JPWO2012001889A1 - Ｔｓｌｐを恒常的に高発現する細胞、及び前記細胞を利用したｔｓｌｐ調節剤のスクリーニング方法 - Google Patents

Ｔｓｌｐを恒常的に高発現する細胞、及び前記細胞を利用したｔｓｌｐ調節剤のスクリーニング方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、TSLPを恒常的に産生するマウス上皮細胞株とその利用に関する。より詳細には、本発明は、TSLPを恒常的に産生するマウス上皮細胞株（KCHM-1）を用いたTSLP調節剤のスクリーニング方法、及び前記細胞株を用いた天然型TSLPの製造方法に関する。

Description

本発明は、TSLPを恒常的に産生するマウス上皮細胞株とその利用に関する。より詳細には、本発明は、TSLPを恒常的に産生するマウス上皮細胞株（KCHM-1）を用いたTSLP調節剤のスクリーニング方法、及び前記細胞株を用いた天然型TSLPの製造方法に関する。
Thymic stromal lymphopoietin (TSLP)は、胸腺ストローマ細胞の培養上清から単離されたIL-7様のサイトカインである。TSLPはアレルギー発症のマスタースイッチとして注目されており、TSLPが肺や皮膚などの局所で発現するとTh2タイプの免疫反応が惹起され、喘息やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性炎症を発症する。
これまで、in vitroの実験系において、気道上皮細胞、皮膚ケラチノサイト、線維芽細胞、マスト細胞をTNF-α、IL-4、LPS、dsRNAなどで刺激するとTSLPの産生が誘導されることが報告されている（非特許文献１〜３)。
TSLPのアレルギー誘発作用は、樹状細胞の活性化を介したTh2細胞の分化誘導等に起因することがin vitroで明らかにされている（非特許文献４）。しかしながら、アレルギー疾患を含む炎症の機構は複雑で、TSLPの作用メカニズムについても未知の部分が多い。
アトピー性皮膚炎患者の多くでは、その皮膚病変部のケラチノサイトにおいて、TSLPが高発現していることが報告されており、TSLPをアレルギー疾患の予防あるいは治療の新たな標的とした特許出願もなされている。
たとえば、TSLPのアゴニストやアンタゴニストを使用して、樹状細胞活性を調節し、免疫障害を処置する方法や、プロテアーゼ抵抗性を付与した組換えTSLPを用いた医薬組成物に関する特許出願がある（特許文献１及び２）。
TSLPの作用メカニズムの解析やTSLP調節剤の探索は、アレルギー疾患の新たな予防あるいは治療方法の提供にとって極めて有用と思われる。しかしながら、TSLPはin vivoでは容易に検出されるが、in vitroでケラチノサイトのTSLP産生を誘導することは困難で、公知の哺乳動物細胞株におけるTSLP発現量も非常に少ない。TSLPの組換え発現系も構築されているが、TSLPの産生機構が異なるため、TSLPの正確な産生制御機構をみることができない。また、現在市販されているTSLPは糖鎖の付かない組換えTSLPであるため、哺乳動物細胞が産生するTSLPと生化学的性質が異なる可能性がある。
そのため、TSLP作用メカニズムの解析や、TSLP標的薬の探索に有用なネイティブなTSLPを高発現する細胞系の構築が望まれていた。
特表２００５−５１６６０６号 特表２００５−５０５２９３号
Bogiatzi S.I. et al., J. Immunol. (2007) 178: 3373-3377, Kato A. et al., J. Immunol. (2007) 179: 1080-1087, Allakhverdi Z et al., J. Exp. Med. (2007) 204: 253-258 Soumelis V., Nat. Immunol. (2002) 3: 673-680
本発明の課題は、TSLPを介した炎症やアレルギーの制御機構に基づき、TSLPを標的とした抗炎症剤や抗アレルギー剤を開発するための新規なツールを提供することにある。
発明者らは、広島大学医学部 秀教授によって樹立されたマウス皮膚上皮細胞株KCMH-1株が、無刺激下においても大量にTSLPを産生することを見出した。TSLPはin vivoでは容易に検出されるが、in vitroでのケラチノサイトのTSLP産生を誘導することは難しく、公知の哺乳類上皮細胞株を用いたTSLP産生系はこれまで存在しなかった。
TSLPはアレルギーや炎症の発症と密接な関連を有することが知られており、本細胞株は、このTSLPを介したアレルギーや炎症の病態解明や、TSLPを標的とした薬剤のin vitro評価系として極めて有用である。
すなわち、本発明は、受託番号FERM BP-11368で特定されるKCMH-1細胞株又はこれと実質的に同等のTSLP産生能を有するその変異株に被験物質を作用させ、得られるTSLP産生量を測定することを特徴とする、TSLP調節剤のスクリーニング方法に関する。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、以下の工程を含む：
１）被験物質の存在下及び非存在下において、KCMH-1細胞株又はこれと実質的に同等のTSLP産生能を有するその変異株を培養する工程、
２）被験物質の存在下及び非存在下におけるTSLP産生量を比較する工程。
前記方法において、TSLP産生量は、TSLPと特異的に結合する抗TSLP抗体を用いて測定できる。例えば、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ELISA法、RIA法、又はフロービーズアレイ法等の免疫学的方法を用いることができる。
TSLP産生量は遺伝子（mRNA）レベルで評価してもよい。そのような方法も、上記した「TSLP産生量を測定すること」に含まれる。遺伝子の発現量は、遺伝子チップ、アレイ等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法など公知の方法を用いて測定することができる。
１つの実施態様において、TSLP調節剤はTSLP産生抑制剤である。TSLP産生抑制剤をスクリーニングする場合においては、被験物質の存在下におけるTSLP産生量が非存在下におけるTSLP産生量に比較して有意に低い場合に、当該被験物質をTSLP産生抑制剤候補として選択する。
TSLP産生抑制剤としては、たとえば抗アレルギー剤又は抗炎症剤を挙げることができる。
本発明はまた、KCMH-1細胞株又はこれと実質的に同等のTSLP産生能を有するその変異株を含む、TSLP調節剤のスクリーニング用キットを提供する。
前記キットは、さらに抗TSLP抗体、あるいは抗TSLP抗体と抗TSLP抗体に特異的に結合しうる二次抗体を含んでいてもよい。
本発明はさらに、受託番号FERM BP-11368で特定されるKCMH-1細胞株、又はこれと実質的に同等のTSLP産生能を有するその変異株を培養することを特徴とする、TSLPの製造方法も提供する。
本発明によれば、簡便に天然型のTSLPを得ることができる。
また、本発明によれば、培養細胞系により、被験物質のTSLP調節活性を簡便に評価することができる。TSLP調節活性を有する物質は、抗アレルギー薬あるいは抗炎症薬として利用できる可能性があるため、本発明はそのような薬剤の簡便で安価なスクリーニング系として利用することができる。とくに、本発明で用いられるKCMH-1細胞株はケラチノサイト由来であるため、皮膚アレルギーの治療・予防薬のスクリーニング、あるいはそのメカニズムの探索に有用である。
図１は、KCMH-1細胞、PAM212細胞、HaCaT細胞のTSLP産生量を比較した結果を示す（図中、左より、KCMH-1細胞、PAM212細胞、HaCaT細胞）。 図２は、デキサメタゾンとFK506刺激後のKCMH-1細胞のTSLP産生量を示す（図中、左より、無添加（control）、デキサメタゾン0.1μM、デキサメタゾン1.0μM、FK506 0.1μM、FK506 1.0μM）。 図３は、KCMH-1細胞のTSLP産生に対するRXRアゴニストHX-600の効果を示す（右：HX-600 1μM 添加、左：無添加）。 図４は、KCMH-1細胞のTSLP産生に対する各種チロシンキナーゼ阻害薬の効果を比較した結果を示す（図中、左より、DMSO（control）Herbimycin A 3μM、PP2 (3μM)、Piceatannol 100μM、AG490 100μM、WHI-P154 30μM）。 図５は、KCMH-1細胞のTSLP産生に対する各種セリンスレオニンキナーゼ阻害薬の効果を比較した結果を示す（図中、左より、DMSO、U0126 1μM、SB203580 10μM、SP600125 30μM、wortmannin 100nM、BAY11-7082 10μM、Go-6976 3μM）。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１０−１４６２６２号の明細書に記載された内容を包含する。
１．KCMH-1細胞株
本発明で用いられる「KCMH-1細胞株」は、後述する参考例に記載するように、広島大学医学部 秀教授によって、マウス皮膚がん細胞から樹立されたケラチノサイト細胞株で、受託番号FERM P-21965として、２０１０年５月２１日付にて、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１-１-１ つくばセンター 中央第６）に国内寄託され、その後２０１１年４月２５日付にて国際寄託への移管がなされ、同センターに受託番号FERM BP-11368として国際寄託されている。
発明者らは、このKCMH-1細胞株が、恒常的にTSLPを産生すること、産生されるTSLP量は他のケラチノサイトにおいて刺激によって誘導される量に比べてはるかに高いことを見出した。
前述したように、TSLPはin vivoでは容易に検出されるが、in vitroでのケラチノサイトのTSLP産生を誘導することは難しく、公知の哺乳類上皮細胞株を用いたTSLP産生系はこれまで知られていない。TSLP遺伝子を導入することにより強制的にTSLPを高発現させることも可能であるが、TSLP遺伝子導入細胞は、TSLP産生制御機構がインタクトな細胞とは異なるため、生体内でのTSLPを介したアレルギーや炎症の病態を正確に反映するものではない。
本発明のKCMH-1細胞株には、上記したような問題はなく、生体におけるTSLP産生機構の解明やその調節剤を探索するための培養細胞系として極めて有用である。
本発明では、上記したKCMH-1細胞株やその子孫に加えて、実質的に同等のTSLP発現能を有する限り、その変異株（以下、「KCMH-1細胞変異株」という）も用いることができる。「KCMH-1細胞変異株」としては、例えば、その栄養要求性変異株や薬剤耐性変異株、遺伝子導入株等を挙げることができる。
２．TSLP
Thymic stromal lymphopoietin (TSLP)は、胸腺ストローマ細胞の培養上清から単離された121個のアミノ酸からなるIL-7様のサイトカインである。TSLPはアレルギー発症のマスタースイッチとして注目されており、TSLPが肺や皮膚などの局所で発現するとTh2タイプの免疫反応が惹起され、喘息やアトピー性皮膚炎などのアレルギー性炎症を発症する。TSLPのアレルギー誘発作用は、樹状細胞の活性化を介したTh2細胞の分化誘導等に起因することがin vitroで明らかにされている。
これまで、in vitroの実験系おいて、気道上皮細胞、皮膚ケラチノサイト、線維芽細胞、マスト細胞をTNF-α、IL-4、LPS、dsRNAなどで刺激するとTSLPの産生が誘導されることが報告されている。一方、デキサメタゾンはTSLPの産生を抑制するが、シクロスポリンAおよびFK506はTSLPの産生を抑制しないことが報告されている。
例えばKatoらは、48時間培養したヒト正常気道上皮細胞3x104 個に、IL-4 (100 ng/ml)、IL-13 (100 ng/ml)、インターフェロン-γ(100 ng/ml)、インターフェロン-β(1000 U/ml)、toll-like receptor 3 リガンド dsRNA (25μg/ml)ならびに TNF-α(100 ng/ml)を加え、TSLP mRNAの発現量及び培養液中の TSLP量を経時的に解析し、dsRNA, TNF-α+IL-4、あるいはTNF-α+IL-13刺激によってTSLPが誘導されることを報告している（Kato, A. et al., J. Immunol. (2007) 179: 1080-1087 ）。
Allakhverdiらは、ヒト初代気道上皮細胞をIL-1 (10 ng/ml)、TNF-α(25 ng/ml)、PGN (100 μg/ml)、PolyI:C (50μg/ml)、LPS (1μg/ml)、CpG (5μM)で48時間刺激し、その培養液上清中の TSLP量を測定するとともに、各細胞におけるtoll-like receptor mRNAの発現を測定している。ヒト初代気道上皮細胞には主にTLR2およびTLR3が発現しており、それぞれのリガンドPGNおよびPoly I:CによりTSLPの産生が上昇することを示している。さらに肺胞洗浄液中の細胞にTSLP受容体を発現させた細胞を、刺激されたヒト初代気道上皮細胞の培養上清(SNT)を、TSLP中和抗体の存在下、非存在下で３日間培養し、その細胞増殖を解析するとともに、同様に刺激後24時間後の培養液上清中のIL-13を測定し、TSLPは細胞増殖活性とIL-13産生誘導活性があることを示している。このようにTSLPは感染による呼吸器系でのアレルギー・炎症の増悪にも関与している可能性が高く、TSLPは感染を伴う呼吸器疾患の標的分子になる(Allakhverdi, Z. et al., J. Exp. Med. (2007) 204: 253-258)。
一方、Leらは、IL-4 (100 ng/ml), IL-13 (100 ng/ml), TNF-α(20 ng/ml) 存在下polyI:C で刺激したヒト正常ケラチノサイト、デキサメタゾン、シクロスポリン A、FK506及びその溶剤である DMSOを刺激と同時に添加したヒト正常ケラチノサイトにおける、24時間培養後の培養液上清中のTSLP測定し、デキサメタゾンによってTSLP産生が抑制され、シクロスポリン AおよびFK506では抑制されないことを報告している（Allergy 2009, 64, 1231-1232）。
また、アトピー性皮膚炎やリウマチなど、アレルギー関連疾患患者において、TSLPが高発現していることが報告されている。
例えばOzawaらは、リウマチ患者(RA)及び骨関節症患者(OA)由来滑膜線維芽細胞においてTSLP産生量が亢進していることを報告している（Mod. Rheumatol 2007, 17, 459-463）。彼らは、リウマチ患者(RA)及び骨関節症患者(OA)から得られた滑膜線維芽細胞(2.5x107cell/well)を、IMD-0354 (IMD, IκB kinase阻害薬、10μM)あるいはデキサメタゾン (0.1 nM)存在下 LPS (1 μg/ml)あるいはpolyI:C (10μg/ml)で刺激して24時間培養後、培養上清中の TSLP量を測定している。また、LPSあるいはpolyI:Cで刺激し、IκBαレベルの変化を経時的に解析している。これらからTLRリガンドによりTSLPが産生されること、そしてTSLPはアレルギー性疾患だけでなく、関節リウマチの標的分子でもあることを報告している。
以上の知見は、TSLPが呼吸器疾患、アトピー性皮膚炎やリウマチを含む炎症・アレルギー治療の標的として極めて有用であることを示唆する。すなわち、TSLP産生の調節・制御を評価するための培養細胞系として利用可能な本発明のKCMH-1細胞株は、炎症・アレルギー治療薬を含むTSLP調節剤のin vitroスクリーニング系として有用であることを示している。
３．TSLP調節剤のスクリーニング方法
３．１ TSLP調節剤
上記した知見に基づき、本発明はKCMH-1細胞株を用いたTSLP調節剤のスクリーニング方法を提供する。
ここで、「TSLP調節剤」とは、TSLP産生量を直接あるいは間接的に調節・制御することにより、TSLPを介した炎症、アレルギー等の症状を調節、予防、治療しうる物質（化合物、組成物等）を意味する。換言すれば、「TSLP調節剤」とは、TSLP活性制御剤あるいはTSLP標的薬である。TSLP調節剤は、TSLP産生量を抑制するものと促進するものの双方を含む。TSLPは一般に炎症やアレルギーのメディエーターであるため、TSLP産生量を抑制する「TSLP産生抑制剤」は抗アレルギー剤や抗炎症剤として有用である。後述する実施例において、発明者らは、デキサメタゾンがKCMH-1細胞株のTSLP産生量を顕著に抑制することを確認している。
本発明においては、KCMH-1細胞株に加えて、これと実質的に同等のTSLP産生能を有するその変異株も用いることができる。すなわち、KCMH-1細胞株又はこれと実質的に同等のTSLP産生能を有するその変異株に被験物質を作用させ、得られるTSLP産生量を測定することにより、被験物質がTSLP調節剤として利用可能かどうかを評価する。
３．２ KCMH-1細胞の培養
KCMH-1細胞又はこれと実質的に同等のTSLP産生能を有するその変異株は、動物細胞の培養に通常用いられる基本培地を用いて接着培養を行う。基本培地としては、例えば、DMEM培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、MEMα培地、Dulbecco MEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、McCoy's培地、ウイリアムスＥ培地、およびこれらの混合培地などを用いることができる。
上記基本培地には、細胞の維持増殖に必要な各種栄養源や分化誘導に必要な各成分を添加してもよい。
例えば、栄養源としては、グリセロール、グルコース、果糖、ショ糖、乳糖、ハチミツ、デンプン、デキストリン等の炭素源、また、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール類等の炭化水素類、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源、食塩、カリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等の無機塩類、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウムおよび硫酸マンガン、各種ビタミン類、アミノ酸類等を含むことができる。
その他必要に応じて、ピルビン酸、ピルビン酸、βメルカプトエタノール等のアミノ酸還元剤、血清あるいは血清代替物等を挙げることができる。なお血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、βメルカプトエタノール又は3’チオールグリセロール、市販のKnockout Serum Replacement（KSR）、Chemically-def ined Lipid concentrated（Gibco社製）、Glutamax（Gibco社製）が挙げられる。
これらの成分を配合して得られる培地のpHは5.5〜9.0、好ましくは6.0〜8.0、より好ましくは6.5〜7.5の範囲である。
培養は、36℃〜38℃、好ましくは36.5℃〜37.5℃で、1％〜25％ O2、1％〜15％ CO2の条件下で行われる。
３．３ TSLP産生量の測定
本発明において、指標とする「TSLP産生量」とはTSLPの物理的な量に限定されず、これを間接的に示す活性、力価（抗体価等）も含む。また、TSLP産生量の測定はタンパクレベルのに限定されず、遺伝子（mRNA）レベルでの測定も含まれる。
タンパクレベルでのTSLP産生の測定
タンパクレベルでのSLP産生量は、たとえば抗原抗体反応を利用した免疫学的方法を用いて測定することができる。免疫学的方法としては、たとえば、免疫沈降法や、ウエスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ELISA法、およびRIA法を含む固相免疫法あるいはこれらに改変を加えた公知の変法（サンドイッチELISA、US Patent No.4202875記載の方法、Meagerらの方法（Meager A., Clin Exp Immunol. 2003 Apr, 132(1), p128-36）等）を挙げることができる。すなわち、これらの方法に基づき、TSLPと特異的に結合する抗TSLP抗体を用いてTSLP産生量を測定する。
上記した免疫学的方法で用いられる抗体は、公知の方法にしたがって調製できるし、市販のものを用いてもよい。抗体は、常法により、抗原となるTSLP、あるいはその一部を用いて動物を免疫し、該動物生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497, 1975、Kennet, R. ed., Monoclonal Antibody p.365-367, 1980, Prenum Press, N.Y.）にしたがって、特異的抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、これよりモノクローナル抗体を得ることもできる。
検出に用いられる抗体作製用の抗原は、抗原であるTSLP又はその一部（エピトープ部分）、あるいはこれらに任意の担体（例えば、Ｎ末端付加するキーホールリンペットヘモシアニン）が付加された誘導体を挙げることができる。
抗TSLP抗体は、それを直接標識するか、又は該抗体を一次抗体とし、該一次抗体を特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と協同で検出に用いられる。
前記標識の種類として好ましいものは、酵素（アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ）又はビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（又は標識ストレプトアビジン）としては、予め標識された抗体（又はストレプトアビジン）が、各種市販されている。なお、RIAの場合は125Ｉ等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。
これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原の発現量が測定される。アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼで標識する場合、これら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法を利用すれば、目視で検出できる。ELISA法では、市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定し、定量することが好ましい。また上述の抗体作製に使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行い、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することも可能である。
一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては、Ｘ線フィルム又はイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができる。また、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社製）等を利用した定量も可能である。さらに、ELISA法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。
遺伝子レベルでのTSLP産生の測定
TSLP遺伝子発現量は、回収した細胞からまず全RNAを抽出し、この全RNA中におけるTSLP遺伝子（mRNA）の発現量を後述するいずれかの方法を用いて測定する。
全RNAの抽出方法は特に限定されず、たとえば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159）等を採用することができる。抽出された全RNAは、必要に応じてさらにmRNAのみに精製して用いてもよい。
遺伝子の発現量は、遺伝子チップ、アレイ等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法など公知の方法を用いて測定することができる。
３．４ 被験物質の評価
評価は、被験物質の存在下でのTSLP産生量と非存在下でのTSLP量を比較して行ってもよいし、基準とするTSLP産生の基準値が決定されれば、その基準値と被験物質存在下におけるTSLP産生量を比較することにより行ってもよい。
標準的には、本発明の方法は、１）被験物質の存在下及び非存在下において、KCMH-1細胞株又はこれと実質的に同等のTSLP産生能を有するその変異株を培養する工程と、２）被験物質の存在下及び非存在下におけるTSLP産生量を比較する工程とを含む。
具体的には、被験物質存在下におけるTSLP産生量が前記した基準値あるいは非存在下におけるTSLP産生量に比較して有意に異なる場合、当該被験物質をTSLP調節剤候補として選択する。ここで、有意とは、当該分野で通常用いられる統計的有意、たとえばp値<0.05であることを意味する。
抗アレルギー剤又は抗炎症剤等のTSLP産生抑制剤をスクリーニングする場合は、被験物質の存在下におけるTSLP産生量が上記基準値あるいは非存在下におけるTSLP産生量に比較して有意に低い場合に、当該被験物質をTSLP産生抑制剤候補として選択する。
本発明のスクリーニング方法は、無刺激下で恒常的に高い TSLP産生を示す細胞株を利用するため、高精度で再現性の高い結果が得られる。また、KCMH-1はTSLP産生量が極めて大きいため、スケールダウンによるハイスループットなスクリーニング法が構築できる。さらに、本発明のスクリーニング方法は、TSLP産生阻害をターゲットとした新たな抗アレルギー剤の開発に利用できる。
選択された候補物質は、上皮細胞のTSLP産生能を標的とするため、外用薬、吸入薬として使用可能である。また、TSLPを標的とするため、感染に対する免疫低下を起こす可能性が低く、アレルギー予防あるいは軽症の段階で使用できる。さらに、低分子化合物であるため、抗体や可溶性受容体に比べて安価で長期的使用が可能である。
４．TSLP調節剤スクリーニング用キット
本発明はまた、TSLP調節剤スクリーニング用キットを提供する。本発明のキットは、必須の構成要素としてKCMH-1細胞株又はこれと実質的に同等のTSLP産生能を有するその変異株を含む。
さらに、本発明のキットは、抗TSLP抗体、あるいは抗TSLP抗体と抗TSLP抗体に特異的に結合しうる二次抗体を含む。
前記TSLP抗体の由来は、ヒトTSLP検出に利用可能であれば特に限定されないが、抗ヒトTSLP抗体が望ましい。抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。また、適当な支持体に固相化されていてもよいし、あるいは固相化可能なように別個に支持体がキットに含まれていてもよい。そのような支持体としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド等の蛋白を付着可能な合成樹脂、ガラス、ニトロセルロース、セルロース、およびアガロース製の支持体、あるいはゲル型支持体を使用することができる。支持体の形態は特に限定されないが、極小球あるいはビーズ（例えば"ラテックス"ビーズ）などの微粒子、微量遠心チューブなどのチューブ（内壁）、マイクロタイタープレート（ウェル）等の形態で提供される。
本発明のキットは、上記した構成要素のほか、必要に応じて、ラベル体の検出のための試薬、反応用緩衝液、酵素、基質等、本発明の実施に必要な他の要素を含んでいてもよい。
５．天然型TSLPの製造方法
本発明におけるTSLPは、上述したKCMH-1細胞株あるいはその変異株によって産生される天然型TSLPである。現在市販されているTSLPは糖鎖がついていない組換えTSLPであるため、哺乳動物細胞によって産生されるTSLPとは生化学的性質が異なる可能性がある。本発明のTSLPは、ヒトTSLPにより近い糖鎖を有するマウスTSLPであり、本発明にかかるKCMH-1細胞株やその変異株を培養することにより、簡便に得ることができる。
KCMH-1細胞株あるいはその変異株の培養は、上記３．１の方法にしたがって実施することができる。
本発明は、KCMH-1細胞株やその変異株を用いた天然型TSLPの製造方法も提供する。本発明のKCMH-1細胞株は無刺激でも恒常的にTSLPを産生するが、各種サイトカインの添加によってその産生量はさらに高まる可能性がある。したがって、本発明の目的を損なわない範囲において、そのようなTSLP産生刺激剤を添加して培養してもよい。
TSLPはKCMH-1細胞株あるいはその変異株の培養上清に分泌される。分泌された、TSLPは公知の方法にしたがって、その培養上清から回収することができる。とくに単離する必要がない場合は、培養上清のまま次の目的に供してもよい。
TSLPの単離は、Simsらの方法に従い、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、逆相HPLCなどを用いて行うことができる（Sims, J.E. et al. J. Exp. Med. (2000) 192: 671-680）。
こうして調製されたTSLPあるいはTSLP含有培養上清もまた、TSLPを介したアレルギーや炎症の病態解明、TSLPを標的とした薬剤のin vitro評価に利用することができる。
上記のほか、本発明にかかるKCMH-1細胞株やこれを用いたスクリーニング方法及びスクリーニングキットは、後述する実施例に示されるように、シグナル伝達阻害薬の効果を解析でき、TSLP産生誘導機構の解明にも活用できる。
以下、実施例及び参考例を用いて、本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
参考例１：KCMH-1細胞の調製
KCMH-1細胞は、広島大学医学部 秀教授らにより、以下に説明する方法にしたがって樹立された（Arch Dermatol Res (1994) 287:91-96参照）。
CBA/Jマウス（7週令、♂）の背部皮膚に週2回ずつ3週間 3-methylcholanthrene アセトン溶液(3 mg/ml) 0.2 mlを塗布した。8週間後、12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate アセトン溶液(12 μg/ml) 0.2 mlを同部位に塗布した。形成された皮膚がん組織を採取し、その1 mm角片を他のCBA/Jマウスの大腿筋内に移植した。移植を10回繰り返したのち得られたがん組織をRPMI1640培地中で分散させ、100μmのステンレス製ふるいで組織片を除き、10% FBS-RPMI1640（100IU ペニシリンG及び100 μg/mlストレプトマイシン含む）中で培養した。5回継代したのち、96 wellマルチウェルプレートに 0.5 細胞/wellとなるように播種し、クローン化した。
樹立されたKCMH-1細胞は、受託番号FERM P-21965として、２０１０年５月２１日付にて、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１-１-１ つくばセンター 中央第６）に国内寄託され、その後２０１１年４月２５日付にて国際寄託への移管がなされ、受託番号FERM BP-11368として国際寄託されている。
実施例１：各ケラチノサイト由来細胞におけるTSLP産生量の比較
KCMH-1、マウスケラチノサイト様細胞株PAM212細胞、及びヒトケラチノサイト様細胞株HaCaT細胞を10% FBS含有MEMα中に1x105/mlとなるように懸濁し、24 wellクラスターディッシュの各wellに0.5 mlずつ播種した。24時間後、培養液を回収し、その上清中の TSLPをELISA（R&D社）により定量した（図１）。
以上の結果から明らかなように、KCMH-1細胞株は他のケラチノサイト由来の細胞株に比較して、有意に高いTSLPを発現している。
実施例２：デキサメタゾン及びFK506によるKCMH-1細胞のTSLP産生抑制効果
KCMH-1細胞を10% FBS含有MEMα中に1x105/mlとなるように懸濁し、24 wellクラスターディッシュの各wellに0.5 mlずつ播種した。24時間後、培地を除去し、phosphate buffered saline (PBS)で洗浄後、各濃度の デキサメタゾン 0.1 あるいは 1μM、FK506 0.1あるいは 1μMを含む10% FBS含有MEMαを0.5 ml加えた。24時間後、培養液を回収し、その上清中のTSLPをELISA法により定量した（図２）。
ヒト正常ケラチノサイトについて報告されているのと同様に、KCMH-1細胞株においてもTSLP産生量はデキサメタゾンの添加によって明確に抑制されること、FK506によっては抑制されないことが確認された。
上記の結果は、正常ケラチノサイトで報告されている結果（Le et al., Allergy 2009,64, 1231-1232）と一致し、本発明のKCMH-1細胞株は、既知の抗炎症剤に応答して、そのTSLP産生抑制効果を明瞭に示唆する培養細胞系として有用であることが実証された。
実施例３：KCMH-1細胞の選択的TSLP産生能
KCMH-1、マウスケラチノサイト様細胞株PAM212細胞を10% FBS含有MEMα中に1x105/mlとなるように懸濁し、24 wellクラスターディッシュの各wellに0.5 mlずつ播種した。24時間後、培養液を回収し、その上清中の TSLP、IL-6、TNF-α、IL-4、IFN‐γをELISA（R&D社、eBioscience社）により定量した。結果を表１に示す。
Figure 2012001889
以上の結果から明らかなように、KCMH-1細胞株は他のサイトカインに比較してTSLPを選択的に高産生しており、これは他のケラチノサイト由来細胞株にはみられない特徴であることが確認された。
実施例４：RXR アゴニストによるKCMH-1細胞のTSLP産生抑制効果
レチノイドX受容体（RXR）のアゴニストであるHX-600をKCMH-1に作用させ、そのTSLP産生に対する効果をみた。
KCMH-1細胞を10% FBS含有MEMα中に1x105/mlとなるように懸濁し、24 wellクラスターディッシュの各wellに0.5 mlずつ播種した。24時間後、培地を除去し、phosphate buffered saline (PBS)で洗浄後、各濃度の HX-600 1μMを含む10% FBS含有MEMαを0.5 ml加えた。24時間後、培養液を回収し、その上清中のTSLPをELISA法により定量した（図３）。
核内受容体刺激薬については、RXRアゴニストである9-cis-retinoic acid (9-cis-RA)が、IL-1βによるヒトTSLP mRNAの発現を抑制することがヒト気道上皮細胞株を用いた実験で報告されている（Lee et al. J. Immunol. 181: 5189-5193 (2008)）。上記の結果は、ヒト気道上皮細胞株での報告と一致し、RXRアゴニストはKCMH-1細胞株においてもTSLP産生に抑制的に作用することが確認された。
実施例５：KCMH-1細胞に対するシグナル伝達阻害薬の効果
KCMH-1細胞に種々のチロシンキナーゼ阻害薬を作用させ、TSLP産生に与える影響を比較した。チロシンキナーゼ阻害薬としては、Herbimaycin A、PP2、Piceatannol、AG490、WHI-P154を用いた。Herbimaycinは非特異的なチロシンキナーゼ阻害薬として知られているが、PP2はSrc ファミリー、PiceatannolはSyk、AG490はJAK2、WHI-P154はJAK3をそれぞれ阻害することが知られている。
KCMH-1細胞を10% FBS含有MEMα中に1x105/mlとなるように懸濁し、24 wellクラスターディッシュの各wellに0.5 mlずつ播種した。24時間後、培地を除去し、phosphate buffered saline (PBS)で洗浄後、Herbimycin A (3μM)、PP2 (3μM)、Piceatannol (100μM)、AG490 (100μM)、WHI-P154 (30μM)をそれぞれ括弧内の終濃度となるように含む10% FBS含有MEMαを0.5 ml加えた。24時間後、培養液を回収し、その上清中のTSLPをELISA法により定量した（図４）。
次いで、KCMH-1細胞に種々のセリンスレオニンキナーゼ阻害薬を作用させ、TSLP産生に与える影響を比較した。セリンスレオニン阻害薬としては、U0126、SB203580、SP600125、wortmannin、BAY11-7082、Go-6976を用いた。一般的に、U0126はp44/42 MAP kinaseの活性化阻害薬、Go-6976は protein kinase Cの阻害薬で、様々なタンパク質の産生、放出を抑制することが知られている。一方、wortmanninはPI3 kinase阻害薬、SB203580はp38 MAP kinase阻害薬、SP600125はc-Jun N-terminal kinase阻害薬として知られている。また、BAY11-7082はIκB kinase を阻害してNF-κBの活性化を抑制することが知られている。
KCMH-1細胞を10% FBS含有MEMα中に1x105/mlとなるように懸濁し、24 wellクラスターディッシュの各wellに0.5 mlずつ播種した。24時間後、培地を除去し、phosphate buffered saline (PBS)で洗浄後、U0126 (1μM)、SB203580 (10μM)、SP600125 (30μM)、wortmannin (100nM)、BAY11-7082 (10μM)、Go-6976 (3μM)をそれぞれ括弧内の終濃度となるように含む10% FBS含有MEMαを0.5 ml加えた。24時間後、培養液を回収し、その上清中のTSLPをELISA法により定量した（図５）。
TSLP産生に関わる細胞内シグナル伝達としては、ヒト気道上皮細胞株において転写因子NF-κBが関与していることが報告されている（Lee and Ziegler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 914-919 (2007)）。KCMH-1細胞においても、NF-κB阻害薬 Bay11-7082はTSLP産生を部分的に抑制することが確認された。さらに、未同定のチロシンキナーゼ、及びp44/42MAP kinaseがTSLP産生に寄与していることが新たに分かった。このようにKCMH-1細胞を用いることにより、TSLP産生に関わるシグナル伝達機構の解析が可能である。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
本発明によれば、被験物質のTSLP調節活性をin vitroで簡便に評価することができる。TSLP調節活性を有する物質は、抗アレルギー薬あるいは抗炎症薬として利用できる可能性があるため、本発明はそのような薬剤の簡便で安価なスクリーニング系として利用することができる。とくに、本発明で用いられるKCMH-1細胞株はケラチノサイト由来であるため、皮膚アレルギーの治療・予防薬のスクリーニング、あるいはそのメカニズムの探索に有用である。
また、本発明によれば、簡便に天然型のTSLPを得ることができる。得られたTSLPもまたTSLPを介したアレルギーや炎症の病態解明、TSLP調節薬のスクリーニングに利用できる。

Claims (10)

  1. 受託番号FERM BP-11368で特定されるKCMH-1細胞株又はこれと実質的に同等のTSLP産生能を有するその変異株に被験物質を作用させ、得られるTSLP産生量を測定することを特徴とする、TSLP調節剤のスクリーニング方法。
  2. 以下の工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法：
    １）被験物質の存在下及び非存在下において、KCMH-1細胞株又はこれと実質的に同等のTSLP産生能を有するその変異株を培養する工程、
    ２）被験物質の存在下及び非存在下におけるTSLP産生量を比較する工程。
  3. TSLP産生量が、TSLPと特異的に結合する抗TSLP抗体を用いて測定されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
  4. TSLP産生量が、ウェスタンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、ELISA法、RIA法、又はフロービーズアレイ法で測定される、請求項３に記載の方法。
  5. TSLP調節剤がTSLP産生抑制剤である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 被験物質の存在下におけるTSLP産生量が非存在下におけるTSLP産生量に比較して有意に低い場合に、当該被験物質をTSLP産生抑制剤候補として選択することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
  7. TSLP産生抑制剤が抗アレルギー剤又は抗炎症剤である、請求項５又は６に記載の方法。
  8. KCMH-1細胞株又はこれと実質的に同等のTSLP産生能を有するその変異株を含む、TSLP調節剤のスクリーニング用キット。
  9. さらに抗TSLP抗体、あるいは抗TSLP抗体と抗TSLP抗体に特異的に結合しうる二次抗体を含む、請求項８に記載のキット
  10. 受託番号FERM BP-11368で特定されるKCMH-1細胞株、又はこれと実質的に同等のTSLP産生能を有するその変異株を培養することを特徴とする、TSLPの製造方法。
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