CN104524584A - 一种逐级响应的纳米载体、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纳米载体、其制备方法及其应用，该纳米载体包括纳米凝胶内核和包裹在纳米凝胶内核表面的嵌段共聚物；所述纳米凝胶内核包括末端的正己基、L-赖氨酸链节、L-胱氨酸链节和L-苯丙氨酸链节；所述嵌段共聚物具有式I结构。该纳米载体通过增强渗透滞留(EPR)效应在肿瘤组织部位富集，在肿瘤组织部位pH值条件下，嵌段共聚物作为外壳脱去，露出带正电的纳米凝胶内核，正电性的纳米凝胶内核有助于细胞内吞，当纳米凝胶内核进入细胞后，在细胞内高谷胱甘肽的浓度下，纳米凝胶内核中作为交联点的二硫键断裂，纳米凝胶内核解体，从而快速释放出药物，因此，该纳米载体通过调节其在肿瘤的各个部位的释放，具有逐级响应性。
Description
技术领域
本发明属于高分子药物载体技术领域，尤其涉及一种逐级响应的纳米载体、其制备方法及其应用。
背景技术
肿瘤已经成为威胁人类健康的最严重疾病之一。临床上常用的癌症治疗手段有化学治疗、放射治疗和手术治疗等。其中，化学治疗是最常用和重要的治疗途径。但临床上所用的抗肿瘤药物在应用中有诸多的缺陷，如：水溶性及稳定性差，药物毒副作用大。为了解决这些问题，可将药物与药物载体结合，以改善药物的水溶性和稳定性，并达到对药物的控制释放，从而减小药物对正常组织的毒副作用，充分发挥药物的功效。
作为药物控制释放载体的高分子材料和药物分子结合能够形成多种高分子药物控制释放体系，通过延长药物在体内的循环时间或使药物刺激响应释放，从而增加药物效果。高分子材料通过以纳米胶束的形式发挥药物控制释放载体的作用。高分子纳米胶束是由亲水链段和疏水链段的两亲性共聚物在水中自发组装形成的纳米尺寸的具有核-壳结构的聚集体，在自组装过程中，疏水嵌段构成胶束的内核，而亲水嵌段则在胶束内核的周围构成胶束的外壳。聚合物纳米胶束具有粒径可控、体内循环时间长，可以进行靶向性修饰等优点，研究较为广泛。但是，由于胶束是线型嵌段共聚物在水中自组装形成的不稳定体系，在血液循环系统中易发生药物的突然释放，不具有逐级相应性，影响药物的疗效。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种逐级响应的纳米载体、其制备方法及其应用，本发明提供的纳米载体具有逐级响应性。
本发明提供了一种纳米载体，包括纳米凝胶内核和包裹在所述纳米凝胶内核表面的嵌段共聚物；
所述纳米凝胶内核包括末端的正己基、L-赖氨酸链节、L-胱氨酸链节和L-苯丙氨酸链节；
所述嵌段共聚物具有式I所示结构：
式I；
式I中，20≤m≤200；
5≤n≤50；
所述R选自式101～式106中任意一种：
式101、式102、式103、式104、式105、式106。
优选地，所述正己基与L-赖氨酸链节的摩尔比为1：(5～50)；
所述正己基与L-胱氨酸链节的摩尔比为1：(5～20)；
所述正己基与L-苯丙氨酸链节的摩尔比为1:(5～20)。
优选地，所述纳米凝胶内核的制备方法包括以下步骤：
将正己胺、N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐和第一有机溶剂混合，反应，得到第一反应溶液；
将L-胱氨酸-N-环内酸酐、L-苯丙氨酸-N-环内酸酐和所述第一反应溶液混合，反应，得到第二反应溶液；
将第二反应溶液和第二有机溶剂混合，过滤，得到固体；
将所述固体脱去苄氧羰基，得到纳米凝胶内核。
优选地，所述正己胺和N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐进行反应的温度为15℃～50℃；
所述正己胺和N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐进行反应的时间为2天～7天。
优选地，L-胱氨酸-N-环内酸酐、L-苯丙氨酸-N-环内酸酐和所述第一反应溶液进行反应的温度为15℃～50℃；
L-胱氨酸-N-环内酸酐、L-苯丙氨酸-N-环内酸酐和所述第一反应溶液进行反应的时间为2天～7天。
优选地，所述第一有机溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺、二氧六环和氯仿中的一种或多种；
所述第二有机溶剂为乙醚。
优选地，所述固体脱去苄氧羰基在酸性条件下进行。
本发明提供了一种纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
将纳米凝胶内核和嵌段共聚物溶解于磷酸盐缓冲溶液中，搅拌，得到纳米载体；
所述纳米凝胶内核包括末端的正己基、L-赖氨酸链节、L-胱氨酸链节和L-苯丙氨酸链节；
所述嵌段共聚物具有式I所示结构：
式I；
式I中，20≤m≤200；
5≤n≤50；
所述R选自式101～式106中任意一种：
式101、式102、式103、式104、式105、式106。
本发明提供了一种纳米载药体系，由以下制备方法制得：
将纳米凝胶内核与抗肿瘤药物溶解于有机溶剂中，搅拌，加入去离子水，搅拌，透析，冻干，得到载药纳米凝胶内核；
将所述载药纳米凝胶内核和嵌段共聚物溶解于磷酸盐缓冲溶液中，搅拌，得到纳米载药体系；
所述纳米凝胶内核包括末端的正己基、L-赖氨酸链节、L-胱氨酸链节和L-苯丙氨酸链节；
所述嵌段共聚物具有式I所示结构：
式I；
式I中，20≤m≤200；
5≤n≤50；
所述R选自式101～式106中任意一种：
式101、式102、式103、式104、式105、式106。
优选地，所述抗肿瘤药物包括阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、奥沙利铂、硼替佐米、喜树碱和紫草素中的一种或多种。
本发明提供了一种纳米载体、其制备方法及其应用，该纳米载体包括纳米凝胶内核和包裹在所述纳米凝胶内核表面的嵌段共聚物；所述纳米凝胶内核包括末端的正己基、L-赖氨酸链节、L-胱氨酸链节和L-苯丙氨酸链节；所述嵌段共聚物具有式I所示结构。本发明提供的纳米载体通过增强渗透滞留(EPR)效应在肿瘤组织部位富集，在肿瘤组织部位pH值条件下，嵌段共聚物作为外壳脱去，露出带正电的纳米凝胶内核，正电性的纳米凝胶内核有助于细胞内吞，当纳米凝胶内核进入细胞后，在细胞内高谷胱甘肽的浓度下，纳米凝胶内核中作为交联点的二硫键断裂，纳米凝胶内核解体，从而快速释放出药物，因此，本发明提供的纳米载体通过需要调节其在肿瘤的各个部位的释放，具有逐级响应性。
本发明提供的纳米载体具有良好的生物相容性和生物降解性，而且降解得到的产物为氨基酸和聚乙二醇，可通过肾脏直接排除体外，对人体无害。
附图说明
图1为本发明实施例9制备的纳米凝胶内核的核磁共振氢谱图；
图2为本发明实施例42制备的嵌段共聚物的核磁共振氢谱图；
图3为本发明实施例71制备的纳米载药体系的透射电镜图；
图4为本发明实施例71制备的纳米载药体系的药物释放曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种纳米载体，包括纳米凝胶内核和包裹在所述纳米凝胶内核表面的嵌段共聚物；
所述纳米凝胶内核包括末端的正己基、L-赖氨酸链节、L-胱氨酸链节和L-苯丙氨酸链节；
所述嵌段共聚物具有式I所示结构：
式I；
式I中，20≤m≤200；
5≤n≤50；
所述R选自式101～式106中任意一种：
式101、式102、式103、式104、式105、式106。
本发明提供的纳米凝胶载药体系包括纳米凝胶内核，所述纳米凝胶内核包括末端的正己基、L-赖氨酸链节、L-胱氨酸链节和L-苯丙氨酸链节。在本发明中，所述纳米凝胶内核中末端的正己基和L-赖氨酸链节通过酰胺键连接；L-胱氨酸链节和L-苯丙氨酸链节无规共聚；L-胱氨酸链节和L-苯丙氨酸链节的无规共聚物通过酰胺键与L-赖氨酸链节相连；
在本发明中，所述正己基与L-赖氨酸链节的摩尔比优选为1：(5～50)，更优选为1：(5～25)，最优选为1：10；
所述正己基与L-胱氨酸链节的摩尔比为1：(5～20)，更优选为1：(5～10)，最优选为1：10；
所述正己基与L-苯丙氨酸链节的摩尔比为1:(5～20)，更优选为1：(5～10)，最优选的为1：10。
在本发明中，所述纳米凝胶内核优选通过以下制备方法制得：
将正己胺、N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐和第一有机溶剂混合，反应，得到第一反应溶液；
将L-胱氨酸-N-环内酸酐、L-苯丙氨酸-N-环内酸酐和所述第一反应溶液混合，反应，得到第二反应溶液；
将第二反应溶液和第二有机溶剂混合，过滤，得到固体；
将所述固体脱去苄氧羰基，得到纳米凝胶内核。
本发明将正己胺、N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐和第一有机溶剂混合，反应，得到第一反应溶液。本发明对所述正己胺的来源没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的正己胺即可，如可以采用其市售商品。
在本发明中，所述第一有机溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺、二氧六环和氯仿中的一种或多种，更优选为N,N-二甲基甲酰胺或二氧六环，最优选为N,N-二甲基甲酰胺。在本发明中，所述N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐的质量与第一有机溶剂的体积比优选为1g:(1～20)mL，更优选为1g:(3～15)mL，最优选为1g:(5～10)mL。
在本发明中，所述N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐的制备方法优选包括以下步骤：
将N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐。
本发明将N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯混合；所述N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯混合的温度优选10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，最优选为20℃～30℃。在本发明中，所述N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1:(0.1～1.2)，更优选为1:(0.3～1)，最优选为1:(0.5～0.8)。本发明优选在无水条件下进行N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应。本发明优选在第三有机溶剂中先溶解所述N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸；所述第三有机溶剂优选为四氢呋喃；所述第三有机溶剂的体积和N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的质量比优选为(8～12)mL:1g，更优选为10mL:1g。在本发明中，所述N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应温度优选为30℃～80℃，更优选为35℃～70℃，最优选为40℃～60℃，所述N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应时间优选为0.1小时～5小时，更优选为0.15小时～3小时，最优选为0.2小时～2小时。
所述N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应结束后，本发明优选将得到的反应产物用石油醚沉降，将得到的沉降物分离，然后将得到的分离产物洗涤、重结晶、干燥，得到N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐。本发明对洗涤、重结晶、干燥的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的洗涤、重结晶、干燥的技术方案即可。
在本发明中，所述正己胺与N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐的摩尔比优选为1：(5～50)，更优选为1：(5～25)，最优选为1：10。
本发明优选在氮气气氛下进行正己胺和N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐的反应。本发明优选在搅拌的条件下进行正己胺和N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐的反应。在本发明中，正己胺和N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐进行反应的温度优选为15℃～50℃，更优选为20℃～40℃，最优选25℃～35℃；正己胺和N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐进行反应的时间选为2天～7天，更优选为3天～5天，最优选为4天。
得到第一反应溶液后，本发明将L-胱氨酸-N-环内酸酐、L-苯丙氨酸-N-环内酸酐和所述第一反应溶液混合，反应，得到第二反应溶液。
在本发明中，所述L-苯丙氨酸-N-环内酸酐优选按照以下方法制备：
将L-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到L-苯丙氨酸-N-环内酸酐。
本发明将L-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯混合；所述L-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯混合时的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，最优选为20℃～30℃。在本发明中，所述L-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1:(0.1～1.2)，更优选为1:(0.3～1)，最优选为1:(0.5～0.8)。本发明优选在无水条件下进行L-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应。本发明优选在第四有机溶剂中先溶解所述L-苯丙氨酸；所述第四有机溶剂优选为四氢呋喃；所述第四有机溶剂的体积和L-苯丙氨酸的质量比优选为(8～12)mL:1g，更优选为10mL:1g。在本发明中，所述L-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应的温度优选为30℃～80℃，更优选为35℃～70℃，最优选为40℃～60℃，所述缩合反应时间优选为0.1小时～5小时，更优选为0.15小时～3小时，最优选为0.2小时～2小时。
在本发明中，L-苯丙氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应结束后，本发明优选将得到的反应产物用石油醚沉降，将得到的沉降物分离，然后将得到的分离产物洗涤、重结晶、干燥，得到L-苯丙氨酸-N-环内酸酐。
在本发明中，所述L-胱氨酸-N-环内酸酐的制备方法优选包括以下步骤：
将L-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应，得到L-胱氨酸-N-环内酸酐。
本发明将L-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯混合；所述L-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯混合时的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，最优选为20℃～30℃。在本发明中，所述L-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的摩尔比优选为1:(0.1～1.2)，更优选为1:(0.3～1)，最优选为1:(0.5～0.8)。本发明优选在第五有机溶剂中先溶解L-胱氨酸；所述第五有机溶剂优选为四氢呋喃；所述第五有机溶剂的体积和L-胱氨酸的质量比优选为(8～12)mL:1g，更优选为10mL:1g。在本发明中，L-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应的温度优选为30℃～80℃，更优选为35℃～70℃，最优选为40℃～60℃；L-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯进行缩合反应的时间优选为0.1小时～5小时，更优选为0.15小时～3小时，最优选为0.2小时～2小时。
L-胱氨酸与双(三氯甲基)碳酸酯的缩合反应结束后，本发明优选将得到的反应产物用石油醚沉降，将得到的沉降物分离，然后将得到的分离产物洗涤、重结晶、干燥，得到L-胱氨酸-N-环内酸酐。
本发明优选将L-胱氨酸-N-环内酸酐与L-苯丙氨酸-N-环内酸酐依次加入到第一反应溶液中。在本发明中，所述正己胺与L-胱氨酸-N-环内酸酐的摩尔比优选为1：(5～20)，更优选为1：(5～10)，最优选为1：10。所述正己胺与L-苯丙氨酸-N-环内酸酐的摩尔比优选为1：(5～20)，更优选为1：(5～10)，最优选的为1：10。
本发明优选在氮气气氛下进行L-胱氨酸-N-环内酸酐、L-苯丙氨酸-N-环内酸酐和所述第一反应溶液的反应。本发明优选在搅拌的条件下进行L-胱氨酸-N-环内酸酐、L-苯丙氨酸-N-环内酸酐和所述第一反应溶液的反应。在本发明中，L-胱氨酸-N-环内酸酐、L-苯丙氨酸-N-环内酸酐和所述第一反应溶液进行反应的温度优选为15℃～50℃，更优选为20℃～40℃，最优选为25℃～35℃。所述的反应时间优选为2天～7天，更优选为3天～5天，最优选为4天。
得到第二反应溶液后，本发明优选将第二反应溶液和第二有机溶剂混合，过滤，得到固体。在本发明中，所述第二有机溶剂优选为乙醚。
本发明优选将过滤得到的产物进行真空干燥，得到固体。在本发明中，所述过滤得到的产物真空干燥的温度优选为20℃～40℃，更优选为25℃～35℃；所述过滤得到的产物真空干燥的时间优选为12h～24h，更优选为18h～24h。
得到固体后，本发明将所述固体脱去苄氧羰基得到纳米凝胶内核。本发明优选将固体溶解在第六有机溶剂中再脱去苄氧羰基；所述第六有机溶剂优选为三氟乙酸或二氯乙酸，更优选为三氟乙酸；所述第六有机溶剂的体积和固体的质量比优选为(8～12)mL:1g，更优选为10mL:1g。在本发明中，所述固体脱去苄氧羰基优选在酸性条件下进行；所述酸性条件优选由溴化氢的乙酸溶液提供；所述溴化氢的乙酸溶液中溴化氢和乙酸的体积比优选为0.5:1～5:1，更优选为2:1。
本发明优选在搅拌的条件下进行固体脱去苄氧羰基。在本发明中，所述固体脱去苄氧羰基的温度优选为20℃～50℃，更优选为30℃～35℃；所述固体脱去苄氧羰基的时间优选为0.5h～4h，更优选为1h～2h，最优选为1h。
完成固体脱去苄氧羰基的反应后，本发明优选将反应液置于乙醚中进行抽滤，将抽滤得到的固体产物用去离子水溶解，然后透析，冻干，得到纳米凝胶内核。本发明优选采用截留分子量为3500的透析袋去透析；所述透析的时间为4天，每4h换一次透析液。本发明对冻干的方法没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的冻干技术方案即可；所述冻干的温度优选为-20℃，冻干的时间优选为72h。
本发明对得到的纳米凝胶内核进行核磁共振氢谱测试，测试结果表明：纳米凝胶内核包括正己胺引发剂末端甲基氢(0.9ppm)，主链叔碳上氢特征峰(4.2ppm)，赖氨酸与苯丙氨酸侧基苯环氢特征峰(7.0ppm～8.0ppm)，赖氨酸链段侧基饱和碳链上氢特征峰与苯丙氨酸链段亚甲基氢的特征峰(1.4ppm与1.6ppm)。
本发明提供的纳米载体包括包裹在上述技术方案所述纳米凝胶内核表面的嵌段共聚物。
在本发明中，所述嵌段共聚物具有式I所示结构：
式I中，所述m为聚合度，20≤m≤200；
所述n为聚合度，5≤n≤50；
所述R选自式101～式106中任意一种：
式101、式102、式103、式104、式105、式106。
在本发明中，所述具有式I所示结构的嵌段共聚物的制备方法优选包括以下步骤：
将聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)和酸酐反应，得到具有式I所示结构的嵌段共聚物；
所述酸酐为丁二酸酐、二甲基马来酸酐、四氢苯酐、马来酸酐、乌头酸酐或四甲基马来酸酐；
式I；
式I中，所述m为聚合度，20≤m≤200；
所述n为聚合度，5≤n≤50；
所述R选自式101～式106中任意一种：
式101、式102、式103、式104、式105、式106。
在本发明中，所述聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)的制备方法优选包括以下步骤：
将端氨基化的聚乙二醇单甲醚与N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐发生聚合反应，得到聚乙二醇单甲醚-聚(N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸)；
将聚乙二醇单甲醚-聚(N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸)脱去N-苄氧羰基，得到聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)。
在本发明中，所述端氨基化的聚乙二醇单甲醚的制备方法优选包括以下步骤：
将聚乙二醇单甲醚溶液、三乙胺和甲基磺酰氯进行酯化反应，得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯；
将所述甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯和氯化铵进行氨解反应，得到端氨基化的聚乙二醇单甲醚。
本发明将聚乙二醇单甲醚溶液、三乙胺和甲基磺酰氯进行酯化反应，得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯。
在本发明中，所述聚乙二醇单甲醚溶液的制备方法优选包括以下步骤：
将聚乙二醇单甲醚和甲苯共沸，除去水和甲苯，再和第七有机溶剂混合，得到聚乙二醇单甲醚溶液。在本发明中，所述第七有机溶剂优选为二氯甲烷；所述聚乙二醇单甲醚的质量和第七有机溶剂的体积比优选为1g:(1～20)mL，更优选为1g:(3～18)mL，最优选为1g:(5～15)mL。
在本发明中，所述聚乙二醇单甲醚的数均分子量优选为2000g/mol～20000g/mol，更优选为1000g/mol～8000g/mol，最优选为1500g/mol～5000g/mol。
得到聚乙二醇单甲醚溶液后，本发明将所述聚乙二醇单甲醚溶液、三乙胺和甲基磺酰氯进行酯化反应，得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯。本发明优选将三乙胺和甲基磺酰氯加入到所述聚乙二醇单甲醚溶液中。在本发明中，所述三乙胺与聚乙二醇单甲醚的摩尔比优选为(2～20):1，更优选为(5～18):1，最优选为(8～14):1；所述三乙胺与甲基磺酰氯的摩尔比优选为(1～10):(10～30)，更优选为(3～8):(18～26)，最优选为(4～7):(15～24)。
本发明优选在无水条件下将三乙胺和甲基磺酰氯加入到所述聚乙二醇单甲醚溶液中。本发明优选在-10℃～10℃下将三乙胺和甲基磺酰氯加入到所述聚乙二醇单甲醚溶液中，更优选为-5℃～5℃。本发明优选以滴加的方式将甲基磺酰氯加入到所述聚乙二醇单甲醚溶液中。本发明优选在第一温度下进行酯化反应第一时间，升温至第二温度进行酯化反应第二时间。在本发明中，所述第一温度优选为-10℃～10℃，更优选为-5℃～5℃；所述第一时间优选为0.5小时～4小时，更优选为1小时～3.5小时，最优选为1.5小时～2.5小时；所述第二温度优选为12℃～40℃，更优选为18℃～35℃，最优选为15℃～28℃；所述第二时间优选为10小时～72小时，更优选为15小时～60小时，最优选为20小时～48小时。
酯化反应结束后，本发明优选将酯化反应产物过滤，得滤液；将滤液依次进行浓缩、沉降和过滤，将得到的沉降物进行洗涤和干燥，得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯。本发明优选采用乙醚进行沉降。在本发明中，所述干燥优选为真空干燥；所述真空干燥的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～38℃，最优选为20℃～30℃；所述真空干燥的时间优选为15小时～35小时，更优选为18小时～30小时，最优选为22小时～28小时。
得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯后，本发明将所述甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯和氯化铵进行氨解反应，得到端氨基化的聚乙二醇单甲醚。本发明优选在氨水中进行氨解反应。在本发明中，所述甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯的质量、氯化铵的质量与氨水的体积比优选为1g:(0.2～3.5)g:(30～70)mL，更优选为1g:(0.5～3)g:(35～55)mL，最优选为1g:(1～1.8)g:(40～50)mL。
在本发明中，所述氨水的质量分数优选为20％～35％，更优选为35％。
在本发明中，所述氨解反应的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，最优选为20℃～30℃，所述氨解反应的时间优选为40小时～100小时，更优选为50小时～85小时，最优选为60小时～75小时。
氨解反应结束后，本发明优选将得到的反应液依次进行萃取、洗涤、干燥、浓缩、沉降和过滤；将过滤物进行洗涤和干燥。本发明优选采用二氯甲烷进行萃取。本发明优选采用氯化钠水溶液进行洗涤。本发明优选采用无水硫酸钠进行反应液的干燥。本发明优选采用乙醚进行沉降。本发明优选将过滤物进行真空干燥；所述过滤物真空干燥的温度优选为10℃～40℃，更优选为15℃～35℃，最优选为20℃～30℃，所述过滤物真空干燥的时间优选为15小时～35小时，更优选为18小时～30小时，最优选为20小时～28小时。
在本发明中，所述N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐与上述技术方案所述的N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐来源一致，在此不再赘述。
本发明优选将端氨基化的聚乙二醇单甲醚先和无水甲苯共沸除水后继续除去甲苯，然后将其溶于第八有机溶剂中，得到第一溶液；所述第八有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或三氯甲烷，更优选为N,N-二甲基甲酰胺。在本发明中，所述端氨基化的聚乙二醇单甲醚的质量和第八有机溶剂的体积比优选为1g:10mL；所述端氨基化的聚乙二醇单甲醚的质量与无水甲苯的体积比优选为1g:(10～50)mL，更优选为1g:(15～45)mL，最优选为1g:(25～35)mL，所述共沸的温度优选为110℃～150℃，更优选为115℃～140℃，最优选为125℃～135℃，所述共沸的时间优选为1小时～3小时，更优选为1.5小时～2.5小时，最优选为1.8小时～2.2小时。
本发明优选将N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐溶于第九有机溶剂中，得到第二溶液；所述第九有机溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或三氯甲烷，更优选为N,N-二甲基甲酰胺；所述第九有机溶剂的体积和N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐的质量比优选为10mL:1g。
将所述第一溶液和第二溶液混合，所述端氨基化的聚乙二醇单甲醚和N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐进行聚合反应。本发明优选在氮气的气氛下进行端氨基化的聚乙二醇单甲醚与N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐的聚合反应。本发明优选在搅拌的条件下进行端氨基化的聚乙二醇单甲醚与N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐的聚合反应。在本发明中，所述端氨基化的聚乙二醇单甲醚与N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐的摩尔比为1:(5～120)，优选为1:(10～100)，更优选为1:(15～90)。所述聚合反应温度优选为15℃～45℃，更优选为20℃～40℃，更优选为25℃～35℃，所述聚合反应时间优选为20小时～80小时，更优选为24小时～72小时，最优选为30小时～70小时。
聚合反应结束后，本发明优选用减压抽干的方法将得到的反应液中的有机溶剂抽干，用氯仿溶解得到的固体，然后用乙醚进行沉降，对得到的沉降物进行抽滤、洗涤、真空干燥，得到聚乙二醇单甲醚-聚(N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸)。
本发明优选将得到的聚乙二醇单甲醚-聚(N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸)溶解与第十有机溶剂中，然后和溴化氢的乙酸溶液反应。在本发明中，所述第十有机溶剂优选包括三氟乙酸和/或二氯乙酸，更优选为三氟乙酸；所述第十有机溶剂的体积和聚乙二醇单甲醚-聚(N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸)的质量比优选为(8～12)mL:1g，更优选为10mL:1g。在本发明中，所述溴化氢的乙酸溶液中溴化氢和乙酸的体积比优选为0.5：1～5：1，更优选为2：1；聚乙二醇单甲醚-聚(N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸)和溴化氢的乙酸溶液反应的温度优选为20℃～50℃，更优选为30℃～35℃；聚乙二醇单甲醚-聚(N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸)和溴化氢的乙酸溶液反应的时间优选为0.5h～4h，更优选为1～2h，最优选为1h。
本发明将得到的反应产物进行抽滤，透析，冻干，得到聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)。本发明优选采用乙醚将反应产物置于乙醚中进行抽滤，将得到的固体优选用去离子水进行透析；本发明优选采用分子量为3500的透析袋在去离子水中透析；所述透析的时间优选为3天，每4h换一次透析液。
在本发明中，所述酸酐优选包括丁二酸酐、二甲基马来酸酐、四氢苯酐、马来酸酐、乌头酸酐和四甲基马来酸酐中的一种或多种。
本发明优选将聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)先溶解，调节得到的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)溶液的pH值；将经过pH值调节的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)溶液和酸酐混合，调节得到的混合液的pH值，反应，透析和冻干，得到具有式I所示结构的嵌段共聚物。
在本发明中，所述聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)溶液的pH值优选为7～10，更优选为8～9；混合液的pH值优选为7～10，更优选为8～9；透析的时间优选为2h～48h，更优选为3h～24h，更优选为4h～12h。
本发明提供了一种纳米载药体系的制备方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述的纳米凝胶内核与抗肿瘤药物溶解于第十一有机溶剂中，搅拌，加入去离子水，搅拌，透析，冻干，得到载药纳米凝胶内核；
将所述载药纳米凝胶内核和具有式I所示结构的嵌段共聚物溶解于磷酸盐缓冲溶液中，搅拌，得到纳米载药体系。
将上述技术方案所述的纳米凝胶内核与抗肿瘤药溶解于第十一有机溶剂中，搅拌，加入去离子水，搅拌，透析，冻干，得到载药纳米凝胶内核。在本发明中，所述第十一有机溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺和/或二甲基亚砜，更优选为二甲基亚砜；所述第十一有机溶剂的体积和纳米凝胶内核的质量比优选为1mL:10mg。在本发明中，纳米凝胶内核在第十一有机溶剂中进行搅拌的时间优选为8h～24h，更优选为8h～16h，最优选为8h。在本发明中，所述透析的温度优选为4℃～20℃，更优选为4℃～8℃，最优选为4℃；透析时间优选为4h～12h，更优选为4h～8h，最优选为8h。在本发明中，所述抗肿瘤药物包括阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、奥沙利铂、硼替佐米、喜树碱和紫草素中的一种或多种；所述抗肿瘤药物为纳米凝胶内核质量的10％～60％。
得到载药纳米凝胶内核后，本发明将所述载药纳米凝胶内核和具有式I所示结构的嵌段共聚物溶解于磷酸盐缓冲溶液中，搅拌，得到纳米载药体系。在本发明中，所述嵌段共聚物中羧基与载药纳米凝胶内核中氨基的物质的量比优选为(1～10):1，更优选为(2～5):1，最优选为3:1；磷酸盐缓冲溶液pH值优选为7.4。
本发明提供的纳米载药体系在血液中循环长；能够在肿瘤组织处富集；渗透进入肿瘤组织内，正电性的载药纳米凝胶内核有助于肿瘤细胞内吞，在肿瘤细胞内快速释放所载药物。
本发明提供了一种纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述的纳米凝胶内核和具有式I所示结构的嵌段共聚物溶解于磷酸盐缓冲溶液中，搅拌，得到纳米载体。
在本发明中，所述纳米凝胶内核和嵌段共聚物通过静电复合作用复合在一起，它能够逐级响应于肿瘤组织与肿瘤细胞内部微环境。
在本发明中，所述嵌段共聚物中羧基与纳米凝胶内核中氨基的物质的量比优选为(1～10):1，更优选为(2～5):1，最优选为3:1；所述磷酸盐缓冲溶液的pH值优选为5～8，更优选为7～8，最优选为7.4；所述磷酸盐缓冲溶液的体积和纳米凝胶内核的质量比优选为1mL:(0.8～1.2)mg，更优选为1mL:1mg。
本发明提供了一种逐级响应的纳米载体、其制备方法及其应用，该纳米载体包括纳米凝胶内核和包裹在所述纳米凝胶内核表面的嵌段共聚物；所述纳米凝胶内核包括末端的正己基、L-赖氨酸链节、L-胱氨酸链节和L-苯丙氨酸链节；所述嵌段共聚物具有式I所示结构。本发明提供的纳米载体通过增强渗透滞留(EPR)效应在肿瘤组织部位富集，在肿瘤组织部位pH值条件下，脱去作为外壳的嵌段共聚物，露出带正电的纳米凝胶内核，正电性的纳米凝胶内核有助于细胞内吞，当纳米凝胶内核进入细胞后，在细胞内高谷胱甘肽的浓度下，纳米凝胶内核中作为交联点的二硫键断裂，纳米凝胶内核解体，从而快速释放出药物，因此，本发明提供的纳米载体可以通过需要调节其在肿瘤的各个部位的释放，具有逐级响应性。
本发明提供的纳米载体具有良好的生物相容性和生物降解性，而且降解得到的产物为氨基酸和聚乙二醇，可通过肾脏直接排除体外，对人体无害。
本发明可以通过调节纳米凝胶内核的聚合度和交联度等，得到不同粒径大小的纳米凝胶内核；可以通过调节遮蔽嵌段共聚物的侧基数量、类型及其与内核的比例，从而得到不同响应程度的纳米载体。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种逐级响应的纳米载体、其制备方法及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1：N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐的制备
将1g所述N-苄氧羰基-L-赖氨酸与0.6g双(三氯甲基)碳酸酯在25℃下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，分离、洗涤、重结晶、干燥后得到N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐。
实施例2：L-苯丙氨酸-N-环内酸酐的制备
将1g所述L-苯丙氨酸与0.6g双(三氯甲基)碳酸酯在25℃下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，分离、洗涤、重结晶、干燥后得到L-苯丙氨酸-N-环内酸酐。
实施例3：L-胱氨酸-N-环内酸酐的制备
将1g所述L-胱氨酸与0.6g双(三氯甲基)碳酸酯在25℃下混合，加入四氢呋喃，加热至50℃反应2h，反应结束后，将反应混合物在过量石油醚中沉降，分离、洗涤、重结晶、干燥后得到L-胱氨酸-N-环内酸酐。
实施例4：不同分子量的聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的制备
将1g N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐置于干燥的反应瓶中，加入10mL N,N-二甲基甲酰胺，再加入9μL正己胺，在氮气气氛下搅拌反应。得到聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的N’N-二甲基甲酰胺溶液。
实施例5：不同分子量的聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的制备
将1g N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐置于干燥的反应瓶中，加入10mL N’N-二甲基甲酰胺，再加入22.5μL正己胺，在氮气气氛下搅拌反应，得到聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的N’N-二甲基甲酰胺溶液。
实施例6：不同分子量的聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的制备
将1g N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐置于干燥的反应瓶中，加入10mL N,N-二甲基甲酰胺，再加入45μL正己胺，在氮气气氛下搅拌反应，得到聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的N’N-二甲基甲酰胺溶液。
实施例7：不同分子量的聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的制备
将1g N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐置于干燥的反应瓶中，加入10mL N’N-二甲基甲酰胺，再加入90μL正己胺，在氮气气氛下搅拌反应3天，得到聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的N’N-二甲基甲酰胺溶液。
实施例8：不同交联度的聚氨基酸纳米凝胶的制备
将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与0.48g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，加入到实施例4所述的聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，但其气氛下搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米凝胶。
实施例9：不同交联度的聚氨基酸纳米凝胶的制备
将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与0.95g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，加入到实施例4所述的聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米凝胶，即纳米凝胶内核。
本发明对本实施例9制备的纳米凝胶内核进行元素分析测试，测试结果如表1所示，表1为本发明实施例9制备的纳米凝胶内核的元素分析结果：
表1本发明实施例9制备的纳米凝胶内核的元素分析结果
| N/％ | C/％ | H/％ | S/％ | |
| 1 | 11.85 | 41.2 | 5.836 | 7.479 |
| 2 | 11.84 | 40.98 | 5.836 | 7.507 |
| 平均值 | 11.85 | 40.09 | 5.836 | 7.493 |
本发明对得到的纳米凝胶内核进行核磁共振氢谱测试，测试结果如图1所示，图1为本发明实施例9所制备的纳米凝胶内核的核磁共振氢谱图；由图1可以看出：正己胺引发剂末端甲基氢(0.9ppm)，主链叔碳上氢特征峰(4.2ppm)，赖氨酸与苯丙氨酸侧基苯环氢特征峰(7.0ppm～8.0ppm)，赖氨酸链段侧基饱和碳链上氢特征峰与苯丙氨酸链段亚甲基氢的特征峰(1.4ppm与1.6ppm)，并计算出各结构单元的比例，赖氨酸链段：苯丙氨酸链段：胱氨酸链段＝10：7：10。
实施例10：不同交联度的聚氨基酸纳米凝胶的制备
将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与1.43g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，加入到实施例4所述的聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米凝胶，即纳米凝胶内核。
实施例11：不同交联度的聚氨基酸纳米凝胶的制备
将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与1.90g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，加入到实施例4所述的聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米凝胶，即纳米凝胶内核。
实施例12：不同聚苯丙氨酸链节的聚氨基酸纳米凝胶的制备
将0.57g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与2.37g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，加入到实施例4所述的聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米凝胶，即纳米凝胶内核。
实施例13：不同聚苯丙氨酸链节的聚氨基酸纳米凝胶的制备
将1.14g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与1.90g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，加入到实施例4所述的聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米凝胶，即纳米凝胶内核。
实施例14：不同聚苯丙氨酸链节的聚氨基酸纳米凝胶的制备
将1.71g的L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与1.90g的L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，加入到实施例4所述的聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米凝胶，即纳米凝胶内核。
实施例15：不同聚苯丙氨酸链节的聚氨基酸纳米凝胶的制备
将2.28g L-苯丙氨酸-N-环内酸酐与1.90g L-胱氨酸-N-环内酸酐混合均匀，加入到实施例4所述的聚N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，氮气气氛下搅拌反应3天，将反应后溶液倾倒入100mL无水乙醚中，抽滤取固体，真空干燥，得到聚氨基酸纳米凝胶，即纳米凝胶内核。
实施例16～23：不同分子量的聚氨基酸纳米凝胶内核脱保护
将1g实施例8～15中制备的不同分子量的聚氨基酸纳米凝胶内核放入50mL圆底烧瓶中，加入10mL三氟乙酸溶解，再加入3mL溴化氢的乙酸溶液(溴化氢与乙酸的体积比为2:1)。室温搅拌反应1h；然后将反应液倒入100mL乙醚中，抽滤，得到的固体用水溶解，用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析3天，每4h换一次透析液；所得溶液冻干后得到纳米凝胶内核。
实施例24～28：不同数均分子量的端氨基化聚乙二醇单甲醚的制备
分别称取10g数均分子量为1000(0.01mol)、2000(0.005mol)、5000(0.002mol)、10000(0.001mol)和20000(0.0005mol)的聚乙二醇单甲醚，分别放入5个干燥的带支口的反应瓶中，分别加入100mL甲苯共沸除水，然后将得到的固体物分别溶于100mL无水二氯甲烷中，冷却至0℃，分别加入5.06g(0.05mol)、2.53g(0.025mol)、1.01g(0.010mol)、0.51g(0.005mol)和0.25g(0.0025mol)三乙胺，然后分别滴加22.91g，11.46g，4.58g，2.29g和1.15g甲基磺酰氯；甲基磺酰氯滴加结束后0℃反应2h，恢复至25℃，在搅拌子搅拌下继续反应24h，反应结束后用滤去生成的沉淀物，滤液用乙醚沉降，过滤，洗涤，25℃下真空干燥24h，得到甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯。本发明对所述甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯进行核磁共振分析，并计算其数均分子量，结果参见表2。
称取8g所得到的甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯，另外分别称取8g氯化铵，溶解于80mL氨水中，室温搅拌3d，反应结束后，用500mL二氯甲烷萃取，用5％氯化钠溶液洗涤3次，转移到锥形瓶中，用无水硫酸镁干燥过夜。抽滤，40℃旋转浓缩至100mL，将浓缩液倒入1000mL的无水乙醚中，抽滤得到固体，用真空干燥器干燥，得到端氨基化的聚乙二醇单甲醚。本发明对所述的端氨基化的聚乙二醇单甲醚进行核磁分析，计算其数均分子量，结果参见表2。
表2本发明实施例24～28制备的产物的数均分子量及产率
表1中，Mn1为甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯的数均分子量，产率1为甲基磺酸聚乙二醇单甲醚酯的产率；Mn2为端氨基化的聚乙二醇单甲醚的数均分子量，产率2为端氨基化的聚乙二醇单甲醚的产率。
实施例29～34
称取1g实施例26制备的数均分子量为4999的端氨基化的聚乙二醇单甲醚，加入到除水除氧的反应瓶中，加入30mL无水甲苯，在油浴中加热到125℃，共沸2h，接出甲苯，用油泵抽去残留甲苯，加入20mL N,N-二甲基甲酰胺，待固体溶解后，分别称取0.61g，1.22g，2.44g，4.88g，9.76g，12.24gN(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐溶于N,N-二甲基甲酰胺，在氮气气氛下，将所得N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐溶液与端氨基化的聚乙二醇单甲醚溶液混合，室温搅拌3天，聚合反应结束后，用减压抽干的方法将得到的反应液中N,N-二甲基甲酰胺的抽干，用氯仿溶解得到的固体，然后用乙醚进行沉降，对得到的沉降物进行抽滤、洗涤、真空干燥，得到聚乙二醇单甲醚-聚(N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸)。
对所述的聚乙二醇单甲醚-聚(N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸)进行核磁分析，计算其数均分子量，结果参见表3。
表3本发明实施例29～34制备的产物的数均分子量及产率
Mn表示数均分子量。
实施例35～40：制备的聚乙二醇单甲醚-聚(N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸)脱去N-苄氧羰基
分别称取1g实施例29～34中制备的相对分子质量为7619，10239，15479，25959，46919，57399的聚乙二醇单甲醚-聚(N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸)溶解于10mL三氟乙酸中，加入3mL溴化氢的乙酸溶液，室温搅拌反应1h，将反应液倒入100mL乙醚中，抽滤，得到的固体用水溶解，用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析3d，每4h换一次透析液，所得溶液冻干后得到聚乙二醇单甲醚-聚(L-赖氨酸)。通过核磁共振氢谱计算其分子量，见表4。
表4本发明实施例35～40制备的产物相对分子质量及产率
实施例41
称取100mg实施例35制备的分子量为6280的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)溶解于去离子水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为8，称取20.1mg 2,3,4,5-四氢苯酐，加入反应体系中，不断加入1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为9，反应12h后，透析，冻干，得到具有式I结构的2,3,4,5-四氢苯酐修饰的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)。
实施例42
称取100mg实施例36制备的分子量为7560的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)溶解于去离子水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为8，称取20.1mg 2,3,4,5-四氢苯酐，加入反应体系中，不断加入1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为9，反应12h后，透析，冻干，得到具有式I所示结构的嵌段共聚物，即2,3,4,5-四氢苯酐修饰的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)。
本发明对制备得到的嵌段共聚物进行核磁共振氢谱测试，测试结果如图2所示，图2为本发明实施例42制备的嵌段共聚物的核磁共振氢谱图，由图2可以看出，本发明实施例42制备的嵌段共聚物为2,3,4,5-四氢苯酐修饰的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)。
实施例43～46
分别称取100mg实施例37、实施例38、实施例39和实施例40制备的分子量为10120，15240，25480，30600的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)溶解于去离子水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为8，称取20.1mg2,3,4,5-四氢苯酐，加入反应体系中，不断加入1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为9，反应12h后，透析，冻干，得到具有式I结构的2,3,4,5-四氢苯酐修饰的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)。
实施例47
称取100mg实施例36中制备的分子量为7560的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)溶解于去离子水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为8～9，称取43.3mg丁二酸酐，加入反应体系中，不断加入1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为8～9，反应12h后，透析，冻干，得到具有式I结构的丁二酸酐修饰的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)。
实施例48
称取100mg实施例36中制备的分子量为7560的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)溶解于去离子水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为9，称取33.3mg二甲基马来酸酐，加入反应体系中；不断加入1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为8～9，反应12h后，透析，冻干，得到具有式I结构的二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)。
实施例49
称取100mg实施例36中制备的分子量为7560的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)溶解于去离子水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为8，称取41.2mg四甲基丁二酸酐，加入反应体系中，不断加入1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为8～9，反应12h后，透析，冻干，得到具有式I结构的四甲基丁二酸酐修饰的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)。
实施例50
称取100mg实施例36中制备的分子量为7560的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)溶解于去离子水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为8～9，称取41.2mg乌头酸酐，加入反应体系中，不断加入1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为8～9，反应12h后，透析，冻干，得到具有式I结构的乌头酸酐修饰的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)。
实施例51
称取100mg实施例36中制备的分子量为7560的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)溶解于去离子水中，用1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为8～9，称取43.3mg马来酸酐，加入反应体系中。不断加入1mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为8～9，反应12h后，透析，冻干，得到具有式I结构的马来酸酐修饰的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)。
实施例52～59：载药纳米凝胶内核的制备
称取100mg实施例16～23中制备的纳米凝胶内核与20mg阿霉素溶解于10mL二甲基亚砜中，搅拌12h，加入10mL去离子水，搅拌24h，透析，冻干，得到载药纳米凝胶内核。
实施例60～69：负载不同药物的纳米凝胶内核的制备
称取10份100mg实施例16中制备的纳米凝胶内核分别与20mg表阿霉素，20mg吡喃阿霉素，20mg紫杉醇，20mg多西紫杉醇，20mg顺铂，20mg卡铂，20mg奥沙利铂，20mg硼替佐米，20mg喜树碱，20mg紫草素溶解于10mL二甲基亚砜中，搅拌12h，再分别加入10mL去离子水，搅拌24h，透析，冻干，得到载药纳米凝胶内核。
实施例70
将1mg实施例52中制备的载药纳米凝胶内核溶解于10mL pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌；称取1mg的实施例42中制备的2,3,4,5-四氢苯酐修饰的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)，加入到上述溶液中，得到逐级响应的纳米载药体系。
实施例71
将1mg实施例52制备的载药纳米凝胶内核溶解于10mL pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌；称取2mg实施例42中制备的2,3,4,5-四氢苯酐修饰的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)，加入到上述溶液中，得到逐级响应的纳米载药体系。
本发明对本实施例71制备得到的纳米载药体系进行透射电镜测试，测试结果如图3所示，图3为本发明实施例71制备的纳米载药体系的透射电镜图；由图3可以看出：该载药体系具有均匀的粒径分布，且都在100nm～200nm，可以有效的提高其增强的渗透滞留效应。
本发明对本实施例71制备得到的纳米载药体系进行药物释放曲线的测试，测试结果如图4所示，其中曲线1为10mmol/L谷胱甘肽(GSH)下纳米载药体系的药物释放曲线，曲线2为纳米载药体系在pH值为5.5的磷酸盐缓冲溶液中的药物释放曲线，曲线3为纳米载药体系在pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中的药物释放曲线，曲线4为纳米载药体系在pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中的药物释放曲线。从图4可以看出：该纳米载药体系具有逐级响应的效果，可以在肿瘤细胞内部搞谷胱甘肽浓度的条件下发生离解，快速释放出包载的药物。
实施例72～74
将1mg实施例52中制备的载药纳米凝胶内核溶解于10mL pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌；分别称取4mg，6mg，10mg的实施例42中制备的2,3,4,5-四氢苯酐修饰的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)，加入到上述溶液中，得到不同遮蔽比例的逐级响应的纳米凝胶载药体系。
实施例75～79：不同遮蔽外壳的逐级响应的纳米载药体系的制备
将1mg实施例52中制备的载药内核溶解于10mL pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌。分别称取2mg实施例47～51中制备的丁二酸酐，二甲基马来酸酐，四甲基丁二酸酐，乌头酸酐，马来酸酐修饰的聚乙二醇单甲醚-b-聚(L-赖氨酸)，加入到上述溶液中，得到不同遮蔽外壳的逐级响应的纳米载药体系。
由以上实施例可知，本发明提供了一种纳米载体、其制备方法及其应用，该纳米载体包括纳米凝胶内核和包裹在所述纳米凝胶内核表面的嵌段共聚物；所述纳米凝胶内核包括末端的正己基、L-赖氨酸链节、L-胱氨酸链节和L-苯丙氨酸链节；所述嵌段共聚物具有式I所示结构。本发明提供的纳米载体通过增强渗透滞留(EPR)效应在肿瘤组织部位富集，在肿瘤组织部位pH值条件下，嵌段共聚物作为外壳脱去，露出带正电的纳米凝胶内核，当纳米凝胶内核进入细胞后，在细胞内高谷胱甘肽的浓度下，纳米凝胶内核中作为交联点的二硫键断裂，纳米凝胶内核解体，从而快速释放出药物，因此，本发明提供的纳米载体可以通过需要调节其在肿瘤的各个部位的释放，具有逐级响应性。
本发明提供的纳米载体具有良好的生物相容性和生物降解性，而且降解得到的产物为氨基酸和聚乙二醇，可通过肾脏直接排除体外，对人体无害。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种纳米载体，包括纳米凝胶内核和包裹在所述纳米凝胶内核表面的嵌段共聚物；
所述纳米凝胶内核包括末端的正己基、L-赖氨酸链节、L-胱氨酸链节和L-苯丙氨酸链节；
所述嵌段共聚物具有式I所示结构：
式I中，20≤m≤200；
5≤n≤50；
所述R选自式101～式106中任意一种：
式101、式102、式103、式104、式105、式106。
2.根据权利要求1所述的纳米载体，其特征在于，所述正己基与L-赖氨酸链节的摩尔比为1：(5～50)；
所述正己基与L-胱氨酸链节的摩尔比为1：(5～20)；
所述正己基与L-苯丙氨酸链节的摩尔比为1:(5～20)。
3.根据权利要求1所述的纳米载体，其特征在于，所述纳米凝胶内核的制备方法包括以下步骤：
将正己胺、N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐和第一有机溶剂混合，反应，得到第一反应溶液；
将L-胱氨酸-N-环内酸酐、L-苯丙氨酸-N-环内酸酐和所述第一反应溶液混合，反应，得到第二反应溶液；
将第二反应溶液和第二有机溶剂混合，过滤，得到固体；
将所述固体脱去苄氧羰基，得到纳米凝胶内核。
4.根据权利要求3所述的纳米载体，其特征在于，所述正己胺和N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐进行反应的温度为15℃～50℃；
所述正己胺和N(ε)-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-环内酸酐进行反应的时间为2天～7天。
5.根据权利要求3所述的纳米载体，其特征在于，L-胱氨酸-N-环内酸酐、L-苯丙氨酸-N-环内酸酐和所述第一反应溶液进行反应的温度为15℃～50℃；
L-胱氨酸-N-环内酸酐、L-苯丙氨酸-N-环内酸酐和所述第一反应溶液进行反应的时间为2天～7天。
6.根据权利要求3所述的纳米载体，其特征在于，所述第一有机溶剂包括N,N-二甲基甲酰胺、二氧六环和氯仿中的一种或多种；
所述第二有机溶剂为乙醚。
7.根据权利要求3所述的纳米载体，其特征在于，所述固体脱去苄氧羰基在酸性条件下进行。
8.一种纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
将纳米凝胶内核和嵌段共聚物溶解于磷酸盐缓冲溶液中，搅拌，得到纳米载体；
所述纳米凝胶内核包括末端的正己基、L-赖氨酸链节、L-胱氨酸链节和L-苯丙氨酸链节；
所述嵌段共聚物具有式I所示结构：
式I中，20≤m≤200；
5≤n≤50；
所述R选自式101～式106中任意一种：
式101、式102、式103、式104、式105、式106。
9.一种纳米载药体系，由以下制备方法制得：
将纳米凝胶内核与抗肿瘤药物溶解于有机溶剂中，搅拌，加入去离子水，搅拌，透析，冻干，得到载药纳米凝胶内核；
将所述载药纳米凝胶内核和嵌段共聚物溶解于磷酸盐缓冲溶液中，搅拌，得到纳米载药体系；
所述纳米凝胶内核包括末端的正己基、L-赖氨酸链节、L-胱氨酸链节和L-苯丙氨酸链节；
所述嵌段共聚物具有式I所示结构：
式I中，20≤m≤200；
5≤n≤50；
所述R选自式101～式106中任意一种：
式101、式102、式103、式104、式105、式106。
10.根据权利要求9所述的纳米载药体系，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括阿霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、奥沙利铂、硼替佐米、喜树碱和紫草素中的一种或多种。
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