JP2019176853A - 胸腺間質性リンパ球新生因子（ｔｓｌｐ）結合性抗体および抗体を使用する方法 - Google Patents

胸腺間質性リンパ球新生因子（ｔｓｌｐ）結合性抗体および抗体を使用する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）に特異的に結合する分子の提供。【解決手段】ヒトＴＳＬＰ内のエピトープに特異的に結合する分子であって、前記エピトープが、以下の残基：ある特定のアミノ酸配列のＬｙｓ３８、Ａｌａ４１、Ｌｅｕ４４、Ｓｅｒ４５、Ｔｈｒ４６、Ｓｅｒ４８、Ｌｙｓ４９、Ｉｌｅ５２、Ｔｈｒ５３、Ｓｅｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｔｈｒ５８、Ｌｙｓ５９、Ｌｙｓ１０１、Ｇｌｎ１４５、およびＡｒｇ１４９のうちの少なくとも１つを含む、分子。【選択図】なし

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットにより電子的に提出され、参照によりその全体が本
明細書に組み込まれる、配列表を含有する。２０１６年８月２３日に作成された前記ＡＳ
ＣＩＩコピーは、ＰＡＴ０５７０３５−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、４６
，６９６バイトのサイズである。
本発明は、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）に特異的に結合する分子、例えば
、抗体または抗体断片、これらの分子を含む組成物、ならびにこれらの分子を使用する方
法および作製する方法を提供する。
胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）は、ＩＬ−７Ｒαサブユニットと、一般的な
γ−受容体様鎖と相同な固有の構成要素であるＴＳＬＰ−Ｒとからなるヘテロ二量体の受
容体を介してシグナル伝達するサイトカインである（Pandey et al., Nat. Immunol. 200
0, 1(1):59-64）。ＴＳＬＰは、胸腺内、肺内、皮膚内、腸内、および扁桃内の上皮細胞
、ならびに気道平滑筋肉細胞、肺線維芽細胞、および間質性細胞が発現する（Edwards, 2
008, Drug news & perspectives 21, 312-316；He and Geha, 2010, Annals of the New
York Academy of Sciences 1183, 13-24；Reche et al., 2001, Journal of immunology
167, 336-343）。これらの細胞は、炎症促進性刺激に応答して、ＴＳＬＰを産生し、ＴＳ
ＬＰは、樹状細胞（Soumelis et al., 2002, Nature immunology 3, 673-680）、単球（R
eche et al., 2001, Journal of immunology 167, 336-343）、およびマスト細胞（Allak
hverdi et al., 2007, The Journal of Experimental Medicine 204, 253-258）を含む、
多数の生得免疫細胞に対するその活性を介して、アレルギー性炎症性応答を駆動する。Ｔ
ＳＬＰ−ＲおよびＩＬ−７Ｒαの両方を最高度に発現する公知の細胞集団は、骨髄樹状細
胞である（Reche et al., 2001, Journal of immunology 167, 336-343）。
ＴＳＬＰは、ナイーブＴ細胞の増殖を促進することが可能であり、高レベルのＩＬ−４
、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を発現するＴｈ２細胞への、それらの分化を駆動しうる（
Omori and Ziegler, 2007, Journal of immunology 178, 1396-1404）。高レベルのＴＳ
ＬＰ発現が、喘息性の肺上皮細胞内および慢性アトピー性皮膚炎病変内で見出されている
ことから、アレルギー性炎症におけるＴＳＬＰの役割が示唆される（Ziegler and Artis,
2010, Nature immunology 11, 289-293）。より近年の証拠は、ＴＳＬＰを、Ｔｈ１７細
胞の分化およびＴｈ１７に駆動される炎症性過程と関係づけている（Hartgring et al.,
2011, Arthritis and rheumatism 63, 1878-1887；Tanaka et al., 2009, Clinical and
experimental allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Im
munology 39, 89-100；Wu et al., 2014, Journal of molecular and cellular cardiolo
gy 76, 33-45）。慢性アレルギー性（アトピー性）喘息は、Ｔｈ２型の炎症を特徴とする
ことが多いのに対し、非アレルギー性喘息性炎症は主に好中球性であり、Ｔｈ１とＴｈ１
７とを混合したサイトカイン環境を伴う。喘息における慢性炎症の帰結は、気管支過敏性
（ＢＨＲ）、粘液の過剰産生、気道壁のリモデリング、および気道の狭窄を含む（Lambre
cht and Hammad, 2014, Nature immunology 16, 45-56）。ＴＳＬＰは、アレルギー性喘
息性応答の誘発および維持／増強に関与することが示されている（Wang et al., 2006, I
mmunity 24, 827-838）。より近年になって、ＴＳＬＰシグナル伝達はまた、局所抗原に
よる二次感作に対する、メモリーＴ細胞のリコール応答にも要求されることが見出された
（Wang et al., 2015, The Journal of allergy and clinical immunology 135, 781-791
e783）。
一態様では、本明細書では、ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）に特異的に
結合する分子、例えば、モノクローナル抗体、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２
、ｓｃＦｖ、ミニボディ、もしくはダイアボディなど、その抗体断片が提示される。一部
の実施形態では、ＴＳＬＰ結合性分子は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決
定領域１（ＨＣＤＲ１）；配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣ
ＤＲ２）；配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）；配列
番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）；配列番号１２のア
ミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）；および配列番号１３のアミノ酸
配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含みうる。一部の実施形態では、ＴＳ
ＬＰ結合性分子は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸
配列を含むＨＣＤＲ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；配列番号１４のア
ミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；および配
列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む分子を含みうる。
一部の具体的な実施形態では、分子は、ヒトＴＳＬＰに結合し、配列番号４のアミノ酸
配列を含むＨＣＤＲ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；配列番号３のアミ
ノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；配列番号１
２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ
３を含む抗体断片を含む。他の具体的な実施形態では、分子は、ヒトＴＳＬＰに結合し、
配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ
２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬ
ＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；および配列番号１６のアミノ
酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む抗体断片を含む。
一部の実施形態では、ＴＳＬＰ結合性分子は、配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可
変領域と、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含みうる。
一部の実施形態では、ＴＳＬＰ結合性分子は、配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖
と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含みうる。一部の実施形態では、ＴＳＬ
Ｐ結合性分子は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１９のアミノ酸配列
を含む軽鎖とを含みうる。
一部の実施形態では、ＴＳＬＰ結合性分子は、以下の残基：配列番号２２の重鎖配列の
Ｔｈｒ２８、Ａｓｐ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｒｐ３３、Ａｓｐ５６、Ｇｌｕ１０１、Ｉｌｅ
１０２、Ｔｙｒ１０３、Ｔｙｒ１０４、Ｔｙｒ１０５、または配列番号２５の軽鎖配列の
Ｇｌｙ２８、Ｓｅｒ２９、Ｌｙｓ３０、Ｔｙｒ３１、Ｔｙｒ４８、Ａｓｐ５０、Ａｓｎ５
１、Ｇｌｕ５２、Ａｓｎ６５、およびＴｒｐ９２のうちの、少なくとも１つ、少なくとも
２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも
７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なく
とも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６
個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または全てを含むパラト
ープを含みうる。
一部の実施形態では、本明細書では、ヒトＴＳＬＰ内のエピトープに特異的に結合する
分子であって、エピトープが、以下の残基：配列番号３８のＬｙｓ３８、Ａｌａ４１、Ｌ
ｅｕ４４、Ｓｅｒ４５、Ｔｈｒ４６、Ｓｅｒ４８、Ｌｙｓ４９、Ｉｌｅ５２、Ｔｈｒ５３
、Ｓｅｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｔｈｒ５８、Ｌｙｓ５９、Ｌｙｓ１０１、Ｇｌｎ１４５、お
よびＡｒｇ１４９のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくと
も４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくと
も９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、
少なくとも１４個、少なくとも１５個、または全てを含む分子が提示される。一部の実施
形態では、このような分子は、配列番号３８の残基の以下のセット：（ａ）Ｌｙｓ４９お
よびＩｌｅ５２、（ｂ）Ｇｌｙ５７およびＬｙｓ５９、（ｃ）Ｌｙｓ１０１、または（ｄ
）Ｇｌｎ１４５およびＡｒｇ１４９のうちの少なくとも１つを含むエピトープに結合する
。
一部の実施形態では、ＴＳＬＰ結合性分子は、ヒトＴＳＬＰに特異的に結合するヒト免
疫グロブリンである。一部の実施形態では、ＴＳＬＰ結合性分子は、モノクローナル抗体
、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ミニボディ、もしくはダイアボ
ディから選択される抗体の断片である。一部の実施形態では、ＴＳＬＰ結合性分子は、ヒ
トＴＳＬＰに特異的に結合するＦａｂ、例えば、ヒトまたはヒト化Ｆａｂである。
一部の実施形態では、本明細書で記載される分子は、１００ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ
）で、ヒトＴＳＬＰに結合する。一部の実施形態では、本明細書で記載される分子は、１
０ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、ヒトＴＳＬＰに結合する。
別の態様では、本明細書では、少なくとも１つの、本明細書で記載されるＴＳＬＰ結合
性分子と、少なくとも１つの、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が提示され
る。一部の実施形態では、賦形剤：ＴＳＬＰ結合性分子の質量比は、０．５を超える。一
部の実施形態では、ＴＳＬＰ結合性分子は、医薬組成物のうちの約５％〜約９５％、また
は約１０％〜約９０％、または約１５％〜約８５％、または約２０％〜約８０％、または
約２５％〜約７５％、または約３０％〜約７０％、または約４０％〜約６０％、または約
４０〜５０％（ｗ／ｗ）である。一部の実施形態では、医薬組成物は、トリロイシンまた
はロイシンなどのシェル形成剤を含む。一部の実施形態では、トリロイシンまたはロイシ
ンは、組成物のうちの約１０〜７５％（ｗ／ｗ）である。一部の実施形態では、トリロイ
シンは、組成物のうちの約１０〜３０％（ｗ／ｗ）である。他の実施形態では、ロイシン
は、組成物のうちの約５０〜７５％（ｗ／ｗ）である。一部の実施形態では、医薬組成物
は、少なくとも１つのガラス形成賦形剤であって、ヒスチジン、トレハロース、マンニト
ール、スクロース、またはクエン酸ナトリウムから選択されるガラス形成賦形剤を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのガラス形成賦形剤は、トレハロースまたはトレハ
ロースとマンニトールとの混合物である。一部の実施形態では、ガラス形成賦形剤は、組
成物のうちの約１５〜３５％（ｗ／ｗ）である。一部の実施形態では、医薬組成物は、ヒ
スチジン緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、またはリン酸緩衝液などの緩衝剤を含む
。一部の実施形態では、緩衝剤は、組成物のうちの約５〜１３％である。
一部の実施形態では、本明細書で提示される医薬組成物を、乾燥粉末製剤、例えば、吸
入に適する乾燥粉末製剤として製剤化する。
一部の実施形態では、本明細書で提示される医薬組成物は、シェルおよびコアを含み、
シェルが、トリロイシンまたはロイシンを含み、コアが、（ｉ）ＴＳＬＰ結合性分子、ト
レハロース、マンニトール、および緩衝剤；または（ｉｉ）ＴＳＬＰ結合性分子、トレハ
ロース、緩衝剤、およびＨＣｌを含む噴霧乾燥粒子を含む。緩衝剤は、ヒスチジン緩衝液
、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、またはリン酸緩衝液でありうる。
一部の実施形態では、本明細書で提示される医薬組成物は、（ｉ）トリロイシンまたは
ロイシンを含むシェルと；（ｉｉ）トレハロース、マンニトール、ヒスチジン、およびＴ
ＳＬＰ結合性分子を含むコア、またはトレハロース、ヒスチジン、ＨＣｌ、およびＴＳＬ
Ｐ結合性分子を含むコアであって、ＴＳＬＰ結合性分子が、（ａ）配列番号４のアミノ酸
配列を含むＨＣＤＲ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；配列番号３のアミ
ノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；配列番号１
２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ
３；または（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；配列番号６のアミノ酸配
列を含むＨＣＤＲ２；配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；配列番号１４のアミ
ノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；および配列
番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３のいずれかを含む、抗体のＦａｂ断片である、
コアとを含む噴霧乾燥粒子を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提示される医薬組成物は、
（ａ）４０％（ｗ／ｗ）のＴＳＬＰ結合性分子、２５％（ｗ／ｗ）のトリロイシン、合
わせた重量を３０％（ｗ／ｗ）とするトレハロースおよびマンニトール、ならびに５％（
ｗ／ｗ）のヒスチジン；
ｂ）５０％（ｗ／ｗ）のＴＳＬＰ結合性分子、１５％（ｗ／ｗ）のトリロイシン、２．
６％（ｗ／ｗ）のＨＣｌ、５．６％（ｗ／ｗ）のヒスチジン、ならびに合わせた重量を２
６．８％（ｗ／ｗ）とするトレハロースおよび塩基；または
ｃ）５０％（ｗ／ｗ）のＴＳＬＰ結合性分子、１５％（ｗ／ｗ）のトリロイシン、１９
．４％（ｗ／ｗ）のトレハロース、１３．０４％（ｗ／ｗ）のヒスチジン、および２．５
６％（ｗ／ｗ）のＨＣｌ
を含む。
本明細書ではまた、本明細書で記載される、任意のＴＳＬＰ結合性分子をコードする核
酸、このような核酸を含むベクター、および核酸またはベクターを含む宿主細胞も提示さ
れる。
また、本明細書で記載されるＴＳＬＰ結合性分子を作製する方法も提示される。このよ
うな方法は、（ａ）分子をコードする核酸を発現する宿主細胞を培養するステップと；（
ｂ）分子を、培養培地から回収するステップとを含みうる。
別の態様では、本明細書では、少なくとも１つの、本明細書で記載されるＴＳＬＰ結合
性分子または医薬組成物と、分子または医薬組成物を、対象に送達するためのデバイスと
を含むキットが提示される。一部の実施形態では、デバイスは、分子または医薬組成物を
、エアゾール化形態で送達しうる。一部の実施形態では、デバイスは、乾燥粉末吸入器で
ある。
別の態様では、本明細書では、対象に、治療有効量の、本明細書で記載される、任意の
ＴＳＬＰ結合性分子または医薬組成物を投与することにより、それを必要とする対象、例
えば、ヒト患者におけるＴＳＬＰ関連状態を処置する方法が提示される。また、それを必
要とする対象におけるＴＳＬＰ関連状態の処置における使用のための、本明細書で記載さ
れる分子または医薬組成物も提示される。それを必要とする対象におけるＴＳＬＰ関連状
態を処置するための、本明細書で記載されるＴＳＬＰ結合性分子または医薬組成物の使用
もまた含まれる。本開示はまた、それを必要とする対象におけるＴＳＬＰ関連状態の処置
における使用のための、医薬の製造における、本明細書で記載される分子の使用も含む。
ＴＳＬＰ関連炎症性状態は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、アレルギー
性鼻副鼻腔炎、アレルギー性結膜炎、好酸球性食道炎、またはアトピー性皮膚炎のうちの
いずれか１つでありうる。一部の実施形態では、ＴＳＬＰ関連炎症性状態は、喘息である
。一部の実施形態では、ＴＳＬＰ結合性分子を、吸入に適する乾燥粉末製剤として製剤化
する。一部の実施形態では、ＴＳＬＰ結合性分子を、対象に、例えば、エアゾール化形態
で、経口投与または鼻腔内投与する。一部の実施形態では、ＴＳＬＰ結合性分子を、対象
に、乾燥粉末吸入器により投与する。
一部の実施形態では、ＴＳＬＰ関連状態を処置する方法またはＴＳＬＰ結合性分子の使
用は、第２の薬剤を、処置を必要とする対象に投与するステップもさらに含む。第２の薬
剤は、コルチコステロイド、気管支拡張剤、抗ヒスタミン剤、抗ロイコトリエン剤、また
はＰＤＥ−４阻害剤でありうる。
別の態様では、本明細書では、本明細書で記載されるＴＳＬＰ結合性分子を含む乾燥粉
末製剤を作製するための方法が提示される。このような方法は、以下のステップ：（ａ）
本明細書で記載されるＴＳＬＰ結合性分子、トリロイシンまたはロイシン、ガラス形成賦
形剤、および緩衝剤を含む水溶液を用意するステップ；（ｂ）ステップ（ａ）の水溶液を
、約１２０℃〜約２００℃の間（インレット）および５５℃〜約７５℃（アウトレット）
の範囲の温度で噴霧乾燥させて、乾燥粉末粒子を作製するステップ；ならびに（ｃ）乾燥
粉末粒子を回収するステップのうちの１つまたは複数を含みうる。一部の実施形態では、
緩衝剤は、ヒスチジン緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、またはリン酸緩衝液から選
択される。一部の実施形態では、ガラス形成賦形剤は、ヒスチジン、ヒスチジンＨＣｌ、
トレハロース、マンニトール、スクロース、またはクエン酸ナトリウムから選択される。
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細を、付属の図面および下記の記載に明示する
。本発明の、他の特色、目的、および利点は、記載および図面、ならびに特許請求の範囲
から明らかであろう。
図１Ａは、抗ヒトＴＳＬＰ Ｆａｂ１重鎖（配列番号２２）のアミノ酸配列を示す図であり、ＣＤＲに下線を付し（Ｋａｂａｔにより規定される）、抗体−抗原間界面に位置する残基を、＊で表示する。図１Ｂは、抗ヒトＴＳＬＰ Ｆａｂ１軽鎖（配列番号２５）のアミノ酸配列を示す図であり、ＣＤＲに下線を付し（Ｋａｂａｔにより規定される）、抗体−抗原間界面に位置する残基を＊で表示する。 結晶構造解析研究で使用される組換えヒトＴＳＬＰのアミノ酸配列（配列番号３８）を示す図であり、二次構造エレメントを、アミノ酸配列の下方に示す。ボックスは、αヘリックスである、αＡ、αＢ、αＣ、およびαＤを表し、太線は、ループ領域を表す。成熟ヒトＴＳＬＰは、Ｔｙｒ２９から始まる。ここで使用される構築物は、Ｎ末端のヘキサヒスチジンタグ（配列番号４０）（残基１５〜２０）に続き、ＨＲＶ−３Ｃプロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ）認識部位（残基２１〜２８）、およびクローニングから生じる残基１１〜１４を有した。Ａｓｎ６４およびＡｓｎ１１９は、潜在的なＮ結合型グリコシル化部位であり、残基１２７〜１３０は、フリン切断部位を構成する。 ＴＳＬＰ中和の、抗原で二次感作されたオボアルブミン感作マウスにおける肺炎症に対する効果を示す棒グラフである。アラムを加えたオボアルブミン（ＯＶＡ）または生理食塩水で感作されるマウスには、感作の１時間前に、抗マウスＴＳＬＰ抗体またはアイソタイプ対照抗体のいずれかの静脈内投与を施した。全てのマウスを、２１日目にＯＶＡで二次感作し、２４時間後に屠殺した。値は、ＢＡＬ中の総細胞数および区別した上での細胞数（total and differential cell counts）の平均値±ＳＥＭ（標準誤差の平均値）を表す。統計学的解析は、対応のないスチューデントのＴ検定を使用して実施した。アイソタイプで処置された生理食塩水感作マウスと、ＯＶＡ感作マウスとの有意差であって、ｐ＜０．０５における有意差を、（＊）で描示し、ｐ＜０．０１における有意差を（＊＊）で描示する。アイソタイプ抗体で処置されたＯＶＡ感作マウスと、抗ＴＳＬＰ抗体処置されたＯＶＡ感作マウスとの、ｐ＜０．０５における差違を、（＃）で描示する［ＰＭＮ：多形核細胞（好中球）；Ｅｏｓ：好酸球；ＭＯ：単球；Ｌｙｍｐｈ：リンパ球；ＴＣＣ：総細胞数］。 図４Ａ〜４Ｃは、ＴＳＬＰの中和が、抗原で二次感作されたオボアルブミン感作マウスの肺内の、ＩＬ−１３レベル（図４Ａ）、エオタキシン−２レベル（ＣＣＬ２４；図４Ｂ）、ならびに胸腺調節性ケモカインレベルおよび活性化調節性ケモカインレベル（ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１７；図４Ｃ）を著明に抑制することを示す一連の棒グラフである。アラムを加えたＯＶＡ（または生理食塩水）で感作されるマウスには、感作の１時間前に、抗マウスＴＳＬＰ抗体またはアイソタイプ対照抗体の静脈内投与を施した。全てのマウスを、２１日目にＯＶＡで二次感作し、２４時間後に屠殺した。値は、特異的ＥＬＩＳＡにより測定される、ＢＡＬ中のメディエーターの平均値±ＳＥＭレベルを表す。統計学的解析は、対応のないスチューデントのＴ検定を使用して実施した。アイソタイプで処置された生理食塩水感作マウスと、ＯＶＡ感作マウスとの有意差であって、ｐ＜０．０５における有意差を、（＊）で描示し、ｐ＜０．０１における有意差を（＊＊）で描示する。アイソタイプ抗体で処置されたＯＶＡ感作マウスと、抗ＴＳＬＰ抗体処置されたＯＶＡ感作マウスとの、ｐ＜０．０５における差違を、（＃）で描示する。 サルにおける総抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１についての、平均値血清濃度−時間プロファイルを示す折れ線グラフである。 図６Ａおよび６Ｂは、最終回の吸入投与の１時間後（１日当たり１ｋｇ当たり１、１０、２０ｍｇの吸入群）、または６日後（１ｋｇ当たり１ｍｇのＩＶ＋１日当たり１ｋｇ当たり２０ｍｇの吸入群）におけるサルの、ＢＡＬ中（６Ａ）または肺ホモジネート中（６Ｂ）の総抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の平均値濃度を示す棒グラフである。 抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１と複合したヒトＴＳＬＰについての概観を例示する図である。ＴＳＬＰヘリックスを、Ｎ末端から、Ｃ末端へと、ＡからＤと表示する。 抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１により標的とされるＴＳＬＰエピトープを示す図である。図の上部は、非水素原子間の４．０Å以内の距離にある、直接的な分子間接点の数を示し、下部は、複合体形成における、溶媒にアクセス可能な表面の低減を示す。ＴＳＬＰのアミノ酸配列（配列番号４１）を、水平軸上に表示する。 抗体から見たＴＳＬＰエピトープを示す図である。ＴＳＬＰを、リボン型の模式図表示で示す。Ｆａｂ１との直接的な接触（４．０Åの距離カットオフ）に関与する全てのアミノ酸残基を、棒球表示で示す。 図１０Ａおよび１０Ｂは、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の重鎖（配列番号４２）（Ａ）パラトープおよび軽鎖（配列番号４３）（Ｂ）パラトープを示す図である。図の上部は、非水素原子間の直接的な分子間接点（≦４．０Å）の数を示し、下部は、複合体形成における、溶媒にアクセス可能な表面の低減を示す。重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を、水平軸上に表示する。 図１１Ａ〜１１Ｃは、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の作用方式を示す図である。図１１Ａは、ＩＬ−７Ｒαとのマウス細胞外シグナル伝達複合体を黒で示し、ＴＳＬＰＲとのマウス細胞外シグナル伝達複合体をライトグレーで示す略図である。図１１Ｂは、図１１Ａと同じ配向の、ヒトＴＳＬＰ−Ｆａｂ１複合体についての略図である。図１１Ｃは、サイトカインのＣα原子に基づく、２つの複合体の構造的重複を示す図である。マウスシグナル伝達複合体をライトグレーで示し、ヒトＴＳＬＰ−Ｆａｂ１複合体を黒で示す。 賦形剤：タンパク質比が大きな製剤が、タンパク質凝集速度の低減により示される通り、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の物理化学的安定性を改善することを例示する散布図である。
定義
本明細書および特許請求の範囲で使用される、単数形の「１つの（a）」、「１つの（a
n）」、および「その」とは、そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにお
いて、複数の指示対象を含む。例えば、「１つの細胞（a cell）」という用語は、複数の
細胞を、その混合物を含め、含意する。
範囲を含む、全ての数値表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、（
＋）または（−）０．１の増分で変化する概数である。常に明示的に言明されているわけ
ではないが、全ての数値表示には、「約」という用語を前置することを理解されたい。ま
た、常に明示的に言明されているわけではないが、本明細書で記載される試薬は、単に例
示的なものであり、当技術分野では、このような試薬の同等物が公知であることも理解さ
れたい。
本明細書で使用される、「ＴＳＬＰ」（「胸腺間質性リンパ球新生因子」としてもまた
公知である）は、炎症促進性刺激に応答して、非造血細胞により産生されるサイトカイン
を指す。ヒトＴＳＬＰ遺伝子は、染色体位置である５ｑ２２．１へとマッピングされ、Ｔ
ＳＬＰ遺伝子のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋのＮＣ＿０００００５．１０に見出すこと
ができる。代替的スプライシングのために、ヒトには、２つのＴＳＬＰアイソフォームが
存在する。２つのヒトＴＳＬＰアイソフォームのタンパク質配列およびｍＲＮＡ配列を、
表１に列挙する。
長型のＴＳＬＰアイソフォーム１は、気道炎症性疾患の発症と連関する（Headley et a
l., 2009, Journal of immunology 182, 1641-1647；Ying et al., 2005, Journal of im
munology 174, 8183-8190）。本明細書で使用される「ＴＳＬＰ」という用語は、ＴＳＬ
Ｐアイソフォーム１を指す。本明細書で使用されるヒトＴＳＬＰタンパク質はまた、その
全長にわたり、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿１４９０２４．１のアミノ酸配列と、少
なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％
、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％
、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
、９９％、または１００％の配列同一性を有するタンパク質も包含する。ヒトＴＳＬＰの
核酸配列は、その全長にわたり、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０３３０３５．４の核
酸配列と、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７
７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８
７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９
７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。当技術分野では、マウス
、カニクイザル、および他の動物のＴＳＬＰタンパク質の配列も公知である（例えば、表
１を参照されたい）。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン
分子に由来するタンパク質配列またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナル
の場合もあり、モノクローナルの場合もあり、多重鎖の場合もあり、単鎖の場合もあり、
無傷免疫グロブリンの場合もあり、天然の供給源に由来する場合もあり、組換え供給源に
由来する場合もある。自然における「抗体」とは、ジスルフィド結合により相互接続され
た、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と、２つの軽（Ｌ）鎖とを含む、糖タンパク質である。
各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。
重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は
、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと略記する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常
領域は、１つのドメインであるＣＬを含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク
領域（ＦＲ）と称するより保存的な領域を散在させた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称す
る超可変性の領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよび各ＶＬは、アミノ末端
からカルボキシ末端へと、以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲ：ＦＲ
１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４からなる。重鎖および軽鎖
の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫
グロブリンの、宿主組織または免疫系の多様な細胞（例えば、エフェクター細胞）および
古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介しうる。抗体は、モノク
ローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ科動物抗体、またはキメラ抗体でありうる
。抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、お
よびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、
およびＩｇＡ２）、またはサブクラスの抗体でありうる。
本明細書で使用される、抗体の「抗体断片」、「抗原結合性断片」、「その抗原結合性
断片」、「抗原結合性部分」などの用語は、所与の抗原（例えば、ＴＳＬＰ）に特異的に
結合する能力を保持する、インタクト抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結
合性機能は、インタクトな抗体の断片により果たされうる。抗体の「抗原結合性部分」と
いう用語内に包含される結合性断片の例は、Ｆａｂ断片、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、
ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片；ヒンジ領域においてジスルフィ
ド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨ
ドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬドメインお
よびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）
断片（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；ならびに単離相補性決定領域（ＣＤＲ
）を含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬドメインおよびＶＨドメインは
、個別の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して、それらを単一のタンパク質
鎖として作製することを可能とする人工のペプチドリンカーにより付着することができ、
この場合、ＶＬ領域およびＶＨ領域は、対合して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として
公知であり、例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423-426；およびHuston et al.,
1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照されたい）を形成する。このような単
鎖抗体は、抗体の１つまたは複数の「抗原結合性部分」を含む。これらの抗体断片は、当
業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片も、インタクトな抗体と同じ形で有用性
についてスクリーニングされる。抗原結合性部分はまた、単一ドメイン抗体、マキシボデ
ィ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−Ｎ
ＡＲ、およびｂｉｓ−ｓｃＦｖ（例えば、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotech
nology, 23, 9, 1126-1136を参照されたい）へと組み込むこともできる。抗体の抗原結合
性部分は、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチド（フィブロネクチン
ポリペプチドモノボディについて記載する米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照
されたい）に基づく足場へとグラフトすることができる。抗原結合性部分は、相補的な軽
鎖ポリペプチドと併せて抗原結合性領域の対を形成する、タンデムＦｖセグメント（ＶＨ
−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む単鎖分子へと組み込むことができる（Zapata et al
., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062；および米国特許第５，６４１，８７０号明細書
）。
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンへの特異的な結合が可能であるか、また
は分子と他の形で相互作用することが可能な、任意のタンパク質決定基を含む。エピトー
プ決定基は一般に、アミノ酸または炭水化物もしくは糖側鎖など、化学的に活性な表面分
子群からなり、特異的な三次元構造特徴のほか、特異的な電荷特徴も有しうる。エピトー
プは、「直鎖状」エピトープの場合もあり、「コンフォメーショナル」エピトープの場合
もある。コンフォメーショナルエピトープと、直鎖状エピトープとは、前者への結合は、
変性溶媒の存在下で失われるが、後者は失われないという点で識別される。
「パラトープ」という用語の定義は、「エピトープ」についての上記の定義から、視点
を逆転することにより導出される。したがって、本明細書で使用される「パラトープ」と
いう用語は、抗原が特異的に結合する、抗体上または抗体断片上の領野または領域、すな
わち、抗体または抗体断片が、抗原と物理的に接触する、抗体上または抗体断片上の領野
または領域を指す。
本明細書で、抗体、例えば、Ｆａｂ断片と、その抗原との間の複合体についての空間座
標により規定される、Ｘ線により導出される結晶構造の文脈では、パラトープという用語
は、そうでないことが指定されるか、または文脈により反対のことが指示されない限りに
おいて、標的抗原内の重原子から、指定の距離内、例えば、４オングストロームの距離内
に、重原子（すなわち、非水素原子）を有することを特徴とする抗体残基として、具体的
に規定される。
本明細書で使用される「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗体または
抗原結合性断片のアミノ酸残基であって、抗原への結合の一因となるアミノ酸残基を指す
。
本明細書で使用される「一価抗体」という用語は、標的分子上の単一のエピトープに結
合する抗体を指す。
本明細書で使用される「二価抗体」という用語は、少なくとも２つの同一な標的分子上
の、２つのエピトープに結合する抗体を指す。二価抗体はまた、標的分子を互いと架橋す
ることも可能である。「二価抗体」はまた、少なくとも２つの同一な標的分子上の、２つ
の異なるエピトープに結合する抗体も指す。
「多価抗体」という用語は、価数が１を超える、単一の結合性分子を指すが、この場合
、「価数」とは、抗体構築物の分子１つ当たりに存在する抗原結合性部分の数として記載
される。したがって、単一の結合性分子は、標的分子上の、１つを超える結合性部位に結
合しうる。多価抗体の例は、二価抗体、三価抗体、四価抗体、五価抗体などのほか、二特
異性抗体およびバイパラトープ抗体を含むがこれらに限定されない。例えば、ＴＳＬＰで
あれば、ＴＳＬＰバイパラトープ抗体などの多価抗体は、それぞれ、ＴＳＬＰの２つの異
なるドメインを認識する結合性部分を有するであろう。
「多価抗体」という用語はまた、２つの別個の標的分子に対する、１つを超える抗原結
合性部分を有する、単一の結合性分子も指す。例えば、ＴＳＬＰと、ＴＳＬＰではない第
２の標的分子とに結合する抗体である。一実施形態では、多価抗体とは、４つのエピトー
プ結合性ドメインを有する四価抗体である。四価分子は、その標的分子上の各結合性部位
に対して、二特異性分子および二価分子でありうる。
本明細書で使用される「バイパラトープ抗体」という用語は、単一の標的分子上の、２
つの異なるエピトープに結合する抗体を指す。用語はまた、少なくとも２つの標的分子の
、２つのドメインに結合する抗体、例えば、四価バイパラトープ抗体も含む。
本明細書で使用される「二特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる標的上
の、２つ以上の異なるエピトープに結合する抗体を指す。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」と
いう語句は、実質的に同一なアミノ酸配列を有するか、または同じ遺伝子供給源に由来す
る、抗体、二特異性抗体などを含むポリペプチドを指す。この用語はまた、単一の分子組
成による抗体分子の調製物も含む。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対
する単一の結合特異性およびアフィニティーを提示する。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という語句は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領
域のいずれもが、ヒト由来の配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。さらに、抗体
が定常領域を含有する場合、定常領域もまた、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細
胞系列配列もしくはヒト生殖細胞系列配列の突然変異させたバージョン、または、例えば
、Knappik et al.（2000, J Mol Biol 296, 57-86）において記載されている、ヒトフレ
ームワーク配列解析に由来する、コンセンサスのフレームワーク配列を含有する抗体に由
来する。免疫グロブリン可変ドメイン、例えば、ＣＤＲの構造および場所は、周知の番号
付けスキーム、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム
、またはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａによる組合せ番号付けスキーム（例えば、Sequ
ences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human
Services (1991), eds. Kabat et al；Al Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio. 273:
927 948)；Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,
5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Servi
ces；Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917；Chothia et al., (1989) Na
ture 342:877-883；およびAl-Lazikani et al., (1997) J. Mal. Biol. 273:927-948を参
照されたい）を使用して規定することができる。
本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発により導入され
た突然変異、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異により導入された突然変異、
または安定性もしくは製造を促進する保存的置換により導入された突然変異）を含みうる
。しかし、本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなど、別の哺乳動物
の種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列を、ヒトフレームワーク配列へとグラフトした
抗体を含むことを意図しない。
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という語句は、ヒト免疫グロブリン遺伝子に
ついてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）
またはこれにより調製されるハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現させる
ように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、組
換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、およびヒト免疫グロ
ブリン遺伝子配列の全部または一部の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う、他の
任意の手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される抗体な
ど、組換え手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される全
てのヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領
域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしなが
ら、ある特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変
異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を使用する場合は
、ｉｎ ｖｉｖｏの体細胞突然変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体
のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列およびＶＬ配
列に由来し、これらに関連するが、ｉｎ ｖｉｖｏのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリ
ー内で天然には存在しない可能性がある配列である。
本明細書で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、抗体の定常ドメインのうちの、ＣＨ
３、ＣＨ２、およびヒンジ領域のうちの少なくとも一部を含むポリペプチドを指す。任意
選択で、Ｆｃ領域は、一部の抗体クラスに存在するＣＨ４ドメインを含みうる。Ｆｃ領域
は、抗体の定常ドメインのうちのヒンジ領域全体を含みうる。一実施形態では、本発明は
、抗体のＦｃ領域およびＣＨ１領域を含む。一実施形態では、本発明は、抗体のＦｃ領域
のＣＨ３領域を含む。別の実施形態では、本発明は、抗体の定常ドメインに由来する、Ｆ
ｃ領域、ＣＨ１領域、およびＣカッパ／ラムダ領域を含む。一実施形態では、本発明の結
合性分子は、定常領域、例えば、重鎖定常領域を含む。一実施形態では、このような定常
領域を、野生型の定常領域と比較して修飾する。すなわち、本明細書で開示される、本発
明のポリペプチドは、３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）および／
または軽鎖定常領域ドメイン（ＣＬ）のうちの１つまたは複数に対する改変または修飾を
含みうる。修飾例は、１つまたは複数のドメイン内の、１つまたは複数のアミノ酸の付加
、欠失、または置換を含む。このような変化は、エフェクター機能、半減期などを最適化
するように組み入れることができる。
本明細書で使用される「アフィニティー」という用語は、単一の抗原性部位における抗
体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領
域は、多数の部位において、弱い非共有結合的力を介して抗原と相互作用し、相互作用が
大きいほど、アフィニティーは強くなる。本明細書で使用される、ＩｇＧ抗体またはその
断片（例えば、Ｆａｂ断片）に対する「高アフィニティー」という用語は、標的抗原に対
するノックダウンが、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、または１０−１０Ｍ、または１
０−１１Ｍ以下、または１０−１２Ｍ以下、または１０−１３Ｍ以下である抗体を指す。
しかし、他の抗体アイソタイプに対する高アフィニティー結合は、変化しうる。例えば、
ＩｇＭアイソタイプに対する高アフィニティー結合は、ノックダウンが、１０−７Ｍ以下
、または１０−８Ｍ以下である抗体を指す。
本明細書で使用される「アビディティー」という用語は、抗体−抗原複合体の、全体的
な安定性または強度についての有益な尺度を指す。アビディティーは、３つ主要な因子：
抗体エピトープのアフィニティー；抗原および抗体の両方の価数；ならびに相互作用部分
の構造的配置により制御される。最終的に、これらの因子は、抗体の特異性、すなわち、
特定の抗体が、正確な抗原エピトープに結合する可能性を規定する。
本明細書で使用される「結合特異性」という用語は、１つの抗原決定基と反応するが、
異なる抗原決定基とは反応しない、抗体の個別の結合性部位の能力を指す。抗体の結合性
部位は、分子のＦａｂ部分内に位置し、重鎖および軽鎖の超可変領域から構築される。抗
体の結合アフィニティーは、単一の抗原決定基と、抗体上の単一の結合性部位との反応の
強度である。結合特異性とは、抗原決定基と、抗体の結合性部位との間に作用する引力お
よび斥力の合計である。
「〜を処置する」および「処置」という用語は、治療的処置および予防的処置または防
止的措置の両方を指し、この場合、目的は、所望されない生理学的変化または障害を防止
するかまたは緩徐化させることである。本発明の目的では、有益なまたは所望の臨床結果
は、検出可能なものであれ、検出不可能なものであれ、症状の緩和、疾患の程度の減殺、
疾患状態の安定化（すなわち、非増悪）、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善
または抑制、および寛解（部分寛解であれ、完全寛解であれ）を含むがこれらに限定され
ない。「処置」はまた、処置を施されない場合に予測される生存と比較した生存の延長も
意味しうる。
「対象」という用語は、本発明の方法に従う処置が施される、ヒトまたは非ヒト動物を
含む。獣医科適用および非獣医科適用が想定される。用語は、哺乳動物、例えば、ヒト、
他の霊長動物、ブタ、マウスおよびラットなどの齧歯動物、ウサギ、モルモット、ハムス
ター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、およびヤギを含むがこれらに限定されない。典
型的な対象は、ヒト、農場動物、ならびにネコおよびイヌなどの愛玩動物を含む。
「有効量」とは、有益な結果または所望の結果を及ぼすのに十分な量を指す。例えば、
治療量とは、所望の治療効果を達成する量である。この量は、疾患または疾患症状の発症
を防止するのに必要な量である、予防有効量と同じ場合もあり、異なる場合もある。有効
量は、１回もしくは複数回の投与、適用、または１つもしくは複数の投与量により投与す
ることができる。治療用化合物の「治療有効量」（すなわち、有効な投与量）は、選択さ
れる治療用化合物に依存する。組成物は、例えば、毎日１回または複数回から、毎週１回
または複数回、毎月１回または複数回、毎年１回または複数回にわたり投与することがで
きる。当業者は、疾患または障害の重症度、かつての処置、対象の全般的な健康および／
または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の因子
が、対象を効果的に処置するのに要求される投与量およびタイミングに影響を及ぼしうる
ことを察知するであろう。さらに、治療有効量の、本明細書で記載される治療用化合物に
よる対象の処置は、単回の処置を含む場合もあり、一連の処置を含む場合もある。
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖形態または二本鎖形態のい
ずれかの、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、およびこれらのポリ
マーを指す。具体的に限定されない限りにおいて、用語は、天然ヌクレオチドの公知の類
似体であって、基準核酸と同様の結合特性を有し、自然におけるヌクレオチドと同様の形
で代謝される類似体を含有する核酸を包含する。そうでないことが指し示されない限りに
おいて、特定の核酸配列はまた暗黙に、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コ
ドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補性配列のほか、明示的に指し
示される配列も包含する。具体的に、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（
または全ての）コドンの第３の位置を、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で
置換した配列を作り出すことにより、達成することができる（Batzer et al., Nucleic A
cid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；お
よびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的に使用
され、ペプチド結合により共有結合的に連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を
指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず
、タンパク質またはペプチドの配列を含みうるアミノ酸の最大数には、限定を設けない。
ポリペプチドは、ペプチド結合により互いと接合された、２つ以上のアミノ酸を含む、任
意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用される用語は、当技術分野ではま
た一般に、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも称する短鎖、なら
びに、当技術分野では一般に、タンパク質と称し、多くの種類が存在する長鎖の両方を指
す。「ポリペプチド」は、例えば、中でも、生物学的に活性の断片、実質的に相同なポリ
ペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポ
リペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、
組換えペプチド、またはこれらの組合せを含む。
「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体または抗体断片の結合
特徴にそれほど大きな影響を及ぼしたりこれを改変したりしないアミノ酸修飾を指す。こ
のような保存的修飾は、アミノ酸の置換、付加、および欠失を含む。修飾は、部位指向突
然変異誘発およびＰＣＲを媒介する突然変異誘発など、当技術分野で公知の標準的な技法
により、本発明の抗体または抗体断片へと導入することができる。保存的アミノ酸置換と
は、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえたアミノ酸置換である
。当技術分野では、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されている。こ
れらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側
鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖（例えば、グリシン、ア
スパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン
）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェ
ニルアラニン、メチオニン）、ベータ−分枝型側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソ
ロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン
、ヒスチジン）を伴うアミノ酸を含む。したがって、本発明の抗体または抗体断片など、
分子内の１つまたは複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸
残基で置きかえることができ、改変された分子は、本明細書で記載される機能アッセイを
使用して調べることができる。
「相同な」または「同一性」という用語は、２つのポリマー分子の間、例えば、２つの
ＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子など、２つの核酸分子の間、または２つのポリペプ
チド分子の間の、サブユニットの配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるあるサブ
ユニット位置を同じ単量体サブユニットが占める場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々
における位置をアデニンが占める場合、それらは、その位置において相同または同一であ
る。２つの配列の間の相同性とは、マッチする位置または相同な位置の数の直接的な関数
であり；例えば、２つの配列内の位置のうちの半分（例えば、１０サブユニットの長さの
ポリマー内の５つの位置）が相同である場合、２つの配列は、５０％相同であり；９０％
の位置（例えば、１０のうち９つ）がマッチするかまたは相同である場合、２つの配列は
、９０％相同である。「配列同一性」の百分率は、２つの最適に配列決定された配列を、
比較域にわたり比較することにより決定することができるが、この場合、比較域内のアミ
ノ酸配列の断片は、２つの配列の最適のアライメントのための基準配列（付加または欠失
を含まない）と比較して、付加または欠失（例えば、ギャップまたはオーバーハング）を
含みうる。百分率は、両方の配列内で同一なアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して、
マッチした位置の数を得、比較域内で、マッチした位置の数を、位置の総数で除し、結果
に１００を乗じて、配列同一性の百分率を得ることにより計算することができる。出力は
、対象配列の、クエリー配列との同一性パーセントである。
「単離された」という用語は、天然状態から改変または取り出されていることを意味す
る。例えば、生存する動物において天然で存在する核酸またはペプチドは、「単離」され
ていないが、その天然状態の材料から、部分的または完全に分離された、同じ核酸または
ペプチドは、「単離」されている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製さ
れた形態で存在する場合もあり、例えば、宿主細胞など、非天然環境内に存在する場合も
ある。単離抗体は、異なる抗原特異性を有する、他の抗体を実質的に含まない（例えば、
ＴＳＬＰに特異的に結合する単離抗体は、ＴＳＬＰ以外の抗原に特異的に結合する抗体を
実質的に含まない）。しかし、標的分子に特異的に結合する単離抗体は、他の種に由来す
同じ抗原との交差反応性を有する、例えば、ヒトＴＳＬＰに特異的に結合する単離抗体は
、他の種に由来するＴＳＬＰ分子に結合しうる。さらに、単離抗体は、他の細胞の材料お
よび／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
一部の実施形態では、本出願の乾燥粉末製剤は、シェル形成賦形剤と、ＡＰＩ、ガラス
形成賦形剤、および緩衝剤を含むコアとを含むコア−シェル粒子であって、本明細書では
また、場合によって、プラットフォーム製剤またはシェルコアプラットフォーム製剤とも
称する、コア−シェル粒子を含む。
本明細書で使用される「有効成分」、「治療有効成分」、「活性薬剤」、「薬物」、ま
たは「原薬」という用語は、医薬有効成分（ＡＰＩ）としてもまた公知である、医薬品の
有効成分を意味する。
本明細書で使用される「質量中央径」または「ＭＭＤ」または「ｘ５０」という用語は
、複数の粒子であって、典型的には、多分散粒子集団内の粒子、すなわち、ある範囲の粒
子サイズからなる粒子の中央径を意味する。本明細書で報告されるＭＭＤ値は、文脈によ
りそうでないことが指し示されない限りにおいて、レーザー回折（Ｓｙｍｐａｔｅｃ Ｈ
ｅｌｏｓ、Ｃｌａｕｓｔｈａｌ−Ｚｅｌｌｅｒｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により決定さ
れる。これに対し、ｄｇは、単一の粒子についての幾何学径を表す。
本明細書で使用される「タップ密度」またはρｔａｐｐｅｄという用語は、例えば、ww
w.usp.org/sites/default/files/usp_pdf/EN/USPNF/revisions/m99375-bulk_density_and
_tapped_density_of_powders.pdfにおいて記載されている、方法Ｉに従い測定される粒子
密度を指す。タップ密度は、測定値が、実際の粒子密度より約２０％小さい場合に、粒子
密度の最も緊密な近似を表す。
本明細書で使用される「凹凸がある」という用語は、多数のひだまたはしわを有するこ
と、すなわち、隆線またはひだが寄っていることを意味する。
本明細書で使用される「凹凸度」という用語は、加工粒子の表面粗さの尺度である。本
発明の目的では、凹凸度を、ＢＥＴ測定から得られる比表面積、ヘリウム比重瓶法から得
られる真の密度、およびレーザー回折（Ｓｙｍｐａｔｅｃ）により得られる表面積対体積
比から計算する、すなわち：
凹凸度＝（ＳＳＡ×ρｔｒｕｅ）／Ｓｖ
［式中、Ｓｖ＝６／Ｄ３２［式中、Ｄ３２は、単位表面積に基づく平均直径である］］
。表面粗さの増大は、粒子間凝集力を低減し、エアゾールの、肺への標的化を改善するこ
とが予測される。肺への標的化の改善は、患者間のばらつき、ならびに中咽頭および全身
循環における薬物レベルを低減することが予測される。１つまたは複数の実施形態では、
凹凸度Ｓｖは、３〜２０、例えば、５〜１０である。
本明細書で使用される「一次粒子の空気動力学中央径」またはＤａという用語は、レー
ザー回折を介して決定される、粒子の一次幾何学サイズ（ｘ５０）と、それらのタップ密
度とから計算される直径、すなわち：Ｄａ＝ｘ５０（ρｔａｐｐｅｄ）１／２を指す。
本明細書で使用される「送達用量」または「ＤＤ」という用語は、粉末ユニットからの
作動イベントまたは分散イベントの後における、吸入器デバイスからの乾燥粉末の送達に
ついての数値表示を指す。ＤＤは、吸入デバイスにより送達される用量の、名目用量また
は計量用量に対する比として規定する。ＤＤは、実験で決定されるパラメータであり、患
者への投与を模倣する、ｉｎ ｖｉｔｒｏデバイス装備を使用して決定することができる
。
本明細書で使用される「空気動力学質量中央径」または「ＭＭＡＤ」という用語は、典
型的には、多分散集団内の、複数の粒子の空気動力学的サイズの中央値を指す。「空気動
力学径」とは一般に、空気中で、粉末として、同じ沈降速度を有する、単位密度球体の直
径であり、したがって、エアゾール化粉末または他の分散粒子もしくは粒子製剤を、その
沈降挙動との関係で特徴付けるのに有用な方途である。本明細書では、空気動力学粒子サ
イズ分布（ＡＰＳＤ）およびＭＭＡＤは、ＮＥＸＴ ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＩＭＰＡＣ
ＴＯＲ（商標）を使用して、カスケード衝突により決定する。一般に、粒子が空気動力学
的に大きすぎると、肺の深部に到達する粒子は少なくなるはずである。粒子が小さすぎる
と、粒子のうちの大きなパーセントは、吐出されうる。これに対し、ｄａとは、単一の粒
子についての空気動力学径を表す。
本明細書で使用される「総肺用量」（ＴＬＤ）という用語は、理想化されたアルベルタ
口腔咽頭モデルにおいて、圧力降下を４ｋＰａで、乾燥粉末吸入器からの粉末の吸入後に
沈着しない有効成分の百分率を指す。データは、名目用量または送達用量の百分率として
表すことができる。ＡＩＴとは、平均的な成人対象について、上気道の理想化形を表す。
そうでないことが言明されない限りにおいて、ＴＬＤは、アルベルタ理想化咽頭モデルで
測定する。ＡＩＴについての情報および実験装備についての詳細な記載は、www.copleysc
ientific.comにおいて見出すことができる。
本明細書で使用される「慣性パラメータ」という用語は、上気道内の慣性衝突を特徴付
けるパラメータを指す。パラメータは、ストークスの法則に由来し、

［式中、ｄａは、空気動力学径であり、Ｑは、体積流量である］
と等しい。
本明細書で使用される「固体含量」という用語は、噴霧乾燥ささる溶液中または分散液
中に溶解または分散させた、有効成分および賦形剤の濃度を指す。
本明細書で使用される「ＡＬＲ」という用語は、空気対液体比を規定する工程パラメー
タであって、アトマイザー内で用いられる工程パラメータである。ＡＬＲ値が小さくなる
ほど、アトマイズされた液滴は大きくなることが典型的である。
本明細書で使用される「粒子集団密度」（ＰＰＤ）という用語は、固体含量と、アトマ
イザー内液体流量との積を、乾燥器内総ガス流量で除した商から計算される無次元数であ
る。ＰＰＤは、一次幾何学粒子サイズと相関することが観察されている。
ＴＳＬＰ結合性分子
本明細書では、ＴＳＬＰに特異的に結合し、ＴＳＬＰ活性を阻害する分子、例えば、Ｆ
ａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、およびｄＡｂ断片、ｓｃＦｖ、単一のド
メイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ
、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびｂｉｓ−ＳＣＦｖを含む、抗体または抗体断片が提
示される。これらの分子は、喘息および慢性閉塞性肺疾患を含む、ＴＳＬＰ関連炎症性状
態、を処置するために有用である。ＴＳＬＰは、Ｔｈ２エフェクターサイトカインの上流
における、鍵となるノーダルサイトカインであるので、ＴＳＬＰの阻害は、下流における
複数のＴｈ２エフェクター（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３）を同時に遮断す
ることが可能であり、また、Ｔｈ２非介在性経路（例えば、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−γ）に
も影響を及ぼしうる。
ＴＳＬＰ抗体およびＴＳＬＰ結合性抗体断片
一部の実施形態では、本発明は、ヒトＴＳＬＰに特異的に結合する抗体および抗体断片
を提供する。ＴＳＬＰ抗体および抗体断片は、実施例を含む、本明細書で記載される通り
に作り出された、ヒトモノクローナル抗体および抗体断片ならびにヒト化モノクローナル
抗体および抗体断片を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本発明は、１
００ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）、例えば、９０ｐＭ未満、８０ｐＭ未満、７０ｐＭ未満
、６０ｐＭ未満、５０ｐＭ未満、４０ｐＭ未満、３０ｐＭ未満、２０ｐＭ未満、１０ｐＭ
未満のＫＤで、ヒトＴＳＬＰに結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する
。一部の実施形態では、本明細書で提示される単離抗体または抗原結合性断片は、１０ｐ
Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で、ヒトＴＳＬＰに結合する。
一部の実施形態では、本明細書で提示されるＴＳＬＰ結合性分子は、重鎖ＣＤＲ１、重
鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３
を含む。一部の実施形態では、本明細書で提示されるＴＳＬＰ結合性分子は、ＣＤＲ１、
ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域とを含む。一部の実施形態では、本明細書で提示されるＴＳＬＰ結合
性分子は、全長重鎖配列および全長軽鎖配列を含む。一部の実施形態では、分子は、ＴＳ
ＬＰ結合性Ｆａｂである。
表２は、それらの全てが、ヒトＴＳＬＰに、高アフィニティーで結合する、例示的なＴ
ＳＬＰ結合性抗体およびＦａｂの配列を列挙する。例えば、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、６
ｐＭの解離定数（ＫＤ）で、組換えヒトＴＳＬＰに結合する。一部の実施形態では、抗Ｔ
ＳＬＰ Ｆａｂ１は、それぞれ、５．０±２．０ｐＭおよび１．４±０．６ｐＭのＫＤ値
で、ヒトおよびカニクイザルのＴＳＬＰタンパク質に結合する。
一部の実施形態では、抗体は、表２に列挙されるＶＨ ＣＤＲのうちのいずれか１つの
アミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む。特に、本発明は、ＴＳＬＰタンパク質に特異
的に結合する抗体であって、表２に列挙されるＶＨ ＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸
配列を有する、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＶＨ ＣＤＲを含む（また
は代替的に、これらからなる）抗体を提供する。本発明はまた、ＴＳＬＰタンパク質に特
異的に結合する抗体であって、表２に列挙されるＶＬ ＣＤＲのうちのいずれか１つのア
ミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に、本発明は、ＴＳＬＰタン
パク質に特異的に結合する抗体であって、表２に列挙されるＶＬ ＣＤＲのうちのいずれ
かのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＶＬ ＣＤＲ
を含む（または代替的に、これらからなる）抗体を提供する。
本発明はまた、表２に列挙されるＶＨアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらか
らなり）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）内の約１つ、２つ、３つ
、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１
５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個以下のアミノ酸を、突然変異させ
た（この場合、突然変異とは、多様な非限定的な例として述べると、付加、置換、または
欠失である）、抗体およびその抗原結合性断片も提供する。
本発明はまた、ＴＳＬＰタンパク質に特異的に結合する抗体およびその抗原結合性断片
であって、表２に列挙されるＶＬアミノ酸配列を含み（または代替的に、これらからなり
）、フレームワーク配列（例えば、ＣＤＲではない配列）内の約１つ、２つ、３つ、４つ
、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、
１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個以下のアミノ酸を、突然変異させた（こ
の場合、突然変異とは、多様な非限定的な例として述べると、付加、置換、または欠失で
ある）、抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
本発明の他の抗体およびそれらの抗原結合性断片は、突然変異させているが、ＣＤＲ領
域内で、表２に記載される配列内で描示されたＣＤＲ領域と、少なくとも６０、７０、８
０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの
同一性を有し、ＴＳＬＰに結合することが可能なアミノ酸を含む。一態様では、本発明の
他の抗体およびそれらの抗原結合性断片は、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つ、ま
たは５つ以下のアミノ酸を、表２に記載される配列に描示されるＣＤＲ領域と比較して突
然変異させた、突然変異体のアミノ酸を含む。
本発明はまた、ＴＳＬＰタンパク質に特異的に結合する抗体およびそれらの抗原結合性
断片のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖、および全長軽鎖をコードする核酸配列も提供する。このよ
うな核酸配列は、哺乳動物細胞内の発現について最適化することができる。
他のＴＳＬＰ抗体およびそれらの抗原結合性断片は、アミノ酸またはアミノ酸をコード
する核酸を突然変異させているが、表２に記載される配列との、少なくとも６０、７０、
８０、９０、または９５パーセントの同一性を有する抗体およびそれらの抗原結合性断片
を含む。一実施形態では、抗体およびそれらの抗原結合性断片は、実質的に同じ治療的活
性を保持しながら、可変領域内の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ酸を
、表２に記載される配列に描示される可変領域と比較して突然変異させた、突然変異体の
アミノ酸配列を含む。
本明細書で開示される抗体の各々は、ＴＳＬＰに結合しうるので、ＶＨ配列、ＶＬ配列
、全長軽鎖配列、および全長重鎖配列（アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列）を、「混合し、マッチさせ」て、本発明の他のＴＳＬＰ結合性抗体およ
びそれらの抗原結合性断片を創出することができる。このような「混合し、マッチさせた
」ＴＳＬＰ結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよび
実施例節で記載される他のアッセイ）を使用して調べることができる。これらの鎖を混合
し、マッチさせる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＨ配列を、構造的に類似する
ＶＨ配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全
長重鎖配列を、構造的に類似する全長重鎖配列で置きかえるものとする。同様に、特定の
ＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列で置きかえるものとす
る。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長軽鎖配列を、構造的に類似す
る全長軽鎖配列で置きかえるものとする。
別の態様では、本発明は、表２に記載される、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重
鎖ＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３、またはこれら
の組合せを含むＴＳＬＰ結合性抗体を提供する。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Ka
bat et al. 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition,
U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）を使
用して、またはＣｈｏｔｈｉａシステム（Chothia et al. 1987 J. Mol. Biol. 196: 901
-917；およびAl-Lazikani et al. 1997 J. Mol. Biol. 273: 927-948）を使用して画定さ
れる。代替的に、ＣＤＲ領域を画定するための他の方法も使用することができる。例えば
、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲ定義を、組み合わせることができる。
これらの抗体の各々は、ＴＳＬＰに結合することが可能であり、抗原結合特異性は主に
、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域によりもたらされることを踏まえれ
ば、各抗体は、本発明の他のＴＳＬＰ結合性分子を創出するのに、ＶＨ ＣＤＲ１配列、
ＶＨ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ
ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列を、「混合し、マッチさせる」ことができる（
すなわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを、混合し、マッチさせることができる。但し、
ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、Ｖ
Ｌ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含有しなければならない）。このような「混合し
、マッチさせた」ＴＳＬＰ結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイおよび実施例
で記載される結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して調べることができる。ＶＨ
ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１配列、
ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえ
るものとする。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＬ配
列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類
似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする。当業者には、新規のＶＨ配列およびＶＬ配列
を、１つまたは複数のＶＨ ＣＤＲ領域配列および／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を、本
発明のモノクローナル抗体のための、本明細書で示されるＣＤＲ配列に由来する、構造的
に類似する配列で突然変異させることにより創出しうることがたやすく明らかであろう。
したがって、本発明は、配列番号１、４、または５のうちのいずれかから選択されるア
ミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）；配列番号２または６のうちの
いずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）；配
列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）；配列番号１１ま
たは１４のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１（
ＬＣＤＲ１）；配列番号１２または１５のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を
含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）；および配列番号１３または１６のうちのい
ずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含み
、ＴＳＬＰに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提
供する。
一部の実施形態では、ＴＳＬＰに特異的に結合する抗体または抗体断片は、表２に記載
される抗体または抗体断片である。
一部の実施形態では、本発明は、ヒトＴＳＬＰに結合し、それぞれ、配列番号４、２、
および３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、それぞれ、配
列番号１１、１２、および１３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３
配列とを含む、単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ヒトＴＳＬＰに結合し、それぞれ、配列番号５、６、
および３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、それぞれ、配
列番号１４、１５、および１６の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３
配列とを含む、単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ヒトＴＳＬＰに結合し、それぞれ、配列番号１、２、
および３の、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、およびＨＣＤＲ３配列と、それぞれ、配
列番号１１、１２、および１３の、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３
配列とを含む、単離抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ヒトＴＳＬＰに結合し、配列番号７のアミノ酸配列を
含むＶＨと、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む、単離抗体またはその抗原
結合性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ヒトＴＳＬＰに結合し、配列番号２２のアミノ酸配列
を含む重鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、単離抗体またはその抗
原結合性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、ヒトＴＳＬＰに結合し、配列番号９のアミノ酸配列を
含む重鎖と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、単離抗体またはその抗原
結合性断片を提供する。
抗体の可変領域または全長鎖が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子を使用する
系から得られる場合、本明細書で使用されるヒト抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産
物」であるかまたはこれ「に由来する」、重鎖もしくは軽鎖可変領域または全長重鎖もし
くは軽鎖を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニ
ックマウスを、対象の抗原で免疫化するか、または対象の抗原を伴うファージ上で提示さ
れるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖
細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」ヒト抗体は
、ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し
、配列がヒト抗体の配列と最も近似する（すなわち、同一性％が最大である）ヒト生殖細
胞系列の免疫グロブリン配列を選択することにより、それ自体として同定することができ
る。特定のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはこれ「に由
来する」ヒト抗体は、例えば、自然発生の体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意
図的な導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較したアミノ酸の差異を含有しうる。しか
し、ＶＨフレームワーク領域またはＶＬフレームワーク領域では、選択されたヒト抗体は
、アミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ
酸配列と少なくとも９０％の同一であり、ヒト抗体を、他の種の生殖細胞系列免疫グロブ
リンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較した場合に、ヒトとして同
定するアミノ酸残基を含有することが典型的である。ある種の場合には、ヒト抗体は、ア
ミノ酸配列が、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と
、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％、なおまたは、
少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。組換えヒト抗体は、
ＶＨフレームワーク領域内またはＶＬフレームワーク領域内のヒト生殖細胞系列の免疫グ
ロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、１０アミノ酸以下の差異を提示す
ることが典型的である。ある種の場合には、ヒト抗体は、生殖細胞系列の免疫グロブリン
遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、５アミノ酸以下、なおまたは、４、３、２
、または１アミノ酸以下の差異を提示しうる。
相同抗体
さらに別の実施形態では、本発明は、表２に記載される配列と相同なアミノ酸配列を含
む、抗体またはその抗原結合性断片を提供し、前記抗体は、ＴＳＬＰに結合し、表２に記
載される抗体の、所望の機能的な特性を保持する。
例えば、本発明は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨが
、配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９
０％、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含み；ＶＬが、配列番号１７からな
る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なく
とも９５％同一なアミノ酸配列を含み；抗体が、ＴＳＬＰタンパク質に特異的に結合し、
ＴＳＬＰを阻害する、単離モノクローナル抗体（またはその抗原結合性断片）を提供する
。
一実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／またはＶＬアミノ酸配列は、表２に示され
る配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％
、９８％、または９９％同一でありうる。一実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／ま
たはＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４、または５カ所以下のアミノ酸位置におけるア
ミノ酸置換を除き同一でありうる。表２に記載されている抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域
と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨ領域およびＶＬ領域を有する抗
体は、配列番号８もしくは２１、または配列番号１８もしくは２４のそれぞれをコードす
る核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異
誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、
機能の保持について調べることにより得ることができる。
一実施形態では、全長重鎖アミノ酸配列および／または全長軽鎖アミノ酸配列は、表２
に示される配列と、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％
、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。配列番号９の全長重鎖、および配列番
号１９の全長軽鎖と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有する全長重鎖および全
長軽鎖を有する抗体は、このようなポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異誘発（
例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載
される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べるこ
とにより得ることができる。
一実施形態では、全長重鎖ヌクレオチド配列および／または全長軽鎖ヌクレオチド配列
は、表２に示される配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、
９８％、または９９％同一でありうる。
一実施形態では、重鎖ヌクレオチド配列および／または軽鎖ヌクレオチド配列の可変領
域は、表２に明示された配列と、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９
７％、９８％、または９９％同一でありうる。
本明細書で使用される、２つの配列の間の同一性パーセントとは、２つの配列の最適な
アライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮
する配列により共有される、同一な位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一な位置の
数／位置の総数×１００）である。２つの配列の間の配列の比較および同一性パーセント
の決定は、下記の非限定的な例で記載されている、数学的アルゴリズムを使用して達成す
ることができる。
加えて、または代替的に、本発明のタンパク質配列は、公表されたデータベースに照ら
して検索を実施する、例えば、関連の配列を同定するための「クエリー配列」としてさら
に使用することもできる。例えば、このような検索は、Altschul et al., 1990 J. Mol.
Biol. 215:403-10によるＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施する
ことができる。
保存的修飾を伴う抗体
一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２
配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および
ＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを有し、これらのＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数
は、本明細書で記載される抗体またはその保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を
有し、抗体は、本発明のＴＳＬＰ結合性抗体およびそれらの抗原結合性断片の、所望の機
能的特性を保持する。したがって、本発明は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤ
Ｒ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含
む軽鎖可変領域とからなり、配列番号１、４、もしくは５、またはその保存的変異体のう
ちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号２
もしくは６、またはその保存的変異体のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含
む、重鎖可変領域のＣＤＲ２；配列番号３、またはその保存的変異体のアミノ酸配列を含
む、重鎖可変領域のＣＤＲ３；配列番号１１もしくは１４、またはその保存的変異体のう
ちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ１；配列番号１
２もしくは１５、またはその保存的変異体のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列
を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および配列番号１３もしくは１６、またはその保存的
変異体のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域のＣＤＲ３；
抗体またはその抗原結合性断片が、ＴＳＬＰタンパク質に特異的に結合し、ＴＳＬＰを阻
害する、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
一部の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、重鎖可変領域および
軽鎖可変領域を有し、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、本明細書で記載される抗体ま
たはその保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のＴＳＬＰ
結合性抗体およびそれらの抗原結合性断片の、所望の機能的特性を保持する。したがって
、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域からなる、単離モノクローナル抗体または
その抗原結合性断片であって、重鎖可変領域が、配列番号７のアミノ酸配列またはその保
存的変異体を含み；軽鎖可変領域が、配列番号１７のアミノ酸配列またはその保存的変異
体を含み；ＴＳＬＰタンパク質に特異的に結合し、ＴＳＬＰを阻害する、抗体またはその
抗原結合性断片を提供する。
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表２に列挙されているＴＳＬＰ結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体
を提供する。したがって、ＴＳＬＰ結合アッセイにおいて、本発明の他の抗体およびそれ
らの抗原結合性断片と交差競合する（例えば、本発明の他の抗体およびそれらの抗原結合
性断片の結合を、統計学的に有意な形で競合的に阻害する）それらの能力に基づき、さら
なる抗体を同定することができる。本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片の、ＴＳ
ＬＰタンパク質への結合を阻害する被験抗体の能力により、被験抗体が、その抗体と、Ｔ
ＳＬＰへの結合について競合することが可能であり、このような抗体は、非限定的な理論
によれば、ＴＳＬＰ上の、それが競合する抗体と同じであるかまたは関連の（例えば、構
造的に類似するか、または空間的に近接した）エピトープに結合しうることが裏付けられ
る。一部の実施形態では、本明細書で開示される抗体およびそれらの抗原結合性断片と同
じ、ＴＳＬＰ上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このよ
うなヒトモノクローナル抗体は、本明細書で記載される通りに、調製および単離すること
ができる。一部の実施形態では、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片と同じ、Ｔ
ＳＬＰ上のエピトープに結合する抗体は、マウスモノクローナル抗体である。ある特定の
実施形態では、本明細書で開示される抗体およびそれらの抗原結合性断片と同じ、ＴＳＬ
Ｐ上のエピトープに結合する抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する、ヒト化モノ
クローナル抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される抗体およびそれ
らの抗原結合性断片と同じ、ＴＳＬＰ上のエピトープに結合する抗体は、ヒト化モノクロ
ーナル抗体である。このようなヒト化モノクローナル抗体は、本明細書で記載される通り
に、調製および単離することができる。
一部の実施形態では、本明細書で提示されるモノクローナル抗体またはその抗原結合性
断片は、ヒトＴＳＬＰ内のエピトープであって、以下の残基：配列番号３８のＬｙｓ３８
、Ａｌａ４１、Ｌｅｕ４４、Ｓｅｒ４５、Ｔｈｒ４６、Ｓｅｒ４８、Ｌｙｓ４９、Ｉｌｅ
５２、Ｔｈｒ５３、Ｓｅｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｔｈｒ５８、Ｌｙｓ５９、Ｌｙｓ１０１、
Ｇｌｎ１４５、およびＡｒｇ１４９のうちの１つまたは複数を含むエピトープに特異的に
結合する。一部の実施形態では、本明細書で提示されるモノクローナル抗体またはその抗
原結合性断片は、ヒトＴＳＬＰ内のエピトープであって、以下の残基：配列番号３８のＬ
ｙｓ３８、Ａｌａ４１、Ｌｅｕ４４、Ｓｅｒ４５、Ｔｈｒ４６、Ｓｅｒ４８、Ｌｙｓ４９
、Ｉｌｅ５２、Ｔｈｒ５３、Ｓｅｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｔｈｒ５８、Ｌｙｓ５９、Ｌｙｓ
１０１、Ｇｌｎ１４５、およびＡｒｇ１４９のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、
少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、
少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１
２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または全てを含むエピ
トープに特異的に結合する。
一部の実施形態では、本明細書で提示されるモノクローナル抗体またはその抗原結合性
断片は、ヒトＴＳＬＰ内のエピトープであって、以下の残基：配列番号３８のＬｙｓ３８
、Ａｌａ４１、Ｌｅｕ４４、Ｓｅｒ４５、Ｔｈｒ４６、Ｓｅｒ４８、Ｌｙｓ４９、Ｉｌｅ
５２、およびＴｈｒ５３のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少
なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、ま
たは全てを含むエピトープに特異的に結合する。このようなモノクローナル抗体またはそ
の抗原結合性断片のエピトープはまた、以下の残基：配列番号３８のＳｅｒ５６、Ｇｌｙ
５７、Ｔｈｒ５８、Ｌｙｓ５９、Ｌｙｓ１０１、Ｇｌｎ１４５、およびＡｒｇ１４９のう
ちの１つまたは複数も含みうる。
一部の実施形態では、本明細書で提示されるモノクローナル抗体またはその抗原結合性
断片は、ヒトＴＳＬＰ内のエピトープであって、以下の残基：配列番号３８のＳｅｒ５６
、Ｇｌｙ５７、Ｔｈｒ５８、およびＬｙｓ５９のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ
、少なくとも３つ、または全てを含むエピトープに特異的に結合する。このようなモノク
ローナル抗体またはその抗原結合性断片のエピトープはまた、以下の残基：配列番号３８
のＬｙｓ３８、Ａｌａ４１、Ｌｅｕ４４、Ｓｅｒ４５、Ｔｈｒ４６、Ｓｅｒ４８、Ｌｙｓ
４９、Ｉｌｅ５２、Ｔｈｒ５３、Ｌｙｓ１０１、Ｇｌｎ１４５、およびＡｒｇ１４９のう
ちの１つまたは複数も含みうる。
一部の実施形態では、本明細書で提示されるモノクローナル抗体またはその抗原結合性
断片は、ヒトＴＳＬＰ内のエピトープであって、配列番号３８のＬｙｓ１０１を含むエピ
トープに特異的に結合する。このようなモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片の
エピトープはまた、以下の残基：配列番号３８のＬｙｓ３８、Ａｌａ４１、Ｌｅｕ４４、
Ｓｅｒ４５、Ｔｈｒ４６、Ｓｅｒ４８、Ｌｙｓ４９、Ｉｌｅ５２、Ｔｈｒ５３、Ｓｅｒ５
６、Ｇｌｙ５７、Ｔｈｒ５８、Ｌｙｓ５９、Ｇｌｎ１４５、およびＡｒｇ１４９のうちの
１つまたは複数も含みうる。
一部の実施形態では、本明細書で提示されるモノクローナル抗体またはその抗原結合性
断片は、ヒトＴＳＬＰ内のエピトープであって、配列番号３８のＧｌｎ１４５またはＡｒ
ｇ１４９を含むエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、本明細書で提示さ
れるモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＴＳＬＰ内のエピトープであ
って、配列番号３８のＧｌｎ１４５およびＡｒｇ１４９を含むエピトープに特異的に結合
する。このようなモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片のエピトープはまた、以
下の残基：配列番号３８のＬｙｓ３８、Ａｌａ４１、Ｌｅｕ４４、Ｓｅｒ４５、Ｔｈｒ４
６、Ｓｅｒ４８、Ｌｙｓ４９、Ｉｌｅ５２、Ｔｈｒ５３、Ｓｅｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｔｈ
ｒ５８、Ｌｙｓ５９、およびＬｙｓ１０１のうちの１つまたは複数も含みうる。
一部の実施形態では、本明細書で提示されるモノクローナル抗体またはその抗原結合性
断片は、ヒトＴＳＬＰ内のエピトープであって、以下の残基：配列番号３８のＬｙｓ４９
、Ｉｌｅ５２、Ｇｌｙ５７、Ｌｙｓ５９、Ｌｙｓ１０１、Ｇｌｎ１４５、およびＡｒｇ１
４９のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少な
くとも５つ、少なくとも６つ、または全てを含むエピトープに特異的に結合する。一部の
実施形態では、本明細書で提示されるモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、
ヒトＴＳＬＰ内のエピトープであって、以下の残基：配列番号３８のＬｙｓ４９、Ｉｌｅ
５２、Ｇｌｙ５７、Ｌｙｓ５９、Ｌｙｓ１０１、Ｇｌｎ１４５、およびＡｒｇ１４９の全
てを含むエピトープに特異的に結合する。
一部の実施形態では、本明細書で提示されるモノクローナル抗体またはその抗原結合性
断片は、ヒトＴＳＬＰ内のエピトープであって、配列番号３８の残基の以下のセット：（
ａ）Ｌｙｓ４９およびＩｌｅ５２、（ｂ）Ｇｌｙ５７およびＬｙｓ５９、（ｃ）Ｌｙｓ１
０１、（ｄ）Ｇｌｎ１４５およびＡｒｇ１４９のうちの少なくとも１つを含むエピトープ
に特異的に結合する。一部の実施形態では、本明細書で提示されるモノクローナル抗体ま
たはその抗原結合性断片は、ヒトＴＳＬＰ内のエピトープであって、配列番号３８のＬｙ
ｓ４９およびＩｌｅ５２を含むエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、本
明細書で提示されるモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＴＳＬＰ内の
エピトープであって、配列番号３８のＧｌｙ５７およびＬｙｓ５９を含むエピトープに特
異的に結合する。一部の実施形態では、本明細書で提示されるモノクローナル抗体または
その抗原結合性断片は、ヒトＴＳＬＰ内のエピトープであって、配列番号３８のＬｙｓ１
０１を含むエピトープに特異的に結合する。一部の実施形態では、本明細書で提示される
モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、ヒトＴＳＬＰ内のエピトープであって
、配列番号３８のＧｌｎ１４５およびＡｒｇ１４９を含むエピトープに特異的に結合する
。
一部の実施形態では、ＴＳＬＰ結合性分子は、以下の残基：配列番号２２の重鎖配列の
Ｔｈｒ２８、Ａｓｐ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｒｐ３３、Ａｓｐ５６、Ｇｌｕ１０１、Ｉｌｅ
１０２、Ｔｙｒ１０３、Ｔｙｒ１０４、Ｔｙｒ１０５、または配列番号２５の軽鎖配列の
Ｇｌｙ２８、Ｓｅｒ２９、Ｌｙｓ３０、Ｔｙｒ３１、Ｔｙｒ４８、Ａｓｐ５０、Ａｓｎ５
１、Ｇｌｕ５２、Ａｓｎ６５、およびＴｒｐ９２のうちの、少なくとも１つ、少なくとも
２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも
７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なく
とも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６
個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または全てを含むパラト
ープを含みうる。
抗原上の所望のエピトープを決定したら、例えば、本発明で記載される技法を使用して
、そのエピトープに対する抗体を作り出すことが可能である。代替的に、発見過程におい
て、抗体の作出および特徴付けにより、所望のエピトープについての情報を解明すること
もできる。次いで、この情報から、抗体を、同じエピトープへの結合について、競合的に
スクリーニングすることが可能である。これを達成する手法は、互いと競合的に結合する
抗体、例えば、抗原への結合について競合する抗体を見出す交差競合研究を行うことであ
る。それらの交差競合に基づき、抗体を「ビニング」するハイスループット過程について
は、国際公開第２００３／４８７３１号パンフレットにおいて記載されている。当業者に
より察知される通り、抗体が特異的に結合しうる、事実上いかなるものも、エピトープで
ありうるであろう。エピトープは、抗体が結合する残基を含みうる。
一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複合混
合物中の、標的抗原上のエピトープを優先的に認識するであろう。
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当技術分野で周知の、任意の数のエピ
トープマッピング法を使用して同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protoc
ols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana
Press, Totowa, New Jerseyを参照されたい。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、固
体支持体上で、タンパク質分子の部分に対応する、多数のペプチドを、共時的に合成し、
ペプチドをなおも支持体へと接合させながら、ペプチドを、抗体と反応させることにより
決定することができる。当技術分野では、このような技法が公知であり、例えば、米国特
許第４，７０８，８７１号明細書；Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
8:3998-4002；Geysen et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:78-182；Geysen
et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715において記載されている。同様に、コンフォ
メーショナルエピトープは、例えば、水素／重水素交換、ｘ腺結晶構造解析、および二次
元核磁気共鳴などにより、アミノ酸ＴＳＬＰの空間的コンフォメーションを決定すること
によりたやすく同定される。例えば、Epitope Mapping Protocols、前出を参照されたい
。タンパク質の抗原性領域はまた、例えば、Ｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｇｒｏｕｐから入手可能な、Ｏｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを使
用して計算されるプロットなど、標準的な抗原性／疎水性プロットを使用して同定するこ
ともできる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロファイルを決定するためのホッ
プ／ウッズ法、Hopp et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78:3824-3828、および
疎水性プロットのためのカイト−ドゥーリトル法、Kyte-Doolittle technique, Kyte et
al., (1982) J. MoI. Biol. 157:105-132を利用する。
操作抗体および修飾抗体
出発抗体から特性を改変した修飾抗体を操作する出発材料として、ＶＨ配列および／ま
たはＶＬ配列のうちの１つまたは複数を有する抗体を使用して、本発明の抗体をさらに調
製することができる。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／また
はＶＬ）内、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内、および／または１つもしくは複
数のフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を修飾することにより操作することが
できる。加えて、または代替的に、抗体は、定常領域内の残基を修飾して、例えば、抗体
のエフェクター機能を改変することによっても操作することができる。
実施しうる可変領域操作のうちの１つの種類は、ＣＤＲグラフティングである。抗体は
、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介し
て、標的抗原と相互作用する。この理由で、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個別の抗体の間
の多様性が、ＣＤＲの外部の配列より大きい。ＣＤＲ配列は、大半の抗体−抗原間相互作
用の一因となるため、異なる特性を伴う異なる抗体に由来するフレームワーク配列へとグ
ラフトされた特異的自然発生抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築するこ
とにより、特異的自然発生抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能であ
る（例えば、Riechmann, L.et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P.et al., 1986
Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86:10029-100
33；Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号明細書、ならびにＱｕｅｅｎら
による米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第
５，６９３，７６２号明細書；および同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）
。
このようなフレームワーク配列は、ゲルミン抗体遺伝子配列または再配列された抗体配
列を含む公表されたＤＮＡデータベースまたは公表された参考文献から得ることができる
。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のゲルミンＤＮＡ配列は、ヒト生殖細胞系
列の配列データベースである「ＶＢａｓｅ」（インターネットのwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/
vbaseで入手可能である）のほか、それらの各々の内容が、参照により本明細書に明示的
に組み込まれる、Kabat, E. A. et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological
Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publ
ication No. 91-3242; Tomlinson, I. M. et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798；お
よびCox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836においても見出すことが
できる。例えば、ヒト重鎖可変領域遺伝子およびヒト軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列
のＤＮＡ配列、ならびに再配列された抗体配列は、「ＩＭＧＴ」データベースにおいて見
出すことができる（インターネットのwww.imgt.orgにおいて利用可能である；Lefranc, M
.P. et al., 1999 Nucleic Acids Res. 27:209-212を参照されたい；これらの各々の内容
は、参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片における使用のためのフレームワーク配列
の例は、本発明の選択された抗体およびそれらの抗原結合性断片により使用されるフレー
ムワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使用されるコンセンサス配列
および／またはフレームワーク配列と構造的に類似するフレームワーク配列である。ＶＨ
ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ ＣＤ
Ｒ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由
来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子内で見出される配列と同一の配列を有するフ
レームワーク領域へとグラフトすることもでき、ＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較
して、１つまたは複数の突然変異を含有するフレームワーク領域へとグラフトすることも
できる。例えば、ある種の場合には、フレームワーク領域内の残基を突然変異させて、抗
体の抗原結合能力を維持または増強することが有益であると見出されている（例えば、Ｑ
ｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明
細書；同第５，６９３，７６２号明細書；および同第６，１８０，３７０号明細書を参照
されたい）。
可変領域修飾の別の種類は、「アフィニティー成熟」として公知の、ＶＨ ＣＤＲ１領
域内、ＶＨ ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＨ ＣＤＲ３領域内、ならびに／また
はＶＬ ＣＤＲ１領域内、ＶＬ ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＬ ＣＤＲ３領域
内のアミノ酸残基を突然変異させて、これにより、対象の抗体の１つまたは複数の結合特
性（例えば、アフィニティー）を改善することである。部位特異的突然変異誘発またはＰ
ＣＲ媒介突然変異誘発を実施して、突然変異を導入することができ、本明細書で記載され
、実施例でも提示される、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイにお
いて、抗体結合性または他の対象の機能的特性に対する効果を査定することができる。保
存的修飾（上記で論じた）を導入することができる。突然変異は、アミノ酸の置換の場合
もあり、付加の場合もあり、欠失の場合もある。さらに、ＣＤＲ領域内の、典型的には１
つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下の残基も改変する。
結果として得られるポリペプチドが、ＴＳＬＰに特異的に結合する少なくとも１つの結
合性領域を含む限りにおいて、多種多様な抗体／免疫グロブリンのフレームワークまたは
足場を援用することができる。このようなフレームワークまたは足場は、ヒト免疫グロブ
リン、それらの抗原結合性断片の５つの主要なイディオタイプを含み、好ましくはヒト化
側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。この点で、ラクダ科動物において同定
される単一重鎖抗体などの単一重鎖抗体は、特に対象である。当業者により、新規のフレ
ームワーク、足場、および断片が、発見および開発され続けている。
一態様では、本発明は、本発明のＣＤＲをグラフトしうる非免疫グロブリン足場を使用
して、非免疫グロブリンベースの抗体を作り出す方法に関する。それらが、標的のＴＳＬ
Ｐタンパク質に特異的な結合性領域を含む限りにおいて、公知または将来の非免疫グロブ
リンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場を援用することができる。公知の非免疫
グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場は、フィブロネクチン（Ｃｏｍｐ
ｏｕｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）、アン
キリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒ
ｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ、
およびＡｂｌｙｎｘ ｎｖ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐ
ｉｅｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、低分子
モジュラー免疫医薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｓ
ｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉ
ｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＧ、Ｓｗｅｄｅｎ
）、およびアフィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（ＳｃｉＩ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎｓ ＧｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むがこれらに限定されない。
フィブロネクチン足場は、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン（例えば、ＩＩＩ型フィ
ブロネクチンの第１０モジュール（１０ Ｆｎ３ドメイン））に基づく。ＩＩＩ型フィブ
ロネクチンドメインは、それら自体が互いに対してパックされてタンパク質のコアを形成
し、ベータ鎖を互いへと接続し、溶媒へと露出されるループもさらに含有する（ＣＤＲと
類似する）、２つのベータシートの間に分配された、７つまたは８つのベータ鎖を有する
。ベータシートサンドイッチの各エッジには、少なくとも３つのこのようなループがあり
、エッジは、ベータ鎖の方向に対して垂直なタンパク質の境界である（米国特許第６，８
１８，４１８号明細書を参照されたい）。全体的なフォールドは、ラクダおよびラマＩｇ
Ｇ内の抗原認識単位全体を含む最小の機能的抗体断片である重鎖可変領域のフォールドと
密接に関連するが、これらのフィブロネクチンベースの足場は、免疫グロブリンではない
。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、性質およびアフィニティーが抗体の性質
およびアフィニティーと類似する抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、ｉｎ ｖｉ
ｖｏにおける抗体のアフィニティー成熟の工程と類似する、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるル
ープのランダム化戦略およびシャフリング戦略において使用することができる。これらの
フィブロネクチンベースの分子は、標準的なクローニング法を使用して、分子のループ領
域を本発明のＣＤＲで置きかえうる、足場として使用することができる。
アンキリン技術は、アンキリンに由来するリピートモジュールを伴うタンパク質を、異
なる標的への結合に使用しうる可変領域を保有する足場として使用することに基づく。ア
ンキリンリピートモジュールとは、２つのアンチパラレルのアルファ−ヘリックスおよび
ベータ−ターンからなる、３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボ
ソームディスプレイを使用することにより大部分が最適化される。
アビマーは、ＬＲＰ−１など、天然のＡドメイン含有タンパク質に由来する。これらの
ドメインは、本来、タンパク質間相互作用に使用され、ヒトでは、２５０を超えるタンパ
ク質が、構造的にＡドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して連結され
た多数の（２つ〜１０の）異なる「Ａドメイン」単量体からなる。標的抗原に結合しうる
アビマーは、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号明細書；同第２００
５００５３９７３号明細書；同第２００５００４８５１２号明細書；および同第２００６
０００８８４４号明細書において記載されている方法を使用して創出することができる。
アフィニティーリガンドであるアフィボディとは、プロテインＡのＩｇＧ結合性ドメイ
ンのうちの１つの足場に基づく３ヘリックスバンドルからなる、低分子の単純なタンパク
質である。プロテインＡとは、細菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に
由来する表面タンパク質である。この足場ドメインは、それらのうちの１３が、多数のリ
ガンド変異体を伴うアフィボディライブラリーを作り出す、ランダム化されている５８ア
ミノ酸からなる（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号明細書を参照されたい）。ア
フィボディ分子は、抗体を模倣し、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して、分子量
が６ｋＤａである。その小サイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は、抗体
の結合部位と同様である。
アンチカリンとは、Ｐｉｅｒｉｓ ＰｒｏｔｅｏＬａｂ ＡＧ社により開発された生成
物である。アンチカリンは、通例、化学的に感受性の化合物または不溶性の化合物の生理
学的輸送または貯蔵に関与する、広範にわたる低分子の頑健なタンパク質群であるリポカ
リンに由来する。いくつかの天然リポカリンは、ヒト組織内またはヒト体液中で生じる。
タンパク質のアーキテクチャーは、リジッドフレームワークの上部の超可変ループを伴う
免疫グロブリンを連想させる。しかし、抗体またはそれらの組換え断片とは対照的に、リ
ポカリンは、単一の免疫グロブリンドメインよりかろうじて大きい、１６０〜１８０アミ
ノ酸残基を伴う単一のポリペプチド鎖からなる。結合性ポケットを構成する４つのループ
のセットは、顕著な構造可塑性を示し、様々な側鎖を許容する。したがって、異なる形状
の規定の標的分子を、高度なアフィニティーおよび特異性で認識するために、結合性部位
を独自の工程で再形成することができる。４つのループのセットを突然変異誘発すること
によりアンチカリンを開発するのには、リポカリンファミリーの１つのタンパク質である
、オオモンシロチョウ（Pieris Brassicae）のビリン結合性タンパク質（ＢＢＰ）が使用
されている。アンチカリンについて記載する特許出願の１つの例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ１
９９９１６８７３号にある。
アフィリン分子とは、タンパク質および低分子に対する特異的なアフィニティーのため
にデザインされた低分子非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、
それらの各々が、異なるヒト由来の足場タンパク質に基づく２つのライブラリーから非常
に迅速に選択することができる。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に対する
いかなる構造相同性も示さない。現在、２つのアフィリン足場が援用されており、それら
のうちの一方は、ヒト水晶体の構造タンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は
、「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。いずれのヒト足場も非常に小型
で、高度な熱安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤に対してほぼ耐性である。この高度な
安定性は主に、タンパク質のベータシート構造の展開に起因する。ガンマクリスタリンに
由来するタンパク質の例は、国際公開第２００１０４１４４号パンフレットにおいて記載
されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は、国際公開第２００４１０６３６８号パ
ンフレットにおいて記載されている。
タンパク質エピトープ模倣体（ＰＥＭ）とは、タンパク質間相互作用に関与する主要な
二次構造である、タンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する、中程度のサイズの
環状ペプチド様分子（分子量：１〜２ｋＤａ）である。
ヒトＴＳＬＰ結合性抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して作り出すことができる
。例えば、非ヒト抗体を、操作ヒト抗体へと転換するのに使用されるヒト化技術である。
米国特許出願公開第２００５０００８６２５号明細書は、非ヒト抗体の結合特徴と比べて
、同じ結合特徴または良好な結合特徴を維持しながら、抗体内の非ヒト抗体の可変領域を
、ヒト可変領域で置きかえるためのｉｎ ｖｉｖｏ法について記載している。方法は、非
ヒト基準抗体の可変領域の、完全ヒト抗体による、エピトープ誘導型置換に依拠する。結
果として得られるヒト抗体は一般に、基準非ヒト抗体と構造的に非類縁であるが、基準抗
体と同じ抗原上の同じエピトープに結合する。略述すると、逐次的エピトープ誘導型相補
性置換法は、被験抗体の、抗原への結合に応答するレポーター系の存在下で、限られた量
の抗原への結合について、「競合体」と、基準抗体の多様なハイブリッド体のライブラリ
ー（「被験抗体」）との、細胞内の競合を準備することにより可能となる。競合体は、単
鎖Ｆｖ断片など、基準抗体またはその誘導体でありうる。競合体はまた、基準抗体と同じ
エピトープに結合する、抗原の天然リガンドまたは人工リガンドでもありうる。競合体の
唯一の要件は、それが、基準抗体と同じエピトープに結合し、基準抗体と、抗原結合につ
いて競合することである。被験抗体は、非ヒト基準抗体に由来する、１つの共通の抗原結
合性Ｖ領域と、ヒト抗体のレパートリーライブラリーなど、多様な供給源からランダムに
選択される他のＶ領域とを有する。基準抗体に由来する共通のＶ領域は、選択に、基準抗
体に対する最高の抗原結合性忠実度へのバイアスをかけるように、被験抗体を、抗原上の
同じエピトープに、同じ配向性で配置するガイドとして用いられる。
多くの種類のレポーター系を使用して、被験抗体と抗原との所望の相互作用を検出する
ことができる。例えば、相補的レポーター断片は、断片の相補性によるレポーターの活性
化が、被験抗体が、抗原に結合する場合に限り生じるように、抗原および被験抗体のそれ
ぞれへと連結することができる。被験抗体−レポーター断片と抗原−レポーター断片との
融合体を、競合体と共発現させる場合、レポーターの活性化は、被験抗体が競合体と競合
する能力であって、被験抗体の、抗原に対するアフィニティーと比例する能力に依存する
。使用しうる他のレポーター系は、米国特許出願第１０／２０８，７３０号明細書（公開
第２００３０１９８９７１号）において開示されている、自己阻害レポーター再活性化の
再活性化因子（ＲＡＩＲ系）、または米国特許出願第１０／０７６，８４５号明細書（公
開第２００３０１５７５７９号）において開示されている競合活性化系を含む。
逐次的エピトープ誘導型相補性置換系では、単一の被験抗体を、競合体、抗原、および
レポーター成分と共に発現する細胞を同定するように、選択を行う。これらの細胞内では
、各被験抗体は、限られた量の抗原への結合について、競合体と一対一で競合する。レポ
ーターの活性は、被験抗体に結合した抗原の量に比例し、被験抗体に結合した抗原の量は
、被験抗体の、抗原に対するアフィニティーおよび被験抗体の安定性と比例する。被験抗
体はまず、被験抗体として発現させる場合の基準抗体の活性と比べた、それらの活性に基
づき選択する。選択の第１ラウンドの結果は、それらの各々が、基準抗体に由来する、同
じ非ヒトＶ領域と、ライブラリーに由来するヒトＶ領域とから構成され、それらの各々が
、抗原上の、基準抗体と同じエピトープに結合する、「ハイブリッド」抗体のセットであ
る。第１ラウンドで選択されるハイブリッド抗体のうちの１つまたは複数は、抗原に対す
る、基準抗体のアフィニティー以上のアフィニティーを有するであろう。
第２のＶ領域置きかえステップでは、第１のステップで選択されたヒトＶ領域を、残り
の非ヒト基準抗体Ｖ領域の、コグネイトヒトＶ領域の多様なライブラリーによるヒト置換
体を選択するためのガイドとして使用する。第１ラウンドで選択されたハイブリッド抗体
はまた、選択の第２ラウンドのための競合体としても使用することができる。選択の第２
ラウンドの結果は、基準抗体と構造的に異なるが、同じ抗原への結合について、基準抗体
と競合する、完全ヒト抗体のセットである。選択されたヒト抗体の一部は、基準抗体と同
じ抗原上の同じエピトープに結合する。これらの選択されたヒト抗体の中で、１つまたは
複数は、同じエピトープに、基準抗体のアフィニティー以上のアフィニティーで結合する
。
ラクダ科動物抗体
ラマ種（アルパカ（Lama paccos）、ラマ（Lama glama）、およびビクーニャ（Lama vi
cugna））などの新世界メンバー含む、ラクダおよびヒトコブラクダ（dromedary）（フタ
コブラクダ（Camelus bactrianus）およびヒトコブラクダ（Calelus dromaderius））フ
ァミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性、およびヒト
対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。天然で見出されるこのファミリーの哺
乳動物に由来するある種のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠き、したがって、他の動物に由来する
抗体の場合の、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する、典型的な４つの鎖の四次構造とは
構造的に異なっている。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４（１９９４年３月３日に公表され
たＷＯ９４／０４６７８）を参照されたい。
ＶＨＨとして同定される小型の単一の可変ドメインである、ラクダ科動物抗体の領域は
、標的に対して高いアフィニティーを有する低分子タンパク質をもたらすことから、「ラ
クダ科動物ナノボディ」として公知の低分子量抗体由来タンパク質を結果としてもたらす
遺伝子操作により得ることができる。１９９８年６月２日に取得された米国特許第５，７
５９，８０８号明細書を参照されたい。また、Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Che
m 279:1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424:783-788; Pleschberger, M.
et al., 2003 Bioconjugate Chem 14:440-448; Cortez-Retamozo, V. et al., 2002 Int
J Cancer 89:456-62；およびLauwereys, M. et al., 1998 EMBO J 17:3512-3520も参照さ
れたい。ラクダ科動物抗体および抗体断片の操作ライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ
、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト由来の他の抗体および抗原結
合性断片と同様に、ラクダ科動物抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列により酷似する配列を
得るように、組換えにより改変することができる、すなわち、ナノボディは、「ヒト化」
することができる。したがって、ヒトに対するラクダ科動物抗体の天然の小さな抗原性を
、さらに低減することができる。
ラクダ科動物ナノボディの分子量は、ヒトＩｇＧ分子の分子量の約１０分の１で、タン
パク質の物理的直径は、数ナノメートルに過ぎない。サイズが小さいことの１つの帰結は
、大型の抗体タンパク質には機能的に不可視である抗原性部位に結合するラクダ科動物ナ
ノボディの能力である、すなわち、ラクダ科動物ナノボディは、古典的な免疫学的技法を
使用するこれ以外の形では隠蔽されたままの抗原を検出する試薬として有用であり、可能
な治療剤として有用である。したがって、サイズが小さいことのさらに別の帰結は、ラク
ダ科動物ナノボディが、標的タンパク質のグルーブ内または狭小なクレフト内の特異的部
位に結合することの結果として、標的タンパク質を阻害することが可能であり、よって、
古典的な抗体の機能よりも、古典的な低分子量の薬物の機能により酷似する能力において
用いられうることである。
低分子量およびコンパクトなサイズはさらに、熱安定性が極めて大きく、極端なｐＨお
よびタンパク質分解性消化に対して安定的であり、抗原性が小さいラクダ科動物ナノボデ
ィを結果としてもたらす。別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、循環系から組織へと
たやすく移動し、血液脳関門もなお越え、神経組織に影響を及ぼす障害も処置しうること
である。ナノボディはさらに、血液脳関門を越える薬物輸送も容易としうる。２００４年
８月１９日に公表された米国特許出願公開第２００４０１６１７３８号明細書を参照され
たい。これらの特色を、ヒトに対する抗原性が小さいことと組み合わせることにより、大
きな治療的可能性が指し示される。さらに、これらの分子は、大腸菌（E. coli）などの
原核細胞内で完全に発現させることができ、バクテリオファージとの融合タンパク質とし
て発現させ、機能的である。
したがって、本発明の特色は、ＴＳＬＰに対して高いアフィニティーを有するラクダ科
動物抗体またはラクダ科動物ナノボディである。本明細書の一実施形態では、ラクダ科動
物抗体またはラクダ科動物ナノボディは、天然ではラクダ科動物において産生される、す
なわち、他の抗体について本明細書で記載される技法を使用する、ＴＳＬＰまたはそのペ
プチド断片による免疫化の後で、ラクダ科動物により産生される。代替的に、ＴＳＬＰ結
合性ラクダ科動物ナノボディは、操作もされる、すなわち、例えば、本明細書の実施例に
おいて記載されている、標的としてのＴＳＬＰを伴うパニング手順を使用する、適切に突
然変異誘発されたラクダ科動物ナノボディタンパク質を提示するファージライブラリーか
らの選択によっても作製される。操作されたナノボディはさらに、遺伝子操作により、レ
シピエント対象における半減期が、４５分間〜２週間となるようにカスタマイズすること
もできる。具体的な実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディを、
例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４において記載されている通り、本発明のヒト抗体
の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、ナノボディまたは単一ドメイン抗体フレームワーク配
列へとグラフトすることにより得る。
二特異性分子および多価抗体
別の態様では、本発明は、本発明のＴＳＬＰ結合性抗体またはその断片を含む二特異性
分子または多特異性分子を特色とする。本発明の抗体またはその抗原結合性断片は、少な
くとも２つの異なる結合性部位または標的分子に結合する二特異性分子を作り出すように
誘導体化することもでき、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例
えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）へと連結することもできる。本発明の抗
体は実際、３つ以上の異なる結合性部位および／または標的分子に結合する多特異性分子
を作り出すように誘導体化することもでき、他の２つ以上の機能的分子へと連結すること
もでき、このような多特異性分子はまた、本明細書で使用される「二特異性分子」という
用語により包含されることも意図される。本発明の二特異性分子を創出するには、本発明
の抗体を、二特異性分子が結果として得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド、
または結合性模倣体など、１つまたは複数の他の結合性分子へと機能的に連結する（例え
ば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、またはこれら以外の形
で）ことができる。
したがって、本発明は、ＴＳＬＰに対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第
２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二特異性分子を含む。例えば、第２
の標的エピトープは、ＴＳＬＰの別のエピトープであって、第１の標的エピトープと異な
るエピトープでありうる。他の実施形態では、第２の標的エピトープは、ＴＳＬＰと非類
縁であるが、ＴＳＬＰと組み合わせて治療的有益性をもたらす標的でありうる。
加えて、二特異性分子が多特異性である本発明では、分子は、第１の標的エピトープお
よび第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性もさらに含みうる。
一実施形態では、本発明の二特異性分子は、結合特異性として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａ
ｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその
抗体断片を含む。抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖の二量体、またはＬａｄｎｅｒら、米国
特許第４，９４６，７７８号明細書において記載されている、Ｆｖもしくは単鎖構築物な
ど、その任意の最小断片でありうる。
ダイアボディとは、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリ
ンカーにより接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを単一のポリペプチド鎖上で発
現させた、二価の二特異性分子である。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別の鎖の相
補的なドメインと対合し、これにより、２つの抗原結合性部位を創出する（例えば、Holl
iger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poijak et al., 1994 S
tructure 2:1121-1123を参照されたい）。ダイアボディは、ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ
−ＶＬＡ構造（ＶＨ−ＶＬ立体配置）、またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ構造
（ＶＬ−ＶＨ立体配置）を伴う２つのポリペプチド鎖を、同じ細胞内で発現させることに
より作製することができる。ダイアボディの大半は、細菌内の可溶性形態で発現させるこ
とができる。単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖
を、約１５アミノ酸残基のリンカーで接続することにより作製する（Holliger and Winte
r, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechn
ology, 2(1):21-36を参照されたい）。ｓｃＤｂは、細菌内の可溶性で活性の単量体形態
で発現させることができる（Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother.,
45(34):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun and Pack
, 1997 Immunotechnology, 3(2):83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):61
7-21を参照されたい）。ダイアボディをＦｃへと融合させて、「ジダイアボディ」を作り
出すことができる（Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65を参照されたい）
。
本発明の二特異性分子内で援用しうる他の抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラ
モノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体である。
本発明の二特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素である結合特
異性をコンジュゲートさせることにより調製することができる。例えば、二特異性分子の
各結合特異性は、個別に作り出し、次いで、互いとコンジュゲートさせることができる。
結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合は、様々なカップリング剤または架橋
剤を、共有結合的コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例は、プロテイ
ンＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−５−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴ
Ａ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマ
レイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ
ート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky et a
l., 1984 J. Exp. Med. 160:1686； Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA
82:8648を参照されたい）。他の方法は、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No.78、118
-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83；およびGlennie et al., 1987 J. Immu
nol. 139:2367-2375において記載されている方法を含む。コンジュゲート剤は、ＳＡＴＡ
およびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれも、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ）から入手可能である。
結合特異性が、抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域をスルフヒ
ドリル結合させることによりコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、
コンジュゲーションの前に、奇数のスルフヒドリル残基、例えば、１つのスルフヒドリル
残基を含有するように、ヒンジ領域を修飾する。
代替的に、いずれの結合特異性も、同じベクター内でコードさせ、同じ宿主細胞内で発
現およびアセンブルさせることができる。この方法は、二特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ
融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク
質、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二
特異性分子は、１つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子の場合もあり、２つの結
合決定基を含む単鎖二特異性分子の場合もある。二特異性分子は、少なくとも２つの単鎖
分子を含みうる。二特異性分子を調製する方法については、例えば、米国特許第５，２６
０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，
１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１
３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号
明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；および米国特許第５，４８２，８５８
号明細書において記載されている。
それらの特異的な標的に対する二特異性分子の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ
（例えば、成長阻害アッセイ）、またはウェスタンブロットアッセイにより確認すること
ができる。これらのアッセイの各々では一般に、対象の複合体に特異的な、標識された試
薬（例えば、抗体）を利用することにより、特に対象となるタンパク質−抗体複合体の存
在が検出される。
別の態様では、本発明は、ＴＳＬＰに結合する、本発明の抗体およびそれらの抗原結合
性断片の、少なくとも２つの、同一であるかまたは異なる抗原結合性部分を含む、多価化
合物を提供する。抗原結合性部分は、タンパク質の融合または共有結合的連結もしくは非
共有結合的連結を介して、互いに連結することができる。代替的に、二特異性分子のため
の連結法も記載されている。四価化合物は、例えば、本発明の抗体およびそれらの抗原結
合性断片を、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片の定常領域に結合する抗体また
は抗原結合性断片、例えば、Ｆｃ領域またはヒンジ領域と架橋することにより得ることが
できる。
三量体化ドメインについては、例えば、Ｂｏｒｅａｎ Ｐｈａｒｍａによる特許である
欧州特許第１０１２２８０号明細書において記載されている。五量体化モジュールについ
ては、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ９７／０５８９７において記載されている。
半減期を延長した抗体
本発明は、ＴＳＬＰに特異的に結合し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体
を提供する。
多くの因子が、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるタンパク質の半減期に影響を及ぼしうる。例え
ば、腎臓における濾過、肝臓における代謝、タンパク質分解性酵素（プロテアーゼ）によ
る分解、および免疫原性応答（例えば、抗体によるタンパク質の中和ならびにマクロファ
ージおよび樹状細胞による取込み）などの因子である。様々な戦略を使用して、本発明の
抗体およびそれらの抗原結合性断片の半減期を延長することができる。例えば、ポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ ＰＥＧ、抗体足場、ポリシアル酸（ＰＳＡ）
、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合性リガンド、および炭水化物シ
ールドとの化学的連結により；アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎ、およびトランスフェリン
などの血清タンパク質に結合するタンパク質との遺伝子融合により；ナノボディ、Ｆａｂ
、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディ、およびアンチカリンなど、血清タンパク質に
結合する他の結合部分とカップリングする（遺伝子的または化学的に）ことにより；ｒＰ
ＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合性タンパク質、およびＦｃと
の遺伝子融合により；またはナノ担体、徐放製剤、もしくは医療デバイスへの組込みによ
り、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片の半減期を延長することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体の血清中循環を延長するため、高分子量のＰＥＧなど、不
活性のポリマー分子を、ＰＥＧの、抗体のＮ末端もしくはＣ末端への部位特異的コンジュ
ゲーションを介して、またはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多
官能性リンカーを伴うかまたは多官能性リンカーを伴わない、抗体またはそれらの断片へ
と付着することができる。抗体をＰＥＧ化するには、抗体、その抗原結合性断片を、ＰＥ
Ｇの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と
、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着する条件下で反応させることが
典型的である。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似する反応性の水溶性ポリマー
）とのアシル化反応またはアルキル化反応により実行することができる。本明細書で使用
される「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ポ
リエチレングリコールもしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチ
レングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているＰ
ＥＧの形態のうちのいずれかを包含することを意図するものである。一実施形態では、Ｐ
ＥＧ化される抗体は、脱グリコシル化抗体である。直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマー
の誘導体化であって、生物学的活性の喪失を結果として最小とする誘導体化が、使用され
るであろう。コンジュゲーションの程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により緊密
にモニタリングして、ＰＥＧ分子の抗体への適正なコンジュゲーションを確認することが
できる。反応しなかったＰＥＧは、サイズ除外クロマトグラフィーまたはイオン交換クロ
マトグラフィーにより、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。ＰＥＧ
誘導体化抗体は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、本明細書で記載されるイムノ
アッセイにより、結合活性ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性について調べることが
できる。当技術分野では、タンパク質をＰＥＧ化するための方法が公知であり、本発明の
抗体およびそれらの抗原結合性断片に適用することができる。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒ
ａらによる欧州特許第０１５４３１６号明細書およびＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許
第０４０１３８４号明細書を参照されたい。
他の改変されたＰＥＧ化技術は、ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成系
を介して、化学的に特定された側鎖を、生合成タンパク質へと組み込む、再構成化学的直
交性直接操作技術（reconstituting chemically orthogonal directed engineering）（
ＲｅＣＯＤＥ ＰＥＧ）を含む。この技術は、３０を超える新たなアミノ酸の、大腸菌（
E. coli）細胞内、酵母細胞内、および哺乳動物細胞内の生合成タンパク質への組込みを
可能とする。ｔＲＮＡは、規範的なアミノ酸を、アンバーコドンが配置される任意の位置
へと組み込み、終止アンバーコドンから、化学的に特定されたアミノ酸の組込みシグナル
を伝達するコドンへと転換する。
組換えＰＥＧ化技術（ｒＰＥＧ）はまた、血清半減期の延長にも使用することができる
。この技術は、３００〜６００アミノ酸の非構造化タンパク質テールを、既存の医薬用タ
ンパク質へと遺伝子融合させることを伴う。このような非構造化タンパク質鎖の見かけの
分子量は、その実際の分子量の約１５倍であるため、タンパク質の血清半減期は、大きく
増大する。化学的コンジュゲーションおよび再精製を要求する従来のＰＥＧ化とは対照的
に、製造工程は大きく簡略化され、生成物は、均質である。
ポリシアリル化は、天然のポリマーであるポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用して、活性寿
命を延長し、治療用ペプチドおよび治療用タンパク質の安定性を改善する、別の技術であ
る。ＰＳＡとは、シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療用ペプチドの
薬物送達に使用される場合、コンジュゲーション時に、ポリシアル酸は、保護的微小環境
をもたらす。これは、循環内の治療用タンパク質の活性寿命を延長し、それが免疫系によ
り認識されることを防止する。ＰＳＡポリマーは、天然では、ヒト体内で見出される。Ｐ
ＳＡは、数百万年にわたり、それらの壁をＰＳＡでコーティングするように進化したある
種の細菌により採用された。次いで、これらの天然でポリシアリル化した細菌は、分子的
模倣により、体内の防御系を失効化することが可能となった。自然の究極のステルス技術
であるＰＳＡは、このような細菌から、大量に、かつ、所定の物理的特徴を伴って、容易
に作製することができる。細菌ＰＳＡは、ヒト体内ではＰＳＡと化学的に同一であるので
、タンパク質へとカップリングさせた場合でもなお、完全に非免疫原性である。
別の技術は、抗体に連結されたヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使用
を含む。ＨＥＳとは、蝋状トウモロコシデンプンに由来する、修飾された天然ポリマーで
あり、体内の酵素により代謝されうる。ＨＥＳ溶液は通例、血液量不足を補い、血液のレ
オロジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性を増大させ
ることのほか、腎クリアランスを低減することによっても、循環半減期の延長を可能とし
、生物学的活性の増大を結果としてもたらす。ＨＥＳの分子量など、異なるパラメータを
改変することにより、広範にわたるＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズすることが
できる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体はまた、１つまたは複数のアミノ酸修飾
（すなわち、置換、挿入、または欠失）を、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ結合
性断片（好ましくはＦｃドメイン断片またはヒンジＦｃドメイン断片）へと導入しても作
り出すことができる。例えば、国際公開第９８／２３２８９号号パンフレット、国際公開
第９７／３４６３１号パンフレット；および米国特許第６，２７７，３７５号明細書を参
照されたい。
さらに、抗体または抗体断片を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてより安定的とするか、または
ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長するために、抗体を、アルブミンへとコンジュゲー
トさせることもできる。当技術分野では、技法が周知であり、例えば、国際特許公開第９
３／１５１９９号パンフレット、同第９３／１５２００号パンフレット、および同０１／
７７１３７号パンフレット；ならびに欧州特許第４１３，６２２号明細書を参照されたい
。
半減期を延長するための戦略は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期の延長が所望される、
ナノボディ、フィブロネクチンベースの結合剤、および他の抗体またはタンパク質におい
てとりわけ有用である。
抗体コンジュゲート
本発明は、ＴＳＬＰの細胞外ドメインに特異的に結合する抗体またはそれらの抗原結合
性断片であって、融合タンパク質を作り出すように、異種タンパク質または異種ポリペプ
チド（またはその抗原結合性断片、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも２０、少な
くとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少な
くとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチドへと）へ
と、組換えにより融合させるか、または化学的にコンジュゲートさせた（共有結合的コン
ジュゲーションおよび非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む）、抗体またはそれ
らの抗原結合性断片を提供する。特に、本発明は、本明細書で記載される抗体の抗原結合
性断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、
ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ ＣＤＲ）と、異種タンパク質、異種ポリペプ
チド、または異種ペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。当技術分野では、タンパ
ク質、ポリペプチド、またはペプチドを、抗体または抗体断片と融合またはコンジュゲー
トさせる方法が知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号明細書、同第５
，６２２，９２９号明細書、同第５，３５９，０４６号明細書、同第５，３４９，０５３
号明細書、同第５，４４７，８５１号明細書、および同第５，１１２，９４６号明細書；
欧州特許第３０７，４３４号明細書および同第３６７，１６６号明細書；国際公開第９６
／０４３８８号パンフレットおよび同第９１／０６５７０号パンフレット；Ashkenazi et
al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Im
munol. 154:5590-5600；およびVil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1133
7-11341を参照されたい。
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシ
ャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて、「ＤＮＡシャフリング」と
称する）の技法を介して作り出すことができる。ＤＮＡシャフリングを利用して、本発明
の抗体およびそれらの抗原結合性断片の活性を改変する（例えば、アフィニティーが大き
く、解離速度が小さい抗体およびそれらの抗原結合性断片）ことができる。一般に、米国
特許第５，６０５，７９３号明細書、同第５，８１１，２３８号明細書、同第５，８３０
，７２１号明細書、同第５，８３４，２５２号明細書、および同第５，８３７，４５８号
明細書；Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama, 1998,
Trends Biotechnol. 16 (2):76-82；Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-7
6；およびLorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24 (2):308-313（これらの特許お
よび刊行物の各々は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる）を参照
されたい。抗体およびそれらの抗原結合性断片、またはコードされた抗体およびそれらの
抗原結合性断片は、組換えの前に、エラープローンＰＣＲによるランダム突然変異誘発、
ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法にかけることにより改変することができる。
ＴＳＬＰのストーク領域に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片をコードする
ポリヌクレオチドを、１つまたは複数の異種分子の、１つまたは複数の構成要素、モチー
フ、区間、部分、ドメイン、断片などで組み換えることができる。
さらに、抗体およびそれらの抗原結合性断片は、精製を容易とするペプチドなどのマー
カー配列へと融合させることもできる。一実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、そ
れらのうちの多くが市販されている中でとりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎ
ｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ、９１３
１１）において提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチド（配列番号４０）で
ある。Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824において記載され
ている通り、例えば、ヘキサヒスチジン（配列番号４０）は、融合タンパク質の簡便な精
製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパ
ク質に由来するエピトープ（Wilson et al., 1984, Cell 37:767）に対応するヘマグルチ
ニン（「ＨＡ」）タグ、および「フラッグ」タグを含むがこれらに限定されない。
一実施形態では、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片を、診断剤または検出用
薬剤へとコンジュゲートさせる。このような抗体は、疾患または障害の発生、発症、進行
、および／または重症度を、特定の治療の有効性を決定することなど、臨床検査手順の一
部としてモニタリングまたは予後診断するのに有用でありうる。このような診断および検
出は、抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラク
トシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどであるがこれらに限定されない多様
な酵素；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどであるがこれらに
限定されない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオ
レセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド
、またはフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光材料；ルミノールなど
であるがこれらに限定されない発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオ
リンなどであるがこれらに限定されない生物発光材料；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１
２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、イ
ンジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネシウム（
９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（
１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、
１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈ
ｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、
６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ
、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどであるがこれらに限定され
ない放射性材料；ならびに多様なポジトロン断層法を使用するポジトロン放出金属および
非放射性の常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出可能な物質へとカップリ
ングすることにより達成することができる。
さらに、抗体およびその抗原結合性断片は、治療用部分または薬物部分へとコンジュゲ
ートさせることもできる。治療用部分または薬物部分は、古典的化学的治療剤に限定され
るとは見なされないものとする。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタ
ンパク質、ペプチド、またはポリペプチドでありうる。このようなタンパク質は、例えば
、アブリン、リシンＡ、シュードモナス属外毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素な
どの毒素；腫瘍壊死因子、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、神
経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、
抗血管新生剤；または例えば、リンホカインなどの生体応答修飾剤などのタンパク質を含
みうる。
さらに、抗体は、２１３Ｂｉなどのアルファ放射体などの放射性金属イオン、１３１Ｉ
ｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含むがこれらに限定されない放射
性金属イオンを、ポリペプチドへとコンジュゲートするのに有用な大環状キレート化剤な
どの治療用部分へとコンジュゲートさせることもできる。一実施形態では、大環状キレー
ト化剤は、リンカー分子を介して抗体へと付着させうる、１，４，７，１０−テトラアザ
シクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。当技術
分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、各々が参照によりそれらの全体
において組み込まれる、Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Pete
rson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7；およびZimmerman et al., 1999, N
ucl. Med. Biol. 26(8):943-50において記載されている。
治療用部分を、抗体へとコンジュゲートさせるための技法は周知であり、例えば、Amon
et al., 「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」
, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., (ed), pp.243-56(Ala
n R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., 「Antibodies For Drug Delivery」, Contr
olled Drug Delivery(2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp.623-53(Marcel Dekker, I
nc. 1987); Thorpe, 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A
Review」, Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinche
ra et al. (eds.), pp.475-506(1985); 「Analysis, Results, And Future Prospective
Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」, Monoclonal
Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16(Ac
ademic Press 1985)；およびThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照され
たい。
抗体はまた、特に、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に有用な固体支持体へと付着
させることもできる。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミ
ド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンを含むがこれらに
限定されない。
抗体をコードする核酸
本発明は、上記で記載したＴＳＬＰ抗体のセグメントまたはドメインを含むポリペプチ
ドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。このようなポリヌクレオチド
は、本明細書で記載されるＴＳＬＰ抗体の重鎖または軽鎖に由来する、少なくとも１つの
ＣＤＲ領域をコードすることが可能であり、通例は、３つＣＤＲ領域全てをコードしうる
。このようなポリヌクレオチドはまた、本明細書で記載されるＴＳＬＰ抗体の重鎖および
／または軽鎖の可変領域配列の全てまたは実質的に全てもコードしうる。このようなポリ
ヌクレオチドはまた、抗体の可変領域および定常領域の両方もコードしうる。コードの縮
重性のために、様々な核酸配列は、免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードするであ
ろう。
ポリヌクレオチド配列は、デノボの固相ＤＮＡ合成、またはＴＳＬＰ結合性抗体または
その結合性断片をコードする既存の配列（例えば、下記の実施例で記載される配列）に対
するＰＣＲによる突然変異誘発により作製することができる。核酸の直接的な化学合成は
、Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90によるホスホトリエステル法；Brown et
al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979によるホスホジエステル法；Beaucage et al., Tetra
. Lett., 22:1859, 1981によるジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第４，４
５８，０６６号明細書による固体支持体法など、当技術分野で公知の方法により達成する
ことができる。ＰＣＲによる、突然変異の、ポリヌクレオチド配列への導入は、例えば、
PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (
Ed.), Freeman Press, NY, N.Y., 1992；PCR Protocols: A Guide to Methods and Appli
cations, Innis et al. (Ed), Academic Press, San Diego, Calif., 1990; Mattila et
al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991；およびEckert et al., PCR Methods and Appli
cations 1:17, 1991において記載されている通りに実施することができる。
本発明ではまた、上記で記載したＴＳＬＰ結合性抗体を作製するための発現ベクターお
よび宿主細胞も提供される。多様な発現ベクターを、援用して、ＴＳＬＰ結合性抗体鎖ま
たは結合性断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスベー
スの発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターのいずれを使用しても、哺乳動物宿主細
胞内で抗体を作製することができる。非ウイルスベクターおよび非ウイルス系は、プラス
ミド、典型的に、タンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットを伴うエピソ
ームベクター、およびヒト人工染色体を含む（例えば、Harrington et al., Nat Genet 1
5:345, 1997を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞内のＴＳＬＰ結
合性ポリヌクレオチドおよびＴＳＬＰ結合性ポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベク
ターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ｂ、およびｐＴｈｉｏＨｉｓ Ｃ、
ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ｂ、およびｐＥＢＶ
Ｈｉｓ Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＭＰＳＶベ
クター、ならびに他のタンパク質を発現させるための、当技術分野で公知の他の多数のベ
クターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随
伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピロー
マウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、およびセ
ムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）を含む。Brent et al., 前出; Smith, Annu. Rev. Micr
obiol. 49:807, 1995；およびRosenfeld et al., Cell 68:143, 1992を参照されたい。
発現ベクターの選択は、その中でベクターを発現させる、意図される宿主細胞に依存す
る。発現ベクターは、ＴＳＬＰ結合性の抗体鎖の抗原結合性断片をコードするポリヌクレ
オチドに作動可能に連結されたプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー
）を含有することが典型的である。一実施形態では、誘導条件下を除き、挿入された配列
の発現を防止するのに、誘導的プロモーターを援用する。誘導的プロモーターは、例えば
、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモー
ターを含む。形質転換された生物の培養物は、それらの発現産物が宿主細胞により良好に
許容されるコード配列の集団にバイアスをかけずに、非誘導条件下で増殖させることがで
きる。プロモーターに加えて、他の調節的エレメントもまた、ＴＳＬＰ結合性の、抗体鎖
または抗原結合性断片の効率的な発現に要求または所望される可能性がある。これらのエ
レメントは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接のリボソーム結合性部位または他の配列を典型
的に含む。加えて、発現の効率は、使用される細胞系に適するエンハンサーを組み入れる
ことにより増強することもできる（例えば、Scharf et al., Results Probl. Cell Diffe
r. 20:125, 1994；およびBittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987を参照された
い）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿
主細胞内の発現を増大させることができる。
発現ベクターはまた、挿入されたＴＳＬＰ結合性抗体配列によりコードされるポリペプ
チドとの融合タンパク質を形成するように、分泌シグナル配列の位置ももたらしうる。挿
入されたＴＳＬＰ結合性抗体配列は、ベクター内に組み入れる前に、シグナル配列へと連
結することが多い。ＴＳＬＰ結合性抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコ
ードする配列を受容するのに使用されるベクターは、場合によってまた、定常領域または
それらの一部もコードする。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質として
の可変領域の発現を可能とし、これにより、インタクトな抗体およびそれらの抗原結合性
断片の作製をもたらす。このような定常領域は、ヒト定常領域であることが典型的である
。
ＴＳＬＰ結合性抗体鎖を保有し、これを発現させるための宿主細胞は、原核細胞の場合
もあり、真核細胞の場合もある。大腸菌（E. coli）は、本発明のポリヌクレオチドをク
ローニングし、発現させるのに有用な１つの原核生物宿主である。使用に適する他の微生
物宿主は、枯草菌（Bacillus subtilis）などの桿菌、およびサルモネラ（Salmonella）
属種、セラチア（Serratia）属種、および多様なシュードモナス（Pseudomonas）属種な
ど、他の腸内細菌科を含む。これらの原核生物宿主内ではまた、典型的に、宿主細胞と適
合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターも作製することができ
る。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベ
ータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダに由来するプロモーター系な
ど、任意の数の、様々な周知のプロモーターも存在する。プロモーターは、任意選択で、
オペレーター配列により発現を制御することが典型的であるが、転写および翻訳を開始し
て終結させるためのリボソーム結合性部位配列なども有する。本発明のＴＳＬＰ結合性ポ
リペプチドを発現させるのに、酵母など、他の微生物もまた援用することができる。また
、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる。
一実施形態では、本発明のＴＳＬＰ結合性ポリペプチドを発現させ、作製するのに、哺
乳動物宿主細胞を使用する。例えば、哺乳動物宿主細胞は、内因性免疫グロブリン遺伝子
を発現させるハイブリドーマ細胞系（例えば、実施例で記載される、１Ｄ６．Ｃ９骨髄腫
ハイブリドーマクローン）の場合もあり、外因性発現ベクターを保有する哺乳動物細胞系
（例えば、下記で例示されるＳＰ２／０骨髄腫細胞）の場合もある。哺乳動物宿主細胞は
、任意の正常非不死化動物細胞または正常不死化動物細胞もしくは非正常不死化動物細胞
またはヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞系、多様なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨
髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞、およびハイブリドーマを含む、インタクトな免疫グロブリ
ンを分泌することが可能な多数の適切な宿主細胞系が開発されている。ポリペプチドを発
現させるための、哺乳動物組織細胞培養物の使用については、例えば、Winnacker, FROM
GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987において一般に論じられている。
哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサ
ーなどの発現制御配列（例えば、Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986を参照さ
れたい）、ならびにリボソーム結合性部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位
、および転写ターミネーター配列などの、必要なプロセシング情報部位を含みうる。これ
らの発現ベクターは通例、哺乳動物遺伝子に由来するプロモーターまたは哺乳動物ウイル
スに由来するプロモーターを含有する。適切なプロモーターは、構成的プロモーター、細
胞型特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、および／またはモジュレート可能プ
ロモーターもしくは調節可能プロモーターでありうる。有用なプロモーターは、メタロチ
オネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘
導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター
、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト即初
期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当技術分野で公知のプ
ロモーター−エンハンサーの組合せを含むがこれらに限定されない。
対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種
類に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に原核細胞に
活用されるのに対し、リン酸カルシウム処理または電気穿孔は、他の細胞宿主に使用する
ことができる（一般に、Sambrook et al., 前出を参照されたい）。他の方法は、例えば
、電気穿孔、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介型形質転換、注射およびマイクロイ
ンジェクション、遺伝子銃法、ウィロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コ
ンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質であ
るＶＰ２２との融合体（Elliot and O'Hare, Cell 88:223, 1997）、ＤＮＡの薬剤増強型
取込み、およびｅｘ ｖｉｖｏにおける形質導入を含む。組換えタンパク質の長期にわた
る高収率作製のためには、安定的発現が所望されることが多い。例えば、ＴＳＬＰ結合性
抗体鎖または結合性断片を安定的に発現させる細胞系は、ウイルス複製起点または内因性
発現エレメント、および選択マーカー遺伝子を含有する、本発明の発現ベクターを使用し
て調製することができる。ベクターを導入した後、細胞は、強化培地中で１〜２日間にわ
たり成長させてから、選択培地へと切り替えることができる。選択マーカーの目的は、選
択に対する耐性を付与し、その存在により細胞の成長を可能とし、これにより、導入され
た配列を選択培地中で発現させることに成功することである。耐性で安定的にトランスフ
ェクトされた細胞は、細胞型に適する組織培養法を使用して増殖させることができる。
抗体および抗体断片の作製
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Kohler and
Milstein, 1975 Nature 256: 495による標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法を含
む様々な技法により作製することができる。例えば、Ｂリンパ球のウイルス性形質転換ま
たは発がん性形質転換など、モノクローナル抗体を作製するための多くの技法を援用する
ことができる。
ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリ
ドーマの作製は、十分に確立された手順である。当技術分野では、融合体のための免疫化
された脾臓細胞を単離するための免疫化プロトコールおよび免疫化法が公知である。融合
パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順もまた公知である。
一部の実施形態では、本発明の抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。本発明のキ
メラ抗体またはヒト化抗体およびそれらの抗原結合性断片は、上記で記載した通りに調製
されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づき調製することができる。重鎖および軽鎖
免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象のマウスハイブリドーマから得、標準的な分
子生物学の技法を使用して、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するよ
うに操作することができる。例えば、キメラ抗体を創出するには、当技術分野で公知の方
法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照され
たい）を使用して、マウス可変領域を、ヒト定常領域へと連結することができる。ヒト化
抗体を創出するには、当技術分野で公知の方法を使用して、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフ
レームワークへと挿入することができる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２
２５，５３９号明細書；ならびにＱｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号明
細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；および同第
６１８０３７０号明細書を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。ＴＳＬＰ
を指向するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなく、ヒト免疫系の一
部を保有する、トランスジェニックマウスまたはトランスクロモソームマウスを使用して
作り出すことができる。これらのトランスジェニックマウスおよびトランスクロモソーム
マウスは、本明細書で、それぞれ、ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称するマウスを
含み、本明細書ではまとめて、「ヒトＩｇマウス」と称する。
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、内因性ミュー鎖遺伝
子座および内因性カッパ鎖遺伝子座を不活化する標的化突然変異と併せて、再配列されて
いないヒト重（ミューおよびガンマ）鎖免疫グロブリン配列およびカッパ軽鎖免疫グロブ
リン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含有する（例えば、Lo
nberg et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859を参照されたい）。したがって、マウス
は、マウスＩｇＭまたはＫの発現の低減を呈示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重
鎖および軽鎖トランス遺伝子は、クラススイッチングおよび体細胞突然変異を経て、高ア
フィニティーのヒトＩｇＧ−カッパモノクローナル抗体を作り出す（Lonberg, N. et al.
, 1994 前出; Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101
において総説される; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 6
5-93；ならびにHarding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-54
6）。ＨｕＭＡｂマウスの調製および使用、ならびにこのようなマウスにより保有される
ゲノムの修飾は、それらの全ての内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に具
体的に組み込まれる、Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295;
Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 199
3 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:1
17-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immu
nol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591；な
らびにFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851においてさらに記
載されている。さらに、全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる、米国特許第５，５４
５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細
書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，７８９，６５０号明細書；同第５，８７
７，３９７号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書；同第５，８１４，３１８号明細
書；同第５，８７４，２９９号明細書；および同第５，７７０，４２９号明細書；Surani
らによる、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙ
による、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２１０３９１８号、同第ＷＯ９３／１２２２７号、同第ＷＯ
９４／２５５８５号、同第ＷＯ９７１１３８５２号、同第ＷＯ９８／２４８８４号、およ
び同第ＷＯ９９／４５９６２号；ならびにＫｏｒｍａｎらによるＰＣＴ公開第ＷＯ０１／
１４４２４号も参照されたい。
いくつかの実施形態では、ヒト抗体は、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トラン
スクロモソームを保有するマウスなど、トランス遺伝子上およびトランスクロモソーム上
にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを使用してもたらすことができる。本明細書
で「ＫＭマウス」と称するこのようなマウスは、ＩｓｈｉｄａらによるＰＣＴ公開第ＷＯ
０２／４３４７８号において詳細に記載されている。
当技術分野ではなおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる代替的なトランス
ジェニック動物系も入手可能であり、ＴＳＬＰ結合性抗体およびそれらの抗原結合性断片
をもたらすのに使用することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，
Ｉｎｃ．）と称する代替的なトランスジェニック系を使用することができる。このような
マウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号
明細書；同第６，０７５，１８１号明細書；同第６，１１４，５９８号明細書；同第６，
１５０，５８４号明細書；および同第６，１６２，９６３号明細書において記載されてい
る。
当技術分野ではさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる代替的なトランスクロ
モソーム動物系も入手可能であり、本発明のＴＳＬＰ結合性抗体をもたらすのに使用する
ことができる。例えば、「ＴＣマウス」と称する、ヒト重鎖トランスクロモソームおよび
ヒト軽鎖トランスクロモソームの両方を保有するマウスを使用することができるが、この
ようなマウスは、Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727にお
いて記載されている。当技術分野ではさらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモソーム
を保有するウシも記載されており（Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889
-894）、本発明のＴＳＬＰ結合性抗体をもたらすのに使用することができる。
ヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリー
ニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。当技術分野
では、ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法が確立されているか
、または下記の実施例で記載する。例えば、Ｌａｄｎｅｒらによる米国特許第５，２２３
，４０９号明細書；同第５，４０３，４８４号明細書；および同第５，５７１，６９８号
明細書；Ｄｏｗｅｒらによる米国特許第５，４２７，９０８号明細書；および同第５，５
８０，７１７号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらによる米国特許第５，９６９，１０８号
明細書；および同第６，１７２，１９７号明細書；ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらによる
米国特許第５，８８５，７９３号明細書；同第６，５２１，４０４号明細書；同第６，５
４４，７３１号明細書；同第６，５５５，３１３号明細書；同第６，５８２，９１５号明
細書；および同第６，５９３，０８１号明細書を参照されたい。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化するとヒト抗体応答を作り出しうるよ
うにヒト免疫細胞を再構成した、ＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。この
ようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらによる米国特許第５，４７６，９９６号明細書
；および同第５，６９８，７６７号明細書において記載されている。
抗体のＦａｂ断片またはＦａｂは、モノクローナル抗体を、パパインで消化し、次いで
、アフィニティークロマトグラフィーで精製することにより作り出することができる。Ｆ
ａｂはまた、上記で記載したＦａｂをコードする核酸を使用する組換え合成により作り出
すこともできる。Ｆａｂ断片は、完全ＩｇＧ分子の結合特異性および／または活性を保持
しうるが、サイズは小さく、分子量も小さく、これが、Ｆａｂ断片を、完全ＩｇＧ分子と
は異なる適用に適するものとしている。
フレームワークまたはＦｃの操作
本発明の操作抗体およびそれらの抗原結合性断片は、例えば、抗体の特性を改善するよ
うに、ＶＨ内および／またはＶＬ内のフレームワーク残基へと、修飾が施された抗体およ
びそれらの抗原結合性断片を含む。このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を
低下させるように施すことが典型的である。例えば、１つの手法は、１つまたは複数のフ
レームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことである
。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異
なるフレームワーク残基を含有しうる。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、
抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定することができる。フレーム
ワーク領域配列を、それらの生殖細胞系列の立体配置へと戻すには、例えば、部位特異的
突然変異誘発により、体細胞突然変異を、生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」
ことができる。このような「復帰突然変異させた」抗体もまた、本発明により包含される
ことを意図する。
フレームワーク修飾の別の種類は、１つもしくは複数のフレームワーク領域内の残基、
なおまたは、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトー
プを除去して、これにより、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。この手法は
また、「脱免疫化」とも称し、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０
４３号明細書においてさらに詳細に記載されている。
フレームワーク内またはＣＤＲ領域内に施された修飾に加えて、またはこれと代替的に
、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内の修飾を含んで、典型的に、血清半減期、補体の結合、Ｆ
ｃ受容体の結合、および／または抗原依存性細胞性細胞傷害など、抗体の１つまたは複数
の機能的特性を改変するように操作することもできる。さらに、本発明の抗体は、化学的
に修飾することもでき（例えば、１つまたは複数の化学的部分を抗体に付着することがで
きる）、そのグリコシル化を改変して、ここでもまた、抗体の１つまたは複数の機能的特
性を改変するように修飾することもできる。これらの実施形態の各々については、下記で
さらに詳細に記載する。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔによるＥＵインデッ
クスである。
一実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基の数を改変する、例えば、増大または
減少させるように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。この手法は、Ｂｏｄｍｅｒらによる
米国特許第５，６７７，４２５号明細書においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ
領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易とするか
、または抗体の安定性を増大もしくは低下させるように改変する。
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を
短縮する。より具体的には、抗体のブドウ球菌属プロテインＡ（ＳｐＡ）への結合が、天
然Ｆｃ−ヒンジドメインのＳｐＡへの結合と比べて損なわれるように、１つまたは複数の
アミノ酸突然変異を、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２ドメイン−ＣＨ３ドメイン間界面領域へ
と導入する。この手法は、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書にお
いてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を延長するように修飾する。多様な手
法が可能である。例えば、以下の突然変異：Ｗａｒｄによる米国特許第６，２７７，３７
５号明細書において記載されている、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆのうちの１つ
または複数を導入することができる。代替的に、生物学的半減期を延長するために、抗体
を、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書；および同第６，１２
１，０２２号明細書において記載されている、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つ
のループから採取されたサルベージ受容体結合性エピトープを含有するように、ＣＨ１領
域内またはＣＬ領域内で改変することもできる。
一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を、抗体のエフェクター機能を改変す
る異なるアミノ酸残基で置きかえることにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、抗体が、
エフェクターリガンドに対するアフィニティーを改変しているが、親抗体の抗原結合能は
保持するように、１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることが
できる。それに対するアフィニティーを改変するエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ
受容体または補体のＣ１成分でありうる。この手法は、両方ともＷｉｎｔｅｒらによる米
国特許第５，６２４，８２１号明細書；および同第５，６４８，２６０号明細書において
さらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、抗体が、Ｃ１ｑへの結合を改変し、かつ／または補体依存性細胞傷
害作用（ＣＤＣ）を低減もしくは消失させるように、アミノ酸残基から選択される１つま
たは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。この手法は、Ｉ
ｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号明細書においてさらに詳細に記
載されている。
別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基を改変して、これにより、補体に結
合する抗体の能力を改変する。この手法は、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開第ＷＯ９４
／２９３５１号においてさらに記載されている。
さらに別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸を修飾することにより、抗体依存
性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増大させ、かつ／またはＦｃ−ガ
ンマ受容体に対する抗体のアフィニティーを増大させるように、Ｆｃ領域を修飾する。こ
の手法は、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開第ＷＯ００／４２０７２号においてさらに記載
されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上の、Ｆｃ−ガンマＲＩ、Ｆｃ−ガンマＲＩＩ、Ｆｃ
−ガンマＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎに対する結合性部位もマップされており、結合を改善
させた変異体も記載されている（Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591
-6604を参照されたい）。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、脱グリコシル化抗
体（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く）を作製することができる。グリコシル化は
、例えば、抗原に対する抗体のアフィニティーを増大させるように改変することができる
。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位
を改変することにより達成することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フレー
ムワークグリコシル化部位の消失を結果としてもたらす、１つまたは複数のアミノ酸置換
を作製して、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させることができる。こ
のような脱グリコシル化により、抗原に対する抗体のアフィニティーを増大させることが
できる。このような手法は、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号明細書；およ
び同第６，３５０，８６１号明細書においてさらに詳細に記載されている。
加えて、または代替的に、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体または二分枝
型ＧｌｃＮａｃ構造を増大させた抗体など、グリコシル化の種類を改変した抗体を作製す
ることもできる。このようなグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能を増大さ
せることが裏付けられている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構を
改変した宿主細胞内で抗体を発現させることにより達成することができる。当技術分野で
は、グリコシル化機構を改変した細胞が記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ
、これにより、グリコシル化を改変した抗体を産生するための宿主細胞として使用するこ
とができる。例えば、Ｈａｎｇらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、この
ような細胞系内で発現させた抗体が、低フコシル化を呈示するように、フコシルトランス
フェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊した細胞系について記載している
。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２
９７）連結された炭水化物へと付着する能力を低減し、また、その宿主細胞内で発現させ
た抗体の低フコシル化も結果としてもたらす、変異体のＣＨＯ細胞系である、ＬｅｃＩ３
細胞について記載している（また、Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26
733-26740も参照されたい）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４３４２号
は、操作細胞系内で発現させた抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増大を結果としてもたらす
二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造の増大を呈示するように、糖タンパク質を修飾するグリコシル
トランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−−Ｎアセチルグルコサミニルトランス
フェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させるように操作された細胞系について記載
している（また、Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180も参照されたい）。
改変抗体を操作する方法
上記で論じた通り、本明細書で示されるＶＨ配列およびＶＬ配列または全長重鎖および
全長軽鎖配列を有するＴＳＬＰ結合性抗体は、全長重鎖配列および／もしくは全長軽鎖配
列、ＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列、またはこれらへと付着された定常領域を修飾す
ることにより、新たなＴＳＬＰ結合性抗体を創出するのに使用することができる。したが
って、本発明の別の態様では、本発明のＴＳＬＰ結合性抗体の構造的特徴を使用して、構
造的に類縁のＴＳＬＰ結合性抗体であって、ヒトＴＳＬＰに結合することなど、本発明の
抗体およびそれらの抗原結合性断片の、少なくとも１つの機能的特性を保持するＴＳＬＰ
結合性抗体を創出する。
例えば、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片の、１つもしくは複数のＣＤＲ領
域、またはそれらの突然変異を、公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと
、組換えにより組み合わせて、上記で論じた通り、さらなる、組換えにより操作された本
発明のＴＳＬＰ結合性抗体およびそれらの抗原結合性断片を創出することができる。他の
種類の修飾は、前出の節で記載した修飾を含む。操作法のための出発材料は、本明細書で
提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数、またはそれら
の１つもしくは複数のＣＤＲ領域である。操作抗体を創出するのに、本明細書で提示され
るＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数、またはそれらの１つも
しくは複数のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発
現させる）ことは必要ではない。そうではなくて、配列内に含有される情報を、元の配列
に由来する「第２世代の」配列を創出するための出発材料として使用し、次いで、「第２
世代の」配列を、タンパク質として調製し、発現させる。
改変抗体配列はまた、ＣＤＲ３配列、または米国特許出願公開第２００５０２５５５５
２号明細書において記載されている、最小限の不可欠な結合決定基を固定し、ＣＤＲ１配
列およびＣＤＲ２配列には多様性を持たせた抗体ライブラリーをスクリーニングすること
によっても調製することができる。スクリーニングは、ファージディスプレイ技術など、
抗体を、抗体ライブラリーからスクリーニングするのに適切な任意のスクリーニング技術
に従い実施することができる。
標準的な分子生物学の技法を使用して、改変抗体配列を調製し、発現させることができ
る。改変抗体配列によりコードされる抗体は、本明細書で記載されるＴＳＬＰ結合性抗体
の機能的特性であって、ヒトＴＳＬＰタンパク質に特異的に結合し、安定化させることを
含むがこれらに限定されない機能的特性のうちの１つ、一部、または全部を保持する抗体
である。
改変抗体の機能的特性は、実施例において示されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）な
ど、当技術分野において利用可能であり、かつ／または本明細書で記載される標準的なア
ッセイを使用して評価することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片を操作する方法
では、突然変異を、ＴＳＬＰ結合性抗体をコードする配列の全部または一部に沿って、ラ
ンダムに、または選択的に導入することができ、結果として得られる修飾ＴＳＬＰ結合性
抗体を、本明細書で記載される結合活性および／または他の機能的特性についてスクリー
ニングすることができる。当技術分野では、突然変異法が記載されている。例えば、Ｓｈ
ｏｒｔによるＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０９２７８０号は、飽和突然変異誘発、合成ライゲ
ーションアセンブリー、またはこれらの組合せを使用して、抗体の突然変異を創出し、ス
クリーニングするための方法について記載している。代替的に、ＬａｚａｒらによるＰＣ
Ｔ公開第ＷＯ０３／０７４６７９号は、コンピュータによるスクリーニング法を使用して
、抗体の生理化学的特性を最適化する方法について記載している。
本発明の抗体の特徴付け
本発明の抗体およびそれらの抗原結合性断片は、多様な機能的アッセイにより特徴付け
ることができる。例えば、それらは、ＴＳＬＰに結合し、ＴＳＬＰの活性を阻害するそれ
らの能力により特徴付けることができる。
ＴＳＬＰに結合する抗体の能力は、対象の抗体を標識することにより、直接的に検出す
ることもでき、抗体を標識せずに、当技術分野で公知の、多様なサンドイッチアッセイフ
ォーマットを使用して、結合を間接的に検出することもできる。
一部の実施形態では、本発明のＴＳＬＰ結合性抗体およびその抗原結合性断片は、基準
ＴＳＬＰ結合性抗体の、ＴＳＬＰポリペプチドへの結合を遮断するか、またはこれと競合
する。これらは、上記で記載した、完全ヒトＴＳＬＰ結合性抗体またはヒト化ＴＳＬＰ結
合性抗体でありうる。これらはまた、基準抗体と同じエピトープに結合する、他のヒトＴ
ＳＬＰ結合性抗体、マウスＴＳＬＰ結合性抗体、キメラＴＳＬＰ結合性抗体、またはヒト
化ＴＳＬＰ結合性抗体でもありうる。基準抗体の結合を遮断するか、またはこれと競合す
る能力は、被験下のＴＳＬＰ結合性抗体が、基準抗体により規定されるエピトープと同じ
であるかもしくは類似のエピトープ、または基準ＴＳＬＰ結合性抗体が結合するエピトー
プと十分に近位のエピトープに結合することを指し示す。このような抗体は、とりわけ、
基準抗体について同定される有利な特性を共有する可能性が高い。基準抗体を遮断するか
、またはこれと競合する能力は、例えば、競合的結合アッセイにより決定することができ
る。競合的結合アッセイでは、被験下の抗体を、基準抗体の、ＴＳＬＰポリペプチドなど
、共通の抗原への特異的結合を阻害する能力について検討する。過剰量の被験抗体が、基
準抗体の結合を実質的に阻害する場合、被験抗体は、抗原への特異的結合について、基準
抗体と競合する。実質的な阻害とは、被験抗体が、基準抗体の特異的結合を、通例、少な
くとも１０％、２５％、５０％、７５％、または９０％低減することを意味する。
抗体の、特定のタンパク質、この場合、ＴＳＬＰへの結合についての、基準抗体との競
合について評価するのに使用しうる、多数の公知の競合的結合アッセイが存在する。これ
らは、例えば、直接的固相イムノアッセイまたは間接的固相イムノアッセイ（ＲＩＡ）、
直接的固相イムノアッセイまたは間接的固相イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競
合アッセイ（Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253, 1983を参照されたい）
；直接的固相ビオチン−アビジンＥＩＡ（Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619
, 1986を参照されたい）；直接的固相標識アッセイ、直接的固相標識サンドイッチアッセ
イ（Harlow & Lane、前出を参照されたい）；Ｉ−１２５標識を使用する、直接的固相標
識ＲＩＡ（Morel et al., Molec. Immunol. 25:7-15, 1988を参照されたい）；直接的固
相ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung et al., Virology 176:546-552, 1990）；および
直接的標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82, 1990）を含む
。このようなアッセイは、非標識化被験ＴＳＬＰ結合性抗体または標識化基準抗体のいず
れかを保有する固体表面または細胞に結合させた精製抗原の使用を伴うことが典型的であ
る。競合的阻害は、被験抗体の存在下で、固体表面または細胞に結合した標識の量を決定
することにより測定する。通例、被験抗体は、過剰に存在する。競合アッセイ（競合抗体
）により同定される抗体は、基準抗体と同じエピトープに結合する抗体と、基準抗体が結
合するエピトープと、立体障害が生じる程度に十分に近位の隣接エピトープに結合する抗
体とを含む。
選択されたＴＳＬＰ結合性モノクローナル抗体が、固有のエピトープに結合するかどう
かを決定するために、市販の試薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ製
の試薬）を使用して、各抗体をビオチニル化することができる。非標識化モノクローナル
抗体およびビオチニル化モノクローナル抗体を使用する競合研究は、ＴＳＬＰポリペプチ
ドでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを使用して実施することができる。ビオチニル
化ＭＡｂの結合は、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼプローブにより検出す
ることができる。精製ＴＳＬＰ結合抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプ
ＥＬＩＳＡを実施することができる。例えば、マイクロ滴定プレートのウェルを、４℃で
一晩、１μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧによりコーティングすることができる。１％のＢＳＡ
によるブロッキングの後で、プレートを、１μｇ／ｍｌ以下の、ＴＳＬＰ結合性モノクロ
ーナル抗体または精製アイソタイプ対照と、雰囲気温度で、１〜２時間にわたり反応させ
る。次いで、ウェルを、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異的アルカリホスファターゼコ
ンジュゲートプローブと反応させることができる。次いで、精製抗体のアイソタイプを決
定しうるように、プレートを、現像および解析する。
ＴＳＬＰ結合性モノクローナル抗体の、ＴＳＬＰポリペプチドを発現する生細胞への結
合を裏付けるために、フローサイトメトリーを使用することができる。略述すると、ＴＳ
ＬＰを発現する細胞株（標準的な成長条件下で成長させた）を、０．１％のＢＳＡおよび
１０％のウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ中に多様な濃度のＴＳＬＰ結合性抗体と共に混合
し、３７℃で、１時間にわたりインキュベートすることができる。洗浄後、細胞を、一次
抗体染色と同じ条件下で、フルオレセイン標識化抗ヒトＩｇＧ抗体と反応させる。試料は
、単一の細胞にゲートをかけるように、光特性および側方散乱特性を使用する、ＦＡＣＳ
ｃａｎ装置により解析することができる。蛍光顕微鏡法を使用する代替的なアッセイを、
フローサイトメトリーアッセイ（に加えて、またはこれの代わりに）使用することができ
る。細胞は、上記で記載した通りに正確に染色し、蛍光顕微鏡法により検討することがで
きる。この方法は、個々の細胞の視覚化を可能とするが、抗原の密度に応じて、感度が低
下する場合がある。
本発明のＴＳＬＰ結合性抗体およびそれらの抗原結合性断片は、ウェスタンブロット法
により、ＴＳＬＰポリペプチドまたはＴＳＬＰ抗原性断片との反応性について、さらに調
べることができる。略述すると、精製ＴＳＬＰポリペプチドもしくは融合タンパク質、ま
たはＴＳＬＰを発現する細胞に由来する細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にかけることができる。電気泳動の後、分離された抗原を
、ニトロセルロース膜へと移し、１０％のウシ胎仔血清でブロッキングし、被験モノクロ
ーナル抗体でプローブする。抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを使用して、ヒトＩｇ
Ｇ結合を検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）で現像することができる。
機能的アッセイの例はまた、下記の実施例節でも記載する。
医薬組成物および製剤
本明細書ではまた、組成物、例えば、ＴＳＬＰに特異的に結合する、１つまたは複数の
分子、例えば、抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ミニボディ、また
はダイアボディなどの抗体断片を、有効成分として含む医薬組成物も提示される。
医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含むことが典型的である。薬学的に許容さ
れる賦形剤は、医薬の投与に適合性の、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌
剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含みうる。医薬組成物は、その意図さ
れる投与経路に適合性となるように製剤化することが典型的である。例えば、吸入による
投与のために、化合物は、適切な高圧ガス、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加
圧型容器または分注器または噴霧器から噴霧される、エアゾールの形態で送達することが
できる。このような方法は、米国特許第６，４６８，７９８号明細書において記載されて
いる方法を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提示される医薬組成物を、対象の気道、とりわけ、対
象の肺への標的化された送達のために製剤化する。このような製剤は、対象の上気道内の
有効成分の沈着を回避し、これにより、口腔および咽頭における薬物沈着と関連する、忍
容性問題または安全性問題を最小化することができる。一部の実施形態では、本明細書で
提示される医薬組成物を、乾燥粉末製剤として製剤化する。このような乾燥粉末製剤は、
有効成分、シェル形成賦形剤、ガラス形成賦形剤、および緩衝剤を含みうる。
有効成分
乾燥粉末製剤の有効成分は、本明細書で記載される抗ＴＳＬＰ抗体および抗体断片のう
ちの１つまたは複数を含みうる。
医薬製剤中の有効成分の量は、単位用量当たり、治療有効量の有効成分を送達して、所
望の結果を達成するように調整することができる。実際には、これは、特定の成分、その
活性、処置される状態の重症度、患者集団、投与要件、所望の治療効果、および組成物中
に含有される添加剤の相対量に応じて、大幅に変化するであろう。組成物は一般に、約１
重量％〜約９９重量％の有効成分、例えば、約５重量％〜約９５重量％、約１０重量％〜
約９０重量％、約１５重量％〜８５重量％、約２０重量％〜８０重量％、約２５重量％〜
７５重量％、約３０重量％〜７０重量％、約４０重量％〜６０重量％、または約５０重量
％の有効成分を含有するであろう。本発明の組成物は、特に、１日当たり０．００１ｍｇ
〜１日当たり１００ｍｇの用量、好ましくは、１日当たり０．０１ｍｇ〜１日当たり７５
ｍｇの用量で送達され、より好ましくは、１日当たり０．１０ｍｇ〜１日当たり５０ｍｇ
の用量で送達される有効成分に有用である。１つを超える有効成分を、本明細書で記載さ
れる製剤へと組み込むことができ、「有効成分」という用語の使用は、いかなる形であれ
、２つ以上のこのような有効成分の使用を除外しないことを理解されたい。
賦形剤
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤は、薬学的に許容される疎水
性シェル形成賦形剤を含有する。シェル形成賦形剤とは、噴霧乾燥粉末の分散性を増強す
る界面活性剤である。疎水性シェル形成賦形剤は、乾燥粉末製剤の組成および意図される
使用に少なくともある程度依存する多様な形態を取りうる。適切な、薬学的に許容される
疎水性賦形剤は一般に、長鎖リン脂質、疎水性アミノ酸、およびペプチド、ならびに長鎖
脂肪酸石鹸からなる群から選択することができる。
一部の実施形態では、シェル形成賦形剤は、グリシン、アラニン、バリン、トリロイシ
ン、ジロイシン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、
トリプトファン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホ
スファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、およびステアリン酸マグネシウムを含む。一部の実施
形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤は、トリロイシンを含む。
製剤および工程の制御により、噴霧乾燥粒子の表面を、主に、シェル形成賦形剤から構
成させることが可能である。表面濃度は、７５％または８０％または８５％を超えるなど
、７０％を超えうる。一部の実施形態では、表面は、９０％を超えるシェル形成賦形剤、
または９５％もしくは９８％もしくは９９％を超える疎水性賦形剤から構成される。強力
な有効成分のために、表面を、９５％を超えるシェル形成賦形剤から構成させることもま
れではない。
一部の実施形態では、シェル形成賦形剤は、ＥＳＣＡ（Electron Spectroscopy for Ch
emical Analysis；Ｘ線光電子分光法またはＸＰＳとしてもまた公知である）により測定
される、７０％を超える、好ましくは、９０％または９５％を超える粒子界面を含む。
一部の実施形態では、シェル形成賦形剤は、凹凸がある粒子形状の発生を容易とする。
これは、粒子形状が、滑らかではなく、多孔性であるか、ひだがあるか、コルゲートであ
るか、またはしわがあることを意味する。これは、吸入用医薬粒子の内面および／または
外面に、少なくとも部分的に、凹凸があることを意味する。この凹凸度は、粉末の流動化
および分散性を改善することにより、高送達効率、用量一貫性、および薬物の標的化をも
たらすのに有用である。粒子凹凸度の増大は、粒子が、ファンデルワールス接触距離内に
接近できないことの結果として、粒子間凝集力の減少をもたらす。凝集力の減少は、凹凸
がある粒子の集団内の粉末の流動化および分散を劇的に改善するのに十分である。
存在する場合、シェル形成賦形剤の含量は一般に、医薬の約１５〜５０％ｗ／ｗの範囲
である。トリロイシンでは、シェル形成剤としての許容可能な性能をもたらすのに、製剤
中、最小で約１５％が要求される。ロイシンでは、要求される最小含量はより大きく、約
３０％である。
トリロイシンなど、疎水性シェル形成賦形剤の使用は、液体原料中のそれらの可溶性に
より制限されうる。典型的に、加工粉末中のトリロイシンの含量は、３０％ｗ／ｗ未満で
あり、１０％ｗ／ｗ〜２０％ｗ／ｗ（約１０〜３０％ｗ／ｗ）のオーダーであることがよ
り多い。その水中で制限される可溶性およびその界面活性のために、トリロイシンは、優
れたシェル形成剤である。ロイシンもまた、シェル形成賦形剤として使用することができ
、本発明の実施形態は、約５０％〜７５％のロイシン濃度を含む粒子を含みうる。
脂肪酸石鹸は、ロイシンおよびトリロイシンと同様に挙動するので、適切な表面修飾剤
である。
乾燥イベントの時間スケールが短いために、原料中に溶解させた有効成分は一般に、噴
霧乾燥させた医薬品中でアモルファス固体として存在するであろう。
アモルファス固体の分子運動性は、その結晶質対応物の分子運動性と比較した場合に著
明である。分子運動性は、分子拡散と関連する、長距離運動のほか、結合の回転など、局
所的な運動も含む。アモルファス材料の固体状態安定化の中心原理は、分子運動性が、所
望されない物理化学的変化をもたらすことである。したがって、アモルファス材料のため
の製剤戦略は通例、分子運動性の抑制に焦点を当てる。
分子運動性と不安定性との関係の存在は、直観的かつ周知である。しかし、有用である
ために、分子運動性は、存在する運動の種類との関係で、注意深く規定および理解しなけ
ればならない。長距離分子運動は、α緩和として公知の、構造的緩和から生じる。このよ
うな運動の時間スケールは、温度が、ガラス転移温度（Ｔｇ）を下回って低下するか、ま
たは、逆に、Ｔｇが一定の観察温度に上昇すると、顕著に増大する。ガラス内の分子の安
定化は、その長距離分子運動性を制限するため、これは、アモルファス薬物の固体状態安
定化のための、最も一般的な製剤戦略となっている。
固体状態下にある分子運動性のガラス安定化制御であって、ガラス形成剤の使用を介す
る制御などの制御は、製剤中のタンパク質の物理化学的安定性を改善しうる。ガラス形成
剤が必要とされる場合、複数の検討事項が、その選択を支配するであろう。ガラス形成賦
形剤の主要な役割は、薬物の全体的な長距離分子運動性を低減することである。実際には
、これは、薬物を含有するアモルファス相のガラス転移温度を上昇させることにより達せ
られる。Ｔｇ値が高い賦形剤が一般に所望されるが、一部の製剤（例えば、薬物のＴｇが
中程度であるか、または製剤中の薬物濃度が低濃度である場合）には、Ｔｇが中程度の賦
形剤も適しうる。配合を行う者への手引きとして、理想的なガラス形成剤の特性：ガラス
転移温度が高い、生体適合性材料であって、薬物と混和可能な生体適合性材料であること
、水によりごく弱く可塑化される、単一のアモルファス相を形成することを強調すること
は有意義である。
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤は、ガラス形成賦形剤を含有
する。長距離分子運動性を抑制するガラス形成賦形剤は、炭水化物、アミノ酸、および緩
衝剤を含む。一部の実施形態では、ガラス形成賦形剤は、ヒスチジン、ヒスチジンＨＣｌ
、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびクエン酸ナトリウムを含む。したが
って、ヒスチジンなど、一部の賦形剤は互換的に、緩衝剤またはガラス形成賦形剤と称し
うる。一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤、例えば、コア−シェル
製剤は、トレハロースを含む。
薬学文献では、他の種類の分子運動の重要性も、ますます認識されるようになっている
。分子運動の種類を指示するのに使用される用語法（α、βなど）は、広帯域誘電分光法
に由来する。誘電緩和スペクトルは従来、周波数スケール上にプロットされている。これ
らのスペクトルを解釈する場合、最低周波数における誘電喪失ピークをα運動、高周波数
の運動をβ運動、次いで、γ運動などと呼ぶ。したがって、高周波数で生じるβ運動およ
び他の運動を、「速い」運動または二次運動と称する（そして、場合によって、ジョハリ
−ゴールドスタイン緩和と称する）。これらの二次緩和は、異なる分子部分（例えば、タ
ンパク質上の側鎖）の分子内運動に帰せられることが多いが、これらは、非可撓性の分子
にも存在する。最も単純な物理的描像では、β運動は、場合によって、その最も近傍の近
隣分子種間でトラップされる分子種の、ランダムな「ケージラットリング」として記載さ
れる。ある点で、最も近傍の近隣分子種の局所運動は、トラップされた種の拡散性ジャン
プを可能とするのに十分な自由容積をもたらす。これがα運動である。したがって、β運
動は、α運動をもたらす。
二次運動は、理論および実践の両面から、活動的な研究領域である。そして、大半の文
献では、凍結乾燥させるかまたはメルトクエンチしたガラスが関わるが、その原理は、吸
入のためのアモルファスの加工粒子（例えば、噴霧乾燥またはある特定の他のボトムアッ
プ工程を使用して製造される粉末）にも当てはまる。Ｔｇ近傍における低分子の結晶化は
、β運動から生じることが疑われている。タンパク質の配合を行う者は、これらのβ運動
を制御することの重要性を認識した。アモルファス製剤中のβ運動の抑制は典型的に、グ
リセロール、マンニトール、ソルビトール、およびジメチルスルホキシドなどの有機低分
子賦形剤によりなされる。これらが、β運動を抑制することが最もしばしば報告される賦
形剤であるが、他の有機低分子量分子（例えば、緩衝塩または対イオン）も、この目的で
用いられる。これらの賦形剤は、局所的な粘度を増大させることにより、高運動性ドメイ
ンの運動を抑制すると仮定されている。ガラス安定化についての膨大な文献に精通した読
者にとって、このような賦形剤の使用は、直観に反すると考えられうるだろう。これらの
低分子量材料および他の最低分子量材料は、Ｔｇ値が低く、製剤のＴｇを低減するが、こ
れは、可塑化として公知の現象である。しかし、これらの賦形剤はまた、β運動も減衰さ
せうる。したがって、これらの賦形剤を、基準点に応じて、逆可塑剤、または、場合によ
って、可塑剤と称するが、これらは、α運動を可塑化し、β運動を逆可塑化する。この用
語法は、文献における、誤解の潜在的な供給源であることに留意されたい。可塑剤または
逆可塑剤という材料の呼称は、基準点がα運動であるのか、二次運動であるのかに依存す
る。
タンパク質の固体状態安定化は、ガラスマトリックスの製剤化を要求するため、α運動
およびβ運動の寄与が特に対象となる。文献では、ガラス形成剤を使用して、タンパク質
を安定化させることについて、多数の言及があるが、近年まで、これらの薬剤の、局所運
動への影響についての具体的な言及はほとんど見られなかった。タンパク質のガラス転移
温度は、測定が難しいが、大半のデータは、Ｔｇ＞１５０℃を示唆する。したがって、タ
ンパク質を安定化させるのに最も一般に使用される賦形剤（例えば、スクロースまたはト
レハロースなどの二糖）はまた、タンパク質内のα運動を可塑化する（そして、二次運動
を逆可塑化する）。近年の研究は、β運動が、大部分、糖ガラス中のタンパク質の安定性
を支配することを裏付けている。したがって、二糖は、タンパク質製剤中のβ運動を逆可
塑化する。
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤は、ガラス転移温度が高い（
＞８０℃）ガラス形成賦形剤を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉
末製剤は、スクロース、トレハロース、マンニトール、フマリルジケトピペラジン、およ
びクエン酸ナトリウムなどのガラス形成剤を含む。
ガラス形成剤の混合物を使用して、アモルファス固体の最適の安定化を達成することが
できる。一部の実施形態では、「プラットフォーム」コア−シェル製剤のために、トレハ
ロースと、マンニトールとの混合物を使用する。
分子運動性の抑制を達成し、物理化学的安定性を達成するのに要求されるガラス形成剤
の量は、活性薬剤の性質に依存するであろう。噴霧乾燥タンパク質を伴う一部の実施形態
では、ガラス形成剤の、タンパク質に対するモル比は、３００〜９００の範囲でありうる
。低分子では、要求されるガラス形成剤の量は、活性薬剤のＴｇに依存するであろう。
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤は、緩衝剤を含有する。緩衝
剤は、生理学的に適合性のｐＨで薬物を送達する（すなわち、忍容性を改善する）手段と
してのほか、薬物の化学的安定性に好適な溶液状態をもたらす手段として、ｐＨ制御で知
られている。本明細書で記載される、一部の製剤および工程では、薬物と緩衝剤とを、同
じ粒子内で共製剤化することにより、薬物のｐＨ環境を制御することができる。
固体状態の医薬品中のｐＨの意味を問題とすることは当然であり、多数の研究が、固体
状態の化学的安定性に対する、ｐＨ制御の重要性を裏付けている。水は、固体状態にある
「乾燥」粉末製剤中でなお遍在する。アモルファス材料の可塑剤としてのその役割に加え
て、水は、反応物質、分解生成物であり、また、溶解および化学反応のための媒介物とし
ても用いられうる。粒子表面への水の吸着は、表面薄膜内で、飽和溶液を結果としてもた
らすという証拠がある。実際、一部の研究では、薬物スラリー（すなわち、飽和溶液）の
ｐＨを、「乾燥」粉末の表面薄膜内に溶解した薬物の局所ｐＨまたは「微小環境」ｐＨの
指標として使用している。微小環境ｐＨは、場合によって、薬物の安定性に関連すること
が示されている。
薬物と同様に、賦形剤もまた、吸着した水の表面薄膜中に溶解して、飽和溶液を形成す
る。配合を行う者は、これを利用して、吸着水分層内の局所ｐＨの制御を可能としうる。
一般に、ヒスチジンまたはリン酸などの、緩衝剤またはｐＨ修飾剤を、凍結乾燥製剤中ま
たは噴霧乾燥製剤中で使用して、タンパク質の、溶液状態および固体状態における化学的
分解を制御する。
一部の実施形態では、製剤のための緩衝剤は、ヒスチジン、グリシン、酢酸、およびリ
ン酸を含む。
任意選択の賦形剤は、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、クエン酸ナトリ
ウム）、抗酸化剤（例えば、メチオニン）、溶液中のタンパク質の凝集を低減する賦形剤
（例えば、アルギニン）、矯味剤、および高分子の、全身循環への吸収を改善するように
デザインされた薬剤（例えば、フマリルジケトピペラジン）を含む。
製剤
本明細書では、平均的な成人対象の中咽頭における沈着を効果的に回避する噴霧乾燥粒
子を含み、医薬の肺への標的化された送達を可能とする乾燥粉末製剤が提示される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤の粒子は、平均的な成人対象
に対する、名目用量の８０〜９５％ｗ／ｗの間、例えば、８５〜９０％ｗ／ｗの間のｉｎ
ｖｉｔｒｏ総肺用量（ＴＬＤ）を有する。
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤の粒子は、平均的な成人対象
に対する、送達用量の９０〜１００％ｗ／ｗの間、例えば、９０〜９５％ｗ／ｗの間のｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ総肺用量（ＴＬＤ）を有する。
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤は、１２０〜４００μｍ２Ｌ
／分の間、例えば、１５０〜３００μｍ２Ｌ／分の間の慣性パラメータを有することが適
切な送達用量を含む。
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤は、多孔性表面、コルゲート
表面、または凹凸表面を含む加工粒子を含む。このような粒子は、一次粒子サイズが同等
な微粒化薬物結晶と比較した、粒子間凝集力の低減を呈する。これは、微粒化薬物と、粗
ラクトースとの秩序混合物と比べた、粉末の流動化および分散性の改善をもたらす。
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤の粒子は、１．５を超える、
例えば、１．５〜２０、３〜１５、または５〜１０の凹凸度を有する。
一部の医薬有効成分、例えば、多くのペプチドまたはタンパク質（例えば、抗ＴＳＬＰ
Ｆａｂ）のために、純粋な薬物の噴霧乾燥を介して、凹凸表面を達成することができる
。このような場合、製剤は、１００％ｗ／ｗの活性薬剤または薬物である、純粋な薬物を
含みうる。
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤は、薬物および緩衝剤を含む
。製剤は、７０％〜９９％ｗ／ｗの薬物または活性薬剤を含むことが可能であり、残りは
緩衝剤である。
一部の実施形態では、本明細書で記載される製剤は、０．１〜９９％ｗ／ｗの活性薬剤
、または０．１〜７０％ｗ／ｗの活性薬剤、または０．１〜５０％ｗ／ｗの有効成分、ま
たは０．１％〜３０％ｗ／ｗの有効成分を含みうる。
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤は、製剤の安定性または生体
適合性をさらに増強するように、賦形剤を含みうる。例えば、多様な塩、緩衝剤、抗酸化
剤、シェル形成賦形剤、およびガラス形成賦形剤が想定される。
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤の粒子は、０．８〜２．０μ
ｍの間、例えば、１．０〜１．５μｍの間の、質量中央径（ｘ５０）として表される幾何
学サイズを有する。
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤の粒子は、２．０μｍ〜４．
０μｍの間、例えば、２．５μｍ〜３．５μｍの間の、ｘ９０として表される幾何学サイ
ズを有する。
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤の粒子は、０．０３〜０．４
０ｇ／ｃｍ３の間、例えば、０．０７〜０．３０ｇ／ｃｍ３の間の、タップ密度（ρｔａ
ｐｐｅｄ）を有する。
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤の一次粒子は、０．１〜１．
０μｍの間、例えば、０．５〜０．８μｍの間の、計算による空気動力学的サイズの中央
値（Ｄａ）を有する。
一部の実施形態では、本明細書で記載される乾燥粉末製剤の粒子は、０．５〜１．２μ
ｍの間、例えば、０．８〜１．０μｍの間の、計算による空気動力学径を有する。
一部の実施形態では、送達用量中に存在する、本明細書で記載される乾燥粉末製剤の粒
子は、１．０〜３．０μｍの間、例えば、１．５〜２．０μｍの間の、空気動力学質量中
央径（ＭＭＡＤ）を有することが適切である。
一部の実施形態では、本開示の製剤は、シェルおよびコア：粒子表面に存在するシェル
形成剤としてのトリロイシンと、有効成分（例えば、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ）、トレハロー
ス、またはトレハロースおよびマンニトールの組合せ、ならびに緩衝剤を含むコアとを含
む粒子を含有する。
一部の実施形態では、本発明は、約４０％（ｗ／ｗ）のＴＳＬＰ結合性分子、例えば、
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１、約２５％（ｗ／ｗ）のトリロイシン、約３０％（ｗ／ｗ）のトレ
ハロースおよびマンニトールの組合せ、ならびに約５％（ｗ／ｗ）のヒスチジンを含む製
剤を提供する。他の実施形態では、本出願は、約５０％（ｗ／ｗ）のＴＳＬＰ結合性分子
、約１５％（ｗ／ｗ）のトリロイシン、約２．６％（ｗ／ｗ）のＨＣｌ、約５．６％（ｗ
／ｗ）のヒスチジン、ならびに約２６．８％（ｗ／ｗ）のトレハロースおよび塩基の組合
せ；または約５０％（ｗ／ｗ）のＴＳＬＰ結合性分子、約１５％（ｗ／ｗ）のトリロイシ
ン、約１９．４％（ｗ／ｗ）のトレハロース、約１３％（ｗ／ｗ）のヒスチジン、および
約２．６％（ｗ／ｗ）のＨＣｌを含む製剤を提示する。
さらなる実施形態では、本出願は、乾燥粉末吸入器から送達可能な粒子を含む、担体を
含有しない医薬組成物であって、本明細書で開示される抗ＴＳＬＰ分子を含み、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ総肺用量が、送達用量のうちの９０％を超え、送達用量中の粒子が、１２０〜４
００μｍ２Ｌ／分の間の慣性パラメータを有する、組成物を開示する。
別の実施形態では、本出願は、乾燥粉末吸入器から送達可能な、担体を含有しない医薬
組成物であって、本明細書で開示される抗ＴＳＬＰ分子、および少なくとも１つのガラス
形成賦形剤を含むコアと、疎水性賦形剤および緩衝剤を含むシェルとを含む複数の粒子を
含み、ｉｎ ｖｉｔｒｏ総肺用量が、送達用量のうちの９０％ｗ／ｗを超える、組成物を
開示する。一部の実施形態では、噴霧乾燥により、粒子を形成する。別の実施形態では、
疎水性賦形剤は、トリロイシンを含む。
さらなる実施形態では、本出願は、乾燥粉末吸入器から送達可能な、複数の一次粒子お
よび粒子凝集物を含む、担体を含有しない医薬組成物であって、本明細書で開示される抗
ＴＳＬＰ分子を含み、ｉｎ ｖｉｔｒｏ総肺用量（ＴＬＤ）が、名目用量のうちの８０％
を超え、一次粒子が、コルゲート形状；０．３〜１．０μｍの間の空気動力学中央径（Ｄ
ａ）を特徴とし、乾燥粉末吸入器から送達される粒子および粒子凝集物が、１．５〜３．
０μｍの間の空気動力学質量中央径（ＭＭＡＤ）を有する、組成物を開示する。一部の実
施形態では、医薬組成物は、一次粒子を含有するための容器と、乾燥粉末吸入器内のそれ
らのエアゾール化の前に、粒子を含有するのに適する容器とをさらに含み、この場合、前
記エアゾール化時に、吸入可能な凝集物を含むエアゾールが形成される。
さらなる実施形態では、本出願は、肺送達のための医薬粉末製剤であって、粉末が、１
〜１００重量％の、本明細書で開示される抗ＴＳＬＰ分子を含む粒子を含み、粉末が、少
なくとも５０％が、１〜１．５ミクロンの間にある粒子サイズ分布、または０．０５〜０
．３ｇ／ｃｍ３の粉末密度、２ミクロン未満の空気動力学径、１．５〜２０の凹凸度を特
徴とし、粉末が、吸入により投与され、８０％を超えるｉｎ ｖｉｔｒｏ総肺用量をもた
らす、医薬粉末製剤を開示する。一部の実施形態では、医薬粉末製剤は、担体を含まない
。他の実施形態では、粉末を、乾燥粉末吸入器を伴う使用のために、容器内にパッケージ
ングし、前記乾燥粉末吸入器を使用してエアゾール化すると、粉末は、約２ミクロン未満
の空気動力学質量中央径を有する、吸入可能な凝集物を特徴とする。
工程
本明細書ではまた、噴霧乾燥粒子を含む、吸入のための乾燥粉末製剤を調製するための
工程であって、製剤が、少なくとも１つの有効成分を含有し、平均的な成人対象に対する
、名目用量の８０〜９５％ｗ／ｗの間、例えば、８５〜９０％ｗ／ｗの間のｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ総肺用量（ＴＬＤ）を有する、工程も提示される。
本明細書ではまた、噴霧乾燥粒子を含む、吸入のための乾燥粉末製剤を調製するための
工程であって、製剤が、少なくとも１つの有効成分を含有し、平均的な成人対象に対する
、送達用量の９０〜１００％ｗ／ｗの間、例えば、９０〜９５％ｗ／ｗの間のｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ総肺用量（ＴＬＤ）を有する、工程も提示される。
一部の実施形態では、乾燥粉末製剤は、閉塞性または炎症性の気道疾患、特に、喘息お
よび／またはＣＯＰＤを処置するのに適する、少なくとも１つの有効成分、例えば、抗Ｔ
ＳＬＰ Ｆａｂを含有する。一部の実施形態では、乾燥粉末製剤は、全身循環において、
疾患を非侵襲的に処置するのに適する、少なくとも１つの有効成分を含有する。
噴霧乾燥は、吸入のための加工粒子を作製するときの利点であって、乾燥粉末を迅速に
作製する能力、ならびにサイズ、形状、密度、および表面組成を含む粒子属性の制御など
の利点を付与する。乾燥工程は、極めて迅速である（ミリ秒のオーダーである）。結果と
して、液相中で溶解させた大半の有効成分は、結晶化するのに十分な時間がないので、ア
モルファス固体として沈殿する。
噴霧乾燥は、４つの単位操作：原料の調製、ミクロンサイズの液滴を作製する、原料の
アトマイゼーション、高温のガス中の液滴の乾燥、およびバグハウスまたはサイクロン分
離器による乾燥粒子の回収を含む。
一部の実施形態では、乾燥粉末粒子を作製する工程は、３つのステップを含むが、一部
の実施形態では、これらのステップのうちの２つ、なおまたは３つ全てを、実質的に同時
に実行しうるので、実際の実践においては、工程を、単一ステップの工程として考えるこ
とができる。本発明の工程について記載することだけを目的として、３つのステップを別
個に記載するが、このような記載は、３ステップ工程に限定されることを意図するもので
はない。
一部の実施形態では、工程は、溶液原料を調製するステップと、原料を噴霧乾燥させて
、活性の乾燥粉末粒子をもたらすステップとを含む。原料は、水性ベースの液体原料中に
溶解させた、少なくとも１つの有効成分を含む。一部の実施形態では、原料は、添加され
た共溶媒を含む水性ベースの原料中に溶解させた、少なくとも１つの有効成分（例えば、
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１）を含む。一部の実施形態では、原料は、エタノール／水原料中に
溶解させた、少なくとも１つの活性薬剤を含み、この場合、エタノールの画分は、５％〜
３０％ｗ／ｗの間、例えば、５％〜２０％ｗ／ｗの間である。
アモルファス固体では、医薬品の水分含量を制御することが重要である。水和物でない
薬物では、粉末中の水分含量は、５％未満、より典型的には、３％未満、なおまたは２％
ｗ／ｗであることが好ましい。水分含量は、十分に大きくなければならないが、粉末が著
明な静電引力を呈しないことを確保する程度の大きさでなければならない。噴霧乾燥粉末
中の水分含量は、カールフィッシャー滴定法により決定しなければならない。
一部の実施形態では、原料を、加熱され、濾過された空気の流れであって、溶媒を蒸発
させ、乾燥生成物を回収器へと運ぶ流れへと噴霧する。次いで、使用済みの空気から溶媒
を枯渇させる。結果として得られる乾燥粒子の、要求される粒子サイズ、水分含量、およ
び生産収率をもたらすために、インレットおよびアウトレットの温度、フィード速度、ア
トマイゼーション圧力、乾燥空気の流量、ならびにノズル構成など、噴霧乾燥器の作動条
件を調整することができる。適切な装置および工程条件の選択は、本明細書の教示を念頭
に置いた当業者の視野の中にあり、不要な実験を伴わずに達することができる。ＮＩＲＯ
（登録商標）ＰＳＤ−１（登録商標）ｓｃａｌｅ ｄｒｙｅｒのための例示的な設定は、
以下の通り：空気インレット温度：約１１０℃〜約１７０℃の間など、約８０℃〜約２０
０℃の間；空気アウトレット：約６０℃〜１００℃の間など、約４０℃〜約１２０℃の間
；液体フィード速度：約５０ｇ／分〜１００ｇ／分の間など、約３０ｇ／分〜約１２０ｇ
／分の間；約１６０標準立方フィート（ｓｃｆｍ）〜２１０ｓｃｆｍなど、１分間当たり
約１４０ｓｃｆｍ〜約２３０ｓｃｆｍの総空気流量；およびアトマイゼーション空気流量
：約４０ｓｃｆｍ〜８０ｓｃｆｍの間など、約３０ｓｃｆｍ〜約９０ｓｃｆｍの間である
。噴霧乾燥原料中の固体含量は、典型的に、１．０％のｗ／ｖ〜５．０％のｗ／ｖなど、
０．５％ｗ／ｖ（５ｍｇ／ｍｌ）〜１０％のｗ／ｖ（１００ｍｇ／ｍｌ）の範囲内の固体
含量であろう。当然ながら、設定は、使用されるスケールおよび装置の種類、ならびに利
用される溶媒系の性質に応じて変化するであろう。いずれにせよ、これらおよび類似の方
法の使用は、エアゾールの肺への沈着に適切な直径を伴う粒子の形成を可能とする。
一部の実施形態では、賦形剤は全て、原料中で溶解させ、分散させた有効成分上のコア
−シェルコーティングは、溶解させた溶質の物理的特性の差違により駆動される。
アモルファスの有効成分を含む粒子について既に論じた通り、粒子表面の性質および形
状は、原料中の成分の可溶性および拡散性を制御することにより制御する。界面活性の疎
水性賦形剤（例えば、トリロイシン、リン脂質、脂肪酸石鹸）は、界面において濃縮され
、粒子の表面粗さの増大もまた駆動しながら、粉末の流動化および分散性を改善しうる。
任意の噴霧乾燥ステップおよび／または噴霧乾燥ステップの全ては、吸入により投与さ
れる医薬品における使用のための噴霧乾燥粒子を調製するのに使用される従来の装置を使
用して実行することができる。市販の噴霧乾燥器は、Ｂｕｃｈｉ Ｌｔｄ．製およびＮｉ
ｒｏ Ｃｏｒｐ．製の噴霧乾燥器を含む。
一部の実施形態では、原料を、二連の流体ノズルによりアトマイズする。固体ロード量
が約１．５％ｗ／ｗを上回ると、液滴の粒子サイズ分布の著明な拡大が生じる。分布のテ
ール部における大型サイズの液滴は、対応する粉末分布内で大型の粒子を結果としてもた
らす。結果として、二連の流体ノズルを伴う、一部の実施形態は、固体ロード量を、１．
０％ｗ／ｗまたは０．７５％ｗ／ｗなど、１．５％ｗ／ｗ以下へと制限する。
一部の実施形態では、狭い液滴サイズ分布は、例えば、米国特許第７，９６７，２２１
号明細書および同第８，６１６，４６４号明細書において開示されている、平面薄膜型ア
トマイザーにより、高固体ロード量で達成することができる。一部の実施形態では、原料
を、２％〜１０％ｗ／ｗの間など、３％〜５％ｗ／ｗの間の固体ロード量でアトマイズす
る。
一部の実施形態では、粒子集団密度またはＰＰＤは、０．０３×１０−６〜０．２×１
０−６の間など、０．０１×１０−６〜１．０×１０−６の間である。
一部の実施形態では、ＥｔＯＨ／固体比は、３．０〜１０．０の間など、１．０〜２０
．０の間である。
一部の実施形態では、本出願は、吸入のための医薬粉末製剤であって、
ａ．本明細書で開示される抗ＴＳＬＰ結合性分子の溶液を、水／エタノール混合物中で
調製するステップであって、エタノールが、１〜２０％の間で存在し、エタノールの、総
固体に対する比が、１〜２０の間である、ステップと；
ｂ．溶液を噴霧乾燥させて、微粒子を得るステップであって、微粒子が、０．２ｇ／ｃ
ｍ３以下の粒子密度、１〜３ミクロンの幾何学径、および１〜２ミクロンの空気動力学径
を特徴とする、ステップと
を含み、
粉末が、吸入により投与されると、約８０％を超えるｉｎ ｖｉｔｒｏ総肺用量をもた
らす、
工程により作製される粒子を含む医薬粉末製剤を開示する。一部の実施形態では、医薬粉
末製剤は、ガラス形成賦形剤もさらに含む。一部の実施形態では、ガラス形成賦形剤は、
アルファ型ガラス形成賦形剤を含む。他の実施形態では、ガラス形成賦形剤は、ベータ型
ガラス形成賦形剤を含む。さらなる実施形態では、ガラス形成賦形剤は、トレハロースを
含む。
医薬粉末製剤の一部の実施形態では、粒子集団密度は、０．０１×１０−６〜１．０×
１０−６の間である。
本出願はまた、対象の肺へと、乾燥粉末を含む粒子を送達する方法であって、
ａ．本明細書で開示される抗ＴＳＬＰ結合性分子の溶液を、水／エタノール混合物中で
調製するステップであって、エタノールが、５〜２０％の間で存在する、ステップと、
ｂ．溶液を噴霧乾燥させて、微粒子を得るステップであって、微粒子が、約０．０５〜
０．３ｇ／ｃｍ３の間の粒子密度、１〜３ミクロンの幾何学径、および１〜２ミクロンの
空気動力学径を特徴とする、ステップと；
ｃ．噴霧乾燥させた粉末を、容器内にパッケージングするステップと；
ｄ．粉末を抽出するための手段を有する吸入器を容器に備え付けるステップであって、
吸入器が、粉末を流動化およびエアゾール化する手段をさらに有し、吸入器が、患者駆動
型の約２〜約６ｋＰａの吸気労作にわたり作動可能であり、吸入器および粉末が、併せて
、約１２０〜４００μｍ２Ｌ／分の間の慣性パラメータをもたらし、粉末が、吸入により
投与されると、少なくとも９０％の肺沈着をもたらす、ステップとを含む方法も開示する
。
本出願はまた、肺送達のための乾燥粉末医薬製剤を調製する方法であって、
ａ．本明細書で開示される抗ＴＳＬＰ結合性分子の溶液を、水／エタノール混合物中で
調製するステップであって、エタノールが、５〜２０％の間で存在する、ステップと、
ｂ．溶液を噴霧乾燥させて、微粒子を得るステップであって、微粒子が、約０．０５〜
０．３ｇ／ｃｍ３の間の粒子密度、１〜３ミクロンの幾何学径、および１〜２ミクロンの
空気動力学径を特徴とする、ステップと
を含む方法も開示する。
さらなる実施形態では、本出願は、乾燥粉末吸入器から送達可能な粉末医薬組成物であ
って、本明細書で開示される抗ＴＳＬＰ結合性分子を含む粒子を含み、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
総肺用量が、送達用量のうちの９０％ｗ／ｗを超え、組成物が、担体を含まないこと、粒
子密度が０．０５〜０．３ｇ／ｃｍ３であること；粒子凹凸度が３〜２０であること；粒
子が、エタノール：水混合物から噴霧乾燥させるステップを含む工程により作製されてい
ること；および粒子が、１〜２０の間のエタノール：固体比を有する、エタノール：水混
合物から噴霧乾燥させるステップを含む工程により作製されていることのうちの少なくと
も１つの特徴を含む、粉末医薬組成物を開示する。一部の実施形態では、粉末医薬組成物
は、特徴のうちの少なくとも２つを含み；他の実施形態では、粉末医薬組成物は、特徴の
うちの少なくとも３つを含む。
投与量
抗ＴＳＬＰ抗体またはそれらの断片を含む医薬組成物を含む、本明細書で開示される抗
ＴＳＬＰ分子の投与量、毒性、および治療的有効性は、細胞培養物または実験動物におい
て、例えば、ＬＤ５０（集団のうちの５０％に対して致死性である用量）およびＥＤ５０
（集団のうちの５０％において治療的に有効な用量）を決定するための標準的な薬学手順
により決定することができる。毒性作用と治療効果との用量比を、治療指数とし、ＬＤ５
０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高治療指数を呈する化合物が所望される。毒
性副作用を呈する化合物も、使用しうるが、このような化合物を、非感染細胞に対する潜
在的な損傷を最小化し、これにより、副作用を低減するために、罹患組織の部位へと標的
化する送達系をデザインするように注意を払うべきである。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトにおける使用のための投
与量範囲の処方において使用することができる。このような化合物の投与量は、毒性をほ
とんどまたは全く伴わずに、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投
与量は、利用される剤形および用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化しうる。
本発明の方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量はまず、細胞培養
アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養物中で決定されるＩＣ５０（すな
わち、症状の最大半量の阻害を達成する化合物の濃度）を含む、循環血漿濃度範囲を達成
するように、動物モデルにより処方することができる。このような情報を使用して、ヒト
において有用な用量を、より正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高
速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
キット
本明細書ではまた、本明細書で提示される医薬組成物、医薬組成物を対象に送達するた
めのデバイス、使用のための指示書のうちの１つまたは複数を含むキットも提示される。
一部の実施形態では、デバイスは、医薬組成物を、エアゾール化形態で送達しうる。一部
の実施形態では、デバイスは、吸入器、例えば、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）である。他の
実施形態では、デバイスは、定量吸入器または噴霧器でありうる。
適切な乾燥粉末吸入器は、乾燥粉末をカプセル内またはブリスター内に保管した、単位
用量吸入器を含み、患者は、使用の前に、カプセルまたはブリスターのうちの１つまたは
複数を、デバイスへと装填する。代替的に、用量を、二重フォイルブリスター内、例えば
、カートリッジ内、ストリップ内、またはホイール内にあらかじめパッケージングした、
複数回投与用の乾燥粉末吸入器も想定される。
乾燥粉末吸入器は、ＤＩＳＫＵＳ（商標）（ＧＳＫ；米国特許第６５３６４２７号明細
書において記載されている）、ＤＩＳＫＨＡＬＥＲ（商標）（ＧＳＫ；国際特許出願公開
第ＷＯ９７／２５０８６号パンフレットにおいて記載されている）、ＧＥＭＩＮＩ（商標
）（ＧＳＫ；国際特許出願公開第ＷＯ０５／１４０８９号パンフレットにおいて記載され
ている）、ＧＹＲＯＨＡＬＥＲ（商標）（Ｖｅｃｔｕｒａ；国際特許出願公開第ＷＯ０５
／３７３５３号パンフレットにおいて記載されている）、およびＰＲＯＨＡＬＥＲ（商標
）（Ｖａｌｏｉｓ；国際特許出願公開第ＷＯ０３／７７９７９号パンフレットにおいて記
載されている）など、複数回投与用の乾燥粉末吸入器を含む。
単回投与用の乾燥粉末吸入器は、ＡＥＲＯＬＩＺＥＲ（商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ；米
国特許第３９９１７６１号明細書において記載されている）およびＢＲＥＥＺＨＡＬＥＲ
（商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ；米国特許第８４７９７３０号明細書（Ziegler et al.）に
おいて記載されている）を含む。他の適切な単回投与用の吸入器は、米国特許第８０６９
８５１号および同第７５５９３２５号に記載されている吸入器を含む。
一部の患者が、毎日１回の投与を要求する医薬を送達するための使用を容易かつより簡
便であると見出す、単位用量ブリスター吸入器は、米国特許第８５７３１９７号明細書（
Axford et al.）において記載されている吸入器を含む。
一部の実施形態では、吸入器は、粉末を流動化および分散させるためのエネルギーを、
患者が与える、複数回投与用の乾燥粉末吸入器（すなわち、「受動的」ＭＤ−ＤＰＩ）で
ある。本発明の粉末は、小さなピーク吸入流量（ＰＩＦ）で、効果的に流動化および分散
する。結果として、観察されるＰＩＦに伴う粉末分散の変化が小さいことにより、ＰＩＦ
の増大に伴う慣性衝突の増大が効果的に調整され、流量に依存しない肺沈着がもたらされ
る。本発明の粉末について観察される、流量依存性の非存在は、患者間のばらつきの全体
的な低減を駆動する。
使用のための指示書は、ＴＳＬＰ関連炎症性状態の診断または処置のための指示書を含
みうる。本明細書で提示されるキットは、本明細書で記載される方法のうちのいずれかに
従い使用することができる。当業者は、本明細書で提示されるキットに適する他の使用に
精通しており、このような使用のためにキットを利用することが可能であろう。本明細書
で提示されるキットはまた、解析のための試料を、例えば、検査室へと返送するのに使用
しうる、郵送用資材（例えば、郵送料前納封筒または郵送梱包材）も含みうる。キットが
試料のための１つまたは複数の容器を含む場合もあり、試料を標準的な血液回収バイアル
内に入れる場合もある。キットはまた、説明同意文書書式、検査依頼書式、および本明細
書で記載される方法により、どのようにしてキットを使用するのかについての指示書のう
ちの１つまたは複数も含みうる。本明細書にはまた、このようなキットを使用するための
方法も含まれる。書式（例えば、検査依頼書式）および試料を保持する容器のうちの１つ
または複数を、例えば、試料を供与した対象を同定するためのバーコードでコード化する
ことができる。
処置法
本明細書では、対象に、治療有効量の、本明細書で記載されるＴＳＬＰ結合性分子また
はその医薬組成物のうちのいずれかを投与することにより、その処置を必要とする対象、
例えば、ヒトにおける、ＴＳＬＰ関連状態を処置する方法が提示される。一部の実施形態
では、このような方法は、ＴＳＬＰ関連炎症性状態の処置を必要とする対象を同定および
選択するステップもさらに含む。本発明はまた、患者における疾患を処置または防止する
ための、本明細書で記載されるＴＳＬＰ結合性分子またはその医薬組成物の使用も提供す
る。一部の実施形態では、本発明は、患者における疾患の処置または防止における使用の
ための、本明細書で記載されるＴＳＬＰ結合性分子またはその医薬組成物を提供する。さ
らなる実施形態では、本発明は、患者における疾患の処置または防止における使用のため
の医薬の製造における、本明細書で記載されるＴＳＬＰ結合性分子またはその医薬組成物
の使用を提供する。
一部の実施形態では、ＴＳＬＰ関連炎症性状態は、アレルギー反応または環境的刺激物
（irritantまたはstimulant）により誘発されうる。一部の具体的実施形態では、ＴＳＬ
Ｐ関連炎症性状態は、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、アレルギー性鼻副鼻
腔炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、好酸球性食道炎を含む。
一部の実施形態では、ＴＳＬＰ結合性分子を含むＴＳＬＰ結合性分子または医薬組成物
を、対象に、吸入により、例えば、エアゾール化形態で、乾燥粉末吸入器により投与する
。他の実施形態では、ＴＳＬＰ結合性分子または医薬組成物は、当技術分野で公知の様々
な方法のうちの１つまたは複数を使用して投与することができる。当業者により察知され
る通り、投与経路および／または投与方式は、所望の結果に応じて変化するであろう。選
択される投与経路は、例えば、注射または注入による、静脈内投与経路、筋内投与経路、
皮内投与経路、腹腔内投与経路、皮下投与経路、脊髄内投与経路、または他の非経口投与
経路を含む。非経口投与は、通例注射による、腸内投与および局所投与以外の投与方式を
表す場合があり、限定なしに述べると、静脈内注射および注入、筋内注射および注入、動
脈内注射および動脈内注入、髄腔内注射および髄腔内注入、関節包内注射および関節包内
注入、眼窩内注射および眼窩内注入、心内注射および心内注入、皮内注射および皮内注入
、腹腔内注射および腹腔内注入、経気管注射および経気管注入、皮下注射および皮下注入
、表皮下注射および表皮下注入、関節内注射および関節内注入、被膜下注射および被膜下
注入、くも膜下注射およびくも膜下注入、脊髄内注射および脊髄内注入、硬膜外注射およ
び硬膜外注入、ならびに胸骨内注射および胸骨内注入を含む。代替的に、本発明のＴＳＬ
Ｐ結合性分子を含むＴＳＬＰ結合性分子または医薬組成物は、局所投与経路、表皮投与経
路、または経粘膜投与経路、例えば、鼻腔内投与経路、経口投与経路、膣内投与経路、直
腸内投与経路、舌下投与経路、または局所投与経路など、非経口経路以外の経路を介して
投与することもできる。
一部の実施形態では、ＴＳＬＰ関連炎症性状態は、喘息である。喘息は、気道の複合性
かつ雑多な慢性炎症性疾患であって、転導可能な気管支狭窄を特徴とし、広範にわたる気
管支収縮刺激に対する気道の過剰な応答（気道過敏性；ＡＨＲ）と関連するする疾患であ
る。近年の研究は、喘息の発症機序に関与する免疫経路の同定に焦点を当てており、２型
ヘルパーＴ（Ｔｈ２）細胞およびＴｈ２非介在性エフェクター細胞の両方の役割を明らか
にしている（Lambrecht and Hammad, Nature immunology 2014, 16: 45-56）。好酸球性
炎症およびアトピーの証拠を特徴とするアレルギー性喘息の場合、Ｔｈ２免疫経路エレメ
ントが、気道炎症およびＡＨＲの発生および維持に極めて重要である。胸腺間質性リンパ
球新生因子（ＴＳＬＰ）は、Ｔｈ２応答の、鍵となる上流調節因子である。ＴＳＬＰは、
多様な刺激（例えば、物理的損傷、周囲微粒物質、アレルゲン、炎症促進性サイトカイン
またはＴｈ２極性化サイトカイン、および微生物生成物）に応答して、気道内の粘膜上皮
細胞内で発現する。ＴＳＬＰの役割は、樹状細胞（ＤＣ）をモジュレートし、ナイーブＴ
細胞の、炎症性Ｔｈ２細胞への分化を誘導し、生得免疫応答の一部として、マスト細胞、
好酸球、およびマクロファージからのサイトカイン分泌を促進することである。加えて、
ＴＳＬＰは、調節性Ｔ細胞の発生に干渉し、寛容性と炎症との平衡を損なう場合がある。
好中球性または顆粒球希少性（paucigranulocytic）炎症を特徴とする非アレルギー性喘
息の場合、炎症を駆動するサイトカインも理解されていないが、非Ｔｈ２介在性サイトカ
インであるＩＬ−１７およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）（interferon-y (IFN-y)
）はいずれも、役割を果たすと考えられている。興味深いことに、Ｔｈ２応答を媒介する
その役割に加えて、前臨床における証拠は、ＴＳＬＰが、非Ｔｈ２応答を増幅し、また、
ＩＬ−１７およびＩＦＮ−γ（IFN-y）により媒介される慢性炎症の確立にも重要であり
うることを示唆する。
ＴＳＬＰは、齧歯動物における、気道のＴｈ２サイトカイン関連炎症の発症に、必要か
つ十分である。ＴＳＬＰの構成的肺上皮分泌を伴うトランスジェニックマウスは、界面活
性剤であるプロテインＣのプロモーターの制御下で、喘息と適合性の以下の特徴：好酸球
性気道炎症；Ｔｈ２の発現によるバイアスがかかったＣＤ４Ｔ細胞浸潤；全身性好酸球増
加症；ＩｇＥの増大；気道過敏性；ならびに杯細胞過形成と、気道線維症および血管線維
症とを含む、著明な気道リモデリングを発症した。アレルギー性炎症、ＴＳＬＰ発現、お
よびタンパク質産生における、ＴＳＬＰの、さらなる促進的な役割はまた、肺内で、吸入
されたアレルゲンへの曝露を増大させることも見出される（Zhou et al., 2005, Nature
immunology 6, 1047-1053）一方、抗原の存在下における、ＴＳＬＰの直接的な鼻腔内送
達は、重度の疾患の急速な発病をもたらす（Headley et al., 2009, Journal of immunol
ogy 182, 1641-1647）。ＴＳＬＰＲ欠損マウスは、古典的なオボアルブミン＋アラムプラ
イミングマウスモデルにおけるＴｈ２様炎症の発症に対して抵抗性である（Al-Shami et
al., 2005, The Journal of experimental medicine 202, 829-839；Zhou et al., 2005,
Nature immunology 6, 1047-1053）。気道炎症の減退は、血清ＩｇＥの低減、ならびに
Ｔｈ２サイトカインならびにＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、エオタキシン、およびＴ
ＡＲＣ（Thymus- and Activation-Regulated Chemokine）などのＴｈ２ケモカインの減少
と相関した。
重度の喘息患者では、気道固有層内のＴＳＬＰ発現の増大が特異的に観察された（Shik
otra et al., 2012, Journal of Allergy and Clinical Immunology 129, 104-111.e109
）。さらに、いくつかの研究は、ヒトＴＳＬＰ遺伝子座における一塩基多型（ＳＮＰ）の
頻度と、ＴＳＬＰの発現レベルと、喘息および好酸球性食道炎への疾患感受性との関連も
示している（Ferreira et al., 2014, The Journal of allergy and clinical immunolog
y 133, 1564-1571；Harada et al., 2011, American journal of respiratory cell and
molecular biology 44, 787-793；He et al., 2009, The Journal of allergy and clini
cal immunology 124, 222-229；Rothenberg et al., 2010, Nature Genetics 42, 289-29
1）。近年の研究では、ＴＳＬＰ遺伝子の変異体はまた、エピスタシス性の関連を介して
、小児喘息における喘息危険性の著明な増大と関連することも見出された（Biagini Myer
s et al., 2014, The Journal of allergy and clinical immunology 134, 891-899 e893
）。
組合せ療法
上記で記載した多様な処置は、ＴＳＬＰ関連炎症性状態のための現行の標準治療など、
他の処置パートナーと組み合わせることができる。したがって、本明細書で記載されるＴ
ＳＬＰ関連炎症性状態を処置する方法は、第２の薬剤を、処置を必要とする対象に投与す
るステップもさらに含みうる。一部の実施形態では、第２の薬剤は、コルチコステロイド
、気管支拡張剤（ＳＡＢＡ、ＬＡＢＡ、ＳＡＭＡ、ＬＡＭＡ）、抗ヒスタミン剤、抗ロイ
コトリエン剤、およびＰＤＥ−４阻害剤から選択しうるがこれらに限定されない。
「組合せ」という用語は、１つの単位剤形中に固定された組合せ、または本発明の化合
物と、組合せパートナー（例えば、下記で説明される通り、「治療剤」または「共薬剤」
ともまた称する、別の薬物）とを、同時に独立に、もしくは時間間隔を置いて別個に投与
しうる組合せ投与、とりわけ、これらの時間間隔により、この組合せパートナーが、協同
作用、例えば、相乗作用を示すことを可能とする組合せ投与を指す。単独の構成要素を、
キットにパッケージングすることもでき、個別にパッケージングすることもできる。構成
要素（例えば、粉末または液体）の一方または両方を、投与前に、所望の用量へと、復元
または希釈することができる。本明細書で用いられる「共投与」または「組合せ投与」な
どの用語は、選択された組合せパートナーの、それを必要とする単一の対象（例えば、患
者）への投与を包含することを意味し、薬剤を、必ずしも同じ投与経路により、または同
時に投与するわけではない処置レジメンを含むことを意図する。本明細書で使用される「
医薬の組合せ」という用語は、１つを超える治療剤の混合または組合せから生じる生成物
を意味し、治療剤の固定された組合せおよび固定されていない組合せの両方を含む。「固
定された組合せ」という用語は、治療剤、例えば、本発明の化合物および組合せパートナ
ーの両方を、患者へと、単一の実体または投与量の形態で、同時に投与することを意味す
る。「固定されていない組合せ」という用語は、治療剤、例えば、本発明の化合物および
組合せパートナーの両方を、患者へと、別個の実体として、具体的時間制限を伴わずに、
同時、共時的、または逐次的のいずれかで投与し、このような投与が、患者の体内に、治
療有効レベルの、２つの化合物をもたらすことを意味する。後者はまた、カクテル療法、
例えば、３つ以上の治療剤の投与にも適用される。本明細書で使用される「医薬の組合せ
」という用語は、１つの単位剤形中に固定された組合せ、または２つ以上の治療剤を、同
時に独立に、もしくは時間間隔を置いて別個に投与しうる組合せ投与、とりわけ、これら
の時間間隔により、この組合せパートナーが、協同作用、例えば、相乗作用を示すことを
可能とする組合せ投与のための部分による、固定されていない組合せもしくはキットを指
す。
「組合せ療法」という用語は、２つ以上の治療剤の投与であって、本開示で記載される
治療的状態または障害を処置する投与を指す。このような投与は、これらの治療剤の共投
与であって、一定の比の有効成分を有する単一のカプセル内など、実質的に共時的な形の
共投与を包含する。代替的に、このような投与は、各有効成分のための、複数または別個
の容器（例えば、錠剤、カプセル、粉末、および液体）による共投与も包含する。粉末お
よび／または液体は、投与前に、所望の用量へと、復元または希釈することができる。加
えて、このような投与また、各種の治療剤の、ほぼ同時または異なる時点のいずれかにお
ける、逐次的な形の使用も包含する。いずれの場合にも、処置レジメンは、本明細書で記
載される状態または障害の処置において、薬物の組合せの有益な効果をもたらすであろう
。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての科学技術用
語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する
。本発明の実施では、本明細書で記載される方法および材料と類似または同等の方法およ
び材料を使用しうるが、下記では、適切な方法および材料について記載する。本明細書で
言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの
全体が組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む、本明細書に従う。加えて、材料、方
法、および例は、例示的なものであるに過ぎず、限定的であることを意図するものではな
い。当業者は、本明細書で記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料
を、本発明の実施において使用しうることを認識するであろう。実際、本発明は、いかな
る形であれ、記載される方法および材料に限定されるものではない。
[実施例１]
ファージディスプレイを使用する、ヒト抗ＴＳＬＰ抗体およびそれらのＦａｂ断片の作出
ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）ファージディスプレ
イ技術を使用して、ヒトＴＳＬＰアイソフォーム１（配列番号２７）に特異的に結合する
Ｆａｂを作り出した。ファージミドライブラリーは、ＨｕＣＡＬ（登録商標）概念（Knap
pik et al., 2000, J Mol Biol 296, 57-86）に基づき、Ｆａｂをファージ表面上に提示
するために、ＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術を利用する（Lohning、国際公開第ＷＯ
２００１／０５９５０号パンフレット）。
パニング
３種類のパニング：直接コーティングした組換えヒトＴＳＬＰ（ｒｈＴＳＬＰ）に対す
る固相パニング、固相アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）捕捉パニング、およびＴＳ
ＬＰに対する溶液パニングを実施した。
直接コーティングしたｒｈＴＳＬＰに対する固相パニングのために、９６ウェルＭａｘ
ｉｓｏｒｐ（商標）プレートを、ウェル１つ当たり３００μｌの大腸菌（E. coli）由来
ｒｈＴＳＬＰ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、４℃で一晩にわたりコーティングした
。各パニングのために、約４×１０１３個のＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）
ファージ−抗体を、コーティングした各抗原へと添加し、マイクロ滴定プレートシェーカ
ー上、ＲＴで２時間にわたりインキュベートした。その後、非特異的に結合したファージ
を、数回の洗浄ステップにより洗浄し、１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８中に２５ｍＭ
のＤＴＴを使用して、特異的に結合したファージを溶出させた。ＤＴＴによる溶出物を、
１４ｍｌの大腸菌（E. coli）ＴＧ１へと移し、ファージ感染のためにインキュベートし
た。
感染した細菌を、２倍濃度のＹＴ培地中に再懸濁させ、ＬＢ／Ｃａｍ寒天プレート上に
播種し、一晩にわたりインキュベートした。コロニーを、プレートから擦り取り、ファー
ジレスキュー、選択されたクローンのポリクローナル増幅、およびファージ産生のために
使用した。精製されたファージにより、次のパニングラウンドを開始した。抗原の量を減
少させ、洗浄条件をより厳密とすることを除き、第１ラウンドのプロトコールに従い、第
２および第３ラウンドの固相パニングを実施した。
カニクイザルＴＳＬＰに対する固相ＡＰＰ捕捉パニングでは、パニングで使用する抗原
は、ＡＰＰ６（アミロイド前駆体タンパク質）タグを有し、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）プ
レート上に固定化したマウス抗ＡＰＰ６抗体を介して、抗原−ＡＰＰ６融合タンパク質を
捕捉した。抗原のＡＰＰ６タグまたは抗ＡＰＰ６捕捉抗体に結合するファージの選択を防
止するため、捕捉抗体および無関係なＡＰＰ６タグ付け抗原を使用して、ファージのプレ
ブロッキングを実施した。
９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレートを、３００μｌの抗ＡＰＰ抗体および無
関係なＡＰＰ６タグ付け抗原により、４℃で一晩にわたりコーティングした。抗原である
、ヒトＴＳＬＰ＿Ａｖｉ−ＡＰＰ６またはカニクイザルＴＳＬＰ＿ＡＰＰ６−Ａｖｉを、
シェーカー上、ＲＴで１時間にわたり捕捉した。並行して、ファージを、抗ＡＰＰ抗体上
および無関係な抗原上に、２回にわたり前吸着させた。
抗原コーティング手順およびファージブロッキング手順に加え、捕捉パニングを、上記
で記載した固相パニングと同様に実施した。
ＴＳＬＰに対する溶液パニングのために、ファージを、５０％のヒト血清／０．３３倍
濃度のＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でブロッキングした。ファ
ージプールごとに、４ｍｇのストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標
）Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１倍濃度のＣｈ
ｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ中でブロッキングした。ストレプトアビジンまたはビーズに結合す
るファージを除去するために、ブロッキングされたストレプトアビジンビーズの各々を使
用して、ブロッキングされたファージ粒子の前吸着を、２回にわたり実施した。次いで、
ビオチニル化抗原である、ヒトＴＳＬＰ＿Ａｖｉ−ＡＰＰ６を、ファージ粒子へと添加し
た。インキュベーションの後、ストレプトアビジンビーズを使用して、ファージ−抗原複
合体を捕捉し、ストレプトアビジンビーズに結合したファージ粒子を、磁気分離器により
回収した。非特異的に結合したファージを、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０およびＰ
ＢＳを使用する、数回の洗浄ステップにより洗い落とした。１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、
ｐＨ８中に２５ｍＭのＤＴＴを使用することにより、特異的に結合したファージを、スト
レプトアビジンビーズから溶出させた。後続のファージ感染およびファージ産生を、固相
パニングプロトコールに従い実施し、次のパニングラウンドを開始した。
発現
可溶性Ｆａｂの迅速な発現を容易とするため、選択されたＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵ
Ｍ（登録商標）ファージのインサートをコードするＦａｂを、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）
３０ディスプレイベクターから、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ１１発現ベクターである、
ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ１１＿ＦＨへとサブクローニングした。大腸菌（E. coli）
ＴＧ１−Ｆへの単一クローンによる形質転換後、ＨｕＣＡＬ（登録商標）−Ｆａｂ断片を
含有するペリプラズム抽出物の発現および調製を、既に記載されている通りに実施した（
Rauchenberger et al., 2003, J Biol Chem 278: 38194-38205）。
クロラムフェニコール耐性の単一クローンを、２倍濃度のＹＴ培地であらかじめ満たし
た滅菌３８４ウェルマイクロ滴定プレートのウェルへと採取し、３７℃で一晩にわたり増
殖させた。翌朝、培地を含有するグリセロールを、マスタープレートの各ウェルへと添加
し；プレートを、アルミニウムホイルでシーリングし、−８０℃で保管した。
ＥＬＩＳＡスクリーニング
ＥＬＩＳＡスクリーニングを使用して、単一のＦａｂクローンを、標的抗原への結合に
ついてのパニング出力から同定した。Ｆａｂは、粗大腸菌（E. coli）溶解物を含有する
Ｆａｂを使用して調べた。調製された大腸菌（E. coli）溶解物中のＦａｂの発現を検証
するために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレートを、ＰＢＳ中、１：１００
０に希釈された、Ｆｄ断片特異的ヒツジ抗ヒトＩｇＧでコーティングした。０．０５％の
Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中に５％のスキムミルク粉末によるブロッキングの後、
大腸菌（E. coli）溶解物を含有するＦａｂを添加した。その後、結合したＨｕＣＡＬ（
登録商標）−Ｆａｂ断片を、アルカリホスファターゼへとコンジュゲートさせたＦ（ａｂ
）２特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０００に希釈した）を伴うインキュベーションに続
き、ＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ；型番１１６８１９８２００１）を添加する
ことにより検出した。５３５ｎｍにおける蛍光発光は、４３０ｎｍにおける励起を伴って
記録した。
直接コーティングした抗原に対するＥＬＩＳＡスクリーニングを実施するため、Ｍａｘ
ｉｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレートを、ＰＢＳ中に２μｇ／ｍｌの濃度の、異なる
ＴＳＬＰ抗原でコーティングした。ＰＢＳ中に５％のスキムミルク粉末でプレートをブロ
ッキングした後、Ｆａｂを含有する大腸菌（E. coli）溶解物を添加した。Ｆａｂの結合
は、ＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ；型番１１６８１９８２００１）を使用して
、アルカリホスファターゼへとコンジュゲートさせたＦ（ａｂ）２特異的ヤギ抗ヒトＩｇ
Ｇ（１：５０００に希釈した）により検出した。５３５ｎｍにおける蛍光発光は、４３０
ｎｍにおける励起を伴って記録した。
ＡＰＰで捕捉された抗原に対するＥＬＩＳＡスクリーニングを実施するため、Ｍａｘｉ
ｓｏｒｐ（商標）３８４ウェルプレートを、ＰＢＳ中に２．５μｇ／ｍｌの濃度の、抗Ａ
ＰＰ特異的抗体でコーティングした。ＰＢＳ中に５％のスキムミルク粉末でプレートをブ
ロッキングした後、２μｇ／ｍｌの濃度のＡＰＰタグ付けＴＳＬＰ抗原を、ＲＴで１時間
にわたり結合させた。次いで、Ｆａｂを含有する大腸菌（E. coli）溶解物を添加した。
Ｆａｂの結合は、ＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ；型番１１６８１９８２００１
）を使用して、アルカリホスファターゼへとコンジュゲートさせたＦ（ａｂ）２特異的ヤ
ギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０００に希釈した）により検出した。５３５ｎｍにおける蛍光発
光は、４３０ｎｍにおける励起を伴って記録した。
ビオチニル化抗原に対するＥＬＩＳＡスクリーニングを実施するため、Ｍａｘｉｓｏｒ
ｐ（商標）３８４ウェルプレートを、ＰＢＳ中、１：１０００に希釈された、Ｆｄ断片特
異的ヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ；型番ＰＣ０７５）、また
は抗Ｈｉｓ特異的マウスＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；型番ＭＡＢ０５０）のそれぞ
れでコーティングした。ＰＢＳ中に５％のスキムミルク粉末によるブロッキングの後、大
腸菌（E. coli）溶解物を含有するＦａｂを添加した。その後、捕捉されたＨｕＣＡＬ（
登録商標）−Ｆａｂ断片を、０．７〜１．５μｇ／ｍｌの、ビオチニル化させた、ｈｕ
ＴＳＬＰ、ｈｕ ＴＳＬＰ、またはｃｙ ＴＳＬＰのそれぞれに結合させ、これを、アル
カリホスファターゼへとコンジュゲートさせたストレプトアビジンを伴うインキュベーシ
ョンに続き、ＡｔｔｏＰｈｏｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ；型番１１６８１９８２００１）を
添加することにより検出した。５３５ｎｍにおける蛍光発光は、４３０ｎｍにおける励起
を伴って記録した。
ビオチニル化抗原（２．５〜５μｇ／ｍｌ）はまた、ニュートラビジンコーティングプ
レート上でも捕捉した。ＰＢＳ中に５％のスキムミルク粉末によるブロッキングの後、大
腸菌（E. coli）溶解物を含有するＦａｂを添加した。Ｆａｂの結合は、ＡｔｔｏＰｈｏ
ｓ蛍光基質（Ｒｏｃｈｅ；型番１１６８１９８２００１）を使用して、アルカリホスファ
ターゼへとコンジュゲートさせたＦ（ａｂ）２特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５０００に
希釈した）により検出した。５３５ｎｍにおける蛍光発光は、４３０ｎｍにおける励起を
伴って記録した。
９９８４のクローン（パニングサブコード１つ当たりのクローン３８４）を、ＮＡプレ
ート上にコーティングされた、ビオチニル化ヒトＴＳＬＰ＿Ａｖｉ−ＡＰＰ６およびビオ
チニル化カニクイザルＴＳＬＰ＿ＡＰＰ６−Ａｖｉについての一次ＥＬＩＳＡスクリーニ
ング（３．４．４を参照されたい）において解析した。ＥＬＩＳＡ結果は、ＧＥＮｉｏｓ
Ｐｒｏの「ＰｒｉｍｅＳｃｒｅｅｎ」プログラムで解析した。結果は、バックグラウン
ドシグナルと比較して解析した。ヒト抗原については、シグナルがバックグラウンドの＞
１０倍であるウェルだけを陽性として選択し、カニクイザル抗原については、シグナルが
バックグラウンドの＞５倍であるウェルを陽性として選択した。バックグラウンドの５倍
未満のシグナルは、発現が低度のＦａｂ、低アフィニティーのＦａｂ、マイクロ滴定プレ
ートのエッジ効果、または非再現可能値の結果である可能性が高い。溶液パニングは、３
１３３の固相パニング中、２４０の一次ヒットを結果としてもたらした。選択された１４
７２の一次ヒットを、二次ＥＬＩＳＡスクリーニングにおいてさらに解析した。
二次ＥＬＩＳＡスクリーニングでは、Ｃ末端またはＮ末端のＡｖｉ−ＡＰＰ６タグ付け
抗原、直接コーティング抗原、溶液中で提示されるビオチニル化抗原、ＨＥＫ由来抗原、
大腸菌（E. coli）由来抗原、抗原の脱グリコシル化変異体（ＰＮＧアーゼ処理変異体）
を含む、異なる抗原提示方式を使用した。加えて、二次スクリーニングでは、反標的（ｃ
ｏｕｎｔｅｒｔａｒｇｅｔ）であるＩＬ−７への非特異的結合も解析した。ビオチン結合
剤およびタグ結合剤を除外するため、ビオチニル化した無関係なＡＰＰ−Ａｖｉタグ付け
抗原を使用した。ＥＬＩＳＡ結果は、ＧＥＮｉｏｓ Ｐｒｏの「ＰｒｉｍｅＳｃｒｅｅｎ
」プログラムで解析し、結果は、バックグラウンドシグナルと比較して解析した。無関係
な抗原および反標的であるＩＬ−７については、シグナルがバックグラウンドの＜２倍で
あるヒットだけを選択した。
二次スクリーニングの結果は、抗原提示方式が、交差反応性に極めて重要であることを
指し示す。脱グリコシル化抗原についてのスクリーニングは、糖エピトープを標的とする
結合剤が存在することを示した。さらに、タグの場所およびタグ組成も、コンフォメーシ
ョン変化に起因する交差反応性に影響を及ぼしうる。クローンを、それらの交差反応性プ
ロファイルに従い群分けする結果として、７つの異なる交差反応性群をもたらした。群１
〜３は、大腸菌（E. coli）由来のｈｕＴＳＬＰ単独またはＨＥＫ由来抗原と組み合わせ
た大腸菌（E. coli）由来のｈｕＴＳＬＰのいずれかと交差反応性である全てのクローン
を含む。群４は、溶液中で提示されるヒトＴＳＬＰ＿Ａｖｉ−ＡＰＰ６と少なくとも交差
反応性である全てのクローンを含む。これに対し、群５は、溶液中のヒトＴＳＬＰ＿Ａｖ
ｉ−ＡＰＰ６ともっぱら交差反応性である全てのクローンを含む。群６では、全てのクロ
ーンが、ヒトＴＳＬＰ＿Ａｖｉ−ＡＰＰ６および脱グリコシル化ヒトＴＳＬＰ＿Ａｖｉ−
ＡＰＰ６と交差反応性であり、群７では、全てのクローンが、脱グリコシル化抗原を含む
、全てのＨＥＫ由来抗原と交差反応性である。
シーケンシングおよびＩｇＧへの転換
配列解析を、交差反応性群１〜３（大腸菌（E. coli）由来のＴＳＬＰと交差反応性で
あるクローン）のうちの７３のクローン、および群４〜７（ＨＥＫ由来抗原と交差反応性
であるクローン）のうちの５６９のクローンに対して実施した。合計で、２９７の固有の
ＨＣＤＲ３クローンを同定し、２２２のクローンを確立し、１２４のクローンを、Ｆａｂ
フォーマットで精製した。
３回目および４回目のシーケンシング解析によるクローンを、速やかに、ＩｇＧ転換に
かけ、その後、哺乳動物細胞内で発現させるために、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）４＿Ｉｇ
Ｇ１ｆベクターへとクローニングした。
アフィニティーの決定
クローンのＨｕＣＡＬ（登録商標）ＦａｂおよびＩｇＧ形の解離定数（ＫＤ）の決定は
、以下の通りに実施した：ストレプトアビジンＭＳＤプレートに、アッセイ緩衝液中、０
．２μｇ／ｍｌのビオチニル化ヒトＴＳＬＰを、ＲＴで１時間にわたりコーティングした
。抗原によるコーティングの前に、ストレプトアビジンプレートを、３％のＢＳＡを伴う
ＰＢＳにより、４℃で一晩にわたりブロッキングした。下記で記載される条件下で、ヒト
ＴＳＬＰおよびカニクイザルＴＳＬＰについての溶液平衡滴定（ＳＥＴ）を実施した。抗
体タンパク質の単量体画分を使用した（少なくとも９０％の単量体含量；解析的ＳＥＣ；
それぞれ、ＦａｂのためのＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）、またはＩｇＧのためのＴｏｓｏｈ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃ
ｉｅｎｃｅ）により解析した）。
溶液中のアフィニティーの決定は基本的に、文献（Friquet et al., 1985, J Immnunol
Meth 77, 305-319）に記載されている通りに実施した。ＳＥＴ法の感度および精度を改
善するために、ＳＥＴ法を、古典的なＥＬＩＳＡから、ＥＣＬベースの技術へと移行させ
た（Haenel et al., 2005, Anal Biochem 339, 182-184）。１ｍｇ／ｍｌのヤギ−抗ヒト
（Ｆａｂ）２断片特異的抗体（Ｄｉａｎｏｖａ）を、製造元の指示書に従い、ＭＳＤ Ｓ
ｕｌｆｏ−ＴＡＧＴＭ ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ
ｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）で標識した。
実験は、ポリプロピレン製のマイクロ滴定プレート内の、アッセイ緩衝液としての、０
．５％のＢＳＡおよび０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ ｐＨ７．４中で
実行した。標識されていない抗原を、予測ＫＤの、少なくとも１０倍の濃度で始まる、２
ｎ系列で希釈した。抗原を伴わないウェルを使用して、Ｂｍａｘ値を決定し；アッセイ緩
衝液だけを含有するウェルを使用して、バックグラウンドを決定した。適切な量の結合剤
（抗体濃度が予測ＫＤと同様であるかまたはこれを下回り、最終容量を６０μＬとする）
を添加した後で、混合物を、ＲＴで一晩にわたりインキュベートした。
ＭＳＤプレートを、抗原（ウェル１つ当たり３０μＬずつ）でコーティングした。０．
０２％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳによるプレートの洗浄後、平衡化させた試料
を、これらのプレート（ウェル１つ当たり３０μｌずつ）へと移し、２０分間にわたりイ
ンキュベートした。洗浄後、ウェル１つ当たり３０μｌずつのＭＳＤ−Ｓｕｌｆｏタグ標
識化検出抗体（抗ヒト（Ｆａｂ）２、最終的な希釈を、典型的に、１：２，０００とする
）を、ＭＳＤプレートへと添加し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆシェーカー上（７００ｒｐｍ）、
ＲＴで３０分間にわたりインキュベートした。
ＭＳＤプレートを洗浄し、ウェル１つ当たり３０μＬずつのＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｂｕｆ
ｆｅｒ Ｔを、界面活性剤と共に添加した後、Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（
Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ
）を使用して、電気化学発光シグナルを検出した。
データは、カスタマイズ化当てはめモデルを適用する、ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ソフト
ウェアで査定した。Ｆａｂ分子のＫＤを決定するために、以下の当てはめモデル（Haenel
et al., 2005に従い、Abraham et al., 1996に従い改変した）：

を使用した。
ＩｇＧ分子のＫＤを決定するために、以下の当てはめモデル（Piehler et al., 1997に
従い改変した）：

を使用した。
アフィニティーはまた、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００またはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００測
定器（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、反応速度定数を決定
することを介する、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することも
できる。直接コーティングした抗原を介する、ＢｉａｃｏｒｅによるＫＤの決定は基本的
に、以下の通りに実施した：５０ＲＵビオチニル化抗原ヒトＴＳＬＰを、ＳＡチップ（Ｂ
ｉａｃｏｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に捕捉した。基準フローセル１を、ブラ
ンクに保った。ＰＢＳ ｐＨ７．２ ＧＩＢＣＯ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を、流量
を３０μｌ／分とするランニングバッファーとして使用した。３．９〜５００ｎＭの範囲
のＦａｂ濃度を、４５μｌの注射容量および３００秒間の解離時間と共に使用した。結合
した解析物の再生は、１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５ ５μｌの、２回にわたる注入によ
り行った。パラメータであるＲｍａｘをローカルに設定し、ＲＩを０に設定して、生デー
タを、１：１結合モデルに当てはめた。
アフィニティー成熟
７つのＦａｂ候補物質を、アフィニティー成熟のために選択した。選択されたＦａｂの
アフィニティーおよび生体活性を増大させるため、Ｌ−ＣＤＲ３領域およびＨＣＤＲ２領
域を、トリヌクレオチド指向突然変異誘発を使用する、カセット式突然変異誘発により、
並行して最適化する（Virnekas et al., 1994, Nucleic Acids Res 22: 5600-5607）一方
で、フレームワーク領域は、一定に保った。親Ｆａｂ断片のＬ−ＣＤＲ３を最適化するた
めに、結合剤プールの軽鎖（４０５ｂｐ）の、ＬＣＤＲ３、フレームワーク４、および定
常領域を、酵素的消化により除去し、フレームワーク４および定数ドメインと併せた、多
様化させたＬ−ＣＤＲ３のレパートリーで置きかえた。第２のライブラリーセットでは、
Ｈ−ＣＤＲ２を多様化させる一方で、接続するフレームワーク領域は一定に保った。ライ
ゲーション混合物を、１０８〜１０９独立のコロニーから得られる、４ｍｌの大腸菌（E.
coli）ＴＯＰ１０Ｆ細胞に電気穿孔した。このライブラリーサイズは、理論的な多様性
のカバレッジを確保した。ライブラリーの増幅は、記載されている通りに実施した（Rauc
henberger et al., 2003, J Biol Chem 278: 38194-38205）。品質管理のために、単一の
クローンをランダムに採取し、シーケンシングした。アフィニティーを改善した結合剤を
選択するために、ビオチニル化抗原である、ヒトＴＳＬＰ＿Ａｖｉ−ＡＰＰ６およびカニ
クイザルＴＳＬＰ＿ＡＰＰ６−Ａｖｉを使用して、成熟ライブラリーに由来するファージ
を、３ラウンドの溶液パニングにかけた。厳密性は、各パニングラウンドにおける抗原濃
度を低下させることにより増大させた（Low et al., 1996, J Mol Biol 260, 359-368. 1
996）。抗原の低減に加えて、オフ速度選択（Hawkins et al., 1992, J Mol Biol 226, 8
89-896）も実施した。これを、ＲＴで一晩にわたる洗浄ステップと組み合わせた。
一部の選択された抗体断片のアフィニティーおよび生体活性を増大させるため、Ｌ−Ｃ
ＤＲ１領域、Ｌ−ＣＤＲ３領域、Ｈ−ＣＤＲ２領域、Ｈ−ＣＤＲ１領域を、トリヌクレオ
チド指向突然変異誘発を使用する、カセット式突然変異誘発により、並行して最適化した
（Virnekas et al., 1994, Nucleic Acids Res 22: 5600-5607）一方で、フレームワーク
領域は、一定に保った。
ＣＤＲ内の翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、このような抗体の効力は、ＰＴＭの位置に応じて
、潜在的に低下し、加えて、ＰＴＭは、不均質な化合物をもたらしうるので、所望されな
い。アフィニティー成熟の前に、選択工程中に、ＰＴＭを除去した変異体を選択すること
を目的として、ＮＧ部位、ＮＳ部位、およびＤＧ部位を欠く変異体を作り出し、親クロー
ンを伴うプールに組み入れた。作り出された変異体の粗細菌細胞溶解物であって、Ｆａｂ
を含有する粗細菌細胞溶解物を、ヒトＴＳＬＰについてのＥＬＩＳＡにおいて、抗原への
結合について調べた。成熟ライブラリーを作り出すために、変異体のプラスミドＤＮＡを
、親ＤＮＡと混合した。
Haenel et al., 2005, Anal Biochem 339: 182-184により記載されている原理に基づく
溶液平衡滴定による成熟結合剤の評定のために、一定量の希釈ＢＥＬ抽出物を、異なる濃
度の抗原で、一晩にわたり平衡化させた。次いで、混合物を、抗原であらかじめコーティ
ングされたＭＳＤプレートへと移し、インキュベーションおよび洗浄の後、適切なＭＳＤ
−Ｓｕｌｆｏタグ標識化検出抗体を添加した。その後、結合しなかったＦａｂの濃度を、
Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用するＥＣＬ検出を介して定量化した。
対応する当てはめモデルを適用して、アフィニティーを推定し、これにより、成熟により
最も改善されたクローンを同定する、ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）ソフトウェアを使用して、
結果を処理した。
産生
真核生物ＨＫＢ１１細胞に、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂまたは抗ＴＳＬＰ ＩｇＧの重鎖およ
び軽鎖の両方をコードする、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）４発現ベクターのＤＮＡをトラン
スフェクトした。トランスフェクションの３または６日間後に、細胞培養物上清を採取し
た。滅菌濾過の後、液体操作ステーションを使用して、溶液を、プロテインＡアフィニテ
ィークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ
）にかけた。そうでないことが言明されない限りにおいて、１倍濃度のダルベッコＰＢＳ
（ｐＨ７．２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）との緩衝液交換を実施し、試料を滅菌濾過した（
０．２μｍの小孔サイズ）。タンパク質濃度は、ＵＶ分光光度法により決定し、ＩｇＧの
純度は、Ｌａｂｃｈｉｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を使用し
て、変性還元条件下で解析した。
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、初期パニングで同定された、ＭＯＲ０１１０８６ファミリー
から導出した。ＭＯＲ０１１０８６のアフィニティー成熟は、ＨＣ−ＣＤＲ２内に、ＤＧ
翻訳後修飾モチーフを含む、ＭＯＲ０１４０５１の作出を結果としてもたらした。このＤ
Ｇモチーフを除去することにより、ＭＯＲ１４７０１（ＤＧ→ＤＡ）を作り出し、次いで
、これを生殖細胞系列化して、ＭＯＲ０１４８２４、すなわち、表２のＭａｂ１を作製し
た。表２の抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、Ｍａｂ１のＦａｂ断片である。
Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、または組合せ番号付
けスキームによる、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）、軽鎖ＣＤＲ（ＬＣ
ＤＲ）のアミノ酸配列、ならびに重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を決定
し、表２に列挙した。抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、ＳＥＴにより決定される通り、組換えヒ
トＴＳＬＰに、極めて大きなアフィニティー（ＫＤ＝６ｐＭ）で結合した。抗ＴＳＬＰ
Ｆａｂ１は、構造的に類似するサイトカインであるＩＬ−７に結合しなかった。
[実施例２]
レポーター遺伝子アッセイにおける、組換えヒトＴＳＬＰおよび天然分泌型ヒトＴＳＬＰ
に対する、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の効力
組換えヒトＴＳＬＰ、天然分泌型ヒトＴＳＬＰ、およびカニクイザルＴＳＬＰに対する
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の効力を、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおいて調べ
た。
材料および方法
天然分泌型ヒトＴＳＬＰは、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１３による、２４
時間にわたる刺激を介して、ヒト肺線維芽細胞から得た。
Ｂａ／Ｆ３細胞に、ｈＴＳＬＰＲ、ｈＩＬ７Ｒα、およびＳｔａｔ５ルシフェラーゼレ
ポーター構築物をトランスフェクトした。Ｓｔａｔ５とは、ＴＳＬＰシグナル伝達の下流
のエフェクターである。細胞は、１０％のＦＣＩＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、１μｇ／ｍｌのピューロマイシン
（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、および５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＳＬＰ（
ｒｈＴＳＬＰ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を伴う細胞増
殖培地：ＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）中
で増殖させた。レポーターアッセイ緩衝液は、１０％のＦＣＩＩＩ、１％のペニシリン／
ストレプトマイシン、および１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを伴うＲＰＭＩ １６４０
を使用して作製した。
Ｂａ／Ｆ３細胞を、Ｔ１６２ｃｍ２のフラスコ内の懸濁液中で増殖させ、毎週２回、１
：５０に分割した。Ｂａ／Ｆ３細胞を、対数増殖中期に回収し、２００×ｇで５分間にわ
たる遠心分離によりペレット化し、ＴＳＬＰを含有しない細胞増殖培地中で洗浄した。こ
れを繰り返し、次いで、ＴＳＬＰ非含有条件下で、１８〜２４時間にわたりインキュベー
トした。翌日、細胞を、２００×ｇで５分間にわたる遠心分離により、再度ペレット化し
、レポーターアッセイ緩衝液中に、１ｍＬ当たりの細胞１×１０６個の細胞濃度まで再懸
濁させた。１ｍＬ当たりの細胞１×１０６個のＢａ／Ｆ３細胞１０μＬを、白色の９６ウ
ェルＯｐｔｉｐｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕ
ｓｅｔｔｓ）の各ウェル内のレポーターアッセイ緩衝液７０μＬと組み合わせた。これに
続き、抗体の、１０μＬで６点にわたる、１：１０の系列希釈（最終最高濃度を１００ｎ
Ｍとする）を行い、加湿型インキュベーター内、３７℃／５％のＣＯ２で、３０分間にわ
たりインキュベートした。最後に、０．５ｎｇ／ｍＬのヒトＴＳＬＰもしくはカニクイザ
ルＴＳＬＰ、または同じ相対活性を伴うように計算された濃度の天然分泌型ＴＳＬＰ １
０μＬを添加し、蒸発を低減するようにプレートをシーリングし、加湿型インキュベータ
ー内、３７℃／５％のＣＯ２で、４時間にわたりインキュベートした。次いで、プレート
を、インキュベーターから取り出し、約１５分間にわたり、室温へと平衡化させた。これ
に続き、１００μＬのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗ
Ｉ）を、各ウェルへと添加し、室温で２０分間にわたりインキュベートした。次いで、発
光プログラム（ウェル１つ当たりのカメラの露出１秒間）を使用して、プレートを、Ｅｎ
ｖｉｓｉｏｎ測定器上で読み取り、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈｐ
ａｄ Ｐｒｉｓｍにより、データを解析した。
結果
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおいて、組換え
ヒトＴＳＬＰ（１ｎｇ／ｍｌ）に対する１５．４ｐＭのＩＣ５０、天然分泌型ヒトＴＳＬ
Ｐに対する１７．１ｐＭのＩＣ５０、およびカニクイザルＴＳＬＰに対する１０．８ｐＭ
のＩＣ５０により、ＴＳＬＰの３つの形態全てに対する優れた効力を裏付けた。複数回の
実験（ｎ＝３）についての平均値レポーター遺伝子アッセイ結果を計算したところ、組換
えヒトＴＳＬＰに対する、Ｆａｂ１の平均値ＩＣ５０値は、１５．３ｐＭ±１．５ｐＭの
ＳＥＭであった。カニクイザルＴＳＬＰに対する、Ｆａｂ１の平均値ＩＣ５０値は、９．
５ｐＭ±０．９ｐＭのＳＥＭであった。
したがって、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、ピコモルレベルの効力を伴う、ヒトおよびカニ
クイザルＴＳＬＰの強力な阻害剤である。抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１が、ヒト肺線維芽細胞に
由来する天然分泌型ＴＳＬＰに対する優れた効力を裏付けたという事実は、体内の活性ヒ
トＴＳＬＰと、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂを作り出すのに使用される組換えヒトＴＳＬＰとの異
なるグリコシル化により引き起こされる問題の可能性を低減した。
[実施例３]
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１による、初代ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの、ＴＳＬＰ誘
導性ＴＡＲＣ（thymus- and activation-regulated chemokine）分泌の阻害
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１が、初代細胞に駆動される応答の文脈で、ＴＳＬＰを中和するこ
とが可能であるのかどうかを決定するために、ヒトＰＢＭＣからの、ヒトＴＳＬＰまたは
カニクイザルＴＳＬＰに誘導されるＴＡＲＣの分泌について、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の存
在下または非存在下で調べた。
材料および方法
健常ドナーから採取した静脈血をヘパリン処理（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ
）し、５０ｍＬのシリンジ内に回収し、次いで、２つの滅菌ファルコンチューブへと、２
５ｍｌずつに分けた。パスツールピペットを使用して、血漿層を除去する前に、加速度お
よび減速度を小さくして、１２００ｒｐｍで２０分間にわたり、これらのチューブを遠心
分離した。各チューブからの血液２０ｍｌずつを、未使用の５０ｍｌファルコンチューブ
へと移し、２０ｍＬのＰＢＳ（１倍濃度；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａ
ｎｄ、ＮＹ）および４％のデキストラン（ｗ／ｖ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ
）１０ｍＬを、各々へと添加した。血液とデキストランとを完全に混合するように、チュ
ーブを倒立させ、次いで、室温で３０分間にわたりインキュベートして、赤血球の沈降を
可能とした。２０ｍＬの上清を、未使用の５０ｍｌファルコンチューブへと移し、３０ｍ
ｌのＰＢＳで洗浄して（１４００ｒｐｍで８分間にわたり）から、上清を吸引し、細胞ペ
レットを、１０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。
赤血球を溶解させるために、２０ｍＬの滅菌低温蒸留水（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ、ＭＯ）を、細胞へと添加し、２０ｍｌのＳｔｒｉｐｅｔｔｅと、１分間にわたり混合
してから、２倍濃度の滅菌低温ＰＢＳ ２０ｍｌを添加して、溶解を停止させた。チュー
ブを数回にわたり倒立させ、１４００ｒｐｍで８分間にわたり遠心分離してから、１つの
チューブへとプールし、アッセイ緩衝液で２回にわたり洗浄した（１４００ｒｐｍで８分
間ずつ）。アッセイ緩衝液は、１０％のヒトＡＢ Ｓｅｒｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）および１％のペニシリン／ストレプト
マイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を伴う、ＲＰＭＩ
１６４０（ＧｌｕｔａＭａｘ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ
）により作製した。
細胞を計数し、１ｍＬ当たりの細胞１０×１０６個の濃度で再懸濁させ、そのうちの１
００μｌを、９６ウェル平底プレートの各ウェルへと添加した（ウェル１つ当たりの細胞
１×１０６個）。ウェル１つ当たり５０μｌの抗ＴＳＬＰ抗体を、各ウェルへと添加し、
３７℃で３０分間にわたりインキュベートするように放置してから、ヒトＴＳＬＰまたは
カニクイザルＴＳＬＰを添加し、最終濃度を１ｎｇ／ｍｌとするＴＳＬＰ（６６ｐＭ）を
得た。細胞を、２４時間にわたりインキュベートしてから、プレートを、１３００ｒｐｍ
で５分間にわたり遠心分離し、上清を、ＥＬＩＳＡによるＴＡＲＣ（thymus- and activa
tion-regulated chemokine）解析のために回収した。上清は、ＴＡＲＣ ＥＬＩＳＡにお
ける解析のためにそれらを融解させるまで、−２０℃で保管した（試料は、何も加えずに
調べる）。
ＴＡＲＣ ＥＬＩＳＡ解析は、製造元のプロトコール（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉ
ｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）に従い実施した。略述すると、捕捉抗体を、担体タンパク質
を伴わないＰＢＳ中で、作業濃度まで希釈した。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｉｍｍｕｎｏ
ｍａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ
ｈ、ＰＡ）を、ウェル１つ当たり１００μｌの希釈された捕捉抗体でコーティングし、プ
レートを、ＴｏｐＳｅａｌ粘着式蓋でシーリングし、室温で一晩にわたりインキュベート
した。翌日、捕捉抗体を吸引し、プレートを、洗浄緩衝液で洗浄し、工程を２回、のべ３
回の洗浄にわたり繰り返した。分枝管型分注器または自動式洗浄機を使用して、各ウェル
に３００μＬの洗浄緩衝液を満たすことにより、ウェルを洗浄した。最終回の洗浄の後、
プレートを倒立させ、清浄なペーパータオルで拭うことにより、残りの洗浄緩衝液を廃棄
した。次いで、３００μＬの試薬希釈液（ＰＢＳ中に１％のＢＳＡ）を、各ウェルへと添
加することにより、プレートをブロッキングした。プレートを、室温で、最短１時間にわ
たりインキュベートした。洗浄ステップを繰り返し、試薬希釈液中、１００μＬの試料ま
たは標準物質を、ウェルごとに添加した。プレートを、粘着テープで覆い、室温で２時間
にわたりインキュベートした。次いで、吸引／洗浄ステップを繰り返し、１００μＬの希
釈された検出抗体を、各ウェルへと添加し、新たな粘着テープで覆い、室温で２時間にわ
たりインキュベートしてから、既に記載した通りに、洗浄ステップを繰り返した。ストレ
プトアビジン−ＨＲＰの作業希釈液１００μＬを、各ウェルへと添加し、次いで、プレー
トを再度覆い、プレートを直射日光下に置くことを避けながら、室温で２０分間にわたり
インキュベートした。次いで、吸引／洗浄ステップを繰り返し、１００μＬのＴＭＢ基質
溶液を、各ウェルへと添加した。プレートを、暗所下、室温で、最長２０分間にわたりイ
ンキュベートするのに続き、５０μＬの停止溶液を添加した。プレートを、静かにタッピ
ングして、ウェルを確実に混合し、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーを使
用して、各ウェルの光学濃度を速やかに決定した。
結果
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、ヒトＰＢＭＣからの、組換えヒトＴＳＬＰ誘導性ＴＡＲＣ分
泌の極めて強力な阻害剤であり、１ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＳＬＰに対して、ＩＣ５０
を２０．３ｐＭとし、ＩＣ９０を９９．６５ｐＭとした。抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、ヒト
ＰＢＭＣからの、カニクイザルＴＳＬＰ誘導性ＴＡＲＣ分泌の極めて強力な阻害剤である
ことが示され、１ｎｇ／ｍｌの組換えカニクイザルＴＳＬＰに対して、ＩＣ５０を１１．
３ｐＭとした。複数回の実験（ｎ＝３）についての平均値ヒトＰＢＭＣ結果を計算したと
ころ、組換えヒトＴＳＬＰに対する、Ｆａｂ１の平均値ＩＣ５０値は、１９．７ｐＭ±１
．９ｐＭのＳＥＭであった。カニクイザルＴＳＬＰに対する、Ｆａｂ１の平均値ＩＣ５０
値は、１１．１ｐＭ±０．５ｐＭのＳＥＭであった。
[実施例４]
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１による、初代カニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からの、Ｔ
ＳＬＰ誘導性ＭＤＣ（マクロファージ由来ケモカイン）分泌の阻害
材料および方法
カニクイザル静脈血を、Ｃｏｖａｎｃｅ（Ｄｅｄｈａｍ、ＭＡ）製のヘパリンリチウム
を含有するＶａｃｕｔａｉｎｅｒチューブへと回収した。各ドナーからの血液３０ｍｌず
つを、５０ｍｌのファルコンチューブへと移し、パスツールピペットを使用して、血漿層
を除去する前に、加速度および減速度を小さくして、１２００ｒｐｍで２０分間にわたり
、これらのチューブを遠心分離し、層の間に０．５ｃｍの空隙をもたらした。残りの細胞
下層を再懸濁させ、１０ｍｌを、未使用のファルコンチューブへと移し、１倍濃度のＰＢ
Ｓ １０ｍｌおよび４％のデキストラン（ｗ／ｖ；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ
）５ｍＬを添加してから、完全に混合するように、チューブを、４〜５回にわたり倒立さ
せた。全てのチューブを、ドラフト内、室温で２５分間にわたりインキュベートして、Ｒ
ＢＣを、チューブの底部に沈降させた。１０ｍＬの上清を、未使用の５０ｍｌファルコン
チューブへと移し、４０ｍｌの培養培地で洗浄して（１４００ｒｐｍで８分間にわたり）
から、上清を吸引し、細胞ペレットを、１倍濃度のＰＢＳ ５ｍＬ中に再懸濁させた。
赤血球を溶解させるために、２０ｍＬの滅菌低温蒸留水（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ、ＭＯ）を、細胞へと添加し、２０ｍｌのＳｔｒｉｐｅｔｔｅと、１分間にわたり混合
してから、２倍濃度の滅菌低温ＰＢＳ ２０ｍｌを添加して、溶解を停止させた。チュー
ブを数回にわたり倒立させ、１４００ｒｐｍで８分間にわたり遠心分離してから、１つの
チューブへとプールし、培養培地で２回にわたり洗浄した（４℃、１４００ｒｐｍで、８
分間ずつ）。培養培地は、１０％のＦｅｔａｌ Ｃｌｏｎｅ ＩＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓ
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ） および１％のペニシリン／ストレ
プトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を伴う、ＲＰ
ＭＩ １６４０（ＧｌｕｔａＭａｘ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、
ＮＹ）により作製した。
細胞を、トリパンブルー色素を使用して計数し、１ｍＬ当たりの細胞１０×１０６個の
濃度で再懸濁させ、そのうちの１００μｌを、９６ウェル平底プレートの各ウェルへと添
加した（ウェル１つ当たりの細胞１×１０６個）。ウェル１つ当たり５０μｌの抗ＴＳＬ
Ｐ抗体（１００ｎＭの最終最高濃度）を、各ウェルへと添加し、３７℃で３０分間にわた
りインキュベートしたままにしてから、カニクイザルＴＳＬＰを添加し、最終濃度を０．
５ｎｇ／ｍｌとするＴＳＬＰ（３３ｐＭ）を得た。細胞を、２４時間にわたりインキュベ
ートしてから、プレートを、１４００ｒｐｍで８分間にわたり遠心分離し、上清を、ＥＬ
ＩＳＡによるマクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ；ＣＣＬ２２）解析のために回収し
た。上清は、ＭＤＣ ＥＬＩＳＡにおける解析のためにそれらを融解させるまで、−２０
℃で保管した（アッセイ緩衝液中、１：２に希釈してから、ＥＬＩＳＡプレートへと添加
した）。ＭＤＣ ＥＬＩＳＡ解析は、製造元のプロトコール（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、
Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）に従い実施した。
結果
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、カニクイザルＰＢＭＣからの、組換えカニクイザルＴＳＬＰ
誘導性ＭＤＣ分泌の極めて強力な阻害剤であって、０．５ｎｇ／ｍｌの組換えカニクイザ
ルＴＳＬＰに対して、ＩＣ５０を５５．５ｐＭとする阻害剤であった。複数回の実験（ｎ
＝３）についての平均値カニクイザルＰＢＭＣ結果を計算したところ、カニクイザルＴＳ
ＬＰに対する、Ｆａｂ１の平均値ＩＣ５０値は、２５．１ｐＭ±５．９ｐＭのＳＥＭであ
った。
[実施例５]
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の種間交差反応性
材料および方法
Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合解析を実行して、抗ＴＳＬＰ Ｆａ
ｂ１が、ヒト、マウス、またはラットのＴＳＬＰタンパク質に結合するのかどうかを確立
した。Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液、ヒ
トＦａｂ捕捉キット、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カル
ボジイミド）、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、エタノールアミン、ＢＩＡｎ
ｏｒｍａｌｉｚｉｎｇ溶液、７０％（ｗ／ｗ）のグリセロール、およびグリシンを含むＢ
ｉａｃｏｒｅ試薬は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。Ｆａｂの捕捉およびＴ
ＳＬＰ結合解析の両方に使用されるランニングバッファーは、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐ
Ｈ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤
Ｐ２０を伴う、１倍濃度のＨＢＳ−ＥＰ＋であった。組換えヒトＴＳＬＰ、組換えカニク
イザルＴＳＬＰ、または組換えマウスＴＳＬＰ（分子量：１５ｋＤａ）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から得た。組換えラットＴＳＬＰ（分子量
：１５．４ｋＤａ）は、ＵＳＣＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（Ｗｕｈａｎ、
Ｃｈｉｎａ）から得た。
ヒトＴＳＬＰ、マウスＴＳＬＰ、またはラットＴＳＬＰを注射する前に、捕捉手法を使
用して、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５チップ上で、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１を調製した。製造元
の指示書に従い、ヒトＦａｂ捕捉キットを使用して、ヒトＦａｂ結合剤を、ＣＭ５チップ
の４つのフローセル全てに固定化した。流量を１０ｕＬ／分として、３６０秒間にわたる
接触時間を指定した。試料コンパートメントの温度を、１０℃、解析温度を、２５℃とし
、固定化の前に、ＣＭ５チップを、ＨＢＳ−ＥＰ＋でプライミングし、ＢＩＡｎｏｒｍａ
ｌｉｚｉｎｇ溶液で標準化した。０．５ｍｇ／ｍＬの原液１５ｕＬを、ｐＨ５の固定化緩
衝液３６０ｕＬと組み合わせることにより、２０ｕｇ／ｍＬのヒトＦａｂ結合剤３７５ｕ
Ｌを調製した（いずれも、ヒトＦａｂ捕捉キットにより提供されている）。結果として得
られた固定化レベルは、Ｆｃ１、Ｆｃ２、Ｆｃ３、およびＦｃ４中のヒトＦａｂ結合剤約
４０００〜４４００ＲＵであった。
特注のＢｉａｃｏｒｅ法を使用して、１サイクル当たり、約１４ＲＵの抗ＴＳＬＰ Ｆ
ａｂ１を捕捉する、反応速度アッセイを準備した。これは、１０ｕＬ／分の流量で６０秒
間にわたる接触時間に続く安定化時間を３０秒間として、５ｎＭの抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１
を、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中に注入することにより達成した。試料コンパートメントの温
度を、１０℃とし、解析温度を、２５℃とした。この特注Ｂｉａｃｏｒｅ法を使用して、
ｈＴＳＬＰ、ｍＴＳＬＰ、およびｒＴＳＬＰの、捕捉された抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１との相
互作用について査定する反応速度アッセイを準備した。各抗原について、０ｎＭの緩衝液
ブランク、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭ、０．６２５ｎＭ、０．３１３
ｎＭ、０．１５６ｎＭ、０．０７８ｎＭ、０．０３９ｎＭ、０．０２ｎＭを含む、以下の
１０の濃度を、ＨＢＳ−ＥＰ＋中で調製し、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１表面上に注入した。約
１４ＲＵの抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１を捕捉した後で、抗原を、４５ｕＬ／分で、３６０秒間
にわたり注入するのに続き、６００秒間（全ての被験濃度について）または１２００秒間
（０ｎＭおよび２．５ｎＭの抗原濃度について）にわたる解離時間を施した。Ｆａｂ結合
剤表面の再生は、各サイクルの後、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０を、１０ｕ
Ｌ／分で６０秒にわたり注入するのに続く、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液による追加洗浄により
達成した。試料コンパートメントの温度を、１０℃とし、解析温度を、２５℃とした。
全てのＳＰＲ実験および解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００制御ソフトウェアにより制
御される、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００測定器上で行った。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ
２００査定ソフトウェアを使用して処理した。ブラックを控除したセンサーグラムを、抗
ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の交差種反応性についての定性解析のためにプロットした。
結果
Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＰＲ交差反応性実験の結果は、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の、組換えヒ
トＴＳＬＰへの緊密な結合を示す一方、組換えラットＴＳＬＰまたは組換えマウスＴＳＬ
Ｐへの検出可能な結合は見られなかったが、これは、ヒトＴＳＬＰと、齧歯動物ＴＳＬＰ
との低相同性（約４０％）と符合する。
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイにおいて、極めて
大きなアフィニティーで、カニクイザル組換えＴＳＬＰに結合し、組換えカニクイザルＴ
ＳＬＰの極めて強力な阻害剤であった（１ｎｇ／ｍｌの組換えＴＳＬＰに対するＩＣ５０
＝１０．８ｐＭ）。初代ヒトＰＢＭＣアッセイおよび初代カニクイザルＰＢＭＣアッセイ
のいずれにおいても、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、ヒトＰＢＭＣからの、組換えカニクイザ
ルＴＳＬＰ誘導性ＴＡＲＣ分泌（ＩＣ５０＝１１．３ｐＭ）、およびカニクイザルＰＢＭ
Ｃからの、組換えカニクイザルＴＳＬＰ誘導性ＭＤＣ分泌（ＩＣ５０＝５５．５ｐＭ）の
、極めて強力な阻害剤であった。
したがって、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、組換えカニクイザルＴＳＬＰは認識するが、ラ
ットＴＳＬＰまたはマウスＴＳＬＰは認識しない、制限された種間交差反応性を示した。
[実施例６]
喘息のマウス疾患モデルにおける、マウス抗ＴＳＬＰ抗体の有効性
材料および方法
アレルギー性気道応答におけるＴＳＬＰの中和効果を、全身オボアルブミン（ＯＶＡ）
感作に続く、肺への抗原による局所二次感作のマウスモデルにおいて評価した。このモデ
ルは、Ｔｈ２表現型および関連する好酸球性炎症の発生を特徴とした。実施例１の抗ＴＳ
ＬＰ Ｆａｂ１は、実施例５で記載した通り、齧歯動物ＴＳＬＰタンパク質と交差反応し
なかったので、組換えマウスＴＳＬＰの生体活性を、０．５ｎＭのマウスＴＳＬＰに対し
て、約１．３ｎＭのＩＣ５０で完全に中和することが報告されている（データは、Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓから供与された）、市販のサロゲート抗マウスＴＳＬＰモノクローナル
抗体（ＭＡＢ５５５；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用
して、ＴＳＬＰの中和効果を評価した。全てのサイトカインおよびケモカインに特異的な
ＥＬＩＳＡキットもまた、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、１日目および１４日目に、ＯＶＡ（または生理食塩水）およ
びアジュバントとしてのアラムで免疫化した。略述すると、マウスを、腹腔内の１．６ｍ
ｇの水酸化アルミニウム（Ｓｉｇｍａ）中に吸着させた、１００μｇのオボアルブミン（
結晶化されたものを５倍濃度で；Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を含有する、０．９％ 重量／体積
のＮａＣｌ（生理食塩水）０．２ｍＬにより免疫化した。２１日目に、マウスに、エアゾ
ールとして施されるＯＶＡまたは生理食塩水で二次感作し、２４時間後に屠殺した。気管
支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中の、区別した上での細胞数および総細胞数により、炎症を評価
する一方で、特異的ＥＬＩＳＡにより、サイトカインおよびケモカインを測定した。
最終回の鼻腔内ＯＶＡまたはＰＢＳによる二次感作の２４時間後に、４ｍｇ／Ｋｇのペ
ントバルビタールナトリウム（Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘ、Ｈａｒｌｏｗ，ＵＫ）の腹
腔内注射により、マウスに麻酔をかけた。気管にカニューレを挿管し、合計１．２ｍｌの
生理食塩水で肺を洗浄すること（０．４ｍＬずつ３回にわたる）により、ＢＡＬ液を回収
した。各試料について、総細胞数を決定し、サイトスピン調製（Ｓｈａｎｄｏｎ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ．、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を実施した。細胞を、Ｄｉｆｆ−
Ｑｕｉｋ（Ｂａｘｔｅｒ Ｄａｄｅ ＡＧ、Ｄｕｄｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ
）で染色し、標準的な形状基準を使用して区別しながら、細胞２００個を計数した。
ＴＳＬＰ枯渇の、応答の感作期に対する効果について評価するために、抗マウスＴＳＬ
Ｐモノクローナル抗体（１０ｍｇ／Ｋｇ）またはラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照を、
ＯＶＡ感作の１時間前に静脈内投与し、１４日目における追加投与の前にも再度静脈内投
与した。二次感作時におけるＴＳＬＰの役割を評価するために、一部のマウスには、２１
日目におけるＯＶＡのエアゾール投与の１時間前だけに、抗体を施した。これらの抗体静
脈内投与では、有害作用は観察されなかった。
結果は、表示数の実験についての平均値±ＳＥＭとして表す。一元分散分析（ＡＮＯＶ
Ａ）を使用して、群間における有意性を決定した。かなりの分散が見出された場合は、対
応のないスチューデントのＴ検定を使用して、平均値間の比較可能性を評価した。ｐ≦０
．０５の値を、有意であると考えた。
結果
ＯＶＡによる感作および二次感作は、好酸球および好中球を含む気管支肺胞洗浄液中の
細胞数の、対照動物と比較した増大を結果としてもたらした（図３）。これは、単回の抗
原による二次感作後における、かつての応答の経過と符合する。さらに、ＯＶＡにより感
作／二次感作されたマウスの洗浄液中では、多数の炎症性メメディエーターもまた、対照
と比較して上方調節された（図４Ａ〜４Ｃ）。
抗マウスＴＳＬＰ抗体による処置（１０ｍｇ／ｋｇ）は、ＢＡＬ液中の細胞総数を、約
５０％、著明に阻害する一方で、好酸球数を、８０％低減した。抗原感作の非存在下にお
ける抗体処置は、ベースラインにおける洗浄液の細胞組成を著明には変更しなかった。Ｔ
ＳＬＰ活性の下流のマーカーについての解析は、アレルギー性気道炎症と関連するサイト
カインであるＩＬ−１３（図４Ａ）、ならびに、それらのいずれもが、Ｔｈ２細胞および
好酸球の公知の化学誘引物質であって、ＴＳＬＰに刺激された樹状細胞が発生させる化学
誘引物質である、ケモカインエオタキシン２およびＴＡＲＣ（図４Ｂおよび４Ｃ）のレベ
ルの低減を明らかにした。
[実施例７]
ラットにおける、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１についての、薬物動態的特徴付け
材料および方法
静脈内（ＩＶ）ボーラス注射、気管内点滴（ＩＴＩ）、または１ｍｇ／ｋｇで噴霧され
る抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の単回の名目用量による投与の、２０分間にわたる鼻腔内に限る
吸入後のラットにおける、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の薬物動態（ＰＫ）および肺内沈着につ
いて研究した。多様な投与後時点における抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の濃度を、血漿中、ＢＡ
Ｌ液中、ならびに肺ホモジネート試料（肺血管系のＢＡＬおよび血液の潅流後における）
中において決定した。
結果
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、ＩＶ注射後、全身循環から迅速にクリアランスされ、平均終
末消失半減期は、約３時間であった。ＩＴＩまたは吸入の後、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、
全身循環へと緩徐に吸収され、いずれの経路についても、およそ２時間後に血漿Ｃｍａｘ
に達し、平均終末半減期は、ＩＶ投与後に決定される平均終末半減期より長かった（ＩＶ
後の３時間と比較した、ＩＴＩ後の７時間および吸入後の４時間）ことから、吸収律速型
の反応速度が指し示される。抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の全身バイオアベイラビリティーは平
均で、ＩＴＩ後の約６％および吸入後の１％であったが、これはおそらく、ＩＴＩの後で
は、吸入と比較して、肺沈着画分が大きいことに起因する。全身曝露が低度であることと
比較して、ＩＴＩまたは吸入後における、ＢＡＬ液中および肺ホモジネート中の抗ＴＳＬ
Ｐ Ｆａｂ１濃度（＞１００倍）は、投与の２、６、２４、または７２時間後において、
３つのマトリックス全てから回収された投与総量のうちの９７〜９９％を占めた（ＢＡＬ
についての６６〜７９％および肺についての２０〜３１％）。ＢＡＬ中および肺ホモジネ
ート中のそれぞれの、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の推定沈着半減期は平均で、約７および９時
間であった。
[実施例８]
サルにおける、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１についての、薬物動態的特徴付け
材料および方法
１、１０、および２０ｍｇ／ｋｇの用量で、毎日１時間ずつ１４日間にわたる吸入（群
３〜５）、または１６日間の休薬期間の後における、用量を１ｍｇ／ｋｇとする単回ＩＶ
投与に続く、用量を２０ｍｇ／ｋｇとする単回吸入のクロスオーバー（群６）後のカニク
イザルにおいて、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１のトキシコキネティクス、ＰＫ／ＰＤ、および肺
内分布について研究した。ＰＫ／ＰＤ、総ＴＳＬＰのための系列血液試料を回収し、ＰＤ
マーカー評価および免疫原性評価として評価した。加えて、肺ホモジネート試料（終点に
おける）およびＢＡＬ液試料（群３〜５については終点であり、ＰＫ群６については、静
脈内の前および終点における）もまた、ＰＫ評価、総ＴＳＬＰ評価、および免疫原性（Ｂ
ＡＬ液だけについて）評価のために回収した。
結果
吸入後における血清中の抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の全身曝露は、低度であり、推定バイオ
アベイラビリティーは、２０ｍｇ／ｋｇの吸入用量レベルで、１％未満であった。１ｍｇ
／ｋｇの吸入用量は、検出可能な全身曝露をもたらさず、１０ｍｇ／ｋｇの吸入用量と、
２０ｍｇ／ｋｇ吸入用量とは、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１への、同等の全身曝露を示した。Ｃ
ｍａｘには、吸入の約３時間後に達した。ラットにおけるＰＫと同様に、全身消失半減期
は、吸入後において（約７時間）、ＩＶ（約２．３時間）と比較して長かったことから、
吸収律速型の反応速度が指し示される。血清中の曝露の蓄積は、１４日間にわたる投与後
に観察された。低血清曝露（図５）と比較して、終末ＢＡＬ液中および終末肺ホモジネー
ト中の抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１濃度についての予備的データは、はるかに高く、用量の増大
と共に増大した（図６）。
[実施例９]
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１についての、結晶構造解析およびエピトープマッピング
本実施例では、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１を、遊離状態またはヒトＴＳＬＰとの複合体で結
晶化させ、対応する結晶構造を決定した。ヒトＴＳＬＰに結合する抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１
についての、Ｘ線データに基づく解析は、ヒトＴＳＬＰ上の抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１のエピ
トープについての洞察をもたらした。
材料および方法
ヒトＴＳＬＰおよび抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の調製および精製
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、抗ＴＳＬＰｍＡｂ１（１０．６ｍｇ）を、１０ｍＭのＤＴＴ
を伴う、１００ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）中、室温で２時間にわたり（ＲＴ）、２１μ
ｇのパパインで消化することにより作り出した。反応は、３０μＭの、パパイン阻害剤で
あるＥ６４により停止させた。次いで、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１を、２０ｍＭのリン酸ナト
リウム（ｐＨ７．０）で平衡化させた、５ｍＬのＬａｍｂｄａ Ｓｅｌｅｃｔカラム上で
精製した。Ｆａｂは、０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ３．０で溶出させ、回収された画分のｐ
Ｈは、１：１０に希釈した、１Ｍのトリス、ｐＨ８．５で速やかに調整した。ＬＣ−ＭＳ
解析は、４７１０７．７Ｄａの観察質量を示したが、これは、重鎖がＴｈｒ２２８の後で
切断され、そのアミノ末端においてピログルタミン酸残基を保有する、予測されるアミノ
酸配列と合致した。結晶化のために、限外濾過デバイスを使用する濃縮−希釈ステップの
繰返しにより、緩衝液を、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５ｍＭのＮａＣｌ
と交換し、試料を、最終的に、１３ｍｇ／ｍｌの抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１へと濃縮した。
Ｎ末端のヘキサヒスチジンタグ（配列番号４０）に続き、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（Ｈ
ＲＶ−３Ｃプロテアーゼ）切断部位を伴う、ヒトＴＳＬＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ登録番号：Ｑ
９６９Ｄ９；アミノ酸２９〜１５９）の構築物をクローニングし、大腸菌（E. coli）内
で、封入体として発現させた。リフォールディングのために、８９．４ｇの大腸菌（E. c
oli）細胞を、１ｍＭのＥＤＴＡ、６ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．３７５Ｍスクロース
を伴う、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．０）７１５ｍｌ中で、Ａｖｅｓｔｉｎ（登録商標）
高圧ホモジナイザーにより溶解させた。３．７ｋＵのベンゾナーゼを伴う、３０分間にわ
たるインキュベーションの後、溶解物を、ＳＳ−３４固定角ローターにより、１３，００
０ｒｐｍで、３０分間にわたり遠心分離した。ペレットを、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５
ＭＮａＣｌ、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を伴う、１００ｍＭのトリス（ｐＨ７．０
）３８７ｍｌ中に再懸濁させ次いで、１３，５００ｒｐｍで、５０分間にわたり遠心分離
した。ペレットを、２０ｍＭのＥＤＴＡを伴う、１００ｍＭのトリスｐＨ７．０ ３８７
ｍｌ中に、再度再懸濁させ、１３，５００ｒｐｍで３０分間にわたり遠心分離し、この洗
浄手順を、４回にわたり繰り返し、１３ｇの封入体をもたらした。次いで、封入体を、５
０ｍＭの酢酸カリウム（ｐＨ５．０）、５ｍＭのＥＤＴＡ、および１０ｍＭのＴＣＥＰを
伴う、６Ｍの塩酸グアニジン溶液６５ｍｌ中で可溶化させた。室温で２時間にわたるイン
キュベーションの後、試料を、２０，０００ｒｐｍ（ＳＳ−３４固定角ローター）で３０
分間にわたり遠心分離した。上清（７０ｍｌ）を、上記で記載した塩酸グアニジニウム溶
液により、１００ｍｌへと希釈した。リフォールディングは、０．５Ｍ塩酸アルギニン、
５ｍＭのＥＤＴＡ、および１ｍＭのＧＳＨを伴う、１００ｍＭのトリス（ｐＨ８．２５）
１０Ｌによる、４℃における急速希釈により実施した。希釈の後、０．１ｍＭのグルタチ
オンジスルフィド（ＧＳＳＧ）を添加し、リフォールディングミックスを、緩徐な撹拌下
、４℃で７日間にわたりインキュベートした。次いで、酢酸により、ｐＨを５．１へと調
整し、０．１ｍＭのＧＳＳＧを添加して、残りのＴＣＥＰを破壊した。わずかに混濁した
リフォールディング溶液を、Ｓａｒｔｏｂｒａｎ ０．６５／０．４５μｍフィルターカ
プセルにより濾過し、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ １０ｋＤ交差流膜により、７５０ｍｌへと濃縮
した。濃縮した溶液を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４ １０Ｌに対して透析し
た。リフォールディングしたＴＳＬＰ約５５０ｍｇを回収した。最終精製試料についての
ＬＣ−ＭＳ解析は、全てのジスルフィド架橋が形成されたことを確認し、ｄｅｓ−Ｍｅｔ
生成物（分子量＝１６８６２．８Ｄａ）９４％と、Ｎ末端のメチオニンを伴うタンパク質
６％とを示した。抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１による結晶化のために、リフォールディングした
ＴＳＬＰ試料を、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼによりＮ末端のタグを切断せずに
使用した。
ＴＳＬＰ−Ｆａｂ複合体を調製するために、５０ｍＭのＮａＣｌを伴う、２５ｍＭのト
リス（ｐＨ７．４）中に、２倍モル過剰量のＨｉｓ６−ＰｒｅＳｃ−ＴＳＬＰタンパク質
（配列番号４０として開示される「Ｈｉｓ６」）を、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１へと添加し、
試料を、限外濾過により、約１０ｍｇ／ｍｌへと濃縮し、ＳＰＸ−７５サイズ除外クロマ
トグラフィーカラムへとロードし、２５ｍＭのＮａＣｌを伴う、１０ｍＭのトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．４中で、等張的に溶出させた。ピーク画分を、限外濾過により、９．２ｍｇ
／ｍｌへと濃縮し、結晶化スクリーニングにかけた。
結晶化およびＸ線データの収集
シッティングドロップ蒸気拡散法により、結晶を、９６ウェルプレート（Ｉｎｎｏｖａ
ｄｙｎｅ ＳＤ２プレート）内で増殖させた。詳述すると、０．２μｌのタンパク質原液
を、０．２μｌのレザバー溶液と混合し、液滴を、８０μｌの同じレザバー溶液に対して
、２０℃で平衡化させた。実験は、Ｐｈｏｅｎｉｘロボットシステム（Ａｒｔ Ｒｏｂｂ
ｉｎｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により準備し、ＲｏｃｋＩｍａｇｅｒ ｈｏｔｅｌ（
Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ）内に保管し、自動でイメージングした。
Ｘ線データ収集のために、結晶を、ＣｒｙｏＬｏｏｐに直接マウントし、液体窒素中で
、瞬時冷却した。Ｘ線データセットは、Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅビームラ
インＸ１０ＳＡで、１．００００１ÅのＸ線放射線を使用して、Ｐｉｌａｔｕｓピクセル
検出器により収集した。いずれの場合も、振動を０．２５°ずつとする７２０の画像を、
結晶−検出器間距離を３４５ｍｍとして記録し、２０１０年１２月６日バージョンのＸＤ
Ｓ（Kabsch 1993, J Appl Crystallogr; 26:795-800）であって、ＡＰＲＶに実装されて
いるＸＤＳで処理した。
構造の決定および解析
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の構造は、抗ＣＤ１３２抗体Ｆａｂ断片の結晶構造を出発モデル
として使用して、Ｐｈａｓｅｒプログラム（McCoy, A. J. et al. 2007 J. Appl. Crysta
llogr. 40: 658-674）による分子置換法を介して決定した。抗ＣＤ１３２抗体のＦａｂは
、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１との配列類似性に基づき選択した。可変ドメインおよび第１定常
ドメインを独立の検索モデルとして使用して、Ｆａｂの肘角度の可変性を可能とした。モ
デル構築サイクルの反復に続き、Ｃｏｏｔ ０．８．０プログラム（Ｃｒｙｓｔａｌｏｇ
ｒａｐｈｉｃ Ｏｂｊｅｃｔ−Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｔｏｏｌｋｉｔ；Emsley et al., 201
0, Acta Crystallogr Sect D: Biol Crystallogr; 66:486-501）およびＡｕｔｏｂｕｓｔ
ｅｒ ２．１１．５プログラム（Bricogne et al., 2011, BUSTER version 2.11.2. Camb
ridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd.）による、自動式結晶構造解析リファイン
メントを使用して、構造をリファイニングした。
ＴＳＬＰ−Ｆａｂ複合体の構造は、自社内で既に、別の抗体のＦａｂ断片と複合させて
決定した、遊離抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１およびヒトＴＳＬＰの、のリファイニングされた構
造を使用して、Ｐｈａｓｅｒプログラムによる分子置換法を介して決定した。ここでもま
た、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の可変ドメインおよび第１定常ドメインを、独立の検索モデル
として使用した。構造は、以前に、遊離Ｆａｂについて記載した通り、Ｃｏｏｔ ０．８
．０およびＡｕｔｏｂｕｓｔｅｒ ２．１１．５によりリファイニングした。
結晶構造の目視観察は、Ｃｏｏｔプログラム（Emsley et al., 2010, Acta Crystallog
r Sect D: Biol Crystallogr; 66:486-501）およびＰｙＭＯＬプログラム（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ；ＤｅＬａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：Ｐａ
ｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して実行した。最終的なリファイニングモデルの品質は、
ＣｏｏｔプログラムおよびＰＲＯＣＨＥＣＫ ｖ３．３プログラム（Laskowski et al.,
1992, J Appl Crystallogr; 26:283-291）により評価した。抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１への結
合時に、溶媒へのアクセスが低下するヒトＴＳＬＰの残基は、ＣＣＰ４プログラムシリー
ズのＡＲＥＡＩＭＯＬプログラム（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏ
ｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｎｕｍｂｅｒ ４、１９９４年）により同定した。分子間接点
は、４．０Åのカットオフ距離を使用して規定し、ＣＣＰ４のＮＣＯＮＴプログラムによ
り同定した。
結果
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の結晶構造
遊離抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１およびヒトＴＳＬＰとのその複合体を、シッティングドロッ
プによる蒸気拡散法を介して、９６ウェルプレート内、１９℃で結晶化させた。興味深い
ことに、２つタンパク質試料は、同じ結晶化条件：０．１７Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、８
５ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．６、２５．５％のＰＥＧ ＭＭＥ ２０００、１５％
のグリセロール下で結晶化した。結晶は、４〜５週間後に現れ、数日以内に完全なサイズ
まで成長した。
遊離Ｆａｂの結晶は、斜方晶系空間群Ｐ２１２１２１内にあり、非対称単位１つ当たり
のＦａｂ分子１つを伴った。Ｆａｂ−ＴＳＬＰ複合体の結晶は、空間群Ｉ２２２内にあり
、非対称単位当たり１つの複合体を伴った（表３）。いずれの結晶も、高解像度まで回折
され、品質が良好で冗長性が大きな、完全な回折データセットを、それらの各々から収集
することができた（表３）。
分子置換法による構造決定は、既に決定したヒトＴＳＬＰ構造を使用して実施した。Ａ
ｕｔｏｂｕｓｔｅｒによるリファインメントは、良好なリファインメント統計および全体
の形状をもたらした（表３）。遊離Ｆａｂの構造では、２つの抗体残基である、Ａｓｐ５
０ＬおよびＡｓｐ１５２Ｌが、ラマチャンドランプロットの異常値であった。Ｆａｂ−Ｔ
ＳＬＰ複合体の構造では、これらの２つの残基に加えて、第３の抗体残基であるＴｙｒ１
０３Ｈもまた、ラマチャンドランプロットの異常値であった。これらの３つ残基は、十分
に規定された電子密度を有したので、純粋に形状上の異常値である。Ａｓｐ５０Ｌおよび
Ｔｙｒ１０３Ｈが、下記で記載される、ＴＳＬＰへの結合に関与するＣＤＲ残基であるこ
とは、注目に値する。
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を、図１Ａおよび１Ｂに提示し
、ＣＤＲに下線を付し（Kabat, 1991, Sequences of proteins of immunological intere
st, NIH Publication No. 91-3242により規定される通りに）、抗体−抗原間界面に位置
する残基を、＊で表示する。
ヒトＴＳＬＰと複合した抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の結晶構造
本実施例で使用される組換えヒトＴＳＬＰのアミノ酸配列（配列番号３８）を、図２に
提示する。成熟ヒトＴＳＬＰは、Ｔｙｒ２９から始まった。本実施例で使用される構築物
は、Ｎ末端のヘキサヒスチジンタグ（配列番号４０）（残基１５〜２０）に続き、ＨＲＶ
−３Ｃプロテアーゼ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ）認識部位（残基２１〜２８）、およびク
ローニングから生じる残基１１〜１４を有した。Ａｓｎ６４およびＡｓｎ１１９は、潜在
的なＮ結合型グリコシル化部位であり；残基１２７〜１３０は、潜在的なフリン切断部位
（ＲＲＫＲ、配列番号３９）を構成した。二次構造エレメントを、アミノ酸配列の下方に
示す：ボックスは、αヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤを表し、太線は、ループ領域を表
す。
ＴＳＬＰは、サイトカインのＩＬ−２スーパーファミリーの他のメンバーとの、著明な
アミノ酸配列類似性を提示しない。しかし、ＴＳＬＰは、ＩＬ−２、ＩＬ−７および他の
多くのサイトカインと同様に、上−上−下−下のトポロジーを伴う、４ヘリックスバンド
ルとしてフォールディングした（図７）。ヘリックスαＡは、Ｔｈｒ４６の周囲の、その
中心近傍に、強いキンクを保有した。ヘリックスαＢおよびαＣは、各々、３つのターン
だけを伴うやや短いヘリックスであったが、Ｃ末端のヘリックスαＤは、５つのターンを
伴う長いヘリックスであった（図７）。３つのジスルフィド（Ｃｙｓ３４−Ｃｙｓ１１０
、Ｃｙｓ６９−Ｃｙｓ７５、Ｃｙｓ９０−Ｃｙｓ１３７）は、この短鎖の４ヘリックスバ
ンドルを安定化させた。しかし、αＡおよびαＢ、ならびにαＣおよびαＤの、２つのク
ロスオーバー接続は、大部分が無秩序であり、この結晶構造内では見られなかった。αＢ
−αＣループに由来する３つのアミノ酸、および最後の５つのカルボキシル末端残基もま
た、最終的なリファイニング構造では逸失していた。潜在的なフリン切断部位およびＮ−
グリコシル化部位は、逸失する接続部内に位置した。
Ｆａｂ−ＴＳＬＰ複合体の三次元構造の全体図を、図７に示す。
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、一方の側では、Ｈ−ＣＤＲ１およびＨ−ＣＤＲ２により裏打
ちされ、他方の側では、Ｈ−ＣＤＲ３およびＬ−ＣＤＲ３により裏打ちされた、浅いグル
ーブを通る、ＴＳＬＰのヘリックスαＡに主に結合した。ヘリックスαＡの顕著なキンク
は、グルーブの中心部分を占めた。隣接するヘリックスαＣおよびαＤと、αＡ−αＢル
ープの最初の４つの残基は、抗体へのさらなる接点に寄与した。
Ｆａｂ−ＴＳＬＰ複合体の形成によって、溶媒にアクセス可能な表面が合わせて約１７
００Å２にわたり埋め込まれることから、Ｆａｂの２５のアミノ酸残基およびＴＳＬＰの
２５のアミノ酸残基は、複合体の形成時に、それらの溶媒にアクセス可能な表面の低減を
経る。４．０Åの距離カットオフを使用したところ、これらのうちで、Ｆａｂの２０の残
基およびＴＳＬＰの１６の残基（表４を参照されたい）は、直接的な分子間接点に関与し
た。形状／相補性統計であるＳｃ（Lawrence and Colman, 1993, J Mol Biol; 234:946-5
0）は、０．７２に等しく、抗体−タンパク質複合体としては、比較的高値であった（Sun
dberg and Mariuzza, 2003, Adv Protein Chem; 61:119-60）。抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の
６つのＣＤＲ全ては、ＴＳＬＰへの結合に寄与した。さらに、十分に規定された６つの水
であって、抗体−抗原間界面に位置する水も、結合相互作用を媒介する。
結合界面に位置するＴＳＬＰ残基は、（ｉ）４．０Å未満の水素以外の原子の間の分子
間接点と、（ｉｉ）複合体形成時における、溶媒にアクセス可能な表面の低減とを計算す
ることにより、結晶構造解析座標から同定した。結果を、図８のグラフに示し、抗体から
見たＴＳＬＰエピトープを、図９に示した。これらの２つの図から見られうる通り、ヘリ
ックスαＡは、αＡ−αＢループの最初の４つ残基と併せてエピトープのコアを形成し、
ＴＳＬＰ上の、分子間接点の総数および埋め込まれた、溶媒にアクセス可能な表面のうち
の８２％に寄与した。さらに、鍵となるエピトープ残基の大半の部分：Ｌｙｓ４９、Ｉｌ
ｅ５２、Ｇｌｙ５７、およびＬｙｓ５９が、この領域内で見出された。これと比較して、
ヘリックスαＣおよびαＤは、極めて少数のエピトープ残基：Ｌｙｓ１０１（αＣ）、Ｇ
ｌｎ１４５、およびＡｒｇ１４９（αＤ）に寄与した。
抗原への結合時における、それらの溶媒にアクセス可能な表面の低減、および直接的な
分子間接点に対するそれらの寄与により証拠立てられる通り、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の６
つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の全ては、結合界面に寄与した（図１０Ａおよび１０Ｂ）
。加えて、軽鎖の第３のフレームワーク領域（Ｌ−ＦＲ３）のＡｓｎ６５Ｌもまた、抗原
結合性界面に位置したが、ＴＳＬＰのＬｙｓ５９に対する、弱い（３．６Å）Ｈ結合型相
互作用をもたらすに過ぎなかった。
Ｈ−ＣＤＲ３ループは、特に重要な役割を果たした。Ｇｌｕ１０１Ｈは、ＴＳＬＰのＬ
ｙｓ４９、ならびにループの先端部に位置する３つの連続チロシンである、Ｔｙｒ１０３
Ｈ、Ｔｙｒ１０４Ｈ、およびＴｙｒ１０５Ｈとの、極めて重要な塩架橋相互作用をもたら
し、併せて、全重鎖によりもたらされる接点のうちの５８％に寄与した。Ｈ−ＣＤＲ１の
Ｔｒｐ３３Ｈ、およびＨ−ＣＤＲ２のＡｓｐ５６Ｈもまた、重要なパラトープ残基であり
、それぞれ、ＴＳＬＰのＬｙｓ４９およびＬｙｓ１０１への結合に寄与した。
Ｔｒｐ９２Ｌは、抗原との直接的な接点をもたらす、唯一のＬ−ＣＤＲ３残基であった
。この残基は、Ｌ−ＣＤＲ３の先端部に位置し、遊離抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の結晶構造内
で規定されたコンフォメーションを採らなかった。しかし、ＴＳＬＰ複合体内では、側鎖
が十分に規定された電子密度を有し、αＡ−αＢループへの広範な接点をもたらし、その
寄与は、全軽鎖によるもたらされる接点のうちの４２％に達した。Ｌ−ＣＤＲ２のＡｓｐ
５０ＬおよびＬ−ＣＤＲ１のＴｙｒ３１Ｌは、軽鎖によりもたらされる、他の２つ重要な
パラトープ残基であった。前者は、ＴＳＬＰのＬｙｓ５９との、極めて射程の短い（２．
８Å）静電相互作用をもたらした。後者は、ＴＳＬＰのＩｌｅ５２、Ｌｙｓ５９、および
Ｇｌｎ１４５との結合相互作用に寄与し、また、Ｔｙｒ１０３ＨおよびＴｙｒ１０４Ｈと
のπ−π相互作用を介して、Ｈ−ＣＤＲ３ループの結合型コンフォメーションも安定化さ
せた。
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の作用方式
ＴＳＬＰシグナル伝達は、ＴＳＬＰ、コグネイトのＴＳＬＰＲ鎖、および共有されるＩ
Ｌ−７Ｒα鎖を含む、三元複合体のアセンブリーを要求する。ＴＳＬＰ−ＴＳＬＰＲ二元
複合体の形成は、ＩＬ−７Ｒα鎖の動員のための前提である。全てのＴＳＬＰＣα原子に
基づき、ヒトＴＳＬＰ−Ｆａｂ１複合体を、マウスＴＳＬＰ−ＴＳＬＰＲ−ＩＬ−７Ｒα
三元複合体へと重ね合わせた。構造的重複は、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１が、ＴＳＬＰの、Ｔ
ＳＬＰＲおよびＩＬ−７Ｒαの両方への結合を遮断することを裏付けた。ＴＳＬＰのヘリ
ックスαＡは、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１エピトープの中心的エレメント（図１１Ｂ）であり
、このヘリックスはまた、ＴＳＬＰＲおよびＩＬ−７Ｒαのいずれへの結合においても、
中心的役割も果たした（図１１Ａ）。加えて、ヘリックスαＣは、ＩＬ−７Ｒαへの結合
に関与し、ヘリックスαＤは、ＴＳＬＰＲ結合界面の一部であった。これらの２つヘリッ
クスはまた、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１エピトープにも寄与したので、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１
と、２つ受容体鎖との間の立体障害は、広範であった。抗体の軽鎖が、ＴＳＬＰＲのＤ２
ドメインと広範に重なり合ったのに対し、重鎖は、ＩＬ−７ＲαのＤ２ドメインと重なり
合い、また、Ｄ１ドメインのループに結合するサイトカインの一部とも重なり合った（図
１１Ｃ）。データは、サイトカインをスカベンジングし、ＴＳＬＰＲ受容体へのその結合
を防止し、こうして、ＩＬ−７Ｒαとの、高アフィニティーのシグナル伝達複合体の形成
を遮断することにより、ＴＳＬＰ Ｆａｂ１が、ＴＳＬＰを中和することを裏付けた。
まとめると、遊離状態にあるか、またはリフォールディングした組換えヒトＴＳＬＰと
複合した、高解像度の抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の結晶構造を決定した。抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ
１は主に、ヒトＴＳＬＰのヘリックスαＡ（アミノ酸残基Ｌｙｓ３８〜Ｔｈｒ５３）に結
合し、ヘリックスαＣ（Ｌｙｓ１０１）およびαＤ（Ｇｌｎ１４５、Ａｒｇ１４９）、な
らびにαＡ−αＢループ（アミノ酸残基Ｓｅｒ５６〜Ｌｙｓ５９）からの寄与は、重要で
あるが少数であることが見出された。抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１と複合したヒトＴＳＬＰの、
公表されているＩＬ−７ＲＡおよびＴＳＬＰＲ細胞外ドメインとのマウスＴＳＬＰ複合体
への構造的重複は、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１が、ＴＳＬＰへの結合について、ＩＬ−７ＲＡ
およびＴＳＬＰＲの両方と競合することを示した。抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１に結合したＴＳ
ＬＰは、ＴＳＬＰＲに結合することができず、ＩＬ７Ｒα受容体の動員もまた、Ｆａｂと
、ＩＬ−７α受容体との間の広範な立体障害に起因して阻害される。
[実施例１０]
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の噴霧乾燥工程および製剤化
噴霧乾燥装置および操作
特注の噴霧乾燥器を使用して、原料を噴霧乾燥させた。噴霧乾燥器の構成は、単一のノ
ズル、二連の流体アトマイザー、乾燥チャンバー、サイクロン、アダプター、単離バルブ
、および温度制御型ジャケット内の、１リットルの回収器を含む。本明細書で記載される
実施形態では、噴霧乾燥工程は、アトマイゼーション工程、乾燥工程、および粒子回収工
程を含みうる。
例示的なアトマイゼーション工程は、以下のステップ：（Ａ１）製剤化された原料流体
を、蠕動ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ）を通して、制御された流量で、噴霧乾燥
器内にマウントされた、単一ノズルの空気支援型アトマイザーへとフィードしうるステッ
プと；（Ａ２）制御された流量の圧縮乾燥空気を、同心円状の収束型ガスノズルへとフィ
ードするステップと；（Ａ３）ノズル先端部における空気の膨張により、原料流を、微細
な液滴噴霧へとアトマイズするステップとを含みうる。
乾燥工程は、以下のステップ：（Ｂ１）電気ヒーターにより加熱された乾燥空気を、設
定温度および制御流量で、乾燥チャンバーへとフィードするステップと；（Ｂ２）高温の
乾燥空気が、ステップＡ３による微細な液滴噴霧と相互作用するステップであって、液滴
中の溶媒（水）が蒸発する結果として、固体粒子をもたらすステップと；（Ｂ３）粒子お
よび溶媒蒸気／空気が、規定の温度の乾燥チャンバーから放出されるステップとを含みう
る。
粒子回収工程は、以下のステップ：（Ｃ１）ステップＢ３による、粒子および溶媒以外
の蒸気／空気が、高接線速度で、サイクロンに進入するステップと；（Ｃ２）粒子を、遠
心力により、空気混合物から分離し、温度制御型回収容器内のサイクロンの底部に回収す
るステップと；（Ｃ３）溶媒以外の排出蒸気／排気が、フィルターを通過し、アイソレー
ター内の雰囲気へと送気されるステップとを含みうる。
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の吸入可能粉末の工程および製剤化
この部分は、多様な賦形剤と共に製剤化された、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の粒子を含む、
吸入可能粉末を調製するのに使用される、製剤化および噴霧乾燥工程を提示する。これは
、タンパク質（抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１）と、主に、分散性増強剤（例えば、トリロイシン
）またはガラス形成剤（例えば、糖、緩衝塩）として機能する賦形剤とを含む、単相の水
性原料を噴霧乾燥させるステップを伴った。原料のｐＨは、標的ｐＨをｐＨ５．０〜ｐＨ
５．５として、ヒスチジン−ＨＣｌ緩衝液により制御した。粒子の加工原理を適用するこ
とにより、粗度の大きな粒子（各々が、ガラス状マトリックス中で安定化させたタンパク
質のコアを、改善された粉末の分散性を改善し、活性薬剤を保護する、疎水性賦形剤のシ
ェルで取り囲んだ粒子）を含む粉末を創出するように、賦形剤および組成物を選択した。
図１２は、賦形剤：タンパク質比の増大により、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の物理化学的安
定性を改善し、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の凝集速度を低減した製剤を示す。
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１を含むＰｕｌｍｏＳｏｌ製剤
この部分は、製造スループットを増大させ、シェルの形成を最適化するように、異なる
総固体濃度およびトリロイシン含量で製剤化された原料組成物を提示する。高固体濃度は
、粉末産生のスループットを増大させる。本実施例では、１つの製剤を例外として、ＴＳ
ＬＰ Ｆａｂ１含量を５０％で固定し、前出の実施例と比較した。
抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１および１５％のトリロイシンを含む製剤
この部分は、トリロイシンの限定的な水溶性に対応しながら、原料および結果として得
られる粒子の許容可能なｐＨを維持するようにデザインされた、いくつかの製剤に焦点を
当てる。本実施例では、トリロイシンを、水性ＨＣｌ中に溶解させ、原料溶液の標的ｐＨ
（ｐＨ５．０〜ｐＨ５．５）を達するように、多様な塩基性培地を使用して逆滴定した。
トリロイシンを完全に溶解させるように、ＨＣｌの、トリロイシンに対する約１：１モル
比が要求された。

[実施例１１]
溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により決定される、抗ＴＳＬＰＦａｂ１の、ヒトおよびカニクイ
ザルのＴＳＬＰタンパク質に対する結合アフィニティー
溶液平衡滴定（ＳＥＴ）の測定を実行して、抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１の、ヒトおよびカニ
クイザルのＴＳＬＰタンパク質への結合アフィニティーを決定した。Ｆａｂを、一定の濃
度で、それぞれの抗原の系列希釈と共にインキュベートした。結合アフィニティーを、結
合しなかった抗体の濃度のリードアウトを、適用された抗原濃度に対してプロットするこ
とにより作成された競合曲線から抽出した。抗ＴＳＬＰ Ｆａｂ１は、全てのヒトおよび
カニクイザルのＴＳＬＰタンパク質について、低ピコモル（ｐＭ）レベルの範囲の結合ア
フィニティーを示した。
アッセイ手順
ヒトＴＳＬＰ抗原（ＨＥＫ細胞内で作製された）およびカニクイザルＴＳＬＰ抗原の、
２２の１．６ｎ倍系列希釈液を、試料緩衝液中で調製し、一定濃度のＦａｂ１を添加した
。ウェル１つ当たりの容量６０μｌの各抗原−Ｆａｂミックスを、二連で、ポリプロピレ
ン製の３８４ウェルマイクロ滴定プレート（ＭＴＰ）へと分配した。試料緩衝液を、陰性
対照として用い、Ｆａｂ１だけを含有する試料を、陽性対照とし用いた（Ｂｍａｘ）。プ
レートをシーリングし、シェーカー上、室温（ＲＴ）で、一晩にわたり（ｏ／ｎ、少なく
とも１６時間）インキュベートした。
３８４ウェルＭＳＤアレイＭＴＰを、ＰＢＳ中、５μｇ／ｍｌで希釈された、ウェル１
つ当たり３０μｌのＴＳＬＰ（大腸菌（E. coli）内で産生された）により、４℃で一晩
にわたりコーティングし、次いで、ウェル１つ当たり７０μｌの洗浄緩衝液で３回にわた
り洗浄し、ウェル１つ当たり５０μｌのブロッキング緩衝液で、シェーカー上、ＲＴで１
時間にわたりブロッキングした。洗浄の後、容量をウェル１つ当たり３０μｌとする、平
衡化させた抗原−Ｆａｂミックスを、ポリプロピレンＭＴＰから、コーティングされたＭ
ＳＤプレートへと移し、ＲＴで２０分間にわたりインキュベートした。
さらなる洗浄ステップの後、試料緩衝液中、１．８μｇ／ｍｌで希釈された、３０μｌ
のｓｕｌｆｏタグ付け検出抗体を、各ウェルへと添加し、シェーカー上、ＲＴで３０分間
にわたりインキュベートした。ＭＳＤプレートを洗浄し、１倍濃度のＭＳＤリード緩衝液
ウェル１つ当たり３５μｌを添加し、ＲＴで５分間にわたりインキュベートした。ＥＣＬ
シグナルを発生させ、ＭＳＤ Ｓｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００で測定した。
各抗原について、３つの独立の実験を実施し、安定的なアッセイ条件を裏付けた。これ
らの実験の、解離平衡定数ＫＤの平均値および標準偏差は、下記で示す通りに計算した。
[実施例１２]
カニクイザルにおける、２週間にわたる、吸入用量範囲発見研究
この非ＧＬＰ研究では、目的は、毎日１回１４日間にわたる吸入経路を介して、または
１日目における単回投与のＩＶ注射であって、１３日間にわたる非投与期間および１５日
目における単回の吸入投与を後続させる注射として、カニクイザルへと投与される場合の
、抗胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）Ｆａｂである、Ｆａｂ１の潜在的な毒性を
決定することであった。加えて、Ｆａｂ１の薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）プロファイ
ルおよび免疫原性（ＩＧ）も探索した。
研究は、単一の研究の、２つの別個の構成要素として行った。
吸入だけ：ＰｕｌｍｏＳｏｌ中に３９．７％のＦａｂ１である、Ｆａｂ１ Ｐｕｌｍｏ
Ｓｏｌ粉末を、吸入により、カニクイザルの３つの群（３匹の雄／群）へと、１日当たり
１ｋｇ当たりのＦａｂ１ １．０、１０．０、および２０．０ｍｇの毎日の標的用量で投
与した。サル（２匹の雄）の別の群は、プラセボのＰｕｌｍｏＳｏｌ粉末を施され、対照
として用いられた。さらに一匹の雄動物は、空気だけを施され、空気対照としての役目を
果たした。Ｆａｂ１ ＰｕｌｍｏＳｏｌエアゾールおよびプラセボＰｕｌｍｏＳｏｌエア
ゾールは、回転ブラシ型発生デバイス（ＲＢＧ１０００）を使用して発生させた。緊密に
適合する口鼻マスクを使用して、動物を、Ｆａｂ１ ＰｕｌｍｏＳｏｌ粉末（群３〜５）
またはプラセボＰｕｌｍｏＳｏｌ粉末（群２）のエアゾールへと、毎日１回１４日間、標
的の６０分間にわたり曝露した。準備された同じ装置を使用して、群１の単一の雄動物を
、濾過された乾燥空気だけへと、同じ標的時間にわたり曝露した。投与されたＦａｂ１の
全体の平均値エアゾール濃度は、群３、４、および５について、それぞれ、０．０３６、
０．３１、および０．６６ｍｇ／Ｌであった。全体の平均値（推定総）送達用量は、群３
、４、および５について、それぞれ、１日当たり１ｋｇ当たりのＦａｂ１ １．１、９．
６、および１９．９ｍｇであった。空気動力学質量中央径（ＭＭＡＤ）は、発生させたＦ
ａｂ１エアゾールが、サルに吸入可能であり、許容可能な肺沈着量が、被験種について達
成されることを確認した。
静脈内／吸入：Ｆａｂ１を、３匹の雄動物の群（群６）へと、１日目に、伏在静脈を介
する単回の静脈内ボーラス注射を介して投与した。標的用量は、１ｋｇ当たりのＦａｂ１
１ｍｇであった。次いで、動物に、１３日間にわたる非投与期間を与えてから、１５日
目に、吸入により、ＰｕｌｍｏＳｏｌ中に３９．７％のＦａｂ１である、Ｆａｂ１ Ｐｕ
ｌｍｏＳｏｌ粉末を投与した。標的用量は、１ｋｇ当たりのＦａｂ１ ２０ｍｇであった
。Ｆａｂ１ ＰｕｌｍｏＳｏｌエアゾールは、回転ブラシ型発生デバイス（ＲＢＧ１００
０）を使用して発生させた。緊密に適合する口鼻マスクを使用して、動物を、Ｆａｂ１
ＰｕｌｍｏＳｏｌのエアゾールへと、単一の機会に、標的の６０分間にわたり曝露した。
次いで、動物を、６日間にわたり保持してから、２１日目に、安楽死させた。投与された
Ｆａｂ１の全体の平均値エアゾール濃度は、０．６０ｍｇ／Ｌであった。全体の平均値推
定総送達用量は、１日当たり１ｋｇ当たりのＦａｂ１ １６．３ｍｇであった。空気動力
学質量中央径（ＭＭＡＤ）は、発生させたＦａｂ１エアゾールが、サルに吸入可能であり
、許容可能な肺沈着量が、被験種について達成されることを確認した。
本研究では、以下のパラメータおよび評価項目：臨床徴候、体重、体重変化、臨床病理
学パラメータ（血液学、凝固、および臨床化学）、Ｆａｂ１濃度およびＴＳＬＰ濃度、な
らびにトキシコキネティクスパラメータ（血清、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、肺組織抽
出物）についてのバイオアナリシス、抗Ｆａｂ１抗体（血清およびＢＡＬ液）、肉眼的部
検所見、臓器重量、ならびに組織病理学検査（群１〜５だけ）について査定した。
Ｆａｂ１の、吸入投与を介する、１４日間にわたる投与は、雄カニクイザルの、鼻腔内
の見かけの変化（呼吸器上皮内の粘膜細胞の増大）、肺の見かけの変化（瀰漫性肺胞マク
ロファージの蓄積、細気管支肺胞リンパ細胞充実性の増大、および混合型肺胞炎症性細胞
の浸潤）、および気管支リンパ節の見かけの変化（一般的な細胞充実性の増大）を結果と
してもたらした。これらの変化は、全ての処置群の動物間で明らかであった。所見の重症
度は、全ての症例において、最小限〜軽度であり、観察は、有害と考えられなかった。
Ｆａｂ１への全体的な曝露は、Ｆａｂ１で処置された全ての動物において、血清中、気
管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中、および肺抽出物中の濃度データに基づき裏付けられたが、
この場合、Ｆａｂ１は、空気対照動物またはプラセボＰｕｌｍｏＳｏｌ対照動物に由来す
る試料のうちのいずれにおいても検出されなかった。バイオアベイラビリティーは、１５
日目の吸入投与後において、約０．２％であると計算された。投与前の１日目には、群４
の動物１匹だけの血清中に、抗Ｆａｂ１抗体が検出され、１４日目には、群５の動物１匹
だけの血清中にも、抗Ｆａｂ１抗体が検出されたが、観察されるシグナルは、これらの動
物におけるＦａｂ１への曝露に対して、見かけの影響を及ぼさないと考えられた。研究で
は、Ｆａｂ１の明白な全体的免疫原性は検出されなかった。試料の大部分における、血清
中、ＢＡＬ中、または肺組織内では、第１の洗浄試料（ＢＡＬ手順時に、３匹のＦａｂ１
処置動物から回収された）中で検出される、一部の極めて低度のシグナルを除き、総ＴＳ
ＬＰは検出されなかった。
結論として、Ｆａｂ１の、３匹のカニクイザルへの、１日目における単一の静脈内ボー
ラス注射としての投与であって、１３日間にわたる非投与期間、および１５日目における
単回の吸入投与を後続させる投与は、有害作用を結果としてもたらさなかった。Ｆａｂ１
の、カニクイザルへの、１４日間にわたる吸入投与は、全ての処置群の動物の鼻腔内、肺
内、および気管支リンパ節内の見かけの変化と関連した。所見の重症度は、全ての症例に
おいて、最小限〜軽度であり、観察は、有害と考えられなかった。Ｆａｂ１を施される全
ての動物は、被験薬へと全身曝露された。
[実施例１３]
カニクイザルにおける、１３週間にわたる吸入による毒性研究
本研究の目的は、吸入経路により、毎日１回ずつ、少なくとも連続９２日間（１３週間
）にわたり、カニクイザルへと施された場合の、Ｆａｂ１である、抗胸腺間質性リンパ球
新生因子（ＴＳＬＰ）Ｆａｂの潜在的な毒性を決定し、４２日間（６週間）にわたる回復
期間後における、任意の所見の潜在的な転導可能性について査定することであった。加え
て、Ｆａｂ１のトキシコキネティクスおよび免疫原性特徴も決定した。
Ｆａｂ１ ＰｕｌｍｏＳｏｌ粉末を、吸入により、カニクイザルの３つの群（群１つ当
たり性別当たり３匹）へと、１日当たり１ｋｇ当たり３、１０、および２２ｍｇの毎日の
標的用量で投与した。サル（性別当たり３匹）の別の群には、プラセボＰｕｌｍｏＳｏｌ
粉末を施し、対照として用いた。プラセボ群内および１日当たり１ｋｇ当たり２２ｍｇ群
内の、さらに２匹の動物（性別当たり２匹）を、６週間の回復期間にわたり、研究に維持
した。Ｆａｂ１ ＰｕｌｍｏＳｏｌエアゾールおよびプラセボＰｕｌｍｏＳｏｌエアゾー
ルは、回転ブラシ型発生デバイス（ＲＢＧ１０００）を使用して発生させた。緊密に適合
する口鼻マスクを使用して、動物を、Ｆａｂ１ ＰｕｌｍｏＳｏｌ粉末（群２〜４）また
はプラセボＰｕｌｍｏＳｏｌ粉末（群１）のエアゾールへと、毎日１回少なくとも連続９
２日間、標的の６０分間にわたり曝露した。
以下のパラメータおよび評価項目：臨床徴候、体重、体重変化、眼科検査、神経学的検
査（呼吸数を含む）、心電図、臨床病理学パラメータ（血液学、凝固、臨床化学、および
尿検査）、末梢血リンパ球免疫表現型解析（フローサイトメトリー）、免疫機能（スカシ
ガイヘモシアニン（ＫＬＨ）に対する、Ｔ細胞依存性抗体応答（ＴＤＡＲ））、Ｆａｂ１
濃度およびトキシコキネティクスパラメータ（血清および肺組織抽出物）についてのバイ
オアナリシス、抗Ｆａｂ１抗体（血清）、肉眼的部検所見、臓器重量、ならびに組織病理
学検査について査定した。
投与されたＦａｂ１の全体の平均値エアゾール濃度は、群２、３、および４について、
それぞれ、０．１０、０．３３、および０．７２ｍｇ／Ｌであった。全体の推定平均値総
送達用量（性別を組み合わせた）は、群２、３、および４について、それぞれ、１日当た
り１ｋｇ当たりのＦａｂ１ ３．０、１０．１、および２２．２ｍｇであった。空気動力
学質量中央径（ＭＭＡＤ）は、発生させたＦａｂ１エアゾールが、サルに吸入可能であり
、許容可能な肺曝露量が、被験種について達成されることを確認した。
明白な被験薬関連作用であって、１日当たり１ｋｇ当たり３、１０、または２２ｍｇの
用量で達成されるＦａｂ１の投与後における、心血管パラメータのうちのいずれかについ
て観察される作用は見られなかった。
免疫機能（ＴＤＡＲ）の探索の結果は、達成された１日当たり１ｋｇ当たり≧１０．１
ｍｇの用量において、抗ＫＬＨ ＩｇＧ抗体レベルの低下への傾向を指し示した。最後の
サンプリング時点（研究７８日目）では、達成された１日当たり１ｋｇ当たり≧３ｍｇの
用量において、抗ＫＬＨ ＩｇＧ抗体および抗ＫＬＨ ＩｇＭ抗体のレベルの低下が留意
された。この効果は、雄では、全ての時点において極めて顕著であり、雌では７８日目に
おいて極めて顕著であったが、他のサンプリング機会における雌では、それほど顕著では
なかった。抗ＫＬＨ応答の減少への傾向は、有害とは考えられなかった。群４（１日当た
り１ｋｇ当たり２２．２ｍｇ）の回復動物における、抗ＫＬＨ ＩｇＧ抗体および抗ＫＬ
Ｈ ＩｇＭ抗体のレベルは、全ての機会において、同時的な対照（群１）の回復値と比較
して高レベルであったが、対照（群１）の主要な研究結果と同様であったことから、低下
した抗ＫＬＨ抗体応答の回復が裏打ちされる。吸入投与を介する、少なくとも９２日間に
わたるＦａｂ１の投与は、１日当たり１ｋｇ当たり３ｍｇの達成された用量で、肺内のリ
ンパ組織の細胞充実性の増大を結果としてもたらした。所見の重症度は、全ての症例にお
いて、最小限〜軽度であり、有害と考えられなかった。６週間にわたる回復期間の後、回
復動物４匹中２匹（５０％）では、所見が見られなかったが、最小限の重症度である高用
量動物４匹中２匹（５０％）では、所見が観察された。同じ所見はまた、１匹の対照の回
復雌においても存在した（軽度）ことから、この変化が、対照動物間でも散発的に見出さ
れうることが確認される。Ｆａｂ１は、プラセボＰｕｌｍｏＳｏｌ対照群（群１）動物に
由来する血清または肺組織試料のうちのいずれにおいても検出されなかった。全体的に、
Ｆａｂ１への曝露は、Ｆａｂ１で処置された動物において、投与期間を通して裏付けられ
、血清中および肺組織内のいずれにおいても、用量と関連する増大が見られた。血清中の
全身曝露はまた、９２日目における最終回の投与後、最長で１４〜２８日間にわたる回復
時にも裏付けられたが、肺組織濃度は、１３５日目（最終回投与の４２日後）における剖
検時までに、全ての回復動物において検出不能であった。全ての投与群にわたり、研究１
日目〜研究９１日目の、毎日の投与を繰り返した後では、Ｆａｂ１への血清曝露の顕著な
蓄積が認められた。見かけの性差に関連する曝露の差違は、観察されなかった。２匹のプ
ラセボＰｕｌｍｏＳｏｌ対照動物では、投与前ベースラインおよび投与後時点のいずれに
おいても、低度であるが、検出可能な抗薬物抗体（ＡＤＡ）シグナルが観察されたが、こ
れは、Ｆａｂ１に特異的でない既存の抗体に起因する可能性が高い。他のいずれの対照動
物でも、ＡＤＡシグナルは、検出されなかった。全てのＦａｂ１処置動物は、早ければ、
研究２８日目以降、投与後のＡＤＡシグナルを発生させた。３匹の動物における強いＡＤ
Ａシグナルは、明らかに、血清中のＦａｂ１への曝露の喪失と関連したが、これらの動物
では、剖検（最終回投与の約１〜６時間後）時にも、肺におけるＦａｂ１への曝露が裏付
けられた。結論として、カニクイザルへの、Ｆａｂ１の、１３週間にわたる吸入投与は、
１日当たり１ｋｇ当たり最大で２２．２ｍｇの、達成された吸入可能な投与レベルで忍容
された。Ｆａｂ１を施される全ての動物は、全身および肺内のいずれのＦａｂ１曝露も有
することが確認された。抗Ｆａｂ１抗体は、早ければ、２８日目以降、全ての処置動物に
おいて存在し、３匹の個体では、残りの処置動物と比較して、曝露のはるかな低下と関連
した。顕微鏡による査定は、全てのＦａｂ１処置動物の大部分について、肺リンパ組織の
細胞充実性の増大を確認したが、これは、６週間にわたる回復期間後の、高用量回復動物
のうちの５０％において観察された。所見の重症度は、全ての症例において、最小限〜軽
度であり、有害ではないと考えられた。
[実施例１４]
モノクローナル抗体断片の、単純な噴霧乾燥製剤の調製
本明細書で記載されるモノクローナル抗体断片であるＦａｂ１は、４６．６ｋＤａの分
子量を有する。喘息の処置における局所肺送達のための、乾燥粉末製剤について記載する
。この文脈では、「単純」という用語の使用は、医薬有効成分（Ｆａｂ１）および緩衝剤
だけによる製剤を指す。
８９．５％の医薬有効成分と、１０．５％のヒスチジン緩衝液とを含む、一連の単純抗
体製剤を、多様なエタノール／水溶媒組成を含む原料から製造した（表９）。エタノール
含量は、５％〜２０％ｗ／ｗの間で変化させた。原料は、インレット温度を１０５℃、ア
ウトレット温度を７０℃、乾燥ガス流量を５９５Ｌ／分、アトマイザーガス流量を２０Ｌ
／分、液体フィード速度を８．０ｍＬ／分とし、ＡＬＲを２．５×１０３ｖ／ｖとして、
ＮＳＤ噴霧乾燥器上で噴霧乾燥させた。固体含量は、２％ｗ／ｖで固定した。
[実施例１５]
抗体の単純な噴霧乾燥製剤の紛体工学特性
実施例１４の噴霧乾燥抗体製剤の紛体工学特性を、表９に提示する。ＡＰＩおよび緩衝
剤だけを含む単純製剤の全ては、滑らかな粒子表面（すなわち、表面コルゲーションを伴
わない）を伴う粒子をもたらした。少量のエタノールの、水性原料への添加は、粉末のバ
ルク密度およびタップ密度（インスリン製剤についてもまた観察される）を減少させた。
粒子はまた、それらの一次粒子サイズ分布（ＰＰＳＤ）の点でも、比較的大型であった。
[実施例１６]
抗体の単純噴霧乾燥製剤のエアゾール性能
実施例１５で画定した粉末について決定したＤＤおよびＴＬＤを、表１０に提示する。
一次粒子は、空気動力学中央径であるＤａの計算値が、０．７１〜０．９３μｍの間であ
った（式：

を使用して、タップ密度および５０回の測定から計算した）。
概念１の乾燥粉末吸入器は、低抵抗のカプセルベースのデバイスである（Ｒ＝０．０７
ｃｍ Ｈ２Ｏ）１／２／（Ｌ／分））。
表１０のデータからは、密度を低下させるだけでは、口腔−咽喉内の沈着を効果的に回
避する粒子の形成を可能とするのに不十分であることが明らかである。これを達成するた
めには、表面凹凸度（コルゲーション）を増大させるように粒子形状を改変しなければな
らず、一次粒子サイズの減少が所望されるであろう。
ペプチドおよび小型のタンパク質は、シェル形成賦形剤の非存在下にある天然でも、コ
ルゲート形状を取るが、抗体の製剤は、コルゲート粒子の形成を可能とするように、シェ
ル形成賦形剤の添加を要求することに注目することは興味深い。この点で、シェル形成賦
形剤とエタノールの添加とは、噴霧乾燥粒子の壁の厚さおよび密度の改変において、同様
の機能を果たす。よって、シェル形成剤の存在下では、エタノールの添加の影響は小さい
。
[実施例１７]
抗体の、プラットフォームの噴霧乾燥製剤の調製および紛体工学特性
この一連の噴霧乾燥粉末では、噴霧乾燥条件を一定とし、シェル形成賦形剤（すなわち
、トリロイシン、０〜１５％ｗ／ｗ）の添加の影響を、抗体製剤について評価した。これ
らの製剤はまた、ガラス形成剤としてのトレハロース（トリロイシン含量に応じて、約２
９〜４４％ｗ／ｗ）およびヒスチジン緩衝液（５．９％ｗ／ｗ、ｐＨ５．０）も含有する
。
粉末は、特注ＮＳＤ噴霧乾燥器上で、インレット温度を１０５℃、アウトレット温度を
７０℃、乾燥ガス流量を５９５Ｌ／分、アトマイザーガス流量を２５Ｌ／分、液体フィー
ド速度を１０．０ｍＬ／分とし、ＡＬＲを２．５×１０３ｖ／ｖとして噴霧乾燥させた。
固体含量は、２％ｗ／ｗで一定に保った。粉末の全ては、シェル形成剤の非存在下で噴霧
乾燥させたロットであって、実施例１６で観察した粒子と同様の滑らかな粒子をもたらし
た、ロット７６１−０２−１２を例外として、コルゲート形状を有した。結果を、表１１
に示す。一部の実施形態では、本発明の乾燥粉末製剤は、シェル形成賦形剤と、ＡＰＩ、
ガラス形成賦形剤、および緩衝剤を含むコアとを含み、本明細書ではまた、場合によって
、プラットフォーム製剤とも称する、コア−シェル粒子を含む。
[実施例１８]
トリロイシン含量を変化させる、抗体の「プラットフォーム」噴霧乾燥製剤のエアゾール
性能
実施例１７に記載した粉末について決定したＤＤおよびＴＬＤを、表１２に提示する。
コルゲート粒子形状を伴う抗体製剤には、ＤＤおよびＴＬＤの著明な改善が観察される
。本発明の実施形態では、所望のコルゲート形状は、粒子表面上のシェル形成賦形剤であ
るトリロイシンの存在から生じる。
本発明の実施形態では、粒子表面上の材料の物理化学的特性は、粒子形状に影響を及ぼ
す。大型のタンパク質（２０，０００ダルトンを上回るある種のタンパク質など）には、
所望の形状を達成するように、トリロイシンなどのシェル形成賦形剤が好ましい。本発明
の実施形態では、製剤および組成物を形成する粒子は、粒子間の凝集力を低減して、凝集
物のサイズが、凝集物が吸入可能となる程度に十分に小さくなるように、コルゲート形状
を有する。
エタノールを添加すると、エタノールは、（他の点では）コルゲート（である）粒子（
(otherwise) corrugated particle）の壁の厚さを減少させることにより、粒子密度を低
下させる。さらにこれは、タップ密度を低下させることから、所望の空気動力学的特性に
従う、小型の一次粒子を可能とする。一部の実施形態では、一次粒子および凝集物が吸入
可能となるように、粒子の密度を低下させるべきである。
エタノール含量を、０％から１０％ｗ／ｗへと増大させると、対になっている製剤７２
８−０６−０４および７６１−０２−１１および７２８−０６−０２および７６１−０２
−１０では、タップ密度の著明な低減が認められる。本実施例における特異的製剤では、
１０％のエタノール単独の添加は、シェル形成賦形剤によりもたらされる改善を超える、
エアゾール性能の標的の改善を与えなかった。ＴＬＤは、優れている（ＤＤの＞８０％）
が、大部分は、粒子が大型かつ稠密に過ぎるため、所望の標的である、ＤＤの９０％ｗ／
ｗを下回る。コルゲート粒子では、一次空気動力学径であるＤａの計算値は、０．７７〜
１．３８μｍの範囲である。
[実施例１９]
工程パラメータ（固体含量および共溶媒添加）の改変の、プラットフォーム抗体製剤の紛
体工学特性に対する影響
製剤は、５０．０％ｗ／ｗのＡＰＩ、５．９％ｗ／ｗのヒスチジン緩衝液（ｐＨ５．０
）、約１４％ｗ／ｗまたは２９％ｗ／ｗのトレハロース、および１５％ｗ／ｗまたは３０
％ｗ／ｗのトリロイシンを含む。粉末は、特注ＮＳＤ噴霧乾燥器上で、インレット温度を
１０５℃、アウトレット温度を７０℃、乾燥ガス流量を５９５Ｌ／分、アトマイザーガス
流量を３０Ｌ／分、液体フィード速度を４．０ｍＬ／分とし、ＡＬＲを７．５×１０３ｖ
／ｖとして噴霧乾燥させた。固体含量は、１％ｗ／ｗへと低減した。噴霧乾燥工程のこれ
らの改変は、一次粒子サイズを低減するようにデザインした。本発明の実施形態では、一
次粒子サイズ分布の有意な低減が観察された。
[実施例２０]
工程パラメータ（固体含量および共溶媒添加）の改変の、プラットフォーム抗体製剤のエ
アゾール性能に対する影響
固体含量の低減およびＡＬＲの増大の、プラットフォーム抗体製剤のエアゾール性能に
対する影響を、表１４に提示する。一次粒子の空気動力学中央径の、実施例１８の粒子と
比べて著明な低減が観察された。これは、ＤＤの約９４％〜９８％の間のＴＬＤ、すなわ
ち、所望であるか、好ましいか、または最適の標的範囲内の性能を意味する。
別段に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が
属する分野の当業者により通例理解される意味と同じ意味を有する。
別段に指し示されない限り、具体的な詳細について記載されていない、全ての方法、ス
テップ、技法、および操作を実施することができ、当業者に明らかな通り、それ自体、公
知の方式で実施されている。例えば、ここでもまた、本明細書で言及される、標準的なハ
ンドブック、および一般的な背景技術、ならびにその中で引用されている、さらなる参考
文献が参照される。
別段に指し示されない限り、本明細書で引用される参考文献の各々は、参照によりその
全体において組み込まれる。
本発明に対する特許請求の範囲は、非限定的なものであり、下記に提示される。
本明細書では、特定の態様および特許請求の範囲について、詳細に開示してきたが、こ
れは、例示だけを目的とする例としてなされたものであり、付属の特許請求の範囲、また
は任意の、対応する、将来の適用についての、特許請求の範囲の対象物の範囲に関して、
限定することを意図するものではない。特に、本発明者らは、特許請求の範囲により規定
される、本開示の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、本開示に対して、多様な
代替、改変、および変更を施しうることを想定する。核酸の出発材料、対象のクローン、
またはライブラリーの種類の選択は、本明細書で記載される態様について通じた当業者に
は、ルーチンの事柄であると考えられる。他の態様、利点、および変更も、以下の特許請
求の範囲内にあると考えられる。当業者は、ルーチンの実験だけを使用して、本明細書で
記載される、本発明の具体的な態様についての、多くの同等物を認識し、これらを確認す
ることが可能であろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲により包摂されるこ
とが意図される。後日になされる、対応する出願における、特許請求の範囲の再起草は、
多様な諸国の特許法による制限に起因する可能性があり、特許請求の範囲の対象物の放棄
として解釈すべきではない。
本明細書では、特定の態様および特許請求の範囲について、詳細に開示してきたが、こ
れは、例示だけを目的とする例としてなされたものであり、付属の特許請求の範囲、また
は任意の、対応する、将来の適用についての、特許請求の範囲の対象物の範囲に関して、
限定することを意図するものではない。特に、本発明者らは、特許請求の範囲により規定
される、本開示の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、本開示に対して、多様な
代替、改変、および変更を施しうることを想定する。核酸の出発材料、対象のクローン、
またはライブラリーの種類の選択は、本明細書で記載される態様について通じた当業者に
は、ルーチンの事柄であると考えられる。他の態様、利点、および変更も、以下の特許請
求の範囲内にあると考えられる。当業者は、ルーチンの実験だけを使用して、本明細書で
記載される、本発明の具体的な態様についての、多くの同等物を認識し、これらを確認す
ることが可能であろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲により包摂されるこ
とが意図される。後日になされる、対応する出願における、特許請求の範囲の再起草は、
多様な諸国の特許法による制限に起因する可能性があり、特許請求の範囲の対象物の放棄
として解釈すべきではない。

本発明は、以下の態様を含む。
［１］
ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）；
配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）；
配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）；
配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）；
配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）；および
配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）
を含む分子；
ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；
配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；
配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；
配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；
配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；および
配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む分子；
ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７のアミノ酸配列を
含む軽鎖可変領域とを含む分子；
ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽
鎖とを含む分子；
ｅ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖
とを含む分子；
ｆ）以下の残基：配列番号２２の重鎖配列のＴｈｒ２８、Ａｓｐ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔ
ｒｐ３３、Ａｓｐ５６、Ｇｌｕ１０１、Ｉｌｅ１０２、Ｔｙｒ１０３、Ｔｙｒ１０４、Ｔ
ｙｒ１０５、または配列番号２５の軽鎖配列のＧｌｙ２８、Ｓｅｒ２９、Ｌｙｓ３０、Ｔ
ｙｒ３１、Ｔｙｒ４８、Ａｓｐ５０、Ａｓｎ５１、Ｇｌｕ５２、Ａｓｎ６５、およびＴｒ
ｐ９２のうちの少なくとも１つを含むパラトープを含む分子；
ｇ）ヒトＴＳＬＰに結合し、
配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；
配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；
配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；
配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；
配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；および
配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む抗体断片；
ならびに
ｈ）ヒトＴＳＬＰに結合し、
配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；
配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；
配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；
配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；
配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；および
配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む抗体断片
のうちのいずれか１つから選択される、ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）に
特異的に結合する分子。
［２］
ヒトＴＳＬＰ内のエピトープに特異的に結合する分子であって、前記エピトープが、以
下の残基：配列番号３８のＬｙｓ３８、Ａｌａ４１、Ｌｅｕ４４、Ｓｅｒ４５、Ｔｈｒ４
６、Ｓｅｒ４８、Ｌｙｓ４９、Ｉｌｅ５２、Ｔｈｒ５３、Ｓｅｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｔｈ
ｒ５８、Ｌｙｓ５９、Ｌｙｓ１０１、Ｇｌｎ１４５、およびＡｒｇ１４９のうちの少なく
とも１つを含む、分子。
［３］
前記エピトープが、配列番号３８の残基の以下のセット：
（ａ）Ｌｙｓ４９およびＩｌｅ５２、
（ｂ）Ｇｌｙ５７およびＬｙｓ５９、
（ｃ）Ｌｙｓ１０１、
（ｄ）Ｇｌｎ１４５およびＡｒｇ１４９
のうちの少なくとも１つを含む、［２］に記載の分子。
［４］
モノクローナル抗体である、［１］から［３］のいずれかに記載の分子。
［５］
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’） 2 、ｓｃＦｖ、ミニボディ、またはダイアボディから
選択される抗体断片である、［１］から［３］のいずれかに記載の分子。
［６］
Ｆａｂである、［１］から［３］のいずれかに記載の分子。
［７］
ヒトまたはヒト化Ｆａｂである、［６］に記載の分子。
［８］
ヒト免疫グロブリンである、［１］から［４］のいずれかに記載の分子。
［９］
１００ｐＭ未満の解離定数（Ｋ D ）で、ヒトＴＳＬＰに結合する、［１］から［８］の
いずれかに記載の分子。
［１０］
１０ｐＭ未満の解離定数（Ｋ D ）で、ヒトＴＳＬＰに結合する、［１］から［８］のい
ずれかに記載の分子。
［１１］
［１］から［１０］のいずれかに記載の分子と、少なくとも１つの、薬学的に許容され
る賦形剤とを含む医薬組成物。
［１２］
前記分子が、前記組成物のうちの約５％〜約９５％、または約１０％〜約９０％、また
は約１５％〜約８５％、または約２０％〜約８０％、または約２５％〜約７５％、または
約３０％〜約７０％、または約４０％〜約６０％、または約４０〜５０％（ｗ／ｗ）であ
る、［１１］に記載の医薬組成物。
［１３］
シェル形成剤を含む、［１１］に記載の医薬組成物。
［１４］
前記シェル形成剤が、トリロイシンまたはロイシンである、［１３］に記載の医薬組成
物。
［１５］
前記トリロイシンまたはロイシンが、前記組成物のうちの約１０〜７５％（ｗ／ｗ）で
ある、［１４］に記載の医薬組成物。
［１６］
前記トリロイシンが、前記組成物のうちの約１０〜３０％（ｗ／ｗ）であるか、または
前記ロイシンが、前記組成物のうちの約５０〜７５％（ｗ／ｗ）である、［１５］に記載
の医薬組成物。
［１７］
少なくとも１つのガラス形成賦形剤を含む、［１１］に記載の医薬組成物。
［１８］
前記少なくとも１つのガラス形成賦形剤が、ヒスチジン、トレハロース、マンニトール
、スクロース、またはクエン酸ナトリウムから選択される、［１７］に記載の医薬組成物
。
［１９］
前記少なくとも１つのガラス形成賦形剤が、トレハロースまたはトレハロースとマンニ
トールとの混合物から選択される、［１８］に記載の医薬組成物。
［２０］
前記ガラス形成賦形剤が、前記組成物のうちの約１５〜３５％（ｗ／ｗ）である、［１
７］に記載の医薬組成物。
［２１］
緩衝剤を含む、［１１］に記載の医薬組成物。
［２２］
前記緩衝剤が、ヒスチジン緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、またはリン酸緩衝液
から選択される、［２１］に記載の医薬組成物。
［２３］
前記緩衝剤が、前記組成物のうちの約５〜１３％である、［２１］に記載の医薬組成物
。
［２４］
乾燥粉末製剤として製剤化される、［１１］に記載の医薬組成物。
［２５］
吸入に適する乾燥粉末製剤として製剤化される、［２４］に記載の医薬組成物。
［２６］
シェルおよびコアを含み、前記シェルが、トリロイシンまたはロイシンを含み、前記コ
アが、
ｉ）前記分子、トレハロース、マンニトール、および緩衝剤；または
ｉｉ）前記分子、トレハロース、緩衝剤、およびＨＣｌ
を含む、噴霧乾燥粒子を含む、［１１］に記載の医薬組成物。
［２７］
前記緩衝剤が、ヒスチジン緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、またはリン酸緩衝液
から選択される、［２６］に記載の医薬組成物。
［２８］
ｉ）トレハロース、マンニトール、ヒスチジン、およびＴＳＬＰ結合性分子を含むコア
、またはトレハロース、ヒスチジン、ＨＣｌ、およびＴＳＬＰ結合性分子を含むコアであ
って、前記ＴＳＬＰ結合性分子が、
ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１
配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２
配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１
配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および
配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、または
ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１
配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２
配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１
配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および
配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む、抗体のＦａｂ断片である、コアと；
ｉｉ）トリロイシンまたはロイシンを含むシェルと
を含む噴霧乾燥粒子を含む医薬組成物。
［２９］
ａ）４０％（ｗ／ｗ）のＴＳＬＰ結合性分子、２５％（ｗ／ｗ）のトリロイシン、合わ
せた重量を３０％（ｗ／ｗ）とするトレハロースおよびマンニトール、ならびに５％（ｗ
／ｗ）のヒスチジン；
ｂ）５０％（ｗ／ｗ）のＴＳＬＰ結合性分子、１５％（ｗ／ｗ）のトリロイシン、２．
６％（ｗ／ｗ）のＨＣｌ、５．６％（ｗ／ｗ）のヒスチジン、ならびに合わせた重量を２
６．８％（ｗ／ｗ）とするトレハロースおよび塩基；または
ｃ）５０％（ｗ／ｗ）のＴＳＬＰ結合性分子、１５％（ｗ／ｗ）のトリロイシン、１９
．４％（ｗ／ｗ）のトレハロース、１３．０４％（ｗ／ｗ）のヒスチジン、および２．５
６％（ｗ／ｗ）のＨＣｌ
を含む、［２８］に記載の医薬組成物。
［３０］
［１］に記載の分子または［１１］に記載の医薬組成物と、前記分子または医薬組成物
を、対象に送達するためのデバイスとを含むキット。
［３１］
前記デバイスが、前記分子または医薬組成物を、エアゾール化形態で送達する、［３０
］に記載のキット。
［３２］
前記デバイスが、乾燥粉末吸入器である、［３０］に記載のキット。
［３３］
それを必要とする対象におけるＴＳＬＰ関連状態を処置する方法であって、前記対象に
、治療有効量の、［１］から［１０］のいずれかに記載の分子または［１１］から［２９
］のいずれかに記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
［３４］
それを必要とする対象におけるＴＳＬＰ関連状態の処置における使用のための、［１］
から［１０］のいずれかに記載の分子または［１１］から［２９］のいずれかに記載の医
薬組成物。
［３５］
それを必要とする対象におけるＴＳＬＰ関連状態を処置するための、［１］から［１０
］のいずれかに記載の分子または［１１］から［２９］のいずれかに記載の医薬組成物の
使用。
［３６］
それを必要とする対象におけるＴＳＬＰ関連状態の処置における使用のための、医薬の
製造における、［１］から［１０］のいずれかに記載の分子の使用。
［３７］
前記ＴＳＬＰ関連炎症性状態が、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、アレル
ギー性鼻副鼻腔炎、アレルギー性結膜炎、好酸球性食道炎、およびアトピー性皮膚炎から
選択される、［３３］に記載の方法、［３４］に記載の分子、または［３５］もしくは［
３６］に記載の使用。
［３８］
前記ＴＳＬＰ関連炎症性状態が、喘息である、［３３］に記載の方法、［３４］に記載
の分子、または［３５］もしくは［３６］に記載の使用。
［３９］
前記分子が、吸入に適する乾燥粉末製剤として製剤化される、［３３］に記載の方法、
［３４］に記載の分子、または［３５］もしくは［３６］に記載の使用。
［４０］
前記分子が、前記対象に、経口投与または鼻腔内投与される、［３３］に記載の方法、
［３４］に記載の分子、または［３５］もしくは［３６］に記載の使用。
［４１］
前記分子が、前記対象に、エアゾール化形態で投与される、［３３］に記載の方法、［
３４］に記載の分子、または［３５］もしくは［３６］に記載の使用。
［４２］
前記分子が、前記対象に、乾燥粉末吸入器により投与される、［３３］に記載の方法、
［３４］に記載の分子、または［３５］もしくは［３６］に記載の使用。
［４３］
前記対象が、ヒトである、［３３］に記載の方法、［３４］に記載の分子、または［３
５］もしくは［３６］に記載の使用。
［４４］
第２の薬剤を、前記対象に投与するステップをさらに含む、［３３］に記載の方法、［
３４］に記載の分子、または［３５］もしくは［３６］に記載の使用。
［４５］
前記第２の薬剤が、コルチコステロイド、気管支拡張剤、抗ヒスタミン剤、抗ロイコト
リエン剤、およびＰＤＥ−４阻害剤からなる群から選択される、［４４］に記載の方法、
分子、または使用。
［４６］
［１］から［１０］のいずれかに記載の分子をコードする核酸。
［４７］
［４６］に記載の核酸を含むベクター。
［４８］
［４６］に記載の核酸または［４７］に記載のベクターを含む宿主細胞。
［４９］
［１］から［１０］のいずれかに記載の分子を作製する方法であって、
前記分子をコードする核酸を発現する宿主細胞を培養するステップと；
前記分子を、培養培地から回収するステップと
を含む方法。
［５０］
［１］から［１０］のいずれかに記載の分子を含む乾燥粉末製剤を作製するための方法
であって、
（ａ）［１］から［１０］のいずれかに記載の分子、トリロイシンまたはロイシン、ガ
ラス形成賦形剤、および緩衝剤を含む水溶液を用意するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の水溶液を、約１２０℃〜約２００℃の間（インレット）の範囲
および５５℃〜約７５℃（アウトレット）の範囲の温度で噴霧乾燥させて、乾燥粉末粒子
を作製するステップと；
（ｃ）前記乾燥粉末粒子を回収するステップと
を含む方法。
［５１］
前記緩衝剤が、ヒスチジン緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、またはリン酸緩衝液
から選択される、［５０］に記載の方法。
［５２］
前記ガラス形成賦形剤が、ヒスチジン、ヒスチジンＨＣｌ、トレハロース、マンニトー
ル、スクロース、またはクエン酸ナトリウムから選択される、［５０］に記載の方法。
［５３］
前記賦形剤：分子の質量比が、０．５を超える、［１１］に記載の医薬組成物。

Claims (53)

  1. ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）；
    配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）；
    配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）；
    配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）；
    配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）；および
    配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）
    を含む分子；
    ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；
    配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；
    配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；
    配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；
    配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；および
    配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
    を含む分子；
    ｃ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７のアミノ酸配列を
    含む軽鎖可変領域とを含む分子；
    ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列を含む軽
    鎖とを含む分子；
    ｅ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖
    とを含む分子；
    ｆ）以下の残基：配列番号２２の重鎖配列のＴｈｒ２８、Ａｓｐ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔ
    ｒｐ３３、Ａｓｐ５６、Ｇｌｕ１０１、Ｉｌｅ１０２、Ｔｙｒ１０３、Ｔｙｒ１０４、Ｔ
    ｙｒ１０５、または配列番号２５の軽鎖配列のＧｌｙ２８、Ｓｅｒ２９、Ｌｙｓ３０、Ｔ
    ｙｒ３１、Ｔｙｒ４８、Ａｓｐ５０、Ａｓｎ５１、Ｇｌｕ５２、Ａｓｎ６５、およびＴｒ
    ｐ９２のうちの少なくとも１つを含むパラトープを含む分子；
    ｇ）ヒトＴＳＬＰに結合し、
    配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；
    配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；
    配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；
    配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；
    配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；および
    配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
    を含む抗体断片；
    ならびに
    ｈ）ヒトＴＳＬＰに結合し、
    配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１；
    配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２；
    配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３；
    配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１；
    配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２；および
    配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
    を含む抗体断片
    のうちのいずれか１つから選択される、ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）に
    特異的に結合する分子。
  2. ヒトＴＳＬＰ内のエピトープに特異的に結合する分子であって、前記エピトープが、以
    下の残基：配列番号３８のＬｙｓ３８、Ａｌａ４１、Ｌｅｕ４４、Ｓｅｒ４５、Ｔｈｒ４
    ６、Ｓｅｒ４８、Ｌｙｓ４９、Ｉｌｅ５２、Ｔｈｒ５３、Ｓｅｒ５６、Ｇｌｙ５７、Ｔｈ
    ｒ５８、Ｌｙｓ５９、Ｌｙｓ１０１、Ｇｌｎ１４５、およびＡｒｇ１４９のうちの少なく
    とも１つを含む、分子。
  3. 前記エピトープが、配列番号３８の残基の以下のセット：
    （ａ）Ｌｙｓ４９およびＩｌｅ５２、
    （ｂ）Ｇｌｙ５７およびＬｙｓ５９、
    （ｃ）Ｌｙｓ１０１、
    （ｄ）Ｇｌｎ１４５およびＡｒｇ１４９
    のうちの少なくとも１つを含む、請求項２に記載の分子。
  4. モノクローナル抗体である、請求項１から３のいずれかに記載の分子。
  5. Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ミニボディ、またはダイアボディから
    選択される抗体断片である、請求項１から３のいずれかに記載の分子。
  6. Ｆａｂである、請求項１から３のいずれかに記載の分子。
  7. ヒトまたはヒト化Ｆａｂである、請求項６に記載の分子。
  8. ヒト免疫グロブリンである、請求項１から４のいずれかに記載の分子。
  9. １００ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、ヒトＴＳＬＰに結合する、請求項１から８のい
    ずれかに記載の分子。
  10. １０ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）で、ヒトＴＳＬＰに結合する、請求項１から８のいず
    れかに記載の分子。
  11. 請求項１から１０のいずれかに記載の分子と、少なくとも１つの、薬学的に許容される
    賦形剤とを含む医薬組成物。
  12. 前記分子が、前記組成物のうちの約５％〜約９５％、または約１０％〜約９０％、また
    は約１５％〜約８５％、または約２０％〜約８０％、または約２５％〜約７５％、または
    約３０％〜約７０％、または約４０％〜約６０％、または約４０〜５０％（ｗ／ｗ）であ
    る、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. シェル形成剤を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
  14. 前記シェル形成剤が、トリロイシンまたはロイシンである、請求項１３に記載の医薬組
    成物。
  15. 前記トリロイシンまたはロイシンが、前記組成物のうちの約１０〜７５％（ｗ／ｗ）で
    ある、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記トリロイシンが、前記組成物のうちの約１０〜３０％（ｗ／ｗ）であるか、または
    前記ロイシンが、前記組成物のうちの約５０〜７５％（ｗ／ｗ）である、請求項１５に記
    載の医薬組成物。
  17. 少なくとも１つのガラス形成賦形剤を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
  18. 前記少なくとも１つのガラス形成賦形剤が、ヒスチジン、トレハロース、マンニトール
    、スクロース、またはクエン酸ナトリウムから選択される、請求項１７に記載の医薬組成
    物。
  19. 前記少なくとも１つのガラス形成賦形剤が、トレハロースまたはトレハロースとマンニ
    トールとの混合物から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 前記ガラス形成賦形剤が、前記組成物のうちの約１５〜３５％（ｗ／ｗ）である、請求
    項１７に記載の医薬組成物。
  21. 緩衝剤を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
  22. 前記緩衝剤が、ヒスチジン緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、またはリン酸緩衝液
    から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 前記緩衝剤が、前記組成物のうちの約５〜１３％である、請求項２１に記載の医薬組成
    物。
  24. 乾燥粉末製剤として製剤化される、請求項１１に記載の医薬組成物。
  25. 吸入に適する乾燥粉末製剤として製剤化される、請求項２４に記載の医薬組成物。
  26. シェルおよびコアを含み、前記シェルが、トリロイシンまたはロイシンを含み、前記コ
    アが、
    ｉ）前記分子、トレハロース、マンニトール、および緩衝剤；または
    ｉｉ）前記分子、トレハロース、緩衝剤、およびＨＣｌ
    を含む、噴霧乾燥粒子を含む、請求項１１に記載の医薬組成物。
  27. 前記緩衝剤が、ヒスチジン緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、またはリン酸緩衝液
    から選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
  28. ｉ）トレハロース、マンニトール、ヒスチジン、およびＴＳＬＰ結合性分子を含むコア
    、またはトレハロース、ヒスチジン、ＨＣｌ、およびＴＳＬＰ結合性分子を含むコアであ
    って、前記ＴＳＬＰ結合性分子が、
    ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１
    配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２
    配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
    配列番号１１のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１
    配列番号１２のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および
    配列番号１３のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３、または
    ｂ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１
    配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２
    配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
    配列番号１４のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１
    配列番号１５のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、および
    配列番号１６のアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
    を含む、抗体のＦａｂ断片である、コアと；
    ｉｉ）トリロイシンまたはロイシンを含むシェルと
    を含む噴霧乾燥粒子を含む医薬組成物。
  29. ａ）４０％（ｗ／ｗ）のＴＳＬＰ結合性分子、２５％（ｗ／ｗ）のトリロイシン、合わ
    せた重量を３０％（ｗ／ｗ）とするトレハロースおよびマンニトール、ならびに５％（ｗ
    ／ｗ）のヒスチジン；
    ｂ）５０％（ｗ／ｗ）のＴＳＬＰ結合性分子、１５％（ｗ／ｗ）のトリロイシン、２．
    ６％（ｗ／ｗ）のＨＣｌ、５．６％（ｗ／ｗ）のヒスチジン、ならびに合わせた重量を２
    ６．８％（ｗ／ｗ）とするトレハロースおよび塩基；または
    ｃ）５０％（ｗ／ｗ）のＴＳＬＰ結合性分子、１５％（ｗ／ｗ）のトリロイシン、１９
    ．４％（ｗ／ｗ）のトレハロース、１３．０４％（ｗ／ｗ）のヒスチジン、および２．５
    ６％（ｗ／ｗ）のＨＣｌ
    を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
  30. 請求項１に記載の分子または請求項１１に記載の医薬組成物と、前記分子または医薬組
    成物を、対象に送達するためのデバイスとを含むキット。
  31. 前記デバイスが、前記分子または医薬組成物を、エアゾール化形態で送達する、請求項
    ３０に記載のキット。
  32. 前記デバイスが、乾燥粉末吸入器である、請求項３０に記載のキット。
  33. それを必要とする対象におけるＴＳＬＰ関連状態を処置する方法であって、前記対象に
    、治療有効量の、請求項１から１０のいずれか一項に記載の分子または請求項１１から２
    ９のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
  34. それを必要とする対象におけるＴＳＬＰ関連状態の処置における使用のための、請求項
    １から１０のいずれか一項に記載の分子または請求項１１から２９のいずれか一項に記載
    の医薬組成物。
  35. それを必要とする対象におけるＴＳＬＰ関連状態を処置するための、請求項１から１０
    のいずれか一項に記載の分子または請求項１１から２９のいずれか一項に記載の医薬組成
    物の使用。
  36. それを必要とする対象におけるＴＳＬＰ関連状態の処置における使用のための、医薬の
    製造における、請求項１から１０のいずれか一項に記載の分子の使用。
  37. 前記ＴＳＬＰ関連炎症性状態が、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性鼻炎、アレル
    ギー性鼻副鼻腔炎、アレルギー性結膜炎、好酸球性食道炎、およびアトピー性皮膚炎から
    選択される、請求項３３に記載の方法、請求項３４に記載の分子、または請求項３５もし
    くは３６に記載の使用。
  38. 前記ＴＳＬＰ関連炎症性状態が、喘息である、請求項３３に記載の方法、請求項３４に
    記載の分子、または請求項３５もしくは３６に記載の使用。
  39. 前記分子が、吸入に適する乾燥粉末製剤として製剤化される、請求項３３に記載の方法
    、請求項３４に記載の分子、または請求項３５もしくは３６に記載の使用。
  40. 前記分子が、前記対象に、経口投与または鼻腔内投与される、請求項３３に記載の方法
    、請求項３４に記載の分子、または請求項３５もしくは３６に記載の使用。
  41. 前記分子が、前記対象に、エアゾール化形態で投与される、請求項３３に記載の方法、
    請求項３４に記載の分子、または請求項３５もしくは３６に記載の使用。
  42. 前記分子が、前記対象に、乾燥粉末吸入器により投与される、請求項３３に記載の方法
    、請求項３４に記載の分子、または請求項３５もしくは３６に記載の使用。
  43. 前記対象が、ヒトである、請求項３３に記載の方法、請求項３４に記載の分子、または
    請求項３５もしくは３６に記載の使用。
  44. 第２の薬剤を、前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法、
    請求項３４に記載の分子、または請求項３５もしくは３６に記載の使用。
  45. 前記第２の薬剤が、コルチコステロイド、気管支拡張剤、抗ヒスタミン剤、抗ロイコト
    リエン剤、およびＰＤＥ−４阻害剤からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法
    、分子、または使用。
  46. 請求項１から１０のいずれかに記載の分子をコードする核酸。
  47. 請求項４６に記載の核酸を含むベクター。
  48. 請求項４６に記載の核酸または請求項４７に記載のベクターを含む宿主細胞。
  49. 請求項１から１０のいずれかに記載の分子を作製する方法であって、
    前記分子をコードする核酸を発現する宿主細胞を培養するステップと；
    前記分子を、培養培地から回収するステップと
    を含む方法。
  50. 請求項１から１０のいずれかに記載の分子を含む乾燥粉末製剤を作製するための方法で
    あって、
    （ａ）請求項１から１０のいずれかに記載の分子、トリロイシンまたはロイシン、ガラ
    ス形成賦形剤、および緩衝剤を含む水溶液を用意するステップと；
    （ｂ）ステップ（ａ）の水溶液を、約１２０℃〜約２００℃の間（インレット）の範囲
    および５５℃〜約７５℃（アウトレット）の範囲の温度で噴霧乾燥させて、乾燥粉末粒子
    を作製するステップと；
    （ｃ）前記乾燥粉末粒子を回収するステップと
    を含む方法。
  51. 前記緩衝剤が、ヒスチジン緩衝液、グリシン緩衝液、酢酸緩衝液、またはリン酸緩衝液
    から選択される、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記ガラス形成賦形剤が、ヒスチジン、ヒスチジンＨＣｌ、トレハロース、マンニトー
    ル、スクロース、またはクエン酸ナトリウムから選択される、請求項５０に記載の方法。
  53. 前記賦形剤：分子の質量比が、０．５を超える、請求項１１に記載の医薬組成物。
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