JP2018095601A - ポリ−γ−グルタミン酸のリン酸誘導体及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
一般的に、γ-PGAは構成する分子内のα−カルボキシル基が反応性官能基として関与し、その分子量が大きい程、粘性、保水性、及びカルシウム吸収促進性が高まることが知られている。この理由から、γ-PGAの分子量の大きさを調整することで、γ-PGAの特性を変化させ、種々の用途に対応してきた。しかしながら、微生物から得られるγ-PGAの分子量を調整して生産することは困難であった。このため、分子の大きさに関係なく、γ-PGAの持つ特性、特に粘性や保水性を変化させる新たな技術が望まれていた。
特許文献1には、γ-PGAの分子内にスルホアルキルアミノ基を導入し、カチオン性の生分解性高分子とのコンプレックス形成が可能なγ-PGA誘導体が開示されている。特許文献2には、バシラス属細菌由来PgsB、PgsC、PgsA、PgsEをコードする遺伝子を有するバシラス属細菌を培養することにより、高分子量のγ-PGAを製造する方法が開示されている。
本発明は、上記した事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、γ-PGAの分子量に依らずに、粘性や保水性を変化させることができるγ-PGAの誘導体及びその製造方法を提供することであり、より具体的にはγ-PGAの分子構造内にリン酸を含むγ-PGAのリン酸誘導体及びその製造方法を提供することである。なお、これまでγ-PGAにリン酸基を導入した報告は認められなかった。
上記γ-PGA誘導体を構成するグルタミン酸一分子当たり、モル比で0.2〜40のリンを含む。このようなγ-PGAのリン酸誘導体は、リン酸又はリン酸塩を含まないγ-PGAと比較すると、粘性が低く、易水溶性を示すので、食品、化粧品、医薬品等の様々な分野に応用できる。
また、本発明に係るγ-PGA誘導体の製造方法は、γ-PGA生産能を有するバシラス属微生物を液体培地中で培養する培養工程、前記液体培地にリン酸又はリン酸塩を添加し、γ-PGAのリン酸誘導体を生成蓄積させる誘導体生成工程、この誘導体生成工程で得られた培養産物からγ-PGAのリン酸誘導体を回収する回収工程を備えることを特徴とする。このとき、添加するリン酸又はリン酸塩は、分子内に少なくとも2個以上のリンを含むリン酸又はリン酸塩を培地に添加して行うことが好ましい。
本発明によれば、バシラス属細菌を液体培地に培養し、培養中又は培養後にリン酸又はリン酸塩を添加するだけで、γ-PGAのリン酸誘導体を培養液中に生成蓄積させることができる。
前記培養工程において、微生物を液体培養する場合には、振とう培養、通気撹拌培養で行えばよく、γ-PGAを生産できる培養条件下であれば、特に限定されない。例えば、培養温度は、25〜50℃が好ましく、30〜40℃が更に好ましい。また、培地pHは、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、塩酸、硫酸又はそれらの水溶液などによって調整し、pH5〜9とすることが好ましく、pH6〜8とすることが更に好ましい。培地の殺菌は通常の方法、例えば110℃〜130℃、8分〜20分で殺菌した後、培地に微生物を添加する。培養期間は、通常2〜5日間程度で良い。
本発明におけるγ-PGAのリン酸誘導体を製造するには、分子内に少なくとも2個以上のリンを含むリン酸化合物を使用できる。具体的には、メタリン酸、ポリリン酸、メタリン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、メタリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、テトラポリリン酸ナトリウム、トリポリリン酸ナトリウム、二リン酸カリウム、トリリン酸カリウムが挙げられる。上記リン酸又はリン酸塩を1種以上利用することができる。
誘導体生成工程において、液体培地にリン酸又はリン酸塩を添加する操作は、培養工程を実施する前の培地調整時に行うこともできるし、培養工程中又は培養工程終了後に行うこともできる。培地調整時に行ったときには、培養工程と誘導体生成工程とを同時に実施することになる。また、リン酸又はリン酸塩を添加する操作は、γ-PGAが培地中に生産されるとき(例えば、培養工程開始から24時間後)に行うことができるし、培養工程が開始して相当時間が経過したとき(例えば、培養開始から2〜3日後)に行うことができる。
培養工程開始時にリン酸又はリン酸塩を培地に添加して微生物を接種して培養する場合、培養温度は25℃〜50℃が好ましく、30℃〜40℃が更に好ましい。また、培養工程実施中にリン酸又はリン酸塩を添加した場合、培養温度は25℃〜50℃が好ましく、30℃〜40℃が更に好ましい。
培養工程終了後にリン酸又はリン酸塩を添加する場合には、加熱処理を行う加熱工程を実施することが好ましい。加熱工程における加熱温度は30℃〜80℃にすることが好ましく、50℃〜80℃が更に好ましい。加熱工程において、処理時間は30分〜24時間が好ましく、1時間〜3時間が更に好ましい。このようにして加熱処理すると、培地中に蓄積されたγ-PGAに結合するリン酸の含量が増加し、γ-PGAのリン酸誘導体が液体培地中に生成蓄積される。
本発明により得られるγ-PGAのリン酸誘導体は、一般的に利用されているγ-PGAを精製後に化学修飾する誘導化工程を省略することを可能にする。また、リン酸がγ-PGAに取り込まれたことにより、従来の機能性とは異なる物性、例えば粘性の低下、易水溶性を保持する。したがって、その機能性に着目した様々な用途への広がりが期待される。例えば、水に溶けやすいことによる溶解工程における負荷の低減やリン酸が導入されたことによる金属吸着量の増加が期待される。
<実施例1> γ-PGAのリン酸誘導体の製造(その1)
(1)培養工程、誘導体生成工程
納豆菌宮城野菌をL培地(1.0%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%NaCl、1.0%ブドウ糖、pH7.2)100mlに植菌し、37℃、150rpmで一晩培養した。この培養液2mlを植菌する前に、γ-PGA生産A液体培地200ml(2.0%ブドウ糖、3.0%グルタミン酸ナトリウム、0.5%硫安、0.25%リン酸一水素カリウム、0.05%硫酸マグネシウム、0.3%酵母エキス、pH7.2)を調整し、リン酸誘導化試薬として表1に示すリン酸塩を添加し、1N NaOHでpH7.2に再調整した。続いて、121℃、15分間の滅菌後、前培養液を植菌し、37℃、150rpmで培養を開始した。
(2)回収工程
培養72時間後に、培養液を10,000g、15分間遠心分離により菌体を除菌後、4倍量のエタノールを加え、2日間室温にて静置した。この沈殿物を回収し、200mlの蒸留水に溶解し、分画分子量12,000〜14,000の透析膜につめ、7℃で3日間透析を行い、低分子物質を除去した。この透析液を常法により凍結乾燥し、γ-PGAのリン酸誘導体を製造した。そのグルタミン酸含量及びグルタミン酸1モル当たりのリンのモル比を表1に示した。
実施例1と同様に、納豆菌宮城野菌をL培地で培養して得られた培養液2mlをγ-PGA生産A液体培地200mlに植菌し、培養を開始した。培養24時間後、リン酸化誘導試薬として5%メタリン酸ナトリウム溶液(W/V)20mlを添加し培養を72時間まで行った。一方、リン酸化誘導試薬の未添加の培養48時間の培養液に、上記と同様メタリン酸ナトリウム溶液を添加した後、72時間まで培養を行った(培養工程、誘導体生成工程)。
培養終了後、実施例1と同様な方法により、粉末のγ-PGAのリン酸誘導体を製造した(回収工程)。
表2に、実施例2で得られたγ-PGAのリン酸誘導体のグルタミン酸含量及びグルタミン酸1モル当たりのリンのモル比を示した。また、対照として、誘導化試薬無添加の培養で得られたγ-PGAの結果を示した。
実施例1と同様に、納豆菌宮城野菌をL培地で培養して得られた培養液2mlをγ-PGA生産A液体培地200mlに植菌し、培養を開始した(培養工程)。培養48時間後、リン酸化誘導試薬として5%メタリン酸ナトリウム溶液(W/V)20mlを添加した。その後、培地のpHを各々pH4.1、pH6.2、pH8.1に調整し、72時間まで37℃で培養を行った(誘導体生成工程)。培養終了後、実施例1と同様な方法により、粉末のγ-PGAのリン酸誘導体を製造した(回収工程)。表3に、実施例3で得られたγ-PGAのリン酸誘導体のグルタミン酸含量及びグルタミン酸1モル当たりのリンのモル比を示した。
実施例1と同様に、納豆菌宮城野菌をL培地で培養して得られた培養液2mlをγ-PGA生産A液体培地200mlに植菌し、培養を開始した(培養工程)。培養48時間後、リン酸化誘導試薬として5%メタリン酸ナトリウム溶液(W/V)20mlを添加し培養を72時間まで行った(誘導体生成工程)。
培養終了後、各培地をそれぞれ60℃1時間、60℃3時間、80℃1時間、80℃3時間の加熱処理を行った(加熱工程)。一方、対照は未加熱の培養液とした。加熱後、常温に戻った後、実施例1と同様な方法により、粉末のγ-PGAのリン酸誘導体を製造した(回収工程)。
表4に、実施例4で得られたγ-PGAのリン酸誘導体のグルタミン酸含量及びグルタミン酸1モル当たりのリンのモル比を示した。また、対照として、リン酸化試薬を添加し、加熱処理を行わないときに得られたγ-PGAの結果を示した。
官能評価項目は、伸びの良さ、さっぱり感、べたつき、さらさら感の4項目とした。γ-PGAに対するγ-PGAのリン酸誘導体のK塩(実施例4のメタリン酸カリウムを用いた試料)の1%水溶液にした時の評価を5人で実施し、平均値を表示した。1%水溶液0.15mLを、左前腕内側、肘線から約5cmの範囲に塗布して、右手人差し指の第1関節部にて広げた。評点は、いずれも3、2、1、0、−1、−2、−3の7段階とし、下記基準に沿った評価を行った。評価の項目として、伸びの良さ、さっぱり感、べたつき、さらさら感の4つを採用し、各項目について、「ある:3」から「ない:−3」までの7段階として評価した。官能試験結果を表5に示した。
(1)FT-IRによる官能基分析
赤外分光光度計(FT-IR)(サーモフィッシャーサイエンテフィック社のNicolet6700)を用いて、実施例2のγ-PGAのリン酸誘導体のNa塩を測定した。測定結果を図1に示した。
(2)走査型電子顕微鏡による撮影
卓上型SEM(走査型電子顕微鏡)(島津製作所社)を用いて、実施例2のγ-PGAのリン酸誘導体のNa塩を倍率800倍にて測定した。顕微鏡写真図を図2に示した。写真中に周囲よりも薄い色で示される液滴様のものが、γ-PGAのリン酸誘導体のNa塩を示している。
ラピッドビスコアナライザー(エヌエスピー社のRVA-Super4)を用いて、1%溶液25gを専用容器に入れ、回転速度700rpm、25℃の条件にて実施例4のγ-PGAとγ-PGAリン酸誘導体のNa塩を測定した。
測定結果を図3に示した。γ-PGAが240cp程度の粘度を示すのに比べ、γ-PGAリン酸誘導体のNa塩の粘度は低く、110cp程度で一定値を示した。
(4)粘性
動的粘弾性解析装置(TAインスツルメントジャパン社のAR-G2)を用いて、1%溶液の粘度を測定した。温度を10℃から70℃まで上昇させ、せん断速度1(1/s)の時の粘度、温度を室温25℃とし、せん断速度0.1〜100(1/s)の時の粘度を実施例4のγ-PGAとγ-PGAリン酸誘導体のNa塩を測定した。
また、図5に示すように、γ-PGAリン酸誘導体のNa塩の動的粘弾性は、γ-PGAの動的粘弾性に比べると、1/10以上も低かった。
リボフラビン酪酸エステルを0.1mg/mlの濃度になるようにクロロホルムに溶解し、実施例5で使用したメタリン酸カリウムを用いたポリグルタミン酸のリン酸誘導体の1%水溶液(W/V)を容量比1:1となるように試験管に入れ、ホモジナイザーで24000回転、2分間撹拌した。室温で30分間放置した後、下層部のクロロホルム中の450nmの吸光度を測定し、ビタミン剤の一つであるリボフラビン酪酸エステルの吸着能を評価した。対照には、未修飾のポリグルタミン酸を用いた。その結果を表6に示す。
Claims (11)
- 下記一般式(1)で表されるリン酸基が導入されたポリ−γ−グルタミン酸誘導体。
- 前記ポリ−γ−グルタミン酸誘導体を構成するグルタミン酸一分子当たり、モル比で0.2〜40のリンを含む請求項1に記載のポリ−γ−グルタミン酸。
- ポリ−γ−グルタミン酸生産能を有するバシラス属微生物を液体培地中で培養する培養工程、前記液体培地にリン酸又はリン酸塩を添加し、ポリ−γ−グルタミン酸のリン酸誘導体を生成蓄積させる誘導体生成工程、前記誘導体生産工程で得られた培養産物からポリ−γ−グルタミン酸のリン酸誘導体を回収する回収工程を備えることを特徴とするリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
- 前記誘導体生産工程において、分子内に少なくとも2個以上のリンを含むリン酸又はリン酸塩を培地に添加する請求項3に記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
- 前記誘導体生産工程において、少なくとも1種以上のリン酸又はリン酸塩を培地に添加する請求項3又は4に記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
- リン酸又はリン酸塩の添加濃度が、0.05〜5.0質量%である請求項3〜5のいずれか一つに記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
- リン酸又はリン酸塩の添加が、培養工程の開始から培養工程終了後の間のいずれかの時点で行われる請求項3〜6のいずれか一つに記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
- 前記培養工程開始時の培地のpHが5〜9の範囲内である請求項3〜7のいずれか一つに記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
- 前記誘導体生成工程と回収工程の間において、リン酸又はリン酸塩を添加した培地を30℃〜80℃で加熱する加熱工程を含む請求項3〜8のいずれか一つに記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
- 前記加熱工程が50℃〜80℃で1〜3時間で行われる請求項9に記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
- 前記誘導体生成工程において、リン酸又はリン酸塩を添加した培地のpHを2〜8に調整する請求項3〜10のいずれか一つに記載のリン酸化ポリ−γ−グルタミン酸の製造方法。
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