JP2009527235A - 胸腺間質リンホポエチン(tslp)抗体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明はヒト胸腺間質リンホポエチン(hTSLP)抗体、取分けhTSLP活性を中和する抗体に関する。本発明はさらにhTSLP関連障害、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、線維症、炎症性腸疾患およびホジキンリンパ腫などの診断または処置における抗−hTSLP抗体の使用法に関する。
Description
本発明はヒト胸腺間質リンホポエチン(hTSLP)抗体、取分けhTSLP活性を中和する抗体に関する。本発明はさらにhTSLP関連障害、例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、線維症、炎症性腸疾患およびホジキンリンパ腫などの診断または処置における抗−hTSLP抗体の使用法に関する。
ヒト胸腺間質リンホポエチン(hTSLP)(ジェンバンク寄託番号:NM_033035)はインターロイキン−7(IL−7)様のサイトカインであり、ヒトの上皮間質および肥満細胞により産生され、樹状細胞(DC)の刺激により、アレルギー性反応を起こす1。推定される159アミノ酸タンパク質は、マウスのTSLPに43%一致し、28残基のシグナル配列、6個のシステイン、および2個の推定N−グリコシル化部位を有する。未変性ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)分析は、23キロダルトン(kDa)のタンパク質の発現を示したが、他方、熟成タンパク質の分子質量の計算値は14.9kDaである;このことはhTSLPがグリコシル化されていることを示唆している。hTSLPは7個の塩基性C−末端アミノ酸(aa)N−リジン−リジン−アルギニン−アルギニン−リジン−アルギニン−リジン−C (KKRRKRK) およびジスルフィド結合の形成に関わる6個のシステインを含んでいる。
hTSLPは炎症性扁桃腺の上皮細胞およびアトピー性皮膚炎の角化細胞により高度に発現され、その発現はランゲルハンス細胞の遊走と活性化に関連している2。
TSLP受容体複合体は、TSLP受容体(TSLPR)とIL−7受容体アルファ(IL−7Ra)鎖から構成されるヘテロ二量体である。この受容体は主として単球および骨髄由来DC上、並びにBリンパ球上で発現される3。
TSLP受容体複合体は、TSLP受容体(TSLPR)とIL−7受容体アルファ(IL−7Ra)鎖から構成されるヘテロ二量体である。この受容体は主として単球および骨髄由来DC上、並びにBリンパ球上で発現される3。
アレルギーは複雑な免疫カスケードの結果であり、このカスケードが、胸腺由来2型ヘルパー細胞(Th2)サブセットリンパ球サイトカインの制御不良産生、アレルゲン特異的IgE産生Bリンパ球の生成、および引き続くアレルゲン攻撃による肥満細胞の活性化と脱顆粒に導く。
DCは数種のアレルギーモデルにおいて重要な役割を果たすが、その場合、TSLP活性化ヒトDCがTh2−誘引ケモカインを産生するが、IL−2は産生せず、非感作CD4−およびCD8−抗原陽性Tリンパ球を分化して、典型的なプロ−アレルギー表現型をもつエフェクター細胞に誘導する。
アトピー性皮膚炎(AD)は特徴的な臨床的外観をもつ慢性の再発性炎症性皮膚疾患の代表である4。遺伝学的背景、食物アレルゲン、空気中アレルゲン、微生物アンチゲン、またはストレスなどの環境接触、および特徴的な免疫学的傾向など、そのすべてが罹患患者において、周期的にかゆみを伴う湿疹様皮膚病変に寄与する。数種の可溶性因子はAD患者の末梢血中で増加することが示されている。これらのサイトカイン類およびケモカイン類はDCの分化、活性化および遊走の調節に重要な役割を果たしており、免疫細胞の往来を調和させる上で重要である。ヒト上皮間質細胞および肥満細胞が産生するhTSLPは、DCの刺激によりアレルギー反応を開始する。TSLPが活性化したDCは、アレルゲン特異的エフェクターリンパ球の走化性と極性化を誘導するCCケモカインを産生する5。従って、上皮−および間質−細胞−由来のTSLPは、アレルギー反応を開始する因子の一つの代表となり得、またアレルギーの治癒的治療法の標的となり得よう。
最近の研究において、1つの抗−ヒトTSLPポリクローナル抗体が記載された(R&Dシステムズ;AF1398)。この抗体は精製した大腸菌由来組換えTSLPで免疫したヒツジで作製された。ヒトTSLP特異ヒツジIgGは、hTSLPアフィニティクロマトグラフィーにより精製された。このポリクローナル抗体は、hTSLP生物活性を中和するその能力について選択され、組換えマウスTSLPとの交差反応性は1%未満であった。この抗体についての中和用量50(ND50)は、アッセイ時に、hIL−7RaおよびhTSLPR鎖で同時形質移入した応答細胞株マウスBaF/3細胞に対して、組換えhTSLP活性の最大阻害の1/2を生じるために必要とされる抗体のその濃度と定義された。ND50は0.5ng/mlの組換えhTSLPの存在下に、約0.05〜0.25μg/mlであると測定された。ポリクローナル抗体の欠点は、同じ処理動物からの血清の供給に制限があるため、抗体の供給が限定されることである。さらに、ポリクローナル抗体は同じ抗原上の複数のエピトープを認識し、不所望の交差反応性を有し得る。ポリクローナル血清は高親和性と低親和性の結合体両方の混合物を含み、また一連のエピトープを標的とするが、一方、モノクローナル抗体でのアプローチは、治療使用にもっとも有用な候補を確実に選択する。
動物由来のポリクローナル抗体は、ヒトに注射した場合、ヒト宿主においては外来タンパク質となるため、ヒトにおけるそれらの免疫源性により、しばしば抗グロブリン応答を誘発する。この抗グロブリン応答は、動物抗体の定常ドメインに対して優先的に向けられるものであり、通常は繰り返し投与後の処置を不可能にする。
本発明の一実施態様は、標的タンパク質hTSLPに特異的な抗原結合領域をもつ単離されたヒトもしくはヒト化抗体またはその機能的フラグメントをここに提供する;また該抗体またはその機能的フラグメントはhTSLPに結合する。関連する実施態様において、hTSLPに対する結合は、少なくとも、炎症性メディエーターの放出を防止する細胞表面hTSLP受容体との結合によって測定される。
さらに別の実施態様において、本発明は抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域を提供する。特定の実施態様において、単離された抗原結合領域は、配列番号1〜7から選択されるアミノ酸配列を有するH−CDR1領域およびその保存的変異体を包含する。本明細書に記載する場合、保存的変異体は同定されたアミノ酸配列のいずれかにアミノ酸残基を含む。関連する実施態様において、単離された抗原結合領域は、配列番号8〜25から選択されるアミノ酸配列を有するH−CDR2領域、およびその保存的変異体である。別の関連する実施態様において、単離された抗原結合領域は、配列番号26〜31から選択されるアミノ酸配列を有するH−CDR3領域、およびその保存的変異体である。
別の実施態様において、単離された抗原結合領域は、配列番号32〜40から選択されるアミノ酸配列を有するL−CDR1領域、およびその保存的変異体である。さらに別の関連する実施態様において、単離された抗原結合領域は、配列番号41〜49から選択されるアミノ酸配列を有するL−CDR2領域、およびその保存的変異体である。なお別の関連する実施態様において、単離された抗原結合領域は、配列番号50〜66から選択されるアミノ酸配列を有するL−CDR3領域、およびその保存的変異体である。
別の実施態様において、単離された抗原結合領域は、配列番号1〜31の1ないし3種から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号1〜31を有するCDR領域と、少なくとも60、70、80、90または95%の配列同一性を有するCDR領域の配列である。関連する実施態様において、単離された抗原結合領域は、配列番号32〜66の1ないし3種から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖、および配列番号32〜66を有するCDR領域と、少なくとも60、70、80、90または95%の配列同一性を有するCDR領域の配列である。
特定の実施態様において、単離された抗原結合領域は、IgGである。別の実施態様において、単離された抗体は、IgG1、IgG2またはIgG4である。
さらに別の実施態様において、本発明はhTSLPのエピトープに特異的である抗原結合領域を有する単離されたヒトもしくはヒト化抗体またはその機能的フラグメントを提供し、該抗体またはその機能的フラグメントは細胞上のhTSLP表面受容体に結合する。関連する実施態様において、本発明は標的hTSLPのエピトープに特異的である抗原結合領域を有する単離されたヒトもしくはヒト化抗体またはその機能的フラグメントを提供し、そのエピトープは標的hTSLPのアミノ酸残基の1個以上のアミノ酸残基を含む。関連する実施態様において、該エピトープは立体配座エピトープである。
さらに別の実施態様において、本発明はhTSLPのエピトープに特異的である抗原結合領域を有する単離されたヒトもしくはヒト化抗体またはその機能的フラグメントを提供し、該抗体またはその機能的フラグメントは細胞上のhTSLP表面受容体に結合する。関連する実施態様において、本発明は標的hTSLPのエピトープに特異的である抗原結合領域を有する単離されたヒトもしくはヒト化抗体またはその機能的フラグメントを提供し、そのエピトープは標的hTSLPのアミノ酸残基の1個以上のアミノ酸残基を含む。関連する実施態様において、該エピトープは立体配座エピトープである。
さらに別の実施態様において、抗体またはその機能的フラグメントは、FabまたはscFv抗体フラグメントである。関連する実施態様において、単離された抗体はIgGである。別の関連する実施態様において、単離された抗体は、IgG1、IgG2またはIgG4である。
別の実施態様において、本発明は上記の抗体もしくはその機能的フラグメントまたは保存的変異体のいずれかの少なくとも1種、およびそのための医薬的に許容される担体または添加剤を有する医薬組成物を提供する。
なおさらなる別の実施態様において、本発明は上記の抗体またはその機能的フラグメントのいずれかをエンコードする遺伝子を担持する形質転換動物を提供する。
なおさらなる別の実施態様において、本発明は上記の抗体またはその機能的フラグメントのいずれかをエンコードする遺伝子を担持する形質転換動物を提供する。
特定の実施態様において、本発明は受容体標的hTSLPを有する細胞の存在と関係する障害または症状を処置する方法を提供する。本方法は処置を必要とする対象に、上記の医薬組成物いずれかの有効量を投与することからなる。関連する実施態様において、処置すべき障害または症状は呼吸器障害である。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は気管支喘息であり、この喘息は、気道過敏症(AHR)、粘液過剰産生、線維症および上昇した血清IgGレベルなどを特徴とする肺の共通する持続性炎症性疾患である。TSLPにとっての重要な役割は、マウスのモデルで示されており、マウスではTSLP導入遺伝子の肺特異的発現が、アレルギー性炎症、杯状細胞過形成、上皮下線維症および上昇したIgGレベルを誘発する(Zhou B, et al Nat. Immunol. 6: 1047-1053)。TSLP−受容体を欠くマウスもまた、エールゾル化した抗原投与に付した場合、アレルギー反応が防御された。さらに、肺上皮細胞におけるTSLP発現と、喘息疾患重症度との間の関連性が、ヒトについて記載されている(Ying, S.B. et al. J. Immunol. 174: 8183-8190)。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状はアトピー性(アレルギー性)皮膚炎である;この皮膚炎は小児期のもっとも一般的な皮膚疾患であり、強い掻痒と慢性湿疹斑を特徴とする。TSLPにとっての重要な役割は、マウスのモデルで示されており、マウスではTSLP導入遺伝子の皮膚特異的発現が、炎症性細胞浸潤を含む湿疹皮膚病変、循環Th2細胞の増加、および血清IgEの上昇を誘発した(Yoo, J. et al. J. Exp. Med. 202: 541-549)。また、ヒトにおいて、TSLPはランゲルハンス細胞遊走と活性化と関連するアトピー性皮膚炎病巣の組織片において高度に発現されることが見出された(Soumelis, V. et al. Nat. Immunol. 3: 673-680)。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は他の炎症性または閉塞性気道疾患および症状、例えば、COPD、急性肺傷害(ALI)、急性/成人呼吸窮迫症候群(ARDS)、呼吸困難、アレルギー性気道炎症、小気道疾患、肺癌、鎌状赤血球症および肺高血圧症の患者の急性胸部症候群、並びに他の薬物療法、取分け他の吸入薬物療法の結果としての気道過活動の悪化などから選択される。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は、あらゆるタイプまたは起源の気管支炎、例えば、急性、アラキジン酸性、カタル性、クループ性、慢性または消耗性気管支炎である。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は、いずれものタイプまたは起源の塵肺症(炎症性の共通する肺の職業病であり、慢性であっても急性であっても、しばしば気道の閉塞をともない、塵埃を繰り返し吸入することが誘引となる)であり、例えば、アルミニウム沈着症、炭粉症、アスベスト症、石肺、ダチョウ塵肺症、鉄症、ケイ粉症、タバコ中毒症および綿花肺である。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は、アトピー性鼻炎(枯草熱)および慢性副鼻腔炎から選択される。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は、皮膚の他の炎症性症状、例えば、乾癬または紅斑性狼瘡から選択される。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は、炎症性腸疾患、例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病である。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は、皮膚の他の炎症性症状、例えば、乾癬または紅斑性狼瘡から選択される。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は、炎症性腸疾患、例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病である。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は、他の線維性症状、例えば、全身性硬化症、肝線維症、肺線維症、特発性肺線維症またはフィブロイド肺などから選択される。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は、腫瘍の再発または転移である。Th2サイトカインの阻害は動物モデルにおいて、抗ウイルスワクチンを増強することが示されており、HIVおよび他の感染症の処置に有益であり得る(Ahlers, J. D. , et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002)。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は、腫瘍の再発または転移である。Th2サイトカインの阻害は動物モデルにおいて、抗ウイルスワクチンを増強することが示されており、HIVおよび他の感染症の処置に有益であり得る(Ahlers, J. D. , et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002)。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は、呼吸器ウイルス感染症であり、この感染症は、喘息、慢性気管支炎、COPD、中耳炎、および副鼻腔炎などの潜在する慢性症状を悪化させる。処置すべき呼吸器ウイルス感染は、二次的細菌感染、例えば、中耳炎、副鼻腔炎または肺炎などとも関連し得る。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は、他の疾患または症状、取分け、炎症性の構成要素をもつ疾患または症状、例えば、リウマチ様関節炎、乾癬性関節炎などの骨と関節の疾患、およびアテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、および慢性同種移植拒絶反応(例えば、心臓、腎臓、肝臓、肺または骨髄移植後)などの他の疾患から選択される。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は、内毒素ショック、糸球体腎炎、脳および心臓虚血、アルツハイマー病、のう胞性線維症、ウイルス感染およびそれと関連する増悪、後天性免疫不全症候群(AIDS)、多発性硬化症(MS)、ヘリコバクター・ピロリ関連胃炎、および癌、取分け卵巣癌の増殖などである。
別の実施態様において、処置すべき障害または症状は、ヒトのウイルス感染を原因とする症候であって、ヒトのライノウイルス、他の腸ウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体層ウイルスまたはアデノウイルスを原因とする。
本発明による処置は対症的または予防的であってもよい。
本発明による処置は対症的または予防的であってもよい。
本発明の、炎症性症状の阻害、例えば、炎症性気道疾患における薬剤の有効性は、気道炎症または他の炎症性症状の動物モデル、例えば、マウス、ラットもしくはウサギモデルにおいて証明可能であり、それらは文献:Wada et al, J. Exp. Med (1994) 180:1135-40; Sekido et al, Nature (1993) 365:654-57; Modelska et al., Am. J. Respir. Crit. Care. Med (1999) 160:1450-56; and Laffon et al (1999) Am. J. Respir. Crit. Care Med. 160:1443-49;に記載されている。
さらに別の実施態様において、本発明はhTSLPの受容体を有する細胞を同定する方法を提供する。この方法はさらに検出可能な標識を有する上記の抗体または抗体フラグメントのいずれかと該細胞を接触させることからなる。該標識は、放射性、蛍光、磁気、常磁性、または化学発光である。本方法はさらに標識した細胞を画像化または分離する上記のいずれかの方法を含み得る。
別の実施態様において、上記のヒトもしくはヒト化抗体または抗体フラグメントのいずれかは、合成物である。
別の実施態様において、本発明は医薬組成物およびさらなる治療剤を提供する。
別の実施態様において、本発明は医薬組成物およびさらなる治療剤を提供する。
さらなる治療剤は、抗炎症剤、気管支拡張剤、抗ヒスタミン剤または鎮咳剤としての物質、取分け、閉塞性または炎症性気道疾患の処置における物質、例えば、本明細書にてすでに言及したかかる薬物の治療活性の増強剤として、またはかかる薬物の必要とされる投与量もしくは潜在的副作用を低減する手段としての物質などから選択され得る。本発明の治療剤は他の薬物物質と混合して固定した医薬組成物とし得るし、またはそれを他の薬物物質の前に、同時に、もしくは後に、別々なものとして投与してもよい。従って、本発明は本明細書にすでに記載した本発明薬剤と、抗炎症性、気管支拡張性、抗ヒスタミンまたは鎮咳剤物質と組合せることを含み、当該本発明の薬物および当該薬物物質は、同じまたは異なる医薬組成物中のものである。
適切な抗炎症剤は、ステロイド類、取分け、グルココルチコステロイド、例えば、ブデソニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン(beclamethasone)、プロピオン酸フルチカゾン、シクレソニドまたはフロ酸モメタゾンなど、または以下に記載されたステロイド類:WO 02/88167、WO 02/12266、WO 02/100879、WO 02/00679 (取分け、実施例3、11、14、17、19、26、34、37、39、51、60、67、72、73、90、99および101のステロイド)、WO 03/35668、WO 03/48181、WO 03/62259、WO 03/64445、WO 03/72592、WO 04/39827 および WO 04/66920;非ステロイド・グルココルチコイド受容体アゴニスト、例えば、以下に記載されたアゴニスト:DE 10261874、WO 00/00531、WO 02/10143、WO 03/82280、WO 03/82787、WO 03/86294、WO 03/104195、WO 03/101932、WO 04/05229、WO 04/18429、WO 04/19935 および WO 04/26248;LTB4 アンタゴニスト、例えば、BIIL 284、CP-195543、DPC11870、LTB4 エタノールアミド、LY 293111、LY 255283、CGS025019C、CP-195543、ONO-4057、SB 209247、SC-53228 および US 5451700 に記載されたもの;LTD4 アンタゴニスト、例えば、モンテルカスト、プランルカスト、ザフィルカスト、アコレート、SR2640、Wy-48,252、ICI 198615、MK-571、LY-171883、Ro 24-5913 および L-648051; PDE4 インヒビター、例えば、シロミラスト(cilomilast)(アリフロ(Ariflo;登録商標);グラクソ・スミスクライン)、ロフルムラスト(Roflumilast)(バイクグルデン;Byk Gulden)、V-11294A (ナップ;Napp)、BAY19-8004 (バイエル)、SCH-351591 (シェリング−プーラウ)、アロフィリン(Arofylline)(アルミラル・プロデスファルマ)、PD189659 / PD168787 (パーク−デイビス)、AWD-12-281 (アスタ・メディカ)、CDC-801 (セルジーン)、SelCID (TM) CC-10004 (セルジーン)、VM554/UM565 (ベルナリス;Vernalis)、T-440 (田辺)、KW-4490 (協和発酵工業)、および以下に記載されたもの:WO 92/19594、WO 93/19749、WO 93/19750、WO 93/19751、WO 98/18796、WO 99/16766、WO 01/13953、WO 03/104204、WO 03/104205、WO 03/39544、WO 04/000814、WO 04/000839、WO 04/005258、WO 04/018450、WO 04/018451、WO 04/018457、WO 04/018465、WO 04/018431、WO 04/018449、WO 04/018450、WO 04/018451、WO 04/018457、WO 04/018465、WO 04/019944、WO 04/019945、WO 04/045607 および WO 04/037805;A2Aアゴニスト、例えば、以下に記載のもの:EP 1052264、EP 1241176、EP 409595A2、WO 94/17090、WO 96/02543、WO 96/02553、WO 98/28319、WO 99/24449、WO 99/24450、WO 99/24451、WO 99/38877、WO 99/41267、WO 99/67263、WO 99/67264、WO 99/67265、WO 99/67266、WO 00/23457、WO 00/77018、WO 00/78774、WO 01/23399、WO 01/27130、WO 01/27131、WO 01/60835、WO 01/94368、WO 02/00676、WO 02/22630、WO 02/96462、および WO 03/086408;およびA2Bアンタゴニスト、例えば、WO 02/42298 に記載されたアゴニストを含む。
適切な気管支拡張剤は、抗コリン作動性または抗ムスカリン性薬、取分け、臭化イプラトロピウム、臭化オキシトロピウム、チオトロピウム塩および CHF 4226 (チーシー;Chiesi)、およびグリコピロレート、さらに以下に記載するもの:EP 424021、US 3714357、US 5171744、WO 01/04118、WO 02/00652、WO 02/51841、WO 02/53564、WO 03/00840、WO 03/33495、WO 03/53966、WO 03/87094、WO 04/018422 および WO 04/05285;およびベータ−2アドレナリン受容体アゴニスト、例えば、アルブテロール (サルブタモール)、メタプロテレノール、テルブタリン、サルメテロール、フェノテロール、プロカテロール、および特に、フォルモテロール、カルモテロールおよびその医薬的に許容される塩、および WO 00/75114 の式Iの化合物(遊離または塩または溶媒和物)(この文献を参照により本明細書の一部とする)、好ましくはその実施例の化合物、例えば、(5−[(R)−2−(5,6−ジエチル−インダン−2−イルアミノ)−1−ヒドロキシ−エチル]−8−ヒドロキシ−1H−キノリン−2−オン)および医薬的に許容されるその塩、並びに WO 04/16601 の式Iの化合物(遊離または塩または溶媒和物)および以下に記載の化合物:EP 1440966、JP 05025045、WO 93/18007、WO 99/64035、US 2002/0055651、WO 01/42193、WO 01/83462、WO 02/66422、WO 02/ 70490、WO 02/76933、WO 03/24439、WO 03/42160、WO 03/42164、WO 03/72539、WO 03/91204、WO 03/99764、WO 04/16578、WO 04/22547、WO 04/32921、WO 04/33412、WO 04/37768、WO 04/37773、WO 04/37807、WO 04/39762、WO 04/39766、WO 04/45618、WO 04/46083、WO 04/80964、EP1460064、WO 04/087142、WO 04/089892、EP 01477167、US 2004/0242622、US 2004/0229904、WO 04/108675、WO 04/108676、WO 05/033121、WO 05/040103 および WO 05/044787を含む。
適切な二重の抗炎症性および気管支拡張性薬物は、二重のベータ−2アドレナリン受容体アゴニスト/ムスカリンアンタゴニストであり、以下に記載されたものである: US 2004/0167167、WO 04/74246 および WO 04/74812。
適切な抗ヒスタミン剤物質は、塩酸セチリジン、アセトアミノフェン、フマル酸クレマスチン、プロメタジン、ロラチジン、デスロラチジン、ジフェンヒドラミンおよび塩酸フェキソフェナジン、アクチバスチン、アステミゾール、アゼラスチン、エバスチン、エピナスチン、ミゾラスチンおよびテフェナジン、並びに JP 2004107299、WO 03/099807 および WO 04/026841.に開示されたものである。
適切な抗ヒスタミン剤物質は、塩酸セチリジン、アセトアミノフェン、フマル酸クレマスチン、プロメタジン、ロラチジン、デスロラチジン、ジフェンヒドラミンおよび塩酸フェキソフェナジン、アクチバスチン、アステミゾール、アゼラスチン、エバスチン、エピナスチン、ミゾラスチンおよびテフェナジン、並びに JP 2004107299、WO 03/099807 および WO 04/026841.に開示されたものである。
本発明の治療剤および抗コリン作動性もしくは抗ムスカリン性薬、ステロイド、ベータ−2アゴニスト、PDE4インヒビター、ドーパミン受容体アゴニスト、LTD4アンタゴニストまたはLTB4アンタゴニストとの組合せも使用し得る。本発明の薬剤と抗炎症性薬物との他の有用な組合せは、ケモカイン受容体、例えば、CCR−1、CCR−3、CCR−4、CCR−5、CCR−6、CCR−7、CCR−8、CCR−9およびCCR10、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5の他のアンタゴニストとの組合せ、特に、CCR−5アンタゴニスト、例えば、シェリング−プーラウのアンタゴニスト SC-351125、SCH-55700 および SCH-D との組合せ、武田のアンタゴニスト、例えば、塩化N−[[4−[[[6,7-ジヒドロ−2−(4−メチルフェニル)−5H−ベンゾシクロヘプテン−8−イル]カルボニル]アミノ]フェニル]−メチル]−テトラヒドロ−N,N−ジメチル−2H−ピラン−4−アミニウム (TAK-770)、US 6166037 (取分け、請求項18および19)、WO 0066558 (取分け、請求項8)、WO 0066559 (取分け、請求項9)、WO 04/018425 および WO 04/026873 に記載されたCCR−5アンタゴニストとの組合せである。
さらなる治療剤はまた他のサイトカイン結合分子、特に他のサイトカインの抗体からなる群より選択され得るが、取分け、PCT/EP2005/00836 に記載されているような抗−IL4抗体、クソレアー(Xolair;登録商標)などの抗−IgE抗体、抗−IL31抗体、抗−IL31R抗体、WO05/007699 に記載されているような抗−IL13抗体、抗エンドグリン抗体、抗−IL1b抗体、抗−TSLPR抗体または別の抗−hTSLP抗体などとの組合せである。
特定の実施態様において、本発明は配列番号1〜31の1ないし3種から選択される重鎖である第一のアミノ酸配列と、配列番号1〜31を有するCDR領域と、CDR領域において少なくとも60、70、80、90または95%の配列同一性を有する配列;および配列番号32〜66の1ないし3種から選択される軽鎖である第二のアミノ酸配列と、配列番号32〜66で示されるCDR領域と、CDR領域において少なくとも60、70、80、90または95%の配列同一性を有する配列;を有する抗体を提供する。
なお別の実施態様において、本発明は抗体またはそのフラグメントである第一の構成要素および第二のアミノ酸配列を有する第二の構成要素から作製された免疫接合体を提供する。例えば、免疫接合体は細胞毒であるか、または免疫接合体はhTSLPとは異なる標的に結合特異性を有する結合タンパク質または抗体である。
特定の実施態様において、本発明は二重特異性抗体を提供する。別の実施態様において、本発明は抗体またはその抗体フラグメントと含むキットを提供する。一部の実施態様において、該キットはさらにそれ故の医薬的に許容される担体または賦形剤を含む。他の関連する実施態様において、キット中の抗体は単位用量として存在する。さらに別の実施態様において、該キットは対象に投与する際の使用法についての説明書を含む。
[発明の詳細な説明]
本発明は単離された抗体、取分け、hTSLPに特異的に結合し、hTSLPの機能的性質を阻害するヒト抗体に関する。特定の実施態様において、本発明の抗体は特定の重鎖および軽鎖配列から誘導されるか、および/または特定のアミノ酸配列を含んでなるCDR領域などの特定の構造的特徴を含んでなる。本発明は、単離された抗体、かかる抗体の作製方法、かかる抗体を含んでなる免疫接合体および二重特異性分子、および本発明の抗体、免疫接合体または二重特異性分子を含む医薬組成物を提供する。本発明は細胞受容体標的hTSLPの存在と関連する障害または症状を阻害するために、例えば、炎症性またはアレルギー症状、取分け、炎症性または閉塞性気道疾患の処置に該抗体を使用する方法に関する。
本発明は単離された抗体、取分け、hTSLPに特異的に結合し、hTSLPの機能的性質を阻害するヒト抗体に関する。特定の実施態様において、本発明の抗体は特定の重鎖および軽鎖配列から誘導されるか、および/または特定のアミノ酸配列を含んでなるCDR領域などの特定の構造的特徴を含んでなる。本発明は、単離された抗体、かかる抗体の作製方法、かかる抗体を含んでなる免疫接合体および二重特異性分子、および本発明の抗体、免疫接合体または二重特異性分子を含む医薬組成物を提供する。本発明は細胞受容体標的hTSLPの存在と関連する障害または症状を阻害するために、例えば、炎症性またはアレルギー症状、取分け、炎症性または閉塞性気道疾患の処置に該抗体を使用する方法に関する。
本発明をより容易に理解し得るようにするために、特定の用語について先ず定義する。さらなる定義は、詳細な説明全体を通じて明らかにする。
「hTSLP」という用語はヒトTSLPについていう。本発明はヒトTSLPに対する抗体、取分け、カニクイザルおよびアカゲザルのTSLPを含む非ヒト霊長類のTSLPと交差反応性を有するヒト抗体を提供する。本発明の一部の実施態様による抗体は、TSLPの変異体である末端切除イソ型(該イソ型はそのタンパク質が残基99位のアラニンで終結しており、その結果、C−末端の最終60個のアミノ酸が欠落している)、およびさらにTSLPの一塩基多形(アミノ酸位置90位のシステイン残基がチロシンに置換わっている)を認識し得る。「免疫応答」という用語は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および上記の細胞または肝臓が産生する可溶性高分子(抗体、サイトカイン、および補体を包含する)の作用をいい、これらは病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞を、または自己免疫もしくは病理学的炎症の場合には、正常のヒト細胞または組織を、選択的に損傷し、破壊し、またはヒトの身体から除去するに至る。
「シグナル伝達経路」とは、1つの細胞の一ヶ所から1つの細胞の別の箇所にシグナルを伝達する際に役割を果たす多様なシグナル伝達分子間の生化学的関係性をいう。本明細書にて使用する場合、「細胞表面受容体」という成句は、例えば、シグナルを受容することが可能であり、またかかるシグナルを細胞の原形質膜をとおして伝播することが可能な分子および分子の複合体を意味する。本発明の「細胞表面受容体」の一例は、hTSLPタンパク質分子が結合するhTSLP受容体である。
本明細書にて言及する場合の用語「抗体」とは、抗体全体および何らかの抗原結合フラグメント(すなわち、「抗原結合部分」)またはその一本鎖を意味する。天然に存在する抗体は、少なくとも2本の重(H)鎖と2本の軽(L)鎖からなり、それらがジスルフィド結合により互いに連結した糖タンパク質である。各重鎖は重鎖可変領域(本明細書ではVHと略記する)および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3から構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域(本明細書ではVLと略記する)および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は1つのドメインCLから構成される。VHとVL領域はさらに相補性決定領域(CDR)と呼称される超可変領域に細分割され、フレームワーク領域(FR)と呼称されるより保存的な領域と共に点在する。各VHとVLはアミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順序で配列された3つのCDRと4つのFRから構成される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。該抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的な補体系の第一成分(C1q)を含む宿主組織または因子に免疫グロブリンが結合するのを仲介し得る。
本明細書にて使用する場合、抗体の「抗原結合部分」(または単に「抗原部分」)という用語は、抗原(例えば、hTSLP)に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つ以上のフラグメントをいう。抗体の抗原結合機能は完全長の抗体のフラグメントにより遂行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合フラグメントの例は、Fabフラグメント、VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価のフラグメント;F(ab)2フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結する2つのFabフラグメントからなる二価のフラグメント;VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;抗体の1本のアームのVLとVHドメインからなるFvフラグメント;VHドメインからなる dAbフラグメント (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546);および単離された相補性決定領域(CDR)である。
さらに、Fvフラグメントの2つのドメイン、VLおよびVHは、別個の遺伝子によりコードされているが、これらは合成リンカーによる組換え法を用いて、それが一本鎖タンパク質として作製され得るように連接し得る;その場合、VLおよびVH領域が対となって一価の分子を形成する (一本鎖 Fv (scFv) として知られる;参照例:Bird et al., 1988 Science 242:423-426; and Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883)。かかる一本鎖抗体はまた抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されるものとする。これらの抗体フラグメントは当業者周知の通常の技法により得られ、該フラグメントは未処理抗体と同じ方式でその用途について選抜される。
本明細書にて使用する場合、「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいう(例えば、特異的にhTSLPに結合する単離された抗体は、hTSLP以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない単離された抗体)。しかしながら、hTSLPに特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのTSLP分子などの他の抗原との交差反応性を有する可能性がある。さらに、単離された抗体は他の細胞性物質および/または化学物質を実質的に含まない可能性がある。「単離された抗体」はまた既知のホモログ/オーソログと交差反応する標的に対する抗体、並びに既知のホモログ/オーソログと交差反応しない標的に対する抗体をいう。
本明細書にて使用する場合、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性と親和性を示す。
本明細書にて使用する場合、用語「ヒト抗体」とは、フレームワークとCDR領域両方がヒト起源の配列に由来する可変領域をもつ抗体を含むものとする。さらに、その抗体が定常領域を含んでいる場合、その定常領域はかかるヒトの配列、例えば、ヒト生殖系列配列、またはヒト生殖系列配列の突然変異形に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒトの配列がエンコードしていないアミノ酸残基を含み得る(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発により、またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異)。しかし、本明細書にて使用する場合、「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR配列が、ヒトのフレームワーク配列に接続されている抗体を含めようとするものではない。CDR接続抗体、または代替法は、ヒト抗−マウス抗体反応を最小化するように設計される(カロビオス(Kalobios)の人間工学技術、またはPDLのヒト化技術)。クソマ(Xoma)はまた「人間工学」技術を有する:参照例、米国特許 US 5766886。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、該抗原上の決定因子(またはエピトープ)を認識し、それに結合する抗体の実質的に均一の母集団から得られる抗体をいう。モノクローナル抗体は単一の結合特異性を提示し、フレームワークとCDR領域の両方がヒトの配列に由来する可変領域を有する。一実施態様において、ヒトモノクローナル抗体は、遺伝子導入非ヒト動物、例えば、遺伝子導入マウスから得られるB細胞(ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有し、不死化細胞に融合される)を含むハイブリドーマにより産生される。
本明細書にて使用する場合、用語「組換えヒト抗体」とは、組換え手段により調製、発現、創製または単離されるヒト抗体すべてを含み、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子用の遺伝子導入または染色体導入した動物(例えば、マウス)またはそれから調製されるハイブリドーマから単離される抗体;ヒト抗体を発現するために形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体;組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体;およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列のすべてまたは一部の他の遺伝子へのスプライシングを含む何らかの他の手段により調製、発現、創製または単離される抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、そのフレームワークとCDR領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、特定の実施態様において、かかる組換えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発(または、ヒトIg配列用に遺伝子導入した動物が使用される場合には、インビボの体細胞変異誘発)に付すことができるが、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のVHおよびVL配列から誘導され、かつ関連させられる一方で、インビボでのヒト抗体生殖系列レパートリー内には当然存在しないはずの配列である。
本明細書にて使用する場合、「イソ型」とは重鎖定常領域遺伝子がエンコードする抗体クラス(例:IgM、IgE、IgG、例えば、IgG1、IgG2またはIgG4)をいう。
「抗原を認識する抗体」および「抗原特異的抗体」という成句は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と相互に交換して使用される。
「抗原を認識する抗体」および「抗原特異的抗体」という成句は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と相互に交換して使用される。
本明細書にて使用する場合、「hTSLPに特異的に結合する」抗体は、Kpが1×10−9M以下でヒトTSLPに結合する抗体をいうものとする。「hTSLP以外の抗原と交差反応する」抗体とは、1×10−9M以下でその抗原と結合する抗体をいうものとする。「特定の抗原と交差反応しない」抗体とは、Kpが1.5×10−8M以上、またはKpが5〜10×10−8Mもしくは1×10−7M以上でその抗原と結合する抗体をいうものとする。特定の実施態様において、抗原と交差反応しないような抗体は、標準的結合アッセイで、これらのタンパク質に対して本質的に検出し得ない結合を示す。
本明細書にて使用する場合、「hTSLP受容体に対するhTSLPの結合を阻害する」抗体とは、KDが5nM以下でhTSLPが該受容体に結合するのを阻害する抗体をいう。
本明細書にて使用する場合、「炎症性メディエーターの放出を阻害する」抗体とは、TSLP受容体を形質導入したBaf-3細胞株と、ルシフェラーゼレポーターシステムからのhTSLP誘発ルシフェラーゼ発現、およびPBMCから単離したヒト一次単核球からのhTSLP誘発TARC分泌を、1.0nM未満のIC50で阻害する抗体をいうものとする。
本明細書にて使用する場合、「炎症性メディエーターの放出を阻害する」抗体とは、TSLP受容体を形質導入したBaf-3細胞株と、ルシフェラーゼレポーターシステムからのhTSLP誘発ルシフェラーゼ発現、およびPBMCから単離したヒト一次単核球からのhTSLP誘発TARC分泌を、1.0nM未満のIC50で阻害する抗体をいうものとする。
本明細書にて使用する場合、用語「Kassoc」または「Ka」は、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度をいうものとするのに対し、用語「Kdis」または「KD」は、本明細書にて使用する場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度をいうものとする。用語「KD」は、本明細書にて使用する場合、解離定数をいうものとし、この値はKdとKaの比(すなわち、Kd/Ka)から得られ、モル濃度(M)として表される。抗体についてのKD値は当該技術分野で確立された方法により決定することができる。抗体のKD値を決定する方法は表面プラズモン共鳴を用いるか、またはバイアコア(Biacore;登録商標)システムなどのバイオセンサーシステムを用いることによる。
本明細書にて使用する場合、IgG抗体に対する「高親和性」という用語は、標的抗原に対する抗体のKDが10−9M以下であることをいう。
本明細書にて使用する場合、用語「対象」はヒトまたは非ヒト動物を含む。
用語「非ヒト動物」はすべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物および非哺乳動物を包含する。
本発明の様々な側面について、以下の小節にてさらに詳細に説明する。
本明細書にて使用する場合、用語「対象」はヒトまたは非ヒト動物を含む。
用語「非ヒト動物」はすべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物および非哺乳動物を包含する。
本発明の様々な側面について、以下の小節にてさらに詳細に説明する。
様々な種のhTSPLに対する抗体の結合力を評価する標準的アッセイ法が、当該技術分野において知られている;例えば、ELISA、ウエスタンブロットおよびRIAなどである。適当なアッセイ法については、実施例に詳細に記載してある。抗体の結合の動力学(例えば、結合親和性)は、当該技術分野で既知の標準的アッセイ法、例えば、バイアコア分析などにより評価することもできる。hTSLPの機能的性質に関する抗体の作用を評価するアッセイ法は、さらに詳細に実施例に記載してある。
従って、これらhTSLPの機能的性質(例えば、生化学的、免疫化学的、細胞の、生理学的またはその他の生物学的活性など)の1つ以上を「阻害する」抗体は、当該技術分野で既知の、または本明細書に記載された方法論に従って決定される場合、特定の活性が、該抗体の存在しない場合に認められる活性に比較して(または、例えば、関連性のない特異性を有する対照の抗体が存在する場合)、統計学的に有意に低下することに関係していることと理解されよう。hTSLP活性を阻害する抗体は、測定したパラメーターの少なくとも10%、少なくとも50%、80%%または90%まで統計的に有意に低下させる作用を有し、特定の実施態様においては、本発明の抗体はhTSLPの機能的活性の95%、98%または99%以上を阻害し得る。
モノクローナル抗体
本発明の抗体は、実施例1〜5に記載するように単離し、構造的に特性化したヒトモノクローナル抗体である。該抗体のVHのアミノ酸配列を配列番号1〜31にそれぞれ示す。該抗体のVLのアミノ酸配列を配列番号32〜66にそれぞれ示す。本発明の他の抗体は変異させたアミノ酸を含むが、なおCDR領域では、上記に示した配列のCDR領域と少なくとも60、70、80、90または95パーセントの同一性を有する。
本発明の抗体は、実施例1〜5に記載するように単離し、構造的に特性化したヒトモノクローナル抗体である。該抗体のVHのアミノ酸配列を配列番号1〜31にそれぞれ示す。該抗体のVLのアミノ酸配列を配列番号32〜66にそれぞれ示す。本発明の他の抗体は変異させたアミノ酸を含むが、なおCDR領域では、上記に示した配列のCDR領域と少なくとも60、70、80、90または95パーセントの同一性を有する。
これらの抗体のそれぞれがhTSLPに結合し得るので、VHおよびVL配列は、本発明の他の抗−hTSLP結合分子を創出するために、「混合し、調和させる」ことができる。かかる「混合し、調和させる」ことによる抗体のhTSLP結合は、上記および実施例に記載の結合アッセイ法(例えば、ELISA)を用いて試験することができる。VHおよびVL鎖を混合し、調和させる場合、特定のVH/VL対合からのVH配列は、構造的に類似のVH配列と置換えるべきである。同様に、特定のVH/VL対合からのVL配列は、構造的に類似のVL配列と置換えるべきである。本発明抗体のVHおよびVL配列は、特に混合と調和のために受け容れ得るものである;その理由は、これらの抗体が同じ生殖系列配列に由来するVHおよびVL配列を使用し、従って、構造的な類似性を有するからである。
別の側面において、本発明は抗体の重鎖および軽鎖CDR1、CDR2とCDR3、またはその組合せからなる抗体を提供する。該抗体のVHCDR1のアミノ酸配列を配列番号1〜7に示す。該抗体のVHCDR2のアミノ酸配列を配列番号8〜25に示す。該抗体のVHCDR3のアミノ酸配列を配列番号26〜31に示す。該抗体のVLCDR1のアミノ酸配列を配列番号32〜40に示す。該抗体のVLCDR2のアミノ酸配列を配列番号41〜49に示す。該抗体のVLCDR3のアミノ酸配列を配列番号50〜66に示す。CDR領域をカバット(Kabat)システムを用いて描出する(Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学的に興味深いタンパク質の配列), Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。
これらの抗体のそれぞれがhTSLPに結合し得るとすれば、また抗原結合特異性が主としてCDR1、2および3領域によって提供されるとすれば、VHCDR1、2および3の配列およびVLCDR1、2および3の配列は、「混合し、調和させる」ことで(すなわち、異なる抗体からのCDRは、各抗体がVHCDR1、2および3とVLCDR1、2および3を含まねばならないが、混合し、調和させることができる)、本発明の他の抗−hTSLP結合分子を創出することができる。かかる「混合し、調和させた」抗体のhTSLP結合は、上記の、または実施例に記載した結合アッセイ法(例えば、ELISA)により試験することができる。VHCDR配列を混合し、調和させる場合、特定のVH配列からのCDR1、CDR2および/またはCDR3の配列は、構造的に類似のCDR配列と置換えるべきである。同様に、VLCDR配列を混合し、調和させる場合、特定のVL配列からのCDR1、CDR2および/またはCDR3配列は、構造的に類似のCDR配列と置換えるべきである。当業者にとって容易に分かることは、新規のVHおよびVL配列が、1つ以上のVHおよび/またはVLCDR領域の配列と、本発明のモノクローナル抗体について本明細書で示したCDR配列からの構造的に類似の配列とを置換することにより創製し得ることである。
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は以下の可変領域を有する:配列番号1〜7からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域CDR1;配列番号8〜25からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域CDR2;配列番号26〜31からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域CDR3;配列番号32〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域CDR1;配列番号41〜49からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域CDR2;および配列番号50〜66からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域CDR3;ただし、該抗体はhTSLPに特異的に結合する。
特定の実施態様において、該抗体は以下の可変領域からなる:配列番号3を含んでなる重鎖可変領域CDR1;配列番号15を含んでなる重鎖可変領域CDR2;配列番号28を含んでなる重鎖可変領域CDR3;配列番号38を含んでなる軽鎖可変領域CDR1;配列番号47を含んでなる軽鎖可変領域CDR2;および配列番号60を含んでなる軽鎖可変領域CDR3。
別の実施態様において、該抗体は以下の可変領域からなる:配列番号3を含んでなる重鎖可変領域CDR1;配列番号17を含んでなる重鎖可変領域CDR2;配列番号28を含んでなる重鎖可変領域CDR3;配列番号38を含んでなる軽鎖可変領域CDR1;配列番号47を含んでなる軽鎖可変領域CDR2;および配列番号60を含んでなる軽鎖可変領域CDR3。
さらに別の実施態様において、該抗体は以下の可変領域からなる:配列番号3を含んでなる重鎖可変領域CDR1;配列番号18を含んでなる重鎖可変領域CDR2;配列番号28を含んでなる重鎖可変領域CDR3;配列番号38を含んでなる軽鎖可変領域CDR1;配列番号47を含んでなる軽鎖可変領域CDR2;および配列番号60を含んでなる軽鎖可変領域CDR3。
別の実施態様において、該抗体は以下の可変領域からなる:配列番号3を含んでなる重鎖可変領域CDR1;配列番号19を含んでなる重鎖可変領域CDR2;配列番号28を含んでなる重鎖可変領域CDR3;配列番号38を含んでなる軽鎖可変領域CDR1;配列番号47を含んでなる軽鎖可変領域CDR2;および配列番号60を含んでなる軽鎖可変領域CDR3。
別の実施態様において、該抗体は以下の可変領域からなる:配列番号3を含んでなる重鎖可変領域CDR1;配列番号20を含んでなる重鎖可変領域CDR2;配列番号28を含んでなる重鎖可変領域CDR3;配列番号38を含んでなる軽鎖可変領域CDR1;配列番号47を含んでなる軽鎖可変領域CDR2;および配列番号60を含んでなる軽鎖可変領域CDR3。
本明細書にて使用する場合、ヒト抗体は、該抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用するシステムから得られるのであれば、特定の生殖系列配列「の産物」であるか、または「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含んでなる。かかるシステムは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を担持する遺伝子導入マウスを所定の抗原で免疫すること、または所定の抗原をもつファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることである。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるか、または「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列に比較し、ヒト抗体の配列に最も近い配列(すなわち、最大%同一性)のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することにより、それ自体同定することができる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるか、または「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入のために、生殖系列配列に比較した場合に、アミノ酸の差異を含み得る。しかし、選択されたヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子がエンコードするアミノ酸配列に、アミノ酸配列として少なくとも90%同一であり、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖系列配列)に比較した場合、ヒト抗体をヒトのものであると同定するアミノ酸残基を含む。特定の事例において、ヒト抗体は生殖系列免疫グロブリン遺伝子がエンコードするアミノ酸配列に対し、少なくとも60&、70%、80%、90%、または少なくとも95%、またはさらには少なくとも96%、97%、98%、または99%、アミノ酸配列において同一である。典型的に、特定のヒト生殖系列配列由来のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子がエンコードするアミノ酸配列と高々10個のアミノ酸の相違を提示するにすぎない。特定の事例において、該ヒト抗体は生殖系列免疫グロブリン遺伝子がエンコードするアミノ酸配列と高々5個の、またはさらに4、3、2、もしくは1個のアミノ酸の相違を提示するにすぎない。
相同抗体
さらに別の実施態様において、本発明の抗体は、本明細書に記載した抗体のアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変領域を有し、その場合の抗体は本発明の抗−hTSLP抗体の所望の機能的性質を保持する。
さらに別の実施態様において、本発明の抗体は、本明細書に記載した抗体のアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変領域を有し、その場合の抗体は本発明の抗−hTSLP抗体の所望の機能的性質を保持する。
例えば、本発明は単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでなり;その場合の重鎖可変領域が配列番号1〜31からなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含んでなり;軽鎖可変領域が配列番号32〜66からなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含んでなり;該抗体がhTSLPに特異的に結合し、そして該抗体が以下の機能的性質の少なくとも1つを示す抗体を提供する:該抗体はhTSLPタンパク質がhTSLP受容体に結合するのを阻害するか、または該抗体はhTSLP受容体の結合を阻害して、炎症性もしくはアレルギー症状、取分け炎症性もしくは閉塞性気道疾患を予防または改善するか、または該抗体はhTSLP受容体の結合を阻害して、喘息を予防または改善するか、または該抗体はhTSLP受容体の結合を阻害して、COPDを予防または改善する。
様々な実施態様において、該抗体は上記で考察した1つ以上、2つ以上、または3つの機能的性質を示す。該抗体は、例えば、ヒトの抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であることができる。
他の実施態様において、VHおよび/またはVLのアミノ酸配列は、上記に示した配列に、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%相同であり得る。配列番号1〜31および32〜66それぞれのVHおよびVL領域に高い相同性(すなわち、80%以上)をもつVHおよびVL領域を有する抗体は、配列番号1〜31および/または32〜66をエンコードする核酸分子を突然変異誘発(例えば、部位特異的またはPCR介在の突然変異誘発)し、次いで、本明細書に記載した機能アッセイにより、保持されている機能(すなわち、上記に示した機能)について、エンコードされ変化している抗体の試験を行うことにより入手し得る。
本明細書にて使用する場合、アミノ酸配列間のパーセント相同性は、2つの配列間のパーセント同一性に等価である。2つの配列間のパーセント同一性は、配列が共有する同一位置の数の関数(すなわち、%相同性=同一位置数/全位置数×100)であるが、2つの配列の最適な整列のために導入される必要のあるギャップ数と各ギャップの長さを考慮する。2つの配列間の配列比較とパーセント同一性の決定は、下記の非限定例に記載するように、数学アルゴリズムを用いて実施し得る。
2つのアミノ酸配列間のパーセント相同性は、すでにアライン(ALIGN)プログラム(バージョン2.0)に組み込まれているメイヤーズとミラーのアルゴリズム(E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988))を用い、PAM120重量残渣表、12のギャップペナルティおよび4のギャップペナルティを用いて決定することができる。さらに、2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウエアパッケージ(http://www.gcg.com にて入手可能)のGAPプログラムにすでに取り込まれているニードルマンとウンシュのアルゴリズム(Needleman and Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970))を用い、ブロッサム62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれか、および16、14、12、10、8、6、もしくは4のギャップウエイトおよび1、2、3、4、5、もしくは6の長さウエイトを用いて決定し得る。
さらにまたは別法として、本発明のタンパク質配列はさらに、例えば、関連する配列を同定するための公開データベースに対する検索を実施するために、「クエリー配列」として使用することができる。かかる検索はXブラスト(XBLAST)プログラム (バージョン2.0)(Altschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10)を用いて実施することができる。ブラスト・タンパク検索は、本発明の抗体分子に相同のアミノ酸配列を得るために、Xブラストプログラム、スコア=50、語長=3として遂行し得る。比較を目的とするギャップ化整列を得るために、ギャップ化ブラストを文献(Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402)記載のように利用することができる。ブラストおよびギャップ化ブラストプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XブラストおよびNブラスト)のデフォルトパラメーターを使用することができる。http:www.ncbi.nlm.nih.gov. 参照。
保存的修飾を有する抗体
特定の実施態様において、本発明の抗体は、CDR1、CDR2、およびCDR3配列からなる重鎖可変領域およびCDR1、CDR2、およびCDR3配列からなる軽鎖可変領域を有し、その場合のこれらのCDR配列の1つ以上が本明細書に記載された抗体もしくはその保存的修飾に基づき特定されたアミノ酸配列を有し、またその場合の抗体は本発明の抗−hTSLP抗体の所望の機能的性質を保持する。従って、本発明はCDR1、CDR2、およびCDR3配列からなる重鎖可変領域およびCDR1、CDR2、およびCDR3配列からなる軽鎖可変領域からなる単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する;その場合、CDR1の重鎖可変領域は配列番号1〜7のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる配列およびその保存的修飾である;CDR2の重鎖可変領域は配列番号8〜25のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる配列およびその保存的修飾である;CDR3の重鎖可変領域は配列番号26〜31のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる配列およびその保存的修飾である;CDR1の軽鎖可変領域は配列番号32〜40のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる配列およびその保存的修飾である;CDR2の軽鎖可変領域は配列番号41〜49のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる配列およびその保存的修飾である;CDR3の軽鎖可変領域は配列番号50〜66のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる配列およびその保存的修飾である;該抗体はhTSLPに特異的に結合する;そして該抗体はhTSLP受容体結合を阻害し、炎症性メディエーターの放出を予防する。
特定の実施態様において、本発明の抗体は、CDR1、CDR2、およびCDR3配列からなる重鎖可変領域およびCDR1、CDR2、およびCDR3配列からなる軽鎖可変領域を有し、その場合のこれらのCDR配列の1つ以上が本明細書に記載された抗体もしくはその保存的修飾に基づき特定されたアミノ酸配列を有し、またその場合の抗体は本発明の抗−hTSLP抗体の所望の機能的性質を保持する。従って、本発明はCDR1、CDR2、およびCDR3配列からなる重鎖可変領域およびCDR1、CDR2、およびCDR3配列からなる軽鎖可変領域からなる単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する;その場合、CDR1の重鎖可変領域は配列番号1〜7のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる配列およびその保存的修飾である;CDR2の重鎖可変領域は配列番号8〜25のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる配列およびその保存的修飾である;CDR3の重鎖可変領域は配列番号26〜31のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる配列およびその保存的修飾である;CDR1の軽鎖可変領域は配列番号32〜40のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる配列およびその保存的修飾である;CDR2の軽鎖可変領域は配列番号41〜49のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる配列およびその保存的修飾である;CDR3の軽鎖可変領域は配列番号50〜66のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる配列およびその保存的修飾である;該抗体はhTSLPに特異的に結合する;そして該抗体はhTSLP受容体結合を阻害し、炎症性メディエーターの放出を予防する。
種々の実施態様において、該抗体は上記で考察、掲載した1つ以上、2つ以上、または3つ以上の機能的性質を示し得る。かかる抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
本明細書において使用する場合、「保存的配列修飾」という用語は、そのアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響しないか、またはそれを変えないアミノ酸の修飾をいうものとする。かかる保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は当該技術分野で既知の標準的技法、例えば、部位特異的突然変異導入およびPCR介在突然変異導入などにより、本発明の抗体に導入することができる。
保存的アミノ酸置換とは、そのアミノ酸が類似の側鎖をもつアミノ酸残基と置換わる置換のことである。類似の側鎖をもつアミノ酸残基のファミリーについては、当該技術分野にて定義されている。これらのファミリーは塩基性の側鎖をもつアミノ酸(例:リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性の側鎖をもつもの(例:アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖をもつもの(例:グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖をもつもの(例:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ−分枝側鎖をもつもの(例:スレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖をもつもの(例:チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)である。このように、本発明抗体のCDR領域内の1個以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置換わることが可能であり、またその変化した抗体は保持されている機能について、本明細書に記載した機能アッセイ法により試験することができる。
本発明抗−hTSLP抗体として同じエピトープに結合する抗体
別の実施態様において、本発明は本明細書に提供した本発明の種々の抗−hTSLP抗体が結合するのと同じエピトープに結合する抗体を提供する。かかるさらなる抗体は、標準的なhTSLP結合アッセイ法により、本発明の他の抗体と交差競合する(例えば、統計的に有意な様式で競合的に結合を阻害すること)それらの能力に基づいて同定することができる。本発明抗体がヒトhTSLPに結合するのを阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がhTSLPに結合する本発明抗体と競合し得ることを実証する;かかる抗体は、限定されない理論に従うと、それと競合する抗体と、hTSLP上の同じまたは関連する(例えば、構造的に類似の、または空間的に近接する)エピトープに結合し得る。特定の実施態様において、本発明の抗体と、hTSLP上の同じエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。かかるヒトモノクローナル抗体は、実施例に記載のように調製し、単離し得る。
別の実施態様において、本発明は本明細書に提供した本発明の種々の抗−hTSLP抗体が結合するのと同じエピトープに結合する抗体を提供する。かかるさらなる抗体は、標準的なhTSLP結合アッセイ法により、本発明の他の抗体と交差競合する(例えば、統計的に有意な様式で競合的に結合を阻害すること)それらの能力に基づいて同定することができる。本発明抗体がヒトhTSLPに結合するのを阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がhTSLPに結合する本発明抗体と競合し得ることを実証する;かかる抗体は、限定されない理論に従うと、それと競合する抗体と、hTSLP上の同じまたは関連する(例えば、構造的に類似の、または空間的に近接する)エピトープに結合し得る。特定の実施態様において、本発明の抗体と、hTSLP上の同じエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。かかるヒトモノクローナル抗体は、実施例に記載のように調製し、単離し得る。
遺伝子工学的に調製修飾した抗体
本発明抗体はさらに修飾した抗体を遺伝子工学的に調製するための出発原料として、本明細書に示すVHおよび/またはVL配列の1つ以上をもつ抗体を使用して調製することができる;該修飾した抗体は原料抗体から変化した性質を有し得る。抗体は一方または双方の可変領域(すなわち、VHおよび/またはVL)内、例えば、1つ以上のCDR領域内および/または1つ以上のフレームワーク領域内の1つ以上の残基を修飾することにより遺伝子工学的に調製し得る。さらに、または別法として、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能を変えるために、定常領域内の残基を修飾することにより遺伝子工学的に調製し得る。
本発明抗体はさらに修飾した抗体を遺伝子工学的に調製するための出発原料として、本明細書に示すVHおよび/またはVL配列の1つ以上をもつ抗体を使用して調製することができる;該修飾した抗体は原料抗体から変化した性質を有し得る。抗体は一方または双方の可変領域(すなわち、VHおよび/またはVL)内、例えば、1つ以上のCDR領域内および/または1つ以上のフレームワーク領域内の1つ以上の残基を修飾することにより遺伝子工学的に調製し得る。さらに、または別法として、抗体は、例えば、抗体のエフェクター機能を変えるために、定常領域内の残基を修飾することにより遺伝子工学的に調製し得る。
遂行し得る可変領域工学の一つのタイプは、CDR移植である。抗体は、6つの重鎖および軽鎖相補性決定領域(CDR)に位置するアミノ酸残基を介して主として標的抗原と相互作用する。このために、CDR内のアミノ酸配列は、CDR外の配列よりも個々の抗体間でより多様である。CDR配列は殆どの抗体−抗原相互作用に大きな関わりをもつので、異なる性質をもつ異なる抗体からのフレームワークに移植した特異的天然産抗体からのCDR配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的天然産抗体の性質を模倣する組換え抗体を発現することが可能である(参照例: Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; 米国特許 US 5,225,539 (winter) および米国特許 US 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 および 6,180,370 (Queen et al.))。
従って、本発明の別の実施態様は、配列番号1〜7からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するCDR1配列;配列番号8〜25からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するCDR2配列;配列番号26〜31からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するCDR3配列;をそれぞれ含んでなる重鎖可変領域;および配列番号32〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するCDR1配列;配列番号41〜49からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するCDR2配列;配列番号50〜66からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するCDR3配列;をそれぞれ含んでなる軽鎖可変領域を含んでなる単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。従って、かかる抗体はモノクローナル抗体のVHおよびVLCDR配列を含み、さらにこれらの抗体と異なるフレームワーク配列を含み得る。
かかるフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開DNAデータベースまたは公開された文献から入手し得る。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列DNA配列は、「Vベース」ヒト生殖系列配列データベース(インターネットで入手可能: www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase)、並びに文献(Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol. 227:776-798; and Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836)(これらのそれぞれの内容を特に参照により本明細書の一部とする)に見出し得る。
本発明抗体にて使用するフレームワークの例は、本発明の選択された抗体により使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使用される共通配列および/またはフレームワーク配列に構造的に類似する配列である。VHCDR1、2および3の配列、およびVLCDR1、2および3の配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子に見出される配列と同一の配列をもつフレームワーク領域に移植することができるし、または当該CDR配列は、生殖系列配列に比較されるように、1つ以上の突然変異を含むフレームワーク領域に移植することができる。例えば、特定の事例において、抗体の抗原結合能力を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であると認められている(参照例:米国特許 US 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 および 6,180,370 ; Queen et al)。
別のタイプの可変領域修飾は、VHおよび/またはVLCDR1、CDR2および/またはCDR3領域内のアミノ酸残基を変異させることであり、それによって「親和性成熟」として知られる当該抗体の1つ以上の結合性(例えば、親和性)を改善する。部位特異的変異誘発またはPCR介在変異誘発は、突然変異を導入するために実施することができ、また抗体結合に対する作用または当該他の機能的性質は、本明細書に記載され、また実施例に提供されているインビトロもしくはインビボのアッセイ法により評価し得る。保存的修飾は(上記考察のように)導入することができる。突然変異とはアミノ酸置換、付加または欠失であり得る。さらに、典型的には、CDR領域内の1個、2個、3個、4個または5個を超えない残基が変更される。
従って、別の実施態様において、本発明は、配列番号1〜7を有する群から選択されるアミノ酸配列または配列番号1〜7と比較して、1、2、3、4または5個のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列からなるVHCDR1領域;配列番号8〜25を有する群から選択されるアミノ酸配列または配列番号8〜25と比較して、1、2、3、4または5個のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列からなるVHCDR2領域;配列番号26〜31を有する群から選択されるアミノ酸配列または配列番号26〜31と比較して、1、2、3、4または5個のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列からなるVHCDR3領域;配列番号32〜40を有する群から選択されるアミノ酸配列または配列番号32〜40と比較して、1、2、3、4または5個のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列からなるVLCDR1領域;配列番号41〜49を有する群から選択されるアミノ酸配列または配列番号41〜49と比較して、1、2、3、4または5個のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列からなるVLCDR2領域;および配列番号50〜66を有する群から選択されるアミノ酸配列または配列番号50〜66と比較して、1、2、3、4または5個のアミノ酸の置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列からなるVLCDR3領域;を有する重鎖可変領域からなる単離された抗−hTSLPモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
遺伝子工学的に調製された本発明抗体は、例えば、抗体の性質を改善するために、VHおよび/またはVL内のフレームワーク残基に修飾が施された抗体である。典型的に、かかるフレームワーク修飾は抗体の免疫原性を低下させるためになされる。例えば、1つの方法は、1つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「復帰変異させ」ることである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、抗体由来の生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。かかる残基は抗体のフレームワーク配列を抗体由来の生殖系列配列と比較することにより同定することができる。フレームワーク領域の配列をそれらの生殖系列配置に戻すためには、体細胞突然変異を生殖系列配列に、例えば、部位特異的突然変異誘発またはPCR−介在突然変異誘発により、「復帰変異させ」ることができる。かかる「復帰変異させ」た抗体もまた本発明に包含されるものとする。
別のタイプのフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内の、さらには1つ以上のCDR領域内の1つ以上の残基を突然変異させ、T細胞−エピトープを除去し、その結果として抗体の潜在的な免疫原性を低下させることからなる。この方法は「脱免疫化」ともいい、米国特許(US 20030153043;Carr et al)にさらに詳細に記載されている。
フレームワークまたはCDR領域内になされた修飾に加えて、またはそれに替わるものとして、本発明抗体はそのFc領域内に、典型的には、抗体の1つ以上の機能的性質、例えば、血清半減期、補体固定、Fc受容体結合、および/または抗原依存性細胞毒性を変えることなどの修飾を含めるために、遺伝子工学的に調製し得る。さらに、本発明の抗体は化学的に修飾する(例えば、1種以上の化学的部分を抗体に付着させ得る)か、またはそのグリコシル化を変えるように修飾して、再び抗体の1つ以上の機能的性質を変えることができる。これらの実施態様のそれぞれについて、以下にさらに詳細に記載する。Fc領域の残基の番号付けはカバット(Kabat)のEUインデックスのものである。
一実施態様において、CH1のヒンジ領域は、ヒンジ領域のシステイン残基数が変わるように、例えば、増加または減少するように修飾する。この方法はさらに米国特許(US 5,677,425;Bodmer et al.)に記載されている。CH1のヒンジ領域のシステイン残基数は、例えば、軽鎖および重鎖の集合を容易にするために、または抗体の安定性を増減するために変化させる。
別の実施態様において、抗体のFcヒンジ領域は抗体の生物学的半減期を短縮するために変異させる。より具体的には、1つ以上のアミノ酸突然変異をFcヒンジフラグメントのCH2−CH3ドメイン界面領域に導入し、抗体が、元のFcヒンジドメインのスタフィロコッカスタンパク質A(SpA)結合に比べて、SpA結合が減弱するようにする。この方法はさらに詳細に米国特許(US 6,165,745;Ward et al.)に記載されている。
別の実施態様において、抗体はその生物学的半減期を延長させるために修飾する。種々の方法が可能である。例えば、以下の突然変異の1つ以上が導入され得る:T252L、T254S、T256F(米国特許:US 6,277,375 ;Ward に記載されている)。別法として、生物学的半減期を延長させるために、抗体のCH1またはCL領域内を、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから取り出したサルベージ受容体結合エピトープを含むように変えることができる(米国特許:5,869,046 and 6,121,022 ; Presta et al. に記載されている)。抗体のFc定常領域は血清半減期とエフェクター機能、すなわち、抗体依存性細胞毒性(ADCC)または補体依存性細胞毒性(CDC)活性の決定にとって重大である。エフェクター機能および/または血清半減期を変えるために、Fcフラグメントの特異的突然変異体を遺伝子工学的に調製することが可能である(例えば、キセンコール(Xencor)技術参照)(参照例:WO2004029207)。
抗体のエフェクター機能と血清半減期を変えるための一つの方法は、抗体フラグメントの可変領域を、適切なエフェクター機能をもつFcフラグメントと接続することである。IgG1またはIgG4のイソ型は細胞死滅活性用に選択し得るが、一方、IgG2のイソ型はサイレント抗体用に使用することができる(細胞死滅活性もたず)。
長い血清半減期をもつサイレント抗体は、抗体の可変領域をHSAなどの血清タンパク質と、またはHSA−結合タンパク質などのかかる血清タンパク質に結合するタンパク質とキメラ融合させることにより入手し得る。
さらに他の実施態様において、抗体のエフェクター機能を変えるためには、少なくとも1個のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置き換えることによりFc領域を変える。例えば、抗体がエフェクターリガンドに対し変化した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するようにするためには、1個以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基と置き換えるとよい。親和性が変化しているエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1構成要素であり得る。この方法はさらに詳細に米国特許(US 5,624,821 および 5,648,260, 共に Winter et al.による)に記載されている。
別の実施態様において、アミノ酸残基より選択される1個以上のアミノ酸は、当該抗体が変化したC1q結合および/または低減もしくは完全に除かれた補体依存性細胞毒性(CDC)をもつように、異なるアミノ酸残基と置き換えることができる。この方法についてはさらに詳細に米国特許(US 6,194,551; Idusogie et at.)に記載されている。
別の実施態様においては、1個以上のアミノ酸残基を変えて、それによって補体を固定する抗体の能力を変える。この方法についてはさらにPCT公開公報(WO 94/29351; Bodmer et al.)に記載されている。
さらに別の実施態様においては、抗体依存性細胞性細胞毒性(ADCC)を仲介する抗体の能力を増大させるか、および/または1個以上のアミノ酸を修飾することによりFcγ受容体に対する抗体の親和性を増大させるために、Fc領域を修飾する。この方法についてはさらにPCT公開公報(WO 00/42072; Presta)に記載されている。さらに、FcγRI、RcγRII、FcγRIIIおよびFcRnに対するヒトIgG1上の結合部位は地図化されており、また改善された結合性をもつ変異体が記載されている(参照:Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604)。
なおさらなる別の実施態様においては、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、無糖化抗体を作製し得る(すなわち、抗体がグリコシル化を欠落する)。グリコシル化を変えることで、例えば、「抗原」に対する抗体の親和性を増大させることができる。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の1つ以上のグリコシル化部位を変えることにより達成され得る。例えば、1つ以上のアミノ酸置換を実施し、結果として1つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を除き、それによってその部位でのグリコシル化を排除することができる。かかる無糖化は抗原に対する抗体の親和性を増大させることができる。かかる方法については、さらに詳細に米国特許(US 5,714,350 および 6,350,861; Co et al.)に記載されている。
さらに、または別法として、減量フコシル残基をもつ低フコシル化抗体または増大した二分化GlcNac構造をもつ抗体など、変化した型のグリコシル化を有する抗体を作製することができる。かかる変化させたグリコシル化パターンは、抗体のADCC能力を上昇させることが証明されている。かかる炭水化物修飾は、例えば、変化させたグリコシル化機構をもつ宿主細胞中に抗体を発現させることにより実施し得る。変化させたグリコシル化機構をもつ細胞は、当該技術分野においてすでに記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによって変化させたグリコシル化機構をもつ抗体を産生させるための宿主細胞として使用することができる。例えば、欧州特許(EP 1,176,195;Hang et al.)は、機能的に分断されたFUT8遺伝子をもつ細胞株を記載しているが、この遺伝子はフコシルトランスフェラーゼをエンコードしており、その結果かかる細胞株で発現された抗体は、低フコシル化を示す。PCT公開公報(WO 03/035835;Presta)は変異体CHO細胞株、Lec13細胞について記載しているが、この細胞はフコースをAsn(297)結合炭水化物を付着させる能力が低下しており、また結果としてその宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化を生じる(以下も参照:Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740)。PCT公開特許(WO 99/54342;Umana et al.)は、糖タンパク−修飾グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、ベータ(1,4)−N アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII))を発現させるために遺伝子工学的に調製した細胞株について記載しており、遺伝子工学的に調製した細胞株で発現される抗体は、抗体のADCC活性を増大させることとなる二分断GlcNac構造の増加を示す(以下も参照:Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180)。
本発明が企図する本明細書の抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生物学的(例えば、血清)半減期を延長するためにペグ化することができる。抗体をペグ化するためには、抗体またはそのフラグメントを、典型的にはポリエチレングリコール(PEG)、例えば、PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、1つ以上のPEG基が該抗体または抗体フラグメントに付着することとなる条件下で反応させる。ペグ化は反応性PEG分子(または類似の反応性水溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応により実施し得る。本明細書にて使用する場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ(C1−C10)アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール−マレイン酸イミドなどの他のタンパク質を誘導化するために使用されているPEG形状のいずれをも包含するものとする。特定の実施態様において、ペグ化されるべき抗体は無糖化抗体である。タンパク質のペグ化方法は、当該技術分野で既知であり、本発明の抗体に適用し得る。参照例:EP 0 154 316 (Nishimura et al.)および EP 0 401 384(Ishikawa et al.)。
エフェクター機能もまた抗体のグリコシル化パターンを変調することにより変化させることができる。グリカート(Glycart)(例, US 6,602,684)、バイオワ(Biowa)(例, US 6,946,292) およびジェネンテック (例 WO 03/035835) は、エフェクター機能を増減させた抗体を産生させるために、哺乳動物細胞株を遺伝子工学的に調製している。取分け、非フコシル化抗体は増強されたADCC活性を有する。グリコファイ(Glycofi)はまた特異的グリコ型抗体を産生し得る酵母細胞株を開発した。また、協和発酵/バイオワはフコースを低減する技法を開発した。参照例:WO 03/085102。
広範囲の多様な抗体/免疫グロブリンフレームワークまたは骨格(スカフォールド)は、得られるポリペプチドがhTSLPタンパク質に特異的である1つ以上の結合領域を含む限り、採用し得る。かかるフレームワークまたは骨格は、5つの主要イディオタイプのヒト免疫グロブリンまたはそのフラグメント(本明細書の別の箇所で開示したものなど)を含み、他の動物種の免疫フロブリン、好ましくはヒト化側面をもつものを含む。カメリドに確認されているものなど、一本重鎖抗体はこの観点で特に興味のあるものである。新規のフレームワーク、骨格およびフラグメントは、当業者によって継続して発見・開発されている。
別法として、既知のまたは将来の非免疫グロブリンフレームワークおよび骨格は、hTSLPタンパク質に特異的な結合領域を含む限り、採用され得る。かかる化合物は本明細書において「cMAC−特異的結合領域を含むポリペプチド」として既知である。既知非免疫グロブリンフレームワークまたは骨格は、アドネクチンズ(Adnectins)(フィブロネクチン)(カンパウンド・セラピューティックス・インク;ウォールサム、マサチューセッツ)、アンキリン (モレキュラー・パートナーズ(株);チューリッヒ、スイス)、ドメイン抗体 (ドマンティス(株)(ケンブリッジ、マサチューセッツ) およびアブリンクスnv (ズイジナード(Zwijnaarde)、ベルギー))、リポカリン(lipocalin)(アンチカリン)(ピエリス・プロテオラボ(株)、フライジング、ドイツ)、小モジュラー免疫医薬(ツルビオン (Trubion)ファーマシューティカル・インク;シアトル、ワシントン州)、マキシーボデイズ(アビディア・インク (Avidia, Inc.)(マウンテンビュー;CA))、プロテインA(アフィボディ (Affibody AG)、スウェーデン) およびアフィリン(affilin)(ガンマ−結晶またはユビキチン)(シル・プロテインズ (Scil Proteins GmbH)、ハーレ、ドイツ)である。
本発明によると、抗−hTSLP抗体もしくはそのフラグメント、またはhTSLP−特異的結合領域を含むポリペプチドは、採用されるフレームワークまたは骨格に関係なく共有結合的にまたは非共有結合的に、さらなる部分に結合し得る。さらなる部分とは、ポリペプチド、PEGなどの不活性ポリマー、小分子、放射性同位体、金属、イオン、核酸または他のタイプの生物学的に関連する分子であってもよい。かかる構築物は、免疫接合体、免疫毒素などとして知られる得るが、本明細書にて使用する場合、抗体、抗体フラグメントまたはahTSLP−特異的結合領域を含むポリペプチドに含まれる。
抗体の遺伝子工学的調製法
上記で考察したように、本明細書に示すVHおよびVL配列を有する抗−hTSLP抗体は、VHおよび/またはVL配列、またはそれに付着する定常領域を修飾することにより、新規抗−hTSLP抗体を創製するために使用することができる。従って、本発明の別の側面において、抗−hTSLP抗体の構造的特徴は、本発明抗体の少なくとも1つの機能的性質、例えば、hTSLPに結合し、またhTSLPの1つ以上の機能的性質を阻害する性質(例えば、受容体結合、メディエーター放出の阻害)を保持する構造的に関連する抗−hTSLP抗体を創製するために使用する。
上記で考察したように、本明細書に示すVHおよびVL配列を有する抗−hTSLP抗体は、VHおよび/またはVL配列、またはそれに付着する定常領域を修飾することにより、新規抗−hTSLP抗体を創製するために使用することができる。従って、本発明の別の側面において、抗−hTSLP抗体の構造的特徴は、本発明抗体の少なくとも1つの機能的性質、例えば、hTSLPに結合し、またhTSLPの1つ以上の機能的性質を阻害する性質(例えば、受容体結合、メディエーター放出の阻害)を保持する構造的に関連する抗−hTSLP抗体を創製するために使用する。
例えば、上記で考察したように、本発明のさらなる組換え遺伝子工学的抗−hTSLP抗体を創製するために、本発明抗体の1つ以上のCDR領域、またはその突然変異を、既知のフレームワーク領域および/または他のCDRと組換え的に組合せることができる。他のタイプの修飾は前節に記載したものである。遺伝子工学法の出発原料は、本明細書に提供するVHおよび/またはVL配列の1つ以上、または1つ以上のそのCDR領域である。遺伝子工学的に調製した抗体を創出するために、本明細書に提供したVHおよび/またはVL配列の1つ以上、またはその1つ以上のCDR領域を有する抗体を実際に調製する(すなわち、タンパク質を発現させる)必要はない。むしろ、その配列に含まれる情報は、元の配列に由来する「第二世代」の配列を創出するために、出発原料として使用し、次いでその「第二世代」の配列を調製し、タンパク質として発現させる。
従って、別の実施態様において、本発明は、配列番号1〜7からなる群より選択されるCDR1配列、配列番号8〜25からなる群より選択されるCDR2配列、および/または配列番号26〜31からなる群より選択されるCDR3配列を有する重鎖可変領域抗体配列;および配列番号32〜40からなる群より選択されるCDR1配列、配列番号41〜49からなる群より選択されるCDR2配列、および/または配列番号50〜66からなる群より選択されるCDR3配列を有する軽鎖可変領域抗体配列からなる抗−hTSLP抗体を調製し;重鎖可変領域抗体配列および/または軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも1個のアミノ酸残基を変化させて少なくとも1つの変化させた抗体配列を創出し;そして変化させた抗体配列をタンパク質として発現させることからなる方法を提供する。
標準的分子生物学技術を用いて、変化させた抗体配列を調製、発現させることができる。変化させた抗体配列によりエンコードされる抗体は、本明細書に記載した抗−hTSLP抗体の1つの、いくつかの、またはすべての機能的性質を保持する抗体であり、この機能的性質は、限定されるものではないが、hTSLPに特異的に結合することである;また該抗体は以下の機能的性質の少なくとも1つを示す:該抗体はhTSLPタンパク質がhTSLP受容体に結合するのを阻害するか、または該抗体はhTSLP受容体の結合を阻害し、炎症性、線維症性またはアレルギー性症状、特に炎症性または閉塞性気道疾患を予防または改善するか、または該抗体はhTSLP受容体結合を阻害し、それによって喘息を予防または改善する。
変化させた抗体は、上記で考察した機能的性質の1つ以上、2つ以上、または3つ以上を示し得る。
変化させた抗体の機能的性質は、当該技術分野で利用し得る、および/または本明細書に記載された標準的アッセイ法、例えば、実施例に記載の方法(例:ELISA)により評価することができる。
変化させた抗体の機能的性質は、当該技術分野で利用し得る、および/または本明細書に記載された標準的アッセイ法、例えば、実施例に記載の方法(例:ELISA)により評価することができる。
本発明の抗体を遺伝子工学的に調製する方法の特定の実施態様において、突然変異は、抗−hTSLP抗体コーディング配列のすべてまたは一部にそって無作為にまたは選択的に導入することが可能であり、得られる修飾された抗−hTSLP抗体は、本明細書に記載のように、結合活性および/または他の機能的性質について選抜することができる。突然変異法については当該技術分野においてすでに記載されている。例えば、PCT公開公報(WO 02/092780;Short)は、飽和突然変異誘発、合成連結構築、またはその組合せなどについて記載している。別法として、PCT公開公報(WO 03/074679;Lazar et al.)は、抗体の生理化学的性質を最適化するために、コンピュータスクリーニング法を使用する方法について記載している。
本発明抗体をエンコードする核酸分子
本発明の別の側面は、本発明抗体をエンコードする核酸分子に関する。核酸は全細胞、細胞溶解液に存在し得るか、または部分的に精製したか、もしくは実質的に純粋な形状の核酸であり得る。核酸は標準的な技法、例えば、アルカリ性/SDS処理、CsClバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、その他技術上周知の方法により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞性核酸またはタンパク質などを除去精製した場合に、「単離された」ものであるか、または「実質的に純粋なものとして提供」される。参照:F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York。本発明の核酸は、例えば、DNAまたはRNAであり得るし、また、イントロン配列を含んでいても、含んでいなくてもよい。一実施態様において、核酸はcDNA分子である。核酸はファージディスプレーベクターなどのベクター中に、または組換えプラスミドベクター中に存在し得る。
本発明の別の側面は、本発明抗体をエンコードする核酸分子に関する。核酸は全細胞、細胞溶解液に存在し得るか、または部分的に精製したか、もしくは実質的に純粋な形状の核酸であり得る。核酸は標準的な技法、例えば、アルカリ性/SDS処理、CsClバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、その他技術上周知の方法により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞性核酸またはタンパク質などを除去精製した場合に、「単離された」ものであるか、または「実質的に純粋なものとして提供」される。参照:F. Ausubel, et al., ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York。本発明の核酸は、例えば、DNAまたはRNAであり得るし、また、イントロン配列を含んでいても、含んでいなくてもよい。一実施態様において、核酸はcDNA分子である。核酸はファージディスプレーベクターなどのベクター中に、または組換えプラスミドベクター中に存在し得る。
本発明の核酸は標準的な分子生物学技法を用いて入手し得る。ハイブリドーマ(例えば、さらに以下に記載するヒト免疫グロブリン遺伝子を担持する遺伝子導入マウスから調製したハイブリドーマ)により発現される抗体の場合、該ハイブリドーマにより作製された抗体の軽鎖および重鎖をエンコードするcDNAは、標準的なPCR増幅またはcDNAクローニング法により入手し得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから(例えば、ファージディスプレー法により)入手した抗体の場合、該抗体をエンコードする核酸は、ライブラリーのメンバーである種々のファージクローンから回収することができる。
VHおよびVLセグメントをエンコードするDNAフラグメントを入手したなら、これらのDNAフラグメントは標準的組換えDNA技法によりさらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に変換することで、Fabフラグメントに、またはscFv遺伝子とすることができる。これらの操作において、VHまたはVL−エンコードDNAフラグメントは、別のDNA分子に、または別のタンパク質をエンコードするフラグメント、例えば、抗体の定常領域もしくは可変性リンカーなどに作動可能なように連結する。「作動可能なように連結する」という用語は、この文脈において使用する場合、2つのDNAフラグメントを機能的な様式で、例えば、2つのDNAフラグメントによりエンコードされるアミノ酸配列がフレーム内にあるように、またはタンパク質が所望のプロモーターの制御下で発現されるように、連結することを意味するものとする。
VH領域をエンコードする単離されたDNAは、VH−エンコーディングDNAを重鎖定常領域(CH1、CH2およびCH3)をエンコードする別のDNA分子に作動可能なように連結することにより、全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において既知であり(参照例:Kabat, E. A., el al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学的対象となるタンパク質の配列), Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)、またこれらの領域を包含するDNAフラグメントは標準的PCR増幅により入手し得る。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgMまたはIgD定常領域であり得る。Fabフラグメント重鎖遺伝子の場合、VH−エンコーディングDNAは、重鎖CH1定常領域のみをエンコードする別のDNA分子に作動可能なように連結することができる。
VL領域をエンコードする単離されたDNAは、VL−エンコードDNAを軽鎖定常領域CLをエンコードする別のDNA分子に作動可能なように連結することにより、全長軽鎖遺伝子(並びにFab軽鎖遺伝子)に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野において既知であり(参照例:Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫グロブリン関連タンパク質の配列), Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)、これらの領域を包含するDNAフラグメントは、標準的PCR増幅により入手することができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であってもよい。
scFv遺伝子を創製するために、VHおよびVL−エンコードDNAフラグメントを可変性リンカーをエンコードする別のフラグメント、例えば、アミノ酸配列(Gly4−Ser)をエンコードするフラグメントに作動可能なように連結する;結果としてVHおよびVL配列は、可変性リンカーにより連結されたVHおよびVL領域をもつ相接する一本鎖タンパク質として発現され得る(参照例:Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et at., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554)。
本発明モノクローナル抗体の生産
モノクローナル抗体(mAbs)は常套のモノクローナル抗体方法論を含む様々な技法、例えば、コーラーとミルシュタイン(Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495)の標準的体細胞ハイブリッド形成法により生産することができる。モノクローナル抗体を製造するための多くの技法、例えば、Bリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換などを採用し得る。
モノクローナル抗体(mAbs)は常套のモノクローナル抗体方法論を含む様々な技法、例えば、コーラーとミルシュタイン(Kohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495)の標準的体細胞ハイブリッド形成法により生産することができる。モノクローナル抗体を製造するための多くの技法、例えば、Bリンパ球のウイルスまたは発癌性形質転換などを採用し得る。
ハイブリドーマを調製するための動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ生産は、確立した手法である。免疫化プロトコールおよび融合用の免疫化脾細胞の単離法は当該技術分野で既知である。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)および融合手法もまた既知である。モノクローナル抗体は、すでに株のコレクションに寄託してある特異的ハイブリドーマを用いて産生させることができる。
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製したマウスモノクローナル抗体の配列にもとづいて調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをエンコードするDNAは、所定のマウスハイブリドーマから入手可能であり、標準的分子生物学技法を用いて、非マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリンを含むように遺伝子工学的に調製することができる。例えば、キメラ抗体を創製するためには、マウス可変領域を当該技術分野で既知の方法に従って、ヒト定常領域に連結することができる(参照例:米国特許 US 4,816,567;Cabilly et al.)。ヒト化抗体を創製するためには、マウスCDR領域を既知の方法に従い、ヒトフレームワークに挿入することができる(参照例:米国特許 US 5,225,539 to Winter, および US 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 および ,6;180;370;Queen.et al.)。
特定の実施態様において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。hTSLPに向けられたかかるヒトモノクローナル抗体は、マウス免疫系よりもむしろヒト免疫系の一部を担持する遺伝子導入または染色体導入マウスを用いて生成させることができる。これらの遺伝子導入および染色体導入マウスは、本明細書にてそれぞれHuMAbマウスおよびKMマウスとして引用するマウスを含み、全部を含めてヒトIgマウスという。
HuMAbマウス(登録商標)(メダレックス・インク;Medarex, Inc.) は、非再配列ヒト重鎖(μおよびγ)およびκ−軽鎖免疫グロブリン配列を内在性μおよびκ鎖遺伝子座と共にエンコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含む(参照例:Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859)。従って、当該マウスはマウスIgMまたはκの発現を低下したものとして示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチと体細胞突然変異を受け、高親和性ヒトIgGKモノクローナル抗体を生成する(Lonberg, N. et al., 1994 上記; 概説:Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, および Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546)。HuMAbマウスの調製と使用、およびかかるマウスが担持するゲノム修飾については、以下に記載されている:Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; および Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851;これらのすべての内容全文を参照により本明細書に添付する。さらなる参照例:米国特許(US 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; および 5,770,429; すべて Lonberg and Kayに付与); 米国特許(US 5,545,807;Surani et al.); PCT公開公報(WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 and WO 99/45962, すべて Lonberg and Kayに付与); およびPCT公開公報(WO 01/14424;Korman et al.)。
別の実施態様において、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を担持するマウスなど、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を担持するマウスを用いて生じさせることができる。かかるマウスは本明細書にて「KMマウス」といい、その詳細はPCT公開公報(WO 02/43478;Ishida et al.)に記載されている。
なおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる代替の導入遺伝子動物系は、当該技術分野において利用可能であり、本発明の抗−hTSLP抗体を生じさせるために使用し得る。例えば、ゼノマウス(Xenomouse)(アブゲニックス・インク(Abgenix, Inc.))といわれる代替の遺伝子導入系が、使用可能である;かかるマウスは、例えば、米国特許(US 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 および 6,162,963;Kucherlapati et al.)に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる代替の染色体導入動物系は、当該技術分野にて利用可能であり、本発明の抗−hTSLP抗体を生じさせるために使用することができる。例えば、「TCマウス」といわれるヒト重鎖導入染色体とヒト軽鎖導入染色体の両方を担持するマウスが使用され得る;かかるマウスは文献(Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727)に記載されている。さらに、ヒトの重鎖および軽鎖導入染色体を担持するウシが、当該技術分野ですでに記載されており(Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894)、本発明の抗−hTSLP抗体を生じさせるために使用することができる。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングするファージディスプレー法を用いて調製することもできる。ヒト抗体を単離するかかるファージディスプレー法は当該技術分野で確立されている。参照例:米国特許(US 5,223,409; 5,403,484; および 5,571,698;Ladner et al.); 米国特許(US 5,427,908 および 5,580,717;Dower et al.); 米国特許(US 5,969,108 および 6,172,197;McCafferty et al.); および米国特許(US 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 および 6,593,081;Griffiths et al.)。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体応答が免疫により生成し得るようにヒト免疫細胞を再構築したSCIDマウスを用いて調製することもできる。かかるマウスは、例えば、米国特許(US 5,476,996 および 5,698,767 ; Wilson et al.)に記載されている。
抗体ヒトライブラリーのスクリーニング(例えば、モルフォシス(Morphosys)でのファージディスプレー)から得られる抗体、モルフォシスからのHuCalライブラリーなどのライブラリーからの抗体、親和性成熟法、およびさらにコドン最適化配列技法が使用され得る。親和性成熟は他の方法(例えば、ハイブリドーマ)で作製した抗体に対しても使用し得る。
トランスフェクトーマ産生モノクローナル抗体の生成
本発明の抗体は、当該技術分野において周知のように、例えば、組換えDNA技法と遺伝子形質移入法の組み合わせを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマにて生産することができる(例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
本発明の抗体は、当該技術分野において周知のように、例えば、組換えDNA技法と遺伝子形質移入法の組み合わせを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマにて生産することができる(例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
例えば、抗体またはその抗体フラグメントを発現するためには、部分的または全長の軽鎖および重鎖をエンコードするDNAが、標準的分子生物学技法(例えば、PCR増幅または所定の抗体を発現するハイブリドーマを用いるcDNAクローニング)により入手することが可能であり、またそのDNAは発現ベクターに挿入し、該遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能なように連結することができる。この文脈において、「作動可能なように連結する」という用語は、該ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写と翻訳の企図した調節機能を発揮するようにベクターに連結することを意味するものとする。発現ベクターと発現制御配列は使用する発現宿主細胞と両立するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別個のベクターに挿入し得るか、またはより典型的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は標準的方法(例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補性制限部位の連結、または制限部位が存在しない場合には、平滑末端連結)により発現ベクターに挿入する。本明細書に記載した抗体の軽鎖および重鎖可変領域は、VHセグメントがベクター内のCLセグメントに作動可能なように連結され、またVLセグメントがベクター内のCLセグメントに作動可能なように連結されるように、所望のイソ型の重鎖定常領域および軽鎖定常領域をすでにエンコードしている発現ベクターにそれらを挿入することにより、いずれかの抗体イソ型の全長抗体遺伝子を創製するために使用し得る。さらに、または別法として、組換え発現ベクターは、宿主細胞から抗体鎖を分泌し易すくするシグナルペプチドをエンコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがフレーム中、抗体鎖遺伝子のアミノ末端に連結されるように、ベクターにクローン化することができる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド)であってもよい。
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を担持する。「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素(例えば、ポリアデニル化シグナル)を含むものとする。かかる調節配列については、例えば、ゲーデル(Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990))に記載されている。当業者が認めるように、発現ベクターの設計は、調節配列の選択を含め、形質転換すべき宿主細胞の選定、所望タンパク質の発現レベルなどの因子に左右され得る。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列は、哺乳動物細胞においてタンパク質発現の高レベルを目的とするウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、シミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP)、およびポリオーマなどである。別法として、非ウイルス性調節配列、例えば、ユビキチンプロモーターまたはP−グロビンプロモーターなどが使用され得る。なおさらに、異なる起源からの配列からなる調節要素、例えば、SRaプロモーターシステムなどもあり、このものはSV40初期プロモーターおよびヒトT細胞白血病ウイルス1型の長末端反復からの配列を含む(Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
抗体鎖遺伝子と調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中のベクターの複製を調節する配列(例えば、複製の起源)および選択可能なマーカー遺伝子などのさらなる配列を担持し得る。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターを導入してある宿主細胞の選択を容易にする(参照例:US 4,399,216, 4,634,665 および 5,179,017, すべて Axel et al.に付与)。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターを導入した宿主細胞に、薬物、例えば、G418、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートなどに対する耐性を付与する。選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子(メトトレキセート選択/増幅でのdhfr−宿主細胞に使用)およびネオ遺伝子(G418選択用)である。
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をエンコードする発現ベクターは、標準的方法により宿主細胞に形質移入する。「形質移入」という用語の種々の形態は、外来DNAを原核または真核宿主細胞に導入するために一般的に使用される様々な技法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、DEAE−デキストラン形質移入などを包含するものとする。原核または真核宿主細胞において本発明の抗体を発現することは理論的に可能である。真核細胞、取分け哺乳動物宿主細胞における抗体の発現は、かかる真核細胞、取分け哺乳動物細胞が原核細胞よりも、適切に折りたたまれた免疫学的に活性な抗体の構築と分泌に、より適切であると思われるために考察される。抗体遺伝子の原核細胞発現は、活性な抗体の高収率生産に無効であると報告されている (Boss, M. A. and Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6:12-13)。
本発明の組換え抗体を発現させる哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)(dhfr−CHO細胞を含む;記載例:Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220;DH FR選択可能マーカーとともに使用される;記載例:R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621)、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞である。抗体遺伝子をエンコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、該抗体は、宿主細胞中で抗体を発現させるか、または宿主細胞を増殖させる培地中に抗体を分泌させるために十分な時間、宿主細胞を培養することにより生産される。抗体は標準的なタンパク質精製法により培地から回収することができる。
部分的または全長の軽鎖および重鎖をエンコードする配列は、標準的形質移入法により、かかる配列を担持する発現ベクターを宿主細胞に形質移入することにより発現する。典型的には、抗体が通例どおりに糖タンパク質であり、原核細胞がそのために不適切である場合、真核宿主細胞を抗体発現用に使用する。組換え抗体の発現に使用し得る哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(dhfr−CHO細胞を含む)、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞である。別法として、哺乳動物様グリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝子工学的に作製した宿主細胞、例えば、酵母、真菌または植物細胞株などを使用することができる。該抗体は、例えば、糖化用に作製した酵母細胞株、ピチア、サッカロミセスまたはクルイベロマイセス(Kluyveromyces)種、好ましくは、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)またはサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisae)またはクルイベロマイセル・ラクティス(Kluyveromyces lactis)などで産生し得る;参照例:EP1297172B1 (Glycofi)。該抗体は糖化用に作製した植物細胞株にても産生可能であり、好ましくは、WO2004057002 (グリーノベーション;Greenovation)に記載されたコケ植物細胞株である。抗体は、宿主細胞中で抗体を発現させるか、または宿主細胞を増殖させる培地中に抗体を分泌させるために十分な時間、宿主細胞を培養することにより生産される。抗体は標準的なタンパク質精製法により培地から回収することができる。
免疫接合体
別の側面において、本発明は治療剤部分、例えば、細胞毒素、薬物(例:免疫抑制剤)または放射性毒素などに接合した高−hTSLP抗体またはそのフラグメントを特徴とする。かかる接合体は本明細書において「免疫接合体」という。1つ以上の細胞毒素を含む免疫接合体は「免疫毒素」という。細胞毒素または細胞傷害剤は細胞に有害(例えば、殺滅)ないずれかの因子である。その例は、タキソン、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、t.コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピュロマイシン、およびその類似体もしくはホモログである。治療剤は、例えば、代謝拮抗剤(例:メトトレキセート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシル、デカルバジン)、剥離剤(例:メクロルエタミン、チオテパ(thiotepa)、クロルアンブシル(chlorambucil)、メルファラン(meiphalan)、カルムシチン(BSNU)とロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾシン(streptozotocin)、マイトマイシンC、およびシスジクロロジアミン白金(II)(DDP)、シスプラチン、アンスラサイクリン (例:ダウノルビシン (以前はダウノマイシン) およびドキソルビシン)、抗生物質(例:ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミスラマイシン、およびアンスラマイシン(AMC))、および抗有糸分裂剤(例:ビンクリスチンおよびビンブラスチン)である。
別の側面において、本発明は治療剤部分、例えば、細胞毒素、薬物(例:免疫抑制剤)または放射性毒素などに接合した高−hTSLP抗体またはそのフラグメントを特徴とする。かかる接合体は本明細書において「免疫接合体」という。1つ以上の細胞毒素を含む免疫接合体は「免疫毒素」という。細胞毒素または細胞傷害剤は細胞に有害(例えば、殺滅)ないずれかの因子である。その例は、タキソン、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、t.コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピュロマイシン、およびその類似体もしくはホモログである。治療剤は、例えば、代謝拮抗剤(例:メトトレキセート、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、シタラビン、5−フルオロウラシル、デカルバジン)、剥離剤(例:メクロルエタミン、チオテパ(thiotepa)、クロルアンブシル(chlorambucil)、メルファラン(meiphalan)、カルムシチン(BSNU)とロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾシン(streptozotocin)、マイトマイシンC、およびシスジクロロジアミン白金(II)(DDP)、シスプラチン、アンスラサイクリン (例:ダウノルビシン (以前はダウノマイシン) およびドキソルビシン)、抗生物質(例:ダクチノマイシン(以前はアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミスラマイシン、およびアンスラマイシン(AMC))、および抗有糸分裂剤(例:ビンクリスチンおよびビンブラスチン)である。
本発明の抗体に接合し得る治療用細胞毒素の他の例は、デュカルマイシン(duocarmycins)、カリケアミシン(calicheamicins)、メイタンシンおよびオーリスタチン、およびその誘導体である。カリケアミシン抗体接合体の例は、商品として入手し得る(マイロターグ (MylotargTm)(ワイエス−アイエルスト)。
細胞毒素は当該技術分野にて利用可能なリンカー技術を用いて、本発明抗体に接合し得る。
細胞毒素を抗体に接合するために使用されているリンカー型の例は、限定されるものではないが、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド−含有リンカーである。リンカーは、例えば、リソソーム区画内で低pHにより切断されやすいもの、または例えば、カテプシン(例;カテプシンB、C、D)などの腫瘍組織内で優先的に発現されるプロテアーゼなどのプロテアーゼにより切断されやすいものを選択することができる。
細胞毒素を抗体に接合するために使用されているリンカー型の例は、限定されるものではないが、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド−含有リンカーである。リンカーは、例えば、リソソーム区画内で低pHにより切断されやすいもの、または例えば、カテプシン(例;カテプシンB、C、D)などの腫瘍組織内で優先的に発現されるプロテアーゼなどのプロテアーゼにより切断されやすいものを選択することができる。
細胞毒素のタイプ、リンカーおよび治療剤を抗体に接合する方法のさらなる考察については、以下を参照されたい:Saito, G. et al., 2003 Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al., 2003 Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G., 2003 Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M., 2002 Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J., 2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J., 2001 Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264。
本発明の抗体はまた放射性同位体に接合し、放射性免疫接合体とも呼称される細胞傷害性放射性医薬を生成させることができる。診断薬としてまたは治療薬として使用するために抗体に接合し得る放射性同位体の例は、限定されるものではないが、ヨウ素l31、インジウム111、イットリウム90、およびルテチウム177などである。放射性免疫接合剤の調製方法は当該技術分野で確立されている。放射性免疫接合剤の例は、商品として入手可能であり、例えば、ゼバリン(Zevalin(商標))(DECファーマシューティカルズ) およびベクサール(Bexxar(商標))(コリクサ(Corixa)ファーマシューティカルズ)があり、類似の方法が本発明の抗体を用いて放射性免疫接合剤の調製に使用し得る。
本発明の抗体接合体は所定の生物学的応答を修飾するために使用でき、その薬物部分は古典的な化学的治療剤に限定されると解釈されるものではない。例えば、薬物部分は所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。かかるタンパク質は、例えば、酵素的に活性な毒素、またはそのフラグメント、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒素;タンパク質、例えば、腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン−γ;または生物学的応答修飾因子、例えば、リンホカイン、インターロイキン−1(“IL−1”)、インターロイキン−2(“IL−2”)、インターロイキン−6(“IL−6”)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(“GM−CSF”)、もしくはその他の増殖因子である。
かかる治療薬部分を抗体に接合させる技法は周知である;参照例:Amon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(モノクローナル抗体と癌治療における「癌治療薬物において免疫標的とするためのモノクローナル抗体」), Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et at., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery(制御薬物送達における「薬物送達用抗体」)(2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review(癌治療における細胞傷害剤のモノクローナル担体;概説)”, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy(癌治療における放射性標識抗体の治療使用の分析、結果、および将来)”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy(癌検出と治療のためのモノクローナル抗体において), Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates(抗体−毒素接合体の調製と細胞傷害の性質)”, Inmunol. Rev., 62:119-58 (1982)。
二重特異性分子
別の側面において、本発明は本発明の抗−hTSLP抗体またはそのフラグメントを含有してなる二重特異性分子を特徴とする。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、少なくとも2つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成する別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質(例:別の抗体または受容体用リガンド)に誘導化または連結し得る。本発明抗体は実際に1つを超える他の機能的分子に誘導化または連結して、2つを超える異なる結合部位および/または標的分子に結合する多重特異的分子を生成させることができる;かかる多重特異的分子はまた本明細書にて使用する場合の用語「二重特異性分子」に包含されるものとする。本発明の二重特異性分子を創出するためには、本発明の抗体を1つ以上の他の結合分子、例えば、二重特異性分子を生じるような別の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模擬体に機能的に(例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有会合その他により)連結することができる。
別の側面において、本発明は本発明の抗−hTSLP抗体またはそのフラグメントを含有してなる二重特異性分子を特徴とする。本発明の抗体またはその抗原結合部分は、少なくとも2つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成する別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質(例:別の抗体または受容体用リガンド)に誘導化または連結し得る。本発明抗体は実際に1つを超える他の機能的分子に誘導化または連結して、2つを超える異なる結合部位および/または標的分子に結合する多重特異的分子を生成させることができる;かかる多重特異的分子はまた本明細書にて使用する場合の用語「二重特異性分子」に包含されるものとする。本発明の二重特異性分子を創出するためには、本発明の抗体を1つ以上の他の結合分子、例えば、二重特異性分子を生じるような別の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模擬体に機能的に(例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有会合その他により)連結することができる。
従って、本発明はhTSLPに対して少なくとも1つの第一結合特異性および第二の標的エピトープに対する第二の結合特異性を含む二重特異性分子を包含する。例えば、第二の標的エピトープはFc受容体、例えば、ヒトFcγR1(CD64)またはヒトFcα受容体(CD89)である。従って、本発明は、FcγR、FcαRまたはFcεRを発現するエフェクター細胞(例えば、単球、マクロファージまたは多形核細胞(PMN)およびhTSLPを発現する標的細胞の両方に結合し得る二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子は、エフェクター細胞に対するhTSLP発現細胞を標的とし、Fc受容体介在エフェクター細胞活性、例えば、hTSLP発現細胞の食作用、抗体依存性細胞介在細胞毒性(ADCC)、サイトカイン放出、またはスーパーオキシドアニオンの生成などの引き金となる。
さらに、二重特異性分子が多重特異的である発明にとって、該分子はさらに抗−Fc結合特異性および抗−hTSLP結合特異性に加えて、第三の結合特異性を含み得る。例えば、第三の結合特異性は抗−増強因子(EF)部分、例えば、細胞傷害活性に関与する表面タンパク質に結合し、それによって標的細胞に対して免疫応答を増大させる分子でもあり得る。「抗−増強因子部分」は、抗体、機能的抗体フラグメント、または所定の分子、例えば、抗原もしくは受容体に結合して、それによってFc受容体もしくは標的細胞抗原に対する結合決定因子の作用を増強することとなる分子に結合するリガンドでもあり得よう。
「抗−増強因子部分」は、Fc受容体または標的細胞抗原に結合し得る。別法として、抗−増強因子部分は、第一および第二の結合特異性が結合する実体とは異なる実体に結合することができよう。例えば、抗−増強因子部分は細胞傷害性T細胞に結合し得る(例えば、CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD44、ICAM−1、または標的細胞に対する免疫応答を増大させるその他の免疫細胞による)。
一実施態様において、本発明の二重特異性分子は、結合特異性として少なくとも1つの抗体またはその抗体フラグメント、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、または一本鎖Fvなどを含んでなる。該抗体は軽鎖もしくは重鎖二量体であってもよいし、またはそのいずれかの最小フラグメント、例えば、Fvまたは米国特許(Ladner et al. US 4,946,778)(その内容を特に参照により本明細書に取り込む)に記載された一本鎖構築物であってもよい。
一実施態様において、Fcγ受容体に対する結合特異性は、モノクローナル抗体により提供され、その結合はヒト免疫グロブリンG(IgG)により遮断されない。本明細書にて使用される場合、用語「IgG受容体」とは、染色体1に位置する8つのγ−鎖遺伝子のいずれかをいう。これらの遺伝子は、3つのFγクラス:FcγRI(CD64)、FcγII(CD32)、およびFcγIII(CD16)に分類される12の膜貫通または可溶性受容体イソ型の全体をエンコードする。別の実施態様において、Fcγ受容体はヒト高親和性FcγRIである。ヒトFcγRIは72kDaの分子であり、単量体IgGに対して高い親和性(108−109M−1)を示す。
特定の抗−Fcγモノクローナル抗体の生産と特性化については、PCT公開公報(Fanger et at. WO 88/00052)および米国特許(US 4,954,617)(その教示をすべて参照により本明細書の一部とする)に記載されている。これらの抗体は受容体のFcγ結合部位とは識別される部位で、FcγRI、FcγIIまたはFcγIIIのエピトープに結合する;従って、それらの結合は生理学的レベルのIgGによっては実質的に遮断されることがない。本発明において有用な特異的抗−FcγRIは、mAb22、mAb32、mAb44、mAb62およびmAb197である。mAb32を産生するハイブリドーマは米国菌培養収集所(ATCC)から寄託番号HB9469として入手し得る。他の実施態様において、抗−Fcγ受容体抗体は、モノクローナル抗体22のヒト化形状(H22)のものである。H22抗体の生産と特性化については、文献(Graziano, R.F. et al., 1995 J. Immunol 155 (10): 4996-5002)およびPCT公開公報(WO 94/10332)に記載されている。1122抗体産生細胞株は、米国菌培養収集所にHA022Cl1の名称で寄託されており、寄託番号CRL11177を有する。
なおさらなる実施態様において、Fc受容体に対する結合特異性は、ヒトIgA受容体、例えば、Fc−アルファ受容体(FcαRI(CD89))に結合する抗体によって提供されるが、この結合はヒト免疫グロブリンA(IgA)によって遮断されてはならない。用語「IgA受容体」とは染色体19上に位置する1遺伝子(FcαRI)の遺伝子産物を含むものとする。この遺伝子は55ないし110kDaの数種の別途にスプライスされた膜貫通イソ型をエンコードすることが知られている。FcαRI(CD89)は単核/マクロファージ、好酸球および好中球顆粒球上に構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団上には発現されない。FcαRIはIgA1およびIgA2両方に対して中程度の親和性(5×107M−1)を示すが、G−CSFまたはGM−CSFなどのサイトカインに接触するとその親和性が上昇する(Morton, H.C. et al., 1996 Critical Reviews in Immunology 116:423-440)。A3、A59、A62およびA77として同定された4種のFcαRI−特異的モノクローナル抗体(これらはIgAリガンド結合ドメインの外でFcαRIに結合する)については、文献(Monteiro, R.C. et al., 1992 J. Immunol. 148:1764)に記載されている。
FcαRIおよびFcγRIは本発明の二重特異性分子に使用するトリガー受容体であるが、その理由はそれらが免疫エフェクター細胞、例えば、単球、PMN、マクロファージおよび樹状細胞上に主として発現され、また高レベル(例えば、5,000〜100,000個/細胞)で発現され、細胞傷害活性のメディエーター(例えば、ADCC、食作用)であり、さらにそれらを標的とする自己抗原を含む抗原の抗原提示の増強を仲介するからである。
本発明の二重特異性分子に使用し得る他の抗体は、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
本発明の二重特異性分子に使用し得る他の抗体は、マウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
本発明の二重特異性分子は、成分結合特異性、例えば、抗−FcRおよび抗−hTSLP結合特性を、当該技術分野にて既知の方法により、接合させることで調製することができる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は、別個に生成させ、次いで、互いに接合させることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドにある場合、架橋剤の種々のカップリングが共有接合に使用することができる。架橋剤の例は、プロテインA、カルボジイミド、N−コハク酸イミジル−S−アセチル−チオアセテート(SATA)、5,5’−ジチオビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNB)、o−フェニレンジマレイン酸イミド(oPDM)、N−コハク酸イミジル−3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、およびスルホコハク酸イミジル・4−(N−マレイミドメチル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート(スルホ−SMCC)である(参照例:Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648)。その他の方法は以下に記載のものである:Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83、および Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375。接合剤はSATAおよびスルホ−SMCCであり、共にピアース・ケミカル(株)(ロックフォード;イリノイ)から入手し得る。
結合特異性が抗体である場合、それらは2つの抗体鎖のC−末端ヒンジ領域のスルフィドリル結合により接合し得る。特定の実施態様において、ヒンジ領域は、接合の前に、奇数のスルフヒドリル残基、例えば、1個の基を含むように修飾する。
別法として、両方の結合特異性は同じベクターにエンコードさせ、同じ宿主細胞中で発現、構築することが可能である。この方法は二重特異性分子がmAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)2またはリガンド×Fabの融合タンパク質である場合に、取分け有用である。本発明の二重特異性分子は、一本鎖抗体と結合決定因子からなる一本鎖分子、または2つの結合決定因子からなる一本鎖二重特異性分子であることができる。二重特異性分子は少なくとも2つの一本鎖を含有し得る。二重特異性分子の調製法は、例えば、米国特許 US 5,260,203; US 5,455,030; US 4,881,175; US 5,132,405; US 5,091,513; US 5,476,786; US 5,013,653; US 5,258,498; および US 5,482,858 に記載されている。
それらの特異的標的に対する二重特異性分子の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(REA)、FACS分析、生物検定(例えば、増殖阻害)、またはウエスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらのアッセイ法では、一般に、当該複合体に特異的な標識試薬(例えば、抗体)を用いて、特定の当該タンパク質−抗体複合体の存在を検出する。例えば、FcR−抗体複合体は、例えば、抗体−FcR複合体を認識し、特異的に結合する酵素結合抗体または抗体フラグメントを用いて検出することができる。別法として、該複合体は他のイムノアッセイ法により検出することができる。例えば、該抗体は放射性に標識し、ラジオイムノアッセイ(RIA)に使用し得る(参照例:Weintraub; B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986;参照により本明細書の一部とする)。放射性同位体は、γ−カウンターまたはシンチレーションカウンターを使用する手段などにより、またはオートラジオグラフィーにより検出し得る。
非免疫グロブリン骨格
広範多様な抗体/免疫グロブリンフレームワークまたは骨格は、得られるポリペプチドが標的タンパク質に特異的な少なくとも1つの結合領域を含む限り、採用し得る。かかるフレームワークまたは骨格は、5種の主要イディオタイプのヒト免疫グロブリンまたはそのフラグメント(本明細書の別の個所に開示したものなど)を含み、他の動物種、好ましくはヒト化側面をもつ動物種の免疫グロブリンである。カメリドに同定されたものなどの一本鎖重鎖抗体は、この点で特に興味深い。新規のフレームワーク、骨格およびフラグメントは継続して当業者が発見し、開発している。
広範多様な抗体/免疫グロブリンフレームワークまたは骨格は、得られるポリペプチドが標的タンパク質に特異的な少なくとも1つの結合領域を含む限り、採用し得る。かかるフレームワークまたは骨格は、5種の主要イディオタイプのヒト免疫グロブリンまたはそのフラグメント(本明細書の別の個所に開示したものなど)を含み、他の動物種、好ましくはヒト化側面をもつ動物種の免疫グロブリンである。カメリドに同定されたものなどの一本鎖重鎖抗体は、この点で特に興味深い。新規のフレームワーク、骨格およびフラグメントは継続して当業者が発見し、開発している。
一側面において、本発明は本発明のCDRが接続可能な非免疫グロブリン骨格を用いて、非免疫グロブリンに基づく抗体を生成させることに関する。既知の、または将来の非免疫グロブリンフレームワークおよび骨格は、それらが標的タンパク質に特異的な結合領域を含む限り、採用し得る。かかる化合物は本明細書において、「標的特異的結合領域を含んでなるポリペプチド」として既知である。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたは骨格は、限定されるものではないが、アドネクチン(フィブロネクチン)(コンパウンド・セラピュティック・インク;ウオールサム、マサチューセッツ)、アンキリン(モレキュラー・パートナー(株);チューリッヒ、スイス)、ドメイン抗体(ドマンティス(株);ケンブリッジ、マサチューセッツ)およびアブリンクスnv(ズイジナード(Zwijnaarde)、ベルギー)、リポカリン(アンチカリン)(ピエリス・プロテオラボ(株);フライジング、ドイツ)、小モジュラー免疫医薬(ツルビオン (Trubion)ファーマシューティカル・インク;シアトル、ワシントン州)、マキシーボデイズ(アビディア・インク (Avidia, Inc.)(マウンテンビュー;CA))、プロテインA(アフィボディ (Affibody AG)、スウェーデン) およびアフィリン(affilin)(ガンマ−結晶性またはユビキチン)(シル・プロテインズ (Scil Proteins GmbH)、ハーレ、ドイツ)である。
(i)アドネクチン類−化合物治療剤
アドネクチン骨格はフィブロネクチンタイプIIIドメインに基づいている(例えば、フィブロネクチンタイプIIIの第10モジュール(10Fn3ドメイン))。フィブロネクチンタイプIIIドメインは2つのベータシート間に分布する7つまたは8つのベータ鎖を有し、該シートはそれ自体で互いに詰まりあってタンパク質のコアを形成し、さらに互いにベータ鎖につながって、溶媒接触するロープ(CDRに類似)を含む。ベータシートサンドイッチの各エッジには少なくとも3つのかかるループが存在し、該エッジはベータ鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である (US 6,818,418)。
アドネクチン骨格はフィブロネクチンタイプIIIドメインに基づいている(例えば、フィブロネクチンタイプIIIの第10モジュール(10Fn3ドメイン))。フィブロネクチンタイプIIIドメインは2つのベータシート間に分布する7つまたは8つのベータ鎖を有し、該シートはそれ自体で互いに詰まりあってタンパク質のコアを形成し、さらに互いにベータ鎖につながって、溶媒接触するロープ(CDRに類似)を含む。ベータシートサンドイッチの各エッジには少なくとも3つのかかるループが存在し、該エッジはベータ鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である (US 6,818,418)。
これらのフィブロネクチンに基づく骨格は免疫グロブリンではないが、全体の折りたたみは、最小の機能的抗体フラグメントである重鎖の可変領域(ラクダとラマのIgGにおいて全抗原認識単位を構成する)の折りたたみと密接に関係している。この構造のために、この非免疫グロブリン抗体は、性質と親和性が抗体に類似する抗原結合性を真似たものである。これらの骨格は、インビボでの抗体の親和性成熟の過程に類似するインビトロでのループランダム化とシャッフリング方法において使用することができる。これらのフィブロネクチンに基づく分子は、該分子のループ領域が標準的クローニング法により、本発明のCDRと置き換えうる場合の骨格として使用し得る。
(ii)アンキリン−分子パートナー
本方法は異なる標的に結合させるために使用し得る可変領域を担うための骨格として、アンキリン由来反復モジュールをもつタンパク質を用いることに基づく。アンキリン反復モジュールは、2つの逆平行α−へリックスとβ−ターンから構成される33個のアミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合はリボソームディスプレイを用いることにより大部分最適化される。
本方法は異なる標的に結合させるために使用し得る可変領域を担うための骨格として、アンキリン由来反復モジュールをもつタンパク質を用いることに基づく。アンキリン反復モジュールは、2つの逆平行α−へリックスとβ−ターンから構成される33個のアミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合はリボソームディスプレイを用いることにより大部分最適化される。
(iii)マキシボデイ/アビマー−アビディア
アビマーはLRP−1などのタンパク質を含有する天然のA−ドメインに由来する。これらのドメインはタンパク質−タンパク質相互作用の性質により使用され、ヒトにおいては250以上のタンパク質が構造的にA−ドメインに基づいている。アビマーはアミノ酸リンカーを介して連結する多数の異なる「A−ドメイン」モノマー(2−10)から構成される。アビマーは例えば、以下に記載された方法論に従い、標的抗原に結合し得るように創出することができる:20040175756; 20050053973; 20050048512; および 20060008844。
アビマーはLRP−1などのタンパク質を含有する天然のA−ドメインに由来する。これらのドメインはタンパク質−タンパク質相互作用の性質により使用され、ヒトにおいては250以上のタンパク質が構造的にA−ドメインに基づいている。アビマーはアミノ酸リンカーを介して連結する多数の異なる「A−ドメイン」モノマー(2−10)から構成される。アビマーは例えば、以下に記載された方法論に従い、標的抗原に結合し得るように創出することができる:20040175756; 20050053973; 20050048512; および 20060008844。
(vi)プロテインA−アフィボディ
アフィボディ(Affibody;登録商標)親和性リガンドは、プロテインAのIgG−結合ドメインの1つの骨格に基づく3つのへリックス束から構成される小型の単純なタンパク質である。プロテインAは細菌の黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)からの表面タンパク質である。骨格ドメインは58個のアミノ酸からなり、その13個はランダム化されて、膨大な数のリガンド変異体を含むアフィボディ(Affibody;登録商標)ライブラリーを生成する(参照例:US 5,831,012)。アフィボディ(Affibody;登録商標)分子は抗体を模倣したものであり、150kDaである抗体の分子量に比べて、それらは6kDaの分子量を有する。その小さなサイズにもかかわらず、アフィボディ(Affibody;登録商標)分子の結合部位は抗体に類似している。
アフィボディ(Affibody;登録商標)親和性リガンドは、プロテインAのIgG−結合ドメインの1つの骨格に基づく3つのへリックス束から構成される小型の単純なタンパク質である。プロテインAは細菌の黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)からの表面タンパク質である。骨格ドメインは58個のアミノ酸からなり、その13個はランダム化されて、膨大な数のリガンド変異体を含むアフィボディ(Affibody;登録商標)ライブラリーを生成する(参照例:US 5,831,012)。アフィボディ(Affibody;登録商標)分子は抗体を模倣したものであり、150kDaである抗体の分子量に比べて、それらは6kDaの分子量を有する。その小さなサイズにもかかわらず、アフィボディ(Affibody;登録商標)分子の結合部位は抗体に類似している。
(v)アンチカリン−ピエリス
アンチカリン(Anticalins;登録商標)はピエリス・プロテオラボ(株)(Pieris ProteoLab AG)という会社の製品である。それらはリポカリンから誘導されるが、リポカリンは化学的に不安定なまたは不溶性化合物の生理学的輸送または貯蔵に通常関与する小さく、かつ丈夫なタンパク質の一群である。数種の天然のリポカリンはヒトの組織または体液に存在する。
アンチカリン(Anticalins;登録商標)はピエリス・プロテオラボ(株)(Pieris ProteoLab AG)という会社の製品である。それらはリポカリンから誘導されるが、リポカリンは化学的に不安定なまたは不溶性化合物の生理学的輸送または貯蔵に通常関与する小さく、かつ丈夫なタンパク質の一群である。数種の天然のリポカリンはヒトの組織または体液に存在する。
タンパク質構築物は柔軟性のないフレームワークの先端に超可変ループをもつ免疫グロブリンの遺構である。しかし、抗体またはそれらの組換えフラグメントと対照的に、リポカインは160ないし180個のアミノ酸残基をもつ1本のポリペプチド鎖から構成されており、1本の免疫グロブリンドメインよりも僅かに大きいだけである。
結合ポケットを造り上げている4つのループのセットは、顕著な構造的柔軟性を示し、多様な側鎖を許容する。従って、結合部位は、高親和性と特異性をもつ異なる形状の定められた標的分子を認識するために、固有のプロセスで新形態をとることができる。
リポカリンファミリーの1つのタンパク質、ピエリス・ブラシセ(Pieris Brassicae)のビリン−結合タンパク質(BBP)は、4つのループのセットを変異誘発することによりアンチカリンを開発するために使用されている。「アンチカリン」について記載する特許出願の一例は、PCT出願 WO 199916873 である。
(vi)アフィリン−シル(Scil)タンパク質
アフィリン(Affilin(商標))分子は、タンパク質と小型分子に向けた特異的親和性のために設計された小型の非免疫グロブリンタンパク質である。新規のアフィリン(Affilin(商標))分子は、2つのライブラリーから非常に迅速に選択できるが、そのライブラリーそれぞれは、異なるヒト由来の骨格タンパク質に基づくものである。
アフィリン(Affilin(商標))分子は、タンパク質と小型分子に向けた特異的親和性のために設計された小型の非免疫グロブリンタンパク質である。新規のアフィリン(Affilin(商標))分子は、2つのライブラリーから非常に迅速に選択できるが、そのライブラリーそれぞれは、異なるヒト由来の骨格タンパク質に基づくものである。
アフィリン(Affilin(商標))分子は、免疫グロブリンタンパク質と何らの構造的相同性を示さない。シル・タンパク質は2つのアフィリン(Affilin(商標))骨格を使用するが、その一つはガンマ結晶性のヒト構造的眼レンズタンパク質であり、他方は「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。両方のヒト骨格は非常に小さく、高温での安定性を示し、pH変化と変性剤に殆どが抵抗性である。この高い安定性は主として該タンパク質の伸展したベータシート構造によるものである。ガンマ結晶性誘導化タンパク質の例はWO200104144 に記載されており、また「ユビキチン様」タンパク質の例は WO2004106368 に記載されている。
医薬組成物
別の側面において、本発明は本発明のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合タンパク質の一つまたは組合せを含有し、医薬的に許容される担体と共に製剤化された組成物、例えば、医薬組成物を提供する。かかる組成物は抗体の一つまたは組合せ(例えば、2つ以上の異なる抗体)、または本発明の免疫接合体もしくは二重特異性分子を含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補性活性を有する抗体(または免疫接合体もしくは二重特異性体)の組合せを含み得る。
別の側面において、本発明は本発明のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合タンパク質の一つまたは組合せを含有し、医薬的に許容される担体と共に製剤化された組成物、例えば、医薬組成物を提供する。かかる組成物は抗体の一つまたは組合せ(例えば、2つ以上の異なる抗体)、または本発明の免疫接合体もしくは二重特異性分子を含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するか、または相補性活性を有する抗体(または免疫接合体もしくは二重特異性体)の組合せを含み得る。
本発明の医薬組成物は併用療法、例えば、他の薬剤との組合せによっても投与し得る。例えば、併用療法は少なくとも1種の他の抗炎症剤と組合せた本発明の抗−hTSLP抗体を含み得る。併用療法に使用し得る治療剤の例については、下記の本発明抗体の使用に関するセクションで詳細に説明する。
本明細書にて使用する場合、「医薬的に許容される担体」は、生理学的に両立し得るいずれもの、またすべての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。該担体は静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与(例えば、注射または注入による)に適したものとすべきである。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、免疫接合体、または二重特異性分子は、該化合物を活性化し得る酸の作用および他の自然条件から化合物を保護する物質で被覆してもよい。
本発明の医薬化合物は1つ以上の医薬的に許容される塩を含み得る。「医薬的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物活性を保持し、不所望の毒性学的作用を示さない塩をいう(参照例:Berge, S.M., et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19)。かかる塩の例は酸付加塩および塩基付加塩である。酸付加塩は非毒性無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などから誘導される塩、並びに非毒性有機酸、例えば、脂肪族モノ−およびジ−カルボン酸、フェニル−置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などから誘導される塩である。塩基付加塩はアルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどから誘導される塩、並びに非毒性有機アミン、例えば、N,N’−ジベンジルエチレンジアミン、N−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから誘導される塩である。
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される抗酸化剤も含み得る。医薬的に許容される抗酸化剤の例は、水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど;油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど;および金属キレート化剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などである。
本発明の医薬組成物に採用し得る適切な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、および適切なその混合物;植物油、例えば、オリーブ油;および注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルなどである。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング物質の使用により、分散剤の場合には要求される粒子径の維持により、また界面活性剤の使用により、維持することができる。
これらの組成物はまた佐剤、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などをも含有し得る。微生物の存在の予防は、上記の滅菌手法により、および種々の抗菌抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールアスコルビン酸などの包接により確実なものとし得る。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物に含有させることも望ましい。さらに、注射用医薬形態の長期吸収は、吸収を遅延させる試剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの包接により惹起し得る。
医薬的に許容される担体は、無菌の水溶液または分散液および無菌注射溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末剤である。医薬的に活性な物質のかかる媒体および試剤の使用は、当該技術分野で既知である。常套の媒体または試剤が、該活性物質と両立し得ない範囲である場合を除いて、本発明医薬組成物でのそれらの使用は予期されるものである。補助的活性化合物もまたこの組成物に包含させ得る。
治療用組成物は、一般的に、製造および貯蔵の条件下で、無菌かつ安定でなければならない。該組成物は溶液、ミクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適する他の規則正しい構造物として製剤化し得る。その担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど)およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合には要求される粒子径の維持により、また界面活性剤の使用により、維持することができる。多くの事例において、組成物には等張化剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを含有させることができる。注射用組成物の長期吸収は、該組成物中に、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンなどの吸収を遅延させる試剤を含有させることにより惹起させ得る。
無菌の注射溶液は、必要量の活性化合物を適当な溶媒中に、上記に列挙した成分の1つと共に、または組合せて取り込ませ、要すれば、次いで無菌精密濾過することにより調製し得る。一般に、分散液は、基礎分散媒体と上記に列挙した成分からの必要とされる他の成分を含む無菌媒体に活性化合物を取り込ませることにより調製する。無菌注射溶液調製のための無菌粉末の場合、その調製法は、有効成分プラス追加の所望の成分の粉末を、先に無菌濾過したその溶液から生成させる真空乾燥および凍結乾燥(凍乾)である。
単一の投与形態を製造するための担体物質と組合せ得る有効成分の量は、処置すべき対象と特定の投与様式によって変るであろう。単一の投与形態を製造するための担体物質と組合せ得る有効成分の量は、一般に、治療作用を生じる組成物のその量であろう。一般に、100パーセントから、この量は約0.01パーセントないし約99パーセントの有効成分の範囲であり、約0.1パーセントないし約70パーセントまたは約1パーセントないし約30パーセントの有効成分と医薬的に許容される担体との組合せである。
投与処方計画は最適な所望の応答(例えば、治療的応答)を提供するように調整する。例えば、単一のボーラスが投与可能であり、数回に分割した用量を長期にわたり投与可能であって、治療状況の緊急性に比例して用量を増減し得る。投与のし易さと投与量の画一性のためには、非経口組成物に製剤化することが、取分け有利である。本明細書にて用いる場合、投与量単位の形状とは、処置すべき対象にって単位投与量として適切な物理的に別個の単位をいう;各単位は必要とされる医薬担体と関連して、所望の治療効果を生じるために計算された所定の量の活性化合物を含む。本発明の投与量単位形態についての明細は、活性化合物のユニークな特性と達成される特定の治療効果、および個々人の感受性の処置のためにかかる活性化合物を混合することの技術上の本来備わっている限界により、またそれに直接依存して決定付けられる。
抗体の投与のためには、その投与量は宿主の体重あたり、約0.0001ないし100mg/kg、そしてより一般的には0.01ないし5mg/kgの範囲である。例えば、投与量は、0.3mg/kg体重、5mg/kg体重または10mg/kg体重または1〜10mg/kgの範囲内であり得る。例示としての処置投与計画は、1週1回、2週ごとに1回、3週ごとに1回、4週ごとに1回、1月に1回、3月ごとに1回または3〜6ヶ月ごとに1回、投与することを必然的に伴う。本発明の抗−hTSLPについての投与計画は、静脈内投与により、1mg/kg体重または3mg/kg体重であり、投与される抗体は以下の投与スケジュールの一つを用いる:6回の投与につい4週ごと、次いで3ヶ月ごと;3週ごと;3mg/kg体重を1回、1mg/kg体重を3週ごと。
一部の方法においては、異なる結合特異性をもつ2種以上のモノクローナル抗体を同時に投与する;この場合、投与される各抗体の投与量は示された範囲内に入る。抗体は通常複数回投与される。1回ごとの投与の間隔は、例えば、週、月、3ヶ月ごと、または毎年である。間隔は、患者の標的抗原に対する血中抗体レベルを測定することにより示される場合、不規則でもあり得る。一部の方法において、投与量は血漿抗体濃度を約1〜1000μg/mlとするように調整し、一部の方法では約25〜300μg/mlとする。
別法として、抗体は持続性放出製剤として投与可能であり、その場合、必要とされる投与回数は少なくなる。投与量と投与回数は患者における抗体の半減期に依存して変わる。一般に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、それに次いで、ヒト化抗体、キメラ抗体、そして非ヒト抗体と続く。投与の用量と回数はその処置が予防的であるか、治療的あるかによても変り得る。予防適用においては、比較的低投与量を長期間にわたり、比較的低頻度間隔で投与する。一部の患者はその人生の残りにわたって処置を受け続ける。治療適用においては、比較的高い用量を比較的短い間隔で、疾患の進行が減速するか、もしくは停止するまで、または患者が疾患の症候の部分的もしくは完全な寛解を示すまで、時々必要とされる。その後、患者には予防的投与計画で投与することができる。
本発明医薬組成物中の有効成分の実際の投与レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式について、患者に対し毒性を生じさせずに、所望の治療応答を達成する有効成分の有効量を得るように変化させ得る。選択される投与量レベルは、様々な薬物動態学因子、例えば、採用される本発明の特定組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、採用される特定化合物の排泄速度、処置の期間、採用される特定組成物と組合せて使用される他の薬物、化合物および/または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、症状、全身の健康およびこれまでの医療歴、および医療技術における周知の同様の因子に左右されるであろう。
本発明の抗−hTSLP抗体の「治療的有効投与量」は、疾患症候の重篤度の低下、疾患無症候期間の頻度と持続時間の増大、または疾患の苦痛による機能的障害もしくは能力的障害の予防につながり得る。
本発明の組成物は、当該技術分野において既知の様々な方法の1つ以上を用いて、1つ以上の投与経路により投与することができる。当業者も認めるように、投与経路および/またはその様式は、所望の結果により変わるであろう。本発明の抗体についての投与経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄またはその他の非経口投与経路であり、例えば、注射または注入による。本明細書にて使用する場合、「非経口投与」という成句は、腸管内および局所投与以外の投与様式を意味し、通常注射によるものであり、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、胸腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管経由、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入である。
別法として、本発明の抗体は非腸管外経路、例えば、局所、表皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸、舌下または局所に投与し得る。
該活性化合物は、急速な放出に対して化合物を保護する担体と共に、例えば、インプラント、皮膚透過性パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムなどの制御放出製剤として調製し得る。生分解性生体適合性ポリマー、例えば、酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などを使用することができる。かかる製剤の多くの製造法は、特許されているか、または一般的に当業者に知られている。参照例:Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(持続性制御放出薬物送達システム), J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
該活性化合物は、急速な放出に対して化合物を保護する担体と共に、例えば、インプラント、皮膚透過性パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムなどの制御放出製剤として調製し得る。生分解性生体適合性ポリマー、例えば、酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などを使用することができる。かかる製剤の多くの製造法は、特許されているか、または一般的に当業者に知られている。参照例:Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(持続性制御放出薬物送達システム), J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
治療用組成物は当該技術分野で既知の医療用具により投与することができる。例えば、一実施態様において、本発明の治療用組成物は、無針皮下注射器具、例えば、以下の米国特許に記載の器具により投与し得る:US 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 または 4,596,556。本発明にて有用な周知のインプラントとモジュールの例は以下のものである:米国特許 US 4,487,603 は医薬品を制御速度で分配する埋め込み可能なマイクロ注入ポンプを開示している;米国特許 US 4,486,194 は皮膚経由で医薬を投与する治療器具を開示している;米国特許 US 4,447,233 は正確な注入速度で医薬品を送達する医薬品注入ポンプを開示している;米国特許 US 4,447,224 は連続的な薬物送達のための埋め込み可能な可変流注入装置を開示している;米国特許 US 4,439,196 は多チャンバー区画をもつ浸透圧薬物送達システムを開示している;また米国特許 US 4,475,196 は浸透圧薬物送達システムを開示している。これらの特許は参照により本明細書の一部とする。多くの他のかかるインプラント、送達システム、およびモジュールが当業者既知である。
特定の実施態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、インビボでの適切な分布を確実なものとするために製剤化し得る。例えば、血液−脳関門(BBB)は多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療用化合物が(要すれば)BBBを横断することを確実にするために、これらを、例えば、リポソームに製剤化することができる。リポソームの製造法についての参照例:米国特許 US 4,522,811; 5,374,548; および 5,399,331。該リポソームは特異的細胞または臓器に選択的に輸送する1つ以上の部分を有し、その結果、標的薬物の送達を増強し得る(参照例:V.V. Ranade, 1989 J. Cline Pharmacol. 29:685)。例示となる標的部分は、葉酸エステルまたはビオチン(参照例:米国特許 US 5,416,016;Low et al.); マンノシド (Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 抗体 (P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180); 界面活性剤プロテインA受容体 (Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233:134); p120 (Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090); 以下も参照:K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Imrnunomethods 4:273。
本発明の用途と方法
本発明の抗体(および免疫接合体および二重特異性分子)は、インビトロおよびインビボでの診断用途および治療用途を有する。例えば、これらの分子は様々な障害の処置、予防または診断のために、培養細胞に、例えば、インビトロまたはインビボで、または被検対象に、例えば、インビボにおいて投与し得る。本明細書にて使用する場合、「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むものとする。非ヒト動物はすべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両性類、および爬虫類である。本方法は異常なhTSLPの発現と関連する障害をもつヒト患者の処置に特に適している。hTSLPに対する抗体を別の薬剤と共に投与する場合、その2つのものは順番にまたは同時に投与し得る。
本発明の抗体(および免疫接合体および二重特異性分子)は、インビトロおよびインビボでの診断用途および治療用途を有する。例えば、これらの分子は様々な障害の処置、予防または診断のために、培養細胞に、例えば、インビトロまたはインビボで、または被検対象に、例えば、インビボにおいて投与し得る。本明細書にて使用する場合、「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むものとする。非ヒト動物はすべての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両性類、および爬虫類である。本方法は異常なhTSLPの発現と関連する障害をもつヒト患者の処置に特に適している。hTSLPに対する抗体を別の薬剤と共に投与する場合、その2つのものは順番にまたは同時に投与し得る。
一実施態様において、本発明の抗体(および免疫接合体および二重特異性分子)は、hTSLPのレベル、またはhTSLPを含有する細胞のレベルを検出するために使用することができる。この検出はサンプル(インビトロのサンプルなど)および対照サンプルを抗−hTSLP抗体と、該抗体とhTSLPとの間に複合体を形成させ得る条件下で接触させることにより達成し得る。該抗体とhTSLPとの間に形成される複合体を検出して、サンプルと対照とを比較する。例えば、当該技術分野で周知の標準的検出法、例えば、ELISAおよびフローサイトメトリーアッセイなどを、本発明の組成物を用いて実施し得る。
従って、一側面において、本発明はさらにサンプル中のhTSLP(例えば、hTSLP抗原)の存在を検出する方法、またはhTSLPの量を測定する方法であって、該サンプル、そして対照サンプルを、本発明の抗体またはその抗原結合部分(該抗体またはその部分とhTSLPとの間に複合体の形成を可能とする条件下に、特異的にhTSLPと結合する)と接触させることからなる方法を提供する。次いで、複合体の形成を検出する;その場合、サンプル間の複合体形成における差異を対照サンプルと比較して、サンプル中のhTSLPの存在を示す。
また、本発明の範囲内には本発明の組成物(例えば、抗体、ヒト抗体、免疫接合体および二重特異性分子)および使用説明書からなるキットがある。該キットはさらに少なくとも1種のさらなる試薬、または1種以上のさらなる本発明の抗体(例えば、第一の抗体と識別し得る標的抗原上のエピトープに結合する相補性活性を有する抗体)を含み得る。キットは、典型的には、キットの内容の企図する用途を示すレーベルを含む。レーベルという用語は、キットに関して、またはキットと共に供給される文書または記録資料を含み、またはさもなければキットに添付する。
これまでに本発明を十分に説明してきたが、以下の実施例および請求項によりさらに説明する;これらは説明するものであって、さらに限定することを意味するものではない。当業者は極々常套の実験を用いて、本明細書に記載されている具体的な手技に多くが同等のものであることを認識し、確認し得るであろう。かかる同等性は本発明の範囲と請求項内のものである。本出願全般にわたり引用されている発行特許および公開特許出願などのすべの参照文献の内容は、参照により本発明の一部とする。
以下の実施例は、一次ヒト細胞アッセイを含む異なる細胞に基づくアッセイにおいて、ヒトTSLPに特異的に結合し、その生物活性を中和するモノクローナル抗体、取分け、ヒトモノクローナル抗−ヒトTSLP抗体について記載する。開発された抗体は低pM範囲において非常に高い親和性を示した。
ヒトTSLPタンパク質に対する治療用抗体を生成させるために、モルホシス・ヒュカル・ゴールド(MorphoSys HuCAL GOLD;登録商標)ファージディスプレイライブラリーによる選択を実施した。ヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)は、ヒュカル(HuCAL;登録商標)の概念6〜8 9に基づくFabライブラリーであり、そこでは6個すべてのCDRが多様化されており、Fabフラグメントをファージ表面に結合するために、シスディスプレイ(CysDisplay;商標)技法を使用している10。
実施例1:ヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)ライブラリーからのヒトTSLP−特異抗体の生成
ファージミドレスキュー、ファージ増幅、および精製
ヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)ライブラリーは、34μg/mlのクロラムフェニコールと1%グルコースを含有する2×YT培地(2×YT−CG)中で増幅した。0.5のOD600でVCSM13ヘルパーファージを感染(振盪せずに37℃で30分;250rpmで37℃、30分間振盪)させた後、細胞を遠心沈降させ(4120g;5分;4℃)、2×YT/34μg/mlクロラムフェニコール/50μg/mlカナマイシン/0.25mM−IPTG中に再懸濁し、22℃で一夜増殖した。ファージを上清から2回、PEG沈殿させ、PBS/20%グリセロールに再懸濁して、−80℃で保存した。
ファージミドレスキュー、ファージ増幅、および精製
ヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)ライブラリーは、34μg/mlのクロラムフェニコールと1%グルコースを含有する2×YT培地(2×YT−CG)中で増幅した。0.5のOD600でVCSM13ヘルパーファージを感染(振盪せずに37℃で30分;250rpmで37℃、30分間振盪)させた後、細胞を遠心沈降させ(4120g;5分;4℃)、2×YT/34μg/mlクロラムフェニコール/50μg/mlカナマイシン/0.25mM−IPTG中に再懸濁し、22℃で一夜増殖した。ファージを上清から2回、PEG沈殿させ、PBS/20%グリセロールに再懸濁して、−80℃で保存した。
2回のパンニング間のファージ増幅は以下のように実施した:中期対数期の大腸菌TG1細胞に溶出したファージを感染させ、1%のグルコースおよび34μg/mlのクロラムフェニコールを補足したLB−寒天上に塗布した(LB−CGプレート)。30℃で一夜インキュベートした後、TG1コロニーを寒天プレートから剥ぎ取り、OD600が0.5に達するまで、2×YT−CGに接種するために使用し、上記のように、VCSM13ヘルパーファージを感染のために加えた。
ヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)によるパンニング
ヒトTSLPを認識する抗体の選択のために、2つの異なるパンニング戦法を適用した。要約すると、ヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)ファージ抗体をVHマスター遺伝子の異なる組合せからなる4つのプールに分割した(プール1:VH1/5λκ;プール2:VH3λκ;プール3:VH2/4/6λκ;プール4:VH1−6λκ)。これらのプールは個々にマキシソープ(Maxisorp)プレートに直接被覆したヒトTSLP上の3回の固相パンニングに付し、さらにビオチニル化TSLP上で3回の溶液パンニングに付した。
ヒトTSLPを認識する抗体の選択のために、2つの異なるパンニング戦法を適用した。要約すると、ヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)ファージ抗体をVHマスター遺伝子の異なる組合せからなる4つのプールに分割した(プール1:VH1/5λκ;プール2:VH3λκ;プール3:VH2/4/6λκ;プール4:VH1−6λκ)。これらのプールは個々にマキシソープ(Maxisorp)プレートに直接被覆したヒトTSLP上の3回の固相パンニングに付し、さらにビオチニル化TSLP上で3回の溶液パンニングに付した。
第一のパンニング変異体はヒトTSLPに対し固相パンニングであった:
マキシソープ(Maxisorp)プレート(F96ヌンク−イムノプレート)上の2個のウエルをそれぞれ5μg/mlの300μlにより4℃で一夜被覆した。被覆したウエルをPBS350μlで2回洗い、マイクロタイタープレートシェーカー上、室温で2時間、350μlの5%MPBSでブロックした。各パンニングについて、約1013のヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)ファージ抗体を等容量のPBST/5%MPにより、室温で2時間ブロックした。ブロック後、被覆したウエルをPBS350μlで2回洗浄した。予めブロックしたヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)ファージ抗体300μlを各被覆ウエルに加え、シェーカー上、室温で2時間インキュベートした。洗浄は350μlのPBS/0.05%トゥイーンを5回加え、次いでPBSでさらに4回洗うことにより実施する。プレートからのファージの溶出は、ウエルあたり300μlの20mM−DTT/10mMトリス/HClにより、10分間実施した。DTTファージ溶出液を14mlの大腸菌TG1に加え、2YT培地中37℃で、0.6〜0.8のOD600まで増殖させ、50mlプラスティックチューブ中で、37℃で45分間、振盪することなく、ファージ感染のためにインキュベートした。5000rpmで10分間遠心分離した後、細菌ペレットをそれぞれ500μlの2×YT培地中に再懸濁し、2×YT−CG寒天プレート上に塗布し、30℃で一夜インキュベートした。次いで、コロニーをプレートからかき取り、ファージを回収し、上記のように増幅した。直接被覆したTSLP上の第二回および第三回の固相パンニングは第一回のプロトコールに従って実施したが、ただし、洗浄操作の緊縮性は増大した。
マキシソープ(Maxisorp)プレート(F96ヌンク−イムノプレート)上の2個のウエルをそれぞれ5μg/mlの300μlにより4℃で一夜被覆した。被覆したウエルをPBS350μlで2回洗い、マイクロタイタープレートシェーカー上、室温で2時間、350μlの5%MPBSでブロックした。各パンニングについて、約1013のヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)ファージ抗体を等容量のPBST/5%MPにより、室温で2時間ブロックした。ブロック後、被覆したウエルをPBS350μlで2回洗浄した。予めブロックしたヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)ファージ抗体300μlを各被覆ウエルに加え、シェーカー上、室温で2時間インキュベートした。洗浄は350μlのPBS/0.05%トゥイーンを5回加え、次いでPBSでさらに4回洗うことにより実施する。プレートからのファージの溶出は、ウエルあたり300μlの20mM−DTT/10mMトリス/HClにより、10分間実施した。DTTファージ溶出液を14mlの大腸菌TG1に加え、2YT培地中37℃で、0.6〜0.8のOD600まで増殖させ、50mlプラスティックチューブ中で、37℃で45分間、振盪することなく、ファージ感染のためにインキュベートした。5000rpmで10分間遠心分離した後、細菌ペレットをそれぞれ500μlの2×YT培地中に再懸濁し、2×YT−CG寒天プレート上に塗布し、30℃で一夜インキュベートした。次いで、コロニーをプレートからかき取り、ファージを回収し、上記のように増幅した。直接被覆したTSLP上の第二回および第三回の固相パンニングは第一回のプロトコールに従って実施したが、ただし、洗浄操作の緊縮性は増大した。
第二のパンニング変異体はビオチニル化ヒトTSLPに対し溶液パンニングであった:
溶液パンニングの場合、ダイナビーズM−280(ダイナル)にカップル結合したビオチニル化TSLPを用いて、以下のプロトコールを適用した:1.5mlエッペンドルフチューブを、PBSで1:1に希釈した2×ケミブロッカー1.5mlにより4℃で一夜ブロックした。200μlのストレプトアビジン被覆磁気ダイナビーズM−280(ダイナル)を200μlのPBSで1回洗浄し、200μlの1×ケミブロッカー(1×PBSで希釈)に再懸濁した。ビーズのブロッキングは予めブロックしたチューブ中、4℃で一夜実施した。各パンニング条件について500μlのPBSに希釈したファージを500μlの2×ケミブロッカー/0.1%トゥイーンと室温で1時間混合した(回転機)。ファージの事前の吸着は2回実施した:50μlのブロック化ストレプトアビジン磁気ビーズをブロック化ファージに加え、回転機上、室温で30分間インキュベートした。磁気装置(ダイナルMPC−E)によりビーズを分離した後、ファージ上清(〜1ml)を新しいブロック化チューブに移し、事前の吸着を50μlのグロック化ベーズ上で30分間繰り返した。次いで、200nMビオチニル化hTSLPを新しいブロック化1.5mlチューブ中、ブロック化ファージに加え、回転機上、室温で1時間インキュベートした。ブロック化ストレプトアビジン磁気ビーズ100μlを各パンニングファージプールに加え、回転機上、室温で10分間インキュベートした。ビオチニル化TSLPに結合したファージを磁気ビーズに固定化し、磁気粒子分離器(ダイナルMPC−E)で捕集した。回転機を用いてビーズをPBS/0.05%トゥイーン中で7回洗浄し、次いで、PBSでさらに3回洗浄した。ダイナビーズからのファージの溶出は、各チューブに300μlの20mM−DTT/10mMトリス/HCl(pH8)を加えて10分間、実施した。磁気粒子分離器によりダイナビーズを除去し、その上清を、OD600nm0.6〜0.8まで増殖した大腸菌TG−1培養物14mlに加えた。次いで、ビーズをPBS200μlで1回洗浄し、さらに除去したファージと共に、そのPBSを14mlの大腸菌TG−1培養物に加えた。ファージ感染のために、その培養物を50mlプラスチックチューブ中、37℃で45分間、振盪することなくインキュベートした。5000rpmで10分間遠心分離した後、細菌ペレットをそれぞれ500μlの2×YT培地に再懸濁し、2×YT−CG寒天プレートに塗布し、30℃で一夜インキュベートした。次いで、コロニーをプレートから剥ぎ取り、ファージを回収し、上記同様に増幅した。
溶液パンニングの場合、ダイナビーズM−280(ダイナル)にカップル結合したビオチニル化TSLPを用いて、以下のプロトコールを適用した:1.5mlエッペンドルフチューブを、PBSで1:1に希釈した2×ケミブロッカー1.5mlにより4℃で一夜ブロックした。200μlのストレプトアビジン被覆磁気ダイナビーズM−280(ダイナル)を200μlのPBSで1回洗浄し、200μlの1×ケミブロッカー(1×PBSで希釈)に再懸濁した。ビーズのブロッキングは予めブロックしたチューブ中、4℃で一夜実施した。各パンニング条件について500μlのPBSに希釈したファージを500μlの2×ケミブロッカー/0.1%トゥイーンと室温で1時間混合した(回転機)。ファージの事前の吸着は2回実施した:50μlのブロック化ストレプトアビジン磁気ビーズをブロック化ファージに加え、回転機上、室温で30分間インキュベートした。磁気装置(ダイナルMPC−E)によりビーズを分離した後、ファージ上清(〜1ml)を新しいブロック化チューブに移し、事前の吸着を50μlのグロック化ベーズ上で30分間繰り返した。次いで、200nMビオチニル化hTSLPを新しいブロック化1.5mlチューブ中、ブロック化ファージに加え、回転機上、室温で1時間インキュベートした。ブロック化ストレプトアビジン磁気ビーズ100μlを各パンニングファージプールに加え、回転機上、室温で10分間インキュベートした。ビオチニル化TSLPに結合したファージを磁気ビーズに固定化し、磁気粒子分離器(ダイナルMPC−E)で捕集した。回転機を用いてビーズをPBS/0.05%トゥイーン中で7回洗浄し、次いで、PBSでさらに3回洗浄した。ダイナビーズからのファージの溶出は、各チューブに300μlの20mM−DTT/10mMトリス/HCl(pH8)を加えて10分間、実施した。磁気粒子分離器によりダイナビーズを除去し、その上清を、OD600nm0.6〜0.8まで増殖した大腸菌TG−1培養物14mlに加えた。次いで、ビーズをPBS200μlで1回洗浄し、さらに除去したファージと共に、そのPBSを14mlの大腸菌TG−1培養物に加えた。ファージ感染のために、その培養物を50mlプラスチックチューブ中、37℃で45分間、振盪することなくインキュベートした。5000rpmで10分間遠心分離した後、細菌ペレットをそれぞれ500μlの2×YT培地に再懸濁し、2×YT−CG寒天プレートに塗布し、30℃で一夜インキュベートした。次いで、コロニーをプレートから剥ぎ取り、ファージを回収し、上記同様に増幅した。
ビオチニル化TSLPに関する第二回および第三回の溶液パンニングを第一回のプロトコールに従って実施した;洗浄操作の緊縮性は増大した。
可溶性Fabフラグメントのサブクローニングと発現
可溶性Fabの迅速かつ効率的な発現を容易にするために、選択されたヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)ファージミドのFab−エンコード挿入断片を発現ベクター pMORPH(登録商標)X9_Fab_FH(図1)にサブクローン化した。この目的のために、選択されたクローンのプラスミドDNAをXbaIおよびEcoRIで消化し、それによってFab−エンコード挿入断片(ompA−VLCLおよびphoA−Fd)を切り取り、XbaI/EcoRIで消化した発現ベクター pMORPH(登録商標)X9_Fab_FHにクローン化した。検出と精製両方のために、このベクターから発現したFabは2つのC−末端タグ(それぞれ、FLAG(商標)および6×His)を担持する。
可溶性Fabの迅速かつ効率的な発現を容易にするために、選択されたヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)ファージミドのFab−エンコード挿入断片を発現ベクター pMORPH(登録商標)X9_Fab_FH(図1)にサブクローン化した。この目的のために、選択されたクローンのプラスミドDNAをXbaIおよびEcoRIで消化し、それによってFab−エンコード挿入断片(ompA−VLCLおよびphoA−Fd)を切り取り、XbaI/EcoRIで消化した発現ベクター pMORPH(登録商標)X9_Fab_FHにクローン化した。検出と精製両方のために、このベクターから発現したFabは2つのC−末端タグ(それぞれ、FLAG(商標)および6×His)を担持する。
大腸菌におけるヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)Fab抗体の微小発現
発現されたFabを pMORPH(登録商標)X9_Fab_FH発現ベクターにサブクローニングした後に得られるクロラムフェニコール−耐性単一コロニーを用いて、1ウエルあたり100μlの2×YT−CG培地を容れた無菌の96穴マイクロタイタープレートのウエルに接種し、37℃で一夜増殖した。各大腸菌TG−1培養物5μlを、予め1ウエルあたり100μlの2×YT培地(34μg/mlのクロラムフェニコールおよび1%グルコースを補足)を容れた新鮮な無菌96穴マイクロタイタープレートに移した。マイクロタイタープレートはマイクロプレートシェーカー上400rpmで振盪しながら、培養物が僅かに濁りを生じ(約2〜4時間)、OD600nmが〜0.5となるまで、30℃でインキュベートした。
発現されたFabを pMORPH(登録商標)X9_Fab_FH発現ベクターにサブクローニングした後に得られるクロラムフェニコール−耐性単一コロニーを用いて、1ウエルあたり100μlの2×YT−CG培地を容れた無菌の96穴マイクロタイタープレートのウエルに接種し、37℃で一夜増殖した。各大腸菌TG−1培養物5μlを、予め1ウエルあたり100μlの2×YT培地(34μg/mlのクロラムフェニコールおよび1%グルコースを補足)を容れた新鮮な無菌96穴マイクロタイタープレートに移した。マイクロタイタープレートはマイクロプレートシェーカー上400rpmで振盪しながら、培養物が僅かに濁りを生じ(約2〜4時間)、OD600nmが〜0.5となるまで、30℃でインキュベートした。
これらの発現プレートに、34μg/mlのクロラムフェニコールおよび3mM−IPTG(イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド)を補足した2×YT培地20μlをウエルごとに加え(終末濃度0.5mM−IPTG)、そのマイクロタイタープレートをガス浸透性テープでシールし、400rpmで振盪しながら、30℃で一夜インキュベートした。
全細胞溶解液の生成(BEL抽出液):発現プレートの各ウエルに、2.5mg/mlのリソザイムを含有するBELバッファー(2×BBS/EDTA:24.7g/Lホウ酸、18.7gのNaCl/L、1.49gのEDTA/L、pH8.0)40μlを加え、マイクロタイタープレートシェーカー上(400rpm)、22℃で1時間インキュベートした。このBEL抽出液はELISAによる結合分析またはバイオベリスM−シリーズ(BioVeris M-series;登録商標)384アナライザーに使用した(実施例2参照)。
酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)
PBS中、ヒト組換えTSLP(R&Dシステムズ)5μg/mlを384穴マキシソーププレート(ヌンク−イムノプレート)上に、4℃で一夜被覆した。コーティング後、ウエルをPBS/0.05%トゥイーン(PBS−T)で一回、およびPBSで2回洗浄した。次いで、ウエルを2%BSA含有PBS−Tで室温、2時間ブロックした。平行して、15μlのBEL抽出液と15μlの2%BSA含有PBS−Tを室温で2時間インキュベートした。塗布したブロックマキシソープをPBS−Tで3回洗い、ブロックしたBEL抽出液10μLをウエルに加え、室温で1時間インキュベートした。一次Fab抗体の検出のために、以下の二次抗体を適用した:アルカリ性ホスファターゼ(AP)−接合アフィニピュア(AffiniPure)F(ab’)2 フラグメント、ヤギ抗−ヒト、−抗−マウスまたは−抗−ヒツジIgG(ジャクソン・イムノ・リサーチ)。AP−接合体の検出のために、アトホス(AttoPhos (ロッシュ))などの発蛍光団基質を製造業者の説明書に従って使用した。すべてのインキュベーション工程の間に、マイクロタイタープレートのウエルをPBS−Tで3回、第二抗体との最終インキュベーション後に3回洗浄した。蛍光はテカン(TECAN)スペクトラフルオルプレートリーダーにて測定した。
PBS中、ヒト組換えTSLP(R&Dシステムズ)5μg/mlを384穴マキシソーププレート(ヌンク−イムノプレート)上に、4℃で一夜被覆した。コーティング後、ウエルをPBS/0.05%トゥイーン(PBS−T)で一回、およびPBSで2回洗浄した。次いで、ウエルを2%BSA含有PBS−Tで室温、2時間ブロックした。平行して、15μlのBEL抽出液と15μlの2%BSA含有PBS−Tを室温で2時間インキュベートした。塗布したブロックマキシソープをPBS−Tで3回洗い、ブロックしたBEL抽出液10μLをウエルに加え、室温で1時間インキュベートした。一次Fab抗体の検出のために、以下の二次抗体を適用した:アルカリ性ホスファターゼ(AP)−接合アフィニピュア(AffiniPure)F(ab’)2 フラグメント、ヤギ抗−ヒト、−抗−マウスまたは−抗−ヒツジIgG(ジャクソン・イムノ・リサーチ)。AP−接合体の検出のために、アトホス(AttoPhos (ロッシュ))などの発蛍光団基質を製造業者の説明書に従って使用した。すべてのインキュベーション工程の間に、マイクロタイタープレートのウエルをPBS−Tで3回、第二抗体との最終インキュベーション後に3回洗浄した。蛍光はテカン(TECAN)スペクトラフルオルプレートリーダーにて測定した。
大腸菌におけるヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)Fab抗体の発現と精製
TG−1細胞において pMORPH(登録商標)X9_Fab_FHがエンコードするFabフラグメントの発現は、シェーカーフラスコ培養物中、34μg/mlのクロラムフェニコールを補足した2×YT培地750mlを用いて実施した。培養物はOD600nmが0.5に達するまで30℃で振盪した。発現は0.75mM−IPTGの添加により、30℃で20時間誘発した。リソザイムにより細胞を破砕し、FabをNi−NTAクロマトグラフィー(キアゲン、ヒルデン、ドイツ)により単離した。タンパク質濃度をUV−分光光度法により測定した11。
TG−1細胞において pMORPH(登録商標)X9_Fab_FHがエンコードするFabフラグメントの発現は、シェーカーフラスコ培養物中、34μg/mlのクロラムフェニコールを補足した2×YT培地750mlを用いて実施した。培養物はOD600nmが0.5に達するまで30℃で振盪した。発現は0.75mM−IPTGの添加により、30℃で20時間誘発した。リソザイムにより細胞を破砕し、FabをNi−NTAクロマトグラフィー(キアゲン、ヒルデン、ドイツ)により単離した。タンパク質濃度をUV−分光光度法により測定した11。
実施例2:TSLP受容体のTSLP誘発シグナル伝達を阻害する中和性抗−ヒトTSLP Fab候補の同定
22種の異なるヒトTSLP特異抗体を、ヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)ライブラリーから選択し、ヒトTSLPを中和する効力について試験した。
22種の異なるヒトTSLP特異抗体を、ヒュカル・ゴールド(HuCAL GOLD;登録商標)ライブラリーから選択し、ヒトTSLPを中和する効力について試験した。
A.FACSアッセイにおける抗−ヒトTSLP FabによるTSLP受容体に結合するTSLPのブロッキング
hTSLPR、hIL7Rαを発現するBa/F3細胞に対するビオチニル化ISLPの結合阻害は、FACSにより分析した。Fab抗体はFACSバッファーで希釈した(細胞洗浄液(B&D)/3%FCS)。50μlのビオチニル化TSLPを100ng/mlで50μlのFab(100μg/ml)と共に室温で1時間インキュベートした。TSLP受容体のインターナリゼーションを回避するために、さらなる細胞との工程はすべて4℃で、または氷上で実施した。Ba/F3細胞100μlを2×106細胞/mlとして96穴プレート(ヌンク)の各ウエルに移し、2000rpm、4℃で遠心分離した。細胞を150μlの冷却FACSバッファーで2回洗い、Fab/ビオチニル化TSLP混合物で再懸濁し、シェーカー上4℃で1時間インキュベートした。FACSバッファー中のストレプトアビジンPE(1:400)を検出のために添加した。インキュベーションの30分後に、上記のように細胞を遠心分離し、150μlの冷却FACSバッファーで2回洗浄した。5000個の細胞をFACSで分析した。MOR04494、MOR04496、MOR04497およびMOR04609が細胞結合の阻害を示した。
hTSLPR、hIL7Rαを発現するBa/F3細胞に対するビオチニル化ISLPの結合阻害は、FACSにより分析した。Fab抗体はFACSバッファーで希釈した(細胞洗浄液(B&D)/3%FCS)。50μlのビオチニル化TSLPを100ng/mlで50μlのFab(100μg/ml)と共に室温で1時間インキュベートした。TSLP受容体のインターナリゼーションを回避するために、さらなる細胞との工程はすべて4℃で、または氷上で実施した。Ba/F3細胞100μlを2×106細胞/mlとして96穴プレート(ヌンク)の各ウエルに移し、2000rpm、4℃で遠心分離した。細胞を150μlの冷却FACSバッファーで2回洗い、Fab/ビオチニル化TSLP混合物で再懸濁し、シェーカー上4℃で1時間インキュベートした。FACSバッファー中のストレプトアビジンPE(1:400)を検出のために添加した。インキュベーションの30分後に、上記のように細胞を遠心分離し、150μlの冷却FACSバッファーで2回洗浄した。5000個の細胞をFACSで分析した。MOR04494、MOR04496、MOR04497およびMOR04609が細胞結合の阻害を示した。
TSLP依存性STATS活性化の阻害
hTSLPR、hIL7RαおよびStat5−Lucレポーター遺伝子を発現するBa/F3細胞は、5ng/mlのTSLPの存在下に増殖させた。アッセイバッファー(RPMI−1640、フェノールレッドなし、10%FCS、ペニシリン 10Uml−1/ストレプトマイシン 10μgml−1、1%ピュロマイシン)中の1×106細胞/mlを10μl、コースター96穴白色プレート(コーニング)に加えた。アッセイバッファー70μlおよびアッセイバッファー中の抗−TSLP抗体(10×)10μlを加え、37℃で20分間インキュベートした。アッセイバッファー中、5ng/ml TSLP(R&Dシステムズ;0.5ng/ml最終濃度)10μlを加えて、最終アッセイ容量100μlとした。プレートに覆いをし、加湿インキュベーター中で37℃、5〜6時間放置した。ウエルに、ブライト−グロ(Bright‐Glo(商標))ルシフェラーゼ(プロメガ)100μl(1:1アッセイ容量)を加え、室温で5分間インキュベートした。このプレートをトップシール(TopSeal(商標))でシールし、ルミネッセンスを記録した。MOR04493、MOR04494、MOR04496、MOR04497およびMOR04609が本アッセイにおいてTSLPを中和した。
hTSLPR、hIL7RαおよびStat5−Lucレポーター遺伝子を発現するBa/F3細胞は、5ng/mlのTSLPの存在下に増殖させた。アッセイバッファー(RPMI−1640、フェノールレッドなし、10%FCS、ペニシリン 10Uml−1/ストレプトマイシン 10μgml−1、1%ピュロマイシン)中の1×106細胞/mlを10μl、コースター96穴白色プレート(コーニング)に加えた。アッセイバッファー70μlおよびアッセイバッファー中の抗−TSLP抗体(10×)10μlを加え、37℃で20分間インキュベートした。アッセイバッファー中、5ng/ml TSLP(R&Dシステムズ;0.5ng/ml最終濃度)10μlを加えて、最終アッセイ容量100μlとした。プレートに覆いをし、加湿インキュベーター中で37℃、5〜6時間放置した。ウエルに、ブライト−グロ(Bright‐Glo(商標))ルシフェラーゼ(プロメガ)100μl(1:1アッセイ容量)を加え、室温で5分間インキュベートした。このプレートをトップシール(TopSeal(商標))でシールし、ルミネッセンスを記録した。MOR04493、MOR04494、MOR04496、MOR04497およびMOR04609が本アッセイにおいてTSLPを中和した。
一次単球における中和活性の決定
ヒト血中単球の単離:NHRCドナーパネル上、健常成人ボランティアから150mLの血液を採取した。血液は血液10mLあたり1mLの抗凝血剤(20mg/mLのEDTA/PBS)を容れたチューブで集め、次に、血液20mLあたり12.5mLのPBSで希釈した。次いで、チューブあたり12.5mLの4%デキストラン(PBS中)と希釈した血液とを混合し、氷上で40分間インキュベートして赤血球を沈降させた。PBMCはフィコールを用いる密度遠心分離により単離し、PBMC含有「バフィーコート」をプラスチックパステーテ(pastete)を用いて回収した。細胞をPBS中で1回(300xg、7分間)洗い、計測した。細胞のMACS単離は単球単離キットII(ミルテニイ・バイオテック)を用いて製造業者の説明書の従い、実施した。バッファーの添加と洗浄は、特に断りのない限り、すべて4℃でMACSバッファー(PBS、0.5%BSA、2mM−EDTA、pH7.2)によった。簡単に説明すると、107細胞に、30μLのバッファーとそれぞれ10μLのFcRブロッキング試薬およびビオチン−抗体カクテルを加え、よく混合し、10分間インキュベートした。さらに30μLのバッファーと20μLの抗−ビオチンマイクロビーズを次いで細胞に加え、15分間インキュベートした。細胞を洗浄し(300xg、10分間)、500μLバッファーあたり108細胞として再懸濁し、「感作」LSカラムに加えた。「手付かず」の単球フラクションは、他のすべての細胞型をカラム上に保持することで集めた。単離処理に際し、サンプルは後のフローサイトメトリーによる分析のために集めた。
ヒト血中単球の単離:NHRCドナーパネル上、健常成人ボランティアから150mLの血液を採取した。血液は血液10mLあたり1mLの抗凝血剤(20mg/mLのEDTA/PBS)を容れたチューブで集め、次に、血液20mLあたり12.5mLのPBSで希釈した。次いで、チューブあたり12.5mLの4%デキストラン(PBS中)と希釈した血液とを混合し、氷上で40分間インキュベートして赤血球を沈降させた。PBMCはフィコールを用いる密度遠心分離により単離し、PBMC含有「バフィーコート」をプラスチックパステーテ(pastete)を用いて回収した。細胞をPBS中で1回(300xg、7分間)洗い、計測した。細胞のMACS単離は単球単離キットII(ミルテニイ・バイオテック)を用いて製造業者の説明書の従い、実施した。バッファーの添加と洗浄は、特に断りのない限り、すべて4℃でMACSバッファー(PBS、0.5%BSA、2mM−EDTA、pH7.2)によった。簡単に説明すると、107細胞に、30μLのバッファーとそれぞれ10μLのFcRブロッキング試薬およびビオチン−抗体カクテルを加え、よく混合し、10分間インキュベートした。さらに30μLのバッファーと20μLの抗−ビオチンマイクロビーズを次いで細胞に加え、15分間インキュベートした。細胞を洗浄し(300xg、10分間)、500μLバッファーあたり108細胞として再懸濁し、「感作」LSカラムに加えた。「手付かず」の単球フラクションは、他のすべての細胞型をカラム上に保持することで集めた。単離処理に際し、サンプルは後のフローサイトメトリーによる分析のために集めた。
TSLPで処理した単球によるTARC産生と抗−TSLP抗体による反応のブロッキング:
新たに単離した単球をアッセイバッファー(RPMI1640、10%FCS、ペニシリン10U/mL/ストレプトマイシン10μg/mL)1mLあたり1×106細胞として再懸濁した。96穴平底プレートの各ウエルに100μLの細胞を加え、ウエルあたり100,000細胞の濃度とした。アッセイバッファー80μLを、TSLP用量応答曲線用に用いるウエルに加え、60μLは抗−TSLP抗体を試験するウエルに加えた。抗−TSLP抗体試験のためには、各抗−TSLP抗体の10×保存溶液20μLを細胞に加え、5%CO2下、37℃で20分間インキュベートした。次いで、rhTSLPを0.5ng/mLとして、抗−TSLP抗体を容れた各ウエル(1ウエルあたり20μLの10×保存溶液)に加えた。TSLP用量応答曲線は各プレートに含めた。プレートは5%CO2下、37℃で24時間インキュベートし、その後、上清を採取し、将来の分析用に−20℃で保存した。
新たに単離した単球をアッセイバッファー(RPMI1640、10%FCS、ペニシリン10U/mL/ストレプトマイシン10μg/mL)1mLあたり1×106細胞として再懸濁した。96穴平底プレートの各ウエルに100μLの細胞を加え、ウエルあたり100,000細胞の濃度とした。アッセイバッファー80μLを、TSLP用量応答曲線用に用いるウエルに加え、60μLは抗−TSLP抗体を試験するウエルに加えた。抗−TSLP抗体試験のためには、各抗−TSLP抗体の10×保存溶液20μLを細胞に加え、5%CO2下、37℃で20分間インキュベートした。次いで、rhTSLPを0.5ng/mLとして、抗−TSLP抗体を容れた各ウエル(1ウエルあたり20μLの10×保存溶液)に加えた。TSLP用量応答曲線は各プレートに含めた。プレートは5%CO2下、37℃で24時間インキュベートし、その後、上清を採取し、将来の分析用に−20℃で保存した。
TARC測定単球上清のELISA
培養上清中、TARC産生の測定は、TARC二重セットELISAキット(R&Dシステムズ)を用いて、製造業者の説明書に従って実施した。簡単に説明すると、単球上清をアッセイバッファー(RPMI1640、10%FCS、ペニシリン10U/mL/ストレプトマイシン10μg/mL)に1:2に希釈し、三重測定用に、TARC捕捉抗体で予め被覆した96穴の半領域のプレートに加えた。プレートを室温で2時間インキュベートし、次いで再度洗った。次いで、ビオチニル化検出 mAb 50μlを各ウエルに加え、さらに2時間室温でインキュベートした。プレートを洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼをウエルあたり50μLとして加え、室温で20分間、暗所でインキュベートした。最終の洗浄を実施し、100μLのTMB基質をウエルごとに加え、プレートを室温暗所で実施した。発色はインキュベーションの20分後に50μLの1M水酸化ナトリウム添加により停止させた。プレートは450nmにセットしたスペクトラマックス・マイクロプレートリーダー(モレキュラーディバイス)上で直ちに読み取った。ソフトマックスプロ・ソフトウエアによりデータを解析し、抗−TSLP抗体による最大吸収応答のパーセント阻害を、エクセルスプレッドシートを用いて計算した。
培養上清中、TARC産生の測定は、TARC二重セットELISAキット(R&Dシステムズ)を用いて、製造業者の説明書に従って実施した。簡単に説明すると、単球上清をアッセイバッファー(RPMI1640、10%FCS、ペニシリン10U/mL/ストレプトマイシン10μg/mL)に1:2に希釈し、三重測定用に、TARC捕捉抗体で予め被覆した96穴の半領域のプレートに加えた。プレートを室温で2時間インキュベートし、次いで再度洗った。次いで、ビオチニル化検出 mAb 50μlを各ウエルに加え、さらに2時間室温でインキュベートした。プレートを洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼをウエルあたり50μLとして加え、室温で20分間、暗所でインキュベートした。最終の洗浄を実施し、100μLのTMB基質をウエルごとに加え、プレートを室温暗所で実施した。発色はインキュベーションの20分後に50μLの1M水酸化ナトリウム添加により停止させた。プレートは450nmにセットしたスペクトラマックス・マイクロプレートリーダー(モレキュラーディバイス)上で直ちに読み取った。ソフトマックスプロ・ソフトウエアによりデータを解析し、抗−TSLP抗体による最大吸収応答のパーセント阻害を、エクセルスプレッドシートを用いて計算した。
受容体遺伝子アッセイにおける天然のヒトTSLPの中和
ヒト天然TSLPは、10%FBSを含むフェノールレット不含RPMI中、IL−1β(1ng/ml)、TNF−α(1ng/ml)およびIL−13(10ng/ml)含有のサイトカインカクテルで、一次ヒト線維芽細胞(クロネティックス)を37℃で24時間処理することにより生成させた。誘発した天然のTSLPを含む細胞培養上清は、上記のRGAにおいて活性であることが示された。
ヒト天然TSLPは、10%FBSを含むフェノールレット不含RPMI中、IL−1β(1ng/ml)、TNF−α(1ng/ml)およびIL−13(10ng/ml)含有のサイトカインカクテルで、一次ヒト線維芽細胞(クロネティックス)を37℃で24時間処理することにより生成させた。誘発した天然のTSLPを含む細胞培養上清は、上記のRGAにおいて活性であることが示された。
TSLP含有天然TSLPの10倍希釈の1つが、RGA中、0.5ng/mlのrhTSLPと略同じ活性レベルに相当したため、これを候補抗体の活性を試験するときの最終希釈として用いた。
TSLP/TSLP受容体結合阻害バイオベリスアッセイ
TSLP結合阻害アッセイの場合、組換えヒトTSLP(R&Dシステムズ)をカルボン酸M−270ダイナル磁気ビーズに直接カップル結合させた。1ウエルあたり50μlのFab抗体(10μMストック、1:5希釈工程)を、96穴プレート(ヌンク)中、TSLP被覆ビーズ25μlと共に2時間インキュベートした。100pM−TSLP−受容体/Fc融合体50μl、および供給者(バイオベリス(BioVeris)、欧州、ウイットニイ、オックスフォフシャー、英国)の説明書に従ってBV−タグ(BV-tag(商標))で標識した1:1000希釈の抗−ヒトFc検出抗体を各ウエルに加え、1時間インキュベートした。(最終Fab濃度:32nM〜4μM;最終TSLP濃度:40pM)。検出はバイオベリスM−384シリーズ(BioVeris M-384 SERIES;登録商標)ワークステーション(バイオベリス、欧州、ウイットニイ、オックスフォフシャー、英国)により実施した。本アッセイにおいては、MOR04493、MOR04494、MOR04496、MOR04497、MOR04609、およびMOR04832がTSLP受容体結合阻害を示した。
TSLP結合阻害アッセイの場合、組換えヒトTSLP(R&Dシステムズ)をカルボン酸M−270ダイナル磁気ビーズに直接カップル結合させた。1ウエルあたり50μlのFab抗体(10μMストック、1:5希釈工程)を、96穴プレート(ヌンク)中、TSLP被覆ビーズ25μlと共に2時間インキュベートした。100pM−TSLP−受容体/Fc融合体50μl、および供給者(バイオベリス(BioVeris)、欧州、ウイットニイ、オックスフォフシャー、英国)の説明書に従ってBV−タグ(BV-tag(商標))で標識した1:1000希釈の抗−ヒトFc検出抗体を各ウエルに加え、1時間インキュベートした。(最終Fab濃度:32nM〜4μM;最終TSLP濃度:40pM)。検出はバイオベリスM−384シリーズ(BioVeris M-384 SERIES;登録商標)ワークステーション(バイオベリス、欧州、ウイットニイ、オックスフォフシャー、英国)により実施した。本アッセイにおいては、MOR04493、MOR04494、MOR04496、MOR04497、MOR04609、およびMOR04832がTSLP受容体結合阻害を示した。
表面プラズモン共鳴によるナノモル親和性の測定(バイオコア)
速度論的SPR分析は、〜400RU濃度ビオチニル化組換えヒトTSLPiで被覆したSA−チップ(バイオコア(Biacore)、スウェーデン)上で実施した。それぞれの量のビオチニル化ヒト血清アルブミン(HSA)を参照フローセルに固相化した。PBS(136mM−NaCl、2.7mM−KCl、10mM−Na2HPO4、1.76mM−KH2PO4、pH7.4)をランニングバッファーとして使用した。Fabを16〜500nMの濃度系列、20μl/分の流速で加えた。会合位相を60秒に、解離位相を120秒にセットした。その方法により決定されたヒトISLPに対する親Fab抗体4493、4494、4496、4497、4832および4609の親和性を要約すると、8〜1400nMの範囲である。
速度論的SPR分析は、〜400RU濃度ビオチニル化組換えヒトTSLPiで被覆したSA−チップ(バイオコア(Biacore)、スウェーデン)上で実施した。それぞれの量のビオチニル化ヒト血清アルブミン(HSA)を参照フローセルに固相化した。PBS(136mM−NaCl、2.7mM−KCl、10mM−Na2HPO4、1.76mM−KH2PO4、pH7.4)をランニングバッファーとして使用した。Fabを16〜500nMの濃度系列、20μl/分の流速で加えた。会合位相を60秒に、解離位相を120秒にセットした。その方法により決定されたヒトISLPに対する親Fab抗体4493、4494、4496、4497、4832および4609の親和性を要約すると、8〜1400nMの範囲である。
実施例3:LCDR3とHCDR2カセットの平行交換による選択された抗−TSLP Fabの親和性成熟
B.親和性成熟用のFabライブラリーの生成
同定した抗−TSLP抗体の親和性と阻害活性を上昇させるために、6種のFabクローンMOR04493、MOR04494、MOR04496、MOR04497、MOR04609、およびMOR04832を親和性成熟に付した。この目的のために、トリヌクレオチド配向突然変異誘発12,13を用いて、カセット突然変異誘発によりCDR領域を最適化した。
B.親和性成熟用のFabライブラリーの生成
同定した抗−TSLP抗体の親和性と阻害活性を上昇させるために、6種のFabクローンMOR04493、MOR04494、MOR04496、MOR04497、MOR04609、およびMOR04832を親和性成熟に付した。この目的のために、トリヌクレオチド配向突然変異誘発12,13を用いて、カセット突然変異誘発によりCDR領域を最適化した。
以下の項は成熟ライブラリーのクローニングとFab最適化に使用されるプロトコールについて簡単に記載する。発現ベクター pMORPH(登録商標)X9_Fab_FHからのFabフラグメントを、ファージミドベクター pMORPH(登録商標)25 (UPS 6,753,136) にクローン化した。親Fabの親和性と有効性両方を最適化するために、平行して、2つの異なる戦略を適用した。
6種のファージ抗体Fabライブラリーは、6種の親クローンのLCDR3を個々の軽鎖CDR3配列のレパートリーと置き換えて、生成させた。平行して、各親クローンのHCDR2領域を個々の重鎖CDR2配列のレパートリーと置き換えた。親和性成熟ライブラリーは、標準的なクローニング手法および多様化したクローンの電子適格大腸菌TOP10F細胞(インビトロゲン)への形質転換により生成させた。Fab−提示ファージは実施例1Aに記載されているように調製した。4つの成熟プールを構築し、引き続く選択プロセスに際して区別した:
・プール1:MOR04493およびMOR04832のLCDR3ライブラリー
・プール2:MOR04493およびMOR04832のHCDR2ライブラリー
・プール3:MOR04494;MOR04496;MOR04497;MOR04609のLCDR3ライブラリー
・プール4:MOR04494;MOR04496;MOR04497;MOR04609のHCDR2ライブラリー
・プール1:MOR04493およびMOR04832のLCDR3ライブラリー
・プール2:MOR04493およびMOR04832のHCDR2ライブラリー
・プール3:MOR04494;MOR04496;MOR04497;MOR04609のLCDR3ライブラリー
・プール4:MOR04494;MOR04496;MOR04497;MOR04609のHCDR2ライブラリー
成熟パンニング戦法
4つの抗体プールを用いるパンニングは、溶液中のビオチニル化組換えヒトTSLP(R&Dシステムズ)上、3回、それぞれ実施例1Bのビオチニル化ヒトTSLPについて記載したように、実施した。選択緊縮性はパンニング回数を重ねるごとのビオチニル化抗原の減少により、洗浄工程の引き伸ばしにより、また速度外選択のためのビオチニル化抗原の添加によって、増大させた。
4つの抗体プールを用いるパンニングは、溶液中のビオチニル化組換えヒトTSLP(R&Dシステムズ)上、3回、それぞれ実施例1Bのビオチニル化ヒトTSLPについて記載したように、実施した。選択緊縮性はパンニング回数を重ねるごとのビオチニル化抗原の減少により、洗浄工程の引き伸ばしにより、また速度外選択のためのビオチニル化抗原の添加によって、増大させた。
細菌溶解液中のTSLP結合Fabの検出のための電気化学発光(バイオベリス)に基づく結合分析
TSLPに対する大腸菌溶解液(BEL抽出液)中の最適化Fab抗体の結合は、バイオベリスM−シリーズ(BioVeris M-384 SERIES;登録商標)384アナライザー(バイオベリス、欧州、ウイットニイ、オックスフォフシャー、英国)により分析した。BEL抽出液はバイオベリス・スクリーニングに使用するために、アッセイバッファー(PBS/0.05%トゥイーン20/0.5%BSA)中に希釈した。ビオチニル化TSLP(R&Dシステムズ)は、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズにカップル結合させ、抗−ヒト (Fab)’2(ダイアノバ)はBV−タグ(BV-tag(商標))(バイオベリス、欧州、ウイットニイ、オックスフォフシャー、英国)によりルテニウム標識した。この二次抗体はTSLPカップルビーズに加え、バイオベリスM−シリーズ(BioVeris M-384 SERIES;登録商標)384アナライザーで測定した。バイオベリススクリーニングからのヒットの配列分析の後、以下の20種のユニークFabクローンを同定した:MOR05008;MOR05009;MOR05010;MOR05011;MOR05012;MOR05013;MOR05014;MOR05015;MOR05016;MOR05017;MOR05018;MOR05019;MOR05020;MOR05021;MOR05022;MOR05023;MOR05024;MOR05025;MOR05026;MOR05027。
TSLPに対する大腸菌溶解液(BEL抽出液)中の最適化Fab抗体の結合は、バイオベリスM−シリーズ(BioVeris M-384 SERIES;登録商標)384アナライザー(バイオベリス、欧州、ウイットニイ、オックスフォフシャー、英国)により分析した。BEL抽出液はバイオベリス・スクリーニングに使用するために、アッセイバッファー(PBS/0.05%トゥイーン20/0.5%BSA)中に希釈した。ビオチニル化TSLP(R&Dシステムズ)は、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズにカップル結合させ、抗−ヒト (Fab)’2(ダイアノバ)はBV−タグ(BV-tag(商標))(バイオベリス、欧州、ウイットニイ、オックスフォフシャー、英国)によりルテニウム標識した。この二次抗体はTSLPカップルビーズに加え、バイオベリスM−シリーズ(BioVeris M-384 SERIES;登録商標)384アナライザーで測定した。バイオベリススクリーニングからのヒットの配列分析の後、以下の20種のユニークFabクローンを同定した:MOR05008;MOR05009;MOR05010;MOR05011;MOR05012;MOR05013;MOR05014;MOR05015;MOR05016;MOR05017;MOR05018;MOR05019;MOR05020;MOR05021;MOR05022;MOR05023;MOR05024;MOR05025;MOR05026;MOR05027。
抗体の親和性をさらに改善するために、2つの独立に最適化した可変鎖のIgG変換および交差形質導入
20種すべての最適化Fab抗体をIgG1フォーマットにサブクローン化した。以下の20種すべてのIgG1の親和性は、組織培養上清からの溶液平衡滴定により測定した:MOR05008;MOR05009;MOR05010;MOR05011;MOR05012;MOR05013;MOR05014;MOR05015;MOR05016;MOR05017;MOR05018;MOR05019;MOR05020;MOR05021;MOR05022;MOR05023;MOR05024;MOR05025;MOR05026;MOR05027。
20種すべての最適化Fab抗体をIgG1フォーマットにサブクローン化した。以下の20種すべてのIgG1の親和性は、組織培養上清からの溶液平衡滴定により測定した:MOR05008;MOR05009;MOR05010;MOR05011;MOR05012;MOR05013;MOR05014;MOR05015;MOR05016;MOR05017;MOR05018;MOR05019;MOR05020;MOR05021;MOR05022;MOR05023;MOR05024;MOR05025;MOR05026;MOR05027。
親和性をさらに改善するために、同じ親クローンに由来する成熟IgG1から独立に最適化したH−CDR2およびL−CDR3を組合せた;その理由は、この組合せがさらなる親和性の獲得につながる高い可能性があるからである14−16。IgG1の重鎖および軽鎖が別個のベクター上にあり、それ故、交差形質導入によって、2つの異なる最適化鎖を組合せ、次いで1個の細胞にてそれらを同時に発現させ、IgG抗体に組上げることが可能である。この方法は親クローンMOR04494およびMOR04497に由来する結合剤に対して適用したが、その際、H−CDR2およびL−CDR3双方のライブラリーから、最適化した鎖を平行して同定した。MOR04494については、MOR05010〜MOR05015からの6種すべての最適化した重鎖を、ひとつひとつMOR05016〜MOR05018の3種の最適化した軽鎖と組合せ、18種の新しい抗体を得た。MOR04497については、MOR5019の一つの最適化したH−CDR2をMOR05020〜MOR05022の3種の最適化した軽鎖と組合せ、3種の新しい抗体を得た。
溶液平衡滴定(SET)によるピコモル親和性の決定
KD決定のために、Fabのモノマーフラクション(少なくとも90%のモノマー含量、分析用SECにより分析;スーパーデックス75、アマーシャムファルマシア)を用いた。さらに、抗原TSLPが溶液中でモノマーであると仮定して、IgG1の親和性を決定することができた。溶液中の電気化学発光(ECL)に基づく親和性決定とデータの評価は、基本的にヘネルら(Haenel et al., 2005)が記載のように実施した。FabまたはIgG1の一定量を溶液中異なる濃度(段階3n希釈)の組換えヒトTSLP(R&Dシステムズ)と平衡化した。常磁性ビーズ(M−280ストレプトアビジン、ダイナル)にカップル結合したビオチニル化ヒトTSLP、およびBV−タグ(BV-tag(商標))(バイオベリス、欧州、ウイットニイ、オックスフォフシャー、英国)標識した抗−ヒト (Fab)’2(ダイアノバ)を加え、その混合物を30分間インキュベートした。次に、結合しなかったFabの濃度をM−シリーズ(M-SERIES;登録商標)384アナライザー(バイオベリスヨーロッパ)により、ECL検出経由で定量した。
KD決定のために、Fabのモノマーフラクション(少なくとも90%のモノマー含量、分析用SECにより分析;スーパーデックス75、アマーシャムファルマシア)を用いた。さらに、抗原TSLPが溶液中でモノマーであると仮定して、IgG1の親和性を決定することができた。溶液中の電気化学発光(ECL)に基づく親和性決定とデータの評価は、基本的にヘネルら(Haenel et al., 2005)が記載のように実施した。FabまたはIgG1の一定量を溶液中異なる濃度(段階3n希釈)の組換えヒトTSLP(R&Dシステムズ)と平衡化した。常磁性ビーズ(M−280ストレプトアビジン、ダイナル)にカップル結合したビオチニル化ヒトTSLP、およびBV−タグ(BV-tag(商標))(バイオベリス、欧州、ウイットニイ、オックスフォフシャー、英国)標識した抗−ヒト (Fab)’2(ダイアノバ)を加え、その混合物を30分間インキュベートした。次に、結合しなかったFabの濃度をM−シリーズ(M-SERIES;登録商標)384アナライザー(バイオベリスヨーロッパ)により、ECL検出経由で定量した。
溶液中のカニクイザルTSLP(NSVでの哺乳動物発現および精製)に対する親和性決定は、ヒトTSLPをカニクイザルTSLPに置き換えて、本質的に上記のように実施した。遊離のFabの検出のために、常磁性ビーズにカップル結合したビオチニル化ヒトTSLPを使用した。親和性はヘネルら(Haenel et al., 2005)17に従って計算した。上記(モノマー)アッセイ条件を用いて、親和性最適化抗−TSLP IgGに対する親和性を溶液中で決定した。ヒトおよびカニクイザルのTSLPに対する親和性を表5に要約する。
従って、本発明のさらなる側面として、細胞受容体標的hTSLPの存在と関連する疾患、例えば、喘息またはアトピー性皮膚炎などの処置において、KDが100pM未満、適切には50pM未満、好ましくは30pM未満である抗体またはその機能的フラグメントの単離されたhTSLP結合領域の使用が提供される。
参照文献リスト
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2.Soumelis,V. et al. Human epithelial cells trigger dendritic cell mediated allergic inflammation by producing TSLP(ヒト表皮細胞はTSLPを産生することにより樹状細胞仲介アレルギー性炎症の引き金を引く). Nat Immunol 3, 673-680 (2002)
3.Levin,S.D. et al. Thymic stromal lymphopoietin: a cytokine that promotes the development of IgM+ B cells in vitro and signals via a novel mechanism(胸腺間質リンホポエチン:インビトロでIgM+B細胞の発生を促進するサイトカインおよび新規メカニズムによるシグナル). J Immunol 162, 677-683 (1999)
4.Novak,N. & Bieber,T. The role of dendritic cell subtypes in the pathophysiology of atopic dermatitis(アトピー性皮膚炎の病態生理学における樹状細胞サブタイプの役割). J Am Acad. Dermatol. 53, S171-S176 (2005)
5.Quentmeier,H. et al. Cloning of human thymic stromal lymphopoietin (TSLP) and signaling mechanisms leading to proliferation(ヒト胸腺間質リンホポエチン(TSLP)のクローニングと増殖に導くシグナル伝達メカニズム). Leukemia 15, 1286-1292 (2001)
6.Knappik,A. et al. Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides(モジュラー共通フレームワークとトリヌクレオチドでランダム化したCDRに基づく完全合成ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー(HuCAL)). J Mol Biol 296, 57-86 (2000)
7.Krebs,B. et al. High-throughput generation and engineering of recombinant human antibodies(組換えヒト抗体の高性能産生と遺伝子工学的調製). J Immunol Methods 254, 67-84 (2001)
8.Rauchenberger,R. et al. Human combinatorial Fab library yielding specific and functional antibodies against the human fibroblast growth factor receptor 3(ヒト線維芽細胞増殖因子受容体3に対する特異的機能的抗体を生じるヒトコンビナトリアルFabライブラリー). J Biol Chem 278, 38194-38205 (2003)
9.Knappik,A. et al. Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides(モジュラー共通フレームワークとトリヌクレオチドでランダム化したCDRに基づく完全合成ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー(HuCAL)). J Mol Biol 296, 57-86 (2000)
10.Lohning,C. Novel methods for displaying (poly)peptides/proteins on bacteriophage particles via disulfide bonds(ジスルフィド結合経由バクテリオファージ粒子上に(ポリ)ペプチド/タンパク質を表示する新規方法). (WO 01/05950). 2001.
文献タイプ: 特許
11.Krebs,B. et al. High-throughput generation and engineering of recombinant human antibodies(組換えヒト抗体の高性能産生と遺伝子工学的調製). J Immunol Methods 254, 67-84 (2001)
12.Nagy,Z.A. et al. Fully human, HLA-DR-specific monoclonal antibodies efficiently induce programmed death of malignant lymphoid cells(完全ヒトHLA−DR−特異的モノクローナル抗体は悪性リンパ系細胞のプログラムされた死を効率的に誘導する). Nat Med 8, 801-807 (2002)
13.Virnekas,B. et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis(トリヌクレオチドホスファーアミダイト:無作為突然変異誘発のための混合オリゴヌクレオチド合成用の理想的試薬). Nucleic Acids Res 22, 5600-5607 (1994)
14.Chen,Y. et al. Selection and analysis of an optimized anti-VEGF antibody: crystal structure of an affinity-matured Fab in complex with antigen(最適化抗−VEGF抗体の選択と分析:抗原との複合体における親和性成熟Fabの結晶構造). J Mol Biol 293, 865-881 (1999)
15.Schier,R. et al. Isolation of picomolar affinity anti-c-erbB-2 single-chain Fv by molecular evolution of the complementarity determining regions in the center of the antibody binding site(抗体結合部位中心における相補性決定領域の分子進化によるピコモル親和性抗−c−erbB−2一本鎖Fvの単離). J Mol Biol 263, 551-567 (1996)
16.Yang,W.P. et al. CDR walking mutagenesis for the affinity maturation of a potent human anti-HIV-1 antibody into the picomolar range(強力なヒト抗−HIV−1抗体のピコモル範囲への親和性成熟のためのCDRウオーキング突然変異誘発). J Mol Biol 254, 392-403 (1995)
17.Haenel,C., Satzger,M., Ducata,D.D., Ostendorp,R. & Brocks,B. Characterization of high-affinity antibodies by electrochemiluminescence-based equilibrium titration(電気化学発光に基づく平衡滴定による抗親和性抗体の特性化). Anal Biochem 339, 182-184 (2005)
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9.Knappik,A. et al. Fully synthetic human combinatorial antibody libraries (HuCAL) based on modular consensus frameworks and CDRs randomized with trinucleotides(モジュラー共通フレームワークとトリヌクレオチドでランダム化したCDRに基づく完全合成ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリー(HuCAL)). J Mol Biol 296, 57-86 (2000)
10.Lohning,C. Novel methods for displaying (poly)peptides/proteins on bacteriophage particles via disulfide bonds(ジスルフィド結合経由バクテリオファージ粒子上に(ポリ)ペプチド/タンパク質を表示する新規方法). (WO 01/05950). 2001.
文献タイプ: 特許
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13.Virnekas,B. et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis(トリヌクレオチドホスファーアミダイト:無作為突然変異誘発のための混合オリゴヌクレオチド合成用の理想的試薬). Nucleic Acids Res 22, 5600-5607 (1994)
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15.Schier,R. et al. Isolation of picomolar affinity anti-c-erbB-2 single-chain Fv by molecular evolution of the complementarity determining regions in the center of the antibody binding site(抗体結合部位中心における相補性決定領域の分子進化によるピコモル親和性抗−c−erbB−2一本鎖Fvの単離). J Mol Biol 263, 551-567 (1996)
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17.Haenel,C., Satzger,M., Ducata,D.D., Ostendorp,R. & Brocks,B. Characterization of high-affinity antibodies by electrochemiluminescence-based equilibrium titration(電気化学発光に基づく平衡滴定による抗親和性抗体の特性化). Anal Biochem 339, 182-184 (2005)
Claims (41)
- TSLPに特異的な抗原結合領域を含んでなる単離されたヒトもしくはヒト化抗体またはその機能的フラグメントであって、該抗体またはその機能的フラグメントがTSLPに結合するものである抗体またはその機能的フラグメント。
- 該抗体またはその機能的フラグメントが、1×10−9M以下のKDでTSLPに結合する請求項1記載の抗体またはその機能的フラグメント。
- 配列番号3のアミノ酸配列で描出されるH−CDR1領域、およびその保存的変異体を含んでなる抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域。
- 配列番号15、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群より選択されるアミノ酸配列で描出されるH−CDR2領域、およびその保存的変異体を含んでなる抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域。
- 配列番号28のアミノ酸配列で描出されるH−CDR3領域、およびその保存的変異体を含んでなる抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域。
- 配列番号3のアミノ酸配列で描出されるH−CDR1領域、配列番号15、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群より選択されるアミノ酸で描出されるH−CDR2領域、および配列番号28のアミノ酸配列で描出されるH−CDR3領域、およびその保存的変異体を含んでなる抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域。
- 配列番号38のアミノ酸配列で描出されるL−CDR1領域、およびその保存的変異体を含んでなる抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域。
- 配列番号47のアミノ酸配列で描出されるL−CDR2領域、およびその保存的変異体を含んでなる抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域。
- 配列番号60のアミノ酸配列で描出されるL−CDR3領域、およびその保存的変異体を含んでなる抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域。
- 配列番号38のアミノ酸配列で描出されるL−CDR1領域、配列番号47のアミノ酸配列で描出されるL−CDR2領域、および配列番号60のアミノ酸配列で描出されるL−CDR3領域、およびその保存的変異体を含んでなる抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域。
- 配列番号3のアミノ酸配列で描出されるH−CDR1領域、配列番号15、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群より選択されるアミノ酸配列で描出されるH−CDR2領域、配列番号28のアミノ酸配列で描出されるH−CDR3領域、配列番号38のアミノ酸配列で描出されるL−CDR1領域、配列番号47のアミノ酸配列で描出されるL−CDR2領域、および配列番号60のアミノ酸配列で描出されるL−CDR3領域、およびその保存的変異体を含んでなる抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域。
- H−CDR2領域が配列番号15、およびその保存的変異体である請求項11に記載の抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域。
- H−CDR2領域が配列番号17、およびその保存的変異体である請求項11に記載の抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域。
- H−CDR2領域が配列番号18、およびその保存的変異体である請求項11に記載の抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域。
- H−CDR2領域が配列番号19、およびその保存的変異体である請求項11に記載の抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域。
- H−CDR2領域が配列番号20、およびその保存的変異体である請求項11に記載の抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載のCDR領域と、CDR領域において少なくとも60、70、80、90または95%の配列同一性を有する配列を含んでなる抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗体またはその機能的フラグメントの単離された抗原結合領域を含んでなる単離されたヒトまたはヒト化TSLP抗体。
- IgG1、IgG2またはIgG4である請求項18記載の単離された抗体。
- 配列番号84、配列番号85および配列番号86から選択される重鎖可変領域、およびその保存的変異体を含んでなる請求項18または19記載の単離された抗体。
- 配列番号88の軽鎖可変領域を含んでなる請求項18〜20のいずれか1項に記載の単離された抗体。
- 重鎖可変領域が配列番号84、およびその保存的変異体である請求項18〜21のいずれか1項に記載の単離された抗体。
- 重鎖可変領域が配列番号85、およびその保存的変異体である請求項18〜21のいずれか1項に記載の単離された抗体。
- 重鎖可変領域が配列番号86、およびその保存的変異体である請求項18〜21のいずれか1項に記載の単離された抗体。
- 配列番号99または配列番号101から選択される軽鎖ラムダ配列、および配列番号103、配列番号105、配列番号107、配列番号109、配列番号111および配列番号113、およびその保存的変異体から選択される重鎖配列を有するIgG1である請求項18〜21のいずれか1項に記載の単離された抗体。
- 請求項1〜17のいずれか1項に記載の抗体もしくはその機能的フラグメントまたは請求項18〜25のいずれか1項に記載の単離された抗体の抗原結合領域を含んでなるポリペプチドをエンコードする単離されたもしくは組換えポリヌクレオチド。
- 抗体がヒトの抗体である請求項26記載のポリヌクレオチド。
- 該ポリヌクレオチドが、
(a)配列番号3、配列番号15、配列番号28のH−CDR;
配列番号38、配列番号47、配列番号60のL−CDR;
(b)配列番号3、配列番号17、配列番号28のH−CDR;
配列番号38、配列番号47、配列番号60のL−CDR;
(c)配列番号3、配列番号18、配列番号28のH−CDR;
配列番号38、配列番号47、配列番号60のL−CDR;
(d)配列番号3、配列番号19、配列番号28のH−CDR;
配列番号38、配列番号47、配列番号60のL−CDR;
(e)配列番号3、配列番号20、配列番号28のH−CDR;および
配列番号38、配列番号47、配列番号60のL−CDR;
から選択されるH−CDR1、H−CDR2およびH−CDR3の配列、およびL−CDR1、L−CDR2およびL−CDR3の配列を含んでなる抗体をエンコードする請求項26または請求項27に記載のポリヌクレオチド。 - 該抗体が、(i)成熟軽鎖可変領域配列および(ii)成熟重鎖可変領域配列を含んでなり、当該配列が、
(a)(i)配列番号101、(ii)配列番号105;
(b)(i)配列番号101、(ii)配列番号107;および
(c)(i)配列番号101、(ii)配列番号109;
から選択され、各配列が当該軽鎖および重鎖配列の成熟領域と少なくとも80%同一である請求項26〜28のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。 - 該抗体の成熟軽鎖可変領域配列および成熟重鎖可変領域配列が当該配列と同一である請求項29記載のポリヌクレオチド。
- DNAである請求項26〜30のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
- (1)請求項18〜25のいずれか1項に記載された抗体の重鎖をエンコードする組換えDNAセグメント、および(2)該抗体の軽鎖をエンコードする第二の組換えDNAセグメントを含んでなる単離された宿主細胞であって、当該DNAセグメントがそれぞれ作動可能なように第一および第二のプロモーターに結合しており、当該宿主細胞にて発現され得るものである宿主細胞。
- 該モノクローナル抗体がヒトの抗体である請求項32に記載の宿主細胞。
- 該モノクローナル抗体が、
(a)配列番号3、配列番号15、配列番号28のH−CDR;
配列番号38、配列番号47、配列番号60のL−CDR;
(b)配列番号3、配列番号17、配列番号28のH−CDR;
配列番号38、配列番号47、配列番号60のL−CDR;
(c)配列番号3、配列番号18、配列番号28のH−CDR;
配列番号38、配列番号47、配列番号60のL−CDR;
(d)配列番号3、配列番号19、配列番号28のH−CDR;
配列番号38、配列番号47、配列番号60のL−CDR;
(e)配列番号3、配列番号20、配列番号28のH−CDR;および
配列番号38、配列番号47、配列番号60のL−CDR;
から選択される重鎖および軽鎖の配列を含んでなる請求項32または請求項33に記載の宿主細胞。 - 該抗体が、(i)成熟軽鎖可変領域配列および(ii)成熟重鎖可変領域配列を含んでなり、当該配列が、
(a)(i)配列番号101、(ii)配列番号105;
(b)(i)配列番号101、(ii)配列番号107;および
(c)(i)配列番号101、(ii)配列番号109;
から選択され、各配列が当該軽鎖および重鎖配列の成熟領域と少なくとも80%同一である請求項32〜34のいずれか1項に記載の宿主細胞。 - 該モノクローナル抗体の成熟軽鎖可変領域配列および成熟重鎖可変領域配列が、当該配列と同一である請求項35記載の宿主細胞。
- 非ヒト哺乳動物細胞株である請求項32〜36のいずれか1項に記載の宿主細胞。
- 請求項18〜25のいずれか1項に記載の抗体またはその機能的フラグメントおよびそのための医薬的に許容される担体もしくは添加剤を含有してなる医薬組成物。
- 細胞受容体標的hTSLPの存在と関係する障害または症状の処置方法であって、処置を必要とする対象に請求項38記載の医薬組成物の有効量を投与することを特徴とする方法。
- 該障害または症状が喘息である請求項39記載の方法。
- 該障害または症状がアトピー性皮膚炎である請求項39記載の方法。
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