JP2009232812A - 胸腺間質リンパ球増殖因子産生を評価するスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
被験物質の胸腺間質リンパ球増殖因子産生を簡便かつ効率的にスクリーニングする方法を提供することを目的とするものである。また、このスクリーニング方法により、胸腺間質リンパ球増殖因子産生阻害剤を容易に見出すことを目的とするものである。
【解決手段】
ケラチノサイトにアジュバントおよび被験物質を接触させ、該ケラチノサイトが産生する胸腺間質リンパ球増殖因子の発現量をリアルタイムPCR法、ELISA法等にて検出することを特徴とする。
【選択図】図1
Description
The Journal of Experimental Medicine. 2005; 202: 541-549. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 2006; 103: 11736-11741.
検出対象とする部位としては皮膚であれば特に制限されないが、耳介が好ましく、耳介組織はパンチで打ち抜くことにより、採取することができる。
ケラチノサイトを2×105cells/wellで6穴培養プレートに播種した。培地中にジブチルフタレートを飽和させた溶液(この溶液を100%飽和とする)および10倍希釈した溶液(10%飽和)を添加して、37℃で24時間インキュベートした。
対照として、ジブチルフタレートを添加することなく、ケラチノサイトを37℃で24時間インキュベートした。
インキュベート終了後、ケラチノサイトをISOGEN中で破砕し、ISOGENに添付のプロトコールに従い総RNAを抽出した。さらにfirst-strand cDNA synthesis kitを用いてcDNAを合成した。
その測定結果を図1に示した。
Backward primer;5’-CTCCGGGCAAATGTTTTGTC-3’(配列番号2)
Probe;FAM標識5’-TACTCTCAATCCTATCCCTGGCTGCCCT-3’(配列番号3)
7週齢のBALB/cマウスの耳介両面に試験開始日(0日目)および翌日(1日目)に20μLのジブチルフタレートを塗布し、2日目に耳介組織をパンチで打ち抜き、RNAlater中に回収した。組織はホモジナイザーを用いてISOGEN中で破砕し、ISOGENに添付のプロトコールに従い総RNAを抽出した。
対照として、無処置のマウスの耳介組織を用いた。
以下、実施例1と同様にしてリアルタイムPCR法にてTSLPの発現量はGAPDHの発現量に対する相対的な発現量として求めた。
その測定結果を図2に示した。
TSLPタンパク質量は実施例2と同様に採取した耳介組織をタンパク質分解酵素阻害剤を含有する0.1% Tween20/PBS中で破砕し、遠心分離した後,その上清中のTSLP量をTSLP ELISA kitを用いて測定した。
その測定結果を図3に示した。
Claims (6)
- 胸腺間質リンパ球増殖因子産生を評価するスクリーニング方法であって、ケラチノサイトにアジュバントおよび被験物質を接触させ、該ケラチノサイトにおいて発現する胸腺間質リンパ球増殖因子の発現量を検出することを特徴とする方法。
- アジュバントがジブチルフタレート、ビス(2−エチルヘキシル)フタレートおよびトリス(2−ブトキシエチル)フタレートから選ばれる請求項1に記載の方法。
- アジュバントがジブチルフタレートである請求項1に記載の方法。
- 胸腺間質リンパ球増殖因子産生阻害剤を評価するための請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 胸腺間質リンパ球増殖因子産生阻害剤がアレルギー性疾患予防剤または治療剤である請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。
- アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎、喘息およびアレルギー性鼻炎から選ばれる請求項5に記載の方法。
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WO2006034433A2 (en) * | 2004-09-21 | 2006-03-30 | Anesiva, Inc. | Delivery of polynucleotides |
WO2008012645A2 (en) * | 2006-07-24 | 2008-01-31 | Association Pour La Recherche A L'igbmc (Ari) | Use of vitamin d3 agonist in a mammalian model for atopic diseases and of vitamin d3 antagonists for the treatment of atopic diseases |
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