JP5294302B2 - 胸腺間質リンパ球増殖因子産生を評価するスクリーニング方法 - Google Patents

Description

本発明は、胸腺間質リンパ球増殖因子(thymic stromal lymphopoietin、以下、ＴＳＬＰと記す)産生を評価するスクリーニング方法に関するものである。

ＴＳＬＰはケラチノサイトを主産生細胞とするインターロイキン（ＩＬ）−７様サイトカインで，アトピー性皮膚炎患者の病変部位で強く発現が増加していることが知られており、ケラチノサイト特異的にＴＳＬＰを強制発現させた遺伝子改変マウスはアトピー性皮膚炎様病変を自然発症することが知られている。

ＴＳＬＰ刺激により活性化されたCD11c⁺樹状細胞はThymus and Activation-Regulated Chemokine (ＴＡＲＣ)およびMacrophage-Derived Chemokine (ＭＤＣ)などのＴｈ２ケモカインを産生すること、ＴＳＬＰで刺激されたCD11c⁺樹状細胞はナイーブCD4⁺細胞よりＩＬ−４，ＩＬ−５， ＩＬ−１３を産生するＴｈ２細胞へと分化させる性質を持つことが明らかにされた。

つまり、アトピー性皮膚炎では表皮細胞がＴＳＬＰを大量に発現し、これが皮膚に局在するランゲルハンス細胞（樹状細胞）を活性化し、それをＴｈ２誘導型形質に極性化することによってＴｈ２型免疫応答を持続的に誘導していると考えられている。

また、喘息罹患者の気道上皮や肺粘膜上皮においてＴＳＬＰの高い発現が認められ、ＴＳＬＰを肺特異的に過剰発現させたトランスジェニックマウスでは喘息様炎症が認められている。

したがって、アトピー性皮膚炎および喘息等のアレルギー疾患に影響を与えると考えられるＴＳＬＰの発現を阻害することによって、これらのアレルギー疾患を治療または予防することが可能であると考えられる。

ＴＳＬＰの発現は、表皮ケラチノサイトのＴＳＬＰの発現を促進させるトランスジェニックマウス（非特許文献１）、活性型ビタミンＤ₃の連続塗布アトピー性皮膚炎様モデルで確認することができる（非特許文献２）。しかし、いずれの方法もモデルの作製が煩雑であったり、モデルの作製に長期間必要であったりする。
The Journal of Experimental Medicine. 2005; 202: 541-549. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 2006; 103: 11736-11741.

本発明は、上記のような事情に鑑み、ケラチノサイトにおけるＴＳＬＰの産生を阻害する物質を簡便かつ効率的にスクリーニングする方法を提供することを目的とするものである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、動物から単離したケラチノサイト、またはこれを培養したケラチノサイトをアジュバントで刺激することによるin vitro培養系においてケラチノサイトからＴＳＬＰが発現していることを見出した。また、マウスの耳介をアジュバントで刺激することによるin vivo系において、耳介のケラチノサイトからＴＳＬＰが発現していることを見出した。これらの結果から、本発明者らは本モデルがＴＳＬＰ産生を指標としたスクリーニング系として用いることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、胸腺間質リンパ球増殖因子活性を評価するスクリーニング方法であって、ケラチノサイトにアジュバントおよび被験物質を接触させ、該ケラチノサイトが産生する胸腺間質リンパ球増殖因子の発現量を検出することを特徴とする発明である。

本発明により被験物質のＴＳＬＰ 産生に対する影響を簡便かつ効率的にスクリーニングすることができる。また、このスクリーニング方法により、ＴＳＬＰ産生阻害剤を容易に見出すことができる。

以下に、本発明のＴＳＬＰ産生のスクリーニング方法について説明する。

本発明のスクリーニング方法は動物から単離したケラチノサイトまたはこれを培養したケラチノサイトをアジュバントで刺激することによりＴＳＬＰを発現させるin vitro培養系、動物の皮膚をアジュバントで刺激することにより皮膚中ケラチノサイトにおいてＴＳＬＰを発現させるin vivo系のいずれにおいても実施することができる。

in vitro培養系における本発明で用いることができるケラチノサイトは、正常な表皮由来のケラチノサイトであり、皮膚組織から単離してそのまま使用してもよいし、その培養物を使用してもよい。例えば、マウスの尾の真皮と表皮を物理的に分離し、表皮を細かく切断して８ｍｇ／ｍＬ 中性ディスパーゼIIにおいて４℃で一晩インキュベートする．次いで，０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡにおいて３７℃で５分間インキュベートする。ＦＣＳおよびＰＢＳを加えて、振盪した後、セルストレーナーでろ過する。遠心して回収し、細胞ペレットを例えばEpiLifeのような市販の培地に懸濁して同培地中で培養することにより、培養ケラチノサイトを調製することができる。あるいは市販のＰＡＭ２１２，ＸＢ−２等を用いることもできる。

本発明のスクリーニング方法では、通常、例えばEpiLifeのような培地中で培養維持したケラチノサイトを、６穴培養プレートに2×10⁵〜5×10⁵cells / wellで播種し、同培地中にアジュバントおよび被験物質を所望の濃度で添加して、３７℃でインキュベートする。また必要に応じて対照として、アジュバントのみを添加して同様にインキュベートする。

アジュバントと被験物質は、同時に添加してもよいが、先に被験物質を添加して所望時間インキュベート後にアジュバントを添加してもよく、または事前にアジュバントを添加して所望時間表皮ケラチノサイトをアジュバントで刺激した後に被験物質を添加してもよい。

本発明のスクリーニング方法で用いるアジュバントは、ケラチノサイトにおいてＴＳＬＰの活性を高めるものであり、ジブチルフタレートおよびビス（２−エチルヘキシル）フタレートが好ましく、ジブチルフタレートがより好ましい。

ケラチノサイトに接触させるアジュバントの濃度および接触時間は、ケラチノサイトから発現されるＴＳＬＰの検出を可能にする濃度および時間であれば特に限定されず、アジュバントの種類やケラチノサイトの細胞数等によって異なる。例えば、ジブチルフタレートをアジュバントとして用いるとき、通常、ジブチルフタレート飽和培地を使用して、また接触時間は約６時間から４８時間、より好ましくは１２時間から３６時間である。

本発明のスクリーニング方法で評価する被験物質は、ＴＳＬＰ産生阻害剤であってもよいし、促進剤であってもよい。またその種類は特に限定されず、動植物由来物のような天然のものであっても、あるいは合成したものであってもよい。さらに、ケラチノサイトに被験物質を接触させる時間も特に限定はされないが、通常６時間から４８時間であり、より好ましくは１２時間から３６時間である。

in vivo系における本発明に用いることができる動物としては、アジュバントによりＴＳＬＰの発現を亢進させることができるものであれば特に制限されないが、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウマおよびウシ等が挙げられ、マウスが好ましい。

また、動物への被験物質の投与量は特に限定されず、被験物質の性状や動物の体重にあわせて、適宜用量を設定することができる。また、動物への被験物質の投与方法および投与期間も特に限定されず、被験物質の性状に合わせて適宜その投与経路と投与期間を設定することができる。
検出対象とする部位としては皮膚であれば特に制限されないが、耳介が好ましく、耳介組織はパンチで打ち抜くことにより、採取することができる。

ＴＳＬＰの発現量は、培養したケラチノサイトまたは耳介等の組織からｍＲＮＡを単離し、リアルタイムＰＣＲによりＴＳＬＰの発現量を調べる方法、抗ＴＳＬＰ抗体を用いた免疫学的手法により当該組織におけるＴＳＬＰの存在を調べる方法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）などの公知の方法により確認することができる。

リアルタイムＰＣＲ法では、公知の方法に従い、総ＲＮＡの抽出方法は採取した組織からＲＮＡ抽出用溶媒を用いて抽出する。ＲＮＡの抽出方法は特に限定されないが、チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法、カラム法を用いることができる。チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法ではＲＮＡ抽出用試薬（ISOGEN）を使用することができる。また、カラム法では試薬としてはRNeasy Fibrous Tissue kit（QIAGEN社製）を用いることができる。すなわち，皮膚片を採取した後、ホモジナイズすることで組織を完全に破壊し、得られた総ＲＮＡを含む溶液から、タンパク質を沈殿法により除去する。その上清をカラムに添加し、カラムに吸着したＲＮＡをバッファーにて洗浄した後、溶出させ総ＲＮＡを得る。

得られた総ＲＮＡを鋳型として相補鎖ＤＮＡを逆転写酵素により合成する。この相補鎖ＤＮＡを鋳型として、ＴＳＬＰ特異的プライマーもしくはハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ特異的プライマーおよびそれらの蛍光プローブを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことで，組織中のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現量に対するＴＳＬＰ ｍＲＮＡ発現量として、定量的に評価する。

ＥＬＩＳＡ法については、公知の方法に従い、組織片を0.1% Tween20とプロテアーゼインヒビターを含有するＰＢＳ中にてホモジナイズすることで，組織を破壊する。その後直ちに液体窒素で急速凍結し、３７℃の温浴にて急速融解させることにより、組織中の細胞を完全に破壊する。遠心分離により組織片および細胞片を除去し、その上清をＥＬＩＳＡのサンプルとする。ＥＬＩＳＡは市販のキットを用いて測定することができる．

本発明のスクリーニング方法の使用態様は特に限定されないが、ＴＳＬＰ産生阻害剤を評価するためのスクリーニング系として有用であり、Ｔｈ２優位な状態になることにより生ずる疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、喘息およびアレルギー性鼻炎等のアレルギー性疾患の予防剤または治療剤のスクリーニングに用いることができる。

以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］ ＴＳＬＰ発現量の測定方法１（リアルタイムＰＣＲ法）
ケラチノサイトを2×10⁵cells/wellで６穴培養プレートに播種した。培地中にジブチルフタレートを飽和させた溶液（この溶液を１００％飽和とする）および１０倍希釈した溶液（１０％飽和）を添加して、３７℃で２４時間インキュベートした。
対照として、ジブチルフタレートを添加することなく、ケラチノサイトを３７℃で２４時間インキュベートした。
インキュベート終了後、ケラチノサイトをISOGEN中で破砕し、ISOGENに添付のプロトコールに従い総ＲＮＡを抽出した。さらにfirst-strand cDNA synthesis kitを用いてｃＤＮＡを合成した。

リアルタイムＰＣＲは下記のプライマーを用いてＴＳＬＰの発現を検出し、ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨをrodent GAPDH control reagents (applied biosystems；4308313) を用いて検出した。ＴＳＬＰの発現量はＧＡＰＤＨの発現量に対する相対的な発現量として求めた。
その測定結果を図１に示した。

Forward primer；5’-GCTTGTCTCCTGAAAATCGAGTATT-3’（配列番号１）
Backward primer；5’-CTCCGGGCAAATGTTTTGTC-3’（配列番号２）
Probe；FAM標識5’-TACTCTCAATCCTATCCCTGGCTGCCCT-3’（配列番号３）

［実施例２］ ＴＳＬＰ発現量の測定方法１（リアルタイムＰＣＲ法）
７週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの耳介両面に試験開始日（０日目）および翌日（１日目）に２０μＬのジブチルフタレートを塗布し、２日目に耳介組織をパンチで打ち抜き、RNAlater中に回収した。組織はホモジナイザーを用いてISOGEN中で破砕し、ISOGENに添付のプロトコールに従い総ＲＮＡを抽出した。
対照として、無処置のマウスの耳介組織を用いた。
以下、実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲ法にてＴＳＬＰの発現量はＧＡＰＤＨの発現量に対する相対的な発現量として求めた。
その測定結果を図２に示した。

［実施例３］ ＴＳＬＰ発現量の測定方法３（ＥＬＩＳＡ法）
ＴＳＬＰタンパク質量は実施例２と同様に採取した耳介組織をタンパク質分解酵素阻害剤を含有する0.1% Tween20／PBS中で破砕し、遠心分離した後，その上清中のＴＳＬＰ量をTSLP ELISA kitを用いて測定した。
その測定結果を図３に示した。

実施例１の結果からわかるように、ジブチルフタレートの濃度に依存してＴＳＬＰの発現量が増加していることがわかる。また、実施例１〜実施例３の結果から、in vitro系、in vivo系のいずれにおいても、ジブチルフタレートによってＴＳＬＰの発現量が増加していることがわかる。

リアルタイムＰＣＲ法におけるＴＳＬＰ発現量に関するグラフである。 リアルタイムＰＣＲ法におけるＴＳＬＰ発現量に関するグラフである。 ＥＬＩＳＡ法におけるＴＳＬＰ発現量に関するグラフである。

Claims (5)

1. 胸腺間質リンパ球増殖因子産生を評価するスクリーニング方法であって、
   ケラチノサイト（ただし、ヒト個体内に存在するものを除く）にアジュバントおよび被験物質を接触させ、該ケラチノサイトにおいて発現する胸腺間質リンパ球増殖因子の発現量を検出すること、および、
   前記アジュバントが、ジブチルフタレートおよびビス（２−エチルヘキシル）フタレートから選ばれること
   を特徴とする方法。
2. 前記アジュバントがジブチルフタレートである請求項１に記載の方法。
3. 胸腺間質リンパ球増殖因子産生阻害剤を評価するための請求項１または２に記載の方法。
4. 前記胸腺間質リンパ球増殖因子産生阻害剤が、アレルギー性疾患予防剤または治療剤である請求項３に記載の方法。
5. 前記アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息およびアレルギー性鼻炎から選ばれる請求項４に記載の方法。