JP2017503857A - ワクチンプラットフォームとしてのフラジェリン含有タンパク質ナノ粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
X−ND1−L1−ND2−FLA (Ia)又はFLA−ND1−L1−ND2−X (Ib)
の複数の構築ブロック(式中、
ND1は、m個のND1サブユニットの(ND1)mオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ND2は、n個のND2サブユニットの(ND2)nオリゴマーを形成するタンパク質であり、
m及びnは、それぞれ2と10の間の数であり、ただし、mは、nと等しくなく、nの倍数でなく、nは、mの倍数でなく、
L1は、結合、又は短い柔軟なリンカーであり、
FLAは、フラジェリンであるか、又はフラジェリンアミノ酸配列の一部を欠くが、TLR5結合ドメインD1を少なくとも含むフラジェリンの誘導体であり、欠落ドメイン(一又は複数)が、残りのフラジェリン配列の2つの末端を結合させる1〜20個のアミノ酸の柔軟なリンカーセグメントにより置換されていても、又は完全に折りたたまれたタンパク質抗原により置換されていてもよく、
Xは、存在しないか、又は1〜1000個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である)の凝集体からなる自己集合タンパク質ナノ粒子であって、
タンパク質オリゴマー化ドメインND3、リンカーL2、タンパク質オリゴマー化ドメインND4、並びにさらなる置換部分Y及びZを含む連続鎖からなる以下の式(II)
Y−ND3−L2−ND4−Z (II)
の複数の構築ブロック(式中、
ND3は、y個のND3サブユニットの(ND3)yオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ND4は、z個のND4サブユニットの(ND4)zオリゴマーを形成するタンパク質であり、
y及びzは、2と10の間の数であり、ただし、yは、zと等しくなく、zの倍数でなく、zは、yの倍数でなく、
ND3がND1と同一であるか、又はND4がND2と同一であるか、又はND3及びND4の両方がそれぞれND1及びND2と同一であり、
L2は、結合であるか、又はL1と異なるか、若しくはL1と同一であってもよい短い柔軟なリンカーであり、
Y及びZは、互いに独立に、存在しないか、又は1〜1000個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である)と共集合していてもよい自己集合タンパク質ナノ粒子に関する。
本発明では、ナノ粒子に何れか一方の向きで組み込まれたフラジェリンの異なるドメインを含む異なる形態のフラジェリンを述べる。一部の設計では、ナノ粒子表面に近いそれらのN及びC末端によりフラジェリンをナノ粒子に結合させる(図1)が、一方他の設計では、フラジェリンの遠い部分をナノ粒子表面に近接させ、したがって、ナノ粒子上に反対の向きにフラジェリンを発現させる(図2)。
X−ND1−L1−ND2−FLA (Ia)又はFLA−ND1−L1−ND2−X (Ib)
の複数の構築ブロック(式中、
ND1は、m個のND1サブユニットの(ND1)mオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ND2は、n個のND2サブユニットの(ND2)nオリゴマーを形成するタンパク質であり、
m及びnは、それぞれ2と10の間の数であり、ただし、mは、nと等しくなく、nの倍数でなく、nは、mの倍数でなく、
L1は、結合、又は短い柔軟なリンカーであり、
FLAは、フラジェリンであるか、又はフラジェリンアミノ酸配列の一部を欠くが、TLR5結合ドメインD1を少なくとも含むフラジェリンの誘導体であり、欠落ドメイン(一又は複数)が、残りのフラジェリン配列の2つの末端を結合させる1〜20個のアミノ酸の柔軟なリンカーセグメントにより置換されていても、又は完全に折りたたまれたタンパク質抗原により置換されていてもよく、
Xは、存在しないか、又は1〜1000個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である)の凝集体からなる自己集合タンパク質ナノ粒子であって、
タンパク質オリゴマー化ドメインND3、リンカーL2、タンパク質オリゴマー化ドメインND4、並びにさらなる置換部分Y及びZを含む連続鎖からなる以下の式(II)
Y−ND3−L2−ND4−Z (II)
の複数の構築ブロック(式中、
ND3は、y個のND3サブユニットの(ND3)yオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ND4は、z個のND4サブユニットの(ND4)zオリゴマーを形成するタンパク質であり、
y及びzは、2と10の間の数であり、ただし、yは、zと等しくなく、zの倍数でなく、zは、yの倍数でなく、
ND3がND1と同一であるか、又はND4がND2と同一であるか、又はND3及びND4の両方がそれぞれND1及びND2と同一であり、
L2は、結合であるか、又はL1と異なるか、若しくはL1と同一であってもよい短い柔軟なリンカーであり、
Y及びZは、互いに独立に、存在しないか、又は1〜1000個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である)と共集合していてもよい自己集合タンパク質ナノ粒子に関する。
MAQVINTNSLSLLTQNNLNRSQSALGTAIERLSSGLRINSARDDAAGQAIANRFTANIRGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVRVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLRQINSQTLGLDQLNVQQKYKDGDKGDDKTENPLQRIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR(配列番号28)
SARLSDLEANNAVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFIDRTASGVSTLINEDAAAARRSTANPLASIDSALSRVDAVRSSLGAIQNRFDSAKAKKKDGKDDKDSKNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLRSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGAKDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPREATVGDLRSSFRNVTGYDTYAAGADRYRVDINSGAV(配列番号30)
ペプチド(又はポリペプチド若しくはタンパク質)は、アミド結合により共有結合したアミノ酸の鎖又は配列である。ペプチドは、天然、修飾天然、部分合成又は完全合成であり得る。修飾天然、部分合成又は完全合成は、天然に存在しないことを意味すると理解される。アミノ酸という用語は、20種の必須天然α−L−アミノ酸から選択される天然アミノ酸、α−D−アミノ酸、6−アミノヘキサン酸、ノルロイシン、ホモシステイン、若しくは同類のものなどの合成アミノ酸、並びにホホセリン若しくはホスホチロシンなどの、電荷などの特定の特性を変化させるある種の方法で、又はn−オクタノイル−セリン、若しくは同類のものなどの他の修飾により修飾された天然アミノ酸を含む。アミノ酸の誘導体において、アミド結合を形成するアミノ基がアルキル化され、又は側鎖アミノ、ヒドロキシ若しくはチオ官能基がアルキル化若しくはアシル化され、又は側鎖カルボキシ官能基がアミド化若しくはエステル化されている。好ましくは、本発明のタンパク質は、20種の必須天然α−L−アミノ酸から選択されるアミノ酸を含む。
[aa(a)−aa(b)−aa(c)−aa(d)−aa(e)−aa(f)−aa(g)]X (IIIa)、
[aa(b)−aa(c)−aa(d)−aa(e)−aa(f)−aa(g)−aa(a)]X (IIIb)、
[aa(c)−aa(d)−aa(e)−aa(f)−aa(g)−aa(a)−aa(b)]X (IIIc)、
[aa(d)−aa(e)−aa(f)−aa(g)−aa(a)−aa(b)−aa(c)]X (IIId)、
[aa(e)−aa(f)−aa(g)−aa(a)−aa(b)−aa(c)−aa(d)]X (IIIe)、
[aa(f)−aa(g)−aa(a)−aa(b)−aa(c)−aa(d)−aa(e)]X (IIIf)、
[aa(g)−aa(a)−aa(b)−aa(c)−aa(d)−aa(e)−aa(f)]X (IIIg)、
ここで、aaは、アミノ酸又はその誘導体を意味し、aa(a)、aa(b)、aa(c)、aa(d)、aa(e)、aa(f)及びaa(g)は、同じ若しくは異なるアミノ酸又はその誘導体を意味し、好ましくはaa(a)及びaa(d)は、同じ若しくは異なる疎水性アミノ酸又はその誘導体を意味し、xは、2と20の間の数、好ましくは3と10の間の数である。
(1)xが3であり、これらの6アミノ酸の表1のスコアの合計が少なくとも14であるようにaa(a)及びaa(d)が20天然α−L−アミノ酸から選択される式(IIIa)〜(IIIg)の何れかのタンパク質、並びに17までのさらなるヘプタッドを含むそのようなタンパク質;
あるいは
(2)xが3であり、これらの6アミノ酸の表1のスコアの合計が少なくとも12であるようにaa(a)及びaa(d)が20天然α−L−アミノ酸から選択される式(IIIa)〜(IIIg)の何れかのタンパク質、ただし、1つのアミノ酸aa(a)は、隣接ヘプタッドのアミノ酸aa(d)若しくはaa(g)へのらせん間塩橋を形成することができる荷電アミノ酸であり、又は1つのアミノ酸aa(d)は、隣接ヘプタッドのアミノ酸aa(a)若しくはaa(e)へのらせん間塩橋を形成することができる荷電アミノ酸であり、並びに2つのさらなるヘプタッドを含むそのようなタンパク質。隣接ヘプタッドのアミノ酸へのらせん間塩橋を形成することができる荷電アミノ酸は、例えば、他のアミノ酸がLys、Arg若しくはHisである場合にはAsp若しくはGluであり、又は逆も同様である。
(11)aa(a)がVal、Ile、Leu及びMet並びにそれらの誘導体から選択され、aa(d)がLeu、Met、Val及びIle並びにそれらの誘導体から選択される式(IIIa)〜(IIIg)の何れかのタンパク質。
(12)1つのaa(a)がAsnであり、他のaa(a)がAsn、Ile及びLeuから選択され、aa(d)がLeuである式(IIIa)〜(IIIg)の何れかのタンパク質。そのようなタンパク質は、通常二量体化ドメインである。
(13)aa(a)及びaa(d)が両方ともLeu又は両方ともIleである式(IIIa)〜(IIIg)の何れかのタンパク質。そのようなタンパク質は、通常三量体化ドメインである。
(14)aa(a)及びaa(d)が両方ともTrpである式(IIIa)〜(IIIg)の何れかのタンパク質。そのようなタンパク質は、通常五量体化ドメインである。
(15)aa(a)及びaa(d)が両方ともPheである式(IIIa)〜(IIIg)の何れかのタンパク質。そのようなタンパク質は、通常四量体化ドメインである。
(16)aa(a)及びaa(d)が両方ともTrp又はPheである式(IIIa)〜(IIIg)の何れかのタンパク質。そのようなタンパク質は、通常五量体化ドメインである。
(17)aa(a)がLeu又はIleであり、1つのaa(d)がGlnであり、他のaa(d)がGln、Leu及びMetから選択される式(IIIa)〜(IIIg)の何れかのタンパク質。そのようなタンパク質は、五量体化ドメインである可能性を有する。
(21)少なくとも1つのaa(g)がAsp及びGluから選択され、以下のヘプタッドにおけるaa(e)がLys、Arg若しくはHisであり;且つ/又は
(22)少なくとも1つのaa(g)がLys、Arg及びHisから選択され、以下のヘプタッドにおけるaa(e)がAsp若しくはGluであり、且つ/又は
(23)少なくとも1つのaa(a〜g)がLys、Arg及びHisから選択され、配列における3若しくは4アミノ酸離れたaa(a〜g)がAsp若しくはGluである。アミノ酸aa(a〜g)のそのような対は、例えば、aa(b)及びaa(e)又はaa(f)である。
自己集合タンパク質ナノ粒子(SAPN)は、式(Ia)、(Ib)の単量体構築ブロック又は式(Ia)若しくは(Ib)の単量体構築ブロックと式(II)の単量体構築ブロックとの混合物から形成される。そのような構築ブロックが集合する場合、それらは、いわゆる「LCMユニット」を形成する。そのようなLCMユニットに集合する、単量体構築ブロックの数は、最小公倍数(LCM)により定義される。したがって、例えば、単量体構築ブロックのオリゴマー化ドメインが五量体(ND1)5(m=5)及び二量体(ND2)2(n=2)を形成する場合、10単量体がLCMユニットを形成する。リンカーセグメントLが適切な長さを有する場合、このLCMユニットは、球状タンパク質ナノ粒子の形態に集合し得る。
四面体、立方体、八面体、十二面体及び二十面体の5種の正多面体が存在する。それらは、異なる内部回転対称要素を有する。四面体は、2回及び3つの3回軸を有し、立方体及び八面体は、2回、3回及び4回回転対称軸を有し、十二面体及び二十面体は、2回、3回及び5回回転対称軸を有する。立方体では、これらの軸の空間配向は、八面体と正確に同じであり、また十二面体及び二十面体では、互いに対するこれらの軸の空間配向は、正確に同じである。したがって、本発明のSAPNの目的のために、十二面体及び二十面体は、同一であるとみなすことができる。十二面体/二十面体は、60個の同じ3次元構築ブロックから構築される(表2)。これらの構築ブロックは、多面体の非対称性ユニット(AUs)である。それらは、錐体であり、錐体の稜は、回転対称軸の1つに対応し、したがって、これらのAUsは、それらの稜において2回、3回及び5回対称要素を有する。これらの対称要素がタンパク質オリゴマー化ドメインから得られる場合、そのようなAUsは、上述のように単量体構築ブロックから構築される。2つのオリゴマー化ドメインND1及びND2又はND3及びND4をAUの2つの対称軸に沿って整列させれば十分である。これらの2つのオリゴマー化ドメインが安定なオリゴマーを形成する場合、第3の対称軸に沿った対称境界面が自動的に生じ、それは、この境界面に沿った相互作用、例えば、疎水性、親水性若しくはイオン性相互作用を最適化することにより、又はジスルフィド架橋のような共有結合により、安定化させることができる。
規則的形状(十二面体、二十面体、八面体、立方体)を有する自己集合タンパク質ナノ粒子(SAPN)を得るために、複数のLCMユニットが必要である。例えば、三量体及び五量体オリゴマー化ドメインを含むモノマーから二十面体を形成するために、それぞれ15個の単量体構築ブロックから構成される4つのLCMが必要である。すなわち、規則的形状を有するタンパク質ナノ粒子は、60個の単量体構築ブロックから構成されることとなる。2つのオリゴマー化ドメインのオリゴマー化状態の組合せが必要であり、2つの可能な多面体を形成するためのLCMユニットの数を表2に示す。
本発明によるFLA−SAPNの特定の例は、以下の構築物「FLA−SAPN−1a」及び「FLA−SAPN−2」である。
式(Ia)に対応するT81c−WRW−8RRVRA−D0−D1(FLJB_SALTY)(FLA−SAPN−1a)
MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARGMAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR(配列番号4)
式(II)に対応するT81c−WRW−8RRVRA−T1BT*(FLA−SAPN−2)
MGHHHHHHASEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARGSGDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANP(配列番号5)
MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGS (配列番号6)
これは、ニッケルアフィニティー精製のためのHisタグ及びDNAレベルでのさらなるサブクローニングのための制限部位(Ncol、Nhel、BamHI)を含む。
SSNAKWDQWSSDWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARWNQRWDNWAT(配列番号12)。
13−WQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRALWM−49(配列番号7)。
RLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARG(配列番号8)
MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR(配列番号9)
MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARGMAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR(配列番号4)
精製を容易にするために、FLA−SAPN−2は、式(II)で定義するように以下の配列Yから始まるものであり、
MGHHHHHHASEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTGS(配列番号10)
これは、ニッケルアフィニティー精製のためのHisタグ、セリンにより置換された1つのシステインを含む、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)の以下のCSタンパク質由来のT細胞エピトープ配列T1BT*(Calvo-Calle J.M.、Infection and immunity 2006:p.6929-6939)
EYLNKIQNSLSTEWSPSSVT(配列番号13)
及びDNAレベルでのさらなるサブクローニングのための制限部位(Ncol、Nhel、BamHI)を含み、したがって、FLA−SAPN−1aの「X」と多少異なっている。
13− WQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARWRALWM−49(配列番号7)。
RLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARG(配列番号8)
これは、FLA−SAPN−1aにおけるのと正確に同じであり、したがって、ナノ粒子FLA−SAPN−1a及びFLA−SAPN−2のコアND1−L1−ND2及びND3−L2−ND4は、完全に同一であり、リフォールディング時の2つのタンパク質鎖の適切な共集合を保証する。
SGDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANP(配列番号11)
MGHHHHHHASEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARGSGDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANP(配列番号5)
ナノ粒子構築物をコードするDNAは、標準的な分子生物学の手順を用いて作製した。タンパク質配列LONG−D2−D1−oriをコードするDNAを含むプラスミド
MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARGSGSSARLSDLEANNAVKGESKITVNGAEYTANATGDKITLAGKTMFIDKTASGVSTLINEDAAAAKKSTANPLASIDSALSKVDAVRSSLGAIQNRFDSAIGSRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLKSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGANDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPKEATVGDLKSSFKNVTGYDTYAAGADKYRVDINSGAV(配列番号15)
は、図3の基本SAPN発現構築物のNcoI/EcoRI制限部位にクローニングすることにより構築した。
プラスミドをアンピシリンを含むLuriaブロス中で37℃で増殖させた大腸菌(Escherichia coli)BL21(DE3)細胞に移入して形質転換を起こさせた。発現は、イソプロピルβ−D−チオガラクトピラノシドにより誘導した。誘導の4時間後に、細胞を37℃から除去し、4000×gで15分間の遠心分離により収集した。細胞ペレットを−20℃で保存した。ペレットを氷上で解凍し、9M尿素、100mM NaH2PO4、10mMトリスpH8、20mMイミダゾール及び0.2mMトリス−2−カルボキシエチルホスフィン(TCEP)からなる溶解緩衝液に懸濁した。
細胞を超音波処理により溶解し、溶解物を30500×gで45分間遠心分離することにより透明にした。透明溶解液をNi−NTAアガロースビーズ(Qiagen、Valencia、CA、USA)とともに少なくとも1時間インキュベートした。カラムを溶解緩衝液で、次いで9M尿素、500mM NaH2PO4、10mMトリスpH8、20mMイミダゾール及び0.2mM TCEPを含む緩衝液で洗浄した。タンパク質は、pH勾配:9M尿素、100mM NaH2PO4、20mMクエン酸、20mMイミダゾール及び0.2mM TCEPにより溶出した。その後の洗浄は、pH6.3、5.9及び4.5で行った。pH勾配後、イミダゾール濃度を増加させることによる溶解緩衝液の勾配を用いて、タンパク質をさらに溶出した。純度は、図5に示すようにドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により評価した。
リフォールディングのためにタンパク質を次の条件に再緩衝した(rebuffered):9M尿素、20mMトリスpH8.5、50mM NaCl、5%グリセロール、2mM EDTA。第1のスクリーンの迅速なリフォールディングのために、1.8mg/mlの濃度を有する4μlの溶液を表3に示す緩衝液に0.05mg/mlの最終濃度まで加えた。次いで、溶液を逆染色透過型電子顕微鏡法により種々の解像度で解析した。
MES=2-モルホリノエタンスルホン酸
HEPES=2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸
TRIS=2-アミノ-2-ヒドロキシメチルプロパン-1,3-ジオール
Toll様受容体5(TLR5)に対するLONG−D2−D1−oriのアゴニスト活性をTLR5/SEAPorter HEK293細胞(IMGENEX、カタログ番号IML−105)を用いて試験し、活性LONG−D2−D1−oriのEC50を評価した。IML−105細胞株を1ウェル当たり5×104細胞で96ウェルプレートに16時間平板培養した。細胞を様々な濃度(0.01〜1000ng/ml)の各試験試料、陽性コントロール(IMGENEXフラジェリン、カタログ番号IMG−2205)又は溶媒コントロール(各対応する緩衝液)で2連で24時間処理した。次いで各ウェルの細胞培養培地を1:2に希釈し、96ウェルマイクロタイタープレートに2連で移し、連続希釈分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)標準も2連で加えた。プレートを65℃で30分間インキュベートして、任意の内因性アルカリホスファターゼを不活性化した。次いでホスファターゼ基質を各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートした。405nmで読み取ることによりプレートを解析し、用量反応活性評価及びEC50評価を準備した(図7A)。
T81c−WRW−8RRVRA−D0−D1(FLJB_SALTY)と称される式(Ia)の化合物:
MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARGMAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR(配列番号4)
T81c−WRW−8RRVRA−T1BT*(FLA−SAPN−2)と称される式(II)の化合物:
MGHHHHHHASEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWRDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARGSGDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANP(配列番号5)
これらの2つの共集合鎖は、上文で詳細に記載されている。式(Ia)及び(II)の両方で同じである、すなわち、ND3−L2−ND4と同じである、ND1−L1−ND2コア構造も実施例1におけるものと同じである。鎖1(式Ia)においては、FLA部分は、フラジェリンのD0及びD1ドメインから構成されているが、実施例1と異なる系統に由来する。鎖2におけるY及びZ置換部分は、T1BT*T細胞エピトープ及びB細胞エピトープとしての熱帯熱マラリア原虫のCSタンパク質由来のNANPリピート領域由来の28残基長配列である。
PD52−2i88−PANDORA−D2−D1−oriと称される式(Ia)の化合物:
MGHHHHHHASGSWEKWNAKWDEWKNDWNDWRRDWQAWVDDWAYWTLTWKYGELYSKLAELERRNEELERRLEELARFVAALSMRLAELERRNEELARGSGSSARLSDLEANNAVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFIDRTASGVSTLINEDAAAARRSTANPLASIDSALSRVDAVRSSLGAIQNRFDSAIGSKNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLRSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGAKDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPREATVGDLRSSFRNVTGYDTYAAGADRYRVDINSGAV(配列番号17)
PD52−2i88−PANDORA−Noroと称される式(II)の化合物:
MGHHHHHHASGSWEKWNAKWDEWKNDWNDWRRDWQAWVDDWAYWTLTWKYGELYSKLAELERRNEELERRLEELARFVAALSMRLAELERRNEELARGSGSTVEQKTRPFTLPNLPLSSLSNSRAPLPISSMGISPDNVQSVQFQNGRCTLDGRLVGTTPVSLSHVAKIRGTSNGTVINLTELDGTPFHPFEGPAPIGFPDLGGCDWHINMTQFGHSSQTQYDVDTTPDTFVPHLGSIQANGIGSGNYVGVLSWISPPSHPSGSQVDLWKIPNYGSSITEATHLAPSVYPPGFGEVLVFFMSKMPGPGAYNLPCLLPQEYISHLASEQAPTVGEAALLHYVDPDTGRNLGEFKAYPDGFLTCVPNGASSGPQQLPINGVFVFVSWVSRFYQLKPVGTAS(配列番号18)
これらの2つの共集合鎖PD52−2i88−PANDORA−D2−D1−ori及びPD52−2i88−PANDORA−Noroは、式(Ia)及び式(II)の両方における同じコア構造を有する。すなわち、ND1−L1−ND2がND3−L2−ND4と同じである。PD52−2i88−PANDORA−D2−D1−ori(式Ia)において、FLA部分は、フラジェリンのD2及びD1ドメインから構成されている。オリゴマー化ドメインND2(又はND4、それぞれ)は、二量体コイルドコイルを形成するように設計されている。B細胞エピトープ(Z)並びにフラジェリン(FLA)の形態の両方が二量体タンパク質であるため、これは重要である。共集合比率は、5:55である。
T81c−8−D0−D1(Eurogentec 0)と称される式(Ia)の化合物:
MGHHHHHHASWKWDGGLVPRGSWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELAKFVAAWTLKAAAVDLELAALRRRLEELARGNTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDGGENPLQKIDAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLTSVRSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQN(配列番号19)
T81c−8−Pfと称される式(II)の化合物:
MGHHHHHHASWKWDGGLVPRGSWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARLRALLMGGRLLLRLEELERRLEELAKFVAAWTLKAAAVDLELAALRRRLEELARGGSGANANPNANPNANPNANP(配列番号20)
これらの2つの共集合鎖は、実施例6で述べたものと類似している。YにおけるT1BT*T細胞エピトープが存在せず、Zにおける熱帯熱マラリア原虫由来のCSタンパク質のリピート領域由来のB細胞エピトープは、16残基長であるにすぎない。三量体コイルドコイル(ND2及びND4)は、panDR結合エピトープPADREを含む。鎖1(式Ia)においては、FLA部分は、フラジェリンのD0(残基6〜171)及びD1(残基229〜312)ドメインから構成されているが、実施例1及び6におけるものと再び異なる系統である、ネズミチフス菌(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium)のフェーズIフラジェリン中間ドメイン変異体C150に由来する。D0とD1は、2つのグリシン残基により連結されている。
DIM−D0−D1(Eurogentec 1)と称される式(Ia)の化合物:
MGHHHHHHASGSWEEWNARWDEWENDWNDWREDWQAWRDDWARWRATWMGGRLLSRLERLERRNEELRRLLQLLRNRLERLAQFVRALSMQNAELERRLEELARGMAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR(配列番号21)
DIM−D2−D1−tip3_NIC−peptと称される式(II)の化合物:
MGHHHHHHASGSWEEWNARWDEWENDWNDWREDWQAWRDDWARWRATWMGGRLLSRLERLERRNEELRRLLQLLRNRLERLAQFVRALSMQNAELERRLEELARGSGSSARLSDLEANNAVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFIDRTASGVSTLINEDAAAARRSTANPLASIDSALSRVDAVRSSLGAIQNRFDSAKAKKKDGKDDKDSKNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLRSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGAKDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPREATVGDLRSSFRNVTGYDTYAAGADRYRVDINSGAV(配列番号22)
実施例5及び実施例6によれば、フラジェリン誘導体は、そのD2−D1形よりもそのD0−D1形において免疫原性が高いと思われる。したがって、D0−D1形は、D2−D1形のフラジェリンを有する免疫原の免疫原性を増加させるためのTLR5アゴニストとして用いることができる。したがって、この実施例では配列D0−D1
MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRINSAKDDAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQINSQTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR(配列番号23)
は、式(Ia)における「FLA」に対応し、一方、D2−D1−tip3
SARLSDLEANNAVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFIDRTASGVSTLINEDAAAARRSTANPLASIDSALSRVDAVRSSLGAIQNRFDSAKAKKKDGKDDKDSKNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLRSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGAKDGETITIDLQKIDVKSLGLDGFNVNGPREATVGDLRSSFRNVTGYDTYAAGADRYRVDINSGAV(配列番号24)
は、式(II)における「Z」に対応する。D2−D1−tip3におけるこの配列「Z」は、D2ドメインが上述のようにフラジェリンのD1ドメインと組み合わされているフラジェリンの修飾である。さらに、D2−D1−tip3のタンパク質足場は、ニコチン抗原の提示のための担体として用いる。タンパク質足場への活性化ニコチンの共有結合を可能にするために、表面に露出しているアルギニンをリシンに突然変異させると同時に、表面に露出していないリシン側鎖をアルギニンに突然変異させる。タンパク質配列の第一級アミンへの活性化ニコチンの共有結合により、ニコチンがナノ粒子の表面上に提示される。さらに、ナノ粒子の最外表面にニコチン分子を提示するために、D2−D1タンパク質は、高密度のリシンを含む分子の最も露出した部分(図2A)に配列KAKKKDGKDDKD(配列番号25)をいわゆる「tip3」として有する。したがって、リシン側鎖へのニコチンの共有結合は、ナノ粒子の表面におけるニコチン分子の高密度提示を可能にする。
DEDDLと称される式(Ia)の化合物:
MGDKHHHHHHKDGSDKGSWEEWNARWDEWENDWNDWREDWQAWRDDWARWRATWMGGRLLSRLERLERRNEELRRLLQLLRNRLERLAQFVRALSMQNAELERRLEELARGMAQVINTNSLSLLTQNNLNRSQSALGTAIERLSSGLRINSARDDAAGQAIANRFTANIRGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVRVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLRQINSQTLGLDQLNVQQKYKDGDKGDDKTENPLQRIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR(配列番号26)
このナノ粒子タンパク質鎖は、実施例8におけるように、ネズミチフス菌のフェーズIフラジェリン中間ドメイン変異体C150に由来する修飾D0−D1ドメインを「FLA」として含む。この配列内のすべてのリシン残基は、アルギニンにより置換されている。D0及びD1ドメインは、分子の共有結合のための結合部位としての4個のリシンを含む、アミノ酸配列KYKDGDKGDDK(配列番号1)により連結されている。
Claims (13)
- タンパク質オリゴマー化ドメインND1、リンカーL1、タンパク質オリゴマー化ドメインND2、フラジェリンの誘導体FLA、及びさらなる置換部分Xを含む連続鎖からなる以下の式(Ia)又は(Ib)
X−ND1−L1−ND2−FLA (Ia)又は FLA−ND1−L1−ND2−X (Ib)
の複数の構築ブロック(式中、
ND1は、m個のND1サブユニットの(ND1)mオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ND2は、n個のND2サブユニットの(ND2)nオリゴマーを形成するタンパク質であり、
m及びnは、それぞれ2と10の間の数であり、ただし、mは、nと等しくなく、nの倍数でなく、nは、mの倍数でなく、
L1は、結合、又は短い柔軟なリンカーであり、
FLAは、フラジェリンであるか、あるいはフラジェリンアミノ酸配列の一部を欠き、且つ/又は1〜20個のアミノ酸が他のアミノ酸により置換されており、且つ/又は直接結合した若しくは1〜20個のアミノ酸を含むリンカーを介して結合した抗原をさらに含むフラジェリンの誘導体であり、
Xは、存在しないか、又は1〜1000個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である)の凝集体からなる自己集合タンパク質ナノ粒子であって、
タンパク質オリゴマー化ドメインND3、リンカーL2、タンパク質オリゴマー化ドメインND4、並びにさらなる置換部分Y及びZを含む連続鎖からなる以下の式(II)
Y−ND3−L2−ND4−Z (II)
の複数の構築ブロック(式中、
ND3は、y個のND3サブユニットの(ND3)yオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ND4は、z個のND4サブユニットの(ND4)zオリゴマーを形成するタンパク質であり、
y及びzは、それぞれ2と10の間の数であり、ただし、yは、zと等しくなく、zの倍数でなく、zは、yの倍数でなく、
ND3がND1と同一であるか、又はND4がND2と同一であるか、又はND3及びND4の両方がそれぞれND1及びND2と同一であり、
L2は、結合であるか、又はL1と異なるか、若しくはL1と同一であってもよい短い柔軟なリンカーであり、
Y及びZは、互いに独立に、存在しないか、又は1〜1000個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である)と共集合していてもよい自己集合タンパク質ナノ粒子。 - 以下の式(II)
Y−ND3−L2−ND4−Z (II)
の複数の構築ブロックと共集合した、
以下の式(Ia)又は(Ib)
X−ND1−L1−ND2−FLA (Ia)又は FLA−ND1−L1−ND2−X (Ib)
の複数の構築ブロックの凝集体からなる請求項1に記載のタンパク質ナノ粒子。 - ND1及びND2のうちの少なくとも1つ並びにND3及びND4のうちの少なくとも1つがコイルドコイルである、請求項1に記載のタンパク質ナノ粒子。
- X、Y及びZのうちの少なくとも1つが目的の抗原である、請求項1から3の何れか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
- FLAが、フラジェリンのD2及びD3ドメインを欠いているフラジェリン誘導体である、請求項1から4の何れか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
- FLAが、目的の抗原を含むフラジェリン誘導体である、請求項1から5の何れか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
- 式(Ia)の構築ブロックにおけるn又は式(Ib)の構築ブロックにおけるmが2である、請求項1から6の何れか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
- FLAが、フラジェリンのD2部分において、nが2である式(Ia)におけるオリゴマー化ドメインND2に、又はmが2である式(Ib)におけるオリゴマー化ドメインND1に連結されている、請求項7に記載のタンパク質ナノ粒子。
- ND1、ND2、ND3及びND4のうちの少なくとも1つがコイルドコイルである、請求項1から8の何れか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
- ND1、ND2、ND3及びND4のうちの少なくとも1つがバクテリオファージT4タンパク質フィブリチンの三量体化ドメインである、請求項1から9の何れか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
- 請求項1から10の何れか一項に記載のタンパク質ナノ粒子を含む組成物。
- タンパク質オリゴマー化ドメインND1、リンカーL1、タンパク質オリゴマー化ドメインND2、フラジェリンの誘導体FLA、及びさらなる置換部分Xを含む連続鎖からなる以下の式(Ia)又は(Ib)
X−ND1−L1−ND2−FLA (Ia)又は FLA−ND1−L1−ND2−X (Ib)
の単量体構築ブロック(式中、
ND1は、m個のND1サブユニットの(ND1)mオリゴマーを形成するタンパク質であり、
ND2は、n個のND2サブユニットの(ND2)nオリゴマーを形成するタンパク質であり、
m及びnは、それぞれ2と10の間の数であり、ただし、mは、nと等しくなく、nの倍数でなく、nは、mの倍数でなく、
L1は、結合、又は短い柔軟なリンカーであり、
FLAは、フラジェリンであるか、あるいはフラジェリンアミノ酸配列の一部を欠き、且つ/又は1〜20個のアミノ酸が他のアミノ酸により置換されており、且つ/又は直接結合した若しくは1〜20個のアミノ酸を含むリンカーを介して結合した抗原をさらに含むフラジェリンの誘導体であり、
Xは、存在しないか、又は1〜1000個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である)。 - 請求項1から10の何れか一項に記載の有効量のタンパク質ナノ粒子を、そのようなワクチン接種を必要とする対象に投与することを含む、ヒト又は非ヒト動物にワクチン接種する方法。
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