CN105295037A - 磷酸化和氨基化的聚谷氨酸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明制备了一种磷酸化和氨基化的聚谷氨酸及其制备方法。该聚谷氨酸是在聚谷氨酸侧链上同时引入磷酸基和氨基，其中氨基、磷酸基和聚谷氨酸的摩尔比为：0.3-0.4:0.05-0.2:1。氨基的引入，可调节了表面电荷，增加聚谷氨酸水溶性，并且此氨基化产物可与醛基化高分子进行席夫碱交联反应，而作为制备水凝胶的高分子前驱体。磷酸基团的引入，有助于蛋白和多肽的生物标记和多功能化，并且可以诱导和加速生物矿化。磷酸化和氨基化的聚谷氨酸在组织工程、药物控释、再生医学等领域有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚谷氨酸及其制备方法，特别是一种磷酸化和氨基化的聚谷氨酸及其制备方法。
背景技术
在生物医用领域，磷酸基团的引入，有利于蛋白和多肽的生物标记及多功能化，并可促进材料生物矿化，获得分布均匀的纳米羟基磷灰石粒子。氨基的引入，可调节材料表面电荷，改善材料亲水性，并且此产物可与醛基化高分子进行席夫碱交联反应，从而作为制备水凝胶的高分子前驱体。随着组织工程与再生医学的发展，同时磷酸化和氨基化的前驱体材料被广泛应用于组织工程、药物控释、再生医学等领域，日益受到关注。
聚谷氨酸是一种具有良好生物相容性的可降解聚氨基酸，包括聚L-谷氨酸（L-PGA）和聚γ-谷氨酸（γ-PGA）。γ-PGA主要通过微生物发酵法制得，是以α-胺基和γ-羧基通过酰胺键连接而成，分子量从五万到两百万道尔顿不等。L-PGA主要通过化学合成法制得，是以α-胺基和β-羧基之间经酰胺键连接得到的聚氨基酸，分子量从几万到几十万道尔顿不等。聚谷氨酸可模拟细胞外基质（ECM）中蛋白质组分和功能，具有优良的生物相容性，在体内能降解为L-谷氨酸单体。其分子链上存在大量的游离羧基，易于修饰改性。聚谷氨酸广泛应用于医药、食品、重金属吸附、农业、缓释剂、药物载体、医用胶黏剂、组织工程等方面。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种磷酸化和氨基化的聚谷氨酸。
本发明的目的之二在于提供该聚谷氨酸的制备方法
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种磷酸化和氨基化聚谷氨酸，其特征在于在聚谷氨酸侧链上同时引入磷酸基和氨基，其中氨基、磷酸基和聚谷氨酸的摩尔比为：0.3-0.4:0.05-0.2:1。
一种制备上述的磷酸化和氨基化聚谷氨酸的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：
a.将聚谷氨酸溶于二甲亚砜中配制成质量百分比浓度为1～10%，再加入碳二亚胺活化剂，完全溶解后加入稳定剂N-羟基琥珀酰亚胺，在惰性气体保护下，反应1～20h，用乙醇沉降，过滤并干燥，得聚谷氨酸琥珀酰亚胺酯；所述的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:10～10:1；所述的N-羟基琥珀酰亚胺NHS和聚谷氨酸的摩尔比为1:50～50:1；
b.将步骤a所得聚谷氨酸琥珀酰亚胺酯溶于二甲亚砜中配制成质量百分比浓度为1～10%的溶液，再滴加浓度为0.1～5mol/L的NaOH或NaHCO3溶液，并加入与上述二甲亚砜等体积的去离子水，得到油水混合体系，将磷酸化合物和氨基化合物先后加入，反应1～24h后透析冻干，即得到磷酸化和氨基化聚谷氨酸；所述的聚谷氨酸琥珀酰亚胺酯与NaOH溶液的体积比为：160:1；所述的磷酸化合物与聚谷氨酸的摩尔比为1:10～3：1；所述的氨基化合物与聚谷氨酸琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:10～3:1。
上述的磷酸化合物为：O-磷酸-L-丝氨酸、磷酸乙醇胺。
上述的氨基化合物为：乙二胺、己二胺、乙二酸二酰肼、己二酸二酰肼。
上述的碳二亚胺活化剂为：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或二环己基碳二亚胺。
上述聚谷氨酸为聚L-谷氨酸或聚γ-谷氨酸。
本发明在聚谷氨酸侧链上引入磷酸基，不仅利于蛋白和多肽的标记和功能化，而且能加速材料生物矿化；而引入的氨基可与醛基化多糖、胶原、明胶、合成高分子等通过席夫碱反应形成化学交联水凝胶，可增强了材料的水溶性和矿化能力。磷酸根和氨基化的改性率可有效调控。在组织工程、药物控释、再生医学等领域有良好的应用前景。
本发明采用了DMSO/H2O、DMF/NaHCO3等油水混合体系，提高了反应效率。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进行详细描述。
实施例一：
将4g聚L-谷氨酸溶于40mlDMSO中，再加入2.853gNHS和4.755g碳二亚胺，在氮气保护下反应20h，用200ml乙醇沉降，过滤，在40℃条件下真空干燥，即得到NHS酯化的聚L-谷氨酸，其改性率可以达到80%。将得到的聚L-谷氨酸琥珀酰亚胺酯溶于400mlDMSO中，加入4.5ml浓度为3mol/l的NaOH水溶液，并迅速加入400ml的去离子水，得澄清溶液，加入0.35g磷酸乙醇胺，待其反应10分钟后再加入12.963g己二酸二酰肼，室温下反应24h，透析并冻干，即得到磷酸化和己二酸二酰肼化聚L谷氨酸，磷酸乙醇胺的接枝率为5%，己二酸二酰肼的接枝率为30%。
实施例二：
将4g聚γ-谷氨酸溶于40mlDMF中，加入2.853gNHS和4.755g碳二亚胺，在氮气保护下反应20h，用200ml乙醇沉降，过滤，在40℃条件下真空干燥，即得到NHS酯化的聚γ-谷氨酸，其改性率达80%。将得到的聚γ-谷氨酸琥珀酰亚胺酯溶于400mlDMSO中，加入4.5ml3mol/lNaOH水溶液，并迅速加入400ml的去离子水，得澄清溶液，加入0.875g磷酸乙醇胺，待其反应10分钟后再加入12.963g己二酸二酰肼，室温下反应24h，透析冻干，即得到磷酸化和己二酸二酰肼化聚γ-谷氨酸，磷酸乙醇胺的接枝率为10%，己二酸二酰肼的接枝率为28%。
实施例三：
将2g聚L-谷氨酸溶于40mlDMSO中，加入1.4265gNHS和2.3775g碳二亚胺，在氮气保护下反应20h，用乙醇沉降，过滤，在40℃条件下真空干燥，即得到NHS酯化的聚L-谷氨酸，其改性率可以达到90%。将得到的聚L-谷氨酸琥珀酰亚胺酯溶于200mlDMSO中，加入2.25ml3mol/lNaOH，并迅速加入200ml的去离子水，溶液澄清，没有析出，加入0.7g磷酸乙醇胺，待其反应十分钟后再加入6.4815g乙二胺，室温下反应24h，透析冻干，即得到磷酸化和氨基化聚L-谷氨酸，磷酸乙醇胺的接枝率为20%，乙二胺的接枝率为23%。
实施例四：
将2g聚γ-谷氨酸溶于10mlDMSO中，加入2.853gNHS和3.588g碳二亚胺，在氮气保护下反应20h，用乙醇沉降，过滤，在40℃条件下真空干燥，即得到NHS酯化的聚γ-谷氨酸，其改性率可以达到100%。将得到的聚γ-谷氨酸琥珀酰亚胺酯溶于100mlDMSO中，加入3.5ml3mol/lNaOH，并迅速加入100ml的去离子水，溶液澄清，没有析出，加入0.855g磷酸乙醇胺，待其反应十分钟后再加入9.243g乙二酸二酰肼，室温下反应24h，透析冻干，即得到磷酸化和乙二酸二酰肼化聚γ-谷氨酸，磷酸乙醇胺的接枝率为25%，乙二酸二酰肼的接枝率为25%。
实施例五：
将1g聚L-谷氨酸溶于10mlDMSO中，加入1.1412gNHS和1.265g碳二亚胺，在氮气保护下反应20h，用乙醇沉降，过滤，在40℃条件下真空干燥，即得到NHS酯化的聚L-谷氨酸，其改性率可以达到100%。将得到的聚L-谷氨酸琥珀酰亚胺酯溶于50mlDMSO中，加入1.25ml3mol/lNaOH，并迅速加入50ml的去离子水，溶液澄清，没有析出，加入0.3552gO-磷酸-L-丝氨酸，待其反应十分钟后再加入9.6326g己二酸二酰肼，室温下反应24h，透析冻干，即得到磷酸化和己二酸二酰肼化聚L-谷氨酸，O-磷酸-L-丝氨酸的接枝率为5%，己二酸二酰肼的接枝率为28%。
实施例六：
将1g聚γ-谷氨酸溶于10mlDMSO中，再加入1.2451gNHS和1.5567g碳二亚胺，在氮气保护下反应20h，用乙醇沉降，真空干燥，即得到NHS酯化的聚γ-谷氨酸，其改性率可以达到100%。将得到的聚γ-谷氨酸琥珀酰亚胺酯溶于60mlDMSO中，加入1.5ml3mol/lNaOH，并迅速加入60ml的去离子水，溶液澄清，没有析出，加入0.218gO-磷酸-L-丝氨酸，待其反应十分钟后再加入9.6326g己二胺，室温下反应24h，透析冻干，即得到磷酸化和氨基化聚γ-谷氨酸，O-磷酸-L-丝氨酸的接枝率为12%，己二胺的接枝率为28%。
实施例七：
将0.4g聚L-谷氨酸溶于8mlDMSO中，加入0.2853gNHS和0.4755g碳二亚胺，在氮气保护下反应20h，用乙醇沉降，过滤，在40℃条件下真空干燥，即得到NHS酯化的聚L-谷氨酸，其改性率可以达到80%。将得到的聚L-谷氨酸琥珀酰亚胺酯溶于30mlDMSO中，加入0.45ml3mol/lNaOH，并迅速加入30ml的去离子水，溶液澄清，没有析出，加入0.035gO-磷酸-L-丝氨酸，待其反应十分钟后再加入1.2963g己二酸二酰肼，室温下反应24h，透析冻干，即得到磷酸化和己二酸二酰肼化聚L-谷氨酸，O-磷酸-L-丝氨酸的接枝率为5%，己二酸二酰肼的接枝率为36%。
实施例八：
将0.4g聚γ-谷氨酸溶于40mlDMSO中，加入0.3765gNHS和0.7832g碳二亚胺，在氮气保护下反应20h，用乙醇沉降，过滤，在40℃条件下真空干燥，即得到NHS酯化的聚γ-谷氨酸，其改性率可以达到100%。将得到的聚γ-谷氨酸琥珀酰亚胺酯溶于20mlDMSO中，加入0.9ml3mol/lNaOH，并迅速加入20ml的去离子水，溶液澄清，没有析出，加入1.5382gO-磷酸-L-丝氨酸，待其反应十分钟后再加入6.8853g乙二酸二酰肼，室温下反应24h，透析冻干，即得到磷酸化和乙二酸二酰肼化聚γ-谷氨酸，O-磷酸-L-丝氨酸的接枝率为24%，乙二酸二酰肼的接枝率为23%。
Claims (5)
1.一种磷酸化和氨基化聚谷氨酸，其特征在于在聚谷氨酸侧链上同时引入磷酸基和氨基，其中氨基的、磷酸基和聚谷氨酸的摩尔比为：0.3-0.4:0.05-0.2:1。
2.一种制备根据权利要求1所述的磷酸化和氨基化聚谷氨酸的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：
a.将聚谷氨酸溶于二甲亚砜中配制成质量百分比浓度为1～10%，再加入碳二亚胺活化剂，完全溶解后加入稳定剂N-羟基琥珀酰亚胺，在惰性气体保护下，反应1～20h，用乙醇沉降，过滤并干燥，得聚谷氨酸琥珀酰亚胺酯；所述的碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:10～10:1；所述的N-羟基琥珀酰亚胺NHS和聚谷氨酸的摩尔比为1:50～50:1；
b.将步骤a所得聚谷氨酸琥珀酰亚胺酯溶于二甲亚砜中配制成质量百分比浓度为1～10%的溶液，再滴加浓度为0.1～5mol/L的NaOH或NaHCO3溶液，并加入与上述二甲亚砜等体积的去离子水，得到油水混合体系，将磷酸化合物和氨基化合物先后加入，反应1～24h后透析冻干，即得到磷酸化和氨基化聚谷氨酸；所述的聚谷氨酸琥珀酰亚胺酯与NaOH溶液的体积比为：160：1；所述的磷酸化合物与聚谷氨酸的摩尔比为1:10～3：1；所述的氨基化合物与聚谷氨酸琥珀酰亚胺酯的摩尔比为1:10～3:1。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的磷酸化合物为：O-磷酸-L-丝氨酸、磷酸乙醇胺。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的氨基化合物为：乙二胺、己二胺、乙二酸二酰肼、己二酸二酰肼。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的碳二亚胺活化剂为：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或二环己基碳二亚胺。
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