TW202337898A - 新穎的抗－ｔｓｌｐ抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明揭露內容提供了抗-TSLP抗體或其抗原結合片段、編碼所述抗-TSLP抗體或其抗原結合片段的分離的多核苷酸、包含所述抗-TSLP抗體或其抗原結合片段和所述分離的多核苷酸的藥物組合物及其用途。

Description

新型抗-TSLP抗體
本發明揭露內容一般地關於新型抗-TSLP抗體。
胸腺基質淋巴細胞生成素（TSLP）是屬細胞因子家族的蛋白。已知它在透過抗原呈現細胞活化的T細胞群體成熟中起重要作用。TSLP主要透過非造血細胞，如纖維母細胞、上皮細胞和不同類型的基質或基質-樣細胞產生。
TSLP是可以透過多種免疫細胞，包括DC細胞、CD4和CD8+ T細胞、B細胞、ILC2、感覺神經元、肥大細胞、嗜鹼性細胞、嗜酸性細胞和NKT細胞表面上的TSLP/IL-7Rα受體發揮生物學功能的多功能細胞因子。TSLP透過JAK/STAT（JAK激酶-訊息傳遞和轉錄活化因子）路徑傳遞訊息。TSLP結合至細胞膜上的TSLPR，然後結合至IL-7Rα以形成穩定的TSLP-TSLPR-IL7rα複合物。複合物中TSLPR受體的胞內節段招募並活化JAK2，其與透過IL7Rα招募的JAK1一起起作用以活化下游訊息分子。研究已表明在人周邊血液來源的CD11c+DC細胞中，TSLP可以活化STAT1、STAT3、STAT4、STAT5和STAT6，其中STAT5活化訊息是促進Th2細胞分化和分泌Th2因子的關鍵。
已知TSLP透過樹突狀細胞、肥大細胞和ILC2的活化控制2型炎症，這使其與II型炎性疾病的發生密切相關。
因此，阻斷TSLP訊息傳遞是治療哮喘、過敏性皮膚炎和與TSLP訊息傳遞有關的其它疾病的潛在有效策略。然而，TSLP-相關疾病具有高度未滿足的醫學需要。因此，仍需要新型抗-TSLP抗體。
在整個發明揭露內容中，冠詞「一個」」和「所述」在本文中用於表示一個或不止一個（即至少一個）所述冠詞的語法對象。舉例來說，「一個抗體」表示一個抗體或不止一個抗體。
在一個方面，本發明揭露內容提供了能夠特異性結合至人TSLP的抗體或其抗原-結合片段，其包括包含在SEQ ID NO：1或3所示的重鏈可變區序列的任一項內的重鏈互補決定區1（HCDR1）、HCDR2和HCDR3，和/或包含在SEQ ID NO：2或4所示的重鏈可變區序列的任一項內的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、LCDR2和LCDR3。
在一個方面，本發明揭露內容提供了能夠特異性結合至人TSLP的抗體或其抗原-結合片段，其包括重鏈互補決定區1（HCDR1）、HCDR2和HCDR3，其中（a）所述HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列；HCDR2包含IFPGDGX 1T（SEQ ID NO：59）所示的胺基酸序列；並且HCDR3包含ARX 2GX 3X 4X 5X 6X 7X 8YAMDY（SEQ ID NO：60）所示的胺基酸序列；其中，X 1是E或D；X 2是G或S；X 3是Y或F；X 4是V或D；X 5是N或Y；X 6是無或G；X 7是F或Y；X 8是L或F；或者（b）HCDR1包含SYWX 9N（SEQ ID NO：61）所示的胺基酸序列；HCDR2包含QIFPGDGX 10TX 11YNGX 12FKG（SEQ ID NO：62）所示的胺基酸序列；並且HCDR3包含X 13GX 14X 15X 16X 17X 18X 19YAMDY（SEQ ID NO：63）所示的胺基酸序列；其中，X 9為M或I；X 10為E或D；X 11為N或T；X 12為K或N；X 13為G或S；X 14為Y或F；X 15為V或D；X 16為N或Y；X 17為無或G；X 18為F或Y；X 19為L或F。
在一些實施方式中，所述抗體或其抗原-結合片段包括輕鏈互補決定區1（LCDR1）、LCDR2和LCDR3，其中（a）LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列；並且LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列；或者（b）LCDR1包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列；LCDR2包含GTSX 20LAS（SEQ ID NO：64）所示的胺基酸序列；並且LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列；其中，X 20為T或N。
在一些實施方式中，所述抗體或其抗原-結合片段包括重鏈可變區，其包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，和/或輕鏈可變區，其包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中（a）HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列；HCDR2包含IFPGDGX 1T（SEQ ID NO：59）所示的胺基酸序列；並且HCDR3包含ARX 2GX 3X 4X 5X 6X 7X 8YAMDY（SEQ ID NO：60）所示的胺基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列；並且LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列；其中X 1為E或D；X 2為G或S；X 3為Y或F；X 4為V或D；X 5為N或Y；X 6為無或G；X 7為F或Y；X 8為L或F；或者（b）HCDR1包含SYWX 9N（SEQ ID NO：61）所示的胺基酸序列；HCDR2包含QIFPGDGX 10TX 11YNGX 12FKG（SEQ ID NO：62）所示的胺基酸序列；並且HCDR3包含X 13GX 14X 15X 16X 17X 18X 19YAMDY（SEQ ID NO：63）所示的胺基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列；LCDR2包含GTSX 20LAS（SEQ ID NO：64）所示的胺基酸序列；並且LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列；其中X 9為M或I；X 10為E或D；X 11為N或T；X 12為K或N；X 13為G或S；X 14為Y或F；X 15為V或D；X 16為N或Y；X 17為無或G；X 18為F或Y；X 19為L或F；X 20為T或N。
在一些實施方式中，HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：12或25所示的胺基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：13或26所示的胺基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列並且LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，HCDR1包含SEQ ID NO：50或55所示的胺基酸序列，HCDR2包含SEQ ID NO：51或56所示的胺基酸序列，HCDR3包含SEQ ID NO：52或57所示的胺基酸序列，LCDR1包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO：54或58所示的胺基酸序列並且LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，（a）HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列；並且LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列；（b）HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列；並且LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列；（c）HCDR1包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：54所示的胺基酸序列；並且LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列；（d）HCDR1包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列；並且LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本文所提供的抗體或其抗原-結合片段還包含一個或多個重鏈框架區1（HFR1）、HFR2、HFR3和HFR4，和/或一個或多個輕鏈框架區1（LFR1）、LFR2、LFR3和LFR4，其中HFR1包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27或者X 21VQLVQSGAEVKKPGX 22SX 23KX 24SCKX 25S（SEQ ID NO：65）所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列，HFR2包含SEQ ID NO：18或WVRQX 27PGX 28GLEWMG（SEQ ID NO：66）所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列，HFR3包含SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28或X 31VTX 32X 33X 34DX 35SX 36STX 37YX 38X 39X 40SSLX 41X 42X 43DTAXYYC（SEQ ID NO：67）所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列，HFR4包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列，LFR1包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列，LFR2包含SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：30或WYQQKPGQSPRPWIX 45（SEQ ID NO：68）所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列，LFR3包含SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列，並且LFR4包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列，其中，X 21為E或Q；X 22為E、S或A；X 23為L或V；X 24為I或V；X 25為S或A；X 27為M或A；X 28為K或Q；X 31為Q或R；X 32為I或M；X 33為S或T；X 34為A或R；X 35為K或T；X 36為I或T；X 37為A或V；X 38為L或M；X 39為Q或E；X 40為W或L；X 41為K或R；X 42為A或S；X 43為S或E；X 44為M或V；X 45為Y或F。
在一些實施方式中，HFR1包含選自下列的序列：SEQ ID NO：17、27、32、40、42、47和87，HFR2包含選自下列的序列：SEQ ID NO：18、33、43和48，HFR3包含選自下列的序列：SEQ ID NO：19、28、34、41、44和49，HFR4包含以下序列：SEQ ID NO：20和35，LFR1包含以下序列：SEQ ID NO：21、29和36，LFR2包含選自下列的序列：SEQ ID NO：22、30、37和45、LFR3包含選自下列的序列：SEQ ID NO：23、31和38並且LFR4包含選自下列的序列：SEQ ID NO：24和39。
在一些實施方式中，（a）HFR1包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，HFR2包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，HFR3包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列，HFR4包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，LFR1包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列，LFR2包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列，LFR3包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，並且LFR4包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列；（b）HFR1包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列，HFR2包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列，HFR3包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，HFR4包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列，LFR1包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列，LFR2包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，LFR3包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，並且LFR4包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列；（c）HFR1包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，HFR2包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，HFR3包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列，HFR4包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列，LFR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，LFR2包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，LFR3包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，並且LFR4包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列；（d）HFR1包含SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列，HFR2包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，HFR3包含SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列，HFR4包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列，LFR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，LFR2包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列，LFR3包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，並且LFR4包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列；（e）HFR1包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列，HFR2包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列，HFR3包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列，HFR4包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列，LFR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，LFR2包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列，LFR3包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，並且LFR4包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列；（f）HFR1包含SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列，HFR2包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，HFR3包含SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列，HFR4包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列，LFR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，LFR2包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列，LFR3包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，並且LFR3包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列；（g）HFR1包含SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列，HFR2包含SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列，HFR3包含SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列，HFR4包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列，LFR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，LFR2包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列，LFR3包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，並且LFR4包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，本文所提供的抗體或其抗原-結合片段的重鏈可變區包括選自下列的序列：SEQ ID NO：1、3、5、7、8、10和86，及其具有至少80%序列同一性，但仍保留對人TSLP的特異性結合親和力的同源序列。
在一些實施方式中，本文所提供的抗體或其抗原-結合片段的輕鏈可變區包括選自下列的序列：SEQ ID NO：2、4、6和9，及其具有至少80%序列同一性，但仍保留對人TSLP的特異性結合親和力的同源序列。
在一些實施方式中，在本文所提供的抗體或其抗原-結合片段中，所述重鏈可變區包含以下序列：SEQ ID NO：1並且所述輕鏈可變區包含以下序列：SEQ ID NO：2；或所述重鏈可變區包含以下序列：SEQ ID NO：3並且所述輕鏈可變區包含以下序列：SEQ ID NO：4；或所述重鏈可變區包含以下序列：SEQ ID NO：5並且所述輕鏈可變區包含以下序列：SEQ ID NO：6；或所述重鏈可變區包含以下序列：SEQ ID NO：7並且所述輕鏈可變區包含以下序列：SEQ ID NO：6；或所述重鏈可變區包含以下序列：SEQ ID NO：86並且所述輕鏈可變區包含以下序列：SEQ ID NO：9；或所述重鏈可變區包含以下序列：SEQ ID NO：8並且所述輕鏈可變區包含以下序列：SEQ ID NO：9；或所述重鏈可變區包含以下序列：SEQ ID NO：10並且所述輕鏈可變區包含以下序列：SEQ ID NO：9。
在一些實施方式中，本文所提供的抗體或其抗原-結合片段還包含一個或多個胺基酸殘基替換或修飾，但保留了對人TSLP的特異性結合親和力。在一些實施方式中，所述替換或修飾中的至少一個處於一個或多個CDR序列中，和/或所述重鏈可變區或輕鏈可變區的一個或多個非CDR序列中。在一些實施方式中，所述替換中的至少一種是保守替換。
在一些實施方式中，本文所提供的抗體或其抗原-結合片段還包括Fc區，任選地人免疫球蛋白（Ig）的Fc區，或者任選地人IgG的Fc區。在一些實施方式中，所述Fc區來源於人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgM。在一些實施方式中，來源於人IgG4的Fc區包含S228P、F234A、L235A、M252Y、S254T、T256E或K447del（PAA-YTE）突變。在一些實施方式中，來源於人IgG1的Fc區包含一個或多個突變，其選自L234A、L235A、M252Y、S254T和T256E。在一些實施方式中，來源於人IgG1的Fc區包含L234A、L235A、M252Y、S254T和T256E（LALA-YTE）的突變。
在一些實施方式中，本文所提供的抗體或其抗原-結合片段還在重鏈可變區的N末端包含訊息肽和/或在輕鏈可變區的N末端包含訊息肽。
在一些實施方式中，本文所提供的抗體或其抗原-結合片段是人源化的。在一些實施方式中，本文所提供的抗體或其抗原-結合片段是單株抗體、雙重特異性抗體、多重特異性抗體、重組抗體、嵌合抗體、標記抗體、二價抗體、抗-個體基因型抗體或融合蛋白。
在一些實施方式中，本文所提供的抗體或其抗原-結合片段是雙鏈抗體、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段（dsFv）、(dsFv) 2、雙重特異性dsFv（dsFv-dsFv'）、二硫鍵穩定的雙鏈抗體（ds雙鏈抗體）、單鏈抗體分子（scFv）、scFv二聚體（二價雙鏈抗體）、多重特異性抗體、駱駝化單域抗體、奈米抗體、域抗體或二價域抗體。
在一些實施方式中，本文所提供的抗體或其抗原-結合片段具有選自下列的一種或多種性質：a）具有特異性結合至人TSLP的能力；b）具有阻斷TSLP與TSLPR之間結合的能力；c）具有阻斷TSLP與表現TSLPR和IL7R的細胞之間的結合的能力；d）具有抑制BaF3細胞的TSLP依賴性增殖的能力；e）具有抑制從PBMC的TSLP依賴性TARC分泌的能力；或者f）具有抑制表現TSLPR和IL7R的細胞中TSLP依賴性STAT5活化的能力。
在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段不特異性結合至猴、大鼠或小鼠的TSLP。
在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段特異性結合至長形式人TSLP並且不結合至短形式人TSLP；其中，所述長形式人TSLP具有如SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列，並且所述短形式人TSLP具有如SEQ ID NO：74所示的胺基酸序列。
在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段具有抑制表現人TSLPR的細胞的人TSLP依賴性增殖的能力。在一些實施方式中，所述細胞還表現人IL7R。
在一些實施方式中，所述抗體或其抗原-結合片段結合至不同於參考抗體所結合的表位，其中所述參考抗體的重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：77所示，並且所述參考抗體的輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：78所示。
在一些實施方式中，所述抗體或其抗原-結合片段連接至一個或多個共軛物部分。在一些實施方式中，所述共軛物部分包含用於檢測或分離的試劑，如清除-改進劑、化療劑、毒素、放射性同位素、鑭系、發光標記、螢光標記、酶-基質標記、DNA-烷化劑、局部異構酶抑制劑、微管蛋白-結合劑或者其它抗癌藥。
在另一個方面，本發明揭露內容提供了編碼本文所揭露的抗體或其抗原-結合片段的分離的多核苷酸。在另一個方面，本發明揭露內容提供了載體，其包含本文所揭露的分離的多核苷酸。在另一個方面，本發明揭露內容提供了宿主細胞，其包含本文所揭露的載體。
在另一個方面，本發明揭露內容提供了藥物組合物，其包含：（i）抗體或其抗原-結合片段或者編碼本文所揭露的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸；和（ii）一種或多種藥物可用的載體、稀釋劑、緩衝液或賦形劑。
在一些實施方式中，所述藥物組合物還包括其它治療劑。在一些實施方式中，所述其它治療劑是用於治療炎性疾病、自體免疫疾病和癌症的藥劑。在一些實施方式中，所述其它治療劑是靶向IL-33、IL-25、IL-4、IL-5、IL-4R或IL-13的藥劑。
在另一個方面，本發明揭露內容提供了表現本文所揭露的抗體或其抗原-結合片段的方法，其包括將本文所揭露的宿主細胞在表現本文所揭露的載體的條件下培養。
在另一個方面，本發明揭露內容提供了治療、預防或減輕受試者中TSLP-相關疾病或病症的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的能夠結合至具有如SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列的長形式人TSLP和TSLP的消化形式的抗體或其抗原-結合片段。
在另一個方面，本發明揭露內容提供了治療、預防或減輕受試者中TSLP-相關疾病或病症的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的本文所揭露的抗體或其抗原-結合片段，或者編碼所述抗體或其抗原結合片段的多核苷酸和/或藥物組合物。在一些實施方式中，所述疾病或病症與對照水平相比，與TSLPR介導的訊息傳遞的調控異常有關。在一些實施方式中，TSLP介導的訊息傳遞的調控異常包括透過磷酸化的STAT5活化的調控異常。在一些實施方式中，TSLP介導的訊息傳遞的調控異常包括表現TSLPR的細胞增殖的調控異常。
在一些實施方式中，所述疾病或病症選自炎性疾病、自體免疫疾病和癌症。
在一些實施方式中，所述疾病或病症選自：哮喘（包括嚴重哮喘）、特發性肺纖維化、異位性皮膚炎（AD）、過敏症結膜炎、過敏性鼻炎（AR）、Netherton症候群（NS）、嗜酸細胞性食管炎（EoE）、食物過敏、過敏性腹瀉、嗜酸細胞性胃腸炎、過敏性支氣管肺麯黴病（ABPA）、過敏性真菌性鼻竇炎、慢性瘙癢、癌症、類風濕性關節炎、慢性阻塞性肺病COPD、全身性硬化症、多發性硬化、瘢痕瘤、潰瘍性結腸炎、慢性鼻竇炎（CRS）、息肉病、慢性嗜酸細胞性肺炎、嗜酸細胞性支氣管炎、過敏性支氣管肺麯黴病、腹腔病、嗜酸細胞性胃腸炎、Churg-Strauss症候群、嗜酸細胞增多肌痛症候群、嗜酸性白細胞增多症候群、伴有多血管炎的嗜酸性肉芽腫病、嗜酸細胞性食管炎、炎症性腸病、纖維化病症、炎症性腸病、霍奇金淋巴瘤、全身性紅斑狼瘡。
在一些實施方式中，癌症選自：乳腺癌、胰癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌和B細胞急性淋巴母細胞性白血病。
在一些實施方式中，其中所述纖維化病症選自：全身性和局部硬皮病、瘢痕瘤和肥厚性瘢痕、間質性肺病（ILD）、特發性肺纖維化（IPF）、由慢性B肝或C肝感染產生的肝臟纖維化、輻射引起的纖維化和由創傷癒合產生的纖維化、動脈粥狀硬化、再狹窄、肺部炎症和纖維化、肝硬化、腎病、由疤痕組織產生的心臟病和眼部疾病，如黃斑變性和視網膜和玻璃體視網膜病、由化療藥物產生的纖維化以及損傷和灼傷。
在一些實施方式中，所述疾病或病症選自哮喘、息肉性鼻竇炎、COPD、蕁麻疹、EoE和異位性皮膚炎。
在另一個方面，本發明揭露內容提供了檢測樣品中TSLP的存在或量的方法，其包括將所述樣品與本文所揭露的抗體或其抗原-結合片段接觸，並確定所述樣品中TSLP的存在或量。在一些實施方式中，所述方法還包括確定TSLP是否在所述樣品中的細胞中過表現的步驟。
在另一個方面，本發明揭露內容提供了本文所揭露的抗體或其抗原-結合片段、藥物組合物和/或編碼所述抗體或其抗原結合片段的多核苷酸在生產用於治療、預防、減輕與TSLP有關的疾病或病症的藥劑中的用途。
在另一個方面，本發明揭露內容提供了嵌合抗原受體（CAR），其包含抗原結合結構域、跨膜結構域和TCR訊息傳遞結構域，其中所述抗原結合結構域特異性結合至TSLP並且包含本文所揭露內容的抗原結合片段。在另一個方面，本發明揭露內容提供了編碼本文所揭露的嵌合抗原受體（CAR）的核酸序列。在另一個方面，本發明揭露內容提供了細胞，其包含本文所揭露的核酸序列。在另一個方面，本發明揭露內容提供了載體，其包含本文所揭露的核酸序列。在另一個方面，本發明揭露內容提供了用於刺激對哺乳動物中TSLP-富集環境或組織的T細胞-介導的免疫反應的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效量的基因修飾以表現本文所揭露的CAR的細胞。
在另一個方面，本發明揭露內容提供了治療患有對TSLP抑制起反應的疾病或病症的哺乳動物的方法，其包括向所述哺乳動物施用有效量的本文所揭露的細胞，借此治療所述哺乳動物。在一些實施方式中，所述細胞是自體同源T細胞。在一些實施方式中，所述哺乳動物是人受試者。在一些實施方式中，將所述哺乳動物鑑別為具有TSLP陽性細胞，或者具有TSLP訊息傳遞上調的細胞。
以下對本發明揭露內容的描述僅旨在說明本發明揭露內容的多種實施方式。照此，所討論的具體修改不應被視為對本發明揭露內容範圍的限制。對於本領域中具有通常知識者顯而易見地，可以在不背離本發明揭露內容的範圍的情況下做出多種等價形式、改變或修改，並且應理解這些等價實施方式將包括在本文中。本文所引用的所有參考文獻，包括專利公開、專利和專利申請以其全部內容作為參考併入本文。
定義
如本文所使用的術語「抗體」包括結合至特異性抗原的任何免疫球蛋白、單株抗體、多株抗體、多價抗體、二價抗體、一價抗體、多重特異性抗體或者雙重特異性抗體。天然完整抗體包含兩條重鏈（H）和兩條輕鏈（L）。哺乳動物重鏈被分為α、δ、ε、γ和μ，每條重鏈由可變區（VH）和第一、第二、第三和任選地第四恆定區（分別為CH1、CH2、CH3、CH4）組成；哺乳動物輕鏈被分為λ或κ，而每條輕鏈由可變區（VL）和恆定區組成。抗體具有「Y」形狀，其中所述Y的莖由透過二硫鍵結合在一起的兩條重鏈的第二和第三恆定區組成。Y的每個臂包括結合至單一輕鏈的可變區和恆定區的單一重鏈的可變區和第一恆定區。輕鏈和重鏈的可變區導致抗原結合。兩條鏈中的可變區通常含有3個被稱為互補決定區（CDR）（輕鏈CDR，包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈CDR，包括HCDR1、HCDR2、HCDR3）的高變環。可以透過Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani（Al-Lazikani, B.,Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997)；Chothia, C.等人, J Mol Biol.Dec 5;186(3):651-63 (1985)；Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196,901 (1987)；Chothia, C.等人, Nature. Dec 21-28;342(6252):877-83 (1989)；Kabat E.A.等人, Sequences of Proteins of immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)；Marie-Paule Lefranc等人, Developmental and Comparative Immunology, 27: 55-77 (2003)；Marie-Paule Lefranc等人, Immunome Research, 1(3), (2005)；Marie-Paule Lefranc, Molecular Biology of B cells (第2版), 第26章, 481-514, (2015)）慣例定義或鑑定本文所揭露內容的抗體和抗原結合片段的CDR邊界。將3個CDR插入被稱為框架區（FR）（輕鏈FR，包括LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，重鏈FR，包括HFR1、HFR2、HFR3和HFR4）的側接延伸之間，其比CDR更高度保守並且形成骨架以支持高變環。重鏈和輕鏈的恆定區不參與抗原-結合，但是顯示出多種效應因子功能。基於它們的重鏈的恆定區的胺基酸序列，將抗體分成不同類型。抗體的5種主要類別或同種型為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特徵分別在於α、δ、ε、γ和μ重鏈的存在。幾種主要抗體類別被分成亞類，如IgG1（γ1重鏈）、IgG2（γ2重鏈）、IgG3（γ3重鏈）、IgG4（γ4重鏈）、IgA1（α1重鏈）或IgA2（α2重鏈）。
在某些實施方式中，本文所提供的抗體涵蓋了其任何抗原結合片段。如本文所使用的術語「抗原-結合片段」是指由包含一條或多條CDR的抗體部分所形成的抗體片段，或者結合至抗原但不包含完整天然抗體結構的任何其它抗體片段。抗原-結合片段的實例無限制地包括雙鏈抗體、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段（dsFv）、(dsFv) 2、雙重特異性dsFv（dsFv-dsFv'）、二硫鍵穩定的雙鏈抗體（ds雙鏈抗體）、單鏈抗體分子（scFv）、scFv二聚體（二價雙鏈抗體）、雙重特異性抗體、多重特異性抗體、駱駝化單域抗體、奈米抗體、域抗體和二價域抗體。抗原-結合片段能夠結合至親代抗體所結合的相同抗原。
對於抗體，「Fab」是指由透過二硫鍵結合至單一重鏈的可變區和第一恆定區的單一輕鏈（可變區和恆定區兩者）所組成的抗體的一部分。
「Fab」是指包括鉸鏈區的一部分的Fab片段。
「F(ab') 2」是指Fab'的二聚體。
對於抗體（例如，IgG、IgA或IgD同種型抗體），「Fc」是指由透過二硫鍵結合至第二重鏈的第二和第三恆定域的第一重鏈的第二和第三恆定域所組成的抗體的一部分。對於IgM和IgE同種型抗體，Fc還包括第四恆定域。所述抗體的Fc部分導致多種效應因子功能，如抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）和補體依賴性細胞毒性（CDC），但是不在抗原結合中起作用。
對於抗體，「Fv」是指具有完整抗原結合位點的抗體的最小片段。Fv片段由結合至單一重鏈的可變區的單一輕鏈的可變區組成。
「單鏈Fv抗體」或「scFv」是指由直接或透過肽連接子序列彼此連接的輕鏈可變區和重鏈可變區組成的工程化抗體（Huston JS等人 Proc Natl Acad Sci USA,85:5879(1988)）。
「單鏈Fv-Fc抗體」或者「scFv-Fc」是指由連接至抗體Fc區的scFv組成的工程化抗體。
「駱駝化單域抗體」、「重鏈抗體」或「HCAb」是指含有兩個V H域並且不含輕鏈的抗體（Riechmann L. and Muyldermans S., J Immunol Methods.Dec 10; 231(1-2):25-38 (1999)；Muyldermans S., J Biotechnol.Jun;74(4):277-302 (2001)；WO94/04678；WO94/25591；美國專利No. 6,005,079）。重鏈抗體最初來源於駱駝屬（ Camelidae）（駱駝、單峰駝和美洲駝）。儘管缺少輕鏈，但是駱駝化抗體具有可信的抗原-結合組庫（Hamers-Casterman C.等人, Nature. Jun 3; 363(6428):446-8 (1993)；Nguyen VK.等人 Immunogenetics. Apr;54(1):39-47 (2002)；Nguyen VK.等人 Immunology. May; 109(1):93-101 (2003)）。重鏈抗體的可變域（VHH結構域）代表了透過適應性免疫反應所產生的最小已知的抗原-結合單元（Koch-Nolte F.等人, FASEB J.Nov; 21(13):3490-8. Epub 2007 Jun 15 (2007)）。
「奈米抗體」是指由來自重鏈抗體的VHH結構域和兩個恆定域CH2和CH3組成的抗體片段。
「雙鏈抗體」或「dAb」包括具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，其中所述片段包含在相同多肽鏈中連接至V L域的V H域（V H-V L或V L-V H）（參見，例如，Holliger P.等人, Proc Natl Acad Sci USA. Jul 15;90(14):6444-8 (1993)；EP404097；WO93/11161）。透過使用過短從而不允許在相同鏈上的兩個結構域之間配對的連接子，所述結構域不得不與另一條鏈的互補結構域配對，借此產生了兩個抗原結合位點。所述抗原結合位點可以靶向相同或不同抗原（或表位）。在某些實施方式中，「雙重特異性ds雙鏈抗體」是靶向兩個不同抗原（或表位）的雙鏈抗體。
「域抗體」是指僅含重鏈可變區或輕鏈可變區的抗體片段。在某些情況下，透過肽連接子將兩個或更多個V H域共價連接以產生二價或多價域抗體。二價域抗體的兩個V H域可以靶向相同或不同的抗原。
如本文所使用的術語「價」是指給定分子中指定數目的抗原結合位點的存在。術語「單價」是指僅具有一個單一抗原結合位點的抗體或抗原-結合片段；並且術語「多價」是指具有多個抗原結合位點的抗體或抗原-結合片段。照此，術語「二價」、「四價」和「六價」分別表示在抗原-結合分子中2個結合位點、4個結合位點和6個結合位點的存在。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段是二價的。
如本文所使用的，「雙重特異性」抗體是指具有來源於兩個不同的單株抗體的片段並且能夠結合至兩個不同的表位的人工抗體。兩個表位可以存在於相同抗原上，或者它們可以存在於兩個不同抗原上。
在某些實施方式中，「scFv二聚體」是包含（透過肽連接子）與另一個V H-V L部分二聚化的V H-V L，從而一個部分的V H與其它部分的V L配合並且形成可以靶向相同抗原（或表位）或不同抗原（或表位）的兩個結合位點的二價雙鏈抗體或雙重特異性scFv（BsFv）。在其它實施方式中，「scFv二聚體」是包含與V L1-V H2（也透過肽連接子連接）結合的V H1-V L2（透過肽連接子連接），從而V H1和V L1配合並且V H2和V L2配合，並且每個配合對具有不同的抗原特異性的雙重特異性雙鏈抗體。
「dsFv」是指單一輕鏈的可變區與單一重鏈的可變區之間的鍵是二硫鍵的二硫鍵-穩定的Fv片段。在一些實施方式中，「(dsFv) 2」或「（dsFv-dsFv'）」包含3條肽鏈：透過肽連接子（例如，長柔性連接子）連接並且分別透過二硫橋鍵結合至兩個V L部分的兩個V H部分。在一些實施方式中，dsFv-dsFv'是雙重特異性的，其中每個二硫鍵配對的重鏈和輕鏈具有不同的抗原特異性。
如本文所使用的，術語「嵌合的」表示具有來源於一個物種的重鏈和/或輕鏈部分並且其餘的重鏈和/或輕鏈來源於不同物種的抗體或抗原-結合片段。在說明性的實例中，嵌合抗體可以包含來源於人的恆定區和來自非人動物，如來自小鼠的可變區。在一些實施方式中，所述非人動物是哺乳動物，例如，小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豚鼠或倉鼠。
如本文所使用的術語「人源化的」表示所述抗體或抗原-結合片段包含來源於非人動物的CDR、來源於人的FR區，並且當適用時，來源於人的恆定區。
如本文所使用的術語「親和力」是指免疫球蛋白分子（即抗體）或其片段與抗原之間的非-共價相互作用的強度。
如本文所使用的術語「特異性的結合」或「特異性結合」是指兩個分子之間，如（例如）抗體與抗原之間的非隨機結合反應。特異性的結合的特徵可以在於結合親和力，例如，由K D值所表示的結合親和力，即當抗原與抗原-結合分子之間的結合達到平衡時，解離速率與結合速率（k off/k on）之比。可以透過使用本領域中已知的任何常規方法確定K D，其包括（但不限於）表面等離子共振法、微量熱泳動法、HPLC-MS法和流式細胞（如FACS）法。K D值≤10 -6M（例如，≤5×10 -7M、≤2×10 -7M、≤10 -7M、≤5×10 -8M、≤2×10 -8M、≤10 -8M、≤5×10 -9M、≤4×10 -9M、≤3×10 -9M、≤2×10 -9M或≤10 -9M）可以表示抗體或其抗原結合片段與TSLP（例如，人TSLP）之間的特異性結合。
如本文所使用的「競爭與人TSLP結合」的能力是指任何可檢測的程度的第一抗體或抗原-結合片段抑制人TSLP和第二抗-TSLP抗體之間的結合相互作用的能力。在某些實施方式中，競爭對人TSLP的結合的抗體或抗原-結合片段將人TSLP與第二抗-TSLP抗體之間的結合相互作用抑制了至少85%，或者至少90%。在某些實施方式中，這種抑制可以大於95%，或者大於99%。
如本文所使用的術語「表位」是指抗體所結合的抗原上的原子或胺基酸的特定的組。如果它們對所述抗原顯示出競爭性結合，則兩個抗體可以結合抗原內相同或密切相關的表位。表位可以是直鏈或構象的（即包括間隔開的胺基酸殘基）。例如，如果抗體或抗原-結合片段將參考抗體與抗原的結合阻斷至少85%，或至少90%，或至少95%，則可以認為所述抗體或抗原-結合片段結合與參考抗體相同/密切相關的表位。
如本文所使用的術語「胺基酸」是指含有胺（-NH 2）和羧基（-COOH）官能團以及對每種胺基酸特異的側鏈的有機化合物。在本發明揭露內容中，還作為標準單字母或3-字母代碼表示胺基酸的名稱，其總結如下。
胺基酸名稱 3- 字母代碼 單字母代碼
丙胺酸 Ala A
精胺酸 Arg R
天門冬醯胺 Asn N
天門冬胺酸 Asp D
半胱胺酸 Cys C
麩胺酸 Glu E
麩醯胺酸 Gln Q
甘胺酸 Gly G
組胺酸 His H
異白胺酸 Ile I
白胺酸 Leu L
賴胺酸 Lys K
甲硫胺酸 Met M
苯丙胺酸 Phe F
脯胺酸 Pro P
絲胺酸 Ser S
蘇胺酸 Thr T
色胺酸 Trp W
酪胺酸 Tyr Y
纈胺酸 Val V
對於胺基酸序列，「保守替換」是指用具有生理化學性質類似的側鏈的不同的胺基酸殘基替換胺基酸殘基。例如，可以在具有疏水性側鏈的胺基酸殘基（例如，Met、Ala、Val、Leu和Ile）中、在具有中性親水性側鏈的胺基酸殘基（例如，Cys、Ser、Thr、Asn和Gln）中、在具有酸性側鏈的胺基酸殘基（例如，Asp、Glu）中、在具有鹼性側鏈的胺基酸殘基（例如，His、Lys和Arg）中或者在具有芳族側鏈的胺基酸殘基（例如，Trp、Tyr和Phe）中進行保守性替換。如本領域中已知的，保守替換通常不引起蛋白構象結構顯著變化，並因此可以保留蛋白的生物活性。
如本文所使用的術語「同源的」是指當最優比對時，與另一條序列具有至少60%（例如，至少65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）的序列同一性的核酸序列（或其互補鏈）或者胺基酸序列。
對於胺基酸序列（或核酸序列），將「序列同一性百分比（%）」定義為在序列比對，並且如有必要，引入空位以實現最大數目的相同胺基酸（或核酸）後，與參考序列中的胺基酸（或核酸）殘基相同的候選序列中的胺基酸（或核酸）殘基的百分比。換言之，可以透過將相對於它所比較的參考序列相同的胺基酸殘基（或鹼基）的數目除以候選序列或參考序列中胺基酸殘基（或鹼基）的數目（以較短者為準）來計算胺基酸序列（或核酸序列）的序列同一性百分比（%）。胺基酸殘基的保守替換可以或可以不被認為是相同殘基。出於確定胺基酸（或核酸）序列同一性百分比的目的，可以（例如）使用揭露內容可獲得的工具實現比對，如BLASTN、BLASTp（在美國國家生物技術資訊中心（NCBI）的網址上可獲得，另外參見，Altschul S.F.等人, J. Mol. Biol., 215:403–410 (1990)；Stephen F.等人, Nucleic Acids Res., 25:3389–3402 (1997)）、ClustalW2（在歐洲生物資訊學研究所的網址上可獲得，還參見，Higgins D.G.等人, Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996)；Larkin M.A.等人, Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007)）和ALIGN或Megalign（DNASTAR）軟體。本領域中具有通常知識者可以使用所述工具所提供的預設參數，或者可以根據情況對比對自定義參數，如（例如）透過選擇適合的算法。
如本文所使用的「效應因子功能」是指可歸因於抗體的Fc區對其效應因子，如C1複合物和Fc受體的結合的生物學活性。示例性的效應因子功能包括透過抗體和C1複合物上的C1q的相互作用介導的補體依賴性細胞毒性（CDC）；透過抗體的Fc區對效應細胞上的Fc受體的結合所介導的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）；和吞噬。可以使用多種測定，如Fc受體結合測定、C1q結合測定和細胞胞溶測定評價效應因子功能。
已透過人從天然狀態改變「分離的」物質。如果「分離的」組合物或物質天然存在，則它已從其原始環境改變或除去或兩者。例如，天然存在於活的動物中的多核苷酸或多肽不是「分離的」，但是如果它已與其天然狀態的共存材料充分分離從而以基本純的狀態存在，則相同的多核苷酸或多肽是「分離的」。「分離的核酸序列」是指分離的核酸分子序列。在某些實施方式中，「分離的抗體或其抗原-結合片段」是指如透過電泳（如SDS-PAGE、等電點聚焦、毛細管電泳）或者色層分析法（如離子交換色層分析法或反相HPLC）所確定的，純度為至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的抗體或其抗原結合片段。
如本文所使用的術語「載體」是指其中可以可操作性地插入遺傳元件以導致該遺傳元件表現，從而產生所述遺傳元件所編碼的蛋白、RNA或DNA或者複製所述遺傳元件的媒介物。載體可以用於轉化、傳遞或轉染宿主細胞以導致它在宿主細胞內所具有的遺傳元件的表現。載體的實例包括質體、噬菌體、黏接質體、人工染色體，如酵母人工染色體（YAC）、細菌人工染色體（BAC）或P1-來源的人工染色體（PAC）、噬菌體，如λ噬菌體或M13噬菌體，和動物病毒。載體可以含有用於控制表現的多種元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、可選擇元件和報告基因。另外，所述載體可以含有複製起點。載體還可以包括幫助其進入細胞的材料，其包括（但不限於）病毒顆粒、脂質體或蛋白塗層。載體可以是表現載體或轉殖載體。本發明揭露內容提供了含有編碼抗體或其抗原-結合片段的本文所提供的核酸序列、可操作性地連接至所述核酸序列的至少一種啟動子（例如，SV40、CMV、EF-1α）和至少一種選擇標記物的載體（例如，表現載體）。
如本文所使用的短語「宿主細胞」是指其中可以或已引入外源多核苷酸和/或載體的細胞。
術語「受試者」包括人和非人動物。非人動物包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類動物、小鼠、大鼠、貓、兔、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除了指出時以外，術語「患者」或「受試者」在本文中可互換使用。
如本文所使用的疾病、病症或病況的「治療（Treating）」或「治療（treatment）」包括預防或減輕疾病、病症或病況、減緩疾病、病症或病況的發病或發展速度、降低出現疾病、病症或病況的風險、預防或延遲與疾病、病症或病況有關的症狀的發展、降低或終止與疾病、病症或病況有關的症狀、產生疾病、病症或病況的完全或部分消退、治癒疾病、病症或病況或其一些組合
術語「診斷」是指病理狀態、疾病或病況的鑑定，如TSLP相關疾病的鑑定，或者表示可以受益於特定治療方案的患有TSLP相關疾病的受試者的鑑定。其中，TSLP相關疾病是指對TSLP抑制起反應的疾病或病症。在一些實施方式中，診斷包含異常量或活性的TSLP的鑑定。在一些實施方式中，診斷是指受試者中炎性疾病、自體免疫疾病或癌症的鑑定。
如本文所使用的，術語「生物樣品」或「樣品」是指從所關心的受試者獲得或來源的含有（例如）基於物理、生物化學、化學和/或生理特徵鑑定和/或鑑別的細胞和/或其它分子實體的生物學組合物。生物樣品包括（但不限於）透過本領域中具有通常知識者已知的任何方法獲得的受試者的細胞、組織、器官和/或生物流體。在一些實施方式中，所述生物樣品是流體樣品。在一些實施方式中，流體樣品是全血、血漿、血清、黏液（包括鼻涕和痰）、腹膜液、胸膜液、胸液、唾液、尿液、關節液、腦脊髓液（CSF）、胸腔穿刺術流體、腹液、腹水或心包液。在一些實施方式中，所述生物樣品是得自受試者的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、皮膚或血管的組織或細胞。
如本文所使用的，「TSLP」是指胸腺基質淋巴細胞生成素，它是屬細胞因子家族的蛋白並且已知透過樹突狀細胞、肥大細胞和ILC2的活化參與2型炎症。TSLP透過由胸腺基質淋巴細胞生成素受體CRLF2和IL-7Rα鏈組成的雜二聚體受體複合物訊息傳遞。在TSLP結合至所述雜二聚體受體複合物後，誘導STAT5磷酸化，從而導致上游轉錄因子表現。
TSLP結合至由IL-7受體α-鏈（IL-7Rα）和TSLPR鏈組成的雜二聚體受體，它與常見的受體γ鏈（γc）密切相關，以對廣泛細胞類型發揮其生物活性。單獨的TSLPR對TSLP具有低親和力，但是TSLPR與IL-7Rα的結合產生了TSLP的高親和力結合位點並引發訊息傳遞。在一些實施方式中，人IL7Ra和人胸腺基質淋巴細胞生成素受體（TSLPR）的融合蛋白可以用於引發TSLP訊息傳遞。在一些實施方式中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：70中所示胺基酸序列。
huIL7Ra-huTSLPR融合蛋白的胺基酸序列（SEQ ID NO：70）：
MGWSCIILFLVATATGVHSESGYAQNGDLEDAELDDYSFSCYSQLEVNGSQHSLTCAFEDPDVNITNLEFEICGALVEVKCLNFRKLQEIYFIETKKFLLIGKSNICVKVGEKSLTCKKIDLTTIVKPEAPFDLSVVYREGANDFVVTFNTSHLQKKYVKVLMHDVAYRQEKDENKWTHVNLSSTKLTLLQRKLQPAAMYEIKVRSIPDHYFKGFWSEWSPSYYFRTPEINNSSGEMDGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSQGGAAEGVQIQIIYFNLETVQVTWNASKYSRTNLTFHYRFNGDEAYDQCTNYLLQEGHTSGCLLDAEQRDDILYFSIRNGTHPVFTASRWMVYYLKPSSPKHVRFSWHQDAVTVTCSDLSYGDLLYEVQYRSPFDTEWQSKQENTCNVTIEGLDAEKCYSFWVRVKAMEDVYGPDTYPSDWSEVTCWQRGEIRDACAETPTPPKPKLSK
人IL-7Rα具有SEQ ID NO：71中所示胺基酸序列。
人IL-7Rα蛋白的胺基酸序列（SEQ ID NO：71）：
MTILGTTFGMVFSLLQVVSGESGYAQNGDLEDAELDDYSFSCYSQLEVNGSQHSLTCAFEDPDVNITNLEFEICGALVEVKCLNFRKLQEIYFIETKKFLLIGKSNICVKVGEKSLTCKKIDLTTIVKPEAPFDLSVVYREGANDFVVTFNTSHLQKKYVKVLMHDVAYRQEKDENKWTHVNLSSTKLTLLQRKLQPAAMYEIKVRSIPDHYFKGFWSEWSPSYYFRTPEINNSSGEMDPILLTISILSFFSVALLVILACVLWKKRIKPIVWPSLPDHKKTLEHLCKKPRKNLNVSFNPESFLDCQIHRVDDIQARDEVEGFLQDTFPQQLEESEKQRLGGDVQSPNCPSEDVVITPESFGRDSSLTCLAGNVSACDAPILSSSRSLDCRESGKNGPHVYQDLLLSLGTTNSTLPPPFSLQSGILTLNPVAQGQPILTSLGSNQEEAYVTMSSFYQNQ
人TSLPR包含SEQ ID NO：72中所示胺基酸序列。
人TSLPR的胺基酸序列（SEQ ID NO：72）：
MGRLVLLWGAAVFLLGGWMALGQGGAAEGVQIQIIYFNLETVQVTWNASKYSRTNLTFHYRFNGDEAYDQCTNYLLQEGHTSGCLLDAEQRDDILYFSIRNGTHPVFTASRWMVYYLKPSSPKHVRFSWHQDAVTVTCSDLSYGDLLYEVQYRSPFDTEWQSKQENTCNVTIEGLDAEKCYSFWVRVKAMEDVYGPDTYPSDWSEVTCWQRGEIRDACAETPTPPKPKLSKFILISSLAILLMVSLLLLSLWKLWRVKKFLIPSVPDPKSIFPGLFEIHQGNFQEWITDTQNVAHLHKMAGAEQESGPEEPLVVQLAKTEAESPRMLDPQTEEKEASGGSLQLPHQPLQGGDVVTIGGFTFVMNDRSYVAL
已在小鼠中描述存在兩個TSLP同工型，短同工型和長同工型，但是這種變化的功能性後果是不清楚的。在人中，在穩態條件期間表現的主要同工型是TSLP的短形式，而在炎性病況中TSLP長形式上調。
在一些實施方式中，本文所揭露內容的抗體或抗原-結合片段結合至長形式TSLP但是不結合至短形式TSLP。在一些實施方式中，本文所揭露內容的抗體或抗原-結合片段特異性結合的TSLP是TSLP的消化形式。在一些實施方式中，與現有抗體（如AMG 157）相比，本文所揭露內容的抗體或抗原-結合片段更有效地結合至TSLP的消化形式。
在一些實施方式中，長形式TSLP包含全長TSLP的位置29至159的胺基酸殘基，而短形式TSLP包含全長TSLP的位置97到159的胺基酸殘基。在一些實施方式中，在NCBI登錄號NP_149024.1（SD.hTSLP，即SEQ ID NO：85）的序列中顯示全長TSLP的胺基酸序列。
MFPFALLYVLSVSFRKIFILQLVGLVLTYDFTNCDFEKIKAAYLSTISKDLITYMSGTKSTEFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQINATQAMKKRRKRKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQ（SEQ ID NO：85）
天然全長或長形式人TSLP蛋白易於被酶促切割，例如，透過PCSK3酶。PCSK3酶可以特異性靶向長形式TSLP蛋白的位置127至130並且在位置130和130之間的位點截短蛋白，其中所述胺基酸編號根據全長人TSLP蛋白的序列。為了防止這種酶促切割並以其長形式穩定TSLP，可以將某些突變引入酶促切割位點（如R127和R130）。因此，在本發明揭露內容中，對長形式TSLP的提及應被理解為涵蓋了天然長形式TSLP以及突變和穩定的長形式TSLP，例如，具有R127A和R130A突變（例如，SEQ ID NO：73）或者具有R127A和R130S突變（例如，SEQ ID NO：80中的TSLP序列）的突變的TSLP。在一些實施方式中，長形式TSLP包括SEQ ID NO：73中所示胺基酸序列。在一些實施方式中，短形式TSLP包括SEQ ID NO：74中所示胺基酸序列。
長形式TSLP的胺基酸序列（SEQ ID NO：73）：
YDFTNCDFEKIKAAYLSTISKDLITYMSGTKSTEFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQINATQAMKKARKAKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQ
短形式TSLP的胺基酸序列（SEQ ID NO：74）：
MFAMKTKAALAIWCPGYSETQINATQAMKKARKAKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQ
如本文所使用的術語「TSLP的消化形式」是指長形式TSLP的酶促消化產物。在一些實施方式中，透過PCSK3酶對野生型長形式人TSLP蛋白的消化，可以獲得TSLP的消化形式。在一些實施方式中，PCSK3酶特異性靶向長形式TSLP蛋白的位置127至130並且在位置130和130之間的位點截短蛋白，其中所述胺基酸編號根據全長人TSLP蛋白的序列。在一些實施方式中，TSLP消化形式包含含有全長TSLP位置29至124的胺基酸殘基的TSLP片段和/或含有全長TSLP位置131至159的胺基酸殘基的TSLP片段。在一些實施方式中，TSLP片段還包含C末端區域的His-標記。在一些實施方式中，TSLP的消化形式作為雜二聚形式存在，其中兩個異源單體透過二硫鍵連接。在本領域中已知與正常生理條件相比，TSLP消化形式，特別是作為雜二聚形式存在的TSLP的表現量在炎症生理條件下顯著更高。
術語「抗-TSLP抗體」是指能夠特異性結合至長形式TSLP（例如，人長形式TSLP）的抗體。在某些實施方式中，抗-TSLP抗體還能夠特異性結合至TSLP的消化產物。術語「抗-人TSLP抗體」是指能夠特異性結合至人TSLP或人TSLP的消化形式的抗體。
「TSLP相關」疾病、病症或病況是指由長形式TSLP的表現或活性升高或降低所引起的，加劇的或另外與之有關的任何疾病或病況。在一些實施方式中，TSLP-相關疾病或病症是對長形式TSLP抑制起反應的疾病或病症。
在一些實施方式中，TSLP相關疾病、病症或病況與相比於對照水平，長形式TSLP介導的訊息傳遞的調控異常有關。在一些實施方式中，長形式TSLP介導的訊息傳遞的調控異常包括透過磷酸化的STAT5活化的調控異常。在一些實施方式中，長形式TSLP介導的訊息傳遞的調控異常包括表現TSLPR的細胞增殖的調控異常。在一些實施方式中，所述對照水平是健康個體中的水平。
在一些實施方式中，TSLP相關疾病、病症或病況是免疫相關病症，如（例如）自體免疫疾病。在一些實施方式中，TSLP相關疾病、病症或病況是與過量細胞增殖有關的病症，如（例如）癌症。在某些實施方式中，TSLP相關疾病或病況的特徵在於TSLP基因的表現或過表現。在某些實施方式中，TSLP相關疾病或病況的特徵在於TSLP的過表現和/或TSLP介導的訊息傳遞的調控異常。
術語「藥物可用的」表示所指明的載體、媒介物、稀釋劑、賦形劑和/或鹽通常與包含所述製劑的其它成分化學和/或物理相同，並且與其受體生理學相容。
如本文所使用的術語「TSLP-陽性細胞」是指相對於對照細胞，顯示出TSLP的異常表現量的細胞。異常表現量可以是相對於對照細胞水平上調或下調，並且可以與TSLP介導的訊息傳遞的調控異常相關。對照細胞可以是正常或健康對應細胞，其可以或可以不表現TSLP。在對照細胞表現TSLP的情況下，TSLP-陽性細胞的異常表現量可以是上調或下調。在對照細胞不表現TSLP的情況下，TSLP-陽性細胞的異常表現量可以上調。
抗 -TSLP 抗體
本發明揭露內容提供了抗-TSLP抗體及其抗原結合片段。本文所提供的抗-TSLP抗體和抗原結合片段能夠特異性結合至長形式TSLP。
在某些實施方式中，本文所提供的抗體及其抗原結合片段以透過表面等離子體共振（SPR）測定的下列K D值特異性結合至人TSLP（即長形式TSLP）：不大於10 -7M、不大於8×10 -8M、不大於5×10 -8M、不大於2×10 -8M、不大於8×10 -9M、不大於5×10 -9M、不大於2×10 -9M、不大於10 -9M、不大於8×10 -10M、不大於7×10 -10M或不大於6×10 -10M，參見，例如，Murphy, M.等人, Current protocols in protein science, 第19章, 第19.14單元, 2006。
也可以透過「半最大有效濃度」（EC 50）值表示本文所提供的抗體或其抗原結合片段與人TSLP的結合，其是指觀察到其最大結合的50%時的抗體濃度。可以透過本領域中已知的結合測定，例如，直接或間接結合測定，如酶聯免疫吸附測定（ELISA）、流式細胞術測定和其它結合測定測量EC 50值。
在某些實施方式中，本文所提供的抗體及其抗原結合片段對食蟹猴、大鼠或小鼠TSLP未顯示出可檢測的結合，或者對食蟹猴、大鼠或小鼠TSLP顯示出與相同測定條件下陰性對照抗體相當的水平。另外，陰性對照抗體可以是已知不結合至食蟹猴、大鼠或小鼠TSLP的任何抗體。
在某些實施方式中，本文所提供的抗體及其抗原結合片段能夠阻斷TSLP促效劑（如包含TSLP和IL-7Rα的融合蛋白）所誘導的TSLP訊息傳遞，如透過TSLP報告分子測定所測量的。
在某些實施方式中，TSLP報告分子測定是測量STAT5活化水平的測定。在某些實施方式中，TSLP報告分子測定是測量TARC分泌的測定。在某些實施方式中，TSLP報告分子測定是測量TSLP依賴性BaF3增殖的測定。
在某些實施方式中，本文所提供的抗體或其抗原結合片段以高於對照抗體（如AMG157）的結合親和力特異性結合至TSLP的消化形式。在一些實施方式中，本文所提供的抗體或其抗原結合片段對TSLP消化形式的結合親和力比AMG157高至少100%（例如，高至少150%、高200%、高300%、高400%、高500%、高600%、高700%、高800%、高900%等）。可以透過本領域中具有通常知識者熟知的傳統方法測量結合親和力，如免疫印跡、ELISA結合測定、螢光活化細胞分選術（FACS）測定、生物膜干涉測量法（BLI）測定、表面等離子共振（SPR）測定等。
說明性抗 -TSLP 抗體
在某些實施方式中，本發明揭露內容提供了抗-TSLP抗體（例如，抗-人TSLP抗體）及其抗原結合片段，其包含一個或多個（例如，1、2或3個）HCDR，所述HCDR包含選自下列的序列SEQ ID NO：11、IFPGDGX 1T（SEQ ID NO：59）和ARX 2GX 3X 4X 5X 6X 7X 8YAMDY（SEQ ID NO：60）；其中，X 1是E或D；X 2是G或S；X 3是Y或F；X 4是V或D；X 5是N或Y；X 6是無或G；X 7是F或Y；X 8是L或F；或者選自：SYWX 9N（SEQ ID NO：61）、QIFPGDGX 10TX 11YNGX 12FKG（SEQ ID NO：62）和X 13GX 14X 15X 16X 17X 18X 19YAMDY（SEQ ID NO：63）；其中，X 9為M或I；X 10為E或D；X 11為N或T；X 12為K或N；X 13為G或S；X 14為Y或F；X 15為V或D；X 16為N或Y；X 17為無或G；X 18為F或Y；X 19為L或F。在某些實施方式中，本發明揭露內容還涵蓋了對本文中的任何序列具有不超過1、2或3個胺基酸殘基替換的抗體及其抗原結合片段。
在某些實施方式中，本發明揭露內容提供了抗-TSLP抗體（例如，抗-人TSLP抗體）及其抗原結合片段，其包含一個或多個（例如，1、2或3個）LCDR，所述LCDR包含選自下列的序列：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16；或者選自：SEQ ID NO：53、GTSX 20LAS（SEQ ID NO：64）和SEQ ID NO：16；其中，X 20為T或N。在某些實施方式中，本發明揭露內容還涵蓋了對本文中的任何序列具有不超過1、2或3個胺基酸殘基替換的抗體及其抗原結合片段。
如本文所使用的抗體「39H11」是指包含具有SEQ ID NO：1所示的序列的重鏈可變區，和具有SEQ ID NO：2所示的序列的輕鏈可變區的單株抗體。
如本文所使用的抗體「35G12」是指包含具有SEQ ID NO：3所示的序列的重鏈可變區，和具有SEQ ID NO：4所示的序列的輕鏈可變區的單株抗體。
在一個方面，本發明揭露內容提供了能夠特異性結合至人TSLP的抗體或其抗原-結合片段，其包括包含在SEQ ID NO：1或3所示的重鏈可變區序列的任一項內的重鏈互補決定區1（HCDR1）、HCDR2和HCDR3，和/或包含在SEQ ID NO：2或4所示的重鏈可變區序列的任一項內的輕鏈互補決定區1（LCDR1）、LCDR2和LCDR3。
在某些實施方式中，本發明揭露內容提供了抗-TSLP抗體及其抗原結合片段，其包括包含SEQ ID NO：11所示的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：12或25所示的序列的HCDR2，和包含所述SEQ ID NO：13或26所示的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO：14所示的序列的LCDR1，包含SEQ ID NO：15所示的序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO：16所示的序列的LCDR3。
在某些實施方式中，本發明揭露內容提供了抗-TSLP抗體及其抗原結合片段，其包括包含SEQ ID NO：11所示的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：12所示的序列的HCDR2，包含所述SEQ ID NO：13所示的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO：14所示的序列的LCDR1，包含SEQ ID NO：15所示的序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO：16所示的序列的LCDR3。
在某些實施方式中，本發明揭露內容提供了抗-TSLP抗體及其抗原結合片段，其包括包含SEQ ID NO：11所示的序列的HCDR1、包含SEQ ID NO：25所示的序列的HCDR2，包含所述SEQ ID NO：26所示的序列的HCDR3，和/或包含SEQ ID NO：14所示的序列的LCDR1，包含SEQ ID NO：15所示的序列的LCDR2，和包含SEQ ID NO：16所示的序列的LCDR3。
下表1和2顯示了抗體39H11和35G12的CDR胺基酸序列，其中表1顯示了IMGT慣例所定義或識別的CDR邊界，並且表2顯示了透過Kabat慣例所定義或識別的CDR邊界。下表3顯示了抗體39H11和35G12的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列。
表 1. 透過 IMGT 識別的 2 個抗體的 CDR 胺基酸序列
抗體 CDR1 CDR2 CDR3
39H11 HCDR SEQ ID NO：11 GYAFSSYW SEQ ID NO：12 IFPGDGET SEQ ID NO：13 ARGGYVNFLYAMDY
LCDR SEQ ID NO：14 SSISSSN SEQ ID NO：15 GTS SEQ ID NO：16 QQWSSYPLT
35G12 HCDR SEQ ID NO：11 GYAFSSYW SEQ ID NO：25 IFPGDGDT SEQ ID NO：26 ARSGFDYGYFYAMDY
LCDR SEQ ID NO：14 SSISSSN SEQ ID NO：15 GTS SEQ ID NO：16 QQWSSYPLT
表 2. 透過 Kabat 識別的 2 個抗體的 CDR 胺基酸序列
抗體 CDR1 CDR2 CDR3
39H11 HCDR SEQ ID NO：50 SYWMN SEQ ID NO：51 QIFPGDGETNYNGKFKG SEQ ID NO：52 GGYVNFLYAMDY
LCDR SEQ ID NO：53 SVSSSISSSNLH SEQ ID NO：54 GTSTLAS SEQ ID NO：16 QQWSSYPLT
35G12 HCDR SEQ ID NO：50 SYWMN SEQ ID NO：56 QIFPGDGDTTYNGNFKG SEQ ID NO：57 SGFDYGYFYAMDY
LCDR SEQ ID NO：53 SVSSSISSSNLH SEQ ID NO：58 GTSNLAS SEQ ID NO：16 QQWSSYPLT
表 3. 2 種抗體的可變區胺基酸序列
抗體 VH VL
39H11 SEQ ID NO：1 QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIFPGDGETNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGGYVNFLYAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO：2 EIVLTQSPALMAASPGEKVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKSETSPKPWIYGTSTLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGAGTKLELK
35G12 SEQ ID NO：3 QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKSSGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIFPGDGDTTYNGNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSGFDYGYFYAMDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO：4 EIVLTQSPTLMAASPGEKVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKSETSPKPWIFGTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISNMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGAGTKLELK
考慮到抗體39H11和35G12兩者可以結合至TSLP並且主要透過CDR1、CDR2和CDR3區提供抗原-結合特異性，因此可以將抗體39H11和35G12的HCDR1、HCDR2和HCDR3序列和LCDR1、LCDR2和LCDR3序列「混合並配對」（即可以將來自不同抗體的CDR混合並配對，但是每個抗體必須含有HCDR1、HCDR2和HCDR3和LCDR1、LCDR2和LCDR3）以產生本發明揭露內容的抗-TSLP結合分子。可以使用以上和實施例中所描述的結合測定測試這些「混合並配對的」抗體的TSLP結合。較佳地，當將VH CDR序列混合並配對時，用結構類似的CDR序列替換來自特定VH序列的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3序列。同樣地，當將VL CDR序列混合並配對時，較佳地用結構類似的CDR序列替換來自特定VL序列的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3序列。對於本領域中具有通常知識者將容易地顯而易見的，對於單株抗體39H11和35G12，可以透過用來自本文所揭露內容的CDR序列的結構類似的序列替換一個或多個VH和/或VL CDR區序列來產生新型VH和VL序列。
已知CDR負責抗原結合。然而，已發現並非全部6個CDR都是不可缺少的或不可改變的。換言之，有可能替換或改變或修飾抗-TSLP抗體39H11和35G12中的一個或多個CDR，但基本保留對TSLP的特異性結合親和力。
在某些實施方式中，本文所提供的抗體及其抗原結合片段包含適合的框架區（FR）序列，只要所述抗體及其抗原結合片段可以特異性結合至TSLP。上表1所提供的CDR序列得自小鼠抗體，但是使用本領域中已知的適合的方法，如重組技術，可以將它們移植到任何適合的物種，如小鼠、人、大鼠、兔等的任何適合的FR序列。
在某些實施方式中，本文所提供的抗體及其抗原結合片段是人源化的。人源化抗體或抗原-結合片段對於其在人中降低的免疫原性是所期望的。人源化抗體在其可變區中是嵌合的，因為將非人CDR序列移植到人或基本人FR序列中。本質上，可以透過用非人（如鼠科）CDR基因替換人免疫球蛋白基因中的相應人CDR基因來實施抗體或抗原-結合片段的人源化（參見，例如，Jones等人 (1986) Nature321:522-525；Riechmann等人 (1988) Nature332:323-327；Verhoeyen等人 (1988) Science239:1534-1536）。
可以使用本領域中已知的方法，選擇適合的人重鏈和輕鏈可變域以實現該目的。在說明性實例中，可以使用「最佳配對」法，其中相對於已知的人可變域序列數據庫篩選或BLAST檢索（BLASTed）非人（例如，齧齒類）抗體可變域序列，並且識別與非人查詢序列最接近的人序列，並將其用作移植非人CDR序列的人支架（參見，例如，Sims等人, (1993) J. Immunol.151:2296；Chothia等人 (1987) J. Mot. Biol.196:901）。作為另外一種選擇，來源於全部人抗體的共有序列的框架可以用於非人CDR的移植（參見，例如，Carter等人 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285；Presta等人 (1993) J. Immunol.,151:2623）。
下表4顯示了39H11或35G12的人源化抗體的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列，其表示為39H11Z07、39H11Z11和mAb39H11、35G12Z01、35G12Z02、35G12Z03和mAb35G12。下表4顯示了39H11或35G12的人源化抗體的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列，其表示為39H11Z07、39H11Z11和mAb39H11、35G12Z01、35G12Z02、35G12Z03和mAb35G12。
表 4. 7 種人源化抗體的可變區胺基酸序列
抗體 VH VL
39H11Z07 SEQ ID NO：5 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSSYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIFPGDGETNYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYVNFLYAMDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO：6 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCSVSSSISSSNLHWYQQKPGQSPRPWIYGTSTLASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQWSSYPLTFGGGTKVEIK
39H11Z11 SEQ ID NO：7 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFSSYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIFPGDGETNYNGKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYVNFLYAMDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO：6 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCSVSSSISSSNLHWYQQKPGQSPRPWIYGTSTLASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQWSSYPLTFGGGTKVEIK
35G12Z01 SEQ ID NO：86 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYAFSSYWMNWVRQAPGQGLEWMGQIFPGDGDTTYNGNFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSGFDYGYFYAMDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO：9 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCSVSSSISSSNLHWYQQKPGQSPRPWIFGTSNLASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQWSSYPLTFGGGTKVEIK
35G12Z02 SEQ ID NO：8 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKSSGYAFSSYWINWVRQMPGKGLEWMGQIFPGDGDTTYNGNFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARSGFDYGYFYAMDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO：9 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCSVSSSISSSNLHWYQQKPGQSPRPWIFGTSNLASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQWSSYPLTFGGGTKVEIK
35G12Z03 SEQ ID NO：10 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSSGYAFSSYWINWVRQAPGQGLEWMGQIFPGDGDTTYNGNFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSGFDYGYFYAMDYWGQGTTVTVSS SEQ ID NO：9 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCSVSSSISSSNLHWYQQKPGQSPRPWIFGTSNLASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQWSSYPLTFGGGTKVEIK
表 5. 7 種人源化抗體的 FR 胺基酸序列
抗體 FR1 FR2 FR3 FR4
39H11Z07 HFR SEQ ID NO：32 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS SEQ ID NO：33 WVRQAPGQGLEWMG SEQ ID NO：34 RVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC SEQ ID NO：35 WGQGTTVTVSS
LFR SEQ ID NO：36 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC SEQ ID NO：37 WYQQKPGQSPRPWIY SEQ ID NO：38 GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC SEQ ID NO：39 FGGGTKVEIK
39H11Z11 HFR SEQ ID NO：40 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS SEQ ID NO：33 WVRQAPGQGLEWMG SEQ ID NO：41 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYC SEQ ID NO：35 WGQGTTVTVSS
LFR SEQ ID NO：36 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC SEQ ID NO：37 WYQQKPGQSPRPWIY SEQ ID NO：38 GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC SEQ ID NO：39 FGGGTKVEIK
35G12Z01 HFR SEQ ID NO：87 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSS SEQ ID NO：33 WVRQAPGQGLEWMG SEQ ID NO：41 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYC SEQ ID NO：35 WGQGTTVTVSS
LFR SEQ ID NO：36 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC SEQ ID NO：45 WYQQKPGQSPRPWIF SEQ ID NO：38 GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC SEQ ID NO：39 FGGGTKVEIK
35G12Z02 HFR SEQ ID NO：42 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKSS SEQ ID NO：43 WVRQMPGKGLEWMG SEQ ID NO：44 QVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYC SEQ ID NO：35 WGQGTTVTVSS
LFR SEQ ID NO：36 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC SEQ ID NO：45 WYQQKPGQSPRPWIF SEQ ID NO：38 GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC SEQ ID NO：39 FGGGTKVEIK
35G12Z03 HFR SEQ ID NO：47 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKSS SEQ ID NO：48 WVRQAPGQGLEWMG SEQ ID NO：49 RVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYC SEQ ID NO：35 WGQGTTVTVSS
LFR SEQ ID NO：36 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC SEQ ID NO：45 WYQQKPGQSPRPWIF SEQ ID NO：38 GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC SEQ ID NO：39 FGGGTKVEIK
在某些實施方式中，除非人CDR序列以外，本文所提供的人源化抗體或其抗原結合片段由基本全部人序列組成。在一些實施方式中，可變區FR和恆定區（如果存在）完全或基本來自人免疫球蛋白序列。人FR序列和人恆定區序列可以來源於不同的人免疫球蛋白基因，例如，FR序列來源於一種人抗體並且恆定區來自另一種人抗體。在一些實施方式中，人源化抗體或其抗原-結合片段包含人重鏈HFR1-4和/或輕鏈LFR1-4。
在一些實施方式中，來源於人的FR區可以包含與它所來源的人免疫球蛋白相同的胺基酸序列。在一些實施方式中，用來自親代非人抗體的相應殘基替換人FR的一個或多個胺基酸殘基。在某些實施方式中，對於製備非常接近非人親代抗體結構的人源化抗體或其片段以優化結合特徵（例如，提高結合親和力）來說，這可以是期望的。在某些實施方式中，本文所提供的人源化抗體或其抗原-結合片段在人FR序列中的每一條中包含不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基替換，或者在重鏈或輕鏈可變域的所有FR序列中包含不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基替換。在一些實施方式中，胺基酸殘基中的這種改變可以僅存在於重鏈FR區、僅存在於輕鏈FR區或者存在於兩條鏈中。在某些實施方式中，使人FR序列的一個或多個胺基酸隨機突變以提高結合親和力。在某些實施方式中，將人FR序列的一個或多個胺基酸回復突變為親代非人抗體的相應胺基酸以提高結合親和力。
在某些實施方式中，本發明揭露內容還提供了人源化抗-TSLP抗體及其抗原結合片段，其包含重鏈HFR1，其包含X 21VQLVQSGAEVKKPGX 22SX 23KX 24SCKX 25S（SEQ ID NO：65）所示的序列，或與其具有至少80%序列同一性的同源序列，重鏈HFR2，其包含WVRQX 27PGX 28GLEWMG（SEQ ID NO：66）所示的序列，或與其具有至少80%序列同一性的同源序列，重鏈HFR3，其包含X 31VTX 32X 33X 34DX 35SX 36STX 37YX 38X 39X 40SSLX 41X 42X 43DTAX 44YYC（SEQ ID NO：67）所示的序列，或與其具有至少80%序列同一性的同源序列，和重鏈HFR4，其包含SEQ ID NO：35所示的序列，或與其具有至少80%序列同一性的同源序列，其中X 21為E或Q；X 22為E、S或A；X 23為L或V；X 24為I或V；X 25為S或A；X 27為M或A；X 28為K或Q；X 31為Q或R；X 32為I或M；X 33為S或T；X 34為A或R；X 35為K或T；X 36為I或T；X 37為A或V；X 38為L或M；X 39為Q或E；X 40為W或L；X 41為K或R；X 42為A或S；X 43為S或E；X 44為M或V。
在某些實施方式中，本發明揭露內容還提供了人源化抗-TSLP抗體及其抗原結合片段，其包含輕鏈LFR1，其包含SEQ ID NO：36所示的序列，或與其具有至少80%序列同一性的同源序列，輕鏈LFR2，其包含WYQQKPGQSPRPWIX 45（SEQ ID NO：68）所示的序列，或與其具有至少80%序列同一性的同源序列，輕鏈LFR3，其包含SEQ ID NO：38所示的序列，或與其具有至少80%序列同一性的同源序列，和輕鏈LFR4，其包含SEQ ID NO：39所示的序列，或與其具有至少80%序列同一性的同源序列，其中X 45為Y或F。
在某些實施方式中，本發明揭露內容還提供了人源化抗-TSLP抗體及其抗原結合片段，其包含含有選自下列的序列的重鏈HFR1：SEQ ID NO：32、40、42、47和87、含有選自下列的序列的重鏈HFR2：SEQ ID NO：33、43和48、含有選自下列的序列的重鏈HFR3：SEQ ID NO：34、41、44和49和含有SEQ ID NO：35所示的序列的重鏈HFR4；和/或含有選自下列的序列的輕鏈LFR1：SEQ ID NO：36、含有選自下列的序列的輕鏈LFR2：SEQ ID NO：37和45、含有SEQ ID NO：38所示的序列的輕鏈LFR3和含有SEQ ID NO：39所示的序列的輕鏈LFR4。
在某些實施方式中，本發明揭露內容還提供了人源化抗-TSLP抗體及其抗原結合片段，其包括包含在選自下列的重鏈可變區中的HFR1、HFR2、HFR3和/或HFR4序列：39H11Z07-VH（SEQ ID NO：5）、39H11Z11-VH（SEQ ID NO：7）、35G12Z01-VH（SEQ ID NO：86）、35G12Z02-VH（SEQ ID NO：8）和35G12Z03-VH（SEQ ID NO：10）。
在某些實施方式中，本發明揭露內容還提供了人源化抗-TSLP抗體及其抗原結合片段，其包括包含在選自下列的輕鏈可變區中LFR1、LFR2、LFR3和/或LFR4序列：39H11Z07-VL/39H11Z11-VL（SEQ ID NO：6）、35G12Z01-VL/35G12Z03-VL（SEQ ID NO：9）。
在某些實施方式中，本文所提供的人源化抗-TSLP抗體及其抗原結合片段包含選自下列的序列的重鏈可變域：SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：10；和/或選自下列的輕鏈可變域序列：SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：9。
本發明揭露內容還提供了39H11或者35G12的示例性人源化抗體，其包括：
「39H11Z07」，其包含39H11Z07-VH（SEQ ID NO：5）所示的重鏈可變區和39H11Z07-VL（SEQ ID NO：6）所示的輕鏈可變區；
「mAb39H11」，其包含39H11Z07-VH（SEQ ID NO：5）所示的重鏈可變區和39H11Z07-VL（SEQ ID NO：6）所示的輕鏈可變區，並且還包含具有PAA-YTE突變的IgG4的Fc區（SEQ ID NO：80）；
「39H11Z11」，其包含39H11Z11-VH（SEQ ID NO：7）所示的重鏈可變區和39H11Z11-VL（SEQ ID NO：6）所示的輕鏈可變區；
「35G12Z01」，其包含35G12Z01-VH（SEQ ID NO：86）所示的重鏈可變區和35G12Z01-VL（SEQ ID NO：9）所示的輕鏈可變區；
「35G12Z02」，其包含35G12Z02-VH（SEQ ID NO：8）所示的重鏈可變區和35G12Z02-VL（SEQ ID NO：9）所示的輕鏈可變區；
「35G12Z03」，其包含35G12Z03-VH（SEQ ID NO：10）所示的重鏈可變區和35G12Z03-VL（SEQ ID NO：9）所示的輕鏈可變區；
「mAb35G12」，其包含35G12Z03-VH（SEQ ID NO：10）所示的重鏈可變區和35G12Z03-VL（SEQ ID NO：9）所示的輕鏈可變區，並且還包含具有PAA-YTE突變的IgG4的Fc區（SEQ ID NO：75）。
「mAb35G12_IgG1」，其包含35G12Z03-VH（SEQ ID NO：10）所示的重鏈可變區和35G12Z03-VL（SEQ ID NO：9）所示的輕鏈可變區，並且還包含IgG1的Fc區（SEQ ID NO：88）。
這些示例性人源化抗-TSLP抗體保留了對TSLP的特異性結合能力或親和力，並且在該方面，與親代小鼠抗體39H11或者35G12至少相當，或甚至更好。例如，數據提供於實施例7。
在一些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體和抗原結合片段包含全部或部分的重鏈可變域和/或全部或部分的輕鏈可變域。在一個實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原-結合片段是單域抗體，其由全部或部分的本文所提供的重鏈可變域組成。這種單域抗體的更多資訊在本領域中是可獲得的（參見，例如，美國專利No. 6,248,516）。
在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段還包含免疫球蛋白（Ig）恆定區，其任選地還包含重鏈和/或輕鏈恆定區。在某些實施方式中，重鏈恆定區包含CH1、鉸鏈和/或CH2-CH3區（或者任選地CH2-CH3-CH4區）。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區。在某些實施方式中，所述輕鏈恆定區包含Cκ或Cλ。本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段的恆定區可以與野生型恆定區序列相同或者相差一個或多個突變。
在某些實施方式中，所述重鏈恆定區包含Fc區。已知Fc區介導抗體的效應因子功能，如抗體依賴性細胞毒作用（ADCC）和補體依賴性細胞毒性（CDC）。不同的Ig同種型的Fc區具有不同的誘導效應因子功能的能力。例如，已認識到IgG1和IgG3的Fc區比IgG2和IgG4的那些對於誘導ADCC和CDC兩者更有效。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體及其抗原結合片段包含IgG1或IgG3同種型的Fc區，其可以誘導ADCC或CDC；或者作為另外一種選擇，IgG4或IgG2同種型的恆定區，其具有降低或消除的效應因子功能。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段包含野生型人IgG4 Fc區或其它野生型人IgG4等位基因。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段包含人IgG4 Fc區，其包含選自下列的一個或多個突變：S228P、F234A、L235A、M252Y、S254T、T256E和K447del。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段包含人IgG4 Fc區，其包含下列突變：S228P、F234A、L235A、M252Y、S254T、T256E和K447del。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段包含具有如SEQ ID NO：75所示的胺基酸序列的重鏈恆定區。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段包含人IgG1 Fc區，其包含選自下列的一個或多個突變：L234A、L235A、M252Y、S254T和T256E。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段包含人IgG1 Fc區，其包含下列突變：L234A、L235A、M252Y、S254T和T256E。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段包含具有如SEQ ID NO：88所示的胺基酸序列的重鏈恆定區。
在某些實施方式中，本文所提供的抗體或其抗原結合片段還在重鏈可變區的N末端包含訊息肽和/或在輕鏈可變區的N末端包含訊息肽。在某些實施方式中，所述訊息肽包含SEQ ID NO：76（MGWSCIILFLVATATGVHS）所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，本文所提供的抗體或其抗原結合片段對人TSLP具有特異性結合親和力，其足以提供診斷和/或治療性用途。
本文所提供的抗體或其抗原結合片段可以是單株抗體、多株抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、雙重特異性抗體、多重特異性抗體、標記抗體、二價抗體、抗-個體基因型抗體或融合蛋白。重組抗體是使用重組方法體外製備，而不是在動物中製備的抗體。
在某些實施方式中，本發明揭露內容提供了抗-TSLP抗體或其抗原-結合片段，其不與包含含有SEQ ID NO：77所示序列的重鏈可變區和含有SEQ ID NO：78所示序列的輕鏈可變區的抗體競爭與人TSLP的結合，其中所述抗體或其抗原-結合片段不是AMG157。
如本文所使用的「AMG157」是指包含具有SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列的重鏈可變區和具有SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列的輕鏈可變區的抗體或其抗原結合片段。
抗體變體
本文所提供的抗體及其抗原結合片段還涵蓋了本文所提供的抗體序列的多種變體。
在某些實施方式中，所述抗體變體包含如上表1和2中所提供的一個或多個CDR序列，上表3和4中所提供的重鏈可變區或輕鏈可變區的一個或多個非CDR序列和/或恆定區（例如，Fc區）中的一個或多個修飾或替換。這些變體保留了對它們親代抗體的TSLP的結合特異性，但是具有所述修飾或替換所賦予的一種或多種所期望的性質。例如：所述抗體變體可以具有改善的抗原-結合親和力、改善的醣基化模式、降低的醣基化風險、降低的脫胺基作用、降低或消除的效應因子功能、改善的FcRn受體結合、提高的藥物動力學半衰期、pH敏感性和/或對共軛（例如，一個或多個所引入的半胱胺酸殘基）的相容性。
使用本領域中已知的方法，例如，「丙胺酸掃描突變」（參見，例如，Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085），可以篩選親代抗體序列以識別對於修飾或替換適合或優選的殘基。簡要地，可以鑑別並透過中性或帶負電荷的胺基酸（例如，丙胺酸或聚丙胺酸）替換標靶殘基（例如，帶電殘基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu），並對所關心的性質產生並篩選修飾的抗體。如果特定胺基酸位置處的替換顯示出所關心的功能性變化，則可以將該位置鑑別為修飾或替換的潛在殘基。可以透過用不同類型的殘基（例如，半胱胺酸殘基、帶正電荷的殘基等）取代來進一步評價潛在殘基。
親和變體
抗體的親和變體可以在如上表1和2中所提供的一個或多個CDR序列、如上表5中所提供的一個或多個FR序列或者如上表3和4中所提供的重鏈或輕鏈可變區序列中含有修飾或替換。基於上表1和2中的CDR序列和上表3和4中的可變區序列，本領域中具有通常知識者可以容易地識別出FR序列，因為在本領域中熟知在可變區中兩個FR區側接CDR區。親和變體保留了對親代抗體的TSLP的特異性結合親和力，或甚至相對於親代抗體具有改善的TSLP特異性結合親和力。在某些實施方式中，CDR序列、FR序列或可變區序列中的至少一個（或全部）替換包含保守替換。
本領域中具有通常知識者將理解在上表1和2中所提供的CDR序列、上表3和4中所提供的可變區序列中，一個或多個胺基酸殘基可以被替換，但是所產生的抗體或抗原-結合片段仍保留了對TSLP的結合親和力或結合能力，或甚至具有改善的結合親和力或能力。本領域中已知的多種方法可以用於實現該目的。例如，可以透過噬菌體展示技術產生和表現抗體變體（如Fab或scFv變體）庫，然後對於對人TSLP的結合親和力進行篩選。對於另一個實例，可以使用計算機軟體來虛擬模擬抗體與人TSLP的結合並在形成結合界面的抗體上識別胺基酸殘基。可以在替換中避免這些殘基以防止結合親和力降低，或者對於替換靶向這些殘基以提供更強的結合。
在某些實施方式中，本文所提供的人源化抗體或其抗原-結合片段包含在一個或多個CDR序列和/或一個或多個FR序列中的一個或多個胺基酸殘基替換。在某些實施方式中，親和變體在CDR序列和/或FR序列中總計包含不超過20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個替換。
在某些實施方式中，抗-TSLP抗體或其抗原結合片段包含1、2或3個與上表1和2中所列的序列具有至少80%（例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）的序列同一性，但仍保留了與其親代抗體類似或甚至更高水平的對TSLP的特異性結合親和力的CDR序列。
在某些實施方式中，抗-TSLP抗體或其抗原結合片段包含與上表3和4中所列的序列具有至少80%（例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）的序列同一性，但仍保留了與其親代抗體類似或甚至更高的對TSLP的特異性結合親和力的一個或多個可變區序列。在一些實施方式中，在上表3和4中所列的可變區序列中已替換、插入或缺失了總計1至10個胺基酸。在一些實施方式中，在CDR的外部區域（例如，在FR）中發生替換、插入或缺失。
醣基化變體
本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段還涵蓋了醣基化變體，可以獲得所述醣基化變體以提高或降低所述抗體或其抗原結合片段的醣基化程度。
所述抗體或其抗原結合片段可以包含引入或除去醣基化位點的一個或多個修飾。醣基化位點是具有可以連接碳水化物部分（例如，寡糖結構）的側鏈的胺基酸殘基。抗體的醣基化通常是N-連接的或O-連接的。N-連接的是指碳水化物部分與天門冬醯胺殘基，例如，三肽序列，如天門冬醯胺-X-絲胺酸和天門冬醯胺-X-蘇胺酸中的天門冬醯胺殘基的側鏈的連接，其中X是除脯胺酸外的任何胺基酸。O-連接的醣基化是指糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一個與羥胺基酸，最通常與絲胺酸或蘇胺酸的連接。可以（例如）透過改變胺基酸序列來方便地實現天然醣基化位點的除去，從而替換序列中存在的上述三肽序列之一（對於N-連接的醣基化位點）或者絲胺酸或蘇胺酸殘基（對於O-連接的醣基化位點）。可以以類似方式透過引入這種三肽序列或者絲胺酸或蘇胺酸殘基來產生新的醣基化位點。
在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體和抗原結合片段在N297包含突變（例如，N297A、N297Q或N297G）以除去醣基化位點。
半胱胺酸 - 工程化變體
本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段還涵蓋了半胱胺酸-工程化變體，其包含一個或多個引入的游離半胱胺酸胺基酸殘基。
游離的半胱胺酸殘基是不是二硫橋鍵的一部分的一個半胱胺酸。半胱胺酸-工程化變體對於在工程化半胱胺酸位點，透過（例如）馬來醯亞胺或鹵代乙醯基，與（例如）細胞毒性和/或成像化合物、標記物或放射性同位素等的共軛是有用的。用於將抗體或其抗原結合片段工程化以引入游離半胱胺酸殘基的方法在本領域中是已知的，參見，例如，WO2006/034488。
Fc 變體
本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段還涵蓋了Fc變體，其包含位於Fc區和/或鉸鏈區的一個或多個胺基酸殘基修飾或替換，例如，以提供改變的效應因子功能，如ADCC和CDC。在本領域中已描述了透過抗體工程化改變ADCC活性的方法，參見，例如，Shields RL.等人, J Biol Chem.2001. 276(9): 6591-604；Idusogie EE.等人, J Immunol.2000.164(8):4178-84；Steurer W.等人, J Immunol. 1995, 155(3): 1165-74；Idusogie EE.等人, J Immunol. 2001, 166(4): 2571-5；Lazar GA.等人, PNAS, 2006, 103(11): 4005-4010；Ryan MC.等人, Mol. Cancer Ther., 2007, 6: 3009-3018；Richards JO,.等人, Mol Cancer Ther.2008, 7(8): 2517-27；Shields R. L.等人, J. Biol. Chem, 2002, 277: 26733-26740；Shinkawa T.等人, J. Biol. Chem, 2003, 278: 3466-3473。
還可以（例如）透過改善或減少C1q結合和/或CDC來改變本文所提供的抗體或抗原結合片段的CDC活性（對於Fc區變體的其它實例，參見，例如，WO99/51642；Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988)；美國專利No. 5,648,260；美國專利No. 5,624,821；和WO94/29351）。可以用不同的胺基酸殘基替換選自Fc區的胺基酸殘基329、331和322的一個或多個胺基酸以改變Clq結合和/或降低或消除補體依賴性細胞毒性（CDC）（參見，Idusogie等人的美國專利No. 6,194,551）。還可以引入一個或多個胺基酸替換以改變抗體結合補體的能力（參見Bodmer等人的PCT專利揭露內容WO 94/29351）。
在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段具有降低的效應因子功能，並且在選自下列的位置：234、235、237和238、268、297、309、330和331處在IgG1中包含一個或多個胺基酸替換。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段具有IgG1同種型並且包含選自下列的一個或多個胺基酸替換：N297A、N297Q、N297G、L235E、L234A、L235A、L234F、L235E、P331S及其任意組合。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段具有IgG2同種型並且包含選自下列的一個或多個胺基酸替換：H268Q、V309L、A330S、P331S、V234A、G237A、P238S、H268A及其任意組合（例如，H268Q/V309L/A330S/P331S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S）。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段具有IgG4同種型並且包含選自下列的一個或多個胺基酸替換：N297A、N297Q、N297G、L235E、L234A、L235A、M252Y/S254T/T256E、T307Q/N434及其任意組合。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段具有IgG2/IgG4交叉同種型。IgG2/IgG4交叉同種型的實例描述於Rother RP等人, Nat Biotechnol25:1256–1264 (2007)。
在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體和抗原結合片段具有IgG4同種型並且包含S228P/F234A/L235A（PAA）胺基酸替換。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體和抗原結合片段具有IgG4同種型並且包含M252Y/S254T/T256（YTE）胺基酸替換。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體和抗原結合片段具有IgG4同種型並且包含K447del胺基酸缺失。
在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體和抗原結合片段具有IgG4同種型並且包含一個或多個胺基酸替換，例如，在228點。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體和抗原結合片段具有IgG4同種型並且在Fc區中包含選自下列的一個或多個突變：S228P、F234A、L235A、M252Y、S254T、T256E和K447del或它們的任意組合。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段包含具有如SEQ ID NO：75所示的胺基酸序列的重鏈恆定區。
在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體和抗原結合片段具有IgG1同種型並且包含L234A/L235A（LALA）胺基酸替換。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體和抗原結合片段具有IgG1同種型並且包含M252Y/S254T/T256（YTE）胺基酸替換。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體和抗原結合片段具有IgG1同種型並且在Fc區中包含選自下列的一個或多個突變：L234A、L235A、M252Y、S254T和T256E或它們的任意組合。在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段包含具有如SEQ ID NO：88所示的胺基酸序列的重鏈恆定區。
在某些實施方式中，抗-TSLP抗體或其抗原結合片段包含改善對新生兒Fc受體（FcRn）的pH-依賴性結合的一個或多個胺基酸替換。這種變體可以具有延長的藥物動力學半衰期，因為它在酸性pH結合至FcRn，這使其能夠逃逸溶酶體中的降解作用，然後移位並從細胞中釋放。工程化抗體或其抗原-結合片段以改善對FcRn的結合親和力的方法在本領域中是熟知的，參見，例如，Vaughn, D.等人, Structure, 6(1): 63-73, 1998；Kontermann, R.等人, Antibody Engineering, 第1卷, 第27章: Engineering of the Fc region for improved PK, Springer出版, 2010；Yeung, Y.等人, Cancer Research, 70: 3269-3277 (2010)；和Hinton, P.等人, J. Immunology, 176:346-356 (2006)。
在某些實施方式中，抗-TSLP抗體或其抗原結合片段在Fc區界面處包含一個或多個胺基酸替換以幫助和/或促進雜二聚化。這些修飾包括向第一Fc多肽中引入突起，並向第二Fc多肽引入空腔，其中所述突起可以定位在所述空腔中，從而促進第一和第二Fc多肽的相互作用以形成雜二聚體或複合物。產生具有這些修飾的抗體的方法在本領域中是已知的，例如，如美國專利No. 5,731,168中所述的。
抗原結合片段
本文還提供了抗-TSLP抗原結合片段。多種類型的抗原結合片段在本領域中是已知的並且可以基於本文所提供的抗-TSLP抗體開發，其包括（例如）其CDR在以上表1和2中所示，其可變序列在以上表3和4中所示的示例性抗體，和它們的不同變體（如親和變體、醣基化變體、Fc變體、半胱胺酸-工程化變體等）。
在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗原-結合片段是雙鏈抗體、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段（dsFv）、(dsFv) 2、雙重特異性dsFv（dsFv-dsFv'）、二硫鍵穩定的雙鏈抗體（ds雙鏈抗體）、單鏈抗體分子（scFv）、scFv二聚體（二價雙鏈抗體）、多重特異性抗體、駱駝化單域抗體、奈米抗體、域抗體和二價域抗體。
多種技術可以用於這些抗原結合片段的生產。說明性方法包括完整抗體的酶促消化（參見，例如，Morimoto等人, Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117 (1992)；和Brennan等人, Science, 229:81 (1985)）、透過宿主細胞，如大腸桿菌（ E. coli）的重組表現（例如，對於Fab、Fv和scFv抗體片段）、如以上所討論的從噬菌體展示庫篩選（例如，對於scFv）和兩種Fab'-SH片段的化學偶聯以形成F(ab') 2片段（Carter等人, Bio/Technology10:163-167 (1992)）。用於生產抗體片段的其它技術將對本領域中具有通常知識者是顯而易見的。
在某些實施方式中，所述抗原-結合片段是scFv。scFv的產生描述於（例如）WO 93/16185；美國專利No. 5,571,894；和5,587,458。scFv可以在胺基或羧基末端融合至效應因子蛋白以提供融合蛋白（參見，例如，Antibody Engineering, Borrebaeck主編）。
在某些實施方式中，本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段是二價、四價、六價或多價的。任何大於二價的分子被認為是多價的，其涵蓋了（例如）三價、四價、六價等。
如果兩個結合位點均對與相同抗原或相同表位的結合特異，則二價分子可以是單特異性的。在某些實施方式中，這提供了與抗原或表位比一價對應物更強的結合。類似的，多價分子也可以是單特異性的。在某些實施方式中，在二價或多價抗原-結合部分中，結合位點的第一價和結合位點的第二價在結構上相同（即具有相同序列）或者在結構上不同（即具有不同序列，儘管具有相同特異性）。
如果兩個結合位點對不同的抗原或表位特異，則二價還可以是雙重特異性的。這也適用於多價分子。例如，當兩個結合位點對第一抗原（或表位）單特異並且第三結合位點對第二抗原（或表位）特異，則三價分子可以是雙重特異性的。
雙重特異性抗體
在某些實施方式中，抗-TSLP抗體或其抗原結合片段是雙重特異性的。在某些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段進一步連接至具有不同於所述TSLP抗體或其抗原結合片段的結合特異性的第二功能性部分。
在某些實施方式中，本文所提供的雙重特異性抗體或其抗原結合片段能夠特異性結合至除TSLP以外的第二抗原，或者TSLP上的第二表位。在一些實施方式中，除TSLP以外的第二抗原選自IL-33、IL-25、IL-4、IL-5、IL-4R、IL-13等。
共軛物
在一些實施方式中，所述抗-TSLP抗體或其抗原結合片段還包含一個或多個共軛物部分。所述共軛物部分可以連接至所述抗體或其抗原結合片段。共軛物部分是可以連接至所述抗體或其抗原結合片段的部分。據考慮多種共軛物部分可以連接至本文所提供的抗體或其抗原結合片段（參見，例如，「Conjugate Vaccines」, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr. (主編), Carger Press, New York, (1989)）。這些共軛物部分可以透過共價結合、親和結合、插層、配位結合、絡合、結合、共混或添加以及其它方法連接至所述抗體或其抗原結合片段。在一些實施方式中，所述抗體或其抗原結合片段可以透過連接子連接至一個或多個共軛物。
在某些實施方式中，可以將本文所提供的抗體或其抗原結合片段工程化以包含位於可以用於結合至一個或多個共軛物部分的表位結合部分以外的特定位點。例如，這種位點可以包括一個或多個反應性胺基酸殘基，如（例如）半胱胺酸或組胺酸殘基，以幫助共價鍵合至共軛物部分。
在一些實施方式中，透過化學鍵或連接子將所述抗體部分與所述共軛物部分連接。在一些實施方式中，使用多種熟知的雙官能試劑和適合於共軛至蛋白的化學來連接所述抗體部分和所述共軛物部分。這些試劑包括（但不限於）：N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯（SPDP）、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯（SMCC）、亞胺基硫烷（IT）、亞胺酸酯的雙官能衍生物（例如，二甲基己二亞醯胺化物HQ）、活性酯（例如，二琥珀醯亞胺基辛二酸）、醛（例如，戊二醛）、雙-疊氮基化合物雙-(p-疊氮基苯甲醯基)-己烷-二胺）、雙-重氮衍生物（例如，雙-(p-二重氮基苯甲醯基)-乙二胺）、二異氰酸酯（例如，甲苯-2,6-二異氰酸酯）和雙-活性氟化合物（例如，1,5-二氟-2,4-二硝基苯）。
在某些實施方式中，可以將所述抗體或其抗原結合片段間接或透過另一個共軛物部分連接至共軛物部分。例如，可以將本文所提供的抗體或其抗原結合片段共軛至生物素，然後間接共軛至已共軛至抗生物素蛋白的第二共軛物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包含清除-改進劑（例如，聚合物，如延長半衰期的PEG）、化療劑、毒素、放射性同位素、鑭系、可檢測標記物（例如，發光標記、螢光標記、酶-基質標記）、DNA-烷化劑、局部異構酶抑制劑、微管蛋白-結合劑、純化部分或其它治療劑或藥物。
作為共軛物部分有用的治療劑或藥物可以是對於治療哮喘、息肉性鼻竇炎、慢性阻塞性肺病（COPD）、蕁麻疹、嗜酸細胞性食管炎（EoE）和異位性皮膚炎等有用的那些。
在一些實施方式中，所述共軛物部分包含用於治療哮喘的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包含β2-腎上腺素能受體促效劑（SABA，如沙丁胺醇、沙美特羅、福莫特羅等）、腎上腺素促效劑（如吸入式腎上腺素）、皮質類固醇（較佳地，吸入形式，如倍氯米松）、白細胞三烯受體拮抗劑（如孟魯司特和紮魯司特）、肥大細胞穩定劑（如色甘酸鈉）、大環內脂類抗菌素或它們的組合。
在一些實施方式中，所述共軛物部分包含用於治療息肉性鼻竇炎的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包含抗生素和小分子，如激酶抑制劑、類固醇等。
在一些實施方式中，所述共軛物部分包含用於治療COPD的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包括抗生素（包括阿莫西林在內、多西環素和阿奇黴素）、β2-腎上腺素促效劑、抗膽鹼能藥（如異丙托銨鹽和噻托銨鹽）、長效毒蕈鹼拮抗劑（LAMA，如噻托銨鹽）、阿地銨（aclidinium）、LAMA溴化阿地銨（umeclidinium bromide）、皮質類固醇、磷酸二酯酶-4抑制劑（PDE4抑制劑，如羅氟司特）等。
在一些實施方式中，所述共軛物部分包含用於治療蕁麻疹的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包括抗組胺劑、全身類固醇、白細胞三烯-受體拮抗劑、抗炎藥、奧馬珠單抗、免疫抑制劑等。非限制性示例性抗組胺劑包括苯海拉明、羥嗪、氯雷他定、西替利嗪、地氯雷他定、非索非那定等。
在一些實施方式中，所述共軛物部分包含用於治療EoE的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包含氫離子幫浦抑制劑（PPI）、皮質類固醇等。
在一些實施方式中，所述共軛物部分包含用於治療異位性皮膚炎的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包括皮質類固醇（如氫化可的松）、鈣神經素抑制劑（如他克莫司或吡美莫司）、他克莫司、吡美莫司、PDE-4抑制劑（如克立硼羅）、全身免疫抑制劑（如環孢素、甲氨蝶呤、干擾素γ-1b、嗎替麥考酚酯和硫唑嘌呤）、其它抗體（如度普利尤單抗、塔羅金單抗）等。
在一些實施方式中，共軛物部分包含酶促活性毒素或其片段，其包括（但不限於）白喉A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈（來自銅綠假單胞菌（ Pseudomonas aeruginosa））、篦麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮素（modeccin）A鏈、α-八疊球菌素、油桐（ Aleurites fordii）蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸（ Phytolaca americana）蛋白、苦瓜（ Momordica charantia）抑制劑、瀉果素、巴豆毒蛋白、肥皂草（ Sapaonaria officinalis）抑制劑、白樹毒素、絲裂吉菌素（mitogellin）、局限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素和單端孢黴烯。
「毒素」可以是對細胞不利或者可以破壞或殺死細胞的任何試劑。毒素的實例無限制地包括紅豆杉醇、細胞分裂抑素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷、長春新鹼、MMAE、MMAF、DM1、長春鹼、秋水仙鹼、多柔比星、柔紅黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、普卡黴素、放線菌素D、1-去氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌羅黴素及其類似物、抗代謝物（例如，甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺）、烷化劑（例如，氮芥、苯丁酸氮芥（thioepa chlorambucil）、美法侖、卡莫司汀（BSNU）和洛莫司汀（CCNU）、環磷醯胺（cyclothosphamide）、白消安、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素、絲裂黴素C和順式-二氯二胺鉑(II)（DDP）順鉑）、蒽環類抗生素（例如，柔紅黴素（先前的道諾黴素）和多柔比星）、抗生素（例如，更生黴素（先前的放線菌素）、博來黴素、普卡黴素和安麯黴素（AMC））、抗有絲分裂劑（例如，長春新鹼和長春鹼）、局部異構酶抑制劑和微管蛋白-結合劑。
可檢測標記物的實例可以包括螢光標記物（例如，螢光素、羅丹明、丹醯、藻紅蛋白或德克薩斯紅）、酶-基質標記（例如，辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶）、放射性同位素、發光標記、發色部分、洋地黃毒苷、生物素/抗生物素蛋白、DNA分子或者用於檢測的金。多種放射性同位素對於這種放射性共軛物的生產可用。實例包括 211At、 131I、 125I、 90Y、 186Re、 188Re、 153Sm、 212Bi、 32P、 212Pb和Lu的放射性同位素。在一些實施方式中，所述共軛物部分可以包含用於閃爍照相檢測的放射性同位素，或者用於NMR檢測或MRI的自旋標記物。適合的放射性同位素或自旋標記物可以包括如 123I、 131I、 111In、 13C、 19F、 15N、 17O、Gd、Mn和Fe的多種同位素。
在某些實施方式中，所述共軛物部分可以是幫助提高抗體半衰期的清除-改進劑。說明性實例包括水溶性聚合物，如PEG、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇的共聚物等。所述聚合物可以具有任何分子量，並且可以是支鏈或非支鏈的。連接至抗體的聚合物的數目可以是不同的，並且如果連接不止一種聚合物，則它們可以是相同或不同的分子。
在某些實施方式中，所述共軛物部分可以是純化部分，如磁珠。
在某些實施方式中，將本文所提供的抗體或其抗原結合片段用作共軛物的基底。
多核苷酸和重組方法
本發明揭露內容提供了編碼本文所提供的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段的分離的多核苷酸。如本文所使用的術語「核酸」或「多核苷酸」是指處於單鏈或雙鏈形式的去氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）及其聚合物。除非另外說明，否則特定多核苷酸序列還暗含地涵蓋了其保守修飾變體（例如，簡併密碼子替換）、等位基因、直系同源基因、SNP和互補序列以及明確表示的序列。具體地，可以透過產生其中一個或多個所選（或全部）密碼子的第三位置被混合鹼基和/或去氧次黃嘌呤核甙殘基替換的序列來實現簡併密碼子替換（參見Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人, J. Biol. Chem.260:2605-2608 (1985)；和Rossolini等人, Mol. Cell. Probes8:91-98 (1994)）。
使用常規程序（例如，透過使用能夠特異性結合至編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針），容易地分離了編碼所述單株抗體的DNA並定序。還可以透過合成方法獲得編碼DNA。
使用本領域中已知的重組技術，可以將編碼抗-TSLP抗體或其抗原結合片段的分離的多核苷酸插入載體以用於進一步轉殖（DNA擴增）或用於表現。多種載體是可用的。載體組分通常包括（但不限於）以下中的一種或多種：訊息序列、複製起點、一個或多個標記物基因、增強子元件、啟動子（例如，SV40、CMV、EF-1α）和轉錄終止序列。
本發明揭露內容提供了包含本文所提供的分離的多核苷酸的載體。在某些實施方式中，本文所提供的多核苷酸編碼抗體或其抗原結合片段、可操作性地連接至所述核酸序列的至少一種啟動子（例如，SV40、CMV、EF-1α）和至少一種選擇標記物。載體的實例包括（但不限於）反轉錄病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺病毒相關病毒、皰疹病毒（例如，單純皰疹病毒）、痘病毒、桿狀病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多空病毒（例如，SV40）、λ噬菌體和M13噬菌體、質體pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
可以將包含編碼抗體或其抗原結合片段的多核苷酸序列的載體引入宿主細胞用於轉殖或基因表現。適合於在本文中的載體中轉殖或表現DNA的宿主細胞是以上所描述的原核生物、酵母或高等真核生物細胞。適合於該目的的原核生物包括真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如，腸桿菌科（ Enterobacteriaceae），如埃希氏菌屬（ Escherichia），例如， 大腸桿菌（ E. coli）、腸桿菌屬（ Enterobacter）、歐文氏菌屬（ Erwinia）、克雷伯氏菌屬（ Klebsiella）、變形菌屬（ Proteus）、沙門氏菌屬（ Salmonella），例如，鼠傷寒沙門氏菌（ Salmonella typhimurium）、沙雷氏菌屬（ Serratia），例如，黏質沙雷氏菌（ Serratia marcescans）和志賀氏菌屬（ Shigella），以及桿菌（ Bacilli），如枯草芽孢桿菌（ B. subtilis）和地衣芽胞桿菌（ B. licheniformis）、假單胞菌屬（ Pseudomonas），如銅綠假單胞菌（ P. aeruginosa）和鏈黴菌屬（ Streptomyces）。
除原核生物外，真核微生物，如絲狀真菌或酵母是適合於抗-TSLP抗體-編碼載體的轉殖或表現宿主。在低等真核宿主微生物中，釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）或常見的麵包酵母是最常用的。然而，在本文中一些其它屬、種和株是通常可獲得的並且有用的，如粟酒裂殖酵母（ Schizosaccharomyces pombe）；克魯維酵母（ Kluyveromyces）宿主，如（例如）乳酸克魯維酵母（ K. lactis）、脆壁克魯維酵母（ K. fragilis）（ATCC 12,424）、保加利亞克魯維酵母（ K. bulgaricus）（ATCC 16,045）、維克漢姆克魯維斯酵母（ K. wickeramii）（ATCC 24,178）、沃爾蒂克魯維酵母（ K. waltii）（ATCC 56,500）、果蠅克魯維酵母（ K. drosophilarum）（ATCC 36,906）、耐熱克魯維酵母（ K. thermotolerans）和馬克斯克魯維酵母（ K. marxianus）；亞羅酵母屬（ yarrowia）（ EP402,226）；巴斯德畢赤氏酵母（ Pichia pastoris）（EP 183,070）；假絲酵母（ Candida）；裡氏木黴（ Trichoderma reesia）（EP 244,234）；粗糙鏈孢黴（ Neurospora crassa）；許旺酵母屬（ Schwanniomyces），如西方許旺酵母（ Schwanniomyces occidentalis）；和絲狀真菌，如（例如）脈孢菌屬（ Neurospora）、青黴屬（ Penicillium）、彎頸黴屬（ Tolypocladium）和麯黴屬（ Aspergillus）宿主，如構巢麴菌（ A. nidulans）和黑麯黴（ A. niger）。
適合於本文所提供的醣基化抗體或其抗原-片段的表現的宿主細胞來源於多細胞生物。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。已鑑別了多種桿狀病毒株和變體以及來自宿主，如草地貪夜蛾（ Spodoptera frugiperda）（毛蟲）、埃及伊蚊（ Aedes aegypti）（蚊子）、白紋伊蚊（ Aedes albopictus）（蚊子）、果蠅（ Drosophila melanogaster）（果蠅）和家蠶（ Bombyx mori）的相應受納昆蟲宿主細胞。多種用於轉染的病毒株是揭露內容可獲得的，例如，苜蓿銀紋夜蛾（ Autographa californica）NPV的L-1變體和家蠶（ Bombyx mori）NPV的Bm-5株，並且這些病毒在本文中可以用作根據本發明的病毒，具體地用於轉染草地貪夜蛾（ Spodoptera frugiperda）細胞。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和煙草的植物細胞培養也可以用作宿主。
然而，最關心脊椎動物細胞，並且培養（組織培養）中的脊椎動物細胞的增殖已成為常規程序。有用的哺乳動物宿主細胞系的實例為SV40轉化的猴腎CV1系（COS-7，ATCC CRL 1651）；人胚腎系（用於懸浮培養生長的亞株的293或293細胞，Graham等人, J. Gen Virol.36:59 (1977)）；幼倉鼠腎細胞（BHK，ATCC CCL 10）；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR（CHO，Urlaub等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA77:4216 (1980)）；小鼠支持細胞（TM4，Mather，Biol. Reprod.23:243-251 (1980)）；猴腎細胞（CV1 ATCC CCL 70）；非洲綠猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL-1587）；人子宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2）；狗腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34）；布法羅大鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；人肺細胞（W138，ATCC CCL 75）；人肝細胞（Hep G2，HB 8065）；小鼠乳腺腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51）；TRI細胞（Mather等人, Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982)）；MRC 5細胞；FS4細胞；和人肝癌系（Hep G2）。在一些實施方式中，宿主細胞是哺乳動物培養的細胞系，如CHO、BHK、NS0 293和它們的衍生物。
使用用於抗-TSLP抗體產生的上述表現或轉殖載體轉化宿主細胞並在根據情況，對於誘導啟動子、選擇轉化體或擴增編碼所期望的序列的基因改良的常規培養基中培養。在另一個實施方式中，可以透過本領域中已知的同源重組產生抗體。在某些實施方式中，所述宿主細胞能夠產生本文所提供的抗體或其抗原結合片段。
本發明揭露內容還提供了表現本文所提供的抗體或其抗原-結合片段的方法，其包括將本文所提供的宿主細胞在表現本發明揭露內容所述的載體的條件下培養。可以在多種培養基中培養用於生產本文所提供的抗體或其抗原結合片段的宿主細胞。可商購的培養基，如Ham F10（Sigma）、最低必需培養基（MEM）（Sigma）、RPMI-1640（Sigma）和達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基（DMEM）（Sigma）適合於培養所述宿主細胞。另外，Ham等人, Meth. Enz.58:44 (1979)、Barnes等人, Anal. Biochem.102:255 (1980)、美國專利No. 4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利Re. 30,985中所述的任何培養基可以用作宿主細胞的培養基。根據需要，任何這些培養基可以補充激素和/或其它生長因子（如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子）、鹽（如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽）、緩衝液（如HEPES）、核苷酸（如腺嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷）、抗生素（如GENTAMYCIN TM藥物）、微量元素（定義為通常以微莫耳範圍內的最終濃度存在的無機化合物）和葡萄糖或等價的能量來源。還可以以適當濃度包括本領域中具有通常知識者將已知的任何其它必要補充劑。培養條件，如溫度、pH等是先前用於對於表現所選擇的宿主細胞的那些，並且將對本領域中具有通常知識者是顯而易見的。
當使用重組技術時，可以在周質間隙中胞內產生抗體，或者直接分泌到培養基中。如果胞內產生抗體，則作為第一步，例如，透過離心或超濾除去顆粒碎片，它是宿主細胞或裂解片段。Carter等人, Bio/Technology10:163-167 (1992)描述了分離分泌至大腸桿菌（ E. coli）周質間隙中的抗體的程序。簡要地，在存在乙酸鈉（pH 3.5）、EDTA和苯甲基磺醯氟（PMSF）的情況下將細胞糊狀物在約30min內融化。可以透過離心除去細胞碎片。當抗體分泌至培養基中時，通常首先使用可商購的蛋白濃縮過濾器，例如，Amicon或Millipore Pellicon超濾單元濃縮來自這些表現系統的上清液。可以在任何上述步驟中包括蛋白酶抑制劑，如PMSF以抑制蛋白水解，並且可以包括抗生素以防止偶然污染物的生長。
可以使用（例如）羥基磷灰石色層分析法、凝膠電泳、透析、DEAE纖維素離子交換色層分析法、硫酸銨沉澱、鹽析和親和色層分析法純化從細胞製備的抗-TSLP抗體或其抗原結合片段，其中親和色層分析法是優選的純化技術。
在某些實施方式中，將固定在固相上的蛋白A用於抗體及其抗原-結合片段的免疫親和純化。蛋白A作為親和配體的適合性取決於存在於抗體中的任何免疫球蛋白Fc域的物種和同種型。蛋白A可以基於人γ1、γ2或γ4重鏈用於純化抗體（Lindmark等人, J. Immunol. Meth.62:1-13 (1983)）。將蛋白G推薦用於所有小鼠同種型和用於人γ3（Guss等人, EMBO J.5:1567 1575 (1986)）。最常見的親和配體所連接的基質是瓊脂糖，但是其它基質是可用的。機械穩定的基質，如可控孔玻璃或聚(苯乙烯-二乙烯)苯允許比可以透過瓊脂糖實現的更快的速流和更短的處理時間。當抗體包含CH3域時，Bakerbond ABX TM樹脂（J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.）對於純化是有用的。基於要回收的抗體，其它蛋白純化技術，如離子交換柱上的分餾、乙醇沉澱、反相HPLC、二氧化矽上的色層分析法、肝素SEPHAROSE TM上的色層分析法、陰離子或陽離子交換樹脂（如聚天冬氨酸柱）上的色層分析法、色層分析焦聚、SDS-PAGE和硫酸銨沉澱也是可用的。
在任何初步純化步驟後，可以使用pH在約2.5-4.5之間在洗脫緩衝液，較佳地在低鹽濃度（例如，約0-0.25M鹽）條件下，對包含所關心的抗體和污染物的混合物進行低pH疏水相互作用色層分析法。
藥物組合物
本發明揭露內容進一步提供了包含抗-TSLP抗體或其抗原結合片段和一個或多個藥物可用的載體的藥物組合物。
本發明揭露內容進一步提供了包含編碼抗-TSLP抗體或其抗原結合片段的多核苷酸和一個或多個藥物可用的載體的藥物組合物。還可以透過遞送編碼本文所提供的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸，如（例如）體外-轉錄的mRNA或表現載體體內產生本文所提供的抗體。對於用於抗體體內表現的多核苷酸遞送的方法在本領域中是已知的，參見，例如，Rybakova, Y.等人, Molecular Therapy, 27卷 (8), 第1415-1423頁 (2019)；Deal, C.E.等人, Vaccines, 2021, 9, 108。
本發明揭露內容進一步提供了包含含有編碼抗-TSLP抗體或其抗原結合片段的多核苷酸的表現載體和一個或多個藥物可用的載體的藥物組合物。
在某些實施方式中，所述表現載體包含病毒載體或非病毒載體。病毒載體的實例無限制地包括腺病毒相關病毒（AAV）載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體和腺病毒載體。非病毒載體的實例無限制地包括裸DNA、質體、外來體、mRNA等。在某些實施方式中，所述表現載體適合於人中的基因療法。適合於基因療法的載體包括（例如）腺病毒相關病毒（AAV）或腺病毒載體。在某些實施方式中，表現載體包括DNA載體或RNA載體。在某些實施方式中，所述藥物可用的載體是聚合物賦形劑，無限制地如微球、微膠囊、聚合物膠束和樹枝狀聚合物。可以透過本領域中已知的方法將本發明揭露內容所述的多核苷酸或多核苷酸載體包封、黏附或塗覆在聚合物-基組分上（參見，例如，W. Heiser, Nonviral gene transfer techniques, Humana Press出版, 2004；美國專利6025337；Advanced Drug Delivery Reviews, 57(15): 2177-2202 (2005)）。
用於在本文所揭露內容的藥物組合物中使用的藥物可接受的載體可以包括（例如）藥物可用的液體、凝膠或固體載體、水媒介物、非水媒介物、抗微生物劑、等張劑、緩衝劑、抗氧化劑、麻醉劑、混懸劑/分散劑、多價螯合或螯合劑、稀釋劑、佐劑、賦形劑或者無毒助劑物質、本領域中已知的其它組分或其多種組合。
適合的組分可以包括（例如）抗氧化劑、填充劑、結合劑、崩解劑、緩衝劑、防腐劑、潤滑劑、調味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑或穩定劑，如糖和環糊精。適合的抗氧化劑可以包括（例如）甲硫胺酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉑、催化酶、檸檬酸、半胱胺酸、硫代甘油、巰基乙酸、硫代山梨糖醇、丁基化羥基茴香醚、丁基化羥基甲苯和/或沒食子酸丙酯。如本文所揭露的，一種或多種抗氧化劑，如甲硫胺酸在包含本文所提供的抗體或其抗原-結合片段和共軛物的組合物中的包含降低了所述抗體或其抗原結合片段的氧化。這種氧化的降低防止或降低了結合親和力的損失，借此改善了抗體穩定性並使儲存期限最大化。因此，在某些實施方式中，提供了藥物組合物，其包含如本文所揭露的一種或多種抗體或其抗原結合片段和一種或多種抗氧化劑，如甲硫胺酸。還提供了透過將所述抗體或抗原-結合片段與一個或多個抗氧化劑，如甲硫胺酸混合來防止本文所提供的抗體或抗原-結合片段的氧化，延長其儲存期限和/或改善其效力的方法。
為了進一步說明，藥物可用的載體可以包括（例如）水性媒介物，如氯化鈉注射液、林格氏注射液、等滲葡萄糖注射液、無菌注射用水或者葡萄糖和乳酸林格氏注射液、非水媒介物，如植物來源的固定油劑、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油、抑菌或抑真菌濃度的抗微生物劑、等張劑，如氯化鈉或右旋糖、緩衝劑，如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝劑、抗氧化劑，如硫酸氫鈉、局部麻醉劑，如鹽酸普魯卡因、混懸劑和分散劑，如羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯烷酮、乳化劑，如聚山梨酯80（TWEEN-80）、多價螯合或螯合劑，如EDTA（乙二胺四乙酸）或EGTA（乙二醇四乙酸）、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。可以將用作載體的抗微生物劑添加至多劑量容器中的藥物組合物中，所述多劑量容器包括苯酚或甲酚、汞劑、苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基p-羥基苯甲酸酯、硫柳汞、苯紮氯銨和苄索氯銨。適合的賦形劑可以包括（例如）水、鹽水、葡萄糖、甘油或乙醇。適合的無毒助劑物質可以包括（例如）潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、增溶劑或者試劑，如乙酸鈉、單月桂酸山梨聚糖酯、油酸三乙醇胺酯或環糊精。
所述藥物組合物可以是液體溶液、混懸劑、乳液、丸劑、膠囊劑、片劑、緩釋製劑或粉末劑。口服製劑可以包括標準載體，如藥品級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
在某些實施方式中，將藥物組合物配製成可注射組合物。可以以任何常規形式製備可注射用藥物組合物，如（例如）液體溶液、混懸液、乳液，或適合於產生液體溶液、混懸液或乳液的固體形式。用於注射的製劑可以包括隨時可注射的無菌和/或無熱原的溶液、在正要使用前隨時可與溶劑合併的無菌乾燥可溶性產品，如冷凍乾燥粉劑，包括皮下片劑、隨時可注射的無菌混懸液、在正要使用前隨時可與媒介物合併的無菌乾燥不溶性產品以及無菌和/或無熱原的乳液。所述溶液可以是水性或非水性的。
在某些實施方式中，將單位-劑量腸胃外製劑包裝在安瓿瓶、小瓶或具針注射器中。用於腸胃外施用的所有製劑應是無菌和無熱原的，如在本領域中已知和實踐的。
在某些實施方式中，透過在適合的溶劑中溶解如本文所揭露的抗體或抗原-結合片段製備無菌、凍乾粉末。所述溶劑可以含有改善粉末或從所述粉末所製備的復原溶液的穩定性或其它藥理學組分的賦形劑。可以使用的賦形劑包括（但不限於）水、葡萄糖、山梨醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它適合的試劑。所述溶劑可以含有緩衝劑，如檸檬酸鹽、磷酸鈉或鉀或者在一個實施方式中，本領域中具有通常知識者已知的處於約中性pH的其它這種緩衝劑。本領域中具有通常知識者已知的溶液後續無菌過濾以及隨後在標準條件下的冷凍乾燥提供了所期望的製劑。在一個實施方式中，將所得溶液分配到小瓶中用於冷凍乾燥。每個小瓶可以含有單一劑量或多劑量的抗-TSLP抗體或其抗原-結合片段或其組合物。以高於劑量或劑量組所需的較少的量（例如，約10%）過度填充小瓶是可接受的，以幫助準確取出樣品和準確劑量施用。凍乾粉末可以在適當的條件，如在約4℃至室溫下儲存。
用注射用水對凍乾粉末復原提供了用於在腸胃外施用中使用的製劑。在一個實施方式中，對於復原，將無菌和/或無熱原的水或其它液體適合的載體加入至凍乾粉末。準確的量取決於要提供的所選療法，並且可以透過經驗確定。
試劑盒
在某些實施方式中，本發明揭露內容提供了試劑盒，其包含本文所提供的抗體或其抗原-結合片段。在某些實施方式中，本發明揭露內容提供了試劑盒，其包含本文所提供的抗體或其抗原-結合片段和第二治療劑。
作為共軛物部分有用的治療劑或藥物可以是對於治療哮喘、息肉性鼻竇炎、慢性阻塞性肺病（COPD）、蕁麻疹、嗜酸細胞性食管炎（EoE）和異位性皮膚炎等有用的那些。
在一些實施方式中，第二治療劑包括用於治療哮喘的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包含β2-腎上腺素能受體促效劑（SABA，如沙丁胺醇、沙美特羅、福莫特羅等）、腎上腺素促效劑（如吸入式腎上腺素）、皮質類固醇（較佳地，吸入形式，如倍氯米松）、白細胞三烯受體拮抗劑（如孟魯司特和紮魯司特）、肥大細胞穩定劑（如色甘酸鈉）、大環內脂類抗菌素或它們的組合。
在一些實施方式中，第二治療劑包括用於治療息肉性鼻竇炎的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包含抗生素和小分子，如激酶抑制劑、類固醇等。
在一些實施方式中，第二治療劑包括用於治療COPD的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包括抗生素（包括阿莫西林在內、多西環素和阿奇黴素）、β2-腎上腺素促效劑、抗膽鹼能藥（如異丙托銨鹽和噻托銨鹽）、長效毒蕈鹼拮抗劑（LAMA，如噻托銨鹽）、阿地銨（aclidinium）、LAMA溴化阿地銨（umeclidinium bromide）、皮質類固醇、磷酸二酯酶-4抑制劑（PDE4抑制劑，如羅氟司特）等。在一些實施方式中，所述第二治療劑是單株抗體，如Dupilumab或Itepekimab。
在一些實施方式中，第二治療劑包括用於治療蕁麻疹的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包括抗組胺劑、全身類固醇、白細胞三烯-受體拮抗劑、抗炎藥、奧馬珠單抗、免疫抑制劑等。非限制性示例性抗組胺劑包括苯海拉明、羥嗪、氯雷他定、西替利嗪、地氯雷他定、非索非那定等。在一些實施方式中，所述第二治療劑是單株抗體，如Dupilumab或Itepekimab。
在一些實施方式中，第二治療劑包括用於治療EoE的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包含氫離子幫浦抑制劑（PPI）、皮質類固醇等。在一些實施方式中，所述第二治療劑是單株抗體，如Dupilumab或Itepekimab。
在一些實施方式中，第二治療劑包括用於治療異位性皮膚炎的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包括皮質類固醇（如氫化可的松）、鈣神經素抑制劑（如他克莫司或吡美莫司）、他克莫司、吡美莫司、PDE-4抑制劑（如克立硼羅）、全身免疫抑制劑（如環孢素、甲氨蝶呤、干擾素γ-1b、嗎替麥考酚酯和硫唑嘌呤）、其它抗體（如度普利尤單抗、塔羅金單抗）等。在一些實施方式中，所述第二治療劑是單株抗體，如Dupilumab或Itepekimab。
在一些實施方式中，所述第二治療劑是靶向IL-33、IL-25、IL-4、IL-5、IL-4R、IL-13等的藥物。
這些試劑盒還可以包括（如果需要）多種常規藥物試劑盒組分中的一種或多種，如（例如）具有一種或多種藥物可用的載體的容器、其它容器等，如將對於本領域中具有通常知識者顯而易見的。還可以在試劑盒中作為插頁或標記包括說明書，其說明了要施用的組分的量、施用指南和/或混合組分的指南。
嵌合抗原受體（ CAR ）組合物
本發明揭露內容還提供了嵌合抗原受體（CAR），其包含如本文所提供的抗-TSLP抗原結合結構域和T細胞活化域。嵌合抗原受體（CAR）是工程化的嵌合受體，其將抗體的抗原-結合結構域與用於T細胞活化的一個或多個訊息傳遞結構域組合。可以將免疫細胞，如T細胞和自然殺傷（NK）細胞基因工程化以表現CAR。表現CAR的T細胞被稱為CAR-T細胞。CAR可以在T細胞中介導抗原-特異性細胞免疫活性，從而使得CAR-T細胞能夠消除表現標靶抗原的細胞（例如，腫瘤細胞）。在一個實施方式中，本文所提供的CAR-T細胞與細胞，如癌細胞上表現的TSLP的結合導致所述CAR-T細胞的增殖和/或活化，其中所述活化的CAT-T細胞可以釋放細胞毒性因子，例如，穿孔素、顆粒酶和顆粒溶素並起始癌細胞的細胞溶解和/或細胞凋亡。
在一些實施方式中，CAR的T細胞活化域包含共刺激訊息傳遞結構域和TCR訊息傳遞結構域，它們可以以隨機或以指定順序彼此連接，任選地透過長度為（例如）2至10個胺基酸（例如，甘胺酸-絲胺酸二聯體連接子）的短肽連接子連接。
在一些實施方式中，所述CAR還包含跨膜結構域。當在細胞中表現時，抗-TSLP抗原結合結構域是胞外的，並且T細胞活化域是胞內的。
在某些實施方式中，CAR包含抗-TSLP抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激訊息區和TCR訊息傳遞結構域，其中所述抗原結合結構域特異性結合至TSLP並且包含本文所提供的抗體的抗原-結合片段。
抗原結合結構域
在一些實施方式中，CAR的抗-TSLP抗原結合結構域包含如本文所提供的一條或多條CDR序列、本文所提供的一個或多個重鏈可變域或輕鏈可變域或者來源於本文所提供的任何抗-TSLP抗體的一個或多個抗原-結合片段。
在一些實施方式中，對於抗原結合結構域，來源於其中CAR將最終所使用的相同物種是有益的。例如，對於在人中的使用，具有在來源於人抗體或人源化抗體的CAR中使用的抗原結合結構域可以是有益的。在一些實施方式中，所述抗原結合結構域包含單鏈可變區片段（scFv）。在一些實施方式中，所述抗原結合結構域可以以多種其它形式存在，其包括（例如）Fv，Fab和(Fab') 2以及雙功能（即雙重特異性）雜交抗體片段（例如，Lanzavecchia等人, Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)）。在某些實施方式中，所述抗原結合結構域包含Fab或scFv。
跨膜域
在某些實施方式中，CAR包含融合至CAR的胞外抗原-結合結構域的跨膜結構域。在一個實施方式中，可以選擇跨膜結構域，從而它天然與CAR中的結構域之一結合。在一些情況下，可以選擇或修飾跨膜結構域以避免與T細胞受體複合物的其它成員的跨膜結構域結合。
本文所提供的CAR的跨膜結構域可以來源於任何天然膜-結合或跨膜蛋白的跨膜結構域，如（例如）T細胞受體的α、β或ξ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在一些實施方式中，CAR的跨膜結構域還可以使用多種人鉸鏈，如人Ig（免疫球蛋白）鉸鏈。
作為另外一種選擇，本文所提供的CAR的跨膜結構域可以是合成的，例如，主要包含疏水性殘基，如白胺酸和纈胺酸。在一個實施方式中，在合成跨膜結構域的每個末端包括苯丙胺酸、色胺酸和纈胺酸的三聯體。任選地，長度在2至10個胺基酸之間的短寡肽或多肽連接子可以在CAR的跨膜結構域和胞內訊息傳遞域之間形成連接。甘胺酸-絲胺酸二聯體提供了特別適合的連接子。
TCR 訊息 傳遞結構域
本文所提供的CAR的T細胞活化域包含TCR訊息傳遞結構域。TCR訊息傳遞結構域可以活化表現CAR的T細胞，以發揮T細胞正常TCR效應因子功能中的至少一種，例如，溶胞活性或輔助活性，包括細胞因子分泌。TCR訊息傳遞結構域可以是全長的天然胞內訊息傳遞結構域，或其足以傳遞TCR效應因子功能信號的片段。
在本文所提供的CAR中有用的示例性胞內訊息傳遞域包括在抗原受體接合後，協同作用以起始訊息傳遞的T細胞受體（TCR）和共受體的胞質序列，以及這些序列的任何衍生物或變體和具有相同功能能力的任何合成序列。
以刺激性方式起作用的TCR訊息傳遞結構域可以含有被稱為免疫受體酪胺酸-基活化基序或ITAM的訊息傳遞基序。含有在本文所提供的CAR中有用的TCR訊息傳遞結構域的ITAM的實例包括來源於TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在某些實施方式中，所述TCR訊息傳遞結構域包含來源於CD3-ξ的胞質訊息傳遞序列。
共刺激訊息傳遞區
在某些實施方式中，本文所提供的CAR的T細胞活化域還可以包含共刺激訊息傳遞區。共刺激信號傳遞區以不依賴於抗原的方式起作用以介導TCR活化並且可以來源於淋巴細胞對抗原的有效反應所需的共刺激分子。示例性的共刺激分子包括CD27、CD28、4-1BB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能-相關抗原-1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和與CD83特異性結合的配體等。
編碼 CAR 的多核苷酸序列
在一個方面，本發明揭露內容進一步提供了編碼本文所提供的CAR的核酸序列，其包括編碼本文所提供的CAR的抗原結合結構域的第一多核苷酸序列和任選地編碼本文所提供的跨膜結構域和T細胞活化域的第二多核苷酸序列。在一些實施方式中，將編碼所述抗原結合結構域的序列可操作性地連接至編碼跨膜結構域和T細胞活化域的序列。可以使用本領域中已知的重組方法獲得編碼所期望的分子的核酸序列，如（例如）使用標準技術，透過從表現所述基因的細胞篩選庫，透過從已知包括它們的載體獲得基因或者直接從含有它們的細胞和組織分離來獲得。作為另外一種選擇，可以合成產生，而不是轉殖產生所關心的基因。
在一個方面，本發明揭露內容提供了包含編碼本文所提供的CAR的核酸序列的載體。在一些實施方式中，所述載體是可以直接傳遞至細胞的表現本發明揭露內容的CAR的反轉錄病毒和慢病毒載體構建體，或者可以直接轉染至細胞的RNA構建體。
在一個方面，本發明揭露內容提供了包含編碼本文所提供的CAR和/或表現所述CAR的核酸序列的分離的細胞。
在某些實施方式中，包含編碼CAR或表現CAR的核酸的細胞選自T細胞、NK細胞、細胞毒T淋巴細胞（CTL）和調節性T細胞。在一個實施方式中，當CAR的抗原結合結構域結合至其相應抗原時，包含編碼CAR或表現CAR的核酸的細胞顯示出抗腫瘤免疫性。所述細胞毒性淋巴細胞將較佳地是自體同源細胞，儘管可以使用異源細胞或同種異體細胞。如本文所使用的，「自體同源的」表示來源於隨後將重新引入該個體的相同個體的任何材料。
在一個方面，本發明揭露內容還提供了用於刺激對受試者中TSLP-富集環境或組織的T細胞-介導的免疫反應的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的基因修飾以表現本文所提供的CAR的細胞。
在一個方面，本發明揭露內容進一步提供了用於治療患有與TSLP表現升高有關的疾病、病症或病況的哺乳動物的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效量的基因修飾以表現本文所提供的CAR的細胞，借此治療所述哺乳動物。在某些實施方式中，所述細胞是自體同源T細胞。在某些實施方式中，所述哺乳動物已診斷患有與TSLP表現升高有關的疾病、病症或病況。
使用方法
在另一個方面，提供了治療將受益於TSLP活性調節的受試者中疾病、病症或病況的方法。在另一個方面，提供了治療對其有需要的受試者中TSLP相關疾病或病症的方法。在另一個方面，提供了治療對其有需要的受試者中對TSLP抑制起反應的疾病、病症或病況的方法。
在一些實施方式中，所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的本文所提供的抗體或其抗原結合片段，或者編碼本文所提供的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸和/或本文所提供的藥物組合物。在某些實施方式中，所述受試者是人。
在一些實施方式中，TSLP相關疾病或病症是TSLP-陽性疾病或病症。在一些實施方式中，已將要治療的受試者鑑別為患有TSLP-陽性疾病或病症。在一些實施方式中，TSLP相關疾病、病症或病況對TSLP抑制起反應。在一些實施方式中，TSLP相關疾病、病症或病況與TSLP介導的訊息傳遞的調控異常有關，或者更具體地，與上調的TSLP訊息傳遞有關。
在一些實施方式中，所述疾病或病症與TSLP介導的訊息傳遞的細胞調控異常有關。在一些實施方式中，TSLP介導的訊息傳遞的調控異常包括透過磷酸化的STAT5活化的調控異常。在一些實施方式中，TSLP介導的訊息傳遞的調控異常包括與對照水平（例如，健康受試者中的水平）相比，表現TSLPR的細胞增殖的調控異常。
在一些實施方式中，所述疾病或病症選自炎性疾病、自體免疫疾病或癌症。
在一些實施方式中，所述疾病或病症選自：哮喘（包括嚴重哮喘）、特發性肺纖維化、異位性皮膚炎（AD）、過敏症結膜炎、過敏性鼻炎（AR）、Netherton症候群（NS）、嗜酸細胞性食管炎（EoE）、食物過敏、過敏性腹瀉、嗜酸細胞性胃腸炎、過敏性支氣管肺麯黴病（ABPA）、過敏性真菌性鼻竇炎、慢性瘙癢、癌症、類風濕性關節炎、慢性阻塞性肺病COPD、全身性硬化症、多發性硬化、瘢痕瘤、潰瘍性結腸炎、慢性鼻竇炎（CRS）、息肉病、慢性嗜酸細胞性肺炎、嗜酸細胞性支氣管炎、過敏性支氣管肺麯黴病、腹腔病、嗜酸細胞性胃腸炎、Churg-Strauss症候群、嗜酸細胞增多肌痛症候群、嗜酸性白細胞增多症候群、伴有多血管炎的嗜酸性肉芽腫病、嗜酸細胞性食管炎、炎症性腸病、纖維化病症、炎症性腸病、霍奇金淋巴瘤、全身性紅斑狼瘡。
在一些實施方式中，所述癌症選自：乳腺癌、胰癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌和B細胞急性淋巴母細胞性白血病。
在一些實施方式中，所述纖維化病症選自：全身性和局部硬皮病、瘢痕瘤和肥厚性瘢痕、間質性肺病（ILD）、特發性肺纖維化（IPF）、由慢性B肝或C肝感染產生的肝臟纖維化、輻射引起的纖維化和由創傷癒合產生的纖維化、動脈粥狀硬化、再狹窄、肺部炎症和纖維化、肝硬化、腎病、由疤痕組織產生的心臟病和眼部疾病，如黃斑變性和視網膜和玻璃體視網膜病、由化療藥物產生的纖維化以及損傷和灼傷。
在一些實施方式中，所述疾病選自哮喘、息肉性鼻竇炎、COPD、蕁麻疹、EoE和異位性皮膚炎。
TSLP在所關心的生物樣品中的存在和/或量可以指示所述生物樣品所來源的受試者是否可以有可能對抗-TSLP抗體起反應。多種方法可以用於確定來自所述受試者的測試生物樣品中TSLP的存在和/或量。例如，可以將所述測試生物樣品暴露於抗-TSLP抗體或其抗原-結合片段，其結合至並檢測所表現的TSLP蛋白。作為另外一種選擇，還可以使用方法，如qPCR、反轉錄酶PCR、微陣列、基因表現系列分析（SAGE）、螢光原位雜交（FISH）等在核酸表現量檢測TSLP。在一些實施方式中，所述測試樣品來源於上皮組織。在某些實施方式中，所述測試生物樣品中TSLP的存在或上調水平指示了反應性的可能性。如本文所使用的，術語「上調」是指與如使用相同方法所檢測的參考樣品中的TSLP表現量相比，測試樣品中TSLP的表現量整體升高不小於10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或以上。參考樣品可以是得自健康或非患病個體的對照樣品，或者得自獲得所述測試樣品的相同個體的健康或非患病樣品。
本文所提供的抗體或抗原-結合片段的治療有效量將取決於本領域中已知的多種因素，如（例如）受試者的體重、年齡、既往病史、目前藥物治療、健康狀況，以及交叉反應、過敏症、敏感性和不利副作用的潛能，以及施用途徑和發病程度。如這些及其它情況或要求所指示，本領域中具有通常知識者（例如，醫師或獸醫）可以按比例降低或升高劑量。
在某些實施方式中，可以以約0.01mg/kg至約100mg/kg的治療有效劑量施用本文所提供的抗體或抗原-結合片段。在某些實施方式中，施用劑量可以隨治療過程改變。例如，在某些實施方式中，初始施用劑量可以高於後續施用劑量。在某些實施方式中，基於受試者的反應，施用劑量可以隨治療過程改變。
可以調節劑量方案以提供最優的所期望的反應（例如，治療反應）。例如，可以施用單一劑量，或者可以隨時間施用幾個劃分劑量。
可以透過本領域中已知的任何途徑，如（例如）腸胃外（例如，皮下、腹膜內、靜脈內，包括靜脈內輸注、肌內或皮內注射）或非腸胃外（例如，口服、鼻內、眼內、舌下、直腸或局部）途徑施用本文所提供的抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方式中，可以單獨或與治療有效量的第二治療劑組合施用本文所提供的抗體或其抗原結合片段。例如，可以將本文所揭露的抗體或其抗原結合片段與第二治療劑組合施用。
作為共軛物部分有用的治療劑或藥物可以是對於治療哮喘、息肉性鼻竇炎、慢性阻塞性肺病（COPD）、蕁麻疹、嗜酸細胞性食管炎（EoE）和異位性皮膚炎等有用的那些。
在一些實施方式中，第二治療劑包括用於治療哮喘的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述第二治療劑包含β2-腎上腺素能受體促效劑（SABA，如沙丁胺醇、沙美特羅、福莫特羅等）、腎上腺素促效劑（如吸入式腎上腺素）、皮質類固醇（較佳地，吸入形式，如倍氯米松）、白細胞三烯受體拮抗劑（如孟魯司特和紮魯司特）、肥大細胞穩定劑（如色甘酸鈉）、大環內脂類抗菌素或它們的組合。
在一些實施方式中，第二治療劑包括用於治療息肉性鼻竇炎的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包含抗生素、激酶抑制劑或類固醇。
在一些實施方式中，第二治療劑包括用於治療COPD的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包括抗生素（包括阿莫西林在內、多西環素和阿奇黴素）、β2-腎上腺素促效劑、抗膽鹼能藥（如異丙托銨鹽和噻托銨鹽）、長效毒蕈鹼拮抗劑（LAMA，如噻托銨鹽）、阿地銨（aclidinium）、LAMA溴化阿地銨（umeclidinium bromide）、皮質類固醇、磷酸二酯酶-4抑制劑（PDE4抑制劑，如羅氟司特）等。
在一些實施方式中，第二治療劑包括用於治療蕁麻疹的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包括抗組胺劑、全身類固醇、白細胞三烯-受體拮抗劑、抗炎藥、奧馬珠單抗、免疫抑制劑等。非限制性示例性抗組胺劑包括苯海拉明、羥嗪、氯雷他定、西替利嗪、地氯雷他定、非索非那定等。
在一些實施方式中，第二治療劑包括用於治療EoE的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述第二治療劑包含氫離子幫浦抑制劑（PPI）、皮質類固醇等。
在一些實施方式中，第二治療劑包括用於治療異位性皮膚炎的治療劑或藥物。在一些實施方式中，所述共軛物部分包括皮質類固醇（如氫化可的松）、鈣神經素抑制劑（如他克莫司或吡美莫司）、他克莫司、吡美莫司、PDE-4抑制劑（如克立硼羅）、全身免疫抑制劑（如環孢素、甲氨蝶呤、干擾素γ-1b、嗎替麥考酚酯和硫唑嘌呤）、其它抗體（如度普利尤單抗、塔羅金單抗）等。
在某些這些實施方式中，與一種或多種其它治療劑組合施用的本文所提供的抗體或其抗原結合片段可以與一種或多種其它治療劑同時施用，並且在這些實施方式的某些中，可以作為相同藥物組合物的一部分施用所述抗體或其抗原結合片段和其它治療劑。然而，與另一種治療劑「組合」施用的抗體或其抗原結合片段不必須與所述治療劑或者在與所述治療劑相同的組合物中同時施用。當在本文中使用該短語時，即使所述抗體或抗原-結合片段和所述第二藥劑經由不同途徑施用，也可以將在另一種藥劑之前或之後施用的抗體或其抗原結合片段認為是與該藥劑「組合」施用。當有可能時，根據其它治療劑的產品資訊頁上所列的時間表或者根據Physicians' Desk Reference 2003（Physicians' Desk Reference,第57版; Medical Economics Company; ISBN:1563634457;第57版（2002年11月））或在本領域中熟知的規程，施用與本文所揭露的抗體或其抗原結合片段組合施用的其它治療劑。
在另一個方面，本發明揭露內容還提供了調節TSLP活性的方法，其包括將所述TSLP和TSLPR-陽性細胞暴露於本文所提供的抗體或其抗原結合片段。
在另一個方面，本發明揭露內容提供了檢測樣品中TSLP的存在或量的方法，其包括將所述樣品與本文所提供的抗體或其抗原結合片段接觸，並確定所述樣品中TSLP的存在或量。
在另一個方面，本發明揭露內容提供了診斷受試者中TSLP相關疾病、病症或病況的方法，其包括a）將得自所述受試者的樣品與本文所提供的抗體或其抗原-結合片段接觸；b）確定所述樣品中TSLP的存在或量；和c）將TSLP的存在或量與所述受試者中TSLP相關疾病、病症或病況的存在或狀態相關聯。
在另一個方面，本發明揭露內容提供了試劑盒，其包含任選地與可檢測部分共軛的本文所提供的抗體或其抗原結合片段，所述可檢測部分在檢測TSLP相關疾病、病症或病況中有用。所述試劑盒還可以包括使用說明書。
在另一個方面，本發明揭露內容還提供了本文所提供的抗體或其抗原結合片段在生產用於在受試者中治療、預防或減輕TSLP相關疾病、病症或病況的藥劑中，在生產用於診斷TSLP相關疾病、病症或病況的診斷試劑中的用途。
提供以下實施例以更好地闡明所主張的發明，而不應理解為對本發明範圍的限制。以下所描述的所有具體組成、材料和方法全部或部分屬本發明的範圍。這些具體組成、材料和方法不意欲限制本發明，而僅說明屬本發明範圍的具體實施方式。本領域中具有通常知識者可以在不運用發明能力且在不背離本發明的範圍的情況下開發等價組成、材料和方法。將理解可以在本文所述的程序中做出多種改變，同時仍在本發明的範圍內。本發明人的意圖在於這些改變包括在本發明的範圍內。
實施例：
實施例 1. TSLPR-hIL7Ra 蛋白表現
人IL7RA得自人IL-7R（NM_002185）cDNA株（Fenghui biological G120380），並且人TSLPR_23-231基因片段得自人CRLF2（NM_022148）cDNA株（Fenghui biological G157739）。透過合成GGS連接子連接兩個基因片段並構建至載體Ori.Vec.E016 pTT5-hIgG1.CH1.His。在序列中的N末端添加IgG輕鏈訊息肽序列並在C末端添加10×His肽。將目標載體huIL7Ra-huTSLPR His融合用於獲得純受體複合物。在透過定序驗證所構建的載體後，提取正確的株用於質體提取。製備轉染水平質體並轉染到freestyle 293T細胞中。在第7天收集上清液，然後透過鎳柱親和純化，並透過透析將蛋白更換至20mM PB和150mM NaCl緩衝液中。SDS-PAGE電泳和ELISA結合測定結果顯示蛋白純度大於90%並且評價結合活性是否合格。純化的TSLPR-hIL7Ra蛋白可以用於隨後的功能性篩選。
實施例 2. 細胞系建立
為了開發結合並阻斷TSLP功能的單株抗體，我們構建了以下細胞系。用慢病毒包裝所有所構建的穩定的過表現細胞系並用相關細胞系感染。
2.1 表現膜長形式和短形式人 TSLP 的細胞
長形式（29-159）和短形式（97-159）人TSLP（huTSLP）得自合成基因片段SD.hTSLP（NP_149024.1，R127A；R130S），然後構建至載體Ori.Vec.E055-pCDH.CMV-Sig.CD3TM-EF1.GFP.T2A.Puro-RE以獲得兩個過表現載體pCDH.CMV-Sig.CD3TM-EF1.GFP.T2A.Puro-RE-hLTSLP、pCDH.CMV-Sig.CD3TM-EF1.GFP.T2A.Puro-RE-hSTSLP，其透過CD3的跨膜區在細胞膜上展示TSLP蛋白。膜長形式huTSLP融合蛋白的胺基酸序列顯示為SEQ ID NO：80。膜短形式huTSLP融合蛋白的胺基酸序列顯示為SEQ ID NO：79。在對質體定序以驗證正確表現框後，透過包裝慢病毒並感染HEK-293細胞構建相關細胞的過表現細胞系。
短形式TSLP包含在膜短形式TSLP融合蛋白中，其在細胞膜上表現。膜短形式TSLP融合蛋白還在短形式TSLP序列的N末端包含訊息肽，並在短形式TSLP序列的C末端包含跨膜區，其中胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示。
膜短形式TSLP融合蛋白的胺基酸序列（SEQ ID NO：79）：
MALPVTALLLPLALLLHAARPMFAMKTKAALAIWCPGYSETQINATQAMKKARKSKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
長形式TSLP包含在膜長形式TSLP融合蛋白中，其在細胞膜上表現。膜長形式TSLP融合蛋白還在長形式TSLP序列的N末端包含訊息肽，並在長形式TSLP序列的C末端包含跨膜區，其中胺基酸序列如SEQ ID NO：80所示。
膜長形式TSLP融合蛋白的胺基酸序列（SEQ ID NO：80）：
MALPVTALLLPLALLLHAARPYDFTNCDFEKIKAAYLSTISKDLITYMSGTKSTEFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQINATQAMKKARKSKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
2.2 表現膜 CyTSLP 的細胞
根據NCBI上食蟹猴TSLP（XM_00557498.2）的胺基酸和核苷酸序列資訊，合成基因CyTSLP並構建至載體Ori.Vec.E055-pCDH.CMV-Sig.CD3TM-EF1.GFP.T2A.Puro-RE，並獲得過表現載體pCDH.CMV-Sig.CD3TM-EF1.GFP.T2A.Puro-RE-CynoTSLP，其透過CD3的跨膜區在細胞膜上展示CyTSLP蛋白。膜CyTSLP融合蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO：81所示。在對質體定序以驗證正確表現框後，透過包裝慢病毒並感染HEK-293和Ba/F3細胞構建相關細胞的過表現細胞系。
膜CyTSLP融合蛋白的胺基酸序列（SEQ ID NO：81）：
MALPVTALLLPLALLLHAARPYDFTNCDFQKIEADYLRTISKDLITYMSGTKSTDFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTPRCASLAKEMFARKTKATLALWCPGYSETQINATQAMKKRRKRKVTTNKCLEQVSQLLGLWRRFIRTLLKKQTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
2.3 表現膜 huTSLPR-huIL7Ra 的細胞
全長人IL7RA基因片段和人TSLPR基因片段得自人IL7R（NM_002185）cDNA株（Fenghui biological G120380）和人CRLF2（nm_022148）cDNA株（Fenghui biological G157739）。透過同源重組分別將它們構建至載體pLVX-IRES-Neo和載體Ori.Vec.E025-pCDH-CMV.MCS-EF1.CopGFP.T2A.Puro，獲得兩個過表現載體人IL7Ra-pLVX-IRES-Neo和人TSLPR-pCDH-CMV-Puro。人IL7RA蛋白的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：71所示。人TSLPR蛋白的胺基酸序列如SEQ ID NO：72所示。在對質體定序以驗證正確表現框後，透過包裝慢病毒並感染HEK-293和Ba/F3細胞構建相關細胞的過表現細胞系。
2.4 表現 hTSLPR-hIL7Ra 和 STAT5- 螢光素酶的 293T 細胞
將STAT5螢光素酶病毒用於感染293T-hTSLPR-hIL7Ra穩定細胞。24小時後，更換新鮮培養基並添加100μg/ml hygro用於篩選。篩選8天后，檢測FACS的陽性率。所表現的細胞的陽性率大於90%。可以在用hTSLP刺激後檢測螢光素酶的表現，其指示細胞表現的受體具有活化STAT5螢光素酶的功能。
實施例 3. 免疫
為了獲得特異性結合至長形式TSLP的抗體，選擇6-8週大的SPF Balb/C雌性健康小鼠（購自Zhejiang Vital River Experimental Animal Technology Co., Ltd.）。用重組人長形式TSLP抗原（購自ACRO，TSP-H52Ha，具有SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列，突變長形式TSLP具有R127A和R130A突變）和相等體積的弗氏佐劑使小鼠免疫幾次，第一次使用弗氏不完全佐劑並且加強使用弗氏不完全佐劑。從第二加強免疫，在每次加強免疫後6-8天內收集小鼠的眼眶血，並透過間接ELISA檢測小鼠的免疫血清滴度。結果顯示小鼠可以在免疫後產生對人長形式TSLP特異的高滴度抗體，表明該方案可以滿足後續融合瘤抗體的製備。
實施例 4. 融合瘤產生和篩選
將在兩次加強免疫後具有穩定且合格的血清滴度的小鼠選擇用於細胞融合。將這些小鼠的脾臟淋巴細胞與SP2/0骨髓瘤細胞電融合。透過次黃嘌呤胺基蝶呤胸腺嘧啶核苷（HAT）篩選所述融合株並培養7天。透過間接ELISA（與以下本實施例4.1節中所述的方法相同）檢測細胞上清液。
將流式細胞術（與以下本實施例4.2節所述的方法相同）用於檢測上清液對人長形式TSLP（His標記，TSP-H52Ha）、猴長形式TSLP（His標記，TSP-C52H8）（全部購自ACRO）對293T-hTSLP/hIL7Ra細胞的結合的阻斷活性。
根據ELISA和流式細胞術的結果，選擇具有優良ELISA結合和FACS阻斷活性的株，並且透過有限稀釋法實施2-3輪亞轉植。當亞轉植培養物均為ELISA陽性且至少兩個單株培養物為流式細胞陽性時，從每個融合瘤選擇兩個株用於株鑑定和擴增培養。
在亞轉植篩選後，最終獲得98個人TSLP特異性融合瘤細胞系用於後續開發。
透過融合瘤抗體的重鏈和輕鏈序列的分析，將69個具有不同VH序列的融合瘤細胞在無血清培養基中培養以表現融合瘤抗體。收集培養上清液，透過蛋白G親和純化，並透過透析將抗體更換至20mM PB和150mM NaCl緩衝液中。透過SDS-PAGE電泳和結合驗證，抗體純度＞90%並且結合活性合格，其可以用於後期抗體篩選。
4.1 ELISA 結合測試
用PBS製備1μg/ml人長形式TSLP蛋白（Acro，tsp-h5255或tsp-h52ha）或食蟹猴長形式TSLP蛋白（Acro，tsp-c52h8）抗原溶液，以25μl/孔在4℃在384孔盤中塗覆過夜。棄去抗原塗覆溶液。添加80μl/孔的3%的牛奶並在室溫下密封1.5小時。棄去上清液，並用PBST（0.1% T20）清洗盤3次。將25μl的樣品加入至384孔盤以在室溫下培育1小時。棄去上清液，並用PBST（0.1% T20）清洗盤3次。將每孔25μl的第二抗體加入至384孔盤以在室溫下培育1小時。棄去上清液，並用PBST（0.1% T20）清洗盤7次。以25μl/孔添加HRP基質TMB。在培育12分鐘後，加入25μl終止溶液和2M HCl以終止反應。將酶標儀用於讀取450nm的吸光度值。識別並選擇對人長形式TSLP顯示出特異性結合的抗體。
4.2 FACS 阻斷測試
用細胞培養基稀釋抗體並將50μl每孔轉移至新的96孔盤。每孔添加10μl的0.012μg/ml人長形式TSLP蛋白（Acro，tsp-h52ha）或食蟹猴長形式TSLP蛋白（Acro，tsp-c52h8）以在4℃培育0.5h。將293T-TSLPR-IL7R穩定細胞（根據實施例2的2.3節構建）加入至96孔盤，並在離心後棄去上清液。將50μl預培育的抗體和TSLP轉移至細胞盤，混合，並在4℃培育0.5小時。離心後，用PBS清洗上清液3次，並在離心後棄去上清液。將50μl第二抗體加入至96孔盤，在4℃培育0.5小時。離心後用PBS清洗上清液3次，並在離心後棄去上清液。用100μl PBS將細胞再混懸，並透過流式細胞術讀取螢光值。識別並選擇對長形式人TSLP與293T-TSLPR-IL7R穩定細胞的結合顯示出特異性阻斷的抗體。
4.3 膜 CyTSLP 表現細胞結合測試
將CyTSLP表現細胞（根據實施例2的2.2節構建）加入至96孔盤，並在離心後棄去上清液。將50μl用D10（DMEM+10% FBS）稀釋的抗體溶液轉移至細胞盤以在4℃培育0.5小時。離心後用PBS清洗盤3次，並在離心後棄去上清液。將50μl第二抗體加入至96孔盤以在4℃結合0.5小時。離心後除去上清液，用PBS清洗盤3次，並在離心後棄去上清液。用100μl PBS將細胞再混懸，並透過流式細胞術讀取螢光值。
4.4 TSLP 依賴性 BaF3 增殖測試
在BaF3-hTSLPR-hIL7R細胞融化後，用融合瘤無血清培養基清洗它們兩次，稀釋至4E5/ml，並每孔30μl添加至384孔細胞培養盤。將融合瘤無血清培養基用於製備20ng/ml人長形式TSLP蛋白（Acro，tsp-h52ha），並且將15μl每孔加入至細胞培養盤。用融合瘤無血清培養基製備抗體，並將15μl每孔添加至細胞培養盤，以在37℃和5% CO 2的細胞培養箱中培育72小時。取出384孔細胞培養盤並添加15μl CTG（Promega，g7572）。離心後，將盤振盪5min，再次離心，並在30min內讀取發光值。識別並選擇對重組長形式TSLP誘導的BaF3增殖顯示出特異性抑制的抗體。
透過如實施例4.1、4.2和4.4所述的ELISA、FACS阻斷測試和功能測試，選擇具有優良活性的株用於嵌合抗體製備。透過嵌合表現抗體進一步驗證和篩選這些候選序列。
實施例 5. 嵌合抗體產生和篩選
根據融合瘤抗體篩選結果，我們構建了重組表現載體並純化所選擇的15個抗體。所述過程如下所示：使用透過融合瘤定序獲得的重鏈定序質體作為模板，透過PCR擴增所述重鏈可變區片段並透過同源重組將其轉殖至pTT5-hIgG2.CH載體中以獲得嵌合抗體重鏈表現載體，所述重鏈可變區片段含有IgG2重鏈恆定區的胺基酸序列。類似地，使用透過融合瘤定序獲得的輕鏈定序質體作為模板，透過PCR擴增輕鏈可變區片段並轉殖至pTT5-hKappa.CL載體中以獲得嵌合抗體輕鏈表現載體，所述輕鏈可變區片段具有κ輕鏈的輕鏈恆定區CL的胺基酸序列。
將所構建的瞬時表現載體用於製備50-100μg無內毒素質體，然後將其轉染至freestyle 293T細胞，透過蛋白A親和純化並透過透析將抗體更換至20mM PB和150mM NaCl緩衝液中。其中，由於它們的低表現，兩個株未獲得。在SDS-PAGE電泳和結合驗證後，其它13個抗體純度＞90%並且結合活性合格，其可以用於後期抗體篩選。
然後，按照如實施例4所述的相同方法，透過FACS阻斷測試和功能測試篩選兩個具有優良活性的株39H11和35G12用於人源化。
將39H11嵌合抗體命名為Chi39H11並且將35G12嵌合抗體命名為Chi35G12。顯示了結合測試（圖1、圖2和圖7）、阻斷測試（圖3）和功能測試（圖8）結果。
實施例 6. 人源化和引導產生
6.1 39H11
根據通常已知的CDR移植方法將候選抗體人源化。使用IMGT/V-QUEST工具（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/input），分析抗體重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）序列以確定抗體輕鏈和重鏈的CDR區序列。使用IgBlast工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/），分析抗體胺基酸序列以獲得人類最近的VH和VL序列。將抗體CDR區移植到所選VH和VL序列的框架區，它們是人源化抗體序列。
然後，對抗體序列中的各個胺基酸實施回復突變。實施人（ Homo sapiens）密碼子最佳化和基因合成，將重鏈基因構建至含有IgG2重鏈恆定區的胺基酸序列的pTT5-hIgG2.CH載體中，並將輕鏈基因構建至含有抗體κ輕鏈恆定區的胺基酸CL序列的pTT5-hKappa.CL載體中。將所構建的瞬時表現載體與輕鏈和重鏈配對，並轉染至freestyle 293T細胞。表現並純化抗體，然後用於定量、結合、阻斷和功能評價。選擇兩個人源化抗體株39H11Z07和39H11Z11用於進一步評價。
將小鼠序列的回復突變引入人源化序列的相應位點。獲得突變體載體，配對並轉染至freestyle 293T細胞。表現並純化抗體，並測試結合、阻斷和功能評價。
結果如圖4a、4b、5a、5b和6所示。結果顯示39H11Z07和39H11Z11的阻斷活性與Chi39H11相當（圖5a、5b）並且功能優於BMK（圖6）。
6.2 35G12
根據通常已知的CDR移植方法將候選抗體人源化。使用IMGT/V-QUEST工具（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/input），分析抗體重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）序列以確定抗體輕鏈和重鏈的CDR區序列。使用IgBlast工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/），分析抗體胺基酸序列以獲得人類最近的VH和VL序列。將抗體CDR區移植到所選VH和VL序列的框架區，它們是人源化抗體序列。
然後，對抗體序列中的各個胺基酸實施回復突變。實施人（ Homo sapiens）密碼子最佳化和基因合成，將重鏈基因構建至含有IgG2重鏈恆定區的胺基酸序列的pTT5-hIgG2.CH載體中，並將輕鏈基因構建至含有抗體κ輕鏈恆定區的胺基酸CL序列的pTT5-hKappa.CL載體中。將所構建的瞬時表現載體與輕鏈和重鏈配對，並轉染至freestyle 293T細胞。表現並純化抗體，然後用於定量、結合、阻斷和功能評價。
將小鼠序列的回復突變引入人源化序列的相應位點。獲得突變體載體，配對並轉染至freestyle 293T細胞。表現並純化抗體，並測試結合、阻斷和功能評價。選擇3種人源化抗體株35G12Z01、35G12Z02和35G12Z03用於進一步評價。
然後，根據嵌合抗體的製備方法實施抗體的表現和純化。測試所獲得的抗體的結合活性、阻斷活性和功能。結果如圖9至圖11所示。結果表明35G12Z01、35G12Z02和35G12Z03的BaF3細胞的人長形式TSLP依賴性增殖的抑制作用優於BMK和Chi35G12（圖11）。
實施例 7. 體外鑑定
透過具有降低的ADCC和延長的半衰期的Fc修飾兩個篩選的抗體39H11Z07和35G12Z03。
引入S228P\F234A\L235A\M252Y\S254T\T256E\K447del突變以獲得IgG4-PAA-YTE重鏈恆定區表現載體。IgG4-PAA-YTE重鏈恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：75所示。
人IgG4-PAA-YTE重鏈恆定區的胺基酸序列（SEQ ID NO：75）：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
引入L234A\L235A\M252Y\S254T\T256E突變以獲得IgG1-LALA-YTE重鏈恆定區表現載體。IgG1-LALA-YTE重鏈恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：88所示。重鏈恆定區IgG1-LALA-YTE Fc的胺基酸序列（SEQ ID NO：88）：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
透過PCR擴增39H11Z07重鏈可變區片段並透過同源重組轉殖至含有IgG4-PAA-YTE重鏈恆定區胺基酸序列的pTT5HE-hIgG4CH-PAA-YTE-RE載體，並且獲得39H11Z07 Fc替換的表現載體。類似地，以h35G12.H3質體作為模板透過PCR擴增35G12Z03重鏈可變區片段並透過同源重組轉殖至含有IgG4-PAA-YTE重鏈恆定區胺基酸序列的pTT5HE-hIgG4CH-PAA-YTE-RE載體中。
獲得35G12Z03 Fc替換的表現載體。將所構建的瞬時表現重鏈載體及其相應輕鏈載體用於製備無內毒素質體，然後將其轉染至freestyle 293T細胞，透過蛋白A親和純化並透過透析或陽離子色層分析法將抗體更換至20mM PB和150mM NaCl緩衝液中。
在實施例中，所使用的基準（縮寫為BMK）為AMG 157，其中重鏈包含SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列且輕鏈包含SEQ ID NO：78所示的胺基酸序列。
AMG 157重鏈的胺基酸序列（SEQ ID NO：77）：
QMQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKHYADSVKGRFTITRDNSKNTLNLQMNSLRAEDTAVYYCARAPQWELVHEAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
AMG 157輕鏈的胺基酸序列（SEQ ID NO：78）：
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNLGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSWIPERFSGSNSGNTATLTISRGEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
鑑定所得抗體的結合、阻斷和功能試驗，其結果如圖12至圖16所示。結果表明不同的Fc抗體在結合活性、阻斷活性和功能方面差異很小，且均優於BMK。
7.1 ELISA 結合
用PBS製備1μg/ml人長形式TSLP蛋白（Acro，tsp-h5255或tsp-h52ha）或食蟹猴長形式TSLP蛋白（Acro，tsp-c52h8）抗原溶液，以25μl/孔在4℃在384孔盤中塗覆過夜。棄去抗原塗覆溶液。添加80μl/孔的3%的牛奶並在室溫下密封1.5小時。棄去上清液，並用PBST（0.1% T20）清洗盤3次。將25μl的樣品加入至384孔盤以在室溫下培育1小時。棄去上清液，並用PBST（0.1% T20）清洗盤3次。將每孔25μl的第二抗體加入至384孔盤以在室溫下培育1小時。棄去上清液，並用PBST（0.1% T20）清洗盤7次。以25μl/孔添加HRP基質TMB。在培育12分鐘後，加入25μl終止溶液和2M HCl以終止反應。將酶標儀用於讀取450nm的吸光度值。
圖12顯示了結果，其顯示在本發明揭露內容中抗體mAb35G12和mAb39H11可以結合至TSLP蛋白。
7.2 親和力確定
使用Gator和HFC的探針（Gator，pl168-160003）確定抗體的親和力。採用5步，包括平衡、加載、平衡、結合和解離。
將不同類型的抗體稀釋至10μg/ml的濃度用於加載，然後分別用具有50nm、25nm、12.5nm、6.25nm、3.12nm、1.56nm和0濃度參考的相同濃度的人長形式TSLP蛋白（Acro，tsp-h5255或tsp-h52ha）平衡傳感器。測試Kon值。在結合達到平衡後，在解離緩衝液中確定抗體抗原複合物的解離曲線並計算koff值。
候選分子的Kd值如下。結果表明與抗原組合的候選株mAb35G12和mAb39H11的不同Fc形式的Kd值與AMG157抗體的Kd值相當。
表6 使用Gator的親和力確定
樣品 Koff(1/s) Kon(1/Ms) KD(M) 完全R 2
mAb35G12 2.28E-03 1.15E+06 1.98E-09 0.958
mAb39H11 3.31E-03 1.58E+06 2.10E-09 0.908
BMK 1.69E-03 2.13E+06 7.49E-10 0.971
7.3 與不同物種的 TSLP 的結合
為了檢測抗體與不同種類的TSLP的結合，用PBS製備1μg/ml人長形式TSLP蛋白（ACRO，tsp-h5255或tsp-h52ha）、食蟹猴長形式TSLP蛋白（ACRO，tsp-c52h8）、小鼠長形式TSLP蛋白（ACRO，tsp-m52h8）和大鼠長形式TSLP蛋白（ACRO，tsp-r52h3）抗原溶液。以25μl塗覆384孔盤的每個孔並在4℃塗覆過夜。然後，棄去上清液，並添加80μl/孔的3%的牛奶並在室溫下密封1.5小時。棄去上清液，並用PBST（0.1% T20）清洗盤3次。將25μl要測試的樣品加入至384孔盤以在室溫下培育1小時。棄去上清液，並用PBST（0.1% T20）清洗盤3次。將每孔25μl的第二抗體加入至384孔盤以在室溫下培育1小時。棄去上清液，並用PBST（0.1% T20）清洗盤7次。以25μl/孔添加HRP基質TMB。12分鐘後，加入25μl終止溶液和2M HCl以終止反應。將酶標儀用於讀取450nm的吸光度值。
圖13a至13d顯示了結果。ELISA結果顯示所有mAb35G12和mAb39H11分子可以結合人長形式TSLP，並且除BMK可以以低效力結合至猴長形式TSLP之外，無一分子可以結合猴、大鼠和小鼠長形式TSLP。
7.4 表位分析
使用Gator和His探針（Gator，pl168-160009）確定抗體表位。
在將探針平衡後，加載濃度5μg/ml的人長形式TSLP蛋白（Acro，tsp-h52ha）抗原。平衡後加載10μg/ml的第一抗體，再次平衡後加載10μg/ml的第二抗體。最終，獲得第二抗體的結合厚度（nm），並將該參數用於分析表位是否相同。
圖14中顯示了結果，其表明Chi39H11和Chi35G12的結合表位與BMK不同。
7.5 受體阻斷
人源化抗體的受體阻斷測試規程與實施例4.1中所述的那些相同。
圖15顯示了結果，其表明本發明揭露內容中的抗體mAb35G12和mAb39H11可以阻斷TSLP與293T-hTSLPR-hIL7R的細胞表面的結合。
7.6 短形式 TSLP 結合
將短形式huTSLP（97-159）表現細胞加入至96孔盤，並在離心後棄去上清液。將50μl用D10稀釋的抗體溶液轉移至細胞盤以在4℃培育0.5小時。離心後用PBS清洗盤3次，並在離心後棄去上清液。將50μl第二抗體加入至96孔盤以在4℃結合0.5小時。離心後除去上清液，用PBS清洗盤3次，並在離心後棄去上清液。用100μl PBS將細胞再混懸，並透過流式細胞術讀取螢光值。
圖16顯示了結果，其表明在本發明揭露內容中抗體mAb35G12和mAb39H11無一可以結合至表現短形式huTSLP的細胞表面。
7.7 消化的 TSLP 結合
為了測試抗體對TSLP的消化形式和非消化形式的結合，在該研究中使用了3種不同形式的TSLP。H52Ha具有SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列並且是具有賦予酶促消化耐受性的R127A和R130A突變的突變的長形式TSLP。H52Hb具有SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列並且是在130含有切割位點且易於被酶促消化的天然長形式TSLP。
要消化的TSLP H53Hb（ACRO #tsp-h52hb）包含SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列。未消化的TSLP H53Ha（ACRO #tsp-h52ha）包含SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列。
YDFTNCDFEKIKAAYLSTISKDLITYMSGTKSTEFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQINATQAMKK RRK RKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQ（SEQ ID NO：82）
YDFTNCDFEKIKAAYLSTISKDLITYMSGTKSTEFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKTKAALAIWCPGYSETQINATQAMKK ARK AKVTTNKCLEQVSQLQGLWRRFNRPLLKQQ（SEQ ID NO：73）
為了獲得天然長形式TSLP的消化產物H53Hb-d，製備了100μL消化緩衝液（25mM Tris，1mM CaCl 2，0.5%（w/V）Brij-35，pH 9.0）的完全系統以用於在37℃酶促消化24小時，其中長形式天然TSLP（ACRO #tsp-h52hb）的工作濃度為10μg/ml並且PCSK3的工作濃度為12μg/ml。然後，將消化產物（稱為52Hb-d）分別製備至還原和非還原樣品的免疫印跡系統（5μg/孔），並且還添加未消化的天然TSLP H53Hb（ACRO #tsp-h52hb）和未消化的突變體TSLP H53Ha（ACRO #tsp-h52ha）同時用於SDS-PAGE電泳。
透過還原SDS-PAGE檢測酶消化作用。52Ha顯示由於突變無消化形式片段，而野生型序列52Hb顯示出明顯消化片段，其可以歸因於生產過程期間存在的天然的酶。此外，一旦增添PCSK3，52Hb被進一步完全消化，如圖17所示。
該結果證實52Hb包含未消化和消化的TSLP的混合物，而52Hb-d是完全消化的TSLP樣品，對兩者進一步測試了抗-TSLP抗體結合活性。
處理了3種形式的TSLP蛋白（分別為52Ha、52Hb和52Hb-d），將其加載至SDS-PAGE蛋白上樣緩衝液並製備成濃度0.5μg/20μl的還原樣品（含有DTT）和非還原樣品（不包括DTT）。在SDS-PAGE電泳後，使用Beyotime膜轉移裝置將樣品轉移至膜（PVDF膜），將膜轉移電流設置為300mA並且將膜轉移時間設置為60min，並且密封（增添Western阻斷溶液，在搖床上緩慢振盪，在37℃阻斷大於1小時，並在室溫下阻斷大於2小時）。
一抗：用抗體稀釋劑分別將BMK、35G12Z03和39H11Z07稀釋至2μg/ml的濃度，培育2h，用清洗溶液清洗3次（每次10min）。在本文中，3種抗體中的每一種包含IgG2重鏈恆定區（SEQ ID NO：83）和IgG2輕鏈恆定區（SEQ ID NO：84）。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO：83）
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID NO：84）
第二抗體：用抗體稀釋劑1:2000稀釋第二抗體抗HuIgG HRP（Sino ssa002），在室溫下培育60min，用清洗溶液清洗3次（每次10min）。
使用化學發光法顯色：將兩個抗PVDF膜置於螢光和化學發光成像系統。將相同體積的發光液A和B混合並均勻分佈在PVDF薄膜上。運行凝膠成像系統軟體並設置暴露時間。
分別在還原和非還原條件下，用如上所指明的第一和第二抗體對52Ha、52Hb和52Hb-d TSLP蛋白進行免疫印跡。圖18a（使用非還原樣品）和18b（使用還原樣品）顯示結果。測量每個單一泳道中總化學發光的灰度值。
結果顯示本發明揭露內容中的分子可以有效結合至TSLP的消化形式（52Hb-d）。這種結合作用要比對於BMK分子所觀察到的強得多（例如，至少2倍）（參見圖18a，18b）。
7.8 STAT5 活化的阻斷
為了確定抗體阻斷長形式TSLP刺激的STAT5活化的功能，使用了處於良好生長狀態的293T-hTSLPR-hIL7Ra和STAT5-螢光素酶穩定細胞（根據實施例2的2.4節構建）。在胰蛋白酶消化和細胞計數後，將細胞稀釋至2×10 5/ml，並且將15μl/孔的細胞加入至384孔盤。用DMEM細胞培養基稀釋抗體溶液，並將15μl不同濃度的抗體溶液加入至384孔盤以用於在培育箱中培育30min。用DMEM細胞培養基製備30ng/ml人TSLP（ACRO，tsp-h52ha），並將15μl/孔的細胞加入至384孔盤並在37℃，5% CO 2培養4-6h。最終，添加25μl bright glo™螢光素酶測定系統（Promega, e2620）。在振盪5min後，透過酶標儀讀取發光值。
實驗結果如圖19所示。根據檢測結果，所存在的分子mAb35G12和mAb39H11可以很好地阻斷透過長形式TSLP刺激的STAT5活化。mAb35G12同種型的切換保留了類似的阻斷效力。與BMK抗體相比，候選株mAb35G12、mAb35G12_IgG1和mAb39H11的阻斷IC50明顯更好。
7.9 天然 TSLP- 誘導的 TARC 分泌的阻斷
誘導並從人肺纖維母細胞收集天然TSLP。簡要地，以80%的密度取出人肺纖維母細胞，用胰蛋白酶消化，並根據1:3繼代培養至T25培養瓶中。監測細胞密度和當它達到80%時，棄去上清液。透過在含有10ng/mL IL1-β、20ng/mL IL-13和20ng/mL TNF-α的培養基中培養人肺纖維母細胞誘導天然TSLP產生。在培育24小時後，將TSLP誘導的上清液收集到離心管中，然後以3000rpm離心10min以將上清液轉移至新的離心管。
用細胞培養基稀釋抗體。離心後融化PBMC，用細胞培養基再混懸細胞。將細胞濃度調節至1×10 7/ml，並將50μl/孔添加至96孔細胞培養盤。如以上所描述的製備天然TSLP，並將25μl/孔添加至96孔細胞培養盤以製備20ng/ml的最終濃度。每孔添加25μl稀釋的抗體溶液。24小時後，透過ELISA檢測TARC表現。
用PBS製備2μg/ml捕獲抗體（Sino，sek10233）抗原溶液，並以25μl每孔在384孔盤中塗覆，在4℃培育過夜。棄去上清液。添加80μl/孔的3%的牛奶並在室溫下密封1.5小時。棄去上清液，並用PBST（0.1% T20）清洗盤3次。將25μl要測試的樣品加入至384孔盤以在室溫下培育2小時。棄去上清液，並用PBST（0.1% T20）清洗盤3次。將每孔25μl的第二抗體溶液加入至384孔盤以在室溫下培育1小時。棄去上清液，並用PBST（0.1% T20）清洗盤7次。以25μl/孔添加HRP基質TMB。在培育12分鐘後，加入25μl終止溶液和2M HCl以終止反應。將酶標儀用於讀取450nm的吸光度值。
結果如圖20所示。結果顯示本發明揭露內容中的抗體mAb35G12和mAb39H11可以阻斷天然TSLP誘導的TARC分泌，其優於BMK。
7.10 重組 TSLP 依賴性 BaF3 增殖
人源化抗體的重組TSLP依賴性BaF3增殖測試規程與實施例4.2中所述的那些相同。
結果如圖21所示，其顯示本發明揭露內容中的抗體mAb35G12、mAb35G12_IgG1和mAb39H11可以阻斷TSLP誘導的BaF3-hTSLP-hIL7R細胞增殖，其優於BMK。mAb35G12同種型的切換保留了相對類似的阻斷效力。
7.11 天然 TSLP 依賴性 BaF3 增殖
以80%的密度取出人肺纖維母細胞，用胰蛋白酶消化，並根據1:3繼代培養至T25培養瓶中。監測細胞密度和當它達到80%時，棄去上清液。透過在含有10ng/mL IL1-β、20ng/mL IL-13和20ng/mL TNF-α的培養基中培養人肺纖維母細胞誘導TSLP產生。取出含有以上培養基但無細胞的另一個T25瓶。在含有無血清培養基的第三T25瓶中培養細胞。培育24小時後，將以上細胞上清液（TSLP誘導的上清液/未誘導的上清液/無細胞上清液）分別收集至離心管，然後以3000rpm離心10min以將所述上清液轉移至新的離心管。用無血清培養基稀釋抗體溶液。融化Baf3-TSLPR-IL7Ra並用培養基清洗兩次。將細胞再混懸並計數，並且將細胞密度調節至4×10 5/ml，添加30μl/孔至384孔細胞培養盤。以15μl/孔將TSLP誘導的上清液塗佈在384孔黑色細胞培養盤（分別將TSLP誘導的上清液加入至實驗孔並將TSLP誘導的上清液、未誘導的上清液/無細胞上清液加入至對照孔）在37℃和5% CO 2的細胞培養室中培養2天。取出384孔盤，添加15μl CTG，振盪5min，並在30min內讀取發光值。檢測baf3的增殖。
結果顯示僅透過細胞因子誘導的纖維母細胞可以刺激Baf3的增殖，表明該方法可以誘導天然TSLP的表現。
然後，我們透過與抗體抑制hTSLP蛋白刺激baf3增殖實驗相同的方法測試了抗體對天然TSLP誘導的Baf3增殖的抑制作用（參見實施例4.3）。圖22顯示了結果，其表明在本發明揭露內容中分子mAb35G12和mAb39H11可以有效阻斷baf3細胞增殖。在抑制作用中，本發明的分子優於BMK。
無
圖1顯示了如透過ELISA測量的抗體Chi39H11和BMK對TSLP的結合。
圖2顯示了如透過FACS所測量的抗體Chi39H11、BMK和對照對細胞膜上表現的人長形式TSLP的融合蛋白的結合。
圖3顯示了抗體Chi39H11、BMK和對照阻斷人長形式TSLP對TSLPR表現細胞的結合的活性。
圖4a和圖4b顯示了抗體Chi39H11、39H11Z07（圖4a）、39H11Z11（圖4b）、BMK和對照對細胞膜上表現的人長形式TSLP的細胞結合。
圖5a和圖5b顯示了抗體Chi39H11、39H11Z07（圖5a）、39H11Z11（圖5b）、BMK和對照阻斷人長形式TSLP對TSLPR表現細胞的結合的活性。
圖6顯示了抗體Chi39H11、39H11Z07、39H11Z11、BMK和對照抑制重組長形式TSLP依賴性BaF3增殖的活性。
圖7顯示了抗體Chi35G12、BMK和對照與細胞膜上表現的人長形式TSLP的細胞結合。
圖8顯示了抗體Chi35G12、BMK和對照抑制重組長形式TSLP依賴性BaF3增殖的活性。
圖9顯示了抗體Chi35G12、35G12Z01、35G12Z02、35G12Z03、BMK和對照與細胞膜上表現的人長形式TSLP的細胞結合。
圖10顯示了抗體Chi35G12、35G12Z01、35G12Z02、35G12Z03、BMK和對照阻斷人長形式TSLP對TSLPR表現細胞的結合的活性。
圖11顯示了抗體Chi35G12、35G12Z01、35G12Z02、35G12Z03、BMK和對照抑制重組TSLP依賴性BaF3增殖的活性。
圖12顯示了抗體mAb35G12、mAb39H11、BMK和對照與TSLP的蛋白結合。
圖13a至圖13d顯示了抗體mAb35G12、mAb39H11、BMK和對照對人TSLP蛋白（圖13a）、猴TSLP（圖13b）、小鼠TSLP（圖13c）和大鼠TSLP（圖13d）的蛋白結合。
圖14顯示了抗體39H11、35G12和BMK的表位分析結果。
圖15顯示了抗體mAb35G12、mAb39H11、BMK和對照阻斷人長形式TSLP對TSLPR表現細胞的結合的活性。
圖16顯示了抗體mAb35G12、mAb39H11、BMK和對照與細胞膜上表現的人短形式TSLP的細胞結合。
圖17顯示用抗-his-HRP對TSLP蛋白52Ha（即長形式突變體TSLP）、52Hb（長形式天然TSLP）和52Hb-d（即52Hb的消化產物）進行免疫印跡。
圖18a和18b顯示了抗體35G12Z03-IgG2、39H11Z07-IgG2和BMK對消化的TSLP的蛋白結合。
圖19顯示了透過抗體mAb35G12、mAb35G12_IgG1、mAb39H11、BMK和對照的TSLP依賴性STAT5活化的抑制。
圖20顯示了透過抗體mAb35G12、mAb39H11、BMK和對照對天然TSLP依賴性TARC分泌的抑制。
圖21顯示了透過抗體mAb35G12、mAb35G12_IgG1、mAb39H11、BMK和對照的TSLP依賴性BaF3增殖的抑制。
圖22顯示了透過抗體mAb35G12、mAb39H11、BMK和對照對天然TSLP依賴性BaF3增殖的抑制。
無
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Claims (63)

  1. 一種抗-TSLP抗體或其抗原-結合片段，其包含重鏈互補決定區1（HCDR1）、HCDR2和HCDR3，其中 （a）HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列； HCDR2包含IFPGDGX 1T（SEQ ID NO：59）所示的胺基酸序列；並且 HCDR3包含ARX 2GX 3X 4X 5X 6X 7X 8YAMDY（SEQ ID NO：60）所示的胺基酸序列； 其中，X 1是E或D；X 2是G或S；X 3是Y或F；X 4是V或D；X 5是N或Y；X 6是無或G；X 7是F或Y；X 8是L或F；或者 （b）HCDR1包含SYWX 9N（SEQ ID NO：61）所示的胺基酸序列； HCDR2包含QIFPGDGX 10TX 11YNGX 12FKG（SEQ ID NO：62）所示的胺基酸序列；並且 HCDR3包含X 13GX 14X 15X 16X 17X 18X 19YAMDY（SEQ ID NO：63）所示的胺基酸序列； 其中，X 9為M或I；X 10為E或D；X 11為N或T；X 12為K或N；X 13為G或S；X 14為Y或F；X 15為V或D；X 16為N或Y；X 17為無或G；X 18為F或Y；X 19為L或F。
  2. 一種抗-TSLP抗體或其抗原-結合片段，其包含輕鏈互補決定區1（LCDR1）、LCDR2和LCDR3，其中 （a）LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列； LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列；並且 LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列；或者 （b）LCDR1包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列； LCDR2包含GTSX 20LAS（SEQ ID NO：64）所示的胺基酸序列；並且 LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列； 其中，X 20為T或N。
  3. 根據請求項1或2所述的抗體或其抗原結合片段，其中 （a）HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列； HCDR2包含IFPGDGX 1T（SEQ ID NO：59）所示的胺基酸序列；並且 HCDR3包含ARX 2GX 3X 4X 5X 6X 7X 8YAMDY（SEQ ID NO：60）所示的胺基酸序列； LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列， LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，並且 LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列， X 1為E或D；X 2為G或S；X 3為Y或F；X 4為V或D；X 5為N或Y；X 6為無或G；X 7為F或Y；X 8為L或F； （b）HCDR1包含SYWX 9N（SEQ ID NO：61）所示的胺基酸序列； HCDR2包含QIFPGDGX 10TX 11YNGX 12FKG（SEQ ID NO：62）所示的胺基酸序列；並且 HCDR3包含X 13GX 14X 15X 16X 17X 18X 19YAMDY（SEQ ID NO：63）所示的胺基酸序列； LCDR1包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列； LCDR2包含GTSX 20LAS（SEQ ID NO：64）所示的胺基酸序列；並且 LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列； 其中，X 9為M或I；X 10為E或D；X 11為N或T；X 12為K或N；X 13為G或S；X 14為Y或F；X 15為V或D；X 16為N或Y；X 17為無或G；X 18為F或Y；X 19為L或F；X 20為T或N。
  4. 根據請求項3所述的抗體或其抗原結合片段，其中 （a）HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列， HCDR2包含SEQ ID NO：12或25所示的胺基酸序列， HCDR3包含SEQ ID NO：13或26所示的胺基酸序列， LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列， LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，並且 LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列；或者 （b）HCDR1包含SEQ ID NO：50或55所示的胺基酸序列， HCDR2包含SEQ ID NO：51或56所示的胺基酸序列， HCDR3包含SEQ ID NO：52或57所示的胺基酸序列， LCDR1包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列， LCDR2包含SEQ ID NO：54或58所示的胺基酸序列，並且 LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
  5. 根據請求項3所述的抗體或其抗原結合片段，其中 （a）HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列， HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列， HCDR3包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列， LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列， LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，並且 LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列；或者 （b）HCDR1包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列， HCDR2包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列， HCDR3包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列， LCDR1包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列， LCDR2包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列，並且 LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列； （c）HCDR1包含SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列， HCDR2包含SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列， HCDR3包含SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列， LCDR1包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列， LCDR2包含SEQ ID NO：54所示的胺基酸序列，並且 LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列；或者 （d）HCDR1包含SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列， HCDR2包含SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列， HCDR3包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列， LCDR1包含SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列， LCDR2包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列，並且 LCDR3包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列。
  6. 根據請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，還包括一個或多個重鏈框架區1（HFR1）、HFR2、HFR3和HFR4，和/或一個或多個輕鏈框架區1（LFR1）、LFR2、LFR3和LFR4，其中 HFR1包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：27或者X 21VQLVQSGAEVKKPGX 22SX 23KX 24SCKX 25S（SEQ ID NO：65）所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列， HFR2包含SEQ ID NO：18或WVRQX 27PGX 28GLEWMG（SEQ ID NO：66）所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列， HFR3包含SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：28或X 31VTX 32X 33X 34DX 35SX 36STX 37YX 38X 39X 40SSLX 41X 42X 43DTAX 44YYC（SEQ ID NO：67）所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列， HFR4包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列， LFR1包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列， LFR2包含SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：30或WYQQKPGQSPRPWIX 45（SEQ ID NO：68）所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列， LFR3包含SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列，並且 LFR4包含SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列，或者與其具有至少85%的序列同一性的同源序列， 其中，X 21是E或Q；X 22是E、S或A；X 23是L或V；X 24是I或V；X 25是S或A；X 27是M或A；X 28是K或Q；X 31是Q或R；X 32是I或M；X 33是S或T；X 34是A或R；X 35是K或T；X 36是I或T；X 37是A或V；X 38是L或M；X 39是Q或E；X 40是W或L；X 41是K或R；X 42是A或S；X 43是S或E；X 44是M或V；X 45是Y或F。
  7. 根據請求項6所述的抗體或其抗原結合片段，其中 HFR1包含SEQ ID NO：17、27、32、40、42、47或87所示的胺基酸序列， HFR2包含SEQ ID NO：18、33、43或48所示的胺基酸序列， HFR3包含SEQ ID NO：19、28、34、41、44或49所示的胺基酸序列， HFR4包含SEQ ID NO：20或35所示的胺基酸序列， LFR1包含SEQ ID NO：21、29或36所示的胺基酸序列， LFR2包含SEQ ID NO：22、30、37或45所示的胺基酸序列， LFR3包含SEQ ID NO：23、31或38所示的胺基酸序列，並且 LFR4包含SEQ ID NO：24或39所示的胺基酸序列。
  8. 根據請求項6或7所述的抗體或其抗原結合片段，其中 （a）HFR1包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列， HFR2包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列， HFR3包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列， HFR4包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列， LFR1包含SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列， LFR2包含SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列， LFR3包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，並且 LFR4包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列；或者 （b）HFR1包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列， HFR2包含SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列， HFR3包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列， HFR4包含SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列， LFR1包含SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列， LFR2包含SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列， LFR3包含SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，並且 LFR4包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列； （c）HFR1包含SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列， HFR2包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列， HFR3包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列， HFR4包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列， LFR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列， LFR2包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列， LFR3包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，並且 LFR4包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列； （d）HFR1包含SEQ ID NO：40所示的胺基酸序列， HFR2包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列， HFR3包含SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列， HFR4包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列， LFR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列， LFR2包含SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列， LFR3包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，並且 LFR4包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列； （e）HFR1包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列， HFR2包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列， HFR3包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列， HFR4包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列， LFR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列， LFR2包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列， LFR3包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，並且 LFR4包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列； （f）HFR1包含SEQ ID NO：87所示的胺基酸序列， HFR2包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列， HFR3包含SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列， HFR4包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列， LFR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列， LFR2包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列， LFR3包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，並且 LFR4包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列；或者 （g）HFR1包含SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列， HFR2包含SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列， HFR3包含SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列， HFR4包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列， LFR1包含SEQ ID NO：36所示的胺基酸序列， LFR2包含SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列， LFR3包含SEQ ID NO：38所示的胺基酸序列，並且 LFR4包含SEQ ID NO：39所示的胺基酸序列。
  9. 根據以上請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區（VH），其包含選自下列的胺基酸序列：SEQ ID NO：1、3、5、7、8、10和86，或其具有至少80%序列同一性的同源序列。
  10. 根據以上請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區（VL），其包含選自下列的胺基酸序列：SEQ ID NO：2、4、6和9，或其具有至少80%序列同一性的同源序列。
  11. 根據以上請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述替換或修飾中的至少一種處於所述重鏈可變區或輕鏈可變區的互補決定區（CDR）序列的一個或多個中。
  12. 根據以上請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述替換或修飾中的至少一種處於所述重鏈可變區或輕鏈可變區的非CDR序列的一個或多個中。
  13. 根據以上請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，還包括Fc區，任選地人免疫球蛋白（Ig）的Fc區，或者任選地人IgG的Fc區。
  14. 根據請求項13所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述Fc區來源於人IgG1或IgG4。
  15. 根據請求項14所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述Fc區來源於人IgG4並且包含選自下列的一個或多個突變：S228P、F234A、L235A、M252Y、S254T、T256E、K447del。
  16. 根據請求項15所述的抗體或其抗原結合片段，其中來源於包含S228P、F234A、L235A、M252Y、S254T、T256E、K447del突變的人IgG4的Fc區的胺基酸序列如SEQ ID NO：75所示。
  17. 根據以上請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，還包括位於所述重鏈可變區的N末端的訊息肽和/或位於所述輕鏈可變區的N末端的訊息肽。
  18. 根據以上請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，它是人源化的。
  19. 根據以上請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，它是單株抗體、雙重特異性抗體、多重特異性抗體、重組抗體、嵌合抗體、標記抗體、二價抗體、抗-個體基因型抗體或融合蛋白。
  20. 根據以上請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，它是雙鏈抗體、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段（dsFv）、(dsFv) 2、雙重特異性dsFv（dsFv-dsFv'）、二硫鍵穩定的雙鏈抗體（ds雙鏈抗體）、單鏈抗體分子（scFv）、scFv二聚體（二價雙鏈抗體）、多重特異性抗體、駱駝化單域抗體、奈米抗體、域抗體或二價域抗體。
  21. 根據以上請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，還包括一個或多個胺基酸殘基替換或修飾，但保留了對人TSLP的結合特異性。
  22. 根據以上請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其具有選自下列的一種或多種性質：a）具有特異性結合至人TSLP的能力；b）具有阻斷TSLP與TSLPR之間結合的能力；c）具有阻斷TSLP與表現TSLPR和IL7R的細胞之間的結合的能力；d）具有抑制BaF3細胞的TSLP依賴性增殖的能力；e）具有抑制從PBMC的TSLP依賴性TARC分泌的能力；或者f）具有抑制表現TSLPR和IL7R的細胞中TSLP依賴性STAT5活化的能力。
  23. 根據請求項18所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段不特異性結合至猴、大鼠或小鼠的TSLP。
  24. 根據請求項18或19所述的抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段特異性結合至長形式人TSLP且不結合至短形式人TSLP； 其中，所述長形式人TSLP具有如SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列，並且所述短形式人TSLP具有如SEQ ID NO：74所示的胺基酸序列。
  25. 根據請求項20所述的抗體或其抗原結合片段，其具有抑制表現人TSLPR的細胞的人TSLP依賴性增殖的能力。
  26. 根據請求項23所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述細胞還表現人IL7R。
  27. 根據以上請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其結合至不同於參考抗體所結合的表位，其中所述參考抗體的重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：77所示，並且所述參考抗體的輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO：78所示。
  28. 根據以上請求項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其連接至一個或多個共軛物部分。
  29. 根據請求項26所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述共軛物部分包含用於檢測或分離的試劑，如清除-改進劑、化療劑、毒素、放射性同位素、鑭系、發光標記、螢光標記、酶-基質標記、DNA-烷化劑、局部異構酶抑制劑、微管蛋白-結合劑或者其它抗癌藥。
  30. 一種分離的多核苷酸，其編碼根據請求項1～29中任一項所述的抗體或其抗原-結合片段。
  31. 一種載體，其包含根據請求項30所述的分離的多核苷酸。
  32. 一種宿主細胞，其包含根據請求項31所述的載體。
  33. 一種藥物組合物，其包含： （i）根據請求項1～29中任一項所述的抗體或其抗原-結合片段，或者編碼根據請求項1～29中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸；和 （ii）一種或多種藥物可用的載體、稀釋劑、緩衝液或賦形劑。
  34. 根據請求項33所述的藥物組合物，還包括其它治療劑。
  35. 根據請求項34所述的藥物組合物，其中所述其它治療劑是用於治療炎性疾病、自體免疫疾病和癌症的藥劑。
  36. 根據請求項35所述的藥物組合物，其中所述其它治療劑是靶向IL-33、IL-25、IL-4、IL-5、IL-4R或IL-13的藥劑。
  37. 一種表現根據請求項1～29中任一項所述的抗體或其抗原-結合片段的方法，其包括在表現根據請求項31所述的載體的條件下，培養根據請求項34所述的宿主細胞。
  38. 一種治療、預防或減輕受試者中TSLP-相關疾病或病症的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的能夠結合至具有如SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列的長形式人TSLP和TSLP的消化形式的抗體或其抗原-結合片段。
  39. 一種治療、預防或減輕受試者中TSLP-相關疾病或病症的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的根據請求項1～29中任一項所述的抗體或其抗原-結合片段，或者編碼根據請求項1～29中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸和/或根據請求項33～36中任一項所述的藥物組合物。
  40. 根據請求項37～39中任一項所述的方法，其中所述疾病或病症與對照水平相比，與TSLPR介導的訊息傳遞的調控異常有關。
  41. 根據請求項40所述的方法，其中所述TSLP介導的訊息傳遞的調控異常包括透過磷酸化的STAT5活化的調控異常。
  42. 根據請求項40所述的方法，其中所述TSLP介導的訊息傳遞的調控異常包括表現TSLPR的細胞增殖的調控異常。
  43. 根據請求項37～39中任一項所述的方法，其中所述疾病或病症選自：炎性疾病、自體免疫疾病和癌症。
  44. 根據請求項43所述的方法，其中所述疾病或病症選自：哮喘（包括嚴重哮喘）、特發性肺纖維化、異位性皮膚炎（AD）、過敏症結膜炎、過敏性鼻炎（AR）、Netherton症候群（NS）、嗜酸細胞性食管炎（EoE）、食物過敏、過敏性腹瀉、嗜酸細胞性胃腸炎、過敏性支氣管肺麯黴病（ABPA）、過敏性真菌性鼻竇炎、慢性瘙癢、癌症、類風濕性關節炎、慢性阻塞性肺病COPD、全身性硬化症、多發性硬化、瘢痕瘤、潰瘍性結腸炎、慢性鼻竇炎（CRS）、息肉病、慢性嗜酸細胞性肺炎、嗜酸細胞性支氣管炎、過敏性支氣管肺麯黴病、腹腔病、嗜酸細胞性胃腸炎、Churg-Strauss症候群、嗜酸細胞增多肌痛症候群、嗜酸性白細胞增多症候群、伴有多血管炎的嗜酸性肉芽腫病、嗜酸細胞性食管炎、炎症性腸病、纖維化病症、炎症性腸病、霍奇金淋巴瘤、全身性紅斑狼瘡。
  45. 根據請求項44所述的方法，其中所述癌症選自：乳腺癌、胰癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌和B細胞急性淋巴母細胞性白血病。
  46. 根據請求項44所述的方法，其中所述纖維化病症選自：全身性和局部硬皮病、瘢痕瘤和肥厚性瘢痕、間質性肺病（ILD）、特發性肺纖維化（IPF）、由慢性B肝或C肝感染產生的肝臟纖維化、輻射引起的纖維化和由創傷癒合產生的纖維化、動脈粥狀硬化、再狹窄、肺部炎症和纖維化、肝硬化、腎病、由疤痕組織產生的心臟病和眼部疾病，如黃斑變性和視網膜和玻璃體視網膜病、由化療藥物產生的纖維化以及損傷和灼傷。
  47. 根據請求項39所述的方法，其中所述疾病或病症選自哮喘、息肉性鼻竇炎、COPD、蕁麻疹、EoE和異位性皮膚炎。
  48. 根據請求項37～47中任一項所述的方法，其中所述受試者是人。
  49. 根據請求項37～48中任一項所述的方法，其中所述施用經由口服、鼻、靜脈內、皮下、舌下或肌內施用。
  50. 一種檢測樣品中TSLP的存在或量的方法，其包括將所述樣品與根據請求項1～29中任一項所述的抗體或其抗原-結合片段接觸，並確定所述樣品中TSLP的存在或量。
  51. 根據請求項50所述的方法，還包括確定TSLP是否在所述樣品中的細胞中過表現的步驟。
  52. 一種根據請求項1～29中任一項所述的抗體或其抗原-結合片段、根據請求項33～36中任一項所述的藥物組合物和/或編碼根據請求項1～29中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸在生產用於治療、預防或減輕對TSLP抑制起反應的疾病或病症的藥劑中的用途。
  53. 一種嵌合抗原受體（CAR），其包含抗原結合結構域、跨膜結構域和TCR訊息傳遞結構域，其中所述抗原結合結構域特異性結合至TSLP並且包含根據請求項1～29中任一項所述的抗原結合片段。
  54. 根據請求項53所述的CAR，其中所述CAR還包含共刺激結構域。
  55. 一種核酸序列，其編碼根據請求項53或54所述的嵌合抗原受體（CAR）。
  56. 一種細胞，其包括根據請求項55所述的核酸序列。
  57. 一種細胞，其基因修飾以表現根據請求項53或54所述的CAR。
  58. 一種載體，其包括根據請求項55所述的核酸序列。
  59. 一種用於刺激對哺乳動物中TSLP-富集環境或組織的T細胞-介導的免疫反應的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效量的基因修飾以表現根據請求項53或54所述的CAR的細胞。
  60. 一種治療患有對TSLP抑制起反應的疾病或病症的哺乳動物的方法，其包括向所述哺乳動物施用有效量的根據請求項56所述的細胞，借此治療所述哺乳動物。
  61. 根據請求項60所述的方法，其中所述細胞是自體同源T細胞。
  62. 根據請求項60所述的方法，其中所述哺乳動物是人受試者。
  63. 根據請求項60所述的方法，其中將所述哺乳動物鑑別為具有TSLP陽性細胞，或者具有TSLP訊息傳遞上調的細胞。
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