JP2017514496A - ヒト化c5およびc3動物 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2014年5月5日に出願された米国仮特許出願第61/988,581号および2014年10月23日に出願された米国仮特許出願第62/067,836号(これら各々の開示は、それらの全体が参考として本明細書に援用される)への優先権を主張する。
本発明の実施では、別段の指定のない限り、当業者に周知の分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来の技法を使用する。そのような技法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第4版(Sambrookら、2012年)およびMolecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版(SambrookおよびRussel、2001年)、(本明細書ではまとめて「Sambrook」と称される);Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubelら編、1987年、2014年までの補遺を含む);PCR: The Polymerase Chain Reaction、(Mullisら編、1994年);Antibodies: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY(Greenfield編、2014年)、Beaucageら編、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry、John Wiley & Sons, Inc.、New York、2000年、(2014年までの補遺を含む)ならびにGene Transfer and Expression in Mammalian Cells(Makrides編、Elsevier Sciences B.V.、Amsterdam、2003年)などの文献において十分に説明されている。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド、ペプチド、ポリペプチドの断片、および融合ポリペプチドを含む。
免疫系の不可欠な構成要素である補体は、古典的経路および副経路の2つの関連する生化学的カスケードに関与する30種を超える血清タンパク質および細胞タンパク質からなる。補体は、侵入微生物を破壊し、組織恒常性を維持するための免疫系を補助するように機能する。
C5遺伝子は、炎症プロセスおよび細胞死滅プロセスにおいて重要な役割を果たす血清補体C5タンパク質をコードする。成熟C5タンパク質は、ジスルフィド結合によって連結したα鎖とβ鎖で構成される。C5タンパク質は、コンバターゼによって切断され、その結果、著しく炎症促進性であるαポリペプチドに由来するアナフィラトキシンである活性化ペプチド、C5a、および、他の補体成分と複合体を形成して標的細胞の浸透圧溶解に関与する膜攻撃複合体(MAC)を形成するβポリペプチドに由来する高分子切断産物であるC5bが生じる。
C3遺伝子は、補体活性化の古典的経路および副経路の活性化において中心的な役割を果たす血清補体タンパク質C3をコードする。
本明細書において示されているように、ヒト化C5マウスは、内因性補体タンパク質の少なくとも一部が種特異性を示す、すなわち、内因性マウス補体タンパク質はヒトC5タンパク質と機能的に相互作用することができないので、機能的C5欠損である。ヒト化C5マウスまたはC5ノックアウトマウスから得た血清を補体活性について試験した;ヒトC3タンパク質およびヒトC5タンパク質の両方を添加しない限り補体溶血活性は観察されなかった。
治療的な補体阻害の2つの標的は、それぞれ補体タンパク質C5およびC3から、古典的経路および副経路の両方において、酵素による切断によって補体が活性化されると生成される補体活性化ペプチドC5aおよびC3aである(Markides(1998年);Mollnesら(2006年)を参照されたい)。
補体タンパク質C5またはC3を標的化する候補治療用分子は、一般に、薬物動態学(PK)および薬力学(PK)について非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットにおいて評価される。そのような治療用分子は、補体活性化に関連するヒト疾患、障害および状態の、非ヒト動物、例えば齧歯類、例えばマウスまたはラットモデルにおいてin vivoでの治療有効性についても試験される。
本発明のヒト化C3および/またはC5動物を生成するための方法は当技術分野で周知である(一般に、Gene Targeting: A Practical Approach、Joyner編、Oxford University Press, Inc.(2000年)を参照されたい)。一実施形態では、マウスの生成は、任意選択で、マウスC3および/またはC5遺伝子を破壊し、ヒトまたはヒト化C3および/またはC5をコードする遺伝子をマウスゲノムに導入することを伴う。一実施形態では、ヒトまたはヒト化C3および/またはC5をコードする遺伝子の導入は、内因性マウスC3および/またはC5遺伝子と同じ位置におけるものである。
一部の態様では、本明細書では、補体活性化を調節することが可能な候補治療用分子(すなわち、化合物)を同定するための方法が提供される。当該方法では、本明細書に開示されているヒト化C3および/またはC5齧歯類(例えば、マウスまたはラット)のいずれかを利用する。一部の実施形態では、補体活性化を実験的に誘導した後(例えば、腎虚血/再灌流モデルにおいて)、候補化合物を齧歯類に直接投与し、前記化合物の、補体系を調節する能力に関する効果を評価する。他の実施形態では、候補化合物をこれらの動物から得た血清と接触させ、任意の一般に使用されるin vitroにおける評価技法(これだけに限定されないが、CH50アッセイなど)を使用して補体活性を評価する。
一部の態様では、候補化合物は、補体タンパク質(これだけに限定されないが、C5またはC3(例えば、C3a)など)に結合する(例えば、優先的に結合するなど)ものであり、抗体である。一部の実施形態では、抗体は、C5および/またはC3アンタゴニストであり、補体活性化を減少させることが可能である。他の実施形態では、抗体は、C5および/またはC3アゴニストであり、補体活性化を増大させることが可能である。
一部の態様では、候補化合物は、補体タンパク質(C5またはC3(例えば、C3a)など)に結合する(優先的に結合するなど)ものであり、非抗体結合性ポリペプチドである。一部の実施形態では、非抗体結合性ポリペプチドは、C5および/またはC3アンタゴニストであり、補体活性化を減少させることが可能である。他の実施形態では、非抗体結合性ポリペプチドは、C5および/またはC3アゴニストであり、補体活性化を増大させることが可能である。
一部の態様では、候補化合物は、補体タンパク質(C5またはC3(例えば、C3a)など)に結合する(優先的に結合するなど)ものであり、小分子である。一部の実施形態では、小分子は、C5および/またはC3アンタゴニストであり、補体活性化を減少させることが可能である。他の実施形態では、小分子は、C5および/またはC3アゴニストであり、補体活性化を増大させることが可能である。
本発明の一態様では、候補補体調節性化合物は、補体系の成分(mRNAなど)に標的化される1つまたは複数のオリゴヌクレオチドである。阻害性核酸は、限定することなく、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子阻害性RNA(siRNA)、またはリボザイムのいずれかであってよい。
所与の非ヒト動物(齧歯類、例えばマウスまたはラットなど)における本発明の候補補体調節性化合物の治療有効性、適切な投薬量、および方法は、当業者に周知のin vitro補体アッセイに従って決定することができる。補体経路では、活性化の正常な経過の間に多数の特異的な産物が生成され、小さな活性化断片C3a、C4a、およびC5aならびに大きな活性化断片BbおよびsC5b−9を含めたこれらの活性化産物の大部分に関して、感度が高く特異的なアッセイが開発されており、商業的に利用可能である。これらのアッセイの大部分では、補体断片上に露出し、それらが形成されるネイティブなタンパク質上には露出していない新しい抗原と反応するモノクローナル抗体を利用し、これにより、これらのアッセイが非常に単純かつ特異的なものになっている。ELISA技術が特に一般的なものであるが、ラジオイムノアッセイ(RIA)も、C3aおよびC5aを検出するために使用される。これらの後者のアッセイでは、プロセシングされていない断片およびそれらのプロセシングされた断片(すなわち、循環中に見いだされる主要な形態)の両方を測定する。C3aの測定により、補体活性化の感度の高く経路に依存しない指標がもたらされる。膜攻撃経路活性化の流体相産物であるsC5b−9の検出により、補体が、完了まで活性化されているという証拠がもたらされる。さらに、同様に古典的経路によってC4aが生成され、その測定により、C3b阻害剤の活性およびそのような阻害剤により古典的経路が活性化されるかどうかに関する情報がもたらされる。
内因性マウスC5遺伝子のヒトC5遺伝子での置き換え
ヒトC5遺伝子のコーディングエクソン2から42を含有する97kbのヒトC5遺伝子で、コーディングエクソン2から41までにわたり、3’非翻訳領域の一部を含む75.8kbのマウスC5遺伝子座を置き換えた。図1を参照されたい。
内因性マウスC3遺伝子のヒトC3遺伝子での置き換え
バージョン1−ヒトC3プロモーターおよびコーディングエクソン1から41を用いた置き換え
5’制御エレメントおよびヒトC3遺伝子のコーディングエクソン1から41までの全てを含有するヒトC3遺伝子で、5’制御エレメントおよびコーディングエクソン2から41までの全てにわたるマウスC5遺伝子座を置き換えた。上の実施例1に記載の方法を基本的に使用してマウスC3遺伝子配列をヒトC3遺伝子配列で置き換えた。図2Aを参照されたい。
ヒトC3遺伝子のコーディングエクソン2から41を含有するヒトC3遺伝子で、コーディングエクソン2から41までにわたるマウスC5遺伝子座を置き換えた。上の実施例1に記載の方法を基本的に使用してマウスC3遺伝子配列をヒトC3遺伝子配列で置き換えた。図2Bを参照されたい。
マウス血清における補体溶血活性アッセイ
補体は、眼の炎症性疾患および網膜変性疾患に関係付けられている(Mullinsら(2000年)Drusen associated with aging and age−related macular degeneration contain proteins common to extracellular deposits associated with atherosclerosis, elastosis, amyloidosis, and dense deposit disease、FASEB J、14巻(7号):835〜846頁を参照されたい)。モノクローナル抗体(mAb)によってC5切断を遮断することが、これらの障害に対する可能性のある治療戦略である(Coplandら(2009年)Systemic and local anti−C5 therapy reduces the disease severity in experimental autoimmune uveoretinitis、Clinical and Experimental Immunology、159巻:303〜314頁を参照されたい)。C5および/またはC3アンタゴニストなどの、補体に向けられた療法を評価するために、候補治療薬の機能を、補体活性化に関連するヒト疾患、障害および状態の適切なモデルにおいてin vitroおよびin vivoで評価するためのアッセイが必要である。
古典的な補体アッセイCH50を使用して補体溶血活性を評価した(Gilcasら(2001年)Classical pathway evaluation、Current Protocols in Immunology、Unit 13.1)。マウス血液を心臓から採取し、エッペンドルフチューブ中、氷上で1時間凝固させた。血清を遠心分離によって分離し、−70℃で保管した。ヒツジ赤血球(E)を、ウサギ抗ヒツジ溶血素と一緒に37℃で20分インキュベートすることによって感作させた。感作させた細胞(EA)を、マウスまたはヒト由来の処理した血清または対照の血清の倍加希釈物と一緒に37℃で1時間インキュベートした。インタクトなEA細胞をペレット化し、上清を取り出して、溶血の指標である541nmにおける吸光度を測定した。緩衝液のみ(0%溶解)と一緒にインキュベートしたEA細胞、またはddH2O(100%溶解)と一緒にインキュベートしたEA細胞は、それぞれ陰性対照および陽性対照としての機能を果たした。各ウェルにおける溶血およびCH50の百分率をddH20対照と比較して算出した(Holtら(2001年)Targeted deletion of the CD59 gene causes spontaneous intravascular hemolysis and hemoglobinuria、Blood、98巻(2号):442〜449頁)。C5hu/hu、C5−/−、C3hu/hu、C3−/−、およびそれぞれの対照系統を含めたマウスを、実施例1および2に記載の通りVelocigene(登録商標)技術を用いて生成した。正常ヒト血清、C5枯渇ヒト血清、およびC3枯渇ヒト血清をQuidel Corp.から入手し、対照としてまたは比較のために使用した。補体成分を、溶血機能を回復させることが可能であるかを試験するために加えた。試験した血清を補体成分;ヒトC5(Sigma−AldrichまたはQuidel Corp.、50μg/ml)、ヒトC3(Sigma−AldrichまたはQuidel Corp.、10、400、1200μg/ml)およびマウスC5(Regeneron Pharmaceuticals、50μg/ml)と一緒に4℃で40分インキュベートした。抗ヒトC5 mAb(100μg/ml)および抗マウスC5 mAb(Hycult Biotech、10μg/ml)を使用して、今後の薬物発見に関するこの系の特異性および有用性を確認した。
野生型マウス血清の補体溶血活性は正常なヒト血清と比較しておよそ10分の1である。図3に示されている通り、CH50値を使用して決定される補体溶血活性は、正常マウス血清または野生型マウス血清の3ロットにおいて、ヒト血清の2ロットと比較して多くても10分の1であった。
野生型マウス血清の補体溶血活性は、ヒト血清と比較して劇的に低い。ヒトC5を発現する遺伝子改変マウスは、おそらくマウスコンバターゼによりヒトC5タンパク質を切断することができないことが原因で、機能的マウスC5ノックアウトである。ヒト化C5マウス血清では、野生型レベルの補体溶血活性を達成するためにはヒトC3タンパク質の添加が必要である。
ヒト化C5および/またはC3マウスの使用
ヒト化C5および/またはC3マウスは、ヒト特異的C5および/またはC3化合物(アンタゴニスト、例えば、中和性抗C5または抗C3抗体など)の薬力学(PD)を評価するために有用である。
ヒト化C5ホモ接合性マウスにおける抗C5抗体の薬物動態/薬力学的試験
本実施例では、前の実施例に従って調製した雄および雌のヒト化C5ホモ接合性マウスを利用して、抗C5抗体の補体活性化を減少させる能力を試験する。
本試験では合計25匹のC5hu/huマウス(雄および雌)を使用した。各指定時点でマウス2匹から血清(20μL)を採取した。指定時点には、「投薬前」時点ならびに15mg/kgの抗ヒトC5モノクローナル抗体の皮下投与後3時間、6時間、1日、2日、4日、1週間、2週間、4週間の時点が含まれた。試料を、補体活性化の薬物動態学(PK)および薬力学(PD)的変更についてアッセイするまで−20℃で保管した。
図8に示されている通り、15mg/kgの抗ヒトC5抗体を皮下注射することにより、補体活性化が注射後少なくとも1週間減少した。この効果は、溶血アッセイにおいてヒトC3タンパク質を400μg/mlで添加したか(図8A)または800μg/mlで添加したか(図8B)に関係なく観察された。
ヒト補体タンパク質とマウス補体タンパク質の交差活性
本実施例では、ヒトC3タンパク質およびC5タンパク質とマウスC3タンパク質およびC5タンパク質との交差活性を、以前の実施例に記載の工学的に作製したマウスを使用して調査した。実施例3において考察されている通り、また、図6に示されている通り、ヒトC5タンパク質およびマウスC3タンパク質は、内因性C5を欠くマウスにおける溶血活性を再構成するために十分ではない。本試験では、C3ノックアウトマウスにおける溶血活性を回復させるマウスC5およびヒトC3の能力を観察した。
実施例3に記載の通り補体溶血活性を評価した。
図10Aに示されている通り、ヒトC3タンパク質を野生型マウス血清に添加することにより、野生型対照において観察されるものに対して溶血機能を増強することができる。しかし、ヒトC3タンパク質をC3枯渇ヒト血清に添加して戻すことと比較して、観察される増強はヒトにおいて示されるものよりも低い。さらに、図10Bに例示されている通り、溶血百分率は、ヒトC3タンパク質を補充したヒト化C5hu/huマウス血清の使用で回復する。
要約すると、本実施例から得られたデータにより、ヒトC3とマウスC5は交差反応することができるが、マウスC3とヒトC5は同様に交差反応して補体活性をin vitroで再現することができないことが実証される。これらの結果の要約を以下の表1に示す。
改変C5遺伝子を形成するために、内因性齧歯類C5遺伝子座において、C5遺伝子のエクソンをコードする齧歯類遺伝子配列の、ヒトC5遺伝子の少なくとも1個のエクソンをコードする核酸配列での置き換えを含む齧歯類であって、上記改変C5遺伝子の発現が、上記内因性齧歯類C5遺伝子座において齧歯類制御エレメントのコントロール下にある、齧歯類。
(項目2)
マウスまたはラットである、項目1に記載の齧歯類。
(項目3)
ヒトC5タンパク質をコードする上記ヒトC5遺伝子が、ヒトC5遺伝子のエクソン2からエクソン41を含む、項目1または項目2に記載の齧歯類。
(項目4)
マウスC5タンパク質を発現することができないマウスである、項目1から3のいずれか一項に記載の齧歯類。
(項目5)
内因性マウスC3遺伝子によりコードされるマウスC3タンパク質を発現するマウスである、項目1から4のいずれか一項に記載の齧歯類。
(項目6)
ヒトまたはヒト化C3タンパク質を発現するマウスである、項目1から5のいずれか一項に記載の齧歯類。
(項目7)
上記マウスが、内因性マウスC3遺伝子座において、C3タンパク質をコードするマウス遺伝子の、ヒトC3タンパク質をコードするヒトC3遺伝子での置き換えを含む、項目6に記載の齧歯類。
(項目8)
上記ヒトC3遺伝子の発現が、上記内因性マウスC3遺伝子座においてマウス制御エレメントのコントロール下にある、項目6または項目7に記載の齧歯類。
(項目9)
血清中に、ヒトC5タンパク質を、機能的内因性マウスC5タンパク質を発現するが上記置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するマウスC5タンパク質のレベルの少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%または200%の濃度で発現するマウスである、項目1から9のいずれか一項に記載の齧歯類。
(項目10)
血清中に、ヒトC5タンパク質を、機能的内因性C5タンパク質を発現するが上記置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するマウスC5タンパク質のレベルの約10%から約200%の間、約20%から約150%の間、または約30%から約100%の間の濃度で発現するマウスである、項目1から10のいずれか一項に記載の齧歯類。
(項目11)
血清中に、ヒトC5タンパク質を、約10μg/mlから約150μg/mlの間、約10μg/mlから約125μg/mlの間、または約15μg/mlから約100μg/mlの間の濃度で発現するマウスである、項目1から11のいずれか一項に記載の齧歯類。
(項目12)
血清中に、ヒトC5タンパク質を、少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125または150μg/mlの濃度で発現するマウスである、項目1から12のいずれか一項に記載の齧歯類。
(項目13)
改変C3遺伝子を形成するために、内因性齧歯類C3遺伝子座において、C3遺伝子のエクソンをコードする齧歯類遺伝子配列の、ヒトC3遺伝子の少なくとも1個のエクソンをコードする核酸配列での置き換えを含む齧歯類であって、上記改変C3遺伝子の発現が、内因性齧歯類C5遺伝子座において齧歯類制御エレメントのコントロール下にある、齧歯類。
(項目14)
マウスまたはラットである、項目13に記載の齧歯類。
(項目15)
ヒトC3タンパク質をコードする上記ヒトC3遺伝子が、ヒトC3遺伝子のエクソン1からエクソン41を含む、項目13または項目14に記載の齧歯類。
(項目16)
ヒトC3タンパク質をコードする上記ヒトC3遺伝子が、ヒトC3遺伝子のエクソン2からエクソン41を含む、項目13から15のいずれか一項に記載の齧歯類。
(項目17)
マウスC3タンパク質を発現することができないマウスである、項目13から16のいずれか一項に記載の齧歯類。
(項目18)
内因性マウスC5遺伝子によりコードされるマウスC5タンパク質を発現するマウスである、項目13から17のいずれか一項に記載の齧歯類。
(項目19)
上記マウスが、ヒトまたはヒト化C5タンパク質を発現する、項目18または項目19に記載の齧歯類。
(項目20)
上記マウスが、内因性マウスC5遺伝子座において、C5タンパク質をコードするマウス遺伝子の、ヒトC5タンパク質をコードするヒトC5遺伝子での置き換えを含む、項目19に記載の齧歯類。
(項目21)
上記ヒトC5遺伝子の発現が、上記内因性マウスC5遺伝子座においてマウス制御エレメントのコントロール下にある、項目19または項目20に記載の齧歯類。
(項目22)
血清中に、ヒトC3タンパク質を、機能的内因性マウスC3タンパク質を発現するが上記置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するマウスC3タンパク質のレベルの少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%または200%の濃度で発現するマウスである、項目13から21のいずれか一項に記載の齧歯類。
(項目23)
血清中に、ヒトC3タンパク質を、機能的内因性マウスC3タンパク質を発現するが上記置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するマウスC3タンパク質のレベルの約10%から約200%の間、約20%から約150%の間、または約30%から約100%の間の濃度で発現するマウスである、項目13から22のいずれか一項に記載の齧歯類。
(項目24)
血清中に、ヒトC3タンパク質を、約100μg/mlから約1500μg/mlの間、約200μg/mlから約1250μg/mlの間、または約300μg/mlから約1000μg/mlの間の濃度で発現するマウスである、項目13から23のいずれか一項に記載の齧歯類。
(項目25)
血清中に、ヒトC3タンパク質を、少なくとも約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250または1500μg/mlの濃度で発現するマウスである、項目13から24のいずれか一項に記載の齧歯類。
(項目26)
ヒト化齧歯類を作製するための方法であって、齧歯類C5タンパク質をコードする齧歯類C5遺伝子配列を、ヒトまたはヒト化C5タンパク質をコードするヒトC5遺伝子配列の1個または複数のエクソンを含むヒトC5遺伝子配列で置き換えるステップを含み、上記置き換えが内因性齧歯類C5遺伝子座におけるものであり、そしてヒトまたはヒト化C5タンパク質をコードするヒトC5遺伝子配列の1個または複数のエクソンを含む上記ヒトC5遺伝子配列が、上記内因性齧歯類C5遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している、方法。
(項目27)
上記齧歯類がマウスまたはラットである、項目26に記載の方法。
(項目28)
上記齧歯類制御エレメントまたは配列が、マウスまたはラット由来である、項目26または項目27に記載の方法。
(項目29)
上記齧歯類制御エレメントまたは配列が、上記齧歯類C5遺伝子座における内因性齧歯類制御エレメントまたは配列である、項目26から28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
上記齧歯類C5遺伝子配列を置き換える上記ヒトC5遺伝子配列が、ヒトC5遺伝子配列の少なくとも1個のエクソンを含む、項目26から29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
上記齧歯類C5遺伝子配列を置き換える上記ヒトC5遺伝子配列が、ヒトC5遺伝子配列の少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、または40個のエクソンを含む、項目30に記載の方法。
(項目32)
上記齧歯類C5遺伝子配列を置き換える上記ヒトC5遺伝子配列が、ヒトC5遺伝子配列の41個のエクソン全てを含む、項目30または項目31に記載の方法。
(項目33)
上記置き換えが内因性齧歯類C5遺伝子座におけるものであり、そしてヒトまたはヒト化C5タンパク質をコードするヒトC5遺伝子配列の1個または複数のエクソンを含む上記ヒトC5遺伝子配列が、上記内因性齧歯類C5遺伝子座において内因性齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している、項目26から32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
ヒト化マウスを作製するための方法であって、マウスC5タンパク質をコードするマウスC5遺伝子配列を、ヒトC5タンパク質をコードするヒトC5遺伝子で置き換えるステップを含む、方法。
(項目35)
上記置き換えが内因性マウスC5遺伝子座におけるものであり、そしてヒトC5タンパク質をコードする上記ヒトC5遺伝子が、上記内因性マウスC5遺伝子座において内因性マウス制御配列に作動可能に連結している、項目34に記載の方法。
(項目36)
ヒト化齧歯類を作製するための方法であって、齧歯類C3タンパク質をコードする齧歯類C3遺伝子配列を、ヒトまたはヒト化C5タンパク質をコードするヒトC3遺伝子配列の1個または複数のエクソンを含むヒトC3遺伝子配列で置き換えるステップを含み、上記置き換えが内因性齧歯類C3遺伝子座におけるものであり、そしてヒトまたはヒト化C3タンパク質をコードするヒトC3遺伝子配列の1個または複数のエクソンを含む上記ヒトC5遺伝子配列が、上記内因性齧歯類C3遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している、方法。
(項目37)
上記齧歯類がマウスまたはラットである、項目36に記載の方法。
(項目38)
上記齧歯類制御エレメントまたは配列が、マウスまたはラット由来である、項目36または37に記載の方法。
(項目39)
上記齧歯類制御エレメントまたは配列が、上記齧歯類C3遺伝子座における内因性齧歯類制御エレメントまたは配列である、項目36から38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
上記齧歯類C5遺伝子配列を置き換える上記ヒトC3遺伝子配列が、ヒトC3遺伝子配列の少なくとも1個のエクソンを含む、項目36から39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
上記齧歯類C3遺伝子配列を置き換える上記ヒトC3遺伝子配列が、ヒトC3遺伝子配列の少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、または40個のエクソンを含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
上記齧歯類C3遺伝子配列を置き換える上記ヒトC3遺伝子配列が、ヒトC3遺伝子配列の41個のエクソン全てを含む、項目41に記載の方法。
(項目43)
上記置き換えが内因性齧歯類C3遺伝子座におけるものであり、そしてヒトまたはヒト化C3タンパク質をコードするヒトC3遺伝子配列の1個または複数のエクソンを含む上記ヒトC3遺伝子配列が、上記内因性齧歯類C3遺伝子座において内因性齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している、項目36から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
ヒト化マウスを作製するための方法であって、マウスC3タンパク質をコードするマウスC3遺伝子配列を、ヒトC3タンパク質をコードするヒトC3遺伝子で置き換えるステップを含む、方法。
(項目45)
上記置き換えが内因性マウスC3遺伝子座におけるものであり、そしてヒトC3タンパク質をコードする上記ヒトC3遺伝子が、上記内因性マウスC3遺伝子座において内因性マウス制御配列に作動可能に連結している、項目44に記載の方法。
(項目46)
内因性齧歯類C5遺伝子座において、C5タンパク質をコードする齧歯類遺伝子の、ヒトまたはヒト化C5タンパク質をコードするヒトC5遺伝子での置き換えを含むヒト化C5遺伝子を含む齧歯類であって、ヒトまたはヒト化C5タンパク質をコードする上記ヒトC5遺伝子の発現が、上記内因性齧歯類C5遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列のコントロール下にあり、そして上記齧歯類が、内因性齧歯類C3遺伝子座において、C3タンパク質をコードする齧歯類遺伝子の、ヒトまたはヒト化C3タンパク質をコードするヒトC3遺伝子での置き換えをさらに含み、ヒトまたはヒト化C3タンパク質をコードする上記ヒトC3遺伝子の発現が、上記内因性齧歯類C3遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列のコントロール下にある、齧歯類。
(項目47)
マウスまたはラットである、項目46に記載の齧歯類。
(項目48)
マウスC5タンパク質を発現することができず、かつマウスC3タンパク質を発現することができないマウスである、項目46に記載の齧歯類。
(項目49)
上記内因性齧歯類C5遺伝子座および/または上記内因性齧歯類C3遺伝子座における上記齧歯類制御エレメントまたは配列が、マウスまたはラット由来である、項目46に記載の齧歯類。
(項目50)
上記齧歯類制御エレメントまたは配列が、上記齧歯類C5遺伝子座および/または上記齧歯類C3遺伝子座における内因性齧歯類制御エレメントまたは配列である、項目46に記載の齧歯類。
(項目51)
補体活性化を調節することが可能な化合物を同定するための方法であって、
a.項目1から25または項目46から50のいずれか一項に記載の齧歯類に上記化合物を投与するステップと、
b.上記齧歯類における補体活性化が調節されるかどうかをアッセイし、それにより、補体活性化を調節することが可能な化合物を同定するステップと
を含む、方法。
(項目52)
上記化合物が、小分子化学化合物、抗体、タンパク質、阻害性核酸、またはそれらの任意の組み合わせである、項目51に記載の方法。
(項目53)
上記化合物が、補体活性を増大させることによって補体活性化を調節する、項目51または項目52に記載の方法。
(項目54)
上記化合物が、補体活性を減少させることによって補体活性化を調節する、項目51または項目52に記載の方法。
(項目55)
上記齧歯類における補体活性化が調節されるかどうかを決定するために、上記齧歯類の血清をアッセイする、項目51から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
上記アッセイがCH50補体スクリーニングアッセイである、項目55に記載の方法。
Claims (53)
- 改変C5遺伝子を形成するために、内因性齧歯類C5遺伝子座において、C5遺伝子のエクソンをコードする齧歯類遺伝子配列の、ヒトC5遺伝子の少なくとも1個のエクソンをコードする核酸配列での置き換えを含む齧歯類であって、前記改変C5遺伝子の発現が、前記内因性齧歯類C5遺伝子座において齧歯類制御エレメントのコントロール下にあり、ここでヒトC5タンパク質をコードする前記ヒトC5遺伝子が、ヒトC5遺伝子のエクソン2からエクソン41を含む、齧歯類。
- マウスまたはラットである、請求項1に記載の齧歯類。
- マウスC5タンパク質を発現することができないマウスである、請求項1または請求項2に記載の齧歯類。
- 内因性マウスC3遺伝子によりコードされるマウスC3タンパク質を発現するマウスである、請求項1から3のいずれか一項に記載の齧歯類。
- ヒトまたはヒト化C3タンパク質を発現するマウスである、請求項1から4のいずれか一項に記載の齧歯類。
- 前記マウスが、内因性マウスC3遺伝子座において、C3タンパク質をコードするマウス遺伝子の、ヒトC3タンパク質をコードするヒトC3遺伝子での置き換えを含む、請求項5に記載の齧歯類。
- 前記ヒトC3遺伝子の発現が、前記内因性マウスC3遺伝子座においてマウス制御エレメントのコントロール下にある、請求項5または請求項6に記載の齧歯類。
- 血清中に、ヒトC5タンパク質を、機能的内因性マウスC5タンパク質を発現するが前記置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するマウスC5タンパク質のレベルの少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%または200%の濃度で発現するマウスである、請求項1から7のいずれか一項に記載の齧歯類。
- 血清中に、ヒトC5タンパク質を、機能的内因性C5タンパク質を発現するが前記置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するマウスC5タンパク質のレベルの約10%から約200%の間、約20%から約150%の間、または約30%から約100%の間の濃度で発現するマウスである、請求項1から8のいずれか一項に記載の齧歯類。
- 血清中に、ヒトC5タンパク質を、約10μg/mlから約150μg/mlの間、約10μg/mlから約125μg/mlの間、または約15μg/mlから約100μg/mlの間の濃度で発現するマウスである、請求項1から9のいずれか一項に記載の齧歯類。
- 血清中に、ヒトC5タンパク質を、少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125または150μg/mlの濃度で発現するマウスである、請求項1から10のいずれか一項に記載の齧歯類。
- 改変C3遺伝子を形成するために、内因性齧歯類C3遺伝子座において、C3遺伝子のエクソンをコードする齧歯類遺伝子配列の、ヒトC3遺伝子の少なくとも1個のエクソンをコードする核酸配列での置き換えを含む齧歯類であって、前記改変C3遺伝子の発現が、前記内因性齧歯類C3遺伝子座において齧歯類制御エレメントのコントロール下にある、齧歯類。
- マウスまたはラットである、請求項12に記載の齧歯類。
- ヒトC3タンパク質をコードする前記ヒトC3遺伝子が、ヒトC3遺伝子のエクソン1からエクソン41を含む、請求項12または請求項13に記載の齧歯類。
- ヒトC3タンパク質をコードする前記ヒトC3遺伝子が、ヒトC3遺伝子のエクソン2からエクソン41を含む、請求項12から14のいずれか一項に記載の齧歯類。
- マウスC3タンパク質を発現することができないマウスである、請求項12から15のいずれか一項に記載の齧歯類。
- 内因性マウスC5遺伝子によりコードされるマウスC5タンパク質を発現するマウスである、請求項12から16のいずれか一項に記載の齧歯類。
- 前記マウスが、ヒトまたはヒト化C5タンパク質を発現する、請求項17または請求項18に記載の齧歯類。
- 前記マウスが、内因性マウスC5遺伝子座において、C5タンパク質をコードするマウス遺伝子の、ヒトC5タンパク質をコードするヒトC5遺伝子での置き換えを含む、請求項18に記載の齧歯類。
- 前記ヒトC5遺伝子の発現が、前記内因性マウスC5遺伝子座においてマウス制御エレメントのコントロール下にある、請求項18または請求項19に記載の齧歯類。
- 血清中に、ヒトC3タンパク質を、機能的内因性マウスC3タンパク質を発現するが前記置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するマウスC3タンパク質のレベルの少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%または200%の濃度で発現するマウスである、請求項12から20のいずれか一項に記載の齧歯類。
- 血清中に、ヒトC3タンパク質を、機能的内因性マウスC3タンパク質を発現するが前記置き換えは含まない齢数を釣り合わせたマウスの血清中に存在するマウスC3タンパク質のレベルの約10%から約200%の間、約20%から約150%の間、または約30%から約100%の間の濃度で発現するマウスである、請求項12から21のいずれか一項に記載の齧歯類。
- 血清中に、ヒトC3タンパク質を、約100μg/mlから約1500μg/mlの間、約200μg/mlから約1250μg/mlの間、または約300μg/mlから約1000μg/mlの間の濃度で発現するマウスである、請求項12から22のいずれか一項に記載の齧歯類。
- 血清中に、ヒトC3タンパク質を、少なくとも約100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1250または1500μg/mlの濃度で発現するマウスである、請求項12から23のいずれか一項に記載の齧歯類。
- ヒト化齧歯類を作製するための方法であって、齧歯類C5タンパク質をコードする齧歯類C5遺伝子配列を、ヒトまたはヒト化C5タンパク質をコードするヒトC5遺伝子配列の1個または複数のエクソンを含むヒトC5遺伝子配列で置き換えるステップを含み、前記置き換えが内因性齧歯類C5遺伝子座におけるものであり、そしてヒトまたはヒト化C5タンパク質をコードするヒトC5遺伝子配列の1個または複数のエクソンを含む前記ヒトC5遺伝子配列が、前記内因性齧歯類C5遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結しており、ここで前記齧歯類制御エレメントまたは配列が、マウスまたはラット由来である、方法。
- 前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項25に記載の方法。
- 前記齧歯類制御エレメントまたは配列が、前記齧歯類C5遺伝子座における内因性齧歯類制御エレメントまたは配列である、請求項25または26に記載の方法。
- 前記齧歯類C5遺伝子配列を置き換える前記ヒトC5遺伝子配列が、ヒトC5遺伝子配列の少なくとも1個のエクソンを含む、請求項25から27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記齧歯類C5遺伝子配列を置き換える前記ヒトC5遺伝子配列が、ヒトC5遺伝子配列の少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、または40個のエクソンを含む、請求項28に記載の方法。
- 前記齧歯類C5遺伝子配列を置き換える前記ヒトC5遺伝子配列が、ヒトC5遺伝子配列の41個のエクソン全てを含む、請求項28または請求項29に記載の方法。
- 前記置き換えが内因性齧歯類C5遺伝子座におけるものであり、そしてヒトまたはヒト化C5タンパク質をコードするヒトC5遺伝子配列の1個または複数のエクソンを含む前記ヒトC5遺伝子配列が、前記内因性齧歯類C5遺伝子座において内因性齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している、請求項25から30のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト化マウスを作製するための方法であって、マウスC5タンパク質をコードするマウスC5遺伝子配列を、ヒトC5タンパク質をコードするヒトC5遺伝子で置き換えるステップを含み、ここで前記置き換えが内因性マウスC5遺伝子座におけるものであり、そしてヒトC5タンパク質をコードする前記ヒトC5遺伝子が、前記内因性マウスC5遺伝子座において内因性マウス制御配列に作動可能に連結している、方法。
- ヒト化齧歯類を作製するための方法であって、齧歯類C3タンパク質をコードする齧歯類C3遺伝子配列を、ヒトまたはヒト化C3タンパク質をコードするヒトC3遺伝子配列の1個または複数のエクソンを含むヒトC3遺伝子配列で置き換えるステップを含み、前記置き換えが内因性齧歯類C3遺伝子座におけるものであり、そしてヒトまたはヒト化C3タンパク質をコードするヒトC3遺伝子配列の1個または複数のエクソンを含む前記ヒトC3遺伝子配列が、前記内因性齧歯類C3遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している、方法。
- 前記齧歯類がマウスまたはラットである、請求項33に記載の方法。
- 前記齧歯類制御エレメントまたは配列が、マウスまたはラット由来である、請求項33または34に記載の方法。
- 前記齧歯類制御エレメントまたは配列が、前記齧歯類C3遺伝子座における内因性齧歯類制御エレメントまたは配列である、請求項33から35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記齧歯類C3遺伝子配列を置き換える前記ヒトC3遺伝子配列が、ヒトC3遺伝子配列の少なくとも1個のエクソンを含む、請求項33から36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記齧歯類C3遺伝子配列を置き換える前記ヒトC3遺伝子配列が、ヒトC3遺伝子配列の少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、または40個のエクソンを含む、請求項37に記載の方法。
- 前記齧歯類C3遺伝子配列を置き換える前記ヒトC3遺伝子配列が、ヒトC3遺伝子配列の41個のエクソン全てを含む、請求項38に記載の方法。
- 前記置き換えが内因性齧歯類C3遺伝子座におけるものであり、そしてヒトまたはヒト化C3タンパク質をコードするヒトC3遺伝子配列の1個または複数のエクソンを含む前記ヒトC3遺伝子配列が、前記内因性齧歯類C3遺伝子座において内因性齧歯類制御エレメントまたは配列に作動可能に連結している、請求項33から39のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト化マウスを作製するための方法であって、マウスC3タンパク質をコードするマウスC3遺伝子配列を、ヒトC3タンパク質をコードするヒトC3遺伝子で置き換えるステップを含む、方法。
- 前記置き換えが内因性マウスC3遺伝子座におけるものであり、そしてヒトC3タンパク質をコードする前記ヒトC3遺伝子が、前記内因性マウスC3遺伝子座において内因性マウス制御配列に作動可能に連結している、請求項41に記載の方法。
- 内因性齧歯類C5遺伝子座において、C5タンパク質をコードする齧歯類遺伝子の、ヒトまたはヒト化C5タンパク質をコードするヒトC5遺伝子での置き換えを含むヒト化C5遺伝子を含む齧歯類であって、ヒトまたはヒト化C5タンパク質をコードする前記ヒトC5遺伝子の発現が、前記内因性齧歯類C5遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列のコントロール下にあり、そして前記齧歯類が、内因性齧歯類C3遺伝子座において、C3タンパク質をコードする齧歯類遺伝子の、ヒトまたはヒト化C3タンパク質をコードするヒトC3遺伝子での置き換えをさらに含み、ヒトまたはヒト化C3タンパク質をコードする前記ヒトC3遺伝子の発現が、前記内因性齧歯類C3遺伝子座において齧歯類制御エレメントまたは配列のコントロール下にある、齧歯類。
- マウスまたはラットである、請求項43に記載の齧歯類。
- マウスC5タンパク質を発現することができず、かつマウスC3タンパク質を発現することができないマウスである、請求項43に記載の齧歯類。
- 前記内因性齧歯類C5遺伝子座および/または前記内因性齧歯類C3遺伝子座における前記齧歯類制御エレメントまたは配列が、マウスまたはラット由来である、請求項43に記載の齧歯類。
- 前記齧歯類制御エレメントまたは配列が、前記齧歯類C5遺伝子座および/または前記齧歯類C3遺伝子座における内因性齧歯類制御エレメントまたは配列である、請求項43に記載の齧歯類。
- 補体活性化を調節することが可能な化合物を同定するための方法であって、
a.請求項1から24または請求項43から47のいずれか一項に記載の齧歯類に前記化合物を投与するステップと、
b.前記齧歯類における補体活性化が調節されるかどうかをアッセイし、それにより、補体活性化を調節することが可能な化合物を同定するステップと
を含む、方法。 - 前記化合物が、小分子化学化合物、抗体、タンパク質、阻害性核酸、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項48に記載の方法。
- 前記化合物が、補体活性を増大させることによって補体活性化を調節する、請求項48または請求項49に記載の方法。
- 前記化合物が、補体活性を減少させることによって補体活性化を調節する、請求項48または請求項49に記載の方法。
- 前記齧歯類における補体活性化が調節されるかどうかを決定するために、前記齧歯類の血清をアッセイする、請求項48から51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アッセイがCH50補体スクリーニングアッセイである、請求項52に記載の方法。
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