KR20170002472A

KR20170002472A - 인간화된 c5 및 c3 동물

Info

Publication number: KR20170002472A
Application number: KR1020167032659A
Authority: KR
Inventors: 잉 후; 아드리안나 라투섹; 징타이 카오; 알렉산더 무지카; 스탠리 위간드; 존 맥훠터; 앤드류 머피; 린 맥도날드
Original assignee: 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2014-05-05
Filing date: 2015-05-04
Publication date: 2017-01-06
Also published as: SG10202003996YA; EP3142483A1; AU2015256299A1; US20220132818A1; EP3636073B1; MX2016014504A; JP6598798B2; JP2017514496A; CA2946412C; EP3636073C0; US10492477B2; US11178860B2; BR112016025751A2; US20170332611A1; US20150313194A1; KR102461511B1; IL248481B; CN106659146B; RU2016146390A3; EP3142483B1

Abstract

인간 또는 인간화된 C3 및/또는 C5 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물, 뿐만 아니라 보체 시스템을 조절할 수 있는 화합물을 식별하기 위해 이것을 사용하는 방법이 제공된다. 인간 또는 인간화된 C5 유전자 및/또는 C3 유전자로 내인성 C5 유전자 및/또는 C3 유전자의 대체를 포함하는 비-인간 동물, 및 비-인간 동물의 제조 및 사용 방법이 기술된다. 비-인간 C5 조절 요소의 제어 하에 인간 또는 인간화된 C5 유전자를 포함하는 비-인간 동물이 또한 제공되며, 내인성 비-인간 C5 유전자좌에서 인간 C5-암호화 서열로 비-인간 C5-암호화 서열의 대체를 가지는 비-인간 동물을 포함한다. 비-인간 C3 조절 요소의 제어 하에 인간 또는 인간화된 C3 유전자를 포함하는 비-인간 동물이 또한 제공되며, 내인성 비-인간 C3 유전자좌에서 인간 또는 인간화된 C3 단백질-암호화 서열로 비-인간 C3 단백질-암호화 서열의 대체를 가지는 비-인간 동물을 포함한다. 인간 또는 인간화된 C3 및/또는 C5 서열을 포함하는 비-인간 동물이 제공되는데, 비-인간 동물은 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트이다.

Description

인간화된 C5 및 C3 동물{HUMANIZED C5 AND C3 ANIMALS}

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2014년 5월 5일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/988,581 및 2014년 10월 23일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/067,836에 대한 우선권을 주장하며, 이것들 각각의 개시물은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본 발명의 분야

인간 서열을 포함하는 C3 단백질 및/또는 C5 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물뿐 아니라 전체적으로 또는 부분적으로 인간인 C3 및/또는 C5 유전자를 포함하는 트랜스제닉(transgenic) 비-인간 동물이 본원에서 개시된다. 또한 인간 또는 인간화된 C3 및/또는 C5 단백질을 발현하는 비-인간 동물 및 인간 또는 인간화된 C3 및/또는 C5 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물을 사용하는 방법이 본원에서 개시된다.

보체 단백질 C5 및 C3는 보체 활성화와 관련된 다양한 인간 질환, 장애 및 질병, 예를 들어, 안구 염증 질환 및 망막 퇴행성 질환의 치료를 위한 치료적 표적이다. 인간 C5 또는 인간 C3 단백질을 특이적으로 표적화하는 치료적 분자의 약물동력학 (PK) 및 약력학 (PD)의 평가는 일상적으로 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트에서 수행된다. 하지만, 이러한 치료적 분자의 PD는 치료적 분자가 내인성 C5 또는 C3 단백질을 표적화하지 않기 때문에 특정 비-인간 동물에서 제대로 결정될 수 없다.

더욱이, 인간-특이적 C5 또는 C3 단백질 길항제의 치료적 효능의 평가를 위해서 활성화된 보체 시스템에 관련된 질환의 다양한 비-인간 동물 모델은 이러한 종-특이적 길항제가 내인성 C5 또는 C3 단백질과 상호작용하지 않는 비-인간 동물에서 문제가 많다.

따라서, 비-인간 동물의 C5 및/또는 C3 유전자가 인간화된 전체적으로 또는 부분적으로 인간화되거나 또는 각각 인간 또는 인간화된 C5 및/또는 C3 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 인간 C5 및/또는 C3 유전자로 대체된 (예를 들어, 내인성 비-인간 유전자좌(loci)에서) 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 쥣과 동물, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 필요하다. 기능적 C5 및/또는 C3 단백질을 발현하지만, 인간 또는 인간화된 C5 및/또는 C3 유전자를 포함하지 않는 연령 일치 비-인간 동물의 혈청에 존재하는 C5 및/또는 C3 단백질의 농도와 각각 유사한 농도로 인간 또는 인간화된 C5 및/또는 C3 단백질을 발현하는 이러한 인간화된 비-인간 동물이 필요하다.

본 명세서 전반에 걸쳐, 다양한 특허, 특허 출원 및 다른 유형의 간행물 (예를 들어, 신문 기사, 전자 데이터베이스 항목, 등)이 언급된다. 본원에서 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 다른 간행물의 개시물은 모든 목적을 위해서 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

인간 서열을 포함하는 C3 및/또는 C5를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물이 제공된다.

전체적으로 또는 부분적으로 인간인 C3 및/또는 C5 유전자를 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물이 제공된다.

인간 또는 인간화된 C3 및/또는 C5 단백질을 발현하는 비-인간 동물이 제공된다.

내인성 비-인간 동물 C5 및/또는 C3 유전자의 대체 (전체적으로 또는 부분적으로)를 가지는 비-인간 동물이 제공된다.

내인성 비-인간 C5 및/또는 C3 유전자좌에서 C5 및/또는 C3 인간화 (전체적으로 또는 부분적으로)를 포함하는 비-인간 동물이 제공된다.

인간 또는 인간화된 C5 및/또는 C3 유전자를 가진 비-인간 동물이 제공되는데, 비-인간 동물은 기능적 내인성 C5 및/또는 C3 단백질을 발현하지 않지만, 대체를 포함하지 않는 연령 일치 비-인간 동물의 혈청에 존재하는 C5 및/또는 C3 단백질과 각각 유사한 농도로 혈청에서 내인성 C5 및/또는 C3 단백질을 발현하지 않지만, 인간 또는 인간화된 C5 및/또는 C3 단백질을 발현한다.

한 양태에서, 인간 또는 인간화된 C3 및/또는 C5 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물이 제공된다.

한 양태에서, 인간 또는 인간화된 C5 및/또는 C3 단백질을 암호화하는 내인성 C5 및/또는 C3 유전자를 암호화하는 유전자의 내인성 C5 및/또는 C3 유전자좌에서 대체를 포함하는 유전적으로 변형된 비-인간 동물이 제공된다. 설치류, 예를 들어, 내인성 설치류 C5 유전자좌에서, 인간 C5 유전자로 내인성 C5 유전자의 대체를 포함하고, 및/또는 내인성 설치류 C3 유전자좌에서, 인간 C3 유전자로 내인성 C3 유전자의 대체를 포함하는 마우스 또는 래트가 제공된다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 양태에서, 내인성 설치류 C5 유전자좌에서 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자로 C5 단백질을 암호화하는 설치류 유전자의 대체를 포함하는 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 제공되는데, 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자의 발현은 내인성 설치류 C5 유전자좌에서 설치류 조절 요소의 제어 하에 이루어진다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 구체예에서, 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자는 인간 C5 유전자의 엑손 2 내지 엑손 41을 포함한다.

한 구체예에서, 설치류는 마우스 C5 단백질을 발현할 수 없는 마우스이다.

한 구체예에서, 설치류는 내인성 마우스 C3 유전자에 의해 암호화된 마우스 C3 단백질을 발현하는 마우스이다.

한 구체예에서, 설치류는 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 발현하는 마우스이다.

한 구체예에서, 설치류는 내인성 마우스 C3 유전자좌에서 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자로 C3 단백질을 암호화하는 마우스 유전자의 대체를 포함하는 마우스이다.

한 구체예에서, 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자의 발현은 내인성 마우스 C3 유전자좌에서 마우스 조절 요소의 제어 하에 이루어진다.

한 양태에서, 내인성 설치류 C3 유전자좌에서 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자로 C3 단백질을 암호화하는 설치류 유전자의 대체를 포함하는 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 제공되는데, 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자의 발현은 내인성 설치류 C3 유전자좌에서 설치류 조절 요소의 제어 하에 이루어진다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 구체예에서, 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자는 인간 C3 유전자의 엑손 1 내지 엑손 41을 포함한다.

한 구체예에서, 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자는 인간 C3 유전자의 엑손 2 내지 엑손 41을 포함한다.

한 구체예에서, 설치류는 마우스 C3 단백질을 발현할 수 없는 마우스이다.

한 구체예에서, 설치류는 내인성 마우스 C5 유전자에 의해 암호화된 마우스 C5 단백질을 발현하는 마우스이다

한 구체예에서, 설치류는 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 발현하는 마우스이다.

한 구체예에서, 설치류는 내인성 마우스 C5 유전자좌에서 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자로 C5 단백질을 암호화하는 마우스 유전자의 대체를 포함하는 마우스이다.

한 구체예에서, 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자의 발현은 내인성 마우스 C5 유전자좌에서 마우스 조절 요소의 제어 하에 이루어진다.

한 양태에서, 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 제공되는데, 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 발현하는 설치류는 정상 보체 시스템을 포함한다, 예를 들어, 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 발현하는 설치류의 혈액, 혈장 또는 혈청에서 보체 단백질의 수준은 기능적 내인성 C5 단백질을 발현하는 설치류의 혈액, 혈장 또는 혈청에서 보체 단백질의 수준과 유사하다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 양태에서, 인간 C5 유전자로부터 C5 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 제공되는데, 설치류는 그것의 혈청에서 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 발현한다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 구체예에서, 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 발현하는 설치류의 혈청은 기능적, 내인성 C5 단백질을 발현하하는 설치류, 예를 들어, 야생형 마우스 또는 래트와 대략 같은 수준의 C5 단백질을 가진다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 구체예에서, 마우스는 기능적 내인성 C5 단백질을 발현하지만, 내인성 마우스 C5 유전자좌에서 인간 C5 유전자로 내인성 C5 유전자의 대체를 포함하지 않는 연령 일치 마우스의 혈청에 존재하는 C5 단백질 수준의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%의 농도로 혈청에서 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 발현한다.

한 구체예에서, 마우스는 기능적 내인성 C5 단백질을 발현하지만, 내인성 마우스 C5 유전자좌에서 인간 C5 유전자로 내인성 C5 유전자의 대체를 포함하지 않는 연령 일치 마우스의 혈청에 존재하는 마우스 C5 단백질 수준의 약 10% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 150%, 또는 약 30% 내지 약 100%의 농도로 혈청에서 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 발현한다.

한 구체예에서, 마우스는 약 10 μg/ml 내지 약 150 μg/ml, 약 10 μg/ml 내지 약 125 μg/ml, 또는 약 15 μg/ml 내지 약 100 μg/ml의 농도로 혈청에서 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 발현한다.

한 구체예에서, 마우스는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125 또는 150 μg/ml의 농도로 혈청에서 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 발현한다.

한 양태에서, 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 제공되는데, 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 발현하는 설치류는 정상 보체 시스템을 포함한다, 즉, 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 발현하는 설치류의 혈액, 혈장 또는 혈청에서 보체 단백질의 수준은 기능적 내인성 C3 단백질을 발현하는 설치류의 혈액, 혈장 또는 혈청에서 보체 단백질의 수준과 유사하다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 양태에서, 인간 C3 유전자로부터 C3 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 제공되는데, 설치류는 그것의 혈청에서 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 발현한다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 구체예에서, 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 발현하는 설치류의 혈청은 기능적, 내인성 C3 단백질을 발현하는 설치류, 예를 들어, 야생형 마우스 또는 래트와 대략 같은 수준의 C3 단백질을 가진다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 구체예에서, 마우스는 기능적 내인성 C3 단백질을 발현하지만, 내인성 마우스 C3 유전자좌에서 인간 C3 유전자로 내인성 C3 유전자의 대체를 포함하지 않는 연령 일치 마우스의 혈청에 존재하는 C3 단백질 수준의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%의 농도로 혈청에서 인간 또는 인간화된 C3 단백질 (hC3)을 발현한다.

한 구체예에서, 마우스는 기능적 내인성 C3 단백질을 발현하지만, 내인성 마우스 C3 유전자좌에서 인간 C3 유전자로 내인성 C3 유전자의 대체를 포함하지 않는 연령 일치 마우스의 혈청에 존재하는 마우스 C3 단백질 수준의 약 10% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 150%, 또는 약 30% 내지 약 100%의 농도로 혈청에서 인간 C3 단백질을 발현한다.

한 구체예에서, 마우스는 약 100 μg/ml 내지 약 1500 μg/ml, 약 200 μg/ml 내지 약 1250 μg/ml, 또는 약 300 μg/ml 내지 약 1000 μg/ml의 농도로 혈청에서 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 발현한다.

한 구체예에서, 마우스는 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1250 또는 1500 μg/ml의 농도로 혈청에서 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 발현한다.

한 양태에서, 내인성 설치류 C5 유전자좌에서 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자로 C5 단백질을 암호화하는 설치류 유전자의 대체를 포함하는 인간 C5 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 설치류가 제공되는데, 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자의 발현은 내인성 설치류 C5 유전자좌에서 설치류 조절 요소 또는 서열의 제어 하에 이루어지고, 설치류는 내인성 설치류 C3 유전자좌에서 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자로 C3 단백질을 암호화하는 설치류 유전자의 대체를 포함하는 인간 C3 유전자를 더 포함하는데, 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자의 발현은 내인성 설치류 C3 유전자좌에서 설치류 조절 요소 또는 서열의 제어 하에 이루어진다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 구체예에서, 마우스는 마우스 C5 단백질을 발현할 수 없고 마우스 C3 단백질을 발현할 수 없다.

한 구체예에서, 내인성 설치류 C5 유전자좌 및/또는 설치류 C3 유전자좌 내 설치류 조절 요소 또는 서열은 마우스 또는 래트의 조절 요소 또는 서열이다.

한 구체예에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 설치류 C5 유전자좌 및/또는 설치류 C3 유전자좌 내 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열이며 마우스 또는 래트의 조절 요소 또는 서열이다.

한 양태에서, 인간 또는 인간화된 C5 및/또는 C3 단백질을 발현하는 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트가 제공되는데, 비-인간 동물은 내인성 비-인간 C5 유전자좌 및/또는 내인성 비-인간 C3 유전자좌로부터 인간 또는 인간화된 C5 및/또는 C3 단백질을 발현한다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 설치류이다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 양태에서, 내인성 마우스 C5 유전자좌로부터 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되는데, 내인성 마우스 C5 유전자는, 전체적으로 또는 부분적으로, 인간 C5 유전자로 대체된다.

한 구체예에서, 내인성 마우스 C5 유전자좌에서 엑손 2 내지 42 및 3' 비번역 서열을 포함하는 약 75.8 kb고 결실되고 인간 C5 유전자의 엑손 2 내지 41을 포함하는, 약 97 kb의 인간 C5 유전자 서열로 대체된다. 특이적 구체예에서, 인간 C5 유전자는 인간 BAC CTD-2559I19의 인간 C5 유전자의 엑손 2 내지 42를 포함한다. 특이적 구체예에서, C5 유전자는 마우스 C5 엑손 1 및 인간 C5 엑손 2 내지 42를 포함한다.

한 양태에서, 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되는데, 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은, 전체적으로 또는 부분적으로, 내인성 마우스 C5 단백질을 암호화하는 내인성 뉴클레오타이드 서열을 대체한다.

한 양태에서, 내인성 마우스 C3 유전자좌로부터 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공되는데, 내인성 마우스 C3 유전자는, 전체적으로 또는 부분적으로, 인간 C3 유전자로 대체되었다.

한 구체예에서, 엑손 1 내지 엑손 41의 업스트림에 5' 조절 요소를 포함하는 내인성 마우스 C3 유전자좌의 일부가 결실되고 인간 C3 유전자의 엑손 1 내지 엑손 41의 업스트림에 5' 조절 요소를 포함하는 인간 C3 유전자 서열로 대체된다. 특이적 구체예에서, 인간 C3 유전자는 전체 인간 C3 암호화 영역을 포함한다.

한 구체예에서 , 인트론 1 및 엑손 2 내지 41의 일부를 포함하는 내인성 마우스 C3 유전자좌의 일부가 결실되고 인간 C3 유전자의 인트론 1 및 엑손 2 내지 엑손 41의 일부를 포함하는 인간 C3 유전자 서열로 대체된다. 특이적 구체예에서, C3 유전자는 마우스 C3 엑손 1 및 인간 C3 엑손 2 내지 41을 포함한다.

한 양태에서, 인간화된 C5 설치류의 제조 방법이 제공되며, 설치류 C5 단백질을 암호화하는 설치류 C5 유전자 서열을, 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 C5 유전자 서열로 대체하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 구체예에서, 대체는 내인성 설치류 C5 유전자좌에서 이루어지고 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 C5 유전자 서열은 내인성 설치류 C5 유전자좌에서 설치류 조절 요소 또는 서열에 작동 가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 구체예에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 마우스로부터 유래된다. 한 구체예에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 래트로부터 유래된다.

한 구체예에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 설치류 C5 유전자좌 내 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열이다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 구체예에서, 설치류 C5 유전자 서열을 대체하는 인간 C5 유전자 서열은 인간 C5 유전자 서열의 적어도 하나의 엑손을 포함한다. 다른 구체예에서, 설치류 C5 유전자 서열을 대체하는 인간 C5 유전자 서열은 인간 C5 유전자 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 엑손을 포함한다. 한 구체예에서, 설치류 C5 유전자 서열을 대체하는 인간 C5 유전자 서열은 인간 C5 유전자 서열의 41개의 엑손 모두를 포함한다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 구체예에서, 대체는 내인성 설치류 C5 유전자좌에서에서 이루어지고 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 C5 유전자 서열은 내인성 설치류 C5 유전자좌 내 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열에 작동 가능하게 연결된다.

한 양태에서, 인간화된 C5 마우스의 제조 방법이 제공되며, 마우스 C5 단백질을 암호화하는 마우스 C5 유전자 서열을, 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자 서열로 대체하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 대체는 내인성 마우스 C5 유전자좌에서 이루어지고, 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자는 내인성 마우스 C5 유전자좌에서 마우스 조절 요소 또는 서열에 작동 가능하게 연결된다.

한 구체예에서, 대체는 내인성 마우스 C5 유전자좌에서 이루어지고, 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자는 내인성 마우스 C5 유전자좌 내 내인성 마우스 조절 요소 또는 서열에 작동 가능하게 연결된다.

한 양태에서, 인간화된 C3 설치류의 제조 방법이 제공되며, 설치류 C3 단백질을 암호화하는 설치류 C3 유전자 서열을 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 C3 유전자 서열로 대체하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 구체예에서, 대체는 내인성 설치류 C3 유전자좌에서 이루어지고 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 C3 유전자 서열은 내인성 설치류 C3 유전자좌에서 설치류 조절 요소 또는 서열에 작동 가능하게 연결된다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 구체예에서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 설치류 C3 유전자좌 내 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열이다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 구체예에서, 설치류 C3 유전자 서열을 대체하는 인간 C3 유전자 서열은 인간 C3 유전자 서열의 적어도 하나의 엑손을 포함한다. 다른 구체예에서, 설치류 C3 유전자 서열을 대체하는 인간 C3 유전자 서열은 인간 C3 유전자 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 엑손을 포함한다. 한 구체예에서, 설치류 C5 유전자 서열을 대체하는 인간 C3 유전자 서열은 인간 C3 유전자 서열의 41개의 엑손 모두를 포함한다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 구체예에서, 대체는 내인성 설치류 C3 유전자좌에서 이루어지고 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 C3 유전자 서열은 내인성 설치류 C3 유전자좌 내 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열에 작동 가능하게 연결된다.

한 양태에서, 인간화된 C3 마우스의 제조 방법이 제공되며, 마우스 C3 단백질을 암호화하는 마우스 C3 유전자 서열을, 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자 서열로 대체하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 대체는 내인성 마우스 C3 유전자좌에서 이루어지고, 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자는 내인성 마우스 C3 유전자좌 내 내인성 마우스 조절 요소 또는 서열에 작동 가능하게 연결된다.

한 구체예에서, 대체는 내인성 마우스 C3 유전자좌에서 이루어지고, 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자 내인성 마우스 C3 유전자좌에서 마우스 조절 요소 또는 서열에 작동 가능하게 연결된다.

다양한 양태에서, 본원에서 기술된 유전적으로 변형된 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트는 그것들의 생식 계열에서 유전적 변형을 포함한다.

한 양태에서, 본원에서 기술된 바와 같이 유전적 변형을 포함하는 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트, 배아가 제공된다.

한 양태에서, 본원에서 기술된 바와 같이 유전적 변형을 포함하는 공여 세포를 포함하는 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트, 숙주 배아가 제공된다.

한 양태에서, 본원에서 기술된 바와 같이 유전적 변형을 포함하는 만능(pluripotent) 또는 전능(totipotent) 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트 세포가 제공된다. 한 구체예에서, 세포는 설치류 세포이다. 한 구체예에서, 세포는 마우스 세포이다. 한 구체예에서, 세포는 설치류 ES 세포이다. 한 구체예에서, 세포는 마우스 ES 세포이다.

한 양태에서, 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트, 난(egg)이 제공되는데, 비-인간 동물 난은 이소성 비-인간 동물 염색체를 포함하고, 이소성 비-인간 동물 염색체는 본원에서 기술된 바와 같이 유전적 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 비-인간 동물은 설치류이다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스이다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다.

한 양태에서, 인간 C5 유전자 또는 인간 C3 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 마우스 배아, 난, 또는 세포는 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 계통인 마우스이다. 또 다른 구체예에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예를 들어, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 계통으로 구성된 군으로부터 선택되는 129 계통이다 (예를 들어, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836 참조, 또한 Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines 참조). 특이적 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 전술된 129 계통 및 전술된 C57BL/6 계통의 혼합체이다. 또 다른 특이적 구체예에서 마우스는 전술된 129 계통의 혼합체, 또는 전술된 BL/6 계통의 혼합체이다. 특이적 구체예에서, 혼합체의 129 계통은 129S6 (129/SvEvTac) 계통이다. 또 다른 구체예에서 마우스는 BALB 계통, 예를 들어, BALB/c 계통이다. 또 다른 구체예에서 마우스는 BALB 계통 및 또 다른 전술된 계통의 혼합체이다. 한 구체예에서, 마우스는 Swiss 또는 Swiss Webster 마우스이다.

추가의 양태에서, 화합물을 본원에서 개시되고 기술된 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트 중 어느 것에 투여하는 단계 및 설치류에서 보체 활성화가 조절되는지를 검정하여(assay), 보체 활성화를 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 단계를 포함하는, 보체 활성화를 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 방법이 본원에서 제공된다. 한 구체예에서, 화합물은 소분자 화합물, 항체, 단백질, 억제 핵산, 또는 이것들의 어떠한 조합이다. 본원에서 개시된 구체예들 중 또 다른 구체예에서, 화합물은 보체 활성을 증가시킴으로써 보체 활성화를 조절한다. 본원에서 개시된 구체예들 중 또 다른 구체예에서, 화합물은 보체 활성을 감소시킴으로써 보체 활성화를 조절한다. 본원에서 개시된 구체예들 중 또 다른 구체예에서, 설치류의 혈청은 설치류에서 보체 활성화가 조절되는지를 결정하기 위해 검정되었다. 추가의 구체예에서, 검정은 CH₅₀ 보체 스크리닝 검정이다.

본원에서 기술된 각각의 양태 및 구체예는 구체예 또는 양태의 문맥으로부터 명시적으로 또는 분명하게 배제되지 않는 한, 함께 사용될 수 있다.

도 1은 마우스 (상단) 및 인간 (하단) C5 게놈 유전자좌의, 비례가 아닌, 예시를 제공한다. 인간화된 C5 마우스를 생성하기 위해 각각 결실되고 대체되는 마우스 및 인간 C5 유전자 영역이 표시된다.
도 2는 마우스 (mC3) 및 인간화된 (hC3) C3 게놈 유전자좌의, 비례가 아닌, 예시를 제공한다. (A) 5' 조절 요소 및 엑손 1 내지 엑손 41의 암호화 영역에 걸쳐있는 마우스 C3 유전자가 결실되고 인간 C3 유전자의 5' 조절 요소 및 엑손 1 내지 엑손 41의 암호화 영역 및 loxP 부위로 대체되며, 각각 굵은 선 및 화살표로 표시된다. (B) 인트론 1 및 엑손 2 내지 엑손 41의 암호화 영역의 일부에 결쳐있는 마우스 C3 유전자가 결실되고 인간 C5 유전자의 인트론 1 및 엑손 2 내지 엑손 41의 암호화 영역의 일부 및 loxP 부위로 대체되며, 각각 굵은 선 및 화살표로 표시된다.
도 3은 용혈 검정에서 마우스 보체가 인간 보체보다 더 낮은 활성을 가진다는 것을 보여준다.
도 4는 보체 용혈 활성이 종-특이적 방식으로 종-특이적 항-C5 단클론성 항체에 의해 차단된다는 것을 보여준다.
도 5는 인간화된 C5 마우스가 기능적 마우스 C5 넉아웃된 것이라는 것을 보여준다. (A) 인간 C5 또는 C3 단백질의 추가는 각각 C5 또는 C3-고갈된 인간 혈청에서 용혈 활성을 복원한다. (B) 인간이 아니라, 마우스 C5 단백질은 C5^-/- 및 인간화된 C5 마우스 혈청에서 용혈 활성을 복원한다. (C) 인간화된 C5 마우스 혈청에서 인간 C5 단백질의 수준은 인간 혈청보다 3배 더 낮다. (D) 인간화된 C5 마우스에서 투여 전 보체 C5 수준은 수컷 및 암컷 간에 차이가 있다. 인간 C5의 범위, 20-100 μg/mL는 인간화된 C5 마우스 혈청에 존재한다.
도 6은 인간 C5 단백질 단독이 아니라, 인간 C3 및 C5 단백질의 추가가 C5^-/- 마우스 혈청에서 용혈 활성을 복원한다는 것을 보여준다.
도 7은 인간화된 C5 마우스 혈청이 마우스 용혈 활성의 야생형 수준을 달성하기 위해 인간 C3 단백질의 추가가 필요하다는 것을 보여준다.
도 8은 400 μg/mL 인간 C3 단백질 (A) 및 800 μg/mL 인간 C3 단백질 (B)를 사용하여 항-인간 C5 항체 (C5Ab)에 노출된 인간화된 C5 마우스의 혈청 샘플에서 수행된 용혈 검정의 결과를 보여준다.
도 9는 연구의 모든 동물 (A) 암컷 (상단) 및 수컷 (하단) 동물 (B)에 대하여 주사 후 시간의 함수로서 항-인간 C5 항체 수준을 측정하는 약물동력학적 검정의 결과를 보여준다.
도 10A는 인간 C3 단백질을 야생형 마우스 혈청에 추가하는 것은 정상 인간 혈청에서 관찰된 바와 같은 정도는 아니지만 용혈 기능을 향상시킬 수 있다는 것을 보여준다 (마우스의 각 데이터 포인트에 대하여, 3마리의 동물의 혈청이 혼합되었다). 도 10B는 용혈 기능이 인간 C3 단백질로 보충될 때 인간화된 C5^hu ^/ ^hu 마우스에서 회복될 수 있다는 것을 보여준다.
도 11은 인간 C3 단백질을 C3 넉아웃 마우스로부터 유래된 혈청에 추가하는 것은 용혈 기능을 구제할 수 있다는 것을 보여준다 (마우스의 각 데이터 포인트에 대하여, 3마리의 동물의 혈청이 혼합되었다).
도 12는 인간 C3 단백질 단독을 C5 넉아웃 마우스 혈청에 추가하는 것은 용혈 기능을 구제할 수 없다는 것을 보여준다 (마우스의 각 데이터 포인트에 대하여, 3마리의 동물의 혈청이 혼합되었다).

보체 시스템은 선천적 면역 시스템의 필수적인 구성요소이며 침입하는 병원체에 대한 방어 메커니즘으로서 중요한 역할을 하고, 후천적 면역 반응을 프라이밍하고(prime) 면역 복합체 및 아폽토시스성 세포(apoptotic cell)의 제거를 돕는다. 보체 시스템은 많은 보호적 면역 기능에 있어서 결정적인 역할을 하는 한편, 보체 활성화는 광범위한 자가면역 및 염증 질환 과정에서 조직 손상의 중요한 매개체이다.

본원에서 기술된 본 발명은, 그 중에서도, 비-인간 동물에서 내인성 C5 및/또는 C3 단백질의 야생형 발현과 유사한 농도로 혈청에서 인간 또는 인간화된 C5 및/또는 C3 단백질을 발현하는 비-인간 동물을 제공한다. 인간 또는 인간화된 C5 및/또는 C3 단백질을 발현할 수 있는 비-인간 동물의 성공적인 조작은 대규모 및 고처리량 약물 스크리닝 검정을 처리 가능한 실험실 동물에서 인간 보체 시스템을 반복하는데 필요하고 유용한 도구를 제공한다. 또한 본원에서는 보체 활성화를 조절할 수 있는 화합물을 식별하기 위해 본원에서 기술된 비-인간 동물 (예를 들어, 설치류)을 사용하는 방법이 제공된다. 방법은, 부분적으로는, C5 단백질의 보체 활성이 종-특이적인 한편 (즉, 인간 C5 단백질은 마우스 C5 단백질에 대한 치환이 불가능하다), 인간 C3 단백질의 보체 활성은 마우스 혈청 보체 활성에서 마우스 C3 단백질에 대한 치환이 가능하다는 발명자들의 발견에 기초한다.

일반적인 기술

본 발명의 실시는, 달리 지시되지 않으면, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학, 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이며, 이것들은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 기술들은 문헌, 예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, fourth edition (Sambrook et al., 2012) 및 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001), (본원에서 공동으로 "Sambrook"으로 불림); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2014); PCR : The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Antibodies: A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (Greenfield, ed., 2014), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000, (including supplements through 2014) 및 Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells (Makrides, ed., Elsevier Sciences B.V., Amsterdam, 2003)에서 충분히 설명된다.

정의

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단백질"은 폴리펩타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드의 단편, 및 융합 폴리펩타이드를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "핵산"은 단일 또는 이중 가닥 형태로 함께 공유 결합된 둘 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드 및/또는 리보뉴클레오타이드를 말한다.

"작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터) 및 제2 핵산 서열 간의 기능적 연결을 의미하며, 발현 제어 서열은 제2 서열에 해당하는 핵산의 전사를 지시한다.

유전자 대체에 관한 용어 "대체"는 내인성 유전자좌에 외인성 유전 물질을 배치하여, 내인성 유전자 모두 또는 그 일부를 이종상동성 또는 상동성 핵산 서열로 대체하는 것을 말한다. 한 예에서, 내인성 비-인간 유전자 또는 이것의 단편은 해당하는 인간 유전자 또는 이것의 단편으로 대체된다. 해당하는 인간 유전자 또는 이것의 단편은 대체되는 내인성 비-인간 유전자 또는 이것의 단편의 오쏠로그(ortholog), 상동체이거나, 또는 이것과 구조 및/또는 기능이 실질적으로 동일하거나 같은 인간 유전자 또는 단편이다. 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이, 내인성 비-인간 (예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스) C3 및/또는 C5 유전자좌의 뉴클레오타이드 서열은 인간 C3 및/또는 C5 유전자좌에 해당하는 뉴클레오타이드 서열로 대체되었다. 또 다른 구체예에서, 유전자 대체는 내인성 유전자가 결실되거나 비기능적이게 되고 (예를 들어, 미스센스(missense) 돌연변이 또는 미성숙 종결 코돈의 삽입에 의해) 해당하는 인간 유전자 또는 이것의 단편이 별도의 위치에서 생식세포 계열로 삽입될 때 일어날 수 있다.

용어 "인간화된"은 구절 "인간화된 C3 대립유전자" 또는 "인간화된 C5 대립유전자", 또는 "인간화된 C3 유전자", 또는 "인간화된 C5 유전자"에서 사용된 바와 같이 모든 내인성 비-인간 C3 및/또는 C5 유전자 또는 대립유전자 또는 그 일부가 인간 C3 및/또는 C5 유전자 또는 대립유전자의 해당하는 부분에 의해 대체되는 구체예를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 용어 "인간화된"은 인간 C3 및/또는 C5 유전자 또는 대립유전자의 해당하는 암호화 영역으로 내인성 비-인간 C3 및/또는 C5 유전자 또는 대립유전자의 암호화 영역 (예를 들어, 엑손)의 완전한 대체를 말하는 한편, 비-인간 동물의 내인성 비-암호화 영역(들) (제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 프로모터, 5' 및/또는 3' 비번역 영역(들), 인핸서 요소, 등)은 대체되지 않는다. 일부 구체예에서, 비-인간 동물은 설치류, 예를 들어, 래트 또는 마우스이다.

"인간화된 단백질"은 모든 암호화된 내인성 비-인간 C3 및/또는 C5 단백질 또는 그 일부가 인간 C3 및/또는 C5 단백질의 해당하는 부분에 의해 대체되는 구체예를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, "인간화된 단백질"은 인간화된 C3 및/또는 C5 유전자 또는 대립유전자에 의해 암호화될 수 있지만 완전한 인간 C3 및/또는 C5 단백질을 암호화할 수 있다 (제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 내인성 비-인간 C3 및/또는 C5 유전자 또는 대립유전자의 모든 암호화 영역 (예를 들어, 엑손)이 인간 C3 및/또는 C5 유전자 또는 대립유전자의 해당하는 암호화 영역에 의해 대체되지만 비-인간 동물의 내인성 비-암호화 영역(들) (제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 프로모터, 5' 및/또는 3' 비번역 영역(들), 인핸서 요소, 등)은 대체되지 않는 상황). 일부 구체예에서, 비-인간 동물은 설치류, 예를 들어, 래트 또는 마우스이다.

"조절하다"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 보체 시스템의 활성을 변화시키는 화합물의 능력을 말한다. 한 구체예에서, 화합물에 의한 보체 시스템의 조절은 대상체 (예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스)에서 보체 활성화를 감소시키는 것을 말한다. 또 다른 구체예에서 화합물에 의한 보체 시스템의 조절은 대상체에서 보체-매개된 활성을 증가시키는 것을 말한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "설치류"는 설치목(order rodentia)의 어느 일원을 말한다. 설치류의 예는, 제한 없이, 마우스, 래트, 다람쥐, 프레리도그(prairie dog), 호저(porcupine), 비버, 기니피그, 및 햄스터를 포함한다. 한 구체예에서, 설치류는 래트이다. 또 다른 구체예에서 설치류는 마우스이다.

본원에서 달리 한정되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 업계의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 가진다.

본원에서 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an", 및 "the"는 문맥상 달리 분명하게 지시되지 않으면 복수의 지시대상을 포함한다.

본 명세서 전반에 걸쳐 주어진 모든 최대 수치 한정은 더 낮은 수치 한정이 본원에 명시적으로 기록된 것처럼 모든 더 낮은 수치 한정을 포함하도록 의도된다. 본 명세서 전반에 걸쳐 주어진 모든 최소 수치 한정은 더 높은 수치 한정이 본원에 명시적으로 기록된 것처럼 모든 더 높은 수치 한정을 포함할 것이다. 본 명세서 전반에 걸쳐 주어진 모든 수치 범위는 더 좁은 수치 범위가 본원에 모두 명시적으로 기록된 것처럼 더 넓은 수치 범위 내에 있는 모든 더 좁은 수치 범위를 포함할 것이다.

보체 시스템

면역 시스템의 필수적인 구성요소인 보체는 30개 이상의 혈청 및 두 개의 연결된 생화학적 캐스케이드, 고전적 및 대체 경로에 수반되는 세포성 단백질로 구성된다. 보체는 면역 시스템이 침입하는 미생물을 파괴하고 조직 항상성을 유지하는 것을 보조하는 기능을 한다.

하지만, 보체의 과도한 또는 미조절 활성화는 조직 손상에 기여하고, 보체 활성화에 관련된 다양한 인간 질환, 장애 및 질병, 예를 들어, 안구 염증 및 망막 퇴행성 질환에 관련되어 있다 (Makrides (1998) Therapeutic inhibition of the complement system, Pharmacological Reviews 50(1):59-87; and Mollnes et al. (2006) Strategies of therapeutic complement inhibition, Molecular Immunology 43;107-121 참조). 비정상 보체 활성화와 관련된 것으로 공지된 다른 질환 또는 질병은, 제한 없이, 알레르기성 천식(allergic asthma) 및 동반된 기도 염증 및 기도 과민반응성 (airway hyperresponsiveness; "AHR"), 만성 폐쇄성 폐 질환 (chronic obstructive pulmonary disease; "COPD"), 알레르기성 기관지 아스페르질루스증(allergic bronchopulmonary aspergillosis), 과민성 폐렴(hypersensitivity pneumonia), 호산구성 폐렴(eosinophilic pneumonia), 폐기종(emphysema), 기관지염(bronchitis), 알레르기성 기관지염(allergic bronchitis), 기관지 확장증(bronchiectasis), 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 결핵(tuberculosis), 과민성 폐렴(hypersensitivity pneumonitis), 직업성 천식(occupational asthma), 육종(sarcoid), 반응성 기도 질환 증후군(reactive airway disease syndrome), 간질성 폐질환(interstitial lung disease), 고-호산구성 증후군(hyper-eosinophilic syndrome), 비염(rhinitis), 부비동염(sinusitis), 운동-유발 천식(exercise-induced asthma), 공해-유발 천식(pollution-induced asthma), 기침 이형 천식(cough variant asthma), 기생충성 폐 질환(parasitic lung disease), 호흡기 세포 융합 바이러스 (respiratory syncytial virus; "RSV") 감염, 파라인플루엔자 바이러스 (parainfluenza virus; "PIV") 감염, 리노바이러스 (rhinovirus; "RV") 감염 및 아데노바이러스(adenovirus) 감염, 및 허혈성 재관류 손상(ischemia-reperfusion injury)을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0260198 참조, 이것은 본원에 참고로 포함됨).

보체 C5 유전자 및 단백질

C5 유전자는 혈청 보체 C5 단백질을 암호화하며, 이것은 염증 및 세포 살해 공정에서 중요한 역할을 한다. 성숙한 C5 단백질은 이황화 결합에 의해 연결되는 α 및 β로 구성된다. C5 단백질은 콘버타제에 의해 분열되어, α 폴리펩타이드로부터 유래된 아나필라톡신인 활성화 펩타이드, C5a, 및 β 폴리펩타이드로부터 유래된 거대분자 분열 생성물인 C5b를 발생시키는데, C5a는 대체로 전염증성이고, C5b는 다른 보체 구성요소와 복합체를 형성하여 막 공격 복합체 (MAC)를 형성하며, 이것들은 표적 세포의 삼투성 용해에 수반된다.

인간 C5. 공식적 부호: C5 ; NCBI Gene ID: 727; 1차 공급원: HGNC:1331; RefSeq mRNA ID: NM_001735.2; UniProt ID: P01031; 게놈 조립체: GRCh38; 위치: chr9:120,952,335-121,050,275 - 가닥.

인간 C5 유전자는 염색체 9 상에서, 9q33-q34에 위치한다. 인간 C5 유전자는 41개의 엑손을 가지며, 18개의 아미노산 신호 펩타이드, 655개의 아미노산 β 사슬 및 999개의 아미노산 α 사슬을 포함하는, 길이가 1676개의 아미노산의 전구체 폴리펩타이드를 암호화한다. 보체 활성화 중에, α 사슬이 분열되어, 74개 아미노산의 C5a를 생성하며, 이것은 강력한 전염증성 아나필라톡신이다.

인간에서 C5 결핍은 심각한 재발성 감염에 대한 증가된 민감성에 관련되어 있다.

C5 유전자는 영장류, 예를 들어, 침팬지, 붉은털 원숭이(Rhesus monkey), 다른 포유동물, 예를 들어, 개, 소, 설치류, 예를 들어, 마우스, 닭, 제브라피쉬 및 개구리를 포함하는 여러 종 사이에서 보존된다.

마우스 C5. 공식적 부호: Hc; NCBI Gene ID: 15139; 1차 공급원: MGI:96031; RefSeq mRNA ID: NM_010406.2; UniProt ID: P06684; 게놈 조립체: GRCm38; 위치: chr2:34,983,331-35,061,449 - 가닥.

마우스 C5 유전자는 염색체 2 상에서, 2 23.22 cM에 위치한다. 마우스 C5 유전자는 42개의 엑손을 가지며 18개의 아미노산 신호 펩타이드, 656개의 아미노산 β 사슬 및 1002개의 아미노산 α 사슬을 포함하는 길이가 1680개의 아미노산의 전구체 폴리펩타이드를 암호화한다. 보체 활성화 중에 α 사슬이 분열되어, 77개 아미노산의 C5a를 생성하며, 이것은 강력한 전염증성 아나필라톡신이다.

C5 결핍은 cDNA의 5' 단부 근처에서 일반적인 2개의 염기 쌍 결실을 가지며 이것은 C5가 분비되지 않는 능력을 발생시키고; 따라서, 기능적으로 C5 결핍, 즉, C5 넉아웃인 실험실 마우스의 여러 일반적인 계통에서 발견된다 (이러한 6개의 계통은 A/HeJ, AKR/J, DBA/2J, NZB/B1NJ, SWR/J, 및 B10.D2/oSnJ이다) (예를 들어, Wetzel et al. (1990) Deficiency of the murine fifth complement component (C5): a 2-base pair deletion in a 5' exon, J Biol Chem 265:2435-2440 참조). C5 넉아웃 마우스는 또한 업계에 공지된 표준 과정에 따라 발생될 수 있다.

보체 C3 유전자 및 단백질

C3 유전자는 혈청 보체 단백질 C3를 암호화하며, 이것은 고전적 및 대체 보체 활성화 경로의 활성화에서 중심적인 역할을 한다.

인간 C3 유전자는 염색체 19 상에서 19p13.3-p13.2에 위치한다. 인간 C3 유전자는 41개의 엑손을 가지며 22개의 아미노산 신호 펩타이드, 645개의 아미노산 β 사슬 및 992개의 아미노산 α 사슬을 포함하는 1663개의 아미노산의 전구체 폴리펩타이드를 암호화한다. 보체 활성화 중에 α 사슬이 분열되어, 77개 아미노산 C5a를 포함하는 9개의 다른 펩타이드를 발생시키며, 이것은 강력한 전염증성 아나필라톡신이다.

인간에서 C3 결핍은 박테리아 감염에 대한 증가된 민감성에 관련되어 있다.

C3 유전자는 영장류, 예를 들어, 침팬지, 붉은털 원숭이, 다른 포유동물, 예를 들어, 개, 소, 설치류, 예를 들어, 마우스, 닭, 제브라피시 및 개구리를 포함하는 여러 종 사이에서 보존된다.

마우스 C3 유전자는 염색체 17 상에서 17 29.72 cM19에 위치한다. 마우스 C3 유전자는 41개의 엑손을 가지며 24개의 아미노산 신호 펩타이드, 642개의 아미노산 β 사슬 및 993개의 아미노산 α 사슬을 포함하는 1663개의 아미노산의 전구체 폴리펩타이드를 암호화한다. 보체 활성화 중에 α 사슬가 분열되어, 78개의 아미노산 C3a를 포함하는 9개의 다른 펩타이드를 발생시키며, 이것은 강력한 전염증성 아나필라톡신이다.

C3 넉아웃 마우스는 업계에 공지된 표준 과정에 따라 발생되었다 (예를 들어, Drouin et al. (2001) Cutting edge: the absence of 3 demonstrates a role for complement in Th2 effector functions in a murine model of pulmonary allergy, J Immunology 167:4141-4144 참조).

C5 및 C3 보체 단백질의 종 특이성

본원에서 나타난 바와 같이, 인간화된 C5 마우스는 내인성 보체 단백질의 적어도 일부가 종-특이성을 나타내기 때문에, 기능적으로 C5 결핍된다, 즉, 내인성 마우스 보체 단백질은 인간 C5 단백질과 기능적으로 상호작용할 수 없다. 인간화된 C5 마우스 또는 C5 넉아웃 마우스로부터 얻은 혈청은 보체 활성에 대하여 테스트되었다; 보체 용혈 활성은 인간 C3 및 인간 C5 단백질 둘 다가 추가되지 않으면 관찰되지 않았다.

또한 본원에서 나타난 바와 같이, C3 넉아웃 마우스로부터 얻은 혈청에 인간 C3의 추가는 용혈 기능을 구제할 수 있었다; 보체 활성은 인간 C3 단백질이 혈청에 추가될 때 C3 넉아웃 마우스에서 관찰되었다.

C5 단백질의 보체 활성은 종-특이적이다, 즉, 인간 C5 단백질은 마우스 혈청 보체 활성 (즉, 용혈) 검정에서 마우스 C5 단백질을 치환시킬 수 없다.

C3 단백질의 보체 활성은, 이에 반해서 유사하게 종-특이적인 것으로 나타나지 않는다, 즉, 인간 C3 단백질은 마우스 혈청 보체 활성 (즉, 용혈) 검정에서 마우스 C3 단백질을 치환시킬 수 없다.

보체 시스템의 치료적 억제

치료적 보체 억제를 위한 두 개의 표적은 보체 활성화 펩타이드 C5a 및 C3a이며, 이것들은 보체 활성화시 각각 보체 단백질 C5 및 C3의 고전적 및 대체 경로 둘 다에서 효소적 분열에 의해 생성된다 (Markides (1998); Mollnes et al. (2006) 참조).

예를 들어, 항체, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,355,245에서 개시된 항체에 의한 C5 분열의 차단은 보체 활성화와 관련된 질환에서 보체 억제에 대하여 가능한 치료 계획이다.

인간 C5 및 C3 억제자의 종 특이성

보체 단백질 C5 또는 C3을 표적으로 하는 후보 치료적 분자는 전형적으로 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트에서 약물동력학 (PK) 및 약력학 (PD)에 대하여 평가된다. 이러한 치료적 분자는 또한 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트, 보체 활성화와 관련된 인간 질환, 장애 및 질병의 모델에서 생체 내 치료적 효능에 대하여 테스트된다.

하지만, 인간 보체 단백질 C5 또는 C3에 특이적인 치료적 분자, 즉, 인간-특이적 C5 또는 C3 억제자는 설치류, 특히 마우스에서 PD 또는 생체 내 치료적 효능에 대하여 충분히 평가될 수 없는데, 이 치료적 분자들의 표적이 없기 때문이다. 이 문제는 인간 C5 또는 C3 보체 단백질들의 상기 언급된 종 특이성 때문에 인간 C5 또는 C3 보체 단백질을 발현하는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트를 사용해서는 극복되지 않는다.

따라서, 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트에서 인간-특이적 C5 또는 C3 단백질 길항제 또는 억제자의 PD 및 생체 내 치료적 효능을 평가하기 위해서는, 내인성 C5 및/또는 C3 단백질을 인간 C5 및/또는 C3 단백질로 대체하는 것이 바람직하다. 더욱이, 인간 C5 및/또는 C3 단백질의 잠재적인 과발현 또는 저발현 문제를 방지하기 위해서는, 내인성 C5 및/또는 C3 유전자좌에서 인간 C5 및/또는 C3 유전자를 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트의 게놈으로 삽입하고, 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트에서, 적어도 부분적으로는, 내인성 C5 및/또는 C3 조절 요소의 제어 하에 C5 및/또는 C3 단백질을 발현하는 것이 바람직하다.

인간화된 C3 및/또는 C5 비-인간 동물의 생성

본 발명의 인간화된 C3 및/또는 C5 동물을 발생시키는 방법은 업계에 공지되어 있다 (일반적으로, Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc. (2000) 참조). 한 구체예에서, 마우스의 발생은 선택적으로 쥣과 C3 및/또는 C5 유전자의 붕괴 및 쥣과 게놈으로 인간 또는 인간화된 C3 및/또는 C5를 암호화하는 유전자의 도입을 수반할 수도 있다. 한 구체예에서, 인간 또는 인간화된 C3 및/또는 C5를 암호화하는 유전자의 도입은 내인성 쥣과 C3 및/또는 C5 유전자와 같은 위치에서 이루어진다.

본 발명의 트랜스제닉 비-인간 동물은 동물의 생식세포 계열에 이식 유전자를 도입함으로써 생산될 수 있다. 다양한 발달 단계의 배아 표적 세포가 이식 유전자를 도입하는데 사용될 수 있다. 배아 표적 세포의 발달 단계에 따라 다른 방법이 사용된다. 본 발명을 실시하는데 사용된 어떤 동물의 특이적 라인(들)은 일반적인 양호한 건강, 양호한 배아 수득율, 배아에서 양호한 전핵 가시성, 및 양호한 생식 적합성에 대하여 선택된다. 트랜스제닉 마우스가 생산될 때, 계통, 예를 들어, C57BL/6 또는 C57BL/6 x DBA/2 F₁, 또는 FVB 라인이 종종 사용된다 (Charles River Labs, Boston, Mass., The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 또는 Taconic Labs.로부터 상업적으로 얻어짐).

배아에 이식 유전자의 도입은 업계에 공지된 어떤 수단, 예를 들어, 미세주입법, 전기천공법, 또는 리포펙션에 의해서도 달성될 수 있다. 예를 들어, 이식 유전자(들)는 구조의 미세주입법에 의해 구조의 하나 이상의 카피가 발달 중인 포유동물(들)의 세포 내에 보유되게 하도록 포유류 수정란(들)의 전핵으로 구조의 미세주입에 의해 포유동물로 도입될 수 있다. 수정란으로 이식 유전자 구조의 도입 후, 난은 다양한 시간 동안 시험관 내에서 인큐베이션되거나, 또는 대리 숙주로 재이식되거나, 또는 둘 다 될 수도 있다. 성숙기까지의 시험관 내 인큐베이션은 본 발명의 범위 내에 있다. 한 일반적인 방법은 종에 따라 약 1-7일 동안 시험관 내에서 배아를 인큐베이션한 다음, 그것들을 대리 숙주로 재이식하는 것이다.

재이식은 표준 방법을 사용하여 달성된다. 보통, 대리 숙주가 마취되고, 배아가 난관으로 삽입된다. 특정 숙주로 이식되는 배아의 수는 종마다 다를 것이지만, 보통은 종이 자연적으로 생산하는 자손의 수와 비슷할 것이다.

레트로바이러스 감염이 또한 비-인간 동물로 이식 유전자를 도입하는데 사용될 수 있다. 발달 중인 비-인간 배아는 시험관 내에서 배반포(blastocyst) 단계까지 배양될 수 있다. 이 기간 동안, 할구(blastomere)는 레트로바이러스 감염에 대한 표적이 될 수 있다 (Jaenich, R. (1976) PNAS 73:1260-1264). 할구의 효율적인 감염은 투명대(zona pellucida)를 제거하기 위한 효소적 처리에 의해 얻어진다 (Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986)). 이식 유전자를 도입하는데 사용된 바이러스 벡터 시스템은 전형적으로 이식 유전자를 가지고 있는 복제-결손 레트로바이러스이다 (Jahner et al. (1985) PNAS 82:6927-6931; Van der Putten et al. (1985) PNAS 82:6148-6152).

이식 유전자 도입을 위한 표적 세포의 세 번째 유형은 배아 줄기 (ES) 세포이다. 이식 유전자는 DNA 트랜스펙션 또는 레트로바이러스-매개된 형질 도입에 의해 ES 세포로 효율적으로 도입될 수 있다. 이러한 형질전환된 ES 세포는 그 이후 비-인간 동물의 배반포와 결합될 수 있다. 그 이후 ES 세포는 배아를 배아를 콜로니화하고 결과로 생긴 키메라 동물의 생식세포 계열에 기여한다.

인간화된 C3 및/또는 C5를 포함하는 트랜스제닉 동물은 다른 동물과 교배될 수 있다. 제조 방식은 각각 원하는 구조 또는 이식 유전자 중 하나를 함유하는 일련의 포유동물을 발생시키는 것이다. 이러한 포유동물은 궁극적으로 원하는 구조 및/또는 이식 유전자 모두를 함유하는 단일 포유동물을 발생시키기 위해 일련의 교배, 역교배 및 선택을 통해 함께 교배되는데, 포유동물은 원하는 구조 및/또는 이식 유전자(들)의 존재를 제외하고는 야생형에 대하여 (유전적으로 동일한) 유사유전자형이다. 한 구체예에서, 인간 또는 인간화된 C3 및/또는 C5 유전자를 포함하는 마우스는 이 방식으로 생산된다.

전형적으로는, 교배 및 역교배는 교배 공정에서 각 특정 단계의 목적에 따라 형매(sibling) 또는 부모 계통과 자손을 교미시킴으로써 달성된다. 특정한 경우에는, 적절한 염색체 위치에서 각각의 넉아웃 구조 및/또는 이식 유전자를 함유하는 단일 자손을 발생시키기 위해서 다수의 자손을 발생시키는 것이 필요할 수도 있다. 이에 더하여, 궁극적으로 원하는 유전자형을 얻기 위해 여러 세대에 걸쳐 교배 또는 역교배하는 것이 필요할 수도 있다.

보체 시스템을 조절할 수 있는 화합물을 식별하기 위한 인간화된 C3 및/또는 C5 비-인간 동물의 사용

일부 양태에서, 보체 활성화를 조절할 수 있는 후보 치료적 분자 (즉, 화합물)를 식별하는 방법이 본원에서 제공된다. 방법은 본원에서 개시된 인간화된 C3 및/또는 C5 설치류 (예를 들어, 마우스 또는 래트) 중 어느 것을 이용한다. 일부 구체예에서, 후보 화합물은 보체 활성화의 실험적 유도 (예를 들어, 신장 허혈/재관류 모델에서) 후 설치류에 직접 투여되고 보체 시스템을 조절하는 그것들의 능력에 대하여 상기 화합물의 효과가 평가된다. 다른 구체예에서, 후보 화합물은 이러한 동물들로부터 얻어진 혈청과 접촉되고 보체 활성은 일반적으로 사용되는 어떠한 시험관 내 평가 기술 (예를 들어, CH₅₀ 검정에 제한되지 않음)을 사용하여 평가된다.

일부 구체예에서, 후보 화합물은 보체 활성화를 줄이거나, 감소시키거나, 또는 억제하여 보체 활성화를 조절할 수 있다. 화합물은 후보 화합물이 처리되지 않은 대조군 설치류와 비교할 때 본원에서 개시된 설치류 중 어느 것에서도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 어느 것만큼 보체 활성화를 감소시킬 수 있다.

또 다른 구체예에서 후보 화합물은 최대 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10,시간, 11,시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 48시간, 54시간, 60시간, 66시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 또는 3주 동안 (3주 포함) (이 값들 사이의 어떠한 기간도 포함함) 보체 활성화를 줄이거나, 감소시키거나, 또는 억제할 수 있다.

후보 화합물은 다른 구체예에서 보체 활성을 증가시키거나, 증폭시키거나 또는 활성화시켜 보체 활성화를 더 조절할 수 있다. 화합물은 후보 화합물이 처리되지 않은 대조군 설치류와 비교할 때 본원에서 개시된 설치류 중 어느 것에서도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 어느 것만큼 보체 활성화를 증가시킬 수 있다.

또 다른 구체예에서 후보 화합물은 최대 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10,시간, 11,시간, 12시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 48시간, 54시간, 60시간, 66시간, 72시간, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 또는 3주 동안 (3주 포함) (이 값들 사이의 어떠한 기간도 포함함) 보체 활성을 증가시키거나, 증폭시키거나 또는 활성화시킬 수 있다.

후보 화합물은, 제한 없이, 소분자 화합물, 항체, 단백질, 억제 핵산, 또는 이것들의 어떤 조합일 수 있다.

1. 항체

일부 양태에서, 후보 화합물은 보체 단백질 (제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, C5 또는 C3 (예를 들어, C3a))에 결합하며 (예를 들어, 우선적으로 결합하며) 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 C5 및/또는 C3 길항제이며 보체 활성화를 감소시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 항체는 C5 및/또는 C3 작용제이며 보체 활성화를 증가시킬 수 있다.

항체의 변종은 또한 업계에 공지된 정보를 기반으로 하여 만들어질 수 있으며, 항체의 활성에 실질적으로 영향을 미친다. 예를 들어, 항체 변종은 다른 잔기에 의해 대체된 항체 분자에서 적어도 하나의 아미노산을 가질 수 있다. 항체에 대하여, 치환형 돌연변이 유발을 위해 가장 원하는 부위는 일반적으로 초가변 영역을 포함하지만, 프레임워크 영역 (FR) 변화 또한 고려된다.

항체에 대하여, 치환형 변종의 한 유형은 모체 항체 (예를 들어, 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기의 치환을 수반한다. 일반적으로, 추가의 발달을 위해 선택된 결과로 생긴 변종(들)은 그것들이 발생하는 모체 항체에 비해 개선된 생물학적 성질을 가질 것이다. 이러한 치환형 변종을 발생시키기 위한 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용하는 친화도 성숙을 수반한다. 간략히 말하면, 여러 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6-7개의 부위)가 돌연변이되어 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환을 발생시킨다. 따라서 생성된 항체는 각 입자 내에 포장된 M13의 유전자 III 생성물로의 융합으로서 사상 파지 입자로부터 디스플레이된다. 파지 디스플레이된 변종은 그후 본원에서 개시된 바와 같이 그것들의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대하여 스크리닝된다. 변형되는 후보 초가변 영역 부위를 식별하기 위해서, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발이 수행되어 항원 결합에 크게 기여하는 초가변 영역 잔기를 식별할 수 있다.

항체의 아미노산 서열 변종을 암호화하는 핵산은 업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법들은 천연 공급원으로부터 분리 (자연 발생 아미노산 서열 변종의 경우에) 또는 항체의 조기 제조된 변종 또는 비-변종 버전의 올리고뉴클레오타이드-매개된 (또는 부위-지향성) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발, 및 카세트 돌연변이 유발을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 면역글로불린 폴리펩타이드의 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 변형을 도입하여, Fc 영역 변종을 발생시키는 것이 바람직할 수도 있다. Fc 영역 변종은 힌지(hinge) 시스테인의 서열을 포함하는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수도 있다.

변화된 (즉, 개선된 또는 감소된) Clq 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 가지는 Fc 영역 변종은 국제 특허 출원 공개 번호 W099/51642에서 기술된다 (본원에 참고로 포함됨). 이러한 변종은 Fc 영역의 아미노산 위치 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수도 있다. 또한, Fc 영역 변종에 관하여 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 국제 특허 출원 공개 번호 W094/29351을 참조하면 되며, 이것들 각각의 개시물은 본원에 참고로 포함된다.

2. 비-항체 결합 폴리펩타이드

일부 양태에서, 후보 화합물은 보체 단백질 (예를 들어, C5 또는 C3 (예를 들어, C3a))에 결합하며 (예를 들어, 우선적으로 결합하며) 비-항체 결합 폴리펩타이드이다. 일부 구체예에서, 비-항체 결합 폴리펩타이드는 C5 및/또는 C3 길항제이며 보체 활성화를 증가시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 비-항체 결합 폴리펩타이드는 C5 및/또는 C3 작용제이며 보체 활성화를 증가시킬 수 있다.

결합 폴리펩타이드는 공지된 폴리펩타이드 합성 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수도 있거나 재조합 기술을 사용하여 제조되고 정제될 수도 있다. 결합 폴리펩타이드는 보통 길이가 적어도 약 5개의 아미노산, 대안으로 길이가 적어도 약 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 아미노산 이상이며, 이러한 결합 폴리펩타이드는 표적, 예를 들어, 본원에서 논의된 보체 단백질 중 어느 것 (예를 들어, C5 또는 C3)에 결합할 수 있다.

결합 폴리펩타이드는 공지된 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 식별될 수도 있다. 이 점에 있어서, 폴리펩타이드 표적에 결합할 수 있는 결합 폴리펩타이드에 대한 폴리펩타이드 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 업계에 공지되어 있다고 한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT 출원 공개 번호 WO 84/03506 및 WO84/03564; Geysen et al, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A ., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 82: 178-182 (1985); Geysen et al., J. Immunol . Meth, 102:259-274 (1987); Clackson, T. et al., (1991) Nature, 352: 624; Kang, A.S. et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, 및 Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol, 2:668을 참조하면 되며, 이것들 각각의 개시물은 본원에 참고로 포함된다.

펩타이드 라이브러리를 생성하고 이 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 또한 미국 특허 번호 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, 및 5,723,323에 개시되어 있으며, 이것들 각각의 개시물은 본원에 참고로 포함된다.

결합 폴리펩타이드는 그것들의 억제 및/또는 치료 효과를 향상시키도록 변형될 수 있다 (예를 들어, 향상된 친화도, 개선된 약물동력학적 성질, 예를 들어, 반감기, 안정성, 및 클리어런스 율(clearance rate), 감소된 독성, 등 포함). 이러한 변형은, 제한 없이, 글리코실화, peg화, 비-자연적으로 발생하지만 기능적으로 동등한 아미노산으로의 치환, 연결기, 등을 포함한다.

3. 소분자

일부 양태에서, 후보 화합물은 보체 단백질 (예를 들어, C5 또는 C3 (예를 들어, C3a))에 결합하며 (예를 들어, 우선적으로 결합하며) 소분자이다. 일부 구체예에서, 소분자는 C5 및/또는 C3 길항제이며 보체 활성화를 감소시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 소분자는 C5 및/또는 C3 작용제이며 보체 활성화를 증가시킬 수 있다.

소분자는 본원에서 한정된 바와 같이 바람직하게는 결합 폴리펩타이드 또는 항체 이외의 유기 분자이다. 유기 소분자는 공지된 방법론을 사용하여 식별되고 화학적으로 합성될 수도 있다 (예를 들어, PCT 출원 공개 번호 WO 00/00823 및 WO 00/39585 참조). 유기 소분자는 보통 크기가 약 2000 달톤 미만, 대안으로 크기가 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만이며, 본원에서 기술된 바와 같이 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 이러한 유기 소분자는 공지된 기술을 사용하여 과도한 실험 없이 식별될 수도 있다. 이 점에 있어서, 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 분자에 대한 유기 소분자 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 업계에 공지되어 있다고 한다 (예를 들어, PCT 출원 공개 번호 WO 00/00823 및 WO 00/39585 참조).

유기 소분자는, 예를 들어, 알데하이드, 케톤, 옥심, 히드라존, 세미카바존, 카바지드, 1차 아민, 2차 아민, 3차 아민, N-치환된 히드라진, 히드라지드, 알콜, 에테르, 티올, 티오에테르, 디설피드, 카르복실산, 에스터, 아미드, 우레아, 카바메이트, 카보네이트, 케탈, 티오케탈, 아세탈, 티오아세탈, 아릴 할리드, 아릴 설포네이트, 알킬 할리드, 알킬 설포네이트, 방향족 화합물, 헤테로환식 화합물, 아닐린, 알켄, 알킨, 디올, 아미노 알콜, 옥사졸리딘, 옥사졸린, 티아졸리딘, 티아졸린, 에나민, 설폰아미드, 에폭시드, 아지리딘, 아이소시아네이트, 설포닐 클로라이드, 디아조 화합물, 산 클로라이드, 등일 수도 있다.

일부 양태에서, 소분자 화합물은 조합 화학적 라이브러리의 구성요소이다. 조합 화학적 라이브러리는 더 작은 서브유닛 또는 모노머로 구성된 화합물의 다수의 종의 컬렉션이다. 조합 라이브러리는 다양한 크기로 제공되며, 수백 개 내지 수 십만 개의 다른 종의 화합물의 범위에 있다. 또한 화합물, 예를 들어, 탄수화물, 올리고뉴클레오타이드, 및 유기 소분자, 등으로 구성된 올리고머 및 폴리머 라이브러리를 포함하는 다양한 라이브러리 유형이 있다. 이러한 라이브러리는 다양한 용도, 예를 들어, 화합물의 고정화 및 크로마토그래피에 의한 분리, 뿐만 아니라 표적 분자 (예를 들어, C5 및/또는 C3)에 결합할 수 있는 리간드를 식별 및 특성 검정하거나 원하는 생물학적 활성을 매개하기 위한 (제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 보체 활성의 억제 또는 활성화) 용도를 가진다.

고체상 지지물 상에서 화합물의 라이브러리를 합성하기 위한 다양한 기술들이 업계에 공지되어 있다. 고체상 지지물은 전형적으로 라이브러리의 화합물을 형성하기 위해 서브유닛 또는 모노머와 결합하도록 기능화된 표면을 가진 폴리머 대상이다. 하나의 라이브러리의 합성은 전형적으로 다수의 고체상 지지물을 수반한다. 조합 라이브러리를 만들기 위해, 고체상 지지물은 화학 반응의 조심스럽게 제어되고, 사전 결정된 서열에서 하나 이상의 시약 및 화합물의 하나 이상의 서브유닛과 반응된다. 다시 말해서, 라이브러리 서브유닛은 고체상 지지물 위에서 성장한다. 라이브러리가 더 클수록, 필요한 반응의 수가 더 크며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 다수의 종의 화학적 조성물을 추적하는 과제를 복잡하게 만든다. 일부 구체예에서, 소분자는 크기가 약 2000 달톤 미만, 대안으로 약 1500, 750, 500, 250 또는 200 달톤 미만이다.

본원의 양태들 중 어느 것에서도 기술된 소분자 약제는 고체 지지물 상에서 수행될 수 있는 어떤 유형의 화학 반응으로부터 유래될 수 있다. 이러한 하학 반응은 부타디엔의 트래핑(trapping)을 포함하는 2+2 사이클로 부가(cycloaddition); 아이속사졸린, 푸란 및 변형된 펩타이드의 합성을 포함하는 [2+3] 사이클로 부가; 디올, 알데하이드 및 케톤의 고정화를 포함하는 아세탈 형성; 알데하이드의 유도체화, 프로판디올의 합성을 포함하는 알돌 축합; 알데하이드의 유도체화를 포함하는 벤조인 축합; 벤조디아제핀 및 히단토인, 티아졸리딘, 턴 유사체(turn mimetic), 포르피린, 프탈로시아닌을 포함하는 사이클로 축합; 다이에스터의 환화를 포함하는 디크만 환화(Dieckmann cyclization); 아크릴산의 유도체화를 포함하는 딜스-알더 반응(Diels-Alder reaction); 알켄으로의 알콜의 첨가를 포함하는 친전자성 첨가 반응; 알데하이드의 유도체화를 포함하는 그리나르 반응(Grignard reaction); 2치환된 알켄의 합성을 포함하는 헥 반응(Heck reaction); 제자리에서 나이트릴 옥사이드의 합성을 포함하는 앙리 반응(Henry reaction) (2+3 사이클로 부가 참조); 페로몬 및 펩타이드의 합성을 포함하는 촉매 수소화 (알켄의 수소 첨가); 설파닐 케톤, 바이사이클로[2.2.2]옥탄의 합성을 포함하는 마이클 반응(Michael reaction); 아릴 에테르, 펩티딜 포스포네이트 및 티오에테르의 합성을 포함하는 미츠노부 반응(Mitsunobu reaction); 퀴놀론의 합성을 포함하는 친핵성 방향족 치환; 알데하이드 및 케톤의 합성을 포함하는 산화; 펜티놀을 이용한 노르보나디엔의 환화를 포함하는 포슨-칸드(Pausen-Khand) 사이클로 부가; 헬리센의 합성을 포함하는 광화학적 환화; 알데하이드 및 아실 클로라이드의 유도체화를 포함하는 유기 금속 화합물과의 반응; 카르보닐, 카르복실산, 에스터 및 나이트로 기의 환원을 포함하는 착수소화물(complex hydride) 및 주석 화합물을 이용한 환원; 카르복실 기의 환원을 포함하는 소아이 반응(Soai reaction); 바이페닐 유도체의 합성을 포함하는 스틸레 반응(Stille reaction); 치환된 사이클로헥사논의 합성을 포함하는 스토크 반응(Stork reaction); 퀴놀론의 합성을 포함하는 환원성 아미노화; 페닐아세트산 유도체의 합성을 포함하는 스즈키 반응(Suzuki reaction); 및 알데하이드, 페로몬, 및 설파닐 케톤의 반응을 포함하는 비티히-호너 반응(Wittig-Horner reaction)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

화학적 라이브러리의 합성뿐 아니라 개개의 고체상 지지물로 상기 라이브러리의 개개의 화합물의 디콘볼루션(deconvolution)을 개시하는 참고문헌은 미국 특허 출원 번호 2009/0032592; Needels et al., (1993), Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 10700-10704; 및 PCT 출원 공개 번호 WO 97/15390에서 발견될 수 있으며, 이것들의 개시물은 본원에 참고로 포함된다.

4. 억제 핵산

본 발명의 한 양태에서, 후보 보체 조절 화합물은 보체 시스템의 구성요소 (예를 들어, mRNA)에 표적화된 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드이다. 억제 핵산은, 제한 없이, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 작은 억제 RNA (siRNA), 또는 리보자임 중 어느 것도 될 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 보체 시스템의 단백질 구성요소를 암호화하는 mRNA일 수도 있다. 올리고뉴클레오타이드는 mRNA에 결합하고 mRNA의 파괴를 매개하거나 단백질로의 번역을 방지함으로써 그것들의 기능을 방해할 것이다. 완벽한 상보성은, 바람직하지만, 필요한 것은 아니다. RNA의 일부에 "상보적"인 올리고뉴클레오타이드 서열은, 본원에서 언급된 바와 같이, RNA와 교잡하여, 안정한 듀플렉스(duplex)를 형성할 수 있을 정도로 충분한 상보성을 가진 서열을 의미한다. 교잡 능력은 올리고뉴클레오타이드의 상보성의 정도 및 길이 둘 다에 의존적일 것이다. 일반적으로, 교잡 핵산이 더 길수록, 그것은 RNA와의 더 많은 염기 불일치를 함유하며 여전히 안정한 듀플렉스를 형성할 수도 있다. 당업자들은 교잡된 복합체의 녹는점을 결정하기 위해 표준 과정을 사용하여 용인 가능한 불일치의 정도를 확인할 수 있다.

일반적으로, 보체 시스템의 단백질에 대한 mRNA와 교잡하도록 제작된 상보적 올리고뉴클레오타이드는 mRNA의 5' 비번역 영역, AUG 개시 코돈의 보체, 또는 3' 비번역 영역을 포함하는 mRNA의 어떠한 영역에도 표적화된다.

올리고뉴클레오타이드, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 포스포로티오에이트 (Mag at al., Nucleic Acids Res. 19:1437-1441, 1991; 및 미국 특허 번호 5,644,048), 펩타이드 핵산 또는 PNA (Egholm, Nature, 3685:566-568, 1993; 및 미국 특허 번호 6,656,687), 포스포르아미드 (Beaucage, Methods Mol . Biol. 20:33-61, 1993), 포스포로디티오에이트 (Capaldi et al., Nucleic Acids Res., 28:E40, 2000)는 대안의 뉴클레오사이드 간 연결을 가질 수 있다. 다른 올리고뉴클레오타이드 유사체는, 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 모르폴리노 (Summerton, Biochim . Biophys . Acta, 1489:141-158, 1999), 잠금 올리고뉴클레오타이드 (Wahlestedt wt al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 97:5633-5638, 2000), 펩티드형 핵산 또는 PNA (Nielsen et al., 1993; Hyrup and Nielsen, 1996) 또는 2-o-(2-메톡시)에틸 변형된 5' 및 3' 단부 올리고뉴클레오타이드 (McKay et al., J. Biol . Chem ., 274:1715-1722, 1999)를 포함한다. 이 모든 참고문헌들은 분명하게 본원에서 참고로 포함된다. 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오타이드의 어떤 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔타닌, 하이포잔타닌, 아이소시토신, 아이소구아닌, 등을 포함하는 염기의 어떤 조합을 함유할 수도 있다.

본 발명에 따르는 상보적 올리고뉴클레오타이드는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록실메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오유리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신. N6-아이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-아이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 위부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스터, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N2-카르복시프로필)우라실, (acp3)_w, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변형된 염기 모이어티를 포함할 수도 있다.

상보적 올리고뉴클레오타이드는 또한 아라비노스, 2-플루오로아라비노스, 자일룰로스, 및 헥소스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 변형된 당 모이어티를 포함할 수도 있다.

상보적 올리고뉴클레오타이드는 길이가 적어도 10개의 뉴클레오타이드여야 하고, 길이가 10 내지 약 50개의 뉴클레오타이드의 범위, 예를 들어, 길이가 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개의 뉴클레오타이드일 수도 있다.

후보 화합물의 효능 평가

주어진 비-인간 동물 (예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트)에서 후보 보체 조절 화합물의 치료적 효능, 적절한 투약량, 및 본 발명의 방법은 당업자에게 공지되어 있는 시험관 내 보체 검정에 따라 결정될 수 있다. 보체 경로는 정상적인 활성화 과정 중에 많은 특이적 생성물을 생성하였고 민감성 및 특이적 검정이 개발되었으며 작은 활성화 단편 C3a, C4a, 및 C5a 및 큰 활성화 단편 Bb 및 sC5b-9를 포함하는 이 활성화 생성물 대부분에 대하여 상업적으로 이용 가능하다. 이 검정들 대부분은 그것들이 형성되는 고유한 단백질 상에서가 아니라, 보체 단편 상에서 노출된 새로운 항원과 반응하는 단클론성 항체를 이용하며, 이 검정을 더 간단하고 특이적으로 만든다. ELISA 기술은 특히 일반적이지만, 방사선면역검정 (RIA)이 또한 C3a 및 C5a의 검출에 사용된다. 이러한 후자의 검정은 미가공된 단편 및 그것들의 가공된 단편 (즉, 순환에서 발견된 주요 형태) 둘 다를 측정한다. C3a의 측정은 보체 활성화의 민감성, 경로-독립적 지표를 제공한다.

막 공격 경로 활성화의 유체상 생성물, sC5b-9의 검출은 완료될 때까지 보체가 활성화되고 있다는 증거를 제공한다. 또한, 고전적 경로는 또한 C4a를 생성하는데, 이것의 측정은 C3b 억제자의 활성 및 이러한 억제자가 고전적 경로를 활성화시키고 있는지에 대한 정보를 제공한다. 이에 더하여, 보체 활성화의 여러 생체 내 모델은 또한 당업자들이 보체 시스템을 조절하는 후보 화합물의 능력을 평가하는데 이용 가능하다. 예를 들어, 보체 시스템은 허혈성 이벤트 및 혈류의 차후 복구 이후에 지속되는 허혈성 재관류 손상에 관련되어 있다. 허혈성 재관류 손상을 유발할 수 있는 손상의 예는, 제한 없이, 심근 경색(myocardial infarction), 뇌 경색 이벤트(cerebral ischemic event), 장 허혈(intestinal ischemia), 및 혈관 수술, 심장 수술, 외상, 및 이식의 많은 양태를 포함한다. 보체 시스템의 활성화는 허혈성 재관류 손상의 염증 이벤트에서 역할을 한다. 허혈 손상은 세포막의 변화를 초래하여, 노출된 에피토프들이 변화되어 신생항원 (변형된 자가 항원)의 역할을 할 수 있도록 외부 표면의 지질, 탄수화물, 또는 단백질에 영향을 미친다. 허혈성 재관류 손상에 대한 보체의 고전적 경로의 관여는 뒷다리 및 손상의 동물 모델의 국소적 손상으로부터 동등한 보호를 나타내는, 유전적으로 C3 또는 C4가 결핍된 마우스에 의해 증명된다 (Austen et al. (2003) Int J Immunopath Pharm 16:1). 추가적으로, 보체 활성화는 또한 허혈 손상의 신장 모델에 수반되는 것으로 나타났다 (Guo et al. (2005) Ann Rev Immunol 23:821).

본 발명은 하기 실시예를 참조하면 더 이해될 수 있으며, 실시예들은 예시의 방법에 의해 제공되고 제한하려는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

인간 C5 유전자로 내인성 마우스 C5 유전자의 대체

인간 C5 유전자의 암호화 엑손 2 내지 42를 함유하는 97 kb 인간 C5 유전자는 암호화 엑손 2 내지 41에 걸쳐 있고 3' 비번역 영역의 일부를 포함하는, 75.8 kb의 쥣과 C5 유전자좌를 대체하였다. 도 1 참조.

단일 표적화 단계에서 마우스 C5 유전자를 인간 C5 유전자로 대체하기 위한 표적화 구조를 VelociGene® 유전적 조작 기술을 사용하여 구성하였다 (Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659 참조). 마우스 및 인간 C5 DNA를 각각 박테리아 인공 염색체 (BAC) 클론 bMQ-2277L16 및 CTD-2559I19로부터 얻었다. 간략히 말하면, 암호화 엑손 2 내지 암호화 엑손 41의 바로 업스트림 상의 인트론 1 및 3' 비번역 영역으로부터 연장된 97 kb 인간 C5 서열에 플랭킹하는(flanking) 마우스 C5 업스트림 및 다운스트림 상동성 팔 (게놈 좌표: GRCh38: chr9:120,952,335-121,050,276 (-가닥)) 및 플록스된(floxed) neo 선택 카세트를 함유하는 간극 회복(gap repair cloning) 클로닝에 의해 생성된 선형화된 표적화 구조를 F1H4 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 (C57BL/6 x 129 F1 하이브리드(hybrid))에 전기천공하였다. 올바르게 표적화된 ES 세포 (MAID 7140)를 일과성 Cre-발현 벡터로 추가로 전기천공하여 약물 선택 카세트를 제거하였다. 약물 카세트가 없는 표적화된 ES 세포 클론 (MAID 7141)을 VelociMouse® 방법에 의해 8-세포 단계 SW 마우스에 도입하였다 (미국 특허 번호 7,294,754, 7,576,259, 7,659,442, 및 Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99 참조). 인간화된 C5 유전자를 함유하는, VelociMice® (공여체 ES 세포로부터 완전히 유래된 F0 마우스)을 대립유전자 검정의 변형을 사용하여 마우스 대립유전자의 손실 및 인간 대립유전자의 획득에 대하여 유전자형 분석함으로써 식별하였다 (Valenzuela et al. (2003) 참조).

올바르게 표적화된 ES 세포 클론을 고유한 대립유전자의 손실 (LONA) 검정에 의해 식별하였으며 (Valenzuela et al. 2003) 이것에서 고유한 비변형 C5 유전자의 카피의 수를 결실에 대하여 표적화된 마우스 C5 유전자의 서열에 특이적인 두 번의 TaqMan™ 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에 의해 결정하였다. qPCR 검정은 다음 프라이머-프로브 세트 (5'에서 3'으로 작성됨)를 포함하였다: 업스트림 정방향 프라이머, CCTCCGGTTA ACTGGTTTGT GAT (서열 번호:1); 업스트림 역방향 프라이머, GCAGTGAATG GTAGACTTCC CA (서열 번호:2); 업스트림 프로브, FAM-AGTGACTTTA CTTTGGTTGT TCTGCTCACA-BHQ (서열 번호:3); 다운스트림 정방향 프라이머, CCGGGAAAGG AAACCAAGAC (서열 번호:4); 다운스트림 역방향 프라이머, CAGCACAGAC TGAGGATCCA A (서열 번호:5); 다운스트림 프로브, FAM-AGACTGTCAT TCTGGCCCGG ACCT-BHQ (서열 번호:6); 이것들에서 FAM은 5-카르복시플루오레세인 형광 프로브를 말하고 BHQ는 블랙홀 소광제(quencher) 유형의 형광 소광제를 말한다 (Biosearch Technologies). 표적화 벡터를 차지한 ES 세포 클론으로부터 정제되고 그것들의 게놈에 포함되는 DNA를 제조사의 제안에 따라 384-웰 PCR 플레이트 (MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate, Life Technologies)에서 TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Life Technologies)와 결합시켰고 PCR의 과정 중에 형광 데이터를 수집하고 역치 주기 (Ct), 축적된 형광성이 사전 설정된 역치에 도달하는 단편적인 PCR 주기를 결정하는 Applied Biosystems Prism 7900HT에서 순환시켰다. 업스트림 및 다운스트림 C5-특이적 qPCR 및 비-표적화된 참조 유전자에 대한 두 번의 qPCR을 각 DNA 샘플에 대하여 실행하였다. 각각의 C5-특이적 qPCR 및 각각의 참조 유전자 qPCR 간의 Ct 값의 차이 (ΔCt)를 계산한 다음, 검정된 모든 샘플에 대하여 각각의 ΔCt 및 중간 ΔCt 간의 차이를 계산하여 각 샘플에 대한 ΔΔCt 값을 얻었다. 각 샘플에서 C5 유전자의 카피 수를 다음 식으로부터 계산하였다: 카피 수 = 2 x 2^- ^ΔΔCt. 올바르게 표적화된 클론은, 고유한 카피 중 하나가 손실되었으며, 1과 같은 C5 유전자 카피 수를 가질 것이다. 인간 C5 유전자 서열이 인간화된 대립유전자에서 결실된 마우스 C5 유전자 서열을 대체하였다는 확인을 다음 프라이머-프로브 세트 (5'에서 3'으로 작성됨)를 포함하는 TaqMan™ qPCR 검정으로 확인하였다: 인간 업스트림 정방향 프라이머, TGCTCTTAAA GGACCATCAT CAC (서열 번호:7); 인간 업스트림 역방향 프라이머, GTAAACGGAT AACGGAAAGG ATAGA (서열 번호:8); 인간 업스트림 프로브, FAM-CCATTTCCAA ATGCACTTCC CAGC-BHQ (서열 번호:9); 인간 다운스트림 정방향 프라이머, CCCACTGAAC TATCACAGGA AACA (서열 번호:10); 인간 다운스트림 역방향 프라이머, GGAGATGCAT TCCAGTCTCT GTTA (서열 번호:11); 인간 다운스트림 프로브, FAM-TGAAGATGAC CTCCGGATGT AACGG-BHQ (서열 번호:12).

같은 LONA 검정을 사용하여 표적화된 ES 세포로부터 유래된 마우스에 대하여 그것들의 C5 유전자형을 결정하기 위해서 꼬리 생검으로부터 정제된 DNA를 검정하고 인간화된 C5 대립유전자가 생식 계열을 통해 전송된다는 것을 확인한다. 대체에 대하여 이형 접합성인 두 마리의 새끼들을 교배하여 인간 C5 유전자에 의한 내인성 마우스 C5 유전자의 대체에 대하여 동형 접합성인 마우스를 발생시킨다. 대체에 대하여 동형 접합성인 새끼들을 표현형 분석에 사용한다.

쥣과 유전자좌 및 인간 C5 유전자를 함유하는 서열의 업스트림 접합부는 5'-TGAAAAACCT CCATTACTAC TTCTACAGAT GCCCACAGTG GTCTTGCATT CTATCCTTGT /(GCGATCGC)/ TCTGCCATCT CCTACTAGGC ATGTGGGGAA GGGGAATTCA GATGATGGTT GGAAATCTGG AAATTCTTTC CTCTCTTTTG TAATTTGCCT (서열 번호:13) 내에 있도록 디자인되며, 인간 C5 유전자의 첫 번째 뉴클레오타이드 이전의 마지막 마우스 C5 뉴클레오타이드는 CTTGT에서 마지막 T이고, 인간 C5 서열의 첫 번째 뉴클레오타이드는 TCTGC에서 첫 번째 T이며, 이것들은 AsiSI 부위 (괄호 내)에 걸쳐있고, 정확한 접합부는 사선으로 표시된다. 인간 C5 유전자 및 플록스된 neo 선택 카세트를 함유하는 서열의 다운스트림 접합부는 5'-GCAAATAGGG CAGGCCACAG TGGCCTAATT AACCCACAAT GCAGCTGTCA AATATCAAAG AAGGTTTTGT GAATTAGCCT/CTCGAGATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG (서열 번호:14) 내에 있도록 디자인되며, 인간 C5 서열의 마지막 뉴클레오타이드는 AGCCT에서 T이고, 플록스된 neo 선택 카세트의 첫 번째 뉴클레오타이드는 CTCGA에서 첫 번째 C이며, 정확한 접합부는 사선으로 표시된다. 쥣과 C5 유전자좌의 서열의 다운스트림 접합부는 5'-ATGTCTGGAA TAACTTCGTA TAATGTATGC TATACGAAGT TATGCTAGTA ACTATAACGG TCCTAAGGTA GCGAGCTAGC/CAGGCTATTA GGCTTCTGTC CCCAACTGTG GTGGCAAATA GGCCAGACCA CAGTCACCAG ATGAAGCCAT AAATGCAGCT (서열 번호:15) 내에 있도록 디자인되며, 플록스된 neo 선택 카세트의 마지막 뉴클레오타이드는 CTAGC에서 두 번째 C이고, 쥣과 C5 유전자와의 첫 번째 뉴클레오타이드는 CAGGC에서 첫 번째 C이며, 정확한 접합부는 사선으로 표시된다. 인간 C5 유전자를 함유하는 서열 및 쥣과 유전자좌의 다운스트림 접합부는 5'-GCAAATAGGG CAGGCCACAG TGGCCTAATT AACCCACAAT GCAGCTGTCA AATATCAAAG AAGGTTTTGT GAATTAGCCT/CTCGAG(ATAA CTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT) GCTAGTAACT ATAACGGTCC TAAGGTAGCG AGCTAGC/CA GGCTATTAGG CTTCTGTCCC CAACTGTGGT GGCAAATAGG CCAGACCACA GTCACCAGAT GAAGCCATAA ATGCAGCTGA (서열 번호:16) 내에 있도록 디자인되며, 인간 C5 서열의 마지막 뉴클레오타이드는 AGCCT에서 "T"이고, 마우스 C5 서열의 첫 번째 뉴클레오타이드는 CAGGC에서 첫 번째 "C"이며; 이것들은 플록스된 neo 선택 카세트 제거 후에 남아있는 loxP 부위 (괄호 내)에 걸쳐 있으며, 정확한 접합부는 사선으로 표시된다.

실시예 2

인간 C3 유전자로 내인성 마우스 C3 유전자의 대체

버전 1 - 인간 C3 프로모터 및 암호화 엑손 1 내지 41로의 대체

5' 조절 요소 및 인간 C3 유전자의 암호화 엑손 1 내지 41 모두를 함유하는 인간 C3 유전자는 5' 조절 요소 및 암호화 엑손 2 내지 41 모두에 걸쳐 있는 쥣과 C5 유전자좌를 대체하였다. 기본적으로 상기 실시예 1에서 기술된 방법을 사용하여 마우스 C3 유전자 서열을 인간 C3 유전자 서열로 대체하였다. 도 2A 참조.

예비적으로, 폴리아데닐화 부위에 대한 3'의 900 bp를 포함하는 암호화 엑손 2 내지 41의, 플록스된 neo 카세트로의 대체에 의해 25 kb의 마우스 C3 유전자의 표적화된 결실을 마우스 ES 세포에서 발생시켰다. 결과의 마우스 ES 세포, 12132 ES 세포는 이형 접합성 C3 넉아웃이다. 12132 세포를 사용하여 업계에 공지된 과정에 따라 C3 넉아웃 마우스를 생성하였다.

암호화 엑손 1 내지 암호화 엑손 41 및 3' 비번역 영역의 업스트림에서 5' 조절 요소로부터 연장된 인간 C3 서열을 플랭킹하는 마우스 C3 업스트림 및 다운스트림 상동성 팔 및 플록스된 hygro 선택 카세트를 함유하는 표적화 구조를 생성하였고, 12132 ES 세포로 전기천공하였다. 올바르게 적화된 ES 세포 (MAID 6148)를 일과성 Cre-발현 벡터로 추가로 전기천공하여 약물 선택 카세트를 제거하였다. 약물 카세트가 없는 표적화된 ES 세포 클론 (MAID 6149)을 8-세포 단계 마우스 배아로 도입하였다. 인간화된 C3 유전자를 함유하는 공여체 ES 세포로부터 완전히 유래된 F0 마우스를 실시예 1에서 기술된 바와 같이 마우스 대립유전자의 손실 및 인간 대립 유전자의 획득에 대하여 유전자형 분석에 의해 식별하였다.

플록스된 neo 카세트가 C3 넉아웃 12132 ES 세포에서 검출된 마우스 C3 유전자 서열을 대체하였다는 확인을 다음 프라이머-프로브 세트 (5'에서 3'으로 작성됨)를 포함하는 TaqMan™ qPCR 검정에 의해 확인하였다: 12132TU, 마우스 C3 인트론 1: 정방향 프라이머, GGCCTGATTA CATGGACCTG TC (서열 번호:17); 역방향 프라이머, CCCAGGCTTG GCTGGAATG (서열 번호:18); 프로브, FAM-TGTCCACTCT GGAAGCCCAG GC-BHQ (서열 번호:19); 12132TD, 마우스 C3 엑손 41의 3': 정방향 프라이머, GCCAGGAGAG GAAGCTGGAG (서열 번호:20); 역방향 프라이머, TGGCTCAGCA GTAAAGAACA C (서열 번호:21); 프로브, FAM-ACAGATTGCT GTGAGCTGCC CAAA-BHQ (서열 번호:22); neo 카세트: 정방향 프라이머, GGTGGAGAGG CTATTCGGC (서열 번호:23); 역방향 프라이머, GAACACGGCG GCATCAG (서열 번호:24); 프로브, FAM-TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG-BHQ (서열 번호:25).

인간 C3 유전자 서열이 인간화된 대립유전자에서 검출된 마우스 C3 유전자 서열을 대체하였다는 확인을 다음 프라이머-프로브 세트 (5'에서 3'으로 작성됨)를 포함하는 TaqMan™ qPCR 검정에 의해 확인하였다: mC3-1, 마우스 C3 프로모터: 정방향 프라이머, GCCAGCCTAG CCTACTTCA (서열 번호:26); 역방향 프라이머, GCCACCCATC CCAGTTCT (서열 번호:27); 프로브, FAM- CAGCCCAGGC CCTTTAGATT GCA-BHQ(서열 번호:28); mC3-2, 마우스 C3 3' 비번역 영역, 정방향 프라이머, TACGGTGTTA GGTTCACTAT TGGT (서열 번호:29); 역방향 프라이머, GTCGCCAGCA GTCTCATACA G (서열 번호:30); 프로브, CAL Orange-AGTGGGCATC CCTTGCCAGG C-BHQ(서열 번호:31); hygro 카세트: 정방향 프라이머, TGCGGCCGAT CTTAGCC (서열 번호:32); 역방향 프라이머, TTGACCGATT CCTTGCGG (서열 번호:33); 프로브, FAM-ACGAGCGGGT TCGGCCCATT C-BHQ (서열 번호:34); hC3-1, 인간 C3 프로모터: 정방향 프라이머, GGGCCTCCTA AGTTTGTTGA GTATC (서열 번호:35); 역방향 프라이머, CAGGGCTGGT TCCCTAGAAA TC (서열 번호:36); 프로브, FAM-TACAATAGCA GGCACAGCAC CCA-BHQ (서열 번호:37); hC3-2, 인간 C3 인트론 1: 정방향 프라이머, GGCTGAGAGT GGGAGTCATG (서열 번호:38); 역방향 프라이머, GCACTTGCCA ATGCCATTAT C (서열 번호:39); 프로브, FAM-CTGCTGTCCT GCCCATGTGG TTG-BHQ (서열 번호:40); hC3-3, 인간 C3 엑손 41: 정방향 프라이머, CGAATGCCAA GACGAAGAGA AC (서열 번호:41); 역방향 프라이머, GGGCACCCAA AGACAACCAT (서열 번호:42); 프로브, CAL Orange-CAGAAACAAT GCCAGGACCT CGGC-BHQ (서열 번호:43).

같은 LONA 검정을 사용하여 표적화된 ES 세포로부터 유래된 마우스에 대하여 그것들의 C3 유전자형을 결정하기 위해서 꼬리 생검으로부터 정제된 DNA를 검정하고 인간화된 C3 대립유전자가 생식 계열을 통해 옮겨진다는 것을 확인한다. 대체에 대하여 이형 접합성인 두 마리의 새끼들을 교배하여 인간 C3 유전자에 의한 내인성 마우스 C3 유전자의 대체에 대하여 동형 접합성인 마우스를 발생시킨다. 대체에 대하여 동형 접합성인 새끼들을 표현형 분석에 사용한다.

쥣과 C3 유전자좌 및 인간 C3 유전자를 함유하는 서열의 접합부, 인간 C3 유전자 및 플록스된 hygro 선택 카세트를 함유하는 서열의 접합부, 및 플록스된 hygro 선택 카세트 및 쥣과 C3 유전자좌의 서열의 접합부의 서열을 상기 실시예 1에서 기술된 바와 같이 결정한다.

버전 2 - 인간 C3 암호화 엑손 2 내지 41로의 대체

인간 C3 유전자의 암호화 엑손 2 내지 41을 함유하는 인간 C3 유전자는 암호화 엑손 2 내지 41에 걸쳐 있는 쥣과 C5 유전자좌를 대체한다. 기본적으로 상기 실시예 1에서 기술된 방법을 사용하여 마우스 C3 유전자 서열을 인간 C3 유전자 서열로 대체하였다. 도 2B 참조.

예비적으로, 폴리아데닐화 부위에 대한 3'의 900 bp를 포함하는 암호화 엑손 2 내지 41의, 플록스된 neo 카세트로의 대체에 의해 25 kb의 마우스 C3 유전자의 표적화된 결실을 마우스 ES 세포에서 발생시켰다. 결과의 마우스 ES 세포, 12132 ES 세포는 이형 접합성 C3 넉아웃이다.

암호화 엑손 2 내지 암호화 엑손 41 및 3' 비번역 영역의 업스트림으로부터 연장된 인간 C3 서열을 플랭킹하는 마우스 C3 업스트림 및 다운스트림 상동성 팔 및 플록스된 hygro 선택 카세트를 함유하는 표적화 구조를 생성하였고, 12132 ES 세포로 전기천공하였다. 올바르게 표적화된 ES 세포 (MAID 6155)를 일과성 Cre-발현 벡터로 추가로 전기천공하여 약물 선택 카세트를 제거하였다. 약물 카세트가 없는 표적화된 ES 세포 클론 (MAID 6156)을 8-세포 단계 마우스 배아로 도입하였다. 인간화된 C3 유전자를 함유하는 공여체 ES 세포로부터 완전히 유래된 F0 마우스를 실시예 1에서 기술된 바와 같이 마우스 대립유전자의 손실 및 인간 대립 유전자의 획득에 대하여 유전자형 분석에 의해 식별하였다.

플록스된 neo 카세트가 C3 넉아웃 12132 ES 세포에서 검출된 마우스 C3 유전자 서열을 대체하였고, 인간 C3 유전자 서열이 인간화된 대립유전자에서 검출된 마우스 C3 유전자 서열을 대체하였다는 확인을 상기 버전 1에서 기술된 바와 같은 프라이머-프로브 세트 (5'에서 3'으로 작성됨)를 포함하는 TaqMan™ qPCR 검정에 의해 확인하였다.

같은 LONA 검정을 사용하여 표적화된 ES 세포로부터 유래된 마우스에 대하여 그것들의 C3 유전자형을 결정하기 위해서 꼬리 생검으로부터 정제된 DNA를 검정하고 인간화된 C3 대립유전자가 생식 계열을 통해 전송된다는 것을 확인한다. 대체에 대하여 이형 접합성인 두 마리의 새끼들을 교배하여 인간 C3 유전자에 의한 내인성 마우스 C3 유전자의 대체에 대하여 동형 접합성인 마우스를 발생시킨다. 대체에 대하여 동형 접합성인 새끼들을 표현형 분석에 사용한다.

실시예 3

마우스 혈청에서 보체 용혈 활성 검정

보체는 안구 염증 및 망막 퇴행성 질환에 관련되어 있다 (Mullins et al. (2000) Drusen associated with aging and age-related macular degeneration contain proteins common to extracellular deposits associated with atherosclerosis, elastosis, amyloidosis, and dense deposit disease, FASEB J, 14(7):835-846 참조). 단클론성 항체 (mAb)에 의한 C5 분열의 차단이 이 장애들에 대하여 가능한 치료 계획이다 (Copland et al. (2009) Systemic and local anti-C5 therapy reduces the disease severity in experimental autoimmune uveoretinitis, Clinical and Experimental Immunology, 159:303-314). 보체, 예를 들어, C5 및/또는 C3 길항제에 대한 치료의 평가를 위해서, 검정은 보체 활성화와 관련된 인간 질환, 장애 및 질병의 적절한 모델에서 시험관 내 및 생체 내에서 후보 치료제의 기능을 평가해야할 필요가 있다.

방법

보체 용혈 활성을 고전적 보체 검정 CH₅₀을 사용하여 평가하였다 (Gilcas et al. (2001) Classical pathway evaluation, Current Protocols in Immunology, Unit 13.1). 마우스 혈액을 심장으로부터 수거하여 얼음 위에서 1시간 동안 에펜도르프 튜브에서 응고시켰다; 혈청을 원심분리에 의해 분리하여 -70℃에 저장하였다. 양 적혈구 (E)를 37℃에서 20분 동안 토끼 항-양 용혈소와 함께 인큐베이션함으로써 민감화시켰다. 민감화된 세포 (E_A)를 37℃에서 1시간 동안 마우스 또는 인간의 처리군 또는 대조군 혈청의 두 배 희석액과 함께 인큐베이션하였다. 온전한 E_A 세포를 펠릿화하였고 상층액을 제거하여 541 nm에서의 흡광도, 용혈 지수를 측정하였다. 버퍼 단독 (0% 용해) 또는 ddH₂O (100% 용해)와 함께 인큐베이션된 E_A 세포는 각각 음성 및 양성 대조군의 역할을 한다. 각 웰에서 용혈 및 CH₅₀의 퍼센트를 ddH₂0 대조군과 비교하여 계산하였다 (Holt et al. (2001) Targeted deletion of the CD59 gene causes spontaneous intravascular hemolysis and hemoglobinuria, Blood, 98(2):442-449). C5^hu ^/ ^hu, C5^-/-, C3^hu ^/ ^hu, C3^-/-, 및 각각의 대조군 계통을 포함하는 마우스를 실시예 1 및 2에서 기술된 VelociGene® 기술로 발생시켰다. 정상, C5-고갈된, 및 C3-고갈된 인간 혈청을 Quidel Corp.로부터 얻었고, 대조군으로서 또는 비교에 사용하였다. 보체 구성요소를 추가하여 용혈 기능이 회복될 수 있는지를 테스트하였다. 테스트된 혈청을 4℃에서 40분 동안 보체 구성요소들, 인간 C5 (Sigma-Aldrich 또는 Quidel Corp., 50 μg/ml), 인간 C3 (Sigma-Aldrich 또는 Quidel Corp., 10, 400, 1200 μg/ml) 및 쥣과 C5 (Regeneron Pharmaceuticals, 50μg/ml)와 함께 인큐베이션하였다. 항-인간 C5 mAb (100 μg/ml) 및 항-마우스 C5 mAb (Hycult Biotech, 10 μg/ml)를 사용하여 미래의 약물 발견에 대한 이 시스템의 특이성 및 유용성을 확인하였다.

결과

야생형 마우스 혈청은 정상 인간 혈청과 비교하여 대략 10배 더 낮은 보체 용혈 활성을 가진다. 도 3에서 나타난 바와 같이, 보체 용혈 활성은, CH₅₀ 값을 사용하여 결정된 바와 같이, 인간 혈청의 두 개의 로트와 비교하여 정상 또는 야생형 마우스 혈청의 세 개의 로트에서 적어도 10배 더 낮았다.

항-C5 단클론성 항체는 종-특이적 방식으로 용혈을 차단한다. 도 4에서 나타난 바와 같이, 항-마우스 C5 단클론성 항체 (msC5Ab)는 정상 마우스 혈청에서 보체 용혈 활성을 차단하고, 항-인간 C5 mAb (C5Ab)는 정상 인간 혈청 및 인간 C5 단백질이 보충된 인간 C5-고갈된 혈청에서 용혈 활성을 차단하지만, 정상 마우스 혈청에서는 그렇지 않다.

인간 C5 및 C3 단백질은 종-특이적 용혈 활성을 나타낸다. 도 5A에서 나타난 바와 같이, 인간 C5 및 C3 단백질은 각각 인간 C5- 및 C3-고갈된 인간 혈청의 보체 용혈 활성을 복원할 수 있었다.

도 5B에서 나타난 바와 같이, C5^-/- 및 C3^-/- 마우스의 혈청은 보체 활성의 결핍을 나타냈고, 인간화된 C5^hu ^/ ^hu 마우스 혈청은 C5^-/- 및 C3^-/- 마우스의 혈청과 본질적으로 동등한 용혈 활성을 나타내지 않았다. 인간화된 C5^hu ^/ ^hu 마우스 혈청에 마우스 C5 단백질의 추가는 보체 용혈 활성을 구제하였지만, 인간화된 C5^hu ^/ ^hu 마우스 혈청에 인간 C5 단백질의 추가는 보체 활성을 구제하지 않았다.

도 5C에서 나타난 바와 같이, 인간화된 C5^hu ^/ ^hu 마우스 혈청의 보체 용혈 활성의 결핍은 인간 C5 단백질의 결핍으로 인한 것으로는 보이지 않는데, 이 마우스의 혈청에 존재하는 인간 C5 단백질의 양은 정상 인간 혈청에 존재하는 C5 단백질의 양의 약 3분의 1이었기 때문이다. 도 5D는 투여 전 보체 C5 수준에 대하여 수컷 및 암컷 인간화된 C5 마우스 간의 차이를 나타낸다. 이 마우스의 혈청에 존재하는 인간 C5 단백질의 범위는 20 내지 100 μg/ml이며, 이것은 혈청에서 용혈 활성을 나타내기에 충분하였다. 이 실험에서 보통 추가되는 인간 C5는 50μg/ml이었다.

인간 C5 및 C3 단백질 둘 다는 마우스 C5 넉아웃 혈청에서 용혈 활성을 복원하는데 필요하다. 도 6에서 나타난 바와 같이, 보체 용혈 활성은 C5^-/- 마우스 혈청에 인간 C5 단백질을 추가함으로써 회복될 수 없는 반면에, 인간 C3 및 C5 단백질의 추가는 C5^-/- 마우스 혈청에서 용혈을 구제하였다.

C5 ^hu ^/ ^hu 마우스 혈청에서 인간 C3 단백질의 추가는 용혈 활성을 구제한다. 도 7에서 나타난 바와 같이, 인간 C3 단백질은 C5^hu ^/ ^hu 마우스의 혈청에서 보체 용혈 활성을 복원하기에 충분하다.

상기 결과에 근거하여, 인간화된 C5^hu ^/ ^hu 및/또는 C3^hu ^/ ^hu 마우스는 인간-특이적 C5 및/또는 C3 길항제의 PK 및 PD를 평가하기에 적절한 비-인간 동물이다. 상기 결과에 근거하여, 이중으로 인간화된 C5^hu ^/ ^hu 및 C3^hu ^/ ^hu 마우스 혈청은 인간 C5 및/또는 C3 단백질에 의한 보충이 필요없는 보체 용혈 활성을 나타내며, 이로 인해 인간-특이적 C5 및/또는 C3 길항제의 치료적 효능의 생체 내 테스트에 적절한 마우스 계통을 구성할 수도 있다.

결론

야생형 마우스 혈청은 인간 혈청과 비교하여 훨씬 더 낮은 보체 용혈 활성을 가진다. 인간 C5를 발현하는 유전적으로 변형된 마우스는 기능적 쥣과 C5 넉아웃이며, 아마도 마우스 콘버타제가 인간 C5 단백질을 분열시킬 수 없기 때문이다. 인간화된 C5 마우스 혈청은 보체 용혈 활성의 야생형 수준을 달성하기 위해서는 인간 C3 단백질의 추가를 필요로 한다.

실시예 4

인간화된 C5 및/또는 C3 마우스에 대한 사용

인간화된 C5 및/또는 C3 마우스는 인간-특이적 C5 및/또는 C3 화합물 (예를 들어, 길항제, 예를 들어, 중화 항-C5 또는 항-C3 항체)의 약력학 (PD)를 평가하는데 유용하다.

인간화된 C5 및/또는 C3 마우스에서 약물동력학 (PK) 및 PD 검정을 업계에 공지된 표준 과정에 따라, 예를 들어, 항-C5 항체에 대하여 미국 특허 번호 6,355,245에서 기술된 바와 같이 수행하였다.

인간화된 C5 및/또는 C3 마우스는 다양한 질환 모델, 제한은 아니지만, 예를 들어, 건성 나이-관련 황반 변성 (dry age-related macular degeneration; AMD); 습성 AMD; experimental 자가면역 포도망막염 (experimental autoimmune uveoretinitis; EAU); 고안압증(ocular hypertension); 및 시신경 손상에서 인간-특이적 C5 또는 C3 길항제, 예를 들어, 중화 항-C5 또는 항-C3 항체의 생체 내 치료적 효능을 테스트하는데 유용하다 (예를 들어, 보체 활성화와 관련된 질환, 장애 및 질병의 목록에 대하여 Makrides (1998) 및 Mollnes et al. (2006) 참조).

건성 AMD는 인간화된 C5 및/또는 C3 마우스에서 고지방 식단 및 블루라이트(blue light) 손상 (예를 들어, Exp Eye Res. 2002, 75(5):543-553 참조), 담배 연기 (예를 들어, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006, 47(2):729-737 참조), 카르복시에틸피롤 (CEP) (예를 들어, Invest. Ophthalmol. Vis . Sci . 2010, 51:1276-1281; Nat Med. 2012, 18(5):791-798 참조)에 의해 유발될 수 있다.

인간화된 C5 및/또는 C3 마우스를 또한 다른 트랜스제닉 AMD 모델, 예를 들어, ApoE(-/-) (예를 들어, Invest. Ophthalmol . Vis . Sci. 2000, 41:2035-2042 참조), Mdm1 (예를 들어, Hum. Mol . Genet. 2008, 17:3929-3941 참조), Sod1(-/-)(예를 들어, PNAS 2006; 103:11282-11287 참조), LDLR(-/-) (예를 들어, Br J Ophthalmol 2005, 89:1627-1630 참조), 및 DICER1 (-/-) (예를 들어, Nature. 2011; 471(7338):325-330 참조)에 교배시킬 수 있다.

습성 AMD는 인간화된 C5 및/또는 C3 마우스에서 레이저-유도 맥락막 신생 혈관 형성 (choroidal neovascularization; CNV)에 의해 유발될 수 있다 (Nat Protoc. 2013, 8(11):2197-2211 참조).

EAU는 인간화된 C5 및/또는 C3 마우스에서 유발될 수 있다 (예를 들어, Clin Exp Immunol. 2010, 159(3): 303-314 참조).

고안압증은 인간화된 C5 및/또는 C3 마우스에서 유발될 수 있다 (예를 들어, Experimental Eye Research 2006, 83:620-628 참조).

시신경 손상은 인간화된 C5 및/또는 C3 마우스에서 유발될 수 있다 (예를 들어, J Neurotrauma 2003, 20(9):895-904 참조).

인간화된 C5 마우스는 다양한 질환 모델, 제한은 아니지만, 예를 들어, 발작성 야간 혈색뇨증(paroxysmal nocturnal hematuria); 시신경 척수염(neuromyelitis optica); 신장 이식; 및 신장 손상에서 인간-특이적 C5 길항제를 평가하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,355,245 참조).

인간화된 C5 및/또는 C3 마우스를 사용하는 치료적 효능 검정을 업계에 공지된 표준 과정에 따라, 예를 들어, 항-C5 항체에 대하여 미국 특허 번호 6,355,245에서 기술된 바와 같이 수행한다.

실시예 5

인간화된 C5 동형 접합성 마우스에서 항-C5 항체의 약물동력학적/ 약력학적 연구

이 실시예는 보체 활성화를 감소시키는 항-C5 항체의 능력을 테스트하기 위해 이전 실시예에 따라 제조된 수컷 및 암컷 인간화된 C5 동형 접합성 마우스를 이용한다.

방법

총 25마리의 C5^hu ^/ ^hu 마우스 (수컷 및 암컷)를 연구에 사용하였다. 혈청 (20 μL)을 두 마리의 마우스로부터 각각 지정된 시점에 수거하였으며, 상기 시점은 "예비 투여" 시점뿐 아니라 항-인간 C5 단클론성 항체의 15 mg/kg의 피하 투여 후 3h, 6h, 1d, 2d, 4d, 1W, 2W, 4W의 시점을 포함하였다. 샘플을 보체 활성화의 약물동력학 (PK) 및 약력학 (PD) 변화에 대하여 검정할 때까지 -20℃에서 저장하였다.

보체 용혈 활성을 상기 실시예 3에서 기술된 바와 같이 평가하였다. 상기와 같이, 인간 C3 (Sigma-Aldrich 또는 Quidel Corp., 400 및 800 μg/ml)를 혈청에 추가하여 인간 보체 시스템을 반복하였다.

결과

도 8에서 나타난 바와 같이, 항-인간 C5 항체 15 mg/kg의 피하 주사는 주사 후 적어도 1주일 동안 보체 활성화를 감소시킨다. 400 μg/ml (도 8A) 또는 800 μg/ml (도 8B) 인간 C3 단백질이 용혈 검정에 추가되었는지와 관계없이 이 효과를 관찰하였다.

도 9에서 나타난 바와 같이, C5 단클론성 항체의 PK 분석은 시간이 흐름에 따른 이 항체의 클리어런스를 나타냈으며 5마리의 마우스 중 2마리는 제28 일까지 검출 불가능한 수준을 가진다.

실시예 6

인간 및 마우스 보체 단백질의 가교 활성

이 실시예는 이전 실시예에서 기술된, 조작된 마우스를 사용하여 인간 및 마우스 C3 및 C5 단백질의 가교-활성을 조사하였다. 실시예 3에서 논의된 바와 같이 및 도 6에서 나타난 바와 같이, 인간 C5 및 마우스 C3 단백질은 내인성 C5가 결핍된 마우스에서 용혈 활성을 복원할 정도로 충분하지 않다. 이 연구에서, C3 넉아웃 마우스에서 용혈 활성을 회복시키는 마우스 C5 및 인간 C3의 능력을 관찰하였다.

방법

보체 용혈 활성을 실시예 3에서 기술된 바와 같이 평가하였다.

C5^-/-, C3^-/-, 및 개개의 대조군 계통을 포함하는 마우스를 실시예 1 및 2에서 기술된 바와 같이 VelociGene® 기술을 이용하여 발생시켰다. 정상, C3-고갈된 인간 혈청을 Quidel Corp.로부터 얻었고 대조군으로서 또는 비교에 사용하였다. 보체 구성요소를 추가하여 용혈 기능이 회복될 수 있는지를 테스트하였다. 테스트된 혈청을 4℃에서 40분 동안 보체 구성요소; 인간 C3 (Sigma-Aldrich 또는 Quidel Corp., 50, 100, 500, 1200 μg/ml); 및 인간 C5 (Sigma-Aldrich 또는 Quidel Corp., 50 μg/ml)와 함께 인큐베이션하였다. 항-인간 C5 mAb (100 μg/ml) 및 항-마우스 C5 mAb (Hycult Biotech, 10 μg/ml)를 사용하여 미래의 약물 발견에 대한 이 시스템의 특이성 및 유용성을 확인하였다.

결과

도 10A에서 나타난 바와 같이, 야생형 마우스 혈청에 인간 C3 단백질의 추가는 야생형 대조군에서 관찰된 것보다 용혈 기능을 향상시킬 수 있다. 하지만, C3-고갈된 인간 혈청으로 인간 C3 단백질의 추가와 비교할 때, 관찰된 향상은 인간에서 나타난 것보다 더 적다. 또한, 도 10B에서 도시된 바와 같이, 퍼센트 용혈은 인간 C3 단백질로 보충된 인간화된 C5^hu/hu 마우스 혈청을 사용하여 회복된다.

이 실험이 C3 넉아웃 동물로부터 유래된 혈청을 사용하여 반복될 때, C3^-/- 혈청에 인간 C3 단백질의 추가가 용혈 기능을 구제하며, 특히 추가된 인간 C3의 농도를 증가시키는 것으로 나타났다 (도 11).

이에 반해서, 도 12는 C5 널(null) 동물-유래 혈청에 인간 C3의 추가는 용혈 기능을 구제하는 것으로 나타난다.

결론

요약하면, 본 실시예로부터 유래된 데이터는 시험관 내 보체 활성을 반복하기 위해서 인간 C3이 쥣과 C5와 교차 반응할 수 있는 한편, 마우스 C3는 인간 C5와 유사하게 교차 반응할 수 없다는 것을 입증한다. 이 결과의 요약은 하기 표 1에 나타난다.

SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Hu, Ying Latuszek, Adriana Cao, Jingtai Mujica, Alexander Wiegand, Stanley McWhirter, John Murphy, Andrew Macdonald, Lynn <120> Humanized C5 and C3 Animals <130> 47206-502001WO <140> PCT/US2015/029111 <141> 2015-05-04 <150> US 61/988,581 <151> 2014-05-05 <150> US 62/067,836 <151> 2014-10-23 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Construct <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 cctccggtta actggtttgt gat 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 gcagtgaatg gtagacttcc ca 22 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 agtgacttta ctttggttgt tctgctcaca 30 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 ccgggaaagg aaaccaagac 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 cagcacagac tgaggatcca a 21 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 agactgtcat tctggcccgg acct 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 tgctcttaaa ggaccatcat cac 23 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 gtaaacggat aacggaaagg ataga 25 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 ccatttccaa atgcacttcc cagc 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 cccactgaac tatcacagga aaca 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 ggagatgcat tccagtctct gtta 24 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 tgaagatgac ctccggatgt aacgg 25 <210> 13 <211> 158 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 tgaaaaacct ccattactac ttctacagat gcccacagtg gtcttgcatt ctatccttgt 60 gcgatcgctc tgccatctcc tactaggcat gtggggaagg ggaattcaga tgatggttgg 120 aaatctggaa attctttcct ctcttttgta atttgcct 158 <210> 14 <211> 160 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 gcaaataggg caggccacag tggcctaatt aacccacaat gcagctgtca aatatcaaag 60 aaggttttgt gaattagcct ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120 atgcatggcc tccgcgccgg gttttggcgc ctcccgcggg 160 <210> 15 <211> 160 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 atgtctggaa taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatgctagta actataacgg 60 tcctaaggta gcgagctagc caggctatta ggcttctgtc cccaactgtg gtggcaaata 120 ggccagacca cagtcaccag atgaagccat aaatgcagct 160 <210> 16 <211> 239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 gcaaataggg caggccacag tggcctaatt aacccacaat gcagctgtca aatatcaaag 60 aaggttttgt gaattagcct ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 120 gctagtaact ataacggtcc taaggtagcg agctagccag gctattaggc ttctgtcccc 180 aactgtggtg gcaaataggc cagaccacag tcaccagatg aagccataaa tgcagctga 239 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 ggcctgatta catggacctg tc 22 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 cccaggcttg gctggaatg 19 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 tgtccactct ggaagcccag gc 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 gccaggagag gaagctggag 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 tggctcagca gtaaagaaca c 21 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 acagattgct gtgagctgcc caaa 24 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 ggtggagagg ctattcggc 19 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 gaacacggcg gcatcag 17 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 tgggcacaac agacaatcgg ctg 23 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 gccagcctag cctacttca 19 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 gccacccatc ccagttct 18 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 cagcccaggc cctttagatt gca 23 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 tacggtgtta ggttcactat tggt 24 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 gtcgccagca gtctcataca g 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 agtgggcatc ccttgccagg c 21 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 tgcggccgat cttagcc 17 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 ttgaccgatt ccttgcgg 18 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 acgagcgggt tcggcccatt c 21 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 gggcctccta agtttgttga gtatc 25 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 cagggctggt tccctagaaa tc 22 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 tacaatagca ggcacagcac cca 23 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 ggctgagagt gggagtcatg 20 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 39 gcacttgcca atgccattat c 21 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 ctgctgtcct gcccatgtgg ttg 23 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 41 cgaatgccaa gacgaagaga ac 22 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 42 gggcacccaa agacaaccat 20 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 43 cagaaacaat gccaggacct cggc 24

Claims

변형된 C5 유전자를 형성하기 위해 내인성 설치류 C5 유전자좌에서 인간 C5 유전자의 적어도 하나의 엑손을 암호화하는 핵산 서열로 C5 유전자의 엑손을 암호화하는 설치류 유전자 서열의 대체를 포함하는 설치류로서, 변형된 C5 유전자의 발현은 내인성 설치류 C5 유전자좌에서 설치류 조절 요소의 제어 하에 이루어지는, 설치류.
제1 항에 있어서, 설치류는 마우스 또는 래트인 것을 특징으로 하는 설치류.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 인간 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자는 인간 C5 유전자의 엑손 2 내지 엑손 41을 포함하는 것을 특징으로 하는 설치류.
제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 마우스 C5 단백질을 발현할 수 없는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 내인성 마우스 C3 유전자에 의해 암호화된 마우스 C3 단백질을 발현하는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 발현하는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
제6 항에 있어서, 마우스는 내인성 마우스 C3 유전자좌에서 인간 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자로 C3 단백질을 암호화하는 마우스 유전자의 대체를 포함하는 것을 특징으로 하는 설치류.
제6 항 또는 제7 항에 있어서, 인간 C3 유전자의 발현은 내인성 마우스 C3 유전자좌에서 마우스 조절 요소의 제어 하에 이루어지는 것을 특징으로 하는 설치류.
제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 혈청에서, 기능적 내인성 마우스 C5 단백질을 발현하지만, 상기 대체를 포함하지 않는 연령 일치 마우스의 혈청에 존재하는 마우스 C5 단백질 수준의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%의 농도로, 인간 C5 단백질을 발현하는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 혈청에서, 기능적 내인성 C5 단백질을 발현하지만, 상기 대체를 포함하지 않는 연령 일치 마우스의 혈청에 존재하는 마우스 C5 단백질 수준의 약 10% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 150%, 또는 약 30% 내지 약 100%의 농도로, 인간 C5 단백질을 발현하는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 혈청에서 약 10 μg/ml 내지 약 150 μg/ml, 약 10 μg/ml 내지 약 125 μg/ml, 또는 약 15 μg/ml 내지 약 100 μg/ml의 농도로 인간 C5 단백질을 발현하는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
제1 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 혈청에서 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125 또는 150 μg/ml의 농도로 인간 C5 단백질을 발현하는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
내인성 설치류 C3 유전자좌에서 변형된 C3 유전자를 형성하기 위해 인간 C3 유전자의 적어도 하나의 엑손을 암호화하는 핵산 서열로 C3 유전자의 엑손을 암호화하는 설치류 유전자 서열의 대체를 포함하는 설치류로서, 변형된 C3 유전자의 발현은 내인성 설치류 C5 유전자좌에서 설치류 조절 요소의 제어 하에 이루어지는, 설치류.
제13 항에 있어서, 설치류는 마우스 또는 래트인 것을 특징으로 하는 설치류.
제13 항 또는 제14 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자는 인간 C3 유전자의 엑손 1 내지 엑손 41을 포함하는 것을 특징으로 하는 설치류.
제13 항 내지 제15 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자는 인간 C3 유전자의 엑손 2 내지 엑손 41을 포함하는 것을 특징으로 하는 설치류.
제13 항 내지 제16 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 마우스 C3 단백질을 발현할 수 없는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
제13 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 내인성 마우스 C5 유전자에 의해 암호화된 마우스 C5 단백질을 발현하는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
제18 항 또는 제19 항에 있어서, 마우스는 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 설치류.
제19 항에 있어서, 마우스는 내인성 마우스 C5 유전자좌에서 인간 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자로 C5 단백질을 암호화하는 마우스 유전자의 대체를 포함하는 것을 특징으로 하는 설치류.
제19 항 또는 제20 항에 있어서, 인간 C5 유전자의 발현은 내인성 마우스 C5 유전자좌에서 마우스 조절 요소의 제어 하에 이루어지는 것을 특징으로 하는 설치류.
제13 항 내지 제21 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 혈청에서, 기능적 내인성 마우스 C3 단백질을 발현하지만, 상기 대체를 포함하지 않는 연령 일치 마우스의 혈청에 존재하는 마우스 C3 단백질 수준의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 200%의 농도로, 인간 C3 단백질을 발현하는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
제13 항 내지 제22 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 혈청에서, 기능적 내인성 마우스 C3 단백질을 발현하지만, 상기 대체를 포함하지 않는 연령 일치 마우스의 혈청에 존재하는 마우스 C3 단백질 수준의 약 10% 내지 약 200%, 약 20% 내지 약 150%, 또는 약 30% 내지 약 100%의 농도로, 인간 C3 단백질을 발현하는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
제13 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 혈청에서 약 100 μg/ml 내지 약 1500 μg/ml, 약 200 μg/ml 내지 약 1250 μg/ml, 또는 약 300 μg/ml 내지 약 1000 μg/ml의 농도로 인간 C3 단백질을 발현하는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
제13 항 내지 제24 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 혈청에서 적어도 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1250 또는 1500 μg/ml의 농도로 인간 C3 단백질을 발현하는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
인간화된 설치류의 제조 방법으로서, 설치류 C5 단백질을 암호화하는 설치류 C5 유전자 서열을 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 C5 유전자 서열로 대체하는 단계를 포함하며, 대체는 내인성 설치류 C5 유전자좌에서 이루어지고 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 C5 유전자 서열은 내인성 설치류 C5 유전자좌에서 설치류 조절 요소 또는 서열에 작동 가능하게 연결되는, 방법.
제26 항에 있어서, 설치류는 마우스 또는 래트인 것을 특징으로 하는 방법.
제26 항 또는 제27 항에 있어서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 마우스 또는 래트로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
제26 항 내지 제28 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 설치류 C5 유전자좌 내 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
제26 항 내지 제29 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 C5 유전자 서열을 대체하는 인간 C5 유전자 서열은 인간 C5 유전자 서열의 적어도 하나의 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제30 항에 있어서, 설치류 C5 유전자 서열을 대체하는 인간 C5 유전자 서열은 인간 C5 유전자 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제30 항 또는 제31 항에 있어서, 설치류 C5 유전자 서열을 대체하는 인간 C5 유전자 서열은 인간 C5 유전자 서열의 41개의 엑손 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제26 항 내지 제32 항 중 어느 한 항에 있어서, 대체는 내인성 설치류 C5 유전자좌에서 이루어지고 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 C5 유전자 서열은 내인성 설치류 C5 유전자좌에서 작동 가능하게 연결된 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
인간화된 마우스의 제조 방법으로서, 마우스 C5 단백질을 암호화하는 마우스 C5 유전자 서열을 인간 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자로 대체하는 단계를 포함하는 방법.
제34 항에 있어서, 대체는 내인성 마우스 C5 유전자좌에서 이루어지고, 인간 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자는 내인성 마우스 C5 유전자좌 내 내인성 마우스 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
인간화된 설치류의 제조 방법으로서, 설치류 C3 단백질을 암호화하는 설치류 C3 유전자 서열을 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 C3 유전자 서열로 대체하는 단계를 포함하며, 대체는 내인성 설치류 C3 유전자좌에서 이루어지고 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 C5 유전자 서열은 내인성 설치류 C3 유전자좌에서 설치류 조절 요소 또는 서열에 작동 가능하게 연결되는, 방법.
제36 항에 있어서, 설치류는 마우스 또는 래트인 것을 특징으로 하는 방법.
제36 항 또는 제37 항에 있어서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 마우스 또는 래트로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
제36 항 내지 제38 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 설치류 C3 유전자좌 내 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
제36 항 내지 제39 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류 C5 유전자 서열을 대체하는 인간 C3 유전자 서열은 인간 C3 유전자 서열의 적어도 하나의 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제40 항에 있어서, 설치류 C3 유전자 서열을 대체하는 인간 C3 유전자 서열은 인간 C3 유전자 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개의 엑손을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제41 항에 있어서, 설치류 C3 유전자 서열을 대체하는 인간 C3 유전자 서열은 인간 C3 유전자 서열의 41개의 엑손 모두를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제36 항 내지 제42 항 중 어느 한 항에 있어서, 대체는 내인성 설치류 C3 유전자좌에서 이루어지고 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자 서열의 하나 이상의 엑손을 포함하는 인간 C3 유전자 서열은 내인성 설치류 C3 유전자좌에서 작동 가능하게 연결된 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
인간화된 마우스의 제조 방법으로서, 마우스 C3 단백질을 암호화하는 마우스 C3 유전자 서열을 인간 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자로 대체하는 단계를 포함하는, 방법.
제44 항에 있어서, 대체는 내인성 마우스 C3 유전자좌에서 이루어지고, 인간 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자는 내인성 마우스 C3 유전자좌 내 내인성 마우스 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
내인성 설치류 C5 유전자좌에서 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자로 C5 단백질을 암호화하는 설치류 유전자의 대체를 포함하는 인간화된 C5 유전자를 포함하는 설치류로서, 인간 또는 인간화된 C5 단백질을 암호화하는 인간 C5 유전자의 발현은 내인성 설치류 C5 유전자좌에서 설치류 조절 요소 또는 서열의 제어 하에 이루어지고, 설치류는 내인성 설치류 C3 유전자좌에서 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자로 C3 단백질을 암호화하는 설치류 유전자의 대체를 더 포함하고, 인간 또는 인간화된 C3 단백질을 암호화하는 인간 C3 유전자의 발현은 내인성 설치류 C3 유전자좌에서 설치류 조절 요소 또는 서열의 제어 하에 이루어지는, 설치류.
제46 항에 있어서, 설치류는 마우스 또는 래트인 것을 특징으로 하는 설치류.
제46 항에 있어서, 설치류는 마우스 C5 단백질을 발현할 수 없고 마우스 C3 단백질을 발현할 수 없는 마우스인 것을 특징으로 하는 설치류.
제46 항에 있어서, 내인성 설치류 C5 유전자좌 및/또는 내인성 설치류 C3 유전자좌에서 설치류 조절 요소 또는 서열은 마우스 또는 래트로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 설치류.
제46 항에 있어서, 설치류 조절 요소 또는 서열은 설치류 C5 유전자좌 및/또는 설치류 C3 유전자좌 내 내인성 설치류 조절 요소 또는 서열인 것을 특징으로 하는 설치류.
보체 활성화를 조절할 수 있는 화합물의 식별 방법으로서,
a. 제1 항 내지 제25 항 또는 제46 항 내지 제50 항 중 어느 한 항의 설치류에 화합물을 투여하는 단계; 및
b. 설치류에서 보체 활성화가 조절되는지를 검정하여, 보체 활성화를 조절할 수 있는 화합물을 식별하는 단계
를 포함하는, 방법.
제51 항에 있어서, 화합물은 소분자 화합물, 항체, 단백질, 억제 핵산, 또는 이것들의 어떤 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제51 항 또는 제52 항에 있어서, 화합물은 보체 활성을 증가시켜 보체 활성화를 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
제51 항 또는 제52 항에 있어서, 화합물은 보체 활성을 감소시켜 보체 활성화를 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
제51 항 내지 제54 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류의 혈청은 설치류에서 보체 활성화가 조절되는지를 결정하기 위해 검정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제55 항에 있어서, 검정은 CH₅₀ 보체 스크리닝 검정인 것을 특징으로 하는 방법.