JP2018095601A

JP2018095601A - ポリ−γ−グルタミン酸のリン酸誘導体及びその製造方法

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Publication number: JP2018095601A
Application number: JP2016242415A
Authority: JP
Inventors: 徹佐合; Toru Sago; 栗田　修; Osamu Kurita; 修栗田; 泰志苔庵; Yasushi Kokean; かおり梅谷; Kaori Umetani; 千鶴山岡; Chizuru Yamaoka
Original assignee: Mie Prefecture
Current assignee: Mie Prefecture
Priority date: 2016-12-14
Filing date: 2016-12-14
Publication date: 2018-06-21
Anticipated expiration: 2036-12-14
Also published as: JP6507426B2

Abstract

【課題】ポリ−γ−グルタミン酸（γ-PGA）の分子量は依らずに保水性や粘性の変化できる、γ-PGA誘導体及びその製造方法の提供。【解決手段】式（１）で表されるリン酸基が導入されたγ-PGA誘導体。γ-PGA生産能を有するバシラス属微生物を液体培地中で培養する培養工程、前記液体培地にリン酸又はリン酸塩を添加し、γ-PGAのリン酸誘導体を生成蓄積させる誘導体生成工程、その培養産物からγ-PGAのリン酸誘導体を回収する回収工程を備える、リン酸化γ−ＰＧＡの製造方法。【選択図】図１

Description

本発明は、ポリ−γ−グルタミン酸（以下、「γ-PGA」という）のリン酸誘導体及びその製造方法に関し、より具体的には、グルタミン酸に対するリンのモル比が０.２〜４０の構成を備えたγ-PGAのリン酸誘導体及びその製造方法に関する。

γ-PGAは、複数のグルタミン酸がγ−アミド結合により結合した鎖状高分子で、粘ちょう性を示すことが知られている。γ-PGAは、生分解性を備え、高い粘性及び保水性を有することから、食品、化粧品、医薬品等の多くの分野で利用されている。
一般的に、γ-PGAは構成する分子内のα−カルボキシル基が反応性官能基として関与し、その分子量が大きい程、粘性、保水性、及びカルシウム吸収促進性が高まることが知られている。この理由から、γ-PGAの分子量の大きさを調整することで、γ-PGAの特性を変化させ、種々の用途に対応してきた。しかしながら、微生物から得られるγ-PGAの分子量を調整して生産することは困難であった。このため、分子の大きさに関係なく、γ-PGAの持つ特性、特に粘性や保水性を変化させる新たな技術が望まれていた。
特許文献１には、γ-PGAの分子内にスルホアルキルアミノ基を導入し、カチオン性の生分解性高分子とのコンプレックス形成が可能なγ-PGA誘導体が開示されている。特許文献２には、バシラス属細菌由来PgsB、PgsC、PgsA、PgsEをコードする遺伝子を有するバシラス属細菌を培養することにより、高分子量のγ-PGAを製造する方法が開示されている。

特開２００２−８０５９３号公報特開２０１６−４２８４４号公報

但し、特許文献１に開示された技術は、γ-PGAの有する粘性や保水性に注目したγ-PGA誘導体に関するものではなく、特許文献２に開示された技術は、限定された遺伝子を単離し、組換えベクターに導入してγ-PGAを生産するなどの複雑な工程を含むことから、汎用できる技術とは言えなかった。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、γ-PGAの分子量に依らずに、粘性や保水性を変化させることができるγ-PGAの誘導体及びその製造方法を提供することであり、より具体的にはγ-PGAの分子構造内にリン酸を含むγ-PGAのリン酸誘導体及びその製造方法を提供することである。なお、これまでγ-PGAにリン酸基を導入した報告は認められなかった。

本発明者らは、γ-PGAの生産能を有する微生物バシラス属の液体培地中に、少なくとも分子内に２個以上のリンを含むリン酸又はリン酸塩を培地に添加して培養したところ、培地中に生産されたγ-PGAがリンを多量に含むことを見出し、リン酸又はリン酸塩の添加時期、添加後の処理について検討した結果、従来のγ-PGAよりも粘度が低く、しかも水に溶けやすいγ-PGA誘導体を製造できることを確認し、本発明を完成するに至った。

こうして、本発明に係るリン酸基が導入されたγ-PGA誘導体は、下記一般式（１）で表されることを特徴とする。
但し、式（１）中、Ｒ１は（ＨＰＯ_３）_ｎ又は（ＨＰＯ_３）_ｎ１ＰＯ_３（ＨＰＯ_３）_ｎ２を表し、γ−グルタミン酸の少なくとも１残基は（ＨＰＯ_３）_ｎを表し、ｎ,n1,n2は１〜５０の整数を表し、ｍはγ−グルタミン酸残基数を表し、Ｒ１はポリ−γ−グルタミン酸の同一分子内において、少なくとも１個以上のα−カルボキシル基と結合している。
上記γ-PGA誘導体を構成するグルタミン酸一分子当たり、モル比で０.２〜４０のリンを含む。このようなγ-PGAのリン酸誘導体は、リン酸又はリン酸塩を含まないγ-PGAと比較すると、粘性が低く、易水溶性を示すので、食品、化粧品、医薬品等の様々な分野に応用できる。
また、本発明に係るγ-PGA誘導体の製造方法は、γ-PGA生産能を有するバシラス属微生物を液体培地中で培養する培養工程、前記液体培地にリン酸又はリン酸塩を添加し、γ-PGAのリン酸誘導体を生成蓄積させる誘導体生成工程、この誘導体生成工程で得られた培養産物からγ-PGAのリン酸誘導体を回収する回収工程を備えることを特徴とする。このとき、添加するリン酸又はリン酸塩は、分子内に少なくとも２個以上のリンを含むリン酸又はリン酸塩を培地に添加して行うことが好ましい。
本発明によれば、バシラス属細菌を液体培地に培養し、培養中又は培養後にリン酸又はリン酸塩を添加するだけで、γ-PGAのリン酸誘導体を培養液中に生成蓄積させることができる。

上記バシラス属微生物は、γ-PGAの生産能を有する微生物であればいかなるものでもよく、例えばバシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｕｔｉｌｉｓ）、バシラス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）などが挙げられる。また、通常納豆製造に使用されている納豆菌の宮城野菌、高橋菌などを用いることができる。
前記培養工程において、微生物を液体培養する場合には、振とう培養、通気撹拌培養で行えばよく、γ-PGAを生産できる培養条件下であれば、特に限定されない。例えば、培養温度は、２５〜５０℃が好ましく、３０〜４０℃が更に好ましい。また、培地ｐＨは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、硫酸又はそれらの水溶液などによって調整し、ｐＨ５〜９とすることが好ましく、ｐＨ６〜８とすることが更に好ましい。培地の殺菌は通常の方法、例えば１１０℃〜１３０℃、８分〜２０分で殺菌した後、培地に微生物を添加する。培養期間は、通常２〜５日間程度で良い。

培地は、バシラス属細菌の培養に適するものであれば特に限定されず、炭素源、窒素源、無機イオン及びビタミン類を含有する通常の培地で良い。炭素源及び窒素源として、グルタミン酸又はその金属塩、例えば、グルタミン酸ナトリウムなどを含有する方が、グルコース単独の炭素源の培地よりもγ-PGAが生産されるので好ましい。
本発明におけるγ-PGAのリン酸誘導体を製造するには、分子内に少なくとも２個以上のリンを含むリン酸化合物を使用できる。具体的には、メタリン酸、ポリリン酸、メタリン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、メタリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、テトラポリリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、二リン酸カリウム、トリリン酸カリウムが挙げられる。上記リン酸又はリン酸塩を１種以上利用することができる。
誘導体生成工程において、液体培地にリン酸又はリン酸塩を添加する操作は、培養工程を実施する前の培地調整時に行うこともできるし、培養工程中又は培養工程終了後に行うこともできる。培地調整時に行ったときには、培養工程と誘導体生成工程とを同時に実施することになる。また、リン酸又はリン酸塩を添加する操作は、γ-PGAが培地中に生産されるとき（例えば、培養工程開始から２４時間後）に行うことができるし、培養工程が開始して相当時間が経過したとき（例えば、培養開始から２〜３日後）に行うことができる。

リン酸又はリン酸塩の添加量は、培地に対して、０.０５％〜５.０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは０.５％〜２.０％（Ｗ／Ｖ）を用いる。培養工程開始前に添加する場合には、リン酸又はリン酸塩の添加後の培地ｐＨは、５〜９の範囲であることが好ましく、６〜８であることが更に好ましい。また、培養工程開始から２４時間以後にリン酸又はリン酸塩を添加する場合には、添加後の培地ｐＨは、ｐＨ２〜９であることが好ましく、３〜６であることが更に好ましい。
培養工程開始時にリン酸又はリン酸塩を培地に添加して微生物を接種して培養する場合、培養温度は２５℃〜５０℃が好ましく、３０℃〜４０℃が更に好ましい。また、培養工程実施中にリン酸又はリン酸塩を添加した場合、培養温度は２５℃〜５０℃が好ましく、３０℃〜４０℃が更に好ましい。
培養工程終了後にリン酸又はリン酸塩を添加する場合には、加熱処理を行う加熱工程を実施することが好ましい。加熱工程における加熱温度は３０℃〜８０℃にすることが好ましく、５０℃〜８０℃が更に好ましい。加熱工程において、処理時間は３０分〜２４時間が好ましく、１時間〜３時間が更に好ましい。このようにして加熱処理すると、培地中に蓄積されたγ-PGAに結合するリン酸の含量が増加し、γ-PGAのリン酸誘導体が液体培地中に生成蓄積される。

回収工程を実施するには、γ-PGAを回収する際に採用されている公知の方法を用いることができる。例えば、アルコール沈殿法、イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー法、限外濾過法、これら適宜組み合わせた方法を用いることができる。具体的な例としては、エタノールを用いて沈殿させた後、透析により培地中成分等の夾雑物及び未反応のリン酸又はリン酸塩を除去し、その後凍結乾燥により乾燥粉末を得る。
本発明により得られるγ-PGAのリン酸誘導体は、一般的に利用されているγ-PGAを精製後に化学修飾する誘導化工程を省略することを可能にする。また、リン酸がγ-PGAに取り込まれたことにより、従来の機能性とは異なる物性、例えば粘性の低下、易水溶性を保持する。したがって、その機能性に着目した様々な用途への広がりが期待される。例えば、水に溶けやすいことによる溶解工程における負荷の低減やリン酸が導入されたことによる金属吸着量の増加が期待される。

本発明により、分子内にリン酸を含むγ-PGAのリン酸誘導体を提供できる。より具体的には、グルタミン酸一分子当たりモル比にて０.２以上のリンを含有するγ-PGAのリン酸誘導体を取得できる。本発明によって提供されるγ-PGAのリン酸誘導体は、リン酸又はリン酸塩を含まないγ-PGAと比較すると、粘性が低く、易水溶性を示すので、食品、化粧品、医薬品、金属回収などの様々な分野に応用できる。

γ-PGAのリン酸誘導体のＮａ塩のＦＴ−ＩＲ分析の結果を示したグラフである。 γ-PGAのリン酸誘導体のＮａ塩の走査型電子顕微鏡写真図である。 γ-PGA及びγ-PGAのリン酸誘導体のＮａ塩のラピッドビスコアナライザーによる粘度及び水溶解性の測定結果を示すグラフである。 γ-PGA及びγ-PGAのリン酸誘導体のＮａ塩の動的粘弾性解析装置による温度に対する粘度の結果を示すグラフである。 γ-PGA及びγ-PGAのリン酸誘導体のＮａ塩の動的粘弾性解析装置によるせん断速度に対する粘度の結果を示すグラフである。

以下、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施できる。
＜実施例１＞ γ-PGAのリン酸誘導体の製造（その１）
(1)培養工程、誘導体生成工程
納豆菌宮城野菌をＬ培地（１.０％ポリペプトン、０.５％酵母エキス、０.５％ＮａＣｌ、１.０％ブドウ糖、ｐＨ７.２）１００ｍｌに植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで一晩培養した。この培養液２ｍｌを植菌する前に、γ-PGA生産Ａ液体培地２００ｍｌ（２.０％ブドウ糖、３.０％グルタミン酸ナトリウム、０.５％硫安、０.２５％リン酸一水素カリウム、０.０５％硫酸マグネシウム、０.３％酵母エキス、ｐＨ７.２）を調整し、リン酸誘導化試薬として表１に示すリン酸塩を添加し、１ＮＮａＯＨでｐＨ７.２に再調整した。続いて、１２１℃、１５分間の滅菌後、前培養液を植菌し、３７℃、１５０ｒｐｍで培養を開始した。
(2)回収工程
培養７２時間後に、培養液を１０,０００ｇ、１５分間遠心分離により菌体を除菌後、４倍量のエタノールを加え、２日間室温にて静置した。この沈殿物を回収し、２００ｍｌの蒸留水に溶解し、分画分子量１２,０００〜１４,０００の透析膜につめ、７℃で３日間透析を行い、低分子物質を除去した。この透析液を常法により凍結乾燥し、γ-PGAのリン酸誘導体を製造した。そのグルタミン酸含量及びグルタミン酸１モル当たりのリンのモル比を表１に示した。

リン酸化誘導試薬を培養開始時から添加して得られるγ-PGAのリン酸誘導体はリン酸塩の添加量が増えるに伴い、リン含有量は増加した。グルタミン酸の粉末当たりの重量比は約３〜１５％であった。

＜実施例２＞ γ-PGAのリン酸誘導体の製造（その２）
実施例１と同様に、納豆菌宮城野菌をＬ培地で培養して得られた培養液２ｍｌをγ-PGA生産Ａ液体培地２００ｍｌに植菌し、培養を開始した。培養２４時間後、リン酸化誘導試薬として５％メタリン酸ナトリウム溶液（W／V）２０ｍｌを添加し培養を７２時間まで行った。一方、リン酸化誘導試薬の未添加の培養４８時間の培養液に、上記と同様メタリン酸ナトリウム溶液を添加した後、７２時間まで培養を行った（培養工程、誘導体生成工程）。
培養終了後、実施例１と同様な方法により、粉末のγ-PGAのリン酸誘導体を製造した（回収工程）。
表２に、実施例２で得られたγ-PGAのリン酸誘導体のグルタミン酸含量及びグルタミン酸１モル当たりのリンのモル比を示した。また、対照として、誘導化試薬無添加の培養で得られたγ-PGAの結果を示した。

メタリン酸ナトリウムの添加は、培養開始から２４時間後よりも４８時間後の方が、リンのγ-PGAへの取り込みは増加した。これに伴い、粉末中のグルタミン酸の含量は減少した。

＜実施例３＞ γ-PGAのリン酸誘導体の製造（その３）
実施例１と同様に、納豆菌宮城野菌をＬ培地で培養して得られた培養液２ｍｌをγ-PGA生産Ａ液体培地２００ｍｌに植菌し、培養を開始した（培養工程）。培養４８時間後、リン酸化誘導試薬として５％メタリン酸ナトリウム溶液（W／V）２０ｍｌを添加した。その後、培地のｐＨを各々ｐＨ４.１、ｐＨ６.２、ｐＨ８.１に調整し、７２時間まで３７℃で培養を行った（誘導体生成工程）。培養終了後、実施例１と同様な方法により、粉末のγ-PGAのリン酸誘導体を製造した（回収工程）。表３に、実施例３で得られたγ-PGAのリン酸誘導体のグルタミン酸含量及びグルタミン酸1モル当たりのリンのモル比を示した。

リン酸のγ-PGAへの取り込みはｐＨに依存するが、γ-PGAが生産された後の培地へのリン酸誘導体の添加は、ｐＨが２〜８の範囲で行うことができた。

＜実施例４＞ γ-PGAのリン酸誘導体の製造（その４）
実施例１と同様に、納豆菌宮城野菌をＬ培地で培養して得られた培養液２ｍｌをγ-PGA生産Ａ液体培地２００ｍｌに植菌し、培養を開始した（培養工程）。培養４８時間後、リン酸化誘導試薬として５％メタリン酸ナトリウム溶液（W／V）２０ｍｌを添加し培養を７２時間まで行った（誘導体生成工程）。
培養終了後、各培地をそれぞれ６０℃１時間、６０℃３時間、８０℃１時間、８０℃３時間の加熱処理を行った（加熱工程）。一方、対照は未加熱の培養液とした。加熱後、常温に戻った後、実施例１と同様な方法により、粉末のγ-PGAのリン酸誘導体を製造した（回収工程）。
表４に、実施例４で得られたγ-PGAのリン酸誘導体のグルタミン酸含量及びグルタミン酸1モル当たりのリンのモル比を示した。また、対照として、リン酸化試薬を添加し、加熱処理を行わないときに得られたγ-PGAの結果を示した。

培養終了後の加熱処理は６０℃及び８０℃の試験区で、グルタミン酸に対するリンの含有量の増加が認められた。加熱時間を３時間に延長した場合、リンの含有量は減少した。

＜実施例５＞塗り心地の官能試験
官能評価項目は、伸びの良さ、さっぱり感、べたつき、さらさら感の４項目とした。γ-PGAに対するγ-PGAのリン酸誘導体のK塩（実施例４のメタリン酸カリウムを用いた試料）の１％水溶液にした時の評価を５人で実施し、平均値を表示した。１％水溶液０.１５ｍＬを、左前腕内側、肘線から約５ｃｍの範囲に塗布して、右手人差し指の第１関節部にて広げた。評点は、いずれも３、２、１、０、−１、−２、−３の７段階とし、下記基準に沿った評価を行った。評価の項目として、伸びの良さ、さっぱり感、べたつき、さらさら感の４つを採用し、各項目について、「ある：３」から「ない：−３」までの７段階として評価した。官能試験結果を表５に示した。

本実施形態のγ-PGAのリン酸誘導体は、伸びの良さ、さっぱり感、さらさら感が高評価であることが分かった。また、べたつきが少ないことも分かった。

＜実施例６＞特性評価
(1)FT-IRによる官能基分析
赤外分光光度計（FT-IR）（サーモフィッシャーサイエンテフィック社のＮｉｃｏｌｅｔ６７００）を用いて、実施例２のγ-PGAのリン酸誘導体のＮａ塩を測定した。測定結果を図１に示した。
(2)走査型電子顕微鏡による撮影
卓上型SEM（走査型電子顕微鏡）（島津製作所社）を用いて、実施例２のγ-PGAのリン酸誘導体のＮａ塩を倍率８００倍にて測定した。顕微鏡写真図を図２に示した。写真中に周囲よりも薄い色で示される液滴様のものが、γ-PGAのリン酸誘導体のＮａ塩を示している。

(3)粘度及び水への溶解性
ラピッドビスコアナライザー（エヌエスピー社のRVA-Super4）を用いて、１％溶液２５ｇを専用容器に入れ、回転速度７００ｒｐｍ、２５℃の条件にて実施例４のγ-PGAとγ-PGAリン酸誘導体のＮａ塩を測定した。
測定結果を図３に示した。γ-PGAが２４０ｃｐ程度の粘度を示すのに比べ、γ-PGAリン酸誘導体のＮａ塩の粘度は低く、１１０ｃｐ程度で一定値を示した。
(4)粘性
動的粘弾性解析装置（TAインスツルメントジャパン社のAR-G2）を用いて、１％溶液の粘度を測定した。温度を１０℃から７０℃まで上昇させ、せん断速度１（１／ｓ）の時の粘度、温度を室温２５℃とし、せん断速度０.１〜１００（１／ｓ）の時の粘度を実施例４のγ-PGAとγ-PGAリン酸誘導体のＮａ塩を測定した。

測定結果を図４及び図５に示した。図４に示すように、γ-PGAの粘度は常にγ-PGAリン酸誘導体のＮａ塩よりも高く、低温時には更に高く（１０℃で約０.４０）、高温になるに連れて減少した（７０℃で約０.２０）。一方、γ-PGAリン酸誘導体のＮａ塩は、温度変化によって大きく変化せず、１０℃〜７０℃の間で低値のまま（約０.０３）であった。
また、図５に示すように、γ-PGAリン酸誘導体のＮａ塩の動的粘弾性は、γ-PGAの動的粘弾性に比べると、１／１０以上も低かった。

(5)リボフラビン酪酸エステルの吸着試験
リボフラビン酪酸エステルを0.1mg／mlの濃度になるようにクロロホルムに溶解し、実施例５で使用したメタリン酸カリウムを用いたポリグルタミン酸のリン酸誘導体の１％水溶液（W/V）を容量比１：１となるように試験管に入れ、ホモジナイザーで24000回転、2分間撹拌した。室温で30分間放置した後、下層部のクロロホルム中の450nmの吸光度を測定し、ビタミン剤の一つであるリボフラビン酪酸エステルの吸着能を評価した。対照には、未修飾のポリグルタミン酸を用いた。その結果を表6に示す。

リン酸誘導体は対照区よりも脂溶性のリボフラビン酪酸エステルを吸着した。

このように本実施形態によれば、分子内にリン酸を含むγ-PGAのリン酸誘導体を提供することができた。より具体的には、グルタミン酸一分子当たりモル比にて０.２以上のリンを含有するγ-PGAのリン酸誘導体を取得できた。本実施形態のγ-PGAのリン酸誘導体は、リン酸又はリン酸塩を含まないγ-PGAと比較すると、粘性が低く、易水溶性を示すので、食品、化粧品、医薬品、金属回収などの様々な分野に応用できることが分かった。

Claims

下記一般式（１）で表されるリン酸基が導入されたポリ−γ−グルタミン酸誘導体。
但し、式（１）中、Ｒ１は（ＨＰＯ_３）_ｎ又は（ＨＰＯ_３）_ｎ１ＰＯ_３（ＨＰＯ_３）_ｎ２を表し、γ−グルタミン酸の少なくとも１残基は（ＨＰＯ_３）_ｎを表し、ｎ,n1,n2は１〜５０の整数を表し、ｍはγ−グルタミン酸残基数を表し、Ｒ１はポリ−γ−グルタミン酸の同一分子内において、少なくとも１個以上のα−カルボキシル基と結合している。
前記ポリ−γ−グルタミン酸誘導体を構成するグルタミン酸一分子当たり、モル比で０.２〜４０のリンを含む請求項１に記載のポリ−γ−グルタミン酸。
ポリ−γ−グルタミン酸生産能を有するバシラス属微生物を液体培地中で培養する培養工程、前記液体培地にリン酸又はリン酸塩を添加し、ポリ−γ−グルタミン酸のリン酸誘導体を生成蓄積させる誘導体生成工程、前記誘導体生産工程で得られた培養産物からポリ−γ−グルタミン酸のリン酸誘導体を回収する回収工程を備えることを特徴とするリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
前記誘導体生産工程において、分子内に少なくとも２個以上のリンを含むリン酸又はリン酸塩を培地に添加する請求項３に記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
前記誘導体生産工程において、少なくとも１種以上のリン酸又はリン酸塩を培地に添加する請求項３又は４に記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
リン酸又はリン酸塩の添加濃度が、０.０５〜５.０質量％である請求項３〜５のいずれか一つに記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
リン酸又はリン酸塩の添加が、培養工程の開始から培養工程終了後の間のいずれかの時点で行われる請求項３〜６のいずれか一つに記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
前記培養工程開始時の培地のｐＨが５〜９の範囲内である請求項３〜７のいずれか一つに記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
前記誘導体生成工程と回収工程の間において、リン酸又はリン酸塩を添加した培地を３０℃〜８０℃で加熱する加熱工程を含む請求項３〜８のいずれか一つに記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
前記加熱工程が５０℃〜８０℃で１〜３時間で行われる請求項９に記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
前記誘導体生成工程において、リン酸又はリン酸塩を添加した培地のｐＨを２〜８に調整する請求項３〜１０のいずれか一つに記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。