeurs ont émis l'hypothèse que l'activité lipolytique est élevée durant la réactivation de la bactérie, les conduisant ainsi à la méthode selon l'invention qui permet d'identifier spécifiquement la seule réactivation, c'est-à-dire la TB active. Au contraire, chez les individus sains, ou les patients/individus ayant une LTBI, le système immunitaire n'a pas été en présence des lipases selon l'invention. Par conséquent, ces individus sains ou patients/individus ayant une LTBI ne seront jamais détectés avec la méthode selon l'invention. Par conséquent, les lipases susmentionnées sont utilisées pour mettre en oeuvre une méthode de diagnostic, préférentiellement in vitro. La méthode selon l'invention est basée sur la détection des lymphocytes activés. Les « lymphocytes activés » sont de simples lymphocytes qui ne sont pas naïfs, c'est-à- dire des lymphocytes qui ont été précédemment stimulés par des antigènes spécifiques. Cette activation est accompagnée de changements morphologiques -connus en tant que transfoiination lymphocytaire, et la capacité à sécréter des molécules actives telles que des anticorps, des cytokines, des facteurs de croissance ou de mort...Ces mécanismes d'activation des lymphocytes sont bien connus de l'état de la technique. Dans une première étape de la méthode selon l'invention, les lymphocytes activés d'un individu, ou d'un patient, suspecté d'avoir une TB active, sont purifiés et mis en contact avec au moins une lipase de mycobactéries, préférentiellement de Mycobacterium tuberculosis, ladite lipase ayant, comme mentionné précédemment, une activité lipolytique, or une activité lipolytique identifiée biochimiquement. Comme mentionné ci-dessus, LipC, LipH et LipF, qui n'ont pas une telle activité lipase, sont exclues de facto de la méthode selon l'invention. De plus, les protéines de Mycobacterium, en particulier de Mycobacterium tuberculosis, n'ayant pas d'activité lipolytique sont également exclues. Dans'une seconde étape de la méthode selon l'invention, les lymphocytes spécifiques des lipases sont détectés par des moyens décrits ci-après. Il est clair pour l'homme de métier que les "lymphocytes activés" selon l'invention sont spécifiques de la protéine ayant une activité lipolytique. En d'autres termes, les lymphocytes qui ont été activés par une autre protéine dépourvue d'activité lipolytique, ne pourront jamais être détectés par la méthode selon l'invention. Ainsi, après la mise en contact des lymphocytes dudit patient/individu suspecté d'avoir un e T B a ctive, et 1 a dé tection de s 1 ymphocytes a ctifs, l e p athologiste e st capable de déterminer si ledit patient/individu a une TB active. Par exemple, si des lymphocytes non actifs sont détectés, il n'est pas possible de conclure que le patient n'est pas atteint de TB active. Par contre, si des lymphocytes activés sont détectés, la conclusion est que ledit patient/individu a une TB active. Dans le dernier cas, il peut également être possible, en quantifiant la quantité de lymphocytes actifs, de déterminer approximativement la période depuis laquelle les bactéries ont été réactivées. Contrairement aux méthodes immunologiques standards utilisées dans l'état de la technique, qui sont basées sur la détection de la présence d'anticorps dans le sérum de patient/individu suspectés d'être atteint de TB active, la méthode selon l'invention permet une détection plus précoce. Cette précocité est due au fait que les lymphocytes activés sont les premiers à être présent dans le sang, avant de produire des .composés détectables, tels que des anticorps, qui peuvent être détectés par des techniques immunologiques. De plus, la détection de ces lymphocytes activés spécifiques des lipases impliquées dans la réactivation de la bactérie permettent clairement la caractérisation de l'état actif de la maladie. Par opposition, la détection d'anticorps, comme dans un ELISA, ne reflète pas nécessairement la maladie active telle qu'elle apparait au moment de la détection mais seulement une exposition antérieure sans indication de temps puisque les
9 anticorps sécrétés après immunisation peuvent avoir une demie-vie longue. La détection d'un tel faible niveau de réponse sérologique de TB est du à une précédente exposition à M. tuberculosis à un moment donné dans le passé et est appelé la « tolérance sérologique ». Par conséquent, la faible demie vie de ces lymphocytes activés spécifiques des enzymes circulant dans le sang seulement durant la TB active, contrairement aux anticorps, combiné à la production préférentielle de certaines lipases utilisées dans l'invention permettent un diagnostic précoce de la TB active. Dans un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne une méthode pour le diagnostic in vitro de la TB active telle que définie ci-dessus, où les lymphocytes sont des lymphocytes B ou des lymphocytes T. Dans la méthode selon l'invention, les lymphocytes, et les lymphocytes activés sont préférentiellement des lymphocytes B, sécrétant des anticorps, et des lymphocytes T mémoire effecteurs, en particulier T CD4+ et CD8+. Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne une méthode de diagnostic in vitro de la TB active définie précédemment, où lesdites enzymes ayant une activité lipolytique sont capables d'hydrolyser des lipides ayant des chaines carbonées comprenant au moins 12 carbones. Les lipases selon l'invention sont par conséquent capable d'hydrolyser un lipide ayant une chaine carbonée comprenant au moins 12 carbones, préférentiellement au moins 14 carbones, en particulier au moins 16 carbones. Au plus, la chaine carbonée a environ 30 carbones. Les lipides définis dans l'invention sont choisis palan les acyles gras, les glycérolipides, les glycérophospholipides, les sphingolipides, ... Ces chaires carbonées contenues dans les lipides sont bien connues de l'état de la 25 technique, et peuvent être mono ou polysaturés, ou non. Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode de diagnostic in vitro de la TB active telle que définie ci-dessus, ou ladite enzyme ayant une activité lipolytique est choisie dans le groupe consistant en : une phospholipase, préférentiellement Rv3452, Rv3802c, PlcA, PlcB, 30 P1cC ou PlcD, une lipase, préférentiellement la lipase Rv1984c, une triacylglycérol hydrolase, préférentiellement LipY, et une monoacylglycérol hydrolase, RvO 183.
Les lipases les plus avantageuses selon de l'invention sont : la protéine ayant une activité phospholipase Rv3452, représentée par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 1, la protéine ayant une activité lipase Rv1984c, représentée par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO :2, la triacylglycérol hydrolase LipY (Rv3097c), représentée par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 3, la monoacylglycérol hydrolase RvOl 83 représentée par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 4, la protéine ayant une activité phospholipase P1cA (aussi appelée Rv2351c), représentée par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 5, la protéine ayant une activité phospholipase P1cB (aussi appelée Rv2350c), représentée par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 6, la protéine ayant une activité phospholipase P1cC (aussi appelée Rv2349c), représentée par la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 7, et la p rotéine ayant un e a ctivité p hospholipase P 1cD, r eprésentée p ar 1 a séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 7 ou la séquence d'acides aminés SEQ ID NO: 8.
Les séquences ci-dessus correspondent aux protéines de Mycobacterium tuberculosis. Cependant, l'invention comprend également des peptides d'autres espèces de Mycobacterium impliquées dans la tuberculose, telles que Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium aviurn, Mycobacterium avium subsp. avium, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, Mycobacterium parascrofulaceum, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium leprae et Mycobacterium bovis. Dans un a utre m ode de r éalisation de 1 'invention, de s fragments de s p eptides c i-dessus possédant des épitropes immunogènes peuvent être utilisés dans la méthode décrite ci-dessus et ci-après.
L'invention englobe également des variants des protéines ci-dessus, ayant une identité de séquence d'au moins 75%, préférentiellement au moins 80%, plus préférentiellement au moins 90%.
11 Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne la méthode de diagnostic in vitro de la TB active définie précédemment, où les lymphocytes sont des lymphocytes B, en particulier des lymphocytes B choisis parmi les plasmablastes et les plasmocytes circulants, lesdits lymphocytes B sécrétant des anticorps dirigés spécifiquement contre ladite enzyme ayant une activité lipolytique. Dans ce mode de réalisation avantageux de la méthode selon l'invention, les lymphocytes B sont détectés. Ce mode de réalisation avantageux correspond à une technique ELISpot (B-ELISpot, or ELISPOT B), où les cellules B exprimant des anticorps dirigés spécifiquement contre la lipase sont détectées. Les détails de la méthode sont décrits dans les Exemples. Brièvement, la méthode consiste à mettre en contact la lipase selon l'invention avec des lymphocytes B purifiés d'un individu/patient suspecté d'avoir la TB active. La purification des lymphocytes B peut être obtenue par n'importe quelle technique bien connue de l'état de la technique, par exemple, en utilisant le protocole décrit dans Greaves et Brown [Greaves and Brown, 1974, The Journal of Immunology, vol. 112 no. 1 420-42], ou n'importe quelle adaptation de celle-ci. Un autre protocole est décrit dans la section Exemples. Préférentiellement, l'invention concerne la méthode de diagnostic in vitro de la TB active telle que définie précédemment, où l'étape de détection de la présence de lymphocytes activés in vivo consiste en la détection de la sécrétion desdits anticorps dirigés spécifiquement contre ladite enzyme ayant une activité lipolytique. Avantageusement, la méthode selon l'invention permet la détection de lymphocytes B activés, en mesurant leur capacité à sécréter des anticorps spécifiques.
Afin de limiter les interférences, ou les faux positifs, les lymphocytes B utilisés dans la méthode selon l'invention sont purifiés, et isolés du sang. Par "purifié" on entend dans l'invention que les lymphocytes B sont isolés des autres cellules contenues dans le sang. Les méthodes permettant la purification des lymphocytes B sont bien connues de l'état de la technique, et incluent les sélections immunologiques positives et/ou négatives (sélection positive avec des marqueurs spécifiques exprimés sur les cellules B ; sélection négative en éliminant les cellules qui ne sont pas des lymphocytes B...).
12 Une étape très importante durant l'isolement des lymphocytes B est d'éliminer toute trace résiduelle de sérum, ou de fluide qui est susceptible de contenir des anticorps. Des répétitions des étapes de lavage en utilisant un tampon ad hoc, ou la séparation sur un gradient de sucrose, ou une combinaison de ceux-ci, peuvent être utilisés.
La méthode rosette telle que décrite dans l'Exemple 4 est particulièrement appropriée.. Comme mentionné précédemment, les lymphocytes sont obtenus à partir du sang d'un individu/patient. Dans le sang, il est possible de distinguer plusieurs lymphocytes B : - les lymphocytes B naïfs (qui n'ont jamais été activés par aucun antigène), - les lymphocytes B mémoires (qui ont été activés par au moins un antigène lors d'une ancienne infection), - les lymphocytes B transitoires (cellules naïves incomplètement différenciées), et - les plasmablastes et les plasmocytes (qui secrètent les anticorps), les plasmablastes étant détectables précocement durant un épisode infectieux. In vivo, si le patient/individu a une réactivation des mycobactéries, la lipase selon l'invention sera exprimée et accessible au système immunitaire. Alors, les cellules B seront activées afin de produire des anticorps spécifiques dirigés contre la lipase qui les a activés.
Les lymphocytes purifiés sont alors mis en contact avec au moins une lipase selon l'invention pendant un délai déterminé. Plus avantageusement, l'invention concerne une méthode pour le diagnostic in vitro de la TB active telle que définie ci-dessus, où ladite sécrétion est détectée en mesurant la formation d'un complexe immun entre lesdits anticorps et ladite enzyme ayant une activité lipolytique. Comme mentionné précédemment, les lymphocytes B purifiés sont mis en contact avec au moins une lipase selon l'invention. Ainsi, tous les lymphocytes B capable de produire des anticorps secréteront ces anticorps dans le milieu. Seuls les anticorps spécifiques de la lipase foimeront un complexe immun (complexe immun lipase/anticorps), les autres anticorps présents n'étant pas capables de former de complexes immuns.
Une étape de la méthode consiste à retirer les lymphocytes B, et le milieu les comprenant et les anticorps sécrétés. Alors, seul le complexe lipase/anticorps sera présent. Un complexe immun spécifique est folmé et peut être détecté. Par conséquent, au moyen de techniques permettant la détection d'un complexe immun, il sera possible de déterminer, et de quantifier, la présence d'un tel complexe. Dans le cas de la réactivation des bactéries, c'est-à-dire la TB active, la méthode selon l'invention permettra de détecter un tel complexe immun. Par contre, dans le cas d'un individu sain, ou d'un individu ayant une tuberculose latente, aucun 10 complexe ne sera détecté. Pour résumer, la méthode ci-dessus peut être mise en oeuvre comme suit : les lipases selon l'invention sont immobilisées sur un support. les lymphocytes B purifiés sont mis en contact avec lesdites lipases immobilisées pour permettre la foilnation d'un complexe binaire lipase/anticorps anti lipase. après une incubation appropriée (de 1h à 72 heures), les lymphocytes sont éliminés et les lipases immobilisées sont lavées au moins une fois, des anticorps marqués dirigés contre les fragments Fc humains sont mis en contact avec les lipases immobilisées. le complexe ternaire lipase/anticorps anti-lipase/ anticorps anti Fc est détecté avec les moyens appropriés correspondant à la molécule de marquage fixée sur l'anticorps anti-Fc. L'étape 3 ci-dessus, les lymphocytes B sont incubés avec les enzymes immobilisées ayant une activité lipolytique d'environ 1 heure à environ 72 heures, 25 préférentiellement d'environ 24 heures à environ 48 heures, en particulier d'environ 16 heures à environ 30 heures. Les temps d'incubation susmentionnés ne devraient pas être trop longs afin de limiter la détection des lymphocytes B mémoires, qui sont présents à une très faible quantité, mais restent capables de sécréter des anticorps. 30 Dans encore un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode pour le diagnostic in vitro de la TB active définie précédemment, où lesdits lymphocytes sont des lymphocytes T, lesdits lymphocytes sécrétant des 1. 2. 15 3. 4. 20 5. biomarqueurs tels que des cytokines, des chimiokines ou des facteurs de croissance après leur activation. Dans ce mode de réalisation avantageux de la méthode selon l'invention, les lymphocytes T sont détectés.
Ce mode de réalisation avantageux de l'invention correspond à une technique ELISpot (T-ELISpot or ELISpot T) où les cellules T activées par la présentation des antigènes correspondant aux lipases selon l'invention sont détectées. Les détails de la méthode sont décrits dans les Exemples. Brièvement, la méthode consiste en la mise en contact de la lipase selon l'invention 10 avec des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) purifiées d'un patient/individu suspecté d'avoir la TB active. La purification des PBMC peut être effectuée par n'importe quelle technique bien connue de l'état de la technique, par exemple en utilisant un gradient comme le Ficoll® ou l'Histopack® ou n'importe laquelle des adaptations de celle-ci. Un 15 protocole est décrit dans la section Exemple. Avantageusement, l'invention concerne la méthode de diagnostic in vitro de la TB active telle que définie ci-dessus, où l'étape de détection de la présence de lymphocytes activés consiste en la détection d'au moins un biomarqueur tel qu'une cytokine, une chimiokine ou un facteur de croissance, lesdits lymphocytes étant 20 activés par ladite enzyme ayant une activité lipolytique. A l'issue du développement des cellules T, les cellules T mature naïves expriment le complexe récepteur T (TCR)-CD3. Le TCR a une forte affinité pour les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). Les protéines du CMH de classe II sont généralement trouvées à la surface des 25 cellules spécialisées présentatrices d'antigènes (APC), lesdites molécules du CMH de classe II exprimant des parties des peptides issus de bactéries ou virus exogènes. Les protéines du CMH de classe I sont généralement trouvées sur toutes les cellules nucléées de l'organisme, lesdites molécules du CMH de classe I exprimant des parties des peptides issus de la dégradation des protéines cytosoliques étrangères. 30 Au cours d'une réponse immunitaire, les cellules APC expriment à leur surface des molécules du CMH contenant des antigènes de bactéries. Les lymphocytes naïfs ayant un TCR complémentaire des molécules du CMH présentant l'antigène sont alors activés. Il s' agit de la première étape d'activation.
Les cellules T ayant reçu le premier signal doivent être activées par un second signal impliquant des protéines de surface de co-stimulation impliquées dans le complexe CMH-TCR. Quand le second signal est reçu, les lymphocytes T sont alors activés ce qui leur permet de proliférer. Les cellules T activées deviennent des lymphocytes effecteurs ou auxiliaires sécrétant des transmetteurs infonnatifs (cytokines, interférons, facteurs de croissance, chimiokines...). Lorsque l'on purifie les PBMC, les lymphocytes T effecteurs sensibilisés par l'antigène sont la source prépondérante de la production précoce de molécules (cytokines, interférons, facteurs de croissance, chimiokines...) après la re stimulation ex vivo par l'antigène dans l'invention. Lorsque l'on purifie des PBMC, les lymphocytes T ayant reçu le premier signal sont présents, et peuvent être stimulés in vitro par l'antigène. Ainsi, si les lipases selon l'invention sont mises en contact avec des PBMC purifiés, seuls les lymphocytes sensibilisés qui ont été préalablement activés et différenciés en cellules effectrices peuvent par conséquent produire des biomarqueurs correspondant aux biomarqueurs informatifs (cytokines, interférons, facteurs de croissance, chimiokines...). Ainsi, si les. biomarqueurs spécifiques sont détectés, cela signifie que les PBMC stimulés in vitro par les lipases selon l'invention contiennent des lymphocytes effecteurs actifs, lesdits lymphocytes T étant activés et sensibilisés in vivo par les cellules APC exprimant dans leurs molécules du CMH des parties desdites lipases. La mesure de la présence de telles cellules T effectrices diagnostique par conséquent l'infection en cours, c'est-à-dire que les bactéries ont été réactivées.
Au contraire, si un biomarqueur non spécifique est détecté, cela signifie que les PBMC ne contiennent pas de lymphocytes effecteurs spécifiques de lipases, c'est-à-dire qu'une réactivation in vivo des bactéries n'a pas eut lieu. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention concerne la méthode de diagnostic in vitro de la TB active telle que définie ci-dessus, où ladite sécrétion est détectée par la mesure de la formation d'un complexe immun entre au moins un biomarqueur tel qu'une cytokine, une chimiokine ou un facteur de croissance sécrété par lesdits lymphocytes T activés et des anticorps dirigés spécifiquement contre ledit au moins un marqueur, tel qu'une cytokine, une chimiokine ou un facteur de croissance. Les protéines telles que l'IFN-7, IP-l0 (aussi connu comme CXCL10), l'IL-2, MCP-1 et l'IL-lRA sont libérées en réponse à une stimulation par un antigène de 5 Mycobacterium tuberculosis. Par conséquent, les biomarqueurs ci-dessus, et n'importe quel autre marqueur connu de l'état cte la technique, peuvent être détectés avec la méthode selon l'invention telle que décrite ci-dessus. Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la méthode 10 définie ci dessus, où ladite étape de détection de la présence de lymphocytes activés est mise en oeuvre par une détection immunologique. Comme mentionné précédemment, les lymphocytes T activés sont capables de produire/sécréter des biomarqueurs dans le milieu. Seuls des anticorps qui sont spécifiques desdits biomarqueurs formeront un complexe immun (complexe 15 biomarqueur/anticorps), les autres biomarqueurs présents n'étant pas capable de former un tel complexe immun. Une étape de la méthode consiste à enlever les lymphocytes T, et le milieu les comprenant et les biomarqueurs sécrétés. Alors, seulement le complexe biomarqueur/anticorps sera présent. 20 Par conséquent, au moyen de techniques classiques peiiuettant la détection d'un complexe immun, il serait possible de déterminer, et de quantifier, la présence d'un tel complexe. Dans le cas de la TB active, la méthode selon l'invention permettrait de détecter un tel complexe immun. Par contre, dans le cas d'un individu sain, ou d'un individu 25 ayant une LTBI, aucun complexe ne serait détecté. Pour résumer, la méthode ci-dessus peut être mise en oeuvre comme suit : 1. Des anticorps dirigés contre des biomarqueurs spécifiques sont immobilisés sur un support. 2. Les PBMC purifiées sont mises en contact avec lesdits anticorps 30 immobilises dirigés contre les biomarqueurs spécifiques pour peilnettre la formation d'un complexe binaire biomarqueur/anticorps dirigés contre les biomarqueurs spécifiques qui seront sécrétés après la stimulation spécifique par les lipases.
17 3. Les antigènes de lipases selon l'invention sont ajoutés aux PBMC. 4. Après une incubation appropriée, (d'environ 24 heures à environ 6 jours), les PBMC sont retirés et les anticorps immobilisés dirigés contre les biomarqueurs spécifiques sont lavés au moins une fois. 5. Des anticorps marqués dirigés contre lesdits biomarqueurs sont mis en contact avec les anticorps immobilisés dirigés contre les biomarqueurs spécifiques. 6. Le complexe ternaire d'anticorps dirigés contre les biomarqueurs spécifiques-anticorps marqués anti biomarqueurs est détecté par des IO moyens appropriés correspondant à la molécule de marquage fixée sur l'anticorps anti-biomarqueur. Dans les deux ELISpots décrit ci-dessus, l'homme du métier sait comment choisir les molécules de marquage appropriées pour détecter le complexe ternaire. L'invention concerne également un kit pour la détection in vitro de la TB active 15 comprenant 1. au moins une protéine de mycobactérie immobilisée sur un support, ladite protéine étant une enzyme ayant une activité lipolytique, et 2. des anticorps, possiblement marqués, dirigés contre la chaine constante des immunoglobulines. 20 Avantageusement, l'invention concerne un kit pour la détection in vitro de la tuberculose active comprenant : au moins une protéine de mycobactérie immobilisée sur un support, ladite protéine étant une enzyme ayant une activité lipolytique, des anticorps, possiblement marqués, dirigés contre la chaine constante des 25 immunoglobulines, et des moyens pour purifier spécifiquement des lymphocytes B. Le kit peut aussi comprendre de plus des contrôles positifs et/ou négatifs. Les supports selon le kit décrit ci-dessus et ci-après sont par exemple des plaques de micro-titration, des plaques Elisa, des membranes plastiques, des membranes de 30 Fluoride de Polyvinylidène (PVDF)... L'homme du métier peut facilement déterminer le support approprié. Pour la procédure de détection, les anticorps utilisés pour la détection sont généralement marqués avec un marqueur. Les marqueurs utilisés pour le marquage des anticorps sont choisis pairui les marqueurs communément utilisés par l'homme du métier dans l'état de la technique, et en particulier choisis parmi les marqueurs radio-isotopiques, les enzymes, les agents fluorescents, les agents luminescents, les particules magnétiques...
L'invention concerne également un kit pour la détection in vitro de la TB active comprenant : 1. au moins une protéine de mycobactérie, ladite protéine étant une enzyme ayant une activité lipolytique, et 2. des anticorps, immobilisés sur un support, dirigés contre au moins un biomarqueur sécrété par des lymphocytes T activés. Avantageusement, l'invention concerne un kit tel que défini ci-dessus, où lesdites enzymes ayant une activité lipolytique sont capables d'hydrolyser des lipides ayant des chaines carbonées comprenant au moins 12 carbones. Plus avantageusement, l'invention concerne un kit défini ci-dessus, où ladite enzyme ayant une activité lipolytique est choisie dans le groupe consistant en : une monoacylglycérol hydrolase, Rv0183, une phospholipase, préférentiellement Rv3452, R v3802c, PlcA, P1cB, PlcC ou P1cD, une lipase, préférentiellement Rvl 984c, et une triacylglycérol hydrolase, préférentiellement LipY. Un autre mode de réalisation avantageux de l'invention concerne un kit tel que défini ci-dessus, où lesdits moyens pour purifier spécifiquement des lymphocytes B sont choisis parmi les anticorps spécifiques des cellules B, ou les gradients de densité, ou une combinaison de ceux-ci.
Le kit peut également comprendre de plus des contrôles positifs et/ou négatifs, tels que des cellules activées par des composés activateurs polyclonaux ou cultivés dans un milieu de culture cellulaire. Avantageusement, l'invention concerne les kits tels que définis ci-dessus, où lesdites enzymes ayant une activité lipolytique sont capables d'hydrolyser des lipides ayant 30 une chaine carbonée comprenant au moins 12 carbones. En particulier, l'invention concerne les kits définis précédemment, où ladite enzyme ayant une activité lipolytique est choisie dans le groupe constitué de une phospholipase, préférentiellement Rv3452, Rv3802c, P1cA, PlcB, P1cC ou PlcD, une lipase, préférentiellement Rv1984c, une triacylglycérol hydrolase, préférentiellement LipY, et - une monoacylglycérol hydrolase, RvOl 83. L'invention sera mieux expliquée par les exemples suivants et les figures 1 à 3 suivantes.
LEGENDE DES FIGURES Les Figures lA et B représentent la carte du plasmide pSD24 obtenu à partir de pSD26. La Figure lA représente la carte du plasmide pSD24 où les sites de restriction sont indiqués La Figure 1B représente le site multiple de clonage (MCS) du vecteur pSD26. La Figure 2 représente une courbe démontrant l'activité lipase de LipY. Le graphique représente la dégradation du para-Nitrophényle avec différentes quantités de protéine. L'axe des X représente la quantité de protéines (µg de paroi cellulaire) ; l'axe des Y représente l'absorbance à 405 nm. Triangles : mycobactéries contrôles.
Cercles : surexpression de LipY par les mycobactéries. La Figure 3 représente les résultats obtenus avec un ELISpot-B utilisant l'antigène LipY. 1. représente les patients avec une tuberculose latente (positifs IGRA) et 2. Les patients avec une TB active. L'axe des Y représente les cellules sécrétrices d'anticorps /106 lymphocytes B. 2. EXEMPLES
Exemple 1 : LipC n'est pas une Lipase en tant que telle, alors que LipY en est 30 une. Comparaison de l'activité lipase de Rv0220(LIPC) et d'une cutinase de F. solani sur la famille des esters de paranitrophényle.
L'activité de rLipC ou des cutinases a été mesurée en utilisant la famille des esters de p-nitrophényle (Sigma) avec des chaines carbonées de longueurs de C2 à C14. La libération de p -NP a é té suivie à 410 nm e n utilisant un s pectrophotomètre p our plaque 96 puits et quantifié en utilisant une courbe étalon de pNP(Eo, 4lonm)= 30 mM- 1). Les réactions enzymatiques ont été réalisées dans un tampon Tris 2,5 mM pH 8,0 contenant 300 mM de NaCl et 4 mM de NaTDC à 37°C pendant une durée de 15 minutes dans un volume final de 300 µL, contenant différentes quantités d'enzyme et 1 mM de substrat. Les résultats sont exprimés en activité spécifique en unité internationale (U/mg) correspondant à 1 mole de pNP libéré par minute et par mg d'enzyme. Tableau 1 Substrat Activité Spécifique (U.mg-i) Rv0220 Cutinase F. solani p-Nitrophenyl esters pNP-butyrate (C4) 133x10-3 382 ± 22 pNP-valerate (C5) 111x10-3 78 ± 0,5 pNP-caprylate (C8) 22x10-3 14 ± 3 pNP-caprate (C10) 2x10-3 9 ±_1 pNP-laurate (C12) 0 1 ± 0,4 pNP-myristate(C14) 0 1 ± 0,2 Le tableau 1 ci-dessus démontre que LipC n'est pas capable d'hydrolyser les fonctions esters associées à la chaîne d'acyl gras de plus de 10 carbones.
L'activité rLipC a également été testée en utilisant un pH-stat, des tests fluorescents et spectrophotométriques pour divers lipides, aussi bien que des phospholipides, pour détecter une activité lipase ou phospholipase, respectivement. Contrairement à la cutinase ou aux lipases bien connues, Rv0220 ne montre aucune activité en utilisant, un pH-stats, des tests fluorescents et spectrophotométriques utilisant des lipides variés comme un substrat triglycéridique, diglycéridique ou monoglycéridique, quelle que soit la longueur de la chaîne carbonée. L'ensemble de ces données biochimiques démontre que Rv0220 n'est pas fine enzyme lipolytique.
LipY L'activité lipolytique a été mesurée en utilisant des préparations de membrane cellulaire de souches de M. segmentis présentant les différents dérivés exprimant. des lipases suivant une induction avec de l'acétamide. La fraction de membrane cellulaire de M. smegmatis présentant le pSD26 vide a été utilisée comme contrôle interne, de telle sorte que l'activité observée peut être attribuée seulement aux lipases surexprimées. Le stéarate de para-nitrophényle (Sigma) a été utilisé comme substrat, puisqu'il est spécifiquement hydrolysé par les lipases et pas par les carboxyles estérases, qui ne peuvent hydrolyser que des substrats avec groupes acyles de courte chaines (Zhang, Met al. 2005. Protein Expr. Purif. 42:59-66). Les tests ont été réalisés dans des plaques 96 puits (dans un mélange réactionnel de 100-1) contenant uné augmentation des concentrations de membrane cellulaire et une concentration finale de 0,5 mM de stéarate de p-nitrophényle (par dilution d'une solution stock de 20 mM dans l'acétonitrile avec 100 mM de Tris-HC1, pH 8,0). Le mélange a été incubé à 35°C, et la libération de p-nitrophénol a été mesurée par spectrophotométrie à 405 nm après 40 min de réaction. L'activité lipase a été expnmée comme la différence entre 1'absorbance à 40 min et celle à 0 min. Les réactions ont été faites en triplicata. Les résultats pour LipY sont montrés dans la figure 2.
Exemple 2 : Production des antigènes de M. tuberculosis : Rv0183, Rv1984c, Rv3452 et Rv3097c (LipY). Souches bactériennes Escherichia coli Rosetta pLysS a été utilisé pour l'expression de RvOl 83 et Rv1984c recombinant, tandis que C41(DE3) a été utilisé pour surexprimer Rv3452 [Côtes et al. (2007) Biochem J 408, 417-427; Schué et al. (2010) Faseb J 24, 1893-1903.]. LipY a été exprimée à partir de mc2155 recombinant de M s megmatis comme rapporté [Mishna, et al. (2008) Infect Immun 76, 127-140] et la purification est décrite ci-après.
Constructions d'expression des enzymes lipolytiques de M. tuberculosis Rv0183, Rv1984c, Rv3452 ont été amplifiées à partir des cosmides MTCl28.23, MTCY39, MTCY13E12 et Rv3097c à partir du BAC 48, respectivement (obtenus de l'Institut Pasteur). Rv0183, Rv1984c et Rv3452 ont été clones dans pDestl4 (Invitrogen) en utilisant la technologie gateway, pour obtenir pDestl4-His-Rv0183, pDestl4-His-Rv1984c et pDestl4-His-Rv3452, respectivement [Côtes et al. (2007) Biochem J 408, 417-427; Schué et al. (2010) Faseb J 24, 1893-1903]. Le gène Rv3097c a été clone dans le pSD26 inductible à l'acétamide (Figure 1) [Daugelat et al. (2003) Microbes Infect 5, 1082-1095] comme décrit précédemment [Mishra, et al. (2008) Infect Immun 76, 127-140]. Expression et purification de Rv0183, Rv1984c et Rv3452 Les souches d'E. colt portant pDestl4-His-Rv0183, pDestl4-His-Rv1984c ou pDestl4-His-Rv3452 ont été mises en culture toute la nuit dans un milieu LB complémenté avec les antibiotiques appropriés à 37°C. L es cultures ont alors é té diluée 20 fois avec du Terrifie Broth et l'expression des protéines a été induite avec 1 mM d'isopropyle [3-D-thiogalactoside (IPTG). La température a été diminuée à 25°C et les cultures ont été mises en culture pendant encore 16 heures. Les bactéries ont été récoltées et resuspendues dans un tampon de lyse glacé supplémenté avec de la DNAseI et du MgSO4. Pour la purification de Rv0183, le surnageant obtenu après centrifugation a été déposé sur une colonne Nie+-Agarose utilisant un système de chromatographie FPLC (Amersham Biosciences). Après lavage avec 10% de tampon B (consistant en du Tris 10 mM pH 8.0, du NaCl 150 mM avec 500 mM d'imidazole), rRvOl83 a été é luée avec 100% de tampon B . L es fractions éluées contenant les protéines purifiées ont été mélangées et purifiées une nouvelle fois par chromatographie d'exclusion de taille (Superdex 200) dans du Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM (tampon A). Rv1984c et Rv3452 recombinantes ont été exprimées uniquement sous une faune insoluble et ont été reconformationnées comme décrit précédemment [Schué et al. (2010) Faseb J 24, 1893-1903]. Autour de 10-15 mg peuvent être purifiés à partir d'un litre de culture. Les enzymes ont finalement été concentrées à 0,5-1 mg/ml et stoekées à -80°C jusqu'à leur utilisation ultérieure. Expression et purification de Rv3097c - Expression L'expression de Rv3097c recombinante a été effectuée en utilisant la souche M smegmatis mc2 155 comme rapporté précédemment [Mishra, et al. (2008) Infect Immun 76, 127-140] avec quelque modifications mineures. Brièvement, une seule colonie de M. smegmatis transformée portant pSD26_LipY a été utilisée pour inoculer 4 ml de milieu complet 7H9 contenant 50 µg/ml d'hygromycine B et utilisée pour inoculer 400 ml de milieu de culture pour une production à grande échelle. Les cellules ont été mises en culture à 37°C avec agitation (220 rpm) jusqu'à ce qu'une valeur de D0600I,n, d'approximativement 3 soit atteinte. L'expression des protéines recombinantes a été induite en ajoutant 0,2% d'acétamide pendant 16 heures supplémentaires. - Purification Les bactéries ont été sevrées et resuspendues dans un tampon glacé Tris/HC1 10 mM (pH8,0) contenant 150 mM de NaCl et 1% de N-lauroyl-sarcosine (sarcosyl) et par la suite cassées en utilisant une presse de French. Le surnageant a été récupéré tandis que le culot a été resuspendu encore une fois et soniqué trois fois durant 30s avec 30 s d'interruption entre chaque cycle et agité toute la nuit à 4°C. Les deux surnageants ont alors été mélangés et déposés sur une résine Nie+-NTA équilibrée avec 10 mM d'un tampon Tris/HC1 (pH 8,0) contenant 150 mM de NaCl et 1% de sarcosyl. La colonne a ensuite été lavée avec le tampon sans le détergeant avant l'élution avec des concentrations croissantes d'imidazole. Les fractions contenant LipY pure ont été mélangées et dialysées toute la nuit contre un tampon 10 mM de Tris/Hcl (pH 8,0) contenant 150 mM de NaCl et ensuite concentrée par ultrafiltration, conduisant généralement à une concentration finale de 0,5 mg/ml.
Exemple13: Isolement et purification des PBMC et des lymphocytes B Approximativement, 20 m 1 de s ang p ériphérique o nt é té c ollectés d ans des t ubes d'acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) et les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) sont cryoconservées avant que les cellules B ne soient isolées et testées. Les PBMC sont obtenues à partir d'échantillon de sang frais par une centrifugation de, densité histopaque® à 1200g pendant 20 min. Les PBMC sont récupérées à l'interface ficoll-plasma et centrifugées trois fois dans du PBS-2% SVF avant d'être resuspendues dans 1 ml de milieu de culture complet. Une fois obtenues, les PBMC sont mélangées avec un volume égal de SVF contenant 20% de DMSO à 4°C, stockées pendant 24 h à -80°C puis dans de l'azote liquide. Après retrait de l'azote liquide, les cryotubes ont été transférés dans un bain-marie à 37°C pour une décongélation rapide, puis dans un tube à centrifugation de 50 ml
24 contenant 5 ml de milieu de culture complet chaud (RPMI 1640 complémenté avec 10% de SVF, 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine, tous les réactifs sont issus d'Eurobio, Les Ullis, France). Les cellules ont été centrifugées pendant 5 minutes à 1200 g et resuspendues dans 1 ml de milieu de culture complet chaud. Pendant ce temps, 5 ml de sang frais sont centrifugés pendant 10 min à 50 g. Le plasma et la couche de lymphocytes sont retirés avant que le culot de cellùles sanguines rouges ne soit lavé avec du PBS-2%SVF. Le dernier culot est resuspendu dans 1 ml de PBS-2%SVF.
Ensuite, 30 m 1 de c ellules s anguines r ouges p urifiées p récédemment e t 10 m 1 d e cocktail d'enrichissement des cellules B Rosette SepTM sont ajoutés aux PBMC décongelées. Le mélange est incubé pendant 20 min à température ambiante avec agitation douce. L'isolement des lymphocytes B purifiés est obtenu par centrifugation de densité histopaque® à 1200 g pendant 20 min. Les cellules B purifiées sont récupérées de l'interface ficoll-plasma et centrifugées trois fois dans du PBS-2%SVF avant d'être resuspendues dans 1 ml de milieu de culture complet. Enfin, les cellules B sont ensemencées dans les puits de plaques ELISPOT.
Exemple 4 : Enumération des plasmocytes et des plasmablastes spontanés 20 sécrétant des anticorps spécifiques de Mvcobacterium tuberculosis- (ELISPOT
La capacité des lymphocytes B à sécréter spantauément des anticorps dirigés contre Rv0183, Rv1984c, Rv3452 et Rv3097c (LipY) a été évaluée ex vivo en utilisant un test ELISpot. Des plaques 96-puits avec une membrane immobilon-P (MAIPN 4550, 25 Millipore, Molsheim, France) sont activées avec 50 µl d'éthanol 70% pendant 10 min, lavées trois fois avec du PBS et recouvertes 18h à 4°C avec environ 3 }rg/puits de Rv0183, Rv1984c, Rv3452, Rv3097c P1cA-D ou Rv3802c dans du PBS. Après trois lavages dans du PBS, chaque puits est saturé avec 100 µl de milieu de culture complet pendant 2 h à 37°C. Toutes les cellules isolées après séparation 30 ficoll-histopaque ont été ensemencée à 2,5 105 cellules/puits dans du milieu de culture complet et incubées pendant environ 24h à 37°C dans une atmosphère humidifiée - 5% CO2. Après que les cultures cellulaires aient été récupérées, la plaque est 1 avée avec d u P BS, du P BS-0,05% Tween 20 e t e ncore du P BS. D es anticorps monoclonaux anti-IgM biotinylée et des anticorps monoclonaux anti-IgG phosphatase alcaline ou des anticorps monoclonaux anti -IgA biotinylées et des anticorps monoclonaux anti IgG phosphatase alcaline ont été ajoutés à une dilution au 1 :1000ème dans du PBS et la plaque a été incubée 18 h à 4°C ou 6h à 37°C. Après lavage avec du PBS, une solution de phosphatase alcaline-streptavidine marquée diluée au 1 :1000ème dans du PBS a été ajoutée et incubée 45 min à 37°C. Les plaques ont été lavées trois fois avec du PBS et développées avec le kit de substrat conjugué de la phosphase alcaline BCIP/NBT (un mélange de phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle et de nitroblue tétrazolium) selon les instructions du fabriquant (Bio-Rad). Une fois les spots violets apparus, la réaction est arrêtée avec trois lavages dans du PBS. 100 ml de substrat AEC (3-amino-9-Ethylcarbazole) de la peroxydase est ajouté à chaque puits pendant 20 min à température ambiante. La réaction est arrêtée avec 3 lavages avec de l'eau distillée. Chaque spot violet correspond à une seule cellule capable de sécréter des anticorps IgG anti-RvO183, Rv1984c, Rv3452 ou Rv3097c, alors que le spot rouge correspond à une seule cellule capable de sécréter des anticorps IgM ou IgA anti-Rv0183, Rv1984c, Rv3452 ou Rv3097c. L es spots ont été c omptés par imagerie à c améra vidéo et une analyse assistée par ordinateur (KS ELISPOT; Cari Zeiss, Jena, Germany). Les résultats avec LipY sont présentés dans la figure 3.
Ces résultats démontrent que l'ELISPOT B utilisant LipY permet de discriminer les patients avec une TB active (2. n=5) des sujets avec une TB latente (1. n=10) au moins pour les IgM et les IgG (P<0.05). Des résultats similaires sont obtenus avec les autres lipases Rv3452, Rv1984c, Rv0183 Rv3452, Rv3802c, P1cA, P1cB, P1cC et P1cD.
Matériels et Méthodes de l'Exemple 4 Jour 1,: - Activation de la membrane : addition de 5O0 par puits d'éthanol 70%, 5-10 minutes - 3 lavages, PBS (machine) - Ajouter, par puits, 1000 d'antigène (tuberculine ou lipases) aux concentrations suivantes : Tuberculine = 4µg/puits (Cm = lmg/ml) dans du PBS LipY = 5 µg/puits (Cm = 6601.ig/ml) dans du PBS Rv3452 = 6 µg/puits (Cm = 450µg/ml) dans du tampon carbonate 100mM, pH 9.6 Rv0183 = 411g/puits (Cm = 430µg/ml) dans du PBS Rv1984c = 5 µg/puits (Cm = 600µg/ml) dans du PBS IgG/IgA: 10111 de chaque dans 3,2 ml PBS (100}i1/puits) Couvrir avec un adhésif et incuber toute la nuit à 4°C (72 heures maximum) ou 6h à 37°C. Jour 2: - 3 lavages, PBS e Saturation de la membrane avec l00111 de RPMI enrichi (10% SVF décomplémenté, glutamine et pénicilline/streptomycine) pendant 2h à 37°C e Pendant ce temps, isolement rosetteSep des lymphocytes B du sang : dans un tube Falcon de 50mL verser le sang total (maximum 15 ml) Ajouter un volume équivalent de Rosettesep (GE Healthcare, pour cellules B : 50µ1 par ml de sang total) Mélanger par inversion Incuber pendant 20 minutes minimum. - Séparation des cellules B Ajouter un volume 1/1 de PBS+2%SVF et mélanger par aspiration/débordement Sur le même volume de Ficoll (le même que le sang total) ajouter avec précaution le mélange sang/PBS en utilisant une pipette de 10 mL Centrifuger 21 min, 1200g Noter l'anneau correspondant aux cellules B Retirer et débarrasser précautionneusement le surnageant avec une pipette Avec une pipette de 5 ml, retirer par rotation l'anneau des cellules B et les placer dans un tube Falcon de 50 mL Ajouter 30m1 de PBS, 2%SVF Centrifuger : 6 min, 1200g Retirer et éliminer précautionneusement le surnageant et laver le culot avec 30m1 de PBS, 2%SVF Laver 2 fois Resuspendre dans lml de RPMI enrichi. - Comptage des cellules 100 cellules + 10µ1 d'acide acétique (lyse des érythrocytes); mélanger, placer sur un dispositif de comptage et compter à l'aide du microscope Placer 5000 cellules B comme contrôle positif dans du RPMI enrichi et environ 100 000 cellules ailleurs Recouvrir la plaque avec un adhésif et incuber de 18h à 24h à 37°C, CO2 5% Attention à ne pas bouger les cellules Durant l'incubation afin d'éviter les traînées.
Jour 3: - Lavage: 3xPBS, 3xPBS/Tween et 3xPBS (laveur de plaque) - Révélation en ajoutant 100111 par puits de mélange PBS + anticorps 1/1000 Anti-IgG AP (phosphatase alcaline) conjuguée Anti-IgA biotine-conjuguée Couvrir avec un adhésif et toute la nuit à 4°C ou 6h à 37°C.
Jour 4 - 3 lavages dans du PBS - Pour les anticorps conjugués à la biotine, ajouter la streptavidine-peroxidase, 1/1000 dans du PBS et incuber 45min à 37°C - laver 3 fois dans du PBS - Ajouter le substrat AP : NTB-BCIP (Biorad) : l0µ1 A + l0111 B par ml de PBS 15 (1600/puits) durant 20min à température ambiante (laver lorsque les taches apparaissent) - Arrêter par trois lavages dans du PBS - Ajouter le substrat peroxydase AEC (100111/puits) durant 20min à température ambiante (4ml H20 distillée + 2 gouttes de tampon acétate + 1 goutte de chromogène 20 AEC + 1 goutte de peroxyde d'hydrogène à 3%) - Arrêter la réaction par 3 lavages dans de l'eau distillée - Sécher la membrane à 37°C - Perforer la membrane et fixer les spots sur un plastique adhésif transparent - lire les résultats (c'est-à-dire compter les spots). 25 Milieu RPMI enrichi Ajouter aux bouteilles de 500m1 de milieu RPMI 1640 - 10% de Sérum de Veau Foetal décomplémenté or SVF (56°C, 30 min) - lml de Streptomycine/Pénicilline 30 - 5ml de L-Glutamine PBS enrichi Ajouter aux bouteilles de 500m1 de Tampon Phosphate salin ou PBS: - 2% de SVF
28 lml de Streptomycine/Pénicilline
Exemple 5: E numération d es 1 ymphocytes T s pécifiques d e M ycobacterium tuberculosis produisant spontanément de l'interféron (IFN)-y (ELISpot T) La stimulation des cellules T par Rv0183, Rv1984c, Rv3452 ou Rv3097c a été mesurée par la production" d'IFN-y en utilisant un kit ELISpot IFN-y (Diaclone, Besançon, France) selon les instructions du fabriquant. Les PBMC ont été purifiées en utilisant un gradient de densité ficoll-hipaque et 105 PBMC sont stimulées avec chaque antigène spécifique de Mycobacterium tuberculosis individuellement (2-8 µg/ml) ou avec 1 µg/ml de phytohémagglutinine (PHA) pendant 24h à 37°C avec 5% de CO2 sur des plaques ELISpot (Millipore, Molsheim, France) qui ont été pré-recouvertes avec des anticorps de capture anti IFN-y humain. Des PBMC dans un milieu de culture sans antigènes ont été utilisées comme contrôles négatifs. Au jour 1, les PBMC ont été retirées, la plaque a été incubée à 4°C pendant 10 min avec 100 ml de PBS-0,05% Tween 20 et 100 µL d'anticorps de détection ont été ajoutés dans chaque puits après trois lavages supplémentaires dans 100 ul de PBS-0,05% Tween 20. La plaque est incubée à température ambiante pendant 1 h 30 min et lavée trois fois supplémentaires avec 100 µl de PBS-0,05% Tween 20. Ensuite, 100 111 de conjugué streptavidine- phosphatase alcaline est ajouté dans chaque puits et la plaque est incubée pendant 1h à température ambiante. Les plaques ont été lavées trois fois avec 100 pl de PBS-0,05% Tween 20 et développées avec le kit substrat du conjugué la phosphatase alcaline BCIP/NBT selon les instructions du fabriquant (Bio-Rad). Une fois que les spots violets apparaissent, la réaction est arrêtée avec trois lavages dans l'eau distillée. Les spots sont comptés par une analyse vidéo assistée par ordinateur (KS ELISPOT ; Cari Zeiss, .Jena, Germany). Le nombre de cellules sécrétant de l'IFN-y (ISC) est normalisé par 106 PBMC. La réponse à chaque antigène est considérée comme positive si le nombre d'ISC était supérieur à deux fois la réponse sans stimulation antigénique, après déduction du bruit de fond. Les résultats sont similaires pour LipY et les autres lipases comme ceux obtenus avec la méthode de l'Exemple 4.
Claims (7)
- REVENDICATIONS1. Méthode pour le diagnostic in vitro de la tuberculose active, comprenant : - une étape de mise en contact d'un échantillon de lymphocytes B purifiés d'un patient suspecté d'être atteint de la tuberculose active avec au moins une protéine de mycobactéries, ladite protéine étant une enzyme ayant une activité lipolytique et étant capable d'hydrolyser les lipides ayant une chaine carbonée comprenant au moins 12 carbones, ledit échantillon étant dépourvu de sérum ou de n'importe quel composé susceptible de contenir des anticorps solubles - une étape d'incubation pendant un temps dételminé pour permettre aux lymphocytes B purifies de sécréter des anticorps spécifiques dirigés contre ladite enzyme ayant une activité lipolytique, et - une étape de détection de la présence d'un complexe immun comprenant lesdits anticorps et ladite enzyme ayant une activité lipolytique.
- 2. Méthode pour le diagnostic in vitro de la tuberculose active selon la revendication 1, où ladite enzyme ayant pne activité lipolytique est choisie dans le groupe consistant en : - une monoacylglycérol hydrolase, RvO183, - une phospholipase, préférentiellement Rv3452, Rv3802c, PlcA, PlcB, PlcC ou PlcD, - la lipase Rv1984c, et - une triacylglycérol hydrolase, préférentiellement LipY.
- 3. Méthode pour le diagnostic in vitro de la tuberculose active selon la revendication 1 ou 2, où les lymphocytes B sont choisis parmi les plasmablastes et les plasmocytes.
- 4. Méthode pour le diagnostic in vitro de la tuberculose active selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, où l'étape de détection de la présence de lymphocytes B activés consiste en la détection de la sécrétion desdites anticorps dirigés spécifiquement contre ladite enzyme ayant une activité lipolytique.
- 5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, où l'étape de détection de la présence de lymphocytes B activés est mise en oeuvre par une détection immunologique.
- 6. Méthode pour le diagnostic in vitro de la tuberculose active selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, où ledit temps dételininé est de 1 heure à 72 heures, préférentiellement de 6 heures à 48 heures, plus préférentiellement de 16 heures à 30 heures. 10
- 7. Kit pour la détection in vitro de la tuberculose active comprenant : - au moins une protéine de mycobactéries immobilisée sur un support, ladite protéine étant une enzyme ayant une activité lipolytique, - des anticorps, possiblement marqués, dirigés contre la chaine constante des 15 immunoglobulines, et - des moyens pour purifier spécifiquement des lymphocytes B. 11. Kit selon la revendication 7, où ladite enzyme ayant une activité lipolytique est capable d'hydrolyser des lipides ayant une chaine carbonée comprenant au moins 20 12 carbones. 12. Kit selon la revendication 7 ou 8, où ladite enzyme ayant une activité lipolytique est choisie dans le groupe consistant en : - une monoacylglycérol hydrolase, RvOl 83, 25 - une phospholipase, préférentiellement Rv3452, Rv3802c, P1cA, P1cB, P1cC ou P1cD, - la lipase Rv1984c, et - une triacylglycérol hydrolase, préférentiellement LipY. 30 10. Kit selon l'une quelconque des r evendications 7 à 9, où lesdits moyens pour purifier spécifiquement les lymphocytes B sont choisis parmi les anticorps spécifiques des lymphocytes B, ou les gradients de densités, ou une combinaison de ceux-ci.5
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