JP2018008980A

JP2018008980A - ＩｇＡ産生促進作用を有する新規乳酸菌及びその用途

Info

Publication number: JP2018008980A
Application number: JP2017145866A
Authority: JP
Inventors: 大介松浦; Daisuke Matsuura; 孝志浅間; Takashi Asama; 弘典元木; Hironori Motoki; 智基立藤; Tomomoto Tatefuji; 橋本　健; Takeshi Hashimoto; 健橋本
Original assignee: Yamada Bee Farm Corp
Current assignee: Yamada Bee Farm Corp
Priority date: 2011-12-28
Filing date: 2017-07-27
Publication date: 2018-01-18
Anticipated expiration: 2032-12-25
Also published as: US20180112176A1; JP6420535B2; WO2013099883A1; JP5468183B2; US9856451B2; US10570366B2; JP6685974B2; JP2014073130A; JPWO2013099883A1; US20140363880A1

Abstract

【課題】ＩｇＡの産生促進作用が高い乳酸菌の提供。並びに乳酸菌又はその菌体処理物を含有する食品組成物、医薬組成物、化粧品組成物、気道又は食道の粘膜から侵入してくる病原体又はウイルスに対する感染予防用の免疫賦活剤、及び食中毒の予防又は緩和用の腸管免疫賦活剤の提供。
【解決手段】ラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌又はその菌体処理物を含有するＩｇＡ産生促進剤。
【効果】ラクトバチルス・クンキーは、ラクトバチルスＧＧ株（ＡＴＣＣ５３１０３）よりＩｇＡの産生促進作用が高く、且つリステリアＥＧＤ株よりマイトジェン活性及びＩＬ−２産生促進作用が低い。
【選択図】なし

Description

本発明は、高いIgA産生促進作用を有し、且つ免疫学的に安全であるラクトバチルス・
クンキー(Lactobacillus kunkeei)に属する乳酸菌、並びに該乳酸菌又はその菌体処理物
を含有する食品組成物、医薬組成物、化粧品組成物、及び免疫賦形剤に関する。

潰瘍性大腸炎とクローン病は、炎症性腸疾患(IBD)の中でも、病因が未だ明らかではな
く、難治性である。炎症性腸疾患に関わる要因としては、腸内細菌叢の異常、腸上皮細胞の分泌型IgA産生障害、腸粘膜下のサイトカインなどの因子が関わっている。潰瘍性大腸
炎は、大腸粘膜下の非特異性慢性炎症を主たる病変とするが、種々の自己抗体を認めることから、自己免疫疾患としての性格を有すると考えられる。一方、クローン病は非乾酪性肉芽腫性炎症性病変を病理学的特徴とし、病因の一つとして単球／マクロファージ系細胞の機能異常が想定されている。わが国において、潰瘍性大腸炎とクローン病の患者数は年10%弱と増加しつづけ問題となっている。

IBDは、従来は自己免疫疾患と言われていたが、最近の研究の進歩により、その炎症は
腸内細菌によって引き起こされていると考えられるようになってきた。IBDの患者の腸管
粘膜は内在性の腸内細菌叢に対して対照と比較して保護が弱く、管腔でのバクテリアの増加という結果になることが報告されている(GASTROENTEROLOGY 1999;117:1089-1097参照)
。そして、プロバイオティクスが腸炎を予防、改善することが報告されてから、治療法の一つとして、プロバイオティクスの有用性が注目されてきている。プロバイオティクスによるIBDの治療についての多くの報告が出されている(非特許文献１)。

乳酸菌は、発酵乳等の形で体内に摂取されることによって、整腸作用や血清コレステロール低下作用等の乳酸菌の機能性に基づいた種々の生理的効用を発揮することが知られている。乳酸菌の生理的効用として、慢性関節リウマチやインスリン依存性糖尿病等の自己免疫疾患や、過敏性腸症候群や潰瘍性大腸炎、クローン病等の炎症性腸疾患に対する効能について注目され始めてきている。

特許文献１には、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属及びストレプトコッカス属に属する乳酸菌からなる群より選択された1種類以上の乳酸菌の菌体を破砕する工程を含む方
法により製造して得られた破砕物は、インターロイキン10と12の産生調節能を有しており、これのクローン病や難治性炎症性腸疾患への適用について記載されている。

特許文献２には、粘膜付着性、増殖性及び耐酸性の高いラクトバチルス・サリバリウスに属する乳酸菌の潰瘍性大腸炎及びクローン病の予防及び／又は治療への適用が記載されている。

非特許文献２では、Lactobacillus casei strain GGが腸でのIgA免疫反応を増加させ、それにより腸の免疫学的バリアを増進する可能性を有することが実験結果により示され、Lactobacillus GGはクローン病への補助的な栄養療法を提供し得ることが報告されている。

非特許文献３では、クローン病の子供においてLactobacillus GGが腸のバリア機能と臨床状態を改善するかもしれないことを示す研究結果が報告されている。

また、Lactobacillus rhamnosus GGの経鼻投与によって、呼吸器の細胞媒介免疫反応が
増強されることによりマウスがインフルエンザウイルス感染から保護されることも報告されている(非特許文献４)。

ところで、クローン病の患者の粘膜では、IFN-γとIL-2のmRNAレベルが対照と比べて有意に増加しており、クローン病の患者の慢性的な腸の炎症は、Th1様のサイトカインの増
加によって特徴づけられるとの報告がある(非特許文献５)。

ラクトバチルス属の新種であるラクトバチルス・クンキーをワインから単離したことが非特許文献６において報告されている。また、非特許文献７では、フルクトースが豊富な場所(花)から好フルクト性乳酸菌株を単離し、その菌株にはラクトバチルス・クンキーが含まれていたことが、特許文献３では、ラクトバチルス・クンキーをミツバチから単離したことが報告されている。

特開2007-269737号公報国際公開第02/016554号特表2010-525809号公報

腸内細菌学雑誌 2009;23:193-201 Annals of Nutrition and Metabolism 1996;40:137-145 Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 2000;31:453-457 Letters in Applied Microbiology 2010;50:597-602 Clinical and Experimental Immunology 1995;101:428-435 Journal of Applied Microbiology 1998;84:698-702 Systematic and Applied Microbiology 2009;32:593-600

このようにIgA産生促進作用に優れ、且つ非特異的な細胞性免疫応答を誘導しない乳酸
菌は有用性が高く、その開発が望まれている。

そこで、本発明は、高いIgA産生促進作用を有し、且つ免疫学的に安全であるラクトバ
チルス・クンキーに属する乳酸菌を提供することを目的とする。更に、本発明は、該乳酸菌又はその菌体処理物を含有する食品組成物、医薬組成物、化粧品組成物、及び免疫賦形剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、蜜蜂が作る花粉荷から分離及び同定したラクトバチラス・クンキーに属する乳酸菌が、ラクトバチルスGG株(ATCC534103)よりIgAの産生促進作用が有意に高く、且つリステリアEGD株よりマイトジェン活性及びIL-2産生促進作用が有意に低いことを見出した。なお、当該乳酸菌のマイトジェン活性及びIL-2産生促進作用は、無刺激と同程度であって、Listeria死菌と比較しても極めて低いため、非特異的に細胞性免疫を誘導する能力はないと考えられる。すなわち、免疫学的に安全な物質であると思われる。

本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、以下の乳酸菌及び該乳酸菌等を含有する組成物等を提供するものである。

(I) 乳酸菌
(I-1) ラクトバチルスGG株(ATCC53103)よりIgAの産生促進作用が高く、且つリステリアEGD株よりマイトジェン活性及びIL-2産生促進作用が低い、ラクトバチルス・クンキーに属
する乳酸菌。
(I-2) グルコース、フルクトース、スクロース、トレハロース及びグルコン酸塩に対する資化性を示すことを特徴とする、(I-1)に記載の乳酸菌。
(I-3) 分離源がミツバチ又は養蜂産品である、(I-1)又は(I-2)に記載の乳酸菌。
(I-4) ラクトバチルス・クンキーBPS402(FERM BP-11439)又はラクトバチルス・クンキーBPS104(FERM BP-11438)である、(I-1)〜(I-3)のいずれか一項に記載の乳酸菌。

(II) 組成物１
(II-1) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する食品
組成物。
(II-2) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する医薬
組成物。
(II-3) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する化粧
品組成物。

(III) 免疫賦活剤
(III-1) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、気道又は食道の粘膜から侵入してくる病原体又はウイルスに対する感染予防用の免疫賦活剤。
(III-2) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、食中毒の予防又は緩和用の腸管免疫賦活剤。

(IV) 組成物２
(IV-1) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、整
腸、美容、又はアンチエイジング用の組成物。
(IV-2) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、炎
症性腸疾患の予防及び／又は治療用組成物。
(IV-3) 前記炎症性腸疾患がクローン病又は潰瘍性大腸炎である、(IV-2)に記載の組成物
。
(IV-4) 食品又は医薬品である、(IV-1)〜(IV-3)のいずれか一項に記載の組成物。

本発明のラクトバチラス・クンキーに属する乳酸菌は、高いIgA産生促進作用を有し、
且つ免疫学的に安全であるという優れた特性を有している。それ故、当該乳酸菌は、食品、医薬、化粧料などの分野において有用である。

本発明の乳酸菌は上記特性を有していることから、気道又は食道の粘膜から侵入してくる病原体又はウイルスに対する感染予防のための免疫賦活化、食中毒の予防又は緩和のための腸管免疫賦活化、整腸、美容又はアンチエイジング、クローン病又は潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患の予防又は治療などの効果が期待される。

ラクトバチルス・クンキーBPS402株、BPS104株及びJCM16173株のRAPD PCRのアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。1%アガロースゲル、50V、1h30min、EtBr染色ラクトバチルス・クンキーBPS402株とBPS104株のIgA産生能を示すグラフである。*: p＜0.05 (vs. L. rhamnosas GG : ATCC53103, Dunnetの多重比較検定) ラクトバチルス・クンキーBPS402株とBPS104株のマイトジェン活性(S.I.値)を示すグラフである。*: p＜0.01 (vs. Listeria monocytogenes : EGD, Dunnetの多重比較検定) S.I.値 : stimulation index 脾臓由来リンパ球のBrdU-Thymidine取込量(無刺激を1.0とした時の値) ラクトバチルス・クンキーBPS402株とBPS104株のIL2産生能(S.I.値)を示すグラフである。*: p＜0.01 (vs. Listeria monocytogenes : EGD, Dunnetの多重比較検定) S.I.値 : stimulation index CTLL-2細胞のBrdU-Thymidine取込量(無刺激を1.0とした時の値) インフルエンザウイルス(A/PR/8/34株)感染後のBALB/cマウスにおける生存率推移の比較(生食投与群 vs 1 mg/kg投与群)を示すグラフである(**: 生理食塩水投与群との比較によりp<0.05にて有意差あり)。インフルエンザウイルス感染後の生理食塩水投与マウスとBPS402投与マウスにおける肺臓内ウイルスゲノム量の比較を示すグラフである。図には、各サンプルにおける肺臓内ウイルスゲノム量の相対値を標準偏差とともに示している(**: p<0.05にて有意差あり)。インフルエンザウイルス感染後の生理食塩水投与マウスとBPS402投与マウスにおける肺胞-気管支洗浄液(BALF)でのウイルス特異的IgAの比較を示すグラフである。図には、各サンプルにおける測定結果の平均値を、標準偏差とともに示している(**: p<0.05にて有意差あり)。

以下、本発明を詳細に説明する。

乳酸菌
本発明のラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌は、ラクトバチルスGG株(ATCC53103)よりIgAの産生促進作用が高く、且つリステリアEGD株よりマイトジェン活性及びIL-2産
生促進作用が低いことを特徴とする。

本発明の乳酸菌は、好ましくは、グルコース、フルクトース、スクロース、トレハロース及びグルコン酸塩に対する資化性を示す乳酸菌である。また、本発明の乳酸菌は、好ましくは、分離源がミツバチ又は養蜂産品(ミツバチ産品)である乳酸菌である。本発明において養蜂産品とは、蜜蜂を飼育することにより得られる生産品を意味し、そのようなものとしては、例えば、蜂蜜、ローヤルゼリー、プロポリス、ミツロウ、蜂パン、花粉荷、蜂の子、それらの加工品(例えば抽出エキスなど)などが挙げられるが、本発明の乳酸菌としては、花粉荷を分離源とするものが特に好ましい。

ラクトバチルスGG株(ATCC53103)は、クローン病の患者などが経口摂取することにより
優れたIgA産生能が得られることについての多くの報告がある(Annals of Nutrition and Metabolism 1996;40:137-145、Pediatric Research 1992;32:141-144、Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 1995;20:333-338、FEMS Immunology and Medical
Microbiology 2000;29:47-52)。そのため、当該ラクトバチルスGG株よりIgA産生促進作
用が高ければ、IgA産生促進作用が顕著に優れると考えられる。

また、リステリア(Listeria monocytogenes)はリステリア症の原因細菌となるグラム陽性短桿菌であり、細胞性感染防御免疫は生菌でしか誘導されず、死菌免疫では容易に成立させることはできない(日本細菌学雑誌、64(4)：365-376、2009)。

一方、生菌程ではないが、リステリアEGD株の死菌も、マイトジェン活性やIL-2誘導能
を有している(Immunology 1987;62:241-248)。しかしながら、実際、加熱殺菌は多くの食
中毒菌と同様にリステリアに有効で、食中毒予防の手段として広く知られている。そのため、リステリアEGD株の死菌よりマイトジェン活性及びIL-2産生促進作用が低ければ、免
疫学的に安全な物質であると考えられる。

本発明のラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌の具体例は、本発明者らが花粉荷から単離及び同定したラクトバチルス・クンキーBPS402株又はラクトバチルス・クンキーBPS104株である(以下、単にBPS402株、BPS104株と記載することもある)。これらの乳酸菌の菌株は、2011年10月3日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６(郵便番号305-8566))に、それぞれ受託番号FERM P-22177、FERM P-22176として寄託されている。また、これらの菌株は、現在国際寄
託に移管されており、それぞれの受託番号はFERM BP-11439、FERM BP-11438である。

BPS402株、BPS104株の菌学的性質及び遺伝学的性質は以下の通りである。

・ラクトバチルス・クンキーBPS402株
＜菌学的性質＞
Ａ．形態的性状
細胞形態：桿菌(0.7-0.8×1.5-2.0μm)
グラム染色：陽性
コロニー色調：クリーム色
MRS寒天平板培地による48時間培養(30℃)
Ｂ．糖類発酵性(api 50CHを使用) 48時間培養後に判定(陽性：＋、陰性：−)
0 コントロール −
1 グリセロール −
2 エリスリトール −
3 D-アラビノース −
4 L-アラビノース −
5 D-リボース −
6 D-キシロース −
7 L-キシロース −
8 D-アドニトール −
9 メチル-β-D-キシロピラノシド −
10 D-ガラクトース −
11 D-グルコース＋
12 D-フルクトース＋
13 D-マンノース −
14 L-ソルボース −
15 L-ラムノース −
16 ズルシトール −
17 イノシトール −
18 D-マンニトール？
19 D-ソルビトール −
20 メチル-α-D-マンノピラノシド −
21 メチル-α-D-グルコピラノシド −
22 N-アセチルグルコサミン −
23 アミグダリン −
24 アルブチン −
25 エスクリンクエン酸第二鉄 −
26 サリシン −
27 D-セロビオース −
28 D-マルトース −
29 D-ラクトース −
30 D-メリビオース −
31 D-スクロース＋
32 D-トレハロース＋
33 イヌリン −
34 D-メレジトース −
35 D-ラフィノース −
36 スターチ −
37 グリコーゲン −
38 キシリトール −
39 ゲンチオビオース −
40 D-ツラノース −
41 D-リキソース −
42 D-タガトース −
43 D-フコース −
44 L-フコース −
45 D-アラビトール −
46 L-アラビトール −
47 グルコネート＋
48 2-ケト-グルコネート −
49 5-ケト-グルコネート −

＜遺伝学的性質＞
BPS402株の16S rDNAの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。BPS402株の16S rDNAの配列は、既知種の基準株であるラクトバチルス・クンキーYH-15(JCM16173)株と100%の同一
性を示した。また、簡易分子系統解析の結果、ラクトバチルス・クンキーとクラスターを形成し、両者は同一の分子系統学的位置を示した。これらの結果から、BPS402株はラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌であると判断された。

・ラクトバチルス・クンキーBPS104株
＜菌学的性質＞
Ａ．形態的性状
細胞形態：桿菌(0.6-0.7×1.2-1.5μm)
グラム染色：陽性
コロニー色調：乳白色
MRS寒天平板培地による72時間培養(30℃)
Ｂ．糖類発酵性(api 50CHを使用) 48時間培養後に判定(陽性：＋、陰性：−)
0 コントロール −
1 グリセロール −
2 エリスリトール −
3 D-アラビノース −
4 L-アラビノース −
5 D-リボース −
6 D-キシロース −
7 L-キシロース −
8 D-アドニトール −
9 メチル-β-D-キシロピラノシド −
10 D-ガラクトース −
11 D-グルコース＋
12 D-フルクトース＋
13 D-マンノース −
14 L-ソルボース −
15 L-ラムノース −
16 ズルシトール −
17 イノシトール −
18 D-マンニトール？
19 D-ソルビトール −
20 メチル-α-D-マンノピラノシド −
21 メチル-α-D-グルコピラノシド −
22 N-アセチルグルコサミン −
23 アミグダリン −
24 アルブチン −
25 エスクリンクエン酸第二鉄 −
26 サリシン −
27 D-セロビオース −
28 D-マルトース −
29 D-ラクトース −
30 D-メリビオース −
31 D-スクロース＋
32 D-トレハロース＋
33 イヌリン −
34 D-メレジトース −
35 D-ラフィノース −
36 スターチ −
37 グリコーゲン −
38 キシリトール −
39 ゲンチオビオース −
40 D-ツラノース −
41 D-リキソース −
42 D-タガトース −
43 D-フコース −
44 L-フコース −
45 D-アラビトール −
46 L-アラビトール −
47 グルコネート＋
48 2-ケト-グルコネート −
49 5-ケト-グルコネート −

＜遺伝学的性質＞
BPS104株の16S rDNAの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。BPS104株の16S rDNAの配列は、既知種の基準株であるラクトバチルス・クンキーYH-15(JCM16173)株と99.9%の同一性を示した。また、簡易分子系統解析の結果、ラクトバチルス・クンキーとクラスターを形成し、両者は同一の分子系統学的位置を示した。これらの結果から、BPS104株はラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌であると判断された。

上記のBPS402株、BPS104株とラクトバチルス・クンキー(JCM16173)の糖類発酵性試験のデータをまとめたものを以下の表１に示す。表１からBPS402株とBPS104株の糖類発酵性は既知の菌株のものと相違していることが分かる。

ランダム増幅多型DNA(RAPD)分析を、プライマー5'-CCGCAGCCAA-3'を使用して次の反応
条件で行った。プリインキュベーション：94℃2分間、増幅：94℃1分間、30℃1分間、72
℃1.5分(40サイクル)、プライマー伸張：74℃5分間(1サイクル)

結果を図１に示す。図１の結果から、BPS402株及びBPS104株のRAPDパターンが、既知のラクトバチルス・クンキーの菌株とは異なることが分かる。

これらの結果から、BPS402株とBPS104株は新規なラクトバチルス・クンキーの菌株であると判断される。

これら菌株の培養方法は常法に従って行うことができる。培地は、これらの菌株が培養できるものであれば特に制限はなく、天然培地、合成培地、半合成培地などの培地を使用することができるし、牛乳やローヤルゼリーなどを培地として使用することもできる。培地としては、窒素源及び炭素源を含有するものを使用することができ、窒素源としては、肉エキス、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、グルテン、大豆粉、大豆加水分解物、アミノ酸等が挙げられ、炭素源としては、グルコース、ラクトース、フラクトース、イノシトール、ソルビトール、水飴、澱粉、麹汁、フスマ、バカス、糖蜜等が挙げられる。その他、無機質(例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、炭酸
カルシウム、鉄、マンガン、モリブデン)、各種ビタミン類などを添加することができる
。

培養温度は通常4〜45℃、好ましくは30〜37℃であり、培養時間は通常8〜72時間程度であり、通気振盪又は通気撹拌してもよく、培地のpHは通常4.0〜9.0、好ましくは6.0〜8.0である。

培養方法としては、例えば、MRS培地に1%の菌体を植菌し、37℃で24時間培養すること
が挙げられる。

食品組成物
本発明の食品組成物は、上記乳酸菌又は菌体処理物を必須成分として含有する。当該食品組成物には、動物(ヒトを含む)が摂取できるあらゆる食品組成物が含まれる。

本発明の食品組成物において乳酸菌は、生菌体又は死菌体のいずれの状態でも使用することができる。乳酸菌としては、単離した菌体を用いてもよいし、菌体の培養物及び発酵物を用いてもよい。

乳酸菌の菌体処理物としては、乳酸菌が、例えば、加熱、ペースト化、乾燥(凍結乾燥
、真空乾燥、噴霧乾燥など)、凍結、溶菌、破砕、抽出等されたものが挙げられる。更に
、菌体処理物としては、超音波などにより破砕処理を行った菌体破砕物に除タンパクを行った後の上清、菌体培養物及び発酵物の固形分を除去した上清等も含まれる。

上記乳酸菌は単体で使用することもできるが、他の微生物と混合して使用してもよい。

本発明の食品組成物には、上記乳酸菌又は菌体処理物をそのまま使用することもできるが、必要に応じて、ミネラル類、ビタミン類、フラボノイド類、キノン類、ポリフェノール類、アミノ酸、核酸、必須脂肪酸、清涼剤、結合剤、甘味料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤等を配合することができる。

本発明の食品組成物の種類は、特に限定されず、例えば、乳製品；発酵食品(ヨーグル
ト、ローヤルゼリー等)；飲料類(コーヒー、ジュース、茶飲料のような清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、乳酸菌入り飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料、日本酒、洋酒、果実酒のような酒等)；スプレッド類(カスタードクリーム等)；ペースト類(フルーツペースト等)；
洋菓子類(チョコレート、ドーナツ、パイ、シュークリーム、ガム、ゼリー、キャンデー
、クッキー、ケーキ、プリン等)；和菓子類(大福、餅、饅頭、カステラ、あんみつ、羊羹等)；氷菓類(アイスクリーム、アイスキャンデー、シャーベット等)；食品類(カレー、牛丼、雑炊、味噌汁、スープ、ミートソース、パスタ、漬物、ジャム、ローヤルゼリー等)
；調味料類(ドレッシング、ふりかけ、旨味調味料、スープの素等)などが挙げられる。

本発明の食品組成物の製法も特に限定されず、適宜公知の方法に従うことができる。例えば、前記のような食品組成物の製造工程における中間製品、又は最終製品に、上記乳酸菌又は菌体処理物を混合又は噴霧等することにより食品を得ることができる。また、上記乳酸菌を用いて牛乳などの獣乳や乳原料等の発酵を行うことにより発酵製品、乳酸菌飲料、及び乳酸菌入り飲料を製造することができる。また、上記乳酸菌によりローヤルゼリーの発酵を行うことで、ローヤルゼリーの発酵食品も製造することができる。

また、本発明の食品組成物は、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、保健用食品、特定保健用食品又はプロバイオティック製品としても使用できる。サプリメントとして使用する際の投与単位形態については特に限定されず適宜選択できるが、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、液剤、散剤等が挙げられる。

本発明の食品組成物における上記乳酸菌又は菌体処理物の含量は、食品組成物全量中1
×10^-7〜100重量%、好ましくは1×10^-5〜100重量%、より好ましくは1〜100重量%の範囲から適宜選択することが可能である。

本発明の食品組成物の摂取量は、摂取者の体重、年齢、性別、症状などの種々の条件に応じて適宜設定することができるが、例えば、乳酸菌の菌数で表すと、一日当たりの摂取量としては1×10⁶個以上、好ましくは1×10⁹個以上、より好ましくは1×10¹²個以上を挙
げることができる。

医薬組成物
本発明の医薬組成物は、上記乳酸菌又は菌体処理物を必須成分として含有する。本発明の医薬組成物は、乳酸菌製剤と称することができる。

本発明の医薬組成物において乳酸菌は、生菌体又は死菌体のいずれの状態でも使用することができる。乳酸菌としては、単離した菌体を用いてもよいし、菌体の培養物及び発酵物を用いてもよい。

乳酸菌の菌体処理物としては、乳酸菌が、例えば、加熱、ペースト化、乾燥(凍結乾燥
、真空乾燥、噴霧乾燥など)、凍結、溶菌等されたものが挙げられる。更に、菌体処理物
としては、超音波などにより破砕処理を行った菌体破砕物に除タンパクを行った後の上清、菌体培養物及び発酵物の固形分を除去した上清等も含まれる。

また、上記乳酸菌は単体で使用することもできるが、他の微生物と混合して使用してもよい。

医薬組成物として調製する場合、上記乳酸菌又は菌体処理物をそのまま使用するか、又は医薬品において許容される無毒性の担体、希釈剤若しくは賦形剤とともに、タブレット(素錠、糖衣錠、発泡錠、フィルムコート錠、チュアブル錠、トローチ剤などを含む)、カプセル剤、丸剤、粉末剤(散剤)、細粒剤、顆粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、シロップ、ペースト、注射剤(使用時に、蒸留水又はアミノ酸輸液や電解質輸液等の輸液に配合して液
剤として調製する場合を含む)などの形態に調製して、医薬用の製剤にすることが可能で
ある。

本発明の医薬組成物における上記乳酸菌又は菌体処理物の含量は、医薬組成物全量中1
×10^-7〜100重量%、好ましくは1×10^-5〜100重量%、より好ましくは1〜100重量%の範囲から適宜選択することが可能である。

本発明の医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状などの種々の条件に応じて適宜決定することができるが、例えば、乳酸菌の菌数で表すと、一日当たりの服用量としては1×10¹⁰個以上、好ましくは1×10¹¹個以上、より好ましくは1×10¹²個以上を挙
げることができる。

本発明の乳酸菌又は菌体処理物は、気道若しくは食道の粘膜から侵入してくる病原体若しくはウイルスに対する感染予防用の免疫賦活剤、又は食中毒の予防若しくは緩和用の腸管免疫賦活剤として使用することもできる。気道若しくは食道の粘膜から侵入してくるウイルスとしては、これに限定されるものではないが、インフルエンザウイルス等が挙げられる。

本発明の食品又は医薬組成物は、整腸、美容、又はアンチエイジング、並びに炎症性腸疾患(好ましくは、クローン病又は潰瘍性大腸炎)の予防及び／又は治療に有用である。

化粧品組成物
本発明の化粧品組成物は、上記乳酸菌又は菌体処理物を必須成分として含有する。

本発明の化粧品組成物において乳酸菌は、生菌体又は死菌体のいずれの状態でも使用することができる。乳酸菌としては、単離した菌体を用いてもよいし、菌体の培養物及び発酵物を用いてもよい。

乳酸菌の菌体処理物としては、乳酸菌が、例えば、加熱、ペースト化、乾燥(凍結乾燥
、真空乾燥、噴霧乾燥など)、凍結、溶菌等されたものが挙げられる。さらに、菌体処理
物としては、超音波などにより破砕処理を行った菌体破砕物に除タンパクを行った後の上清、菌体培養物及び発酵物の固形分を除去した上清等も含まれる。

本発明の化粧品組成物には、動物(ヒトを含む)の皮膚、粘膜、体毛、頭髪、頭皮、爪、歯、顔皮、口唇等に適用されるあらゆる化粧品組成物が含まれる。

本発明の化粧品組成物における上記乳酸菌又は菌体処理物の含量は、化粧品組成物全量中1×10^-10〜100重量%、好ましくは1×10^-6〜50重量%、より好ましくは1×10^-2〜10重量%
の範囲から適宜選択することが可能である。

本発明の化粧料には、上記乳酸菌又は菌体処理物以外に、通常化粧品に用いられる成分、例えば、美白剤、保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。

本発明の化粧品組成物の剤型は、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水−油２層系、水−油−粉末３層系等、幅広い剤型を採り得る。

本発明の化粧品組成物の用途も任意であり、例えば基礎化粧品であれば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス、美容液、パック、マスク等が挙げられ、メークアップ化粧品であれば、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等が挙げられ、ネイル化粧料であれば、マニキュア、ベースコート、トップコート、除光液等が挙げられ、その他、洗顔料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、アフターシェーブローション、プレシェーブローション、シェービングクリーム、ボディソープ、石けん、シャンプー、リンス、ヘアートリートメント、整髪料、ヘアートニック剤、育毛剤、制汗剤、入浴剤等が挙げられる。

本発明の化粧品組成物は、美白効果、保湿効果などのアンチエイジング効果などが期待できる。

以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。

ラクトバチルス・クンキーBPS402株とBPS104株のスクリーニング
菌の分離に用いた培地は、MRS培地(又はROGOSA培地)であり、必要に応じてリンゴジュ
ース、オレンジジュース、トマトジュース又はグレープジュースのいずれかを最終濃度25%となるように混ぜ、酢酸と水酸化ナトリウムを用いてpH4.5に調整した。調製した培地に、花粉荷を適宜希釈し、インキュベータ内にて、25〜37℃で培養を開始した。2〜3日間培養後、炭酸カルシウム入りのMRS寒天培地に画線法にて広げ、更に、同様の温度にて2〜3
日間培養し、乳酸産生によりクリアゾーンを有するシングルコロニーを複数株得た。得られたコロニーを、MRSにて培養後、10%グリセロールストックとして、-80℃にて凍結保存
した。

特に、今回の試験例では、IgA産生量がO.D.=0.2以上であり、且つマイトジェン活性とIL-2産生がSI値で1.2以下をスクリーニングの指標とした。なお、マイトジェン活性とIL-2産生については、無刺激のSI値を1.0とした。

試験例
試験例１
＜実験方法＞
・動物の飼育・飼養
検疫・検収の終了後、１週間予備飼育を行った6週齢のBALB/c雌マウスを使用した。試
験に用いる動物は、ほぼ同体重又は予備飼育期間中の体重変動がほぼ同様の動きを示した個体を選択した。

・細胞の調製
実験動物の飼育と飼養に関する法律に則り、麻酔処理した動物より採血を行い、放血させた。放血後、脾臓及び小腸(盲腸回盲部を含む)を摘出し、1%BSA含有Hank's液の入った
シャーレに移し、氷冷保存した。脾臓より脾臓由来リンパ球(SPL)、小腸よりパイエル氏
板由来リンパ球(PPL)を回収し、各細胞を1×10⁶/mL となるように10%RPMI-1640培地に再
懸濁した。

・細菌の調製
細菌株をミューラーヒントン寒天培地に画線し、37℃孵卵器で16時間培養した。寒天培地上に発育した単一の細菌集落より白金線にて釣菌し、新たなミューラーヒントン寒天培地に画線し、37℃孵卵器で16時間培養した。マクファーランド濁度(McFarland；MCF) 3.0を目安にTS液体培地中に細菌集落を溶解し、細菌懸濁液を調製した。菌液の一部は、10倍階段希釈法にて菌数を測定した。調製した細菌懸濁液を100℃、30分間加熱処理を行い、
次項に示す被験物質とした。対照細菌株にはListeria monocyotogenes (EGD株)を使用し
、上述した画線培養と同様の操作を行い、MCF3.0を目安に細菌懸濁液を調製した。さらに、調製した細菌懸濁液を100℃、30分間加熱処理を行い、次項に示す対照株とした。

・IgA産生能測定試験
回収したPPLに対して被験物質による抗原刺激を行い、刺激後48時間後に培養上清の回
収を行った。回収した培養上清中のIgAをELISA法にて測定した。

・リンパ球幼若化試験
回収したSPLをBrdU-Thymidine存在下でマイトゲン刺激(PWM終濃度5μg/mL)又は被験物
質による抗原刺激を行い、BrdU-Thymidineの取込量を測定した。また、同様の系にて培養上清を回収し、CTLL-2細胞による細胞増殖能試験を行った。

＜結果および考察＞
(IgA抗体産生能)
被験物質を用いてパイエル氏板細胞への刺激を行った。48時間刺激後の培養上清をIgA
抗体測定用ELISAプレートに添加し、IgA抗体産生能を評価した。なお、パイエル氏板細胞無刺激の状態を陰性対照とし、陰性対照のO.D.値を基準に被験物質毎のO.D.値を評価した。結果を図２に示す。

BPS402株とBPS104株のO.D.値は、0.243、0.242であり、対照株であるListeria monocyotogenesを用いた場合のO.D.値は0.107であった。

(リンパ球幼若化反応)
・BrdU取込を指標とした脾臓細胞増殖反応
被験物質を用いて脾臓細胞への刺激を行った。蛍光標識したBrdU-Thymidineの取込量をフローサイトメータによる蛍光強度により評価した。なお、脾臓細胞無刺激の状態を陰性対照とし、陰性対照の蛍光強度を基準に被験物質毎の蛍光強度を評価した。結果を図３に示す。

BPS402株とBPS104株のS.I.値は、1.2、0.9であり、対照株であるListeria monocyotogenesを用いた幼若化反応のS.I.値は2.1であった。

・CTLL-2細胞増殖反応を指標とした被験物質の評価
上記の試験で得られた培養上清中のIL-2測定をCTLL-2細胞を指標に行った。測定に関しては、CTLL-2細胞のBrdU-Thymidineの取込量をフローサイトメータによる蛍光強度により評価した。なお、脾臓細胞無刺激の状態を陰性対照とし、陰性対照の蛍光強度を基準に被験物質毎の蛍光強度を評価した。結果を図４に示す。

BPS402株とBPS104株のS.I.値は、1.1、1.0であり、対照株であるListeria monocyotogenesを用いた幼若化反応のS.I.値は1.4であった。

BPS402株とBPS104株について、乳酸菌加熱死菌体では、T細胞の免疫応答を誘導する強
力なマイトジェン活性は認められなかった。細胞内寄生性細菌であるListeria死菌と比較しても、細胞増殖反応及びIL-2産生能は極めて低く、非特異的に細胞性免疫を誘導する能力はない。すなわち、宿主における免疫活性を常に向上させるものではなく、免疫学的に安全な物質であると思われる。

乳酸菌加熱死菌体では、パイエル氏板細胞のIgA産生を誘導する可能性が示唆された。
そのため、気道粘膜や食道粘膜などの粘膜上皮にIgA抗体をより多く配備させる可能性が
考えられ、経口・経鼻侵入してくる病原体(ウイルスなど)に対して、感染を防御するのに有効であると考えられる。

試験例２
＜試験方法＞
１．ウイルスの調製
超低温冷凍庫に凍結保存してあるインフルエンザウイルス(IFVA, PR/8/34(H1N1)株)を
細胞増殖培地で培養したMDCK 細胞にM.O.I. (Multiplicity of infection) 0.01で感染させ、37℃, 5% CO₂存在下で72時間培養した(1継代)。連続して5代継代したものを大量培養し、蔗糖密度勾配超高速遠心法によりウイルス液を分離精製した後、使用時まで超低温冷凍庫にて保存した。ウイルス液の一部は10倍階段希釈法にて細胞変性効果を確認し、ウイルス感染力価(TCID₅₀)並びにプラーク形成単位(pfu:plaque forming unit)を測定した。

２．生存率解析
a 被験物質の経口投与
検疫及び検収の終了後、１週間予備飼育を行った6週齢の雌性BALB/cマウスに、被験物
質をマウス１匹当たり0.2 mLずつ１回強制経口投与した。被験物質の濃度は1 mg/kgに設
定し、被験物質の強制経口投与は試験期間を通じて1日1回行い、これをIFVA感染後の試験期間終了時まで継続した。なお、陰性対照には生理食塩水を用い、被験物質と同様の経口投与を行った。

b 群分け
試験群は、2群にて構成し、詳細は下表の通りとした。2群には調製したIFVAを経鼻接種し、ウイルス接種が確実に行われた動物を各群に20 匹ずつ割り付けた。なお、群分けの
指標には動物番号を用い、被験物質投与開始時に層別無作為に割り付けた。

c IFVA の接種
被験物質を3週間連続強制経口投与した9週齢の雌性BALB/cマウスを使用し、動物番号順に生理食塩水にて希釈したペントバルビタールナトリウム(5.0 mg/mL；共立製薬株式会社(商品名;ソムノペンチル麻酔用注射液))を50 mg/kg にて腹腔内に注射し、全身麻酔を施
した。麻酔下において、調製したIFVA をマウスの右鼻腔に103 pfu/20μLずつ経鼻的に接種した。

d 生存率の測定
生存率の測定には、IFVA接種後3週間の経過観察を行った。経過観察中生存した個体数
を群当たりの総数で除した値に100を乗じた値を生存率とした。

３．免疫学的解析
a 被験物質の経口投与
検疫・検収の終了後、1週間予備飼育を行った6週齢の雌性BALB/c マウスに、被験物質
をマウス1匹当たり0.2 mLずつ1回強制経口投与した。被験物質の濃度は100 mg/kg のみとし、被験物質の強制経口投与は試験期間を通じて1日1回行い、これをIFVA感染後の試験期間終了時まで継続した。なお、陰性対照には生理食塩水を用い、被験物質と同様の経口投与を行った。

b 群分け
試験群は、ウイルス接種群2群およびウイルス非接種群2群の計4群にて構成し、詳細は
下表の通りとした。ウイルス接種群の2群には調製したIFVAを経鼻接種し、ウイルス接種
が確実に行われた動物を各群に50匹ずつ割り付けた。ウイルス非接種群の動物数は各群10匹とした。なお、群分けの指標には動物番号を用い、被験物質投与開始時に層別無作為に割り付けた。

c IFVA の接種
被験物質を3週間連続強制経口投与した9週齢の雌性BALB/cマウスを使用し、動物番号順に生理食塩水にて希釈したペントバルビタールナトリウム(5.0 mg/mL；共立製薬株式会社(商品名;ソムノペンチル麻酔用注射液))を50 mg/kgにて腹腔内に注射し、全身麻酔を施した。麻酔下において、調製したIFVAをマウスの右鼻腔に102 pfu/20μLずつ経鼻的に接種
した。なお、ウイルス非接種群には、生理食塩水を同様に20μLずつ経鼻的に注入した。

d 組織サンプルの回収
IFVA 感染0日後(d0)及び14日後(d14)に各群8匹ずつ動物を屠殺した。各群5匹からは、
肺胞-気管支洗浄液(BALF)を回収した。各群3匹からは、無処置のまま肺臓を摘出して10%(v/v)ホルマリン液にて保存した。

e 肺臓ウイルスゲノムRNA量の測定
各群5匹より処置後の肺臓を摘出し、gentleMACS dissociator (Miltenyi Biotec)を用
いて細胞懸濁液を作成した。調製した細胞懸濁液からISOGEN IIを用いて、肺臓由来全RNAを抽出した。抽出したRNAについてはUni12 primer (Hoffmann E. et al. Arch Virol. 2001.)を用いた逆転写反応を行い、ウイルスゲノムRNAを選択的に増幅した後、ウイルスNP
遺伝子に対する特異的プライマーを用いたリアルタイムPCR法により、肺臓におけるウイ
ルスゲノムRNA量を測定した。

f 抗体測定
回収したBALFについては遠心操作を実施し、上清と細胞成分に分離した。上清については解析実施時まで超低温冷凍庫にて保存した。BALF上清の抗体について、ELISA法にて測
定した。測定項目は、抗インフルエンザウイルス特異的IgAとした。

４．統計処理について
生存率解析における群間の比較はLogrank検定にて実施し、有意水準は両側5%とした。
その他の試験における群間の有意差はStudentのt検定にて行い、有意水準は両側5%とした。

＜結果及び考察＞
１．生存率解析(図５)
実験対照群である生理食塩水投与群については、試験終了時の生存率は25.0%であった
。被験物質(乳酸菌末BPS402;以下BPS402) 1 mg/kg投与群については、試験終了時の生存
率は55.0%であった。BPS402 1 mg/kg投与群ではLogrank検定(p=0.0465)にて、実験対照群との比較により有意差が認められた。

以上の結果から、BPS402投与群では実験対照群に比較して、IFVA感染抵抗性を示す傾向が認められた。また、非特許文献４(Letters in Applied Microbiology 2010;50:597-602)では、LGGの200μg/mouseの投与によりインフルエンザウイルスの予防効果が得られているのに対して、BPS402では20μg/mouse (マウス体重20 gとして)で予防効果が得られていることから、BPS402はLGGの10分の1の用量で効果が認められた。

２．免疫学的解析
a 肺臓ウイルスゲノムRNA量の測定(図６)
BPS402投与群におけるウイルス量の推移は、感染14日後について有意な減少が認められた。

b 抗体測定(図７)
IFVA感染マウスのBALFに関して、感染14日後のインフルエンザウイルス特異的IgAにつ
いては、BPS402投与群で有意に増加していた。

BPS402投与マウスを用いたin vivoでの免疫学的な解析の結果、BPS402投与群では、感
染後期における肺胞-気管支におけるインフルエンザウイルス特異的分泌型IgAの上昇、感染後期における排ウイルス作用の促進の現象が認められた。BPS402は特にB細胞系列の形
質細胞に強く作用し、インフルエンザウイルス特異的IgAを効率良く分泌させることによ
り、速やかな感染の収束を担っている可能性が示唆された。

試験例３
本試験ではラクトバチルス・クンキーBPS402のヒトにおける有効性及び安全性の確認を行った。

便秘傾向であること以外は健常である一般有償ボランティアを対象とし、二重盲検法によるプラセボ比較対照試験を実施した。被験者は40歳以上の有償ボランティアとし、この被験者を各項目がなるべく均等になるように2群に割付け、BPS402群7名、プラセボ群7名
とした。摂取量はいずれも1日5錠(1,000 mg)、摂取期間は4週間とした。

＜有効性＞
BPS402摂取前後において唾液中sIgA(μg/min)が有意に上昇していた。sIgAは粘膜系に
おける重要な免疫機能を持つ免疫グロブリンとして広く知られており、上気道感染症においてその感染リスクを低減しうると考えられている。

また、VAS (Visual Analog Scale)法により、肌の乾燥について、その程度を0〜100 mmの直線状に示した結果を解析したところ、BPS402摂取前後で有意に肌の乾燥が改善し、保湿作用が確認された。

＜安全性＞
BPS402の摂取により安全性について特筆すべき問題は生じなかった。

製造例
以下、本発明の組成物の製造例を示す。

(乳酸菌末の製造例)
グルコースを2%、酵母エキスを5%含む1,000Lの培地をpH6.5に調整し、既に前培養して
おいたBPS104培養液を1%植菌した。適宜、途中でpHを調整しながら、30〜37℃にて、24〜48時間培養したものを菌体培養液とした。その菌体培養液を遠心分離し、菌体1重量部に
対して1重量部の水を加えた後、凍結乾燥し、固形物を粉砕機によって粉砕することで、BPS104菌体末1 kgを得た。

(乳酸菌カプセルの製造例)
乳酸菌BPS104粉末400 gとショ糖脂肪酸エステル20 gを混合し、充填機にてハードカプ
セルに充填し、2,000粒の乳酸菌BPS104カプセルを得た。

(乳酸菌発酵エキスの製造例)
実施例１
ローヤルゼリーを終濃度5%に希釈した希釈液1,000 mLを、pH6.5に調整した後、既に前
培養しておいたBPS402培養液を1%植菌した。30℃にて、48時間培養後、遠心分離によって残渣を除き、ローヤルゼリー発酵エキス800 mLを得た。

実施例２
実施例１と同様に、酵素処理ローヤルゼリーを終濃度5%に希釈した希釈液1,000 mLから、酵素処理ローヤルゼリー発酵エキス800 mLを得た。

実施例１及び２で得られた発酵エキスについて以下5項目の試験を行った。効果がない
場合を−とし、わずかな効果しかない場合を−／＋、また、効果がある場合を低い効果から順に＋〜＋＋＋の3段階で評価し、その結果を表４に示した。

＜pH低減＞
48時間後の発酵エキスを、pHメーターにて評価した。

＜残渣抑制＞
48時間後の培養液を、発酵前と比較し、評価した。

＜生菌維持＞
48時間後の培養液を懸濁後、適宜希釈し、MRS寒天培地に塗り広げ、評価した。

＜メラニン産生抑制＞
(i) PBS 20 mlとポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル(Triton X-100) 0.2 mlを混合し撹拌した。
(ii) PBS 10 mlとL-DOPA 19.7 mlを混合しアルミホイルで巻き攪拌した。
(iii) 発酵エキスと2日間培養したB16メラノーマ細胞(3000 cells/well)に、(i)を90μl,
(ii)を10μl添加し、マイクロプレートリーダーで0, 60分の吸光度(490 nm)を測定し、
評価した。

＜酸化抑制＞
メラニン産生抑制試験から5日後の培地の色を目視にて確認し、DOPAの酸化を評価した
。

(乳酸菌発酵エキス化粧水の製造例)
クエン酸ナトリウム0.1%、ピロリドンカルボン酸ナトリウム1.0%、1,3-ブチレングリコール5.0%となるように、精製水にそれぞれを50℃で混合した溶液1000 mLに、POE(30)POP(6)デシルテトラデシルエーテル(NIKKOL PEN-4630)を0.6%配合して100 mLとしたエタノー
ルを、撹拌しながら徐々に加えて可溶化した。撹拌しながら冷却し30℃まで下げ、最後に0.5%となるよう、実施例２の乳酸菌発酵エキスを加え、1000 mLの乳酸菌発酵エキス化粧
水を得た。

Claims

ラクトバチルスGG株(ATCC53103)よりIgAの産生促進作用が高く、且つリステリアEGD株よりマイトジェン活性及びIL-2産生促進作用が低い、ラクトバチルス・クンキー(Lactobacillus kunkeei)に属する乳酸菌又はその菌体処理物を含有するIgA産生促進剤。
前記乳酸菌が、グルコース、フルクトース、スクロース、トレハロース及びグルコン酸塩に対する資化性を示すことを特徴とする、請求項１に記載のIgA産生促進剤。
食品又は医薬品である、請求項１又は２に記載のIgA産生促進剤。