JP2017501695A - アデノウイルスおよび対応するプラスミドの作製方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、アデノウイルスゲノムの一部または全部と、アデノウイルスゲノムの迅速で柔軟な操作を可能にする１つまたは複数の独自の制限部位とを含む、アデノウイルスプラスミドを作製する方法、および例えば導入遺伝子を含むアデノウイルス構築物を調製する方法に関する。本開示はほかにも、当該方法に用いられ、当該方法によって作製される新規な中間体、当該方法のプラスミドおよびシャトルベクターならびに当該プラスミドおよび／または方法から得られるアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターに及ぶ。本開示はさらに、ウイルスまたはベクター、例えば本明細書に開示される方法から得られるウイルスまたはベクターの治療法への使用、例えば癌治療への使用などに関する。
【選択図】なし

Description

本開示は、アデノウイルスゲノムの一部または全部と、アデノウイルスゲノムの迅速で柔軟な操作を可能にする１つまたは複数の独自の制限部位とを含むアデノウイルスプラスミドを作製する方法、および例えば導入遺伝子を含むアデノウイルス構築物を調製する方法に関する。本開示はほかにも、当該方法に用いられ、当該方法によって作製される新規な中間体、当該方法のプラスミドおよびシャトルベクターならびに当該プラスミドおよび／または方法から得られるアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターに及ぶ。本開示はさらに、ウイルスまたはベクター、例えば本明細書に開示される方法から得られるウイルスまたはベクターの治療法への使用、例えば癌治療への使用などに関する。
例えば、治療用ウイルスを武装して治療による影響を増大させるため、あるいは複製能を有するウイルスベクターまたは複製能欠損ウイルスベクターを用いて標的細胞に遺伝子を送達するためといった多くの理由で、アデノウイルスに導入遺伝子を挿入するのが望ましい。
ウイルスゲノムに導入遺伝子を挿入するには通常、アデノウイルスゲノムを含むプラスミドを作製し、次いで、例えば相同組換えを用いて、このプラスミドに導入遺伝子を挿入した後、プラスミドからウイルスゲノムを切り取る。しかし、本明細書に記載されるいくつかの理由から、特に、Ｅ１またはＥ３領域の外側など通常とは異なる位置に導入遺伝子を挿入しようとする場合、複製能を有するウイルスベクターおよび複製能欠損ウイルスベクターの両方に用いることができ、かつ例えば、既知の予測可能な位置に大型の導入遺伝子を受け入れることが可能な柔軟なプラスミドを入手するのは必ずしも容易なことではない。
治療および診断を目的としてアデノウイルスに導入遺伝子を挿入する際に生じる問題点は大きく３種類に分けられる。第一に、アデノウイルスであればすべて治療および診断適用に理想的な候補になるわけではなく、例えば、ヒトの集団はＡｄ５（サブグループＣアデノウイルス）に対する免疫の保有率が高く、このため、ウイルスを投与しても短時間で免疫系により除去される。この問題を克服するため、免疫保有率が比較的低いアデノウイルスが用いられている。しかし、現在まで行われてきたゲノム研究の多くがＡｄ５に関するものである。このため、代替アデノウイルスの材料および入手源が利用できないことが多い。
第二に、アデノウイルスであればすべて、大型の導入遺伝子を受け入れ、生存ウイルスとしてその安定性を維持することができるわけではない。さらに、アデノウイルスゲノムは大型で、ウイルスの機能に影響を及ぼさずに追加の遺伝物質を挿入する余地はほとんどなく、例えば、ウイルスをウイルスキャプシド内に封入する機能が悪影響を受けることがあり、これが次にはウイルスの感染力に影響を及ぼす可能性がある。
この問題を克服するため、ゲノムに欠失を生じさせる。この戦略は、複製に不可欠な１つまたは複数の遺伝子が除去されるため、特に複製欠損ウイルスベクターに適している。この戦略では、ベクターのｉｎ ｖｉｖｏでの複製能が制限されるとともに、ゲノム内にスペースが生まれて大型の導入遺伝子の挿入が可能になる。このような導入遺伝子は、ウイルスベクターに複製能がないにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏで発現することが可能である。欠損させることが最も多いのはＥ１遺伝子である。ＡＤＥＡＳＹシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）などの先行技術のシステムでは、Ｅ１領域に導入遺伝子を挿入することが可能である。いくつかの場合には、Ｅ３領域の一部または全部を欠失させ（例えば、国際公開第２０１１／０１２３５６４号を参照されたい）、この欠失させた領域に遺伝子を挿入し得る。
このため、導入遺伝子は通常、欠失が生じた位置と同じ位置に挿入される。したがって、導入遺伝子の挿入部位は初期遺伝子の位置にほぼ限定されているが、これによりウイルス遺伝子発現、ウイルス生活環および／または複製速度が影響を受ける可能性が高くなるため、問題となり得る。特に、Ｅ１領域の欠失は複製可能なアデノウイルスには適さず、論じられている通り、ウイルス生活環への影響が最小限に抑えられるように、導入遺伝子が初期遺伝子の位置に来ないようこれを挿入するのが有用であるものと考えられる。
第三に、アデノウイルスゲノムは密に詰め込まれており、ウイルス生活環および／または転写などの機能に影響を及ぼさずに導入遺伝子を安全に挿入し得る材料が遺伝子間にほとんど存在しないため、操作が容易ではない。さらに、遺伝子間領域に存在する制限部位があるとしても少なく、ゲノム内の１箇所にのみ存在する制限部位となるとさらに少ない。１つの制限部位がウイルスゲノムに２箇所以上存在すると、その制限部位を用いて導入遺伝子を１つの位置に選択的に挿入する能力が著しく阻害されるため、後者のような制限部位は重要である。
したがって、複製能を有するウイルスの操作に用いることができ、初期遺伝子から除去された位置に導入遺伝子が挿入され得るプラスミドを提供するのが望ましい。
複製能を有するウイルスに利用可能な戦略の１つに、挿入に偏りのないトランスポゾンを用いてゲノムに導入遺伝子を挿入するものがある（Ｊｉｎら，２００４に記載されている）。このトランスポゾンは後期遺伝子に挿入され得るため、この技術はシステムに上記のような不利な点はない。Ｊｉｎらは、遺伝子挿入位置の部位が挿入する遺伝子の種類の影響を受けるとする仮説を提唱したが、一部の遺伝子は挿入後に置換することが不可能であり、場合によっては、挿入された遺伝子の置換が困難であったり、置換遺伝子が異なる方向に挿入されたりすることがあった。このトランスポゾンがランダムに挿入されるという性質は、挿入可能な部位を多数もたらすものである。したがって、結果として挿入の予測可能性および再現性が損なわれる可能性がある。さらに、トランスポゾンが自ら導入遺伝子とともにゲノム内に挿入され、理論上、のちにウイルスゲノム内の遺伝子を「移動させる」可能性も否定できない。しかし、ランダムに挿入されるトランスポゾンはウイルスゲノム研究の素晴らしいツールである一方で、この方法の最も不利な点は、ウイルス構築物の合理的設計が不可能なことである。
したがって、複製能を有するウイルスの操作に用いることができ、初期遺伝子から除去された位置に導入遺伝子を再現可能に挿入することが可能なプラスミドを提供するのが望ましい。
本発明者らは、初期遺伝子の部位ではない位置に特異的に導入遺伝子を選択的に挿入するのに用いることが可能な制限部位の組合せを有するプラスミドを作製することにより、上記の１つまたは複数の問題点を解決することを試みた。
本発明者らは、Ｌ５遺伝子の付近に独自の制限部位を含むアデノウイルスプラスミドを開発した。本開示のプラスミドにより、初期遺伝子部位以外の位置に制限部位／導入遺伝子を有するウイルス、例えば、Ｅ１領域がインタクトな複製可能なアデノウイルスあるいは複製能欠損アデノウイルス、例えばＥ１および／またはＥ３が欠失した、または妨害された複製能欠損アデノウイルスなどの作製が可能になる。
一態様では、選択マーカー遺伝子と低コピー細菌複製起点とを含むシャトルベクターを調製する方法であって、前記アデノウイルスゲノムが、５’ＩＴＲ、３’ＩＴＲ、Ｌ５遺伝子を含む、方法が提供され、前記方法は、
ａ）アデノウイルスシャトルベクターを調製する段階であって、以下の３つのフラグメント：
ｉ）選択マーカー遺伝子と低コピー細菌複製起点とを含むベクターフラグメントであって、ベクターフラグメントの５’末端が、第一の制限酵素部位から始まり、第二の制限酵素部位内のベクターフラグメントの３’末端で終わる、ベクターフラグメント、
ｉｉ）５’ＩＴＲを含むアデノウイルスゲノムの５’末端を含む５’アームであって、５’アームの５’末端が、第二の制限酵素部位から始まり、第三の制限酵素部位を有する５’アームの３’末端で終わる、５’アーム、
ｉｉｉ）３’ＩＴＲとＬ５遺伝子とを含むアデノウイルスゲノムの３’末端を含む３’アームであって、３’アームの５’末端が、第三の制限酵素部位から始まり、第一の制限酵素部位を有する３’アームの３’末端で終わる、３’アーム
を等しい割合でライゲートすることと、
第一の制限酵素部位で３’アーム（フラグメントｉｉｉ）の３’末端とベクターフラグメント（フラグメントｉ）の５’末端とを連結し、
第二の制限酵素部位でベクターフラグメント（フラグメントｉ）の３’末端と５’アーム（フラグメントｉｉ）の５’末端とを連結し、
第三の制限酵素部位、少なくともＬ５遺伝子で５’アーム（フラグメントｉｉ）の３’末端と３’アーム（フラグメントｉｉｉ）の５’末端とを連結する、
１段階の３者ライゲーションを実施して、第一の制限酵素部位、次いでベクターフラグメント、次いで第二の制限酵素部位、次いで５’アーム、次いで第三の制限酵素部位、次いで３’アームの順で配置される環状シャトルベクターを形成することと
を含む、段階ならびに
ｂ）シャトルベクターのＬ５遺伝子と、Ｅ３部位、Ｅ４部位または前記部位の両方を含む（またはこれらからなる）群より選択される部位との間の位置に少なくとも１つの独自の制限部位および／または導入遺伝子を導入する段階
を含む。
一実施形態では、この方法は、段階ｃ）：
ｃ）段階ａ）または段階ｂ）のシャトルベクターとアデノウイルスゲノムとの間で相同組換えを実施して、プラスミドを形成する段階
をさらに含む。
一態様では、アデノウイルスゲノムと、選択マーカー遺伝子と、低コピー細菌複製起点とを含むアデノウイルスプラスミドを調製する方法であって、前記アデノウイルスゲノムが、５’ＩＴＲと３’ＩＴＲとＬ５遺伝子とＥ３部位とＥ４部位とを含む、方法が提供され、前記方法は、
ａ）アデノウイルスシャトルベクターを調製する段階であって、以下の３つのフラグメント：
ｉ）選択マーカー遺伝子と低コピー細菌複製起点とを含むベクターフラグメントであって、ベクターフラグメントの５’末端が、第一の制限酵素部位から始まり、第二の制限酵素部位内のベクターフラグメントの３’末端で終わる、ベクターフラグメント、
ｉｉ）５’ＩＴＲを含むアデノウイルスゲノムの５’末端を含む５’アームであって、５’アームの５’末端が、第二の制限酵素部位から始まり、第三の制限酵素部位を有する５’アームの３’末端で終わる、５’アーム、
ｉｉｉ）３’ＩＴＲを含むアデノウイルスゲノムの３’末端とＬ５遺伝子とを含む３’アームであって、３’アームの５’末端が、第三の制限酵素部位から始まり、第一の制限酵素部位を有する３’アームの３’末端で終わる、３’アーム
を等しい割合でライゲートすることと、
第一の制限酵素部位で３’アーム（フラグメントｉｉｉ）の３’末端とベクターフラグメント（フラグメントｉ）の５’末端とを連結し、
第二の制限酵素部位でベクターフラグメント（フラグメントｉ）の３’末端と５’アーム（フラグメントｉｉ）の５’末端とを連結し、
第三の制限酵素部位で５’アーム（フラグメントｉｉ）の３’末端と３’アーム（フラグメントｉｉｉ）の５’末端とを連結する、
１段階の３者ライゲーションを実施して、第一の制限酵素部位、次いでベクターフラグメント、次いで第二の制限酵素部位、次いで５’アーム、次いで第三の制限酵素部位、次いで３’アームの順で配列される環状シャトルベクターを形成することと
を含む、段階、
ｂ）シャトルベクターのＬ５遺伝子と、Ｅ３部位、Ｅ４部位および前記部位の両方を含む（からなる）群より選択される部位との間の位置に少なくとも１つの独自の制限部位を導入する段階ならびに
ｃ）段階ａ）または段階ｂ）のシャトルベクターとアデノウイルスゲノムとの間で相同組換えを実施して、プラスミドを形成する段階
を含む。
一実施形態では、段階ａ）の前に段階ｂ）を実施する。
一実施形態では、段階ａ）の後に段階ｂ）を実施する。
一実施形態では、５’アームは、アデノウイルスゲノムの約２．４〜４．７ｋｂの５’末端を含む。
一実施形態では、３’アームは、アデノウイルスゲノムの約３．３〜４．８ｋｂの３’末端を含む。
一実施形態では、１段階の３者ライゲーションを実施する時間は、少なくとも５０分間、例えば１時間以上、例えば２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間または２４時間などである。
一実施形態では、１段階の３者ライゲーションを約１０〜４０℃の温度範囲、例えば２０〜２５℃、例えば室温／周囲温度前後などで実施する。
一実施形態では、アデノウイルスはヒトアデノウイルス、例えばサブグループＢ型、例えば、ＥｎＡｄ、ＯｖＡｄ１、ＯｖＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ５（Ｃ群ウイルス）およびＡｄ１１から選択されるウイルスなどである。一実施形態では、アデノウイルスはＡｄ５ではない。一実施形態では、アデノウイルスはＡ群ウイルスではない。一実施形態では、アデノウイルスはＣ群ウイルスではない。
一実施形態では、アデノウイルスは複製能を有するか、複製可能であり、例えば複製可能などである。一実施形態では、アデノウイルスは条件付きで複製するウイルスではない。一実施形態では、アデノウイルスは複製欠損性である。
一実施形態では、独自の制限部位は、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂｆＩおよびＳｇｆＩ、例えば、ＮｏｔＩまたはＳｂｆＩとＳｇｆＩまたはＦｓｅＩとＮｏｔＩとＳｂｆＩとＳｇｆＩなどから独立して選択される。
一実施形態では、ベクターフラグメント内の第一の制限部位と３’アーム内の第一の制限部位は同じものである。一実施形態では、ベクターフラグメント内の第二の制限部位と５’アーム内の第二の制限部位は同じものである。一実施形態では、５’アーム内の第三の制限部位と３’アーム内の第三の制限部位は同じものである。
一実施形態では、第一の制限部位と第二の制限部位は同じものである。
一実施形態では、ライゲーションの前にベクターフラグメントを脱リン酸化する。
一実施形態では、複製起点はｐ１５Ａである。
一実施形態では、選択マーカー遺伝子はＫａｎＲまたはＡｍｐＲ、例えばＫａｎＲなどである。
一実施形態では、段階ｃ）を、例えばエレクトロコンピテントＢＪ５１８３細胞で、段階ａ）またはｂ）のシャトルベクターとアデノウイルスゲノムの比をそれぞれ３．５部：１．５部にして実施する。
一実施形態では、この方法は、例えば初期遺伝子の位置以外の位置に、少なくとも１つの導入遺伝子を例えばファイバーＬ５などと関連させて挿入する段階をさらに含む。一実施形態では、導入遺伝子は、例えばスプライスアクセプター配列を含む、カセットの形態である。
一実施形態では、導入遺伝子は内在性アデノウイルスプロモーター、例えば主要後期プロモーターの制御下にある。一実施形態では、Ｌ５の後に位置する１つまたは複数の遺伝子が、主要後期プロモーターまたはＥ４プロモーターの制御下にある。一実施形態では、Ｌ５の前に位置する１つまたは複数の遺伝子が、主要後期プロモーターまたはＥ３プロモーターの制御下にある。Ｌ５開始コドンの直前に位置する遺伝子が主要後期プロモーターの制御下にあってもよく、そのような遺伝子は一般に、Ｌ５の発現を可能にする調節エレメントを含んでいる必要がある。
一実施形態では、Ｌ５の後ろに位置する１つまたは複数の遺伝子が外来性プロモーターの制御下にある。
一実施形態では、この方法は、プラスミドからアデノウイルスゲノムを切り取し、ウイルスまたはウイルスベクターを形成する段階をさらに含む。
したがって、本開示の方法は、本開示のプラスミドおよびシャトルベクターなどの中間体を提供する。
実施形態では、この方法は、ウイルスまたはウイルスベクターの医薬製剤を調製する段階をさらに含む。
一実施形態では、この方法は、必要とする患者に本開示によるウイルスもしくはウイルスベクターまたは医薬組成物を投与する段階をさらに含む。
一実施形態では、
ａ）Ｌ５遺伝子、Ｅ３部位およびＥ４部位を含む、アデノウイルスゲノムと、
ｂ）Ｌ５遺伝子と、Ｅ３部位、Ｅ４部位およびＥ３部位とＥ４部位のそれぞれからなる群より選択される部位との間の位置にある少なくとも１つの独自の制限部位と、
ｃ）低コピー細菌複製起点と、
ｄ）選択マーカー遺伝子と
を含む、アデノウイルスプラスミドが提供される。
一実施形態では、プラスミドは、例えば導入遺伝子カセットの形態で、導入遺伝子をさらに含む。
一実施形態では、導入遺伝子は、治療用のタンパク質、ペプチドまたはＲＮＡ、例えば、抗体または抗体ドメイン、プロドラッグ変換酵素、免疫調節物質、酵素、ｓｉＲＮＡ、転写因子、細胞内シグナル伝達タンパク質または表面膜タンパク質、抗原などをコードする、目的の治療遺伝子およびレポーター遺伝子または造影物質、例えばルシフェラーゼまたはｅＧＦＰなどからなる群より選択される。
この方法は、新規なアデノウイルスプラスミドおよび中間体シャトルベクターを作製する柔軟な手段であって、例えば段階ｂ）で独自の制限部位を導入することにより、初期遺伝子発現を調節する領域の外側でアデノウイルスゲノムの操作を可能にする、手段を提供する点で有利である。
ＣｏｌｏＡｄ１ゲノムの模式図である。初期遺伝子（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４）は濃い灰色、後期遺伝子（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５）は薄い灰色で表されている。 ＣｏｌｏＡｄプラスミド：ＣｏｌｏＡｄ２．０、ＣｏｌｏＡｄ２．１およびＣｏｌｏＡｄ２．４の模式図である。 ＣｏｌｏＡｄ２．０、ＣｏｌｏＡｄ２．１およびＣｏｌｏ２．４プラスミドのＣｏｌｏＡｄ１ゲノム配列における特異的変化を示す図である。黒色で示される塩基対はいずれも、ＣｏｌｏＡｄ１ゲノム配列に追加されたものである。特異的制限酵素の配列および名称が示されている。 ＣｏｌｏＡｄ１ゲノム内でのＰｓｐＯＭＩ制限部位の位置を示す模式図である。 ＣｏｌｏＡｄプラスミド構築の概要を示す図である。 ＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターの制限部位マップを示す図である。 ＣｏｌｏＡｄ２．４プラスミドまたはＣｏｌｏＡｄ２．４シャトルベクター内に挿入する一般的な導入遺伝子カセットの設計を示す図である。 ｐ１５Ａ複製起点、カナマイシン耐性遺伝子、ＣｏｌｏＡｄ１の、ＩＴＲ、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ遺伝子、Ｅ２Ｂ遺伝子の一部、Ｅ３遺伝子の一部、ファイバー遺伝子およびＥ４遺伝子を有する１２ｋｂのＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターを示す図である。 ＰｓｐＯＭＩ制限部位およびＡｃｌＩ制限部位を詳細に示したＣｏｌｏＡｄ１のマップである。 Ａ：５’アームＰＣＲの増幅産物を示す図である。５’ＡｓｃＩ制限部位および３’ＰｓｐＯＭＩ制限部位に隣接するＣｏｌｏＡｄ１の５’ＩＴＲ、Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢおよびＥ２Ｂ遺伝子の一部を含む約４．６ｋｂのフラグメントである。 Ｂ：３’アームのＰＣＲ増幅産物を示す図である。５’ＰｓｐＯＭＩ制限部位および３’ＡｓｃＩ制限部位に隣接するＣｏｌｏＡｄ１のＥ３、ファイバー、Ｅ４および３’ＩＴＲを含む約４．５ｋｂのフラグメントである。 Ｃ：ｐ１５Ａ−ＫａｎＲベクターフラグメントのＰＣＲ産物を示す図である。５’ ＡｓｃＩ制限部位および３’ＡｓｃＩ制限部位を含む約２．９ｋｂのフラグメントである。 Ａ：５’アーム、３’アームおよびｐ１５ａ ＫＡＮベクターフラグメントのＰＣＲ産物を示す図である。産物はそれぞれ４．６ｋｂ、４．５ｋｂおよび３ｋｂであった。 Ｂ：５’アームおよび３’アームのＰＣＲ産物を示す図である。 ＡｓｃＩおよびＡｓｃＩ／ＰｓＰＯＭＩで消化したｐ１５Ａ−Ｋａｎベクターフラグメント、５’アームおよび３’アームを示す図である。消化産物が黒線の四角で強調されている。 各ＰＣＲ増幅で予想されるプライマー結合領域および産物を示す模式図である。 スクリーニングしたクローンの代表的なものから得られたＰＣＲ産物を示すゲルである。構築物１３、１４および１６は正しい大きさのＰＣＲ産物を示した。これらの構築物は１：１：１（５’アーム：３’アーム：ｐ１５ａベクターフラグメント）で実施した三者ライゲーション反応の後に得られたものである。１：１：６のライゲーション比、１：１：１２のライゲーション比を用いた構築物はいずれも正しい大きさのＰＣＲ産物を示さなかった。 選択した構築物のＰｓｐＯＭＩまたはＡｓｃＩ／ＰｓｐＯＭＩによる制限分析を示す図である。１：１：１の比での三者ライゲーションの後に得られた構築物１３および１６は、正しい大きさの消化産物を示した。試料番号１６（ｍａｘｉ）は、構築物１６から得られたマキシプレップを消化したものに対応する。 ＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターの作製に２段階のライゲーション法を用いて作製された構築物のＰＣＲ産物を示すゲルである。スクリーニングした構築物はいずれも正しいＰＣＲ産物を示さなかった。 ＣｏｌｏＡｄ２．４シャトルベクターを示す図である。このシャトルベクターは、ファイバー遺伝子の下流に独自の制限部位ＳｇｆＩおよびＳｂｆＩを含む。 制限部位ＰｓＰＯＭＩおよびＡｃｌＩが隣接するＣｏｌｏＡｄ２．４合成フラグメントの模式図である。 ＣｏｌｏＡｄ２．４シャトルベクターであると推定された構築物の制限分析を示す図である。５つの構築物はいずれも、ＥｃｏＲＶおよびＳｂｆＩによる消化の後にＣｏｌｏＡｄ２．４シャトルベクターに対応する正しい大きさのバンド、すなわち３ｋｂのバンドおよび９ｋｂのバンドを示した。 ＣｏｌｏＡｄ２．０シャトルベクターを示す図である。このシャトルベクターは、ファイバー（Ｌ５）遺伝子および２つのポリＡ配列の上流に独自のＦｓｅＩ部位を、ファイバー（Ｌ５）遺伝子の下流に独自のＳｇｆＩ部位、ＮｏｔＩ部位、ＳｂｆＩ部位を含む。 制限部位ＰｓｐＯＭＩおよびＡｃｌＩが隣接するＣｏｌｏＡｄ２．０合成フラグメントの模式図である。 ＣｏｌｏＡｄ２．０シャトルベクターであると推定された構築物の酵素ＦｓｅＩ、ＡｓｃＩ、ＳｂｆＩまたはＰｓｐＯＭＩによる制限分析を示す図である。５つの構築物にはいずれも、ＣｏｌｏＡｄ２．０シャトルベクターに対応する正しい大きさのバンドが見られる。 ＣｏｌｏＡｄ２．１シャトルベクターを示す図である。このシャトルベクターは、ファイバー（Ｌ５）遺伝子の上流に独自のＮｏｔＩ部位を含む。 ＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターに挿入してＣｏｌｏＡｄ２．１シャトルベクターを作製するためのＤＮＡフラグメント（Ｃ）の構築に用いたＰＣＲ１（Ａ）およびＰＣＲ２（Ｂ）産物の模式図である。 ＣｏｌｏＡｄ２．１シャトルベクターであると推定された構築物の制限分析を示す図である。５つの構築物はいずれも、ＡｓｃＩおよびＮｏｔＩによる消化の後にＣｏｌｏＡｄ２．１シャトルベクターに対応する正しい大きさのバンド、すなわち３ｋｂ、４ｋｂおよび５ｋｂのバンドを示した。 組換えＣｏｌｏＡｄ２．４プラスミドを示す図である。この組換え体は、ｐ１５Ａ複製起点、カナマイシン耐性およびＣｏｌｏＡｄ１ゲノムを含み、ファイバーの下流に独自の制限部位ＳｇｆＩおよびＳｂｆＩを有する。 Ａ：エレクトロポレーションを実施したＢＪ５１８３細胞を散布したＬＢ＋カナマイシンプレートを示す図である。左側のプレートはネガティブ対照であり、右側のプレートはＣｏｌｏＡｄ１＋直線化したＣｏｌｏＡｄ２．４シャトルベクターの組換え体である。Ｂ：制限消化したＣｏｌｏＡｄ２．４組換え体を示す図である。候補の組換え体をＥｃｏＲＶおよびＳｂｆＩ（Ｅ＋Ｓ）で消化した。組換え体３、８および１０には２２ｋｂ、５．５ｋｂ、４．７ｋｂおよび２．８ｋｂのバンドが見られ、正確に形成された組換え体であることを示していた。ほかにも、組換え体をＰｓｐＯＭＩ（Ｐ）で消化し、１６ｋｂ、１２ｋｂおよび７ｋｂのバンドが得られた。 推定ＣｏｌｏＡｄ２．４組換え体の制限分析を示す図である。組換え体４は、ＰｓｐＯＭＩによる消化（Ｐ）で１６ｋｂ、１２ｋｂおよび７ｋｂの正しい大きさのバンドを示し、ＳｂｆＩおよびＥｃｏＲＶによる消化（Ｅ＋Ｓ）で２２ｋｂ、４．７ｋｂ、５．５ｋｂおよび２．８ｋｂのバンドを示した。この消化産物から、番号４にのみ組換えＣｏｌｏＡｄ２．４の存在が確認された。 Ａ：５’アーム−３’アームライゲーション後のＰＣＲ増幅産物を示す図である。低体積ライゲーション後のＰＣＲでは、０１９８（１）プライマーまたは０１９９（２）プライマーのいずれかを用いて約９．１ｋｂのフラグメントが得られた。高体積ライゲーション後のＰＣＲは有効ではなかった。Ｂ：ＡｓｃＩで消化した低体積５’アーム−３’アームライゲーションの産物（約９．１ｋｂ、レーン１および２）およびＡｓｃＩで消化したｐ１５Ａ−Ｋａｎベクターフラグメント（約３ｋｂ、レーン３）を示す図である。 プラスミドｐＮＧ−６２のマップを示す図である。これはプラスミドＣｏｌｏＡｄ２．４から作製したものであり、ｐ１５Ａ複製起点、カナマイシン耐性カセットおよびＣｏｌｏＡｄ１ゲノムを含み、独自の制限部位ＳｇｆＩとＳｂｆＩとの間にＧＦＰレポーター遺伝子の導入遺伝子カセットが挿入されている。 ｐＮＧ−６２プラスミド内に存在する導入遺伝子カセットの模式図である。このカセットは、分岐スプライスアクセプター配列（ｂＳＡ）、ＫＯＺＡＫ配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡおよびＳＶ４０後期ポリＡ配列を含む。このカセットには、ＣｏｌｏＡｄ２．４ベクターへ挿入するための制限部位ＳｇｆＩおよびＳｂｆＩが隣接している。 ｐＮＧ−６２導入遺伝子カセットを含む制限消化された構築物を示す図である。５つの構築物はいずれも正しい大きさのカセットを含む。 Ａ：ｐＮＧ−６２プラスミドを酵素ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＶで消化した予備的制限分析を示す図である。１．５：１のライゲーション比で得られた番号１、２および３の構築物ならびに２：１のライゲーション比で得られた番号１、２および４の構築物は、ｐＮＧ−６２プラスミドに対応する正しいバンドパターンを示した。Ｂ：２つのｐＮＧ−６２構築物およびｐＮＧ−６２を構築したプラスミドＣｏｌｏＡｄ２．４の酵素ＢｇｌＩＩまたは酵素ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＶによる診断的制限消化を示す図である。ＤＮＡフラグメントのバンドパターンから、ｐＮＧ−６２プラスミドの構築が確認された。 Ａ：ＮＧ−６２ゲノムＤＮＡをトランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞から回収したＮＧ−６２ウイルス粒子に２４時間（上のパネル）または４８時間（下のパネル）感染させたＡＤ２９３細胞の明視野顕微鏡像である。Ｂ：Ａの明視野像に対応する蛍光顕微鏡像であり、ＮＧ−６２ウイルス粒子に２４時間（上のパネル）または４８時間（下のパネル）感染させたＡＤ２９３細胞でのＧＦＰ発現を示している。
（詳細な説明）
本明細書で使用されるベクターは、遺伝物質を、例えばその複製および／または発現が可能な、別の構築物または細胞内に人為的に運搬する運搬体として用いられるＤＮＡ分子を指す。シャトルベクターの調製方法およびシャトルベクターそのものにより、本発明者らは、アデノウイルスゲノムの操作を可能にするのに必要な機能性をすべて含むプラスミドを構築することが可能になった。
本明細書で使用されるシャトルベクターは、例えば２種類の宿主細胞、通常、細菌細胞および哺乳動物細胞内で増殖することができる、ベクターを指す。
先行技術のシャトルベクターは一般に、３’アームに最小限のアデノウイルスゲノムＤＮＡ、例えば約１００塩基対の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列などが含まれるに過ぎない。この３’フラグメントは組換えを可能にするには十分であるが、Ｅ４、Ｅ３およびＬ５遺伝子が位置する３’末端でゲノムに操作をすることを可能にするものではない。通常、ＰＣＲ法および単純な２つのＤＮＡフラグメントのライゲーションを用いて、短い３’アームを有する小型のシャトルベクターを組み立てる。しかし、多数のアデノウイルス遺伝子を操作することが可能なより大型のシャトルベクターをライゲーションで作製するとなると、相当な大きさのＤＮＡフラグメントを３つ用いるため、より難度が高く予測不可能なものとなる。
本開示による方法で使用される３’アーム（フラグメントｉｉｉ）は一般に、必要に応じてＥ３部位および／またはＥ４部位を含む。一実施形態では、３’アームは、例えばウイルスゲノムのフラグメントとして、３’ＩＴＲ、Ｌ５およびＥ３部位を含む、すなわち、遺伝要素が、ウイルス内での本来の位置に対応する位置を有する（かつ、例えば、フラグメントはＥ４部位を含まない）。一実施形態では、３’アームは、例えばウイルスゲノムのフラグメントとして、３’ＩＴＲ、Ｌ５およびＥ４部位を含む、すなわち、遺伝要素が、ウイルス内での本来の位置に対応する位置を有する（かつ、例えば、フラグメントはＥ３部位を含まない）。一実施形態では、３’アームは、例えばウイルスゲノムのフラグメントとして、３’ＩＴＲ、Ｌ５、Ｅ３部位およびＥ４部位を含む、すなわち、遺伝要素が、ウイルス内での本来の位置に対応する位置を有する。
先行技術では一般に、３片のＤＮＡをライゲートしてシャトルベクターを形成する場合、第１段階で２片をライゲートし、次いで第２段階で第三のＤＮＡ片をライゲートするという、２段階のライゲーションを用いる。これには、大型のＤＮＡ片を一緒にライゲートするのは非効率的な工程であるという理由がある。驚くべきことに、通常の方法では、必要な大きさのアデノウイルスのシャトルベクターおよびプラスミドを上手く作製できなかった。このため、ＰＣＲ法および２段階のライゲーション法による２つのＤＮＡフラグメントのライゲーションを用いて、本発明者らの手で作業を数か月間実施するも、アデノウイルスシャトルベクターは全く作製されなかった。
本発明者らは、本発明の１段階の三者ライゲーション法を用いることにより、この問題を克服した。驚くべきことに、様々な条件下で複数の実験を実施したところ、最終的には確実で効率的な１段階の三者ライゲーションが明らかになった。ライゲーションを成功させるには、三者ライゲーションのＤＮＡ要素の割合が重要であるように思われる。理論的には、３つのＤＮＡセグメントを同時に組み立てるのは２つのＤＮＡセグメントを同時に組み立てるよりも難しいことから、この１段階の方法は若干直観に反するものではある。しかし、本開示の方法は有効であり、必要な大きさのシャトルベクターおよびプラスミドの調製を可能にすることが本発明者らによって明らかにされている。
Ｅ３部位、Ｌ５遺伝子およびＥ４部位を含むシャトルベクターが作製されると、本発明者らは、シャトルベクターに独自の制限部位を導入し、次いで、初期遺伝子から除去され導入遺伝子が導入され得る位置に新規な独自の制限部位を有する完全ゲノムを含むプラスミドを作出することができた。この実施形態では、制限部位を導入する段階ｂ）を段階ａ）の後に実施した。これに代わる方法としては、例えば、既に制限部位および／または導入遺伝子を含む３’アーム（フラグメントｉｉ）を調製するものがある。これを達成する１つの方法が、ライゲーション段階を実施する前に、所望の構造および機能をすべて有する３’アームフラグメントを合成することによるものである。後者の実施形態では、段階ａ）の前に段階ｂ）を実施する。繰り返し使用することが可能なクローニングプラットフォームを必要とする場合、制限部位を用いる。１つの特定のウイルス構築物のみを必要とする場合、単に導入遺伝子とそれが機能するのに必要な機構のみを挿入すればよい。したがって、本開示の代替的な一態様では、制限部位は全く挿入せず、むしろ、必要とされる位置に１つまたは複数の導入遺伝子を直接挿入する。
５’アームフラグメントも同様に、必要な要素、配列および／または機能性を用いて調製し得る、例えば合成し得ることは明らかである。
合成アデノウイルスフラグメントを用いる場合、それらを組み立てて、完全に機能するウイルスまたはウイルスベクターを作製し得る。
本明細書で使用されるＤＮＡ構築物は、シャトルベクターまたはプラスミドを指す。
本明細書で使用されるウイルス構築物は、本開示による複製可能なウイルスまたは複製欠損ウイルスを指す。
アデノウイルス
本開示は、あらゆる種類のアデノウイルスに幅広く適用可能であり、例えば表１に示されるようなヒトアデノウイルス、例えばサブグループＢアデノウイルスなど、特にキメラアデノウイルスＥｎＡｄ（Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２に特に適している。
文脈上別の意味であることが明らかでない限り、本明細書で使用されるアデノウイルスは、ウイルスベクターを含めアデノウイルスまたは任意の起源、血清型を指す総称である。文脈上別の意味であることが明らかでない限り、本明細書で使用されるアデノウイルスゲノムはアデノウイルスの遺伝子ＤＮＡ全体を意味する。
ゲノムＤＮＡとは、アデノウイルスゲノム由来のＤＮＡの一部または全部のことである。
アデノウイルスは正二十面体の非エンベロープ型二本鎖ＤＮＡウイルスであり、約３４〜４８キロ塩基対（Ｋｂ）の直鎖状ゲノムを有する。アデノウイルスはそのゲノムの大きさゆえに、その安定性または感染力に大きな影響を及ぼさずに追加で組み込むことができる外来ＤＮＡは、ゲノムの約１０％である。このため、これよりも長い配列を組み込むためには一般に、ウイルスの遺伝子の一部を除去する必要がある。
一実施形態では、アデノウイルスはヒトアデノウイルスである。本明細書で使用されるヒトアデノウイルスは、現在知られており、赤血球凝集性を含めた様々な特性に基づいてサブグループＡ〜Ｆに分類される（Ｓｈｅｎｋ，２００１を参照されたい）、５０を超えるアデノウイルス血清型のいずれかに属する任意のアデノウイルスを指し、さらに、現時点で未同定または未分類の任意のアデノウイルス血清型にも及ぶ。例えば、表１に示すように、Ｓｔｒａｕｓｓ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ，” ｉｎ Ｔｈｅ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．４５１−５９６（１９８４）ならびにＳｈｅｎｋ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，” ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋｎｉｐｅ，３５ｅａ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，ｐｐ．２２６５−２２６７（２００１）を参照されたい。
Figure 2017501695
これまでに検討されたヒトアデノウイルスゲノムはいずれも、同じ一般的構造を有する、すなわち、特定の機能をコードする遺伝子がウイルスゲノム内の同じ位置に位置している。ウイルスゲノムの各末端には、ウイルス複製に必要な逆方向末端反復（またはＩＴＲ）として知られる短い配列がある。ウイルスゲノムには５つの初期転写単位（Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４）、３つの遅延初期単位（ＩＸ、ＩＶａ２およびＥ２後期）のほか、プロセシングを受けて５つのファミリーの後期ｍＲＮＡ（Ｌ１〜Ｌ５）を生じる１つの後期単位（主要後期）が含まれている。初期遺伝子によってコードされるタンパク質は主として複製および感染に対する宿主細胞応答に関与するのに対し、後期遺伝子はウイルス構造タンパク質をコードする。初期遺伝子には前にＥの文字が付され、後期遺伝子には前にＬの文字が付される。
Ａｄ１１ゲノム内の遺伝子の位置のまとめを実施例に記載する。
ＩＴＲは既知の全アデノウイルスに共通してみられるものである。逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列は、その対称性を理由に命名されたものであり、ウイルス染色体の複製起点である。この配列の別の特性としてヘアピン形成能がある。本明細書で使用される５’ＩＴＲは、ゲノムの５’末端にあるＩＴＲを指す。本明細書で使用される３’ＩＴＲは、ゲノムの３’末端にあるＩＴＲを指す。
本明細書で使用されるＬ５遺伝子はファイバー遺伝子を意味する。ファイバー遺伝子は、アデノウイルスの主要なキャプシド成分であるファイバータンパク質をコードする。ファイバーは受容体認識において機能し、アデノウイルスが細胞に選択的に結合して感染する能力に寄与する。ファイバー遺伝子は、例えば、９８６塩基対の領域を含む。一実施形態では、ファイバーはゲノム、例えば、特に参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４５９，１５３号の配列番号１で定義されるか、ウイルス寄託Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ５９８９７０を参照することによる、Ａｄ１１ゲノムの３０８１１〜３１７８８の位置により定義される。
非ヒトアデノウイルスとしては、ヒツジウイルス、ブタウイルス、イヌウイルスおよびチンパンジーウイルスが挙げられる。
一実施形態では、アデノウイルスゲノムはサブグループＢアデノウイルスゲノムである。本明細書で使用されるサブグループＢは血清型Ｂアデノウイルスを意味する。サブグループＢアデノウイルスとしては、Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ５１が挙げられる。アデノウイルスのうち最も広く研究されているＡｄ５は、サブグループＣアデノウイルスである。ヒト集団ではＡｄ５に対する免疫がよくみられ、迅速な免疫応答によってウイルスが中和される可能性があるため、Ａｄ５は治療薬の候補としては劣る。
一実施形態では、アデノウイルスは、ＥｎＡｄ（ＣｏｌｏＡｄ１としても知られるＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ配列番号１、複製能を有する腫瘍溶解性キメラアデノウイルス−国際公開第２００５／１１８８２５号を参照されたい）、ＯｖＡｄ１（国際公開第２００８０８０００３号を参照されたい−そこに記載されている配列番号１であり、参照により本明細書に組み込まれる）、ＯｖＡｄ２（国際公開第２００８０８０００３号を参照されたい−そこに記載されている配列番号２であり、参照により本明細書に組み込まれる）、Ａｄ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＤＱ０８６４６６）、Ａｄ１１ｐ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ５９８９７０）などのＡｄ１１およびＡｄ５、例えばＥｎＡｄ（配列番号１）、ＯｖＡｄ１またはＯｖＡｄ２、特にＥｎＡｄから選択される。
一実施形態では、本開示の方法に使用されるアデノウイルスゲノムは、ＥｎＡｄ（配列番号１）と少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの配列同一性を有する。一実施形態では、アデノウイルスゲノムは、ＯｖＡｄ１（国際公開第２００８０８０００３号の配列番号１）と少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの配列同一性を有する。一実施形態では、アデノウイルスゲノムは、ＯｖＡｄ２（国際公開第２００８０８０００３号の配列番号２）と少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する。一実施形態では、アデノウイルスゲノムは、Ａｄ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＤＱ０８６４６６）と少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの配列同一性を有する。一実施形態では、アデノウイルスゲノムは、Ａｄ１１ｐ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ５９８９７０）と少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの配列同一性を有する。
ＥｎＡｄは、野生型Ａｄ１１ｐキャプシド、Ａｄ３およびＡｄ１１の両方に由来するキメラＥ２Ｂ領域ならびにＥ３領域およびＥ４領域における欠失（特に、Ｅ３全体の欠失およびＥ４ｏｒｆ４の欠失）を有する点で有利である。このような構造変化により、ＣｏｌｏＡｄ１ゲノム内に、例えば治療物質または免疫調節物質を発現する導入遺伝子カセットを挿入するための新たな「スペース」が生じる。さらに、ＥｎＡｄはサブグループＢアデノウイルスであるため、Ａｄ５に比べてヒトに既存の免疫がみられる頻度が低い。
ＥｎＡｄの構造変化により、Ａｄ１１ｐよりも約３．５ｋｂ小さく、導入遺伝子カセットを挿入するための新たな「スペース」が生じるゲノムが得られる。ＥｎＡｄは、例えばＥｎＡｄの強力な抗癌活性を増強するか、これと協同する多岐にわたる治療用タンパク質を送達するのに適した運搬体となる。このほか、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２は、同じくゲノム内に新たな「スペース」を有する、ＣｏｌｏＡｄ１と類似したキメラアデノウイルスである（国際公開第２００８／０８０００３号を参照されたい）。
本明細書で使用される配列同一性は、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が比較ウィンドウにわたって、例えばその長さ全体にわたって一致する（すなわち、ヌクレオチド同士または残基同士に基づく）ことを指す。「配列同一性の百分率」という用語は、最適に整列させた２つの配列を比較ウィンドウにわたって比較し、両配列に一致する核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）または残基がみられる位置の数を決定してマッチする位置の数を求め、それを比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を求めることにより算出されるものである。
本明細書で使用される「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の特徴を表し、ここでは、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸は、少なくとも１８個のヌクレオチド（６個のアミノ酸）位置の比較ウィンドウにわたって、多くの場合、少なくとも２４〜４８個のヌクレオチド（８〜１６個のアミノ酸）位置のウィンドウにわたって参照配列と比較したとき、少なくとも８５パーセントの配列同一性、例えば少なくとも９０〜９５パーセントの配列同一性、特に少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含み、配列同一性の百分率は、参照配列と、合計で参照配列の２０パーセント以下の欠失または付加を含み得る配列とを比較ウィンドウにわたって比較することにより算出される。参照配列は、それより大きい配列の一部分であり得る。
「類似性」という用語は、ポリペプチドを記載するために使用される場合、あるポリペプチドのアミノ酸配列および保存的アミノ酸置換と、第二のポリペプチドとを比較することにより決定されるものである。
「相同」という用語は、ポリヌクレオチドを記載するために使用される場合、２つのポリヌクレオチドまたはその指定された配列を最適に整列させて比較したとき、しかるべきヌクレオチド挿入または欠失を有し、ヌクレオチドの少なくとも７０％、通常、ヌクレオチドの約７５％〜９９％、特に少なくとも約９８〜９９％が一致することを表す。一実施形態では、所与の配列の全長にわたって比較を実施する。
一実施形態では、アデノウイルスゲノムはキメラＥ２Ｂ領域、例えば、Ｅ２Ｂ領域を含むゲノムを有する組換えキメラアデノウイルスまたはその変異体もしくは誘導体を有し、前記Ｅ２Ｂ領域は、第一のアデノウイルス血清型に由来する核酸配列と、第二のアデノウイルス血清型に由来する核酸配列とを含み；前記第一の血清型および前記第二の血清型は、それぞれ独立してアデノウイルスサブグループＢ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦから選択され、かつ互いに異なっており；前記キメラアデノウイルスは、特に参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／１１８８２５号に開示されるように、腫瘍溶解性であり、腫瘍細胞に対する治療指数の増大を示す。
一実施形態では、アデノウイルスゲノムはＥ３領域の一部または全部が欠失または変異しており、例えば、Ｅ３領域が変異している。一実施形態では、アデノウイルスゲノムはＥ４領域の一部または全部が欠失または変異しており、例えば、Ｅ４ｏｒｆ４が欠失している。
複製欠損および複製可能
一実施形態では、使用するアデノウイルスゲノムは、複製可能なアデノウイルス、特に複製能を有するアデノウイルス由来のものである。一実施形態では、本開示のウイルスまたはウイルス構築物は複製可能なもの、特に複製能を有するものである。一実施形態では、ＥｎＡｄは複製可能なものである。
本明細書で使用される複製可能は一般に、例えばパッケージング細胞系を必要とせずに、複製することが可能なウイルスを指す。本明細書ではこのようなウイルスは、ウイルス、複製能を有するウイルス（複製可能なウイルスのサブグループである）および条件付きで複製するウイルス（複製可能なウイルスのサブグループでもある）または生存ウイルスとも呼ばれる。したがって、本明細書で使用される複製可能なウイルスは、条件付きで複製するウイルスおよび複製能を有するウイルスを指す。
本明細書で使用される条件付きで複製するウイルスは、ある特定の遺伝子を発現、過剰発現または過小発現する癌細胞などの細胞内、例えばｐ５３遺伝子を過小発現する細胞内で複製することが可能なウイルスを指す。
複製能を有するウイルスとは、ヘルパーウイルスまたは補完／パッケージング細胞系の補助がなくても、例えばｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏで複製するのに必要な機構をすべて有するウイルスのことである。
文脈上別の意味であることが明らかでない限り、本明細書で使用される「ウイルス」は（上で定義されるアデノウイルスとは異なり）、複製可能なウイルス、例えば複製能を有するウイルスを指す。したがって、一実施形態では、本明細書で使用されるウイルスは一般に、複製能を有するウイルス、例えば、腫瘍溶解性ウイルスのような治療用ウイルスなどを指す。
一実施形態では、本開示による方法に使用するアデノウイルスゲノムは、複製可能でないアデノウイルスベクター由来である。一実施形態では、本開示のウイルスまたはウイルス構築物は非複製型（複製欠損とも呼ばれる）である。非複製型アデノウイルス、例えばウイルスベクター（ワクチン抗原などの導入遺伝子の送達、抗体などの細胞内送達に運搬体として使用されるもの）は一般に、複製に不可欠な１つまたは複数の遺伝子が除去されている。特に明示されない限り、本明細書で使用されるウイルスベクターは複製欠損である。
複製欠損アデノウイルスとは、複製するのにヘルパーウイルスまたは補完／パッケージング細胞系を必要とするウイルスのことである。複製するのにパッケージング細胞系を必要とするアデノウイルス（例えば、導入遺伝子を含むアデノウイルス）は一般に、ウイルスベクターと呼ばれる。一実施形態では、例えばＥ１領域の一部または全部の欠損により、ＥｎＡｄを複製欠損にする。
複製に不可欠な１つまたは複数の遺伝子を除去する理由は２つある。第一に、ベクターはｉｎ ｖｉｖｏで複製することができないため、安全性プロファイルが単純化されると考えられる。第二に、遺伝子を欠失させると、ゲノム内にスペースが生じることにより大型の導入遺伝子の挿入が可能になる。これらの導入遺伝子は、ウイルスベクターが複製することができないにもかかわらずｉｎ ｖｉｖｏで発現し得る。一実施形態では、ウイルスベクター作製時にウイルスからＥ１遺伝子を欠失させ、いくつかの場合には、これに代えて、または加えて、Ｅ３領域の一部または全部を欠失させる。
パッケージング細胞系とは、遺伝子が欠損した問題のウイルスを補助するよう調製された組換え細胞系のことである。本明細書で使用されるパッケージング細胞は、ウイルスが複製に不可欠な要素を欠損している場合にウイルスにその要素を供給することができる細胞を意味する。パッケージング細胞系の例としては、ＰｅｒＣ６細胞系が挙げられる。一実施形態では、パッケージング細胞系はＨＥＫ細胞である。
ウイルス遺伝子
Ｅ１はウイルス複製に何らかの役割を果たしている。Ｅ１領域を欠失または変異させることにより、ウイルスは特定の「パッケージング」細胞系の補助がないと複製できないようになる。
一実施形態では、本開示のウイルスベクターのゲノムのＥ１領域は全体または一部分が欠失している。一実施形態では、Ｅ１部位がＥ１領域の欠失であるか、５’アームにおいてＥ１領域のフラグメントが欠失している。
本明細書で使用されるＥ１部位は、Ｅ１領域の全体または一部分に欠失または置換があるか、Ｅ１領域に欠失も置換もないかに関係なく、Ｅ１領域の位置を指す。「Ｅ１部位」という用語は、Ｅ１が変異している場合、Ｅ１の一部分が欠失している場合、Ｅ１全体が欠失している場合またはＥ１全体がインタクトであり変異していない場合を包含する。例えばＥ１に関連する任意の非コード領域の後ろから始まる場合を含め、フラグメントまたは配列がＥ１領域の後ろから始まるか、その前で終わる場合、例えば配列がＥ２領域内で始まるような場合、Ｅ１部位は存在しなくてもよい。一実施形態では、Ｅ１部位は、Ｅ１領域またはその機能的フラグメントもしくは変異からなる。一実施形態では、Ｅ１が存在し、完全かつ／または機能的である。
Ｅ３は、ウイルス感染に対する宿主細胞の応答を調節するのに重要なタンパク質をコードする。
本明細書で使用されるＥ３部位は、アデノウイルスゲノム内でＥ３遺伝子または領域が存在するか、存在することが予想され得る位置を指す。Ｅ３遺伝子は、その全体が存在していても、そのフラグメントとして存在していても、その全体が存在しなくても、その一部分または全体が変異していてもよい。したがって、本明細書で使用されるＥ３部位は、Ｅ３領域の全体または一部分に欠失または置換があるか、Ｅ３領域に欠失も置換もないかに関係なく、Ｅ３領域の位置を指す。すべての既知のヒトアデノウイルスでアデノウイルスのゲノム構造が一様であることを考えれば（図１を参照されたい）、当業者は、遺伝子が存在するか欠失しているかに関係なく、Ｅ３部位を特定することができる。実際、問題のフラグメントまたは配列が、例えばＥ３に関連する任意の非コード領域を含め、Ｅ３領域を超えてから始まる場合、あるいはＥ３領域の前で終わる場合、例えば配列がＬ５領域内で始まるような場合、Ｅ３部位が存在しないことがある。
本明細書で使用されるＥ４部位は、アデノウイルスゲノム内でＥ４遺伝子または領域が存在するか、存在することが予想され得る位置を指す。Ｅ４遺伝子は、その全体が存在していても、そのフラグメントとして存在していても、その全体が存在しなくても、その一部分または全体が変異していてもよい。したがって、本明細書で使用されるＥ４部位は、Ｅ４領域の全体または一部分に欠失または置換があるか、Ｅ４領域に欠失も置換もないかに関係なく、Ｅ４領域の位置を指す。すべての既知のヒトアデノウイルスでアデノウイルスのゲノム構造が一様であることを考えれば（図１を参照されたい）、当業者は、遺伝子が存在するか欠失しているかに関係なく、Ｅ４部位を特定することができる。実際、問題のフラグメントまたは配列が、例えばＥ４に関連する任意の非コード領域を含め、Ｅ４領域を超えてから始まる場合、あるいはＥ４領域の前で終わる場合、例えば配列がＬ５領域内で始まるような場合、Ｅ４部位が存在しないことがある。
Ｌ５遺伝子は後期発現キャプシドタンパク質ファイバーをコードする。
一実施形態では、Ｌ５領域は完全長配列またはその機能フラグメント、例えば、特にｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで野生型遺伝子の５０％以上、例えば６０％、７０％、８０％、９０％または１００％などの活性を保持するフラグメントである。一実施形態では、Ｌ５は、ゲノムＤＮＡ Ｌ５遺伝子の８０％以上、例えば８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、を含む。
一実施形態では、Ｅ３、Ｅ４またはＬ５遺伝子の一部または全部が独立して変異している。
本明細書で使用される「変異している」は、関連する遺伝子の改変、例えば、点変異、欠失変異、付加変異、正変異、置換変異および／またはフレームシフト変異を指す。１つまたは複数の実施形態では、変異している遺伝物質の量は、関連する配列の１０％以下である。必須遺伝子、例えばＬ５（ファイバー遺伝子）では、変異遺伝子においてその遺伝子の機能が維持され、例えば機能の５０、６０、７０、８０、９０または１００などが保持されているか、機能が増大している、すなわち、機能が未変異遺伝子の１００％を上回る。
制限部位
本明細書で使用される制限部位とは、制限酵素によって特異的に認識されて切断される短いＤＮＡ配列のことである。
本明細書で使用される適切な制限部位は、ウイルスのゲノムＤＮＡを所与の位置で、例えば初期遺伝子ではないＤＮＡの領域で特異的に切断するのに（しかるべき制限酵素とともに）用い得る部位を意味する。一実施形態では、ＤＮＡを切断して導入遺伝子の挿入を容易にする。一実施形態では、適切な部位は通常、ゲノムの５’末端および／またはウイルスゲノムの３’末端あるいは３’アームフラグメントおよび／または５’アームフラグメントの対応する位置の付近に存在し、これにより、例えば図面に示されるように、ＤＮＡを直線化し操作することが可能になる。
一実施形態では、適切な制限部位は、シャトルベクターが約４〜５Ｋｂの３’アームおよび／または５’アームを有するように、３’ＩＴＲＳおよび／または５’ＩＴＲＳの末端から約４〜５Ｋｂの位置にある。このことは、シャトルベクターとアデノウイルスゲノムとの間での効率的な相同組換えが可能になる点で有利ある。この設計によりほかにも、シャトルベクターに（例えば５’アーム内に）Ｅ１遺伝子ならびに（例えば３’アーム内に）ファイバーおよびＥ４遺伝子を含ませ、これらの遺伝子を取り囲む任意の領域が導入遺伝子カセット挿入のために操作され得るようにすることが可能になる。
一実施形態では、シャトルベクターは、さらに１つ、２つまたは３つの適切な／独自の制限部位を含む。一実施形態では、シャトルベクターの他のどの位置にも適切な制限部位を挿入しない。一実施形態では、例えばＥ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４から独立して選択される、少なくとも１つの初期遺伝子またはその一部分の周囲に制限部位を組み込んで、当業者がゲノムを操作するためのさらなる選択肢を与える。
適切な制限制限は一般に、独自の制限部位である。制限部位と関連する「独自の」、「新規な」、「固有の」は、本明細書では互換的に使用され、特異的に切断され得る制限部位を指すものとする。制限部位またはいくつかの場合には１対の制限部位は、それが切断されるのが望ましい位置にのみ現れる場合に特異的に切断され得る。したがって、ウイルスゲノムまたはゲノムＤＮＡ内に制限部位が１回のみ現れるか、１対の制限部位が１回のみ現れる場合、この制限部位（対の場合は複数の制限部位）がしかるべき酵素によって特異的に切断され得る。したがって、一実施形態では、「独自の」、「新規な」または「固有の」は、それまでウイルスゲノムまたは関連するゲノムＤＮＡ内のいずれの場所にも存在していなかった制限部位または制限部位の対の導入を指す。したがって、一実施形態では、適切な制限部位はアデノウイルスゲノムに非天然（外来性）のものである。一実施形態では、独自の制限部位または制限部位の対は、ウイルスゲノムまたはゲノムＤＮＡ内に１回のみ現れる。一実施形態では、適切な制限部位は付着末端を生じる。一実施形態では、適切な制限部位はしかるべき市販の制限酵素によって切断される。
したがって、制限部位とは、制限酵素によって、通常、配列に特異的な酵素によって切断され得るＤＮＡ配列の位置のことである。一実施形態では、制限部位は３〜２２対の塩基対、例えば、４〜２２対、例えば５対、６対、７対、８対、９対、１０対、１１対、１２対、１３対、１４対、１５対、１６対、１７対、１８対、１９対、２０対、２対または２２対の塩基対を含む。
本明細書で使用される「導入された」または「導入すること」は一般に、天然、野生型または開始時のアデノウイルスゲノムには存在しない制限部位を挿入することを指す。
一実施形態では、本明細書で使用される独自の制限部位は、プラスミド内またはウイルス構築物内に１回だけ現れる制限部位を意味する。これにより、所与の制限酵素がプラスミドを１つの既知の位置でのみ切断するのを確実にすることが可能になる。本開示の文脈においては、独自の制限部位は通常、ゲノム内に導入されたものであって、天然に存在していたものではない酵素のことである。
一実施形態では、本明細書で使用される独自の制限部位は、特に、導入される制限部位がウイルスに天然に存在するものではなく、それにより、所与の制限酵素を用いたときにウイルスのゲノムが切断される位置に特異性を付与する場合に、組換え技術によってアデノウイルスゲノム内に導入される制限部位を指す。
したがって、別の実施形態では、本明細書で使用される独自の制限部位は、プラスミド、ウイルスまたはシャトルベクター内に１回のみ現れる制限部位を意味する。これにより、所与の制限酵素がプラスミドを１つの既知の位置でのみ切断するのを確実にすることが可能になる。
独自の制限部位は特に、導入遺伝子カセットを、例えば初期遺伝子から除去された位置で、ゲノム内に挿入することを可能にする。
この方法はアデノウイルスに幅広く適用可能であり、ＣｏｌｏＡｄ１、ＯｖＡｄ１、ＯｖＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ１１およびＡｄ５では、シャトルベクターを構築するためのしかるべき５’アームおよび３’アームをもたらし得る適切な制限部位が特定されている。
したがって、本開示の方法は、例えば導入遺伝子の導入によって活性の増強がもたらされた治療用ウイルスの作製の出発点として用いられ得る。
一実施形態では、独自の制限部位は、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂｆＩおよびＳｇｆＩ、例えば、ＮｏｔＩまたはＳｂｆＩとＳｇｆＩまたはＦｓｅＩとＮｏｔＩとＳｂｆＩとＳｇｆＩから独立して選択される。同じ配列において切断する他の制限酵素に置き換えることも可能である。
本明細書で使用されるＦｓｅＩは、以下の配列−ＧＧＣＣＧＧ／ＣＣ−において制限酵素により切断される制限部位を指す。同じ配列において切断する他の制限酵素に置き換えることも可能である。
本明細書で使用されるＮｏｔＩは、以下の配列−ＧＣ／ＧＧＣＣＧＣ−において制限酵素により切断される制限部位を指す。同じ配列において切断する他の制限酵素に置き換えることも可能である。
本明細書で使用されるＳｂｆＩは、以下の配列−ＣＣＴＧＣＡ／ＧＧ−において制限酵素により切断される制限部位を指す。同じ配列において切断する他の制限酵素に置き換えることも可能である。
本明細書で使用されるＳｇｆＩは、以下の配列−ＧＣＧＡＴ／ＣＧＣ−において制限酵素により切断される制限部位を指す。同じ配列において切断する他の制限酵素に置き換えることも可能である。
一実施形態では、ゲノムの所与の位置に２つ以上の独自の制限部位を挿入する。
一実施形態では、独自の制限部位は、Ｌ５遺伝子とＥ３部位との間の位置にある単一の独自の制限部位である。例えば、Ｌ５遺伝子とＥ３部位との間の位置に導入された、ＮｏｔＩなどの単一の独自の制限部位など。一実施形態では、この単一の独自の制限部位は、プラスミドまたはウイルス構築物内に導入された唯一の独自の制限部位である。
一実施形態では、独自の制限部位は、Ｌ５遺伝子とＥ４部位との間の位置にある１つまたは２つ（２つなど）の独自の制限部位、例えば、Ｌ５遺伝子とＥ４部位との間の位置に導入された２つの独自の制限部位、例えば１つのＳｂｆＩ部位と１つのＳｇｆＩ部位である。一実施形態では、これらはシャトルベクター、プラスミドまたはウイルス構築物内に導入された、ただ２つの独自の制限部位である。
一実施形態では、独自の制限部位は、Ｌ５遺伝子とＥ３部位との間の位置にある単一の独自の制限部位およびＬ５遺伝子とＥ４部位との間の位置にある３つの独自の制限部位、例えば、Ｌ５遺伝子とＥ３部位との間の位置に導入された単一の独自の制限部位、例えば１つのＦｓｅＩ部位などおよびＬ５遺伝子とＥ４部位との間の位置に導入された３つの独自の制限部位、例えば１つのＮｏｔＩ部位と、１つのＳｌｂｆＩ部位と、１つのＳｇｆＩ部位などである。一実施形態では、これらはシャトルベクター、プラスミドまたはウイルス構築物内に導入された、ただ４つの独自の制限部位である。
一実施形態では、ＦｓｅＩは、グループＣｏｌｏＡｄ１、Ａｄ１１、Ａｄ３、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２から選択されるアデノウイルスゲノムに導入するのに適した独自の制限部位である。ＲｉｇＩは、ＦｓｅＩと同じ配列において切断する既知の制限酵素であり、したがって、ＦｓｅＩ制限部位はＲｉｇＩ制限部位としても知られる。
一実施形態では、ＮｏｔＩは、グループＣｏｌｏＡｄ１およびＡｄ１１から選択されるアデノウイルスゲノムに導入するのに適した独自の制限部位である。ＣｃｉＮＩは、ＮｏｔＩと同じ配列において切断する既知の制限酵素であり、したがって、ＮｏｔＩ制限部位はＣｃｉＮＩ制限部位としても知られる。
一実施形態では、ＳｂｆＩは、グループＣｏｌｏＡｄ１、Ａｄ１１、Ａｄ３、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２から選択されるアデノウイルスゲノムに導入するのに適した独自の制限部位である。ＳｄａＩおよびＳｓｅ８３８７１は、ＳｂｆＩと同じ配列において切断する既知の制限酵素であり、したがって、ＳｂｆＩ制限部位はＳｄａＩ制限部位またはＳｓｅ８３８７１制限部位としても知られる。
一実施形態では、ＳｇｆＩは、グループＣｏｌｏＡｄ１、Ａｄ１１、Ａｄ３、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２から選択されるアデノウイルスゲノムに導入するのに適した独自の制限部位である。ＡｓｉＳＩ、ＲｇａＩおよびＳｆａＡＩは、ＳｇｆＩと同じ配列において切断する既知の制限酵素であり、したがって、ＳｇｆＩ制限部位はＡｓｉＳＩ制限部位、ＲｇａＩ制限部位またはＳｆａＡＩ制限部位としても知られる。
一実施形態では、ＣｌａＩは、Ａｄ５アデノウイルスゲノムに導入するのに適した独自の制限部位である。本明細書で使用されるＣｌａＩは、以下の配列−ＡＴ／ＣＧＡＴ−において制限酵素により切断される制限部位を意味する。ＢｓｐＤＩ、ＺｈｏＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢａｎＩＩＩ、Ｂｓａ２９Ｉ、ＢｓｅＣＩ、ＢｓｈＶＩ、ＢｓｉＸＩ、Ｂｓｐ１０６Ｉ、ＢｓｐＸＩ、Ｂｓｕ１５ＩおよびＢｓｕＴＵＩは、ＣｌａＩと同じ配列において切断する既知の制限酵素であり、したがって、ＣｌａＩ制限部位は、ＢｓｐＤＩ制限部位、ＺｈｏＩ制限部位、ＢｓｐＤＩ制限部位、ＢａｎＩＩＩ制限部位、Ｂｓａ２９Ｉ制限部位、ＢｓｅＣＩ制限部位、ＢｓｈＶＩ制限部位、ＢｓｉＸＩ制限部位、Ｂｓｐ１０６Ｉ制限部位、ＢｓｐＸＩ制限部位、Ｂｓｕ１５Ｉ制限部位またはＢｓｕＴＵＩ制限部位としても知られる。
一実施形態では、ＰａｃＩは、Ａｄ５アデノウイルスゲノムに導入するのに適した独自の制限部位である。本明細書で使用されるＰａｃＩは、以下の配列−ＴＴＡＡＴ／ＴＡＡ−において制限酵素により切断される制限部位を意味する。
一実施形態では、ＭｌｕＩは、グループＡｄ３およびＯｖＡｄ２から選択されるアデノウイルスゲノムに導入するのに適した独自の制限部位である。本明細書で使用されるＭｌｕＩは、以下の配列−Ａ／ＣＧＣＧＴ−において制限酵素により切断される制限部位を意味する。
一実施形態では、ＢｓｔＢＩは、Ａｄ５アデノウイルスゲノムに導入するのに適した独自の制限部位である。本明細書で使用されるＢｓｔＢＩは、以下の配列−ＴＴ／ＣＧＡＡ−において制限酵素により切断される制限部位を意味する。ＳｆｕＩ、ＡｓｕＩＩ、Ｂｐｕ１４Ｉ、ＢｓｉＣＩ、Ｂｓｐ１１９Ｉ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、Ｃｓｐ４５ＩおよびＮｓｐＶは、ＢｓｔＢＩと同じ配列において切断する既知の制限部位であり、したがって、ＢｓｔＢＩ制限部位は、ＳｆｕＩ制限部位、ＡｓｕＩＩ制限部位、Ｂｐｕ１４Ｉ制限部位、ＢｓｉＣＩ制限部位、Ｂｓｐ１１９Ｉ制限部位、ＢｓｐＴ１０４Ｉ制限部位、Ｃｓｐ４５Ｉ制限部位またはＮｓｐＶ制限部位としても知られる。
一実施形態では、ＢｃｌＩは、グループＣｏｌｏＡｄ１、Ａｄ１１、Ａｄ３、Ａｄ５、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２から選択されるアデノウイルスゲノムに導入するのに適した独自の制限部位である。本明細書で使用されるＢｃｌＩは、以下の配列−Ｔ／ＧＡＴＣＡ−において制限酵素により切断される制限部位を意味する。ＢｓｉＱＩ、ＦｂａＩおよびＫｓｐ２２１は、ＢｃｌＩと同じ配列において切断する既知の制限部位であり、したがって、ＢｃｌＩ制限部位は、ＢｓｉＱＩ制限部位、ＦｂａＩ制限部位またはＫｓｐ２２１制限部位としても知られる。これらの制限部位は一般に好ましくない。
一実施形態では、平滑末端切断制限酵素部位、例えばＰｍｅＩ、ＳｒｆＩおよびＳｗａＩを独自の制限部位として用いる。
一実施形態では、ＰｍｅＩは、グループＣｏｌｏＡｄ１、Ａｄ１１、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２から選択されるアデノウイルスゲノムに導入するのに適した独自の制限部位である。本明細書で使用されるＰｍｅＩは、以下の配列−ＧＴＴＴ／ＡＡＡＣ−において制限酵素により切断される制限部位を意味する。
一実施形態では、ＳｒｆＩＩは、グループＣｏｌｏＡｄ１、Ａｄ１１、Ａｄ３、Ａｄ５、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２から選択されるアデノウイルスゲノムに導入するのに適した独自の制限部位である。本明細書で使用されるＳｒｆＩＩは、以下の配列−ＧＣＣＣ／ＧＧＧＣ−において制限酵素により切断される制限部位を意味する。
一実施形態では、ＳｗａＩは、グループＣｏｌｏＡｄ１、Ａｄ１１、Ａｄ３、Ａｄ５、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２から選択されるアデノウイルスゲノムに導入するのに適した独自の制限部位である。本明細書で使用されるＳｗａＩは、以下の配列−ＡＴＴＴ／ＡＡＡＴ−において制限酵素により切断される制限部位を意味する。
一実施形態では、ＮｏｔＩ以外の独自の制限部位がＬ５遺伝子とＥ３部位との間の位置にある。一実施形態では、Ｌ５遺伝子とＥ４部位との間の位置に２つの独自の制限部位、例えば１つのＳｂｆＩと１つのＳｇｆＩなどが存在する。
一実施形態では、４つの独自の制限部位が存在し、そのうち１つの独自の制限部位はＬ５遺伝子とＥ３部位との間の位置にあり、３つの独自の制限部位はＬ５遺伝子とＥ４部位との間の位置にある。例えば、１つの独自の制限部位がＦｓｅＩであり、３つの独自の制限部位がＳｂｆＩ、ＳｇｆＩおよびＮｏｔＩのそれぞれ１つずつである場合など。
一実施形態では、１つまたは複数の独自の制限部位を含むアデノウイルスゲノムは、配列番号３２の配列を有する。一実施形態では、１つまたは複数の独自の制限部位を含むアデノウイルスゲノムは、配列番号３３の配列を有する。一実施形態では、１つまたは複数の独自の制限部位を含むアデノウイルスゲノムは、配列番号３４の配列を有する。
一実施形態では、１つまたは複数の独自の制限部位を含むアデノウイルスは、配列番号３２と少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの同一性を有する。一実施形態では、１つまたは複数の独自の制限部位を含むアデノウイルスは、配列番号３３を少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの同一性を有する。一実施形態では、１つまたは複数の独自の制限部位を含むアデノウイルスは、配列番号３４と少なくとも９５％の配列同一性、例えば９６％、９７％、９８％、９９％または１００％などの同一性を有する。
調製されたプラスミドおよびシャトルベクターは、アデノウイルスのゲノムの周囲に新規な独自の制限部位の組合せを有する。次いで、アデノウイルスゲノムの操作される部分をコントロールするためにこれらを選択して用いることができる。
独自の制限部位を戦略的に導入して、例えば、所望に応じて、導入遺伝子が１つの制限部位の位置に挿入されるように、あるいは選択した２つの制限部位の間にあるゲノムのセクションが欠失するようにする。
一実施形態では、プラスミドは、少なくとも１つのＥ１の独自の制限部位をさらに含む。本明細書で使用されるＥ１の独自の制限部位は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域内に導入された制限部位を指す。いくつかの実施形態では、Ｅ１遺伝子は存在するが、導入されたＥ１の独自の制限部位によって分断されており、他の実施形態では、Ｅ１遺伝子は欠失しており、導入されたＥ１の独自の制限部位に置き換わっており、また別の実施形態では、Ｅ１遺伝子は存在するが、その機能は導入されたＥ１の独自の制限部位による変化を受けていない。
一実施形態では、１つまたは複数の制限部位は：
・ＮｏｔＩおよびＣｃｉＮＩによって切断され５’−ＧＧＣＣオーバーハングが残る配列ＧＣＧＧＣＣＧＣ
・ＦｓｅＩおよびＲｉｇＩによって切断され３’−ＣＣＧＧオーバーハングが残る配列ＧＧＣＣＧＧＣＣ
・ＡｓｉＳＩ、ＲｇａＩ、ＳｇｆＩおよびＳｆａＡＩによって切断され３’−ＡＴオーバーハングが残る配列ＧＣＧＡＴＣＧＣ
・ＳｂｆＩ、ＳｄａＩおよびＳｓｅ８３８７１によって切断され３’−ＴＧＣＡオーバーハングが残る配列ＣＣＴＧＣＡＧＧ
・ＢｃｌＩ、ＦｂａＩ、Ｋｓｐ２２１およびＢｓｉＱ１によって切断され５’−ＧＡＴＣオーバーハングが残る配列ＴＧＡＴＣＡ
・Ｉ−Ｃｒｅ１によって切断され３’−ＧＴＧＡオーバーハングが残る配列ＣＡＡＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＧＡＣＡＧＴＴＴＧ［配列番号４１］
・Ｉ−ＣｅｕＩによって切断され３’ＣＴＡＡオーバーハングが残る配列ＴＡＡＣＴＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＴＡＧＣＧＡＡ［配列番号４２］
・Ｉ−Ｓｃｅ１によって切断され３’ＡＴＡＡオーバーハングが残る配列ＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴ［配列番号４３］
・ＳｒｆＩによって切断され平滑末端が残る配列ＧＣＣＣＧＧＧＣ
・ＭｓｓＩ、ＰｍｅＩによって切断され平滑末端が残る配列ＧＴＴＴＡＡＡＣ
・ＳｗａＩ、ＳｍｉＩによって切断され平滑末端が残る配列ＡＴＴＴＡＡＡＴ
・ＡｓｃＩ、ＰａｌＡ１およびＳｇｓＩによって切断され５’ＣＧＣＧオーバーハングが残る配列ＧＧＣＧＣＧＣＣ
から独立して選択される。
同じ認識部位を切断する他の制限酵素も適し得る。
一実施形態では、３’アームとベクターフラグメントに存在する第一の制限部位は同じ制限部位（すなわち、同じ制限酵素によって切断される部位）である。これにより、ベクターフラグメント５’末端と３’アームの３’末端との連結が容易になる。
一実施形態では、５’アームとベクターフラグメントに存在する第二の制限部位は同じ制限部位（すなわち、同じ制限酵素によって切断される部位）である。これにより、ベクターフラグメントの３’末端と５’アームの５’末端との連結が容易になる。
一実施形態では、第一の制限酵素部位および第二の制限酵素部位は、グループＦｓｅＩ、ＲｉｇＩ、ＮｏｔＩ、ＣｃｉＮＩ、ＳｂｆＩ、ＳｄａＩ、Ｓｓｅ８３８７１、ＳｇｆＩ、ＡｓｉＳＩ、ＲｇａＩ、ＳｆａＡＩ、ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩ、ＺｈｏＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢａｎＩＩＩ、Ｂｓａ２９Ｉ、ＢｓｅＣＩ、ＢｓｈＶＩ、ＢｓｉＸＩ、Ｂｓｐ１０６Ｉ、ＢｓｐＸＩ、Ｂｓｕ１５Ｉ、ＢｓｕＴＵＩ、ＰａｃＩ、ＭｌｕＩ、ＢｓｔＢＩ、ＳｆｕＩ、ＡｓｕＩＩ、Ｂｐｕ１４Ｉ、ＢｓｉＣＩ、Ｂｓｐ１１９Ｉ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、Ｃｓｐ４５Ｉ、ＮｓｐＶ、ＢｃｌＩ、ＢｓｉＱＩ、ｆｂａＩ、Ｋｓｐ２２１、ＰｍｅＩ、ＳｒｆＩおよびＳｗａＩから独立して選択される。
一実施形態では、第一の制限部位はＡｓｃＩである。一実施形態では、第二の制限酵素部位はＡｓｃＩである。本明細書で使用されるＡｓｃＩは、以下の配列−ＧＧ／ＣＧＣＧＣＣ−において制限酵素により切断される制限部位を意味する。同じ配列において切断する他の制限酵素に置き換えることも可能である。一実施形態では、第一の制限部位と第二の制限部位は同じものである。一実施形態では、第一の制限酵素部位および第二の制限酵素部位はそれぞれＡｓｃＩである。
１つの制限酵素部位を第一および／または第二の制限酵素部位あるいは第三の制限酵素部位として用いる一実施形態では、ゲノムＤＮＡが２つ以上の位置で切断される。
一実施形態では、アデノウイルスのゲノムまたはゲノムＤＮＡ（５’アームなど）内の制限部位は制限部位ＰｓｐＯＭＩを含み、この制限部位は例えば、ゲノムの４６２８、２０８９１および２７８４０の位置またはこれに対応する位置に位置する。一実施形態では、アデノウイルスがＥｎＡｄであるか、ゲノムＤＮＡがＥｎＡｄに由来するものである。
一実施形態では、第三の制限部位は１種類の制限部位、例えばＰｓｐＯＭＩを指す。したがって、一実施形態では、３’アーム内および５’アーム内の第三の制限部位は同じものである。３’アーム内および５’アーム内の第三の制限部位の配列が同じであれば、シャトルプラスミドを調製する際に５’アームの３’末端と３’アームの５’末端との連結が容易になる。さらに、のちにこの部位でシャトルベクターを切断して配列を直線化し、アデノウイルスゲノムを含むプラスミドとの相同組換えを容易にすることができる（例えば、図５を参照されたい）。
一実施形態では、例えば図面に示されるように、シャトルベクターの作製に第一の部位と最後の部位を用いる。
一実施形態では、図４に示される通り、シャトルベクターが約４〜５ｋｂの３’アームおよび５’アームを有するように、制限部位がウイルスゲノム（例えば、ＥｎＡｄゲノム）の５’末端およびウイルスゲノムの３’末端の付近、特に３’ＩＴＲＳおよび５’ＩＴＲＳの末端から約４〜５ｋｂに来るよう設計する。したがって、一実施形態では、ＰｓｐＯＭＩは５’アームおよび／または３’アーム内の「第三の制限部位」となる。この制限部位の対により、ゲノム配列に望ましくない変化を全く導入せずに、ゲノムＤＮＡを直線化し、ウイルスゲノム（例えば、ＥｎＡｄゲノム）と組み換えてプラスミドを形成することが可能になる。
この量のＤＮＡにより、シャトルベクターとウイルスゲノム、例えばＥｎＡｄゲノムとの間の効率的な相同組換えが可能になる。このような設計基準によりほかにも、シャトルベクターにＥ１遺伝子ならびにファイバーおよびＥ４遺伝子を含ませ、所望に応じて、これらの遺伝子およびこれらの遺伝子を取り囲む任意の領域が導入遺伝子カセット挿入のために操作され得るようにすることが可能になる。
一実施形態では、第一の制限部位と第二の制限部位は同じ制限酵素の基質であり、第三の制限部位は異なる制限酵素の基質である。
一実施形態では、第一の制限部位は第二の制限部位とは異なる制限酵素の基質であり、第三の制限部位は第一の制限部位および第二の制限部位それぞれと異なる制限酵素の基質である。
本発明者らはさらに、他のアデノウイルスゲノムに適した制限部位を特定した。
Ａｄ５には酵素ＳｐｈＩ（−ＧＣＡＴＧ／Ｃ−）を用い得る。制限部位はＡｄ５ゲノムの３６６１および３１２２０の位置に位置する。これらの部位はＥ１Ｂ遺伝子の終点およびファイバー遺伝子の始点にあり、３．６ｋｂおよび４．７ｋｂのシャトルベクター構築のためのＰＣＲフラグメントを生じる。したがって、これらの部位は、導入遺伝子がＥ１領域内またはファイバー遺伝子の近傍に挿入され得るシャトルベクターの構築を可能にする。
Ａｄ３、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２には部位ＡｓｅＩ（−ＡＴ／ＴＡＡＴ−）を用い得る。制限部位は、Ａｄ３ゲノムでは２４６９および３１９４０の位置、ＯｖＡｄ１ゲノムでは２４８８および３１７２４の位置、ＯｖＡｄ２ゲノムでは２４８３および３１９４９の位置に位置する。いずれのゲノムも、上記の部位がＥ１Ｂおよびファイバー遺伝子内に位置し、２．５ｋｂおよび３．４ｋｂのシャトルベクター構築のためのＰＣＲフラグメントを生じる。したがって、これらの部位は、導入遺伝子がＥ１領域内またはファイバー遺伝子の近傍に挿入され得るシャトルベクターの構築を可能にする。
Ａｄ１１にはＰｓｉＩ（−ＴＴＡ／ＴＡＡ−）を用い得る。この酵素は、ＰｓｐＯＭＩ、ＳｐｈＩおよびＡｓｅＩとは異なり、平滑末端切断酵素である。ＰｓｉＩ制限部位はＡｄ１１ゲノムの２６４８および３０８９０の位置に位置する。これらの部位はＥ１Ｂ遺伝子内およびファイバー遺伝子の始点にあり、２．６ｋｂおよび４ｋｂのシャトルベクター構築のためのＰＣＲフラグメントを生じる。したがって、これらの部位は上記のように、独自の制限部位がＥ１領域内またはファイバー遺伝子の近傍に挿入され得るシャトルベクターの構築を可能にする。
ゲノムの５’末端および３’末端を増幅して３’アームおよび５’アームを生じさせる工程では通常、ＰＣＲ実施時に適切なプライマーを用いて連結用の制限部位を付加する。増幅時に、細菌複製起点と選択マーカー遺伝子とを含むベクターフラグメント内に同じ連結用の制限部位が挿入される。この連結用の制限部位は、アデノウイルスゲノムと、細菌複製起点と選択マーカー遺伝子とを含むベクターフラグメントとが連結されるよう設計されている。第一の制限酵素部位、第二の制限酵素部位および第三の制限酵素部位はいずれも、連結用の制限部位の例である。
一実施形態では、３’アームおよび５’アーム内の第三の制限部位は、アデノウイルスＤＮＡを含むプラスミド内の対応する位置にある。一実施形態では、５’アームは、５’ＩＴＲの上流に導入された連結用の制限部位を有し、３’アームは、３’ＩＴＲの下流に導入された連結用の制限部位を有する。これらの制限部位は、細菌複製起点と選択マーカー遺伝子とを含むベクターフラグメントの切取りを可能にする。あるいは、これらの制限部位は第一の制限酵素部位および第二の制限酵素部位としても知られ、プラスミドからのアデノウイルスゲノムの切取りを可能にする。
一実施形態では、連結用の制限部位はＡｓｃＩである。同じ配列において切断する他の制限酵素に置き換えることも可能である。
フラグメント
シャトルベクターを作製する方法と関連するベクターフラグメントは、複製起点と選択マーカーとを含むＤＮＡフラグメントを指す。一実施形態では、ベクターフラグメントは長さ２〜４Ｋｂの領域内にある。ベクターフラグメントは、３’アームの３’末端とのライゲーションを可能にするよう配置された第一の制限酵素部位を有するベクターフラグメントの５’末端から始まる。ベクターフラグメントはさらに、低コピー細菌複製起点と選択マーカー遺伝子とを含み、５’アームの５’末端とのライゲーションを可能にするよう配置された第二の制限酵素部位を有するベクターフラグメントの３’末端で終わる。一実施形態では、ベクターフラグメントは３Ｋｂ以下である。この長さは複製起点と選択マーカー遺伝子とを含むのに十分なものである。
本明細書で使用される５’アームは、例えば５’ＩＴＲ（逆方向末端反復）を含むアデノウイルスゲノムの５’末端から数千塩基対の、ＤＮＡフラグメントを指す。アームの正確な長さは適切な制限部位の位置によって決まる。一実施形態では、５’アームは、長さが約２〜５Ｋｂ、例えば、長さが約２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３．０ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、４．５ｋｂ、４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、４．８ｋｂまたは４．９ｋｂなどの領域内にあり、Ｅ１部位、例えば、Ｅ１遺伝子全体またはＥ１遺伝子が欠失もしくは一部欠失した部位を含む。一実施形態では、５’アームは、例えばＥｎＡｄゲノムの５’末端から、４６２７塩基対の長さである。
５’アームは、第二の制限部位（上述のようにベクターフラグメントの３’末端とのライゲーションを可能にするよう配置されている）を有する５’末端から始まり、５’ＩＴＲを含み、第三の制限部位（３’アームの５’末端とのライゲーションを可能にするよう配置されている）を有する５’アームの３’末端で終わる。
一実施形態では、５’アームは非変異Ｅ１領域を含み、このため、複製能を有するウイルスの調製に用いることができる。
一実施形態では、５’アーム内のアデノウイルスゲノムＤＮＡの量は最小限のものであり、例えばＩＴＲなどである。一実施形態では、５’アーム内のアデノウイルスゲノムＤＮＡの量は１００ｂｐ〜５ｋｂの範囲内にある。
本明細書で使用される３’アームは、例えば３’ＩＴＲ（逆方向末端反復）を含むアデノウイルスゲノムの３’末端から数千塩基対の、ＤＮＡフラグメントを指す。アームの正確な長さは適切な制限部位の位置によって決まる。一実施形態では、３’アームは、長さが約３〜５ｋｂ、例えば、長さが約３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、４．５ｋｂ、４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、４．８ｋｂまたは４．９ｋｂなどの領域内にあり、ファイバー（Ｌ５）遺伝子全体を含む。一実施形態では、３’アームは、例えばＥｎＡｄの３’末端から、４４８２塩基対の長さである。
３’アームは、第三の制限部位（例えば、５’アームの３’末端とのライゲーションを可能にするよう配置されている）を有する３’アームの５’末端から始まり、Ｌ５遺伝子と３’ＩＴＲとを含み、第一の制限酵素部位（例えば、ベクターフラグメントの５’末端とのライゲーションを可能にするよう配置されている）を有する３’末端で終わる。
一実施形態では、３’アームは、Ｌ５としても知られるファイバー遺伝子を含む。ファイバー遺伝子を３’アーム内に含ませると、後期遺伝子の操作が可能になり、ウイルスを設計するうえで柔軟性が増す点で有利である。
本明細書で使用される「〜の間の位置」は、特定の領域によって境界が定められている、または挟まれていること、例えば、ある特定領域、例えばＥ３部位などの最後の核酸と、第二の特定領域、例えばＬ５遺伝子などの最初の核酸との間の位置を指す。この文脈での最初の核酸は、関連する遺伝子／領域のフラグメントの最初の核酸を含む（すなわち、逐語的に完全長遺伝子の最初の核酸に限定されるのではなく、所与の構築物内の遺伝子に割り当てられた最初に出現する核酸を指す）。一実施形態では、この位置は、５’から３’の方向に向かって、Ｌ５遺伝子の最後の核酸とＥ４部位の最初の核酸との間にある。
本明細書で使用されるＬ５遺伝子の近傍は、Ｅ３部位とＬ５遺伝子との間の位置および／またはＬ５遺伝子とＥ４部位との間の位置を指す。一実施形態では、１つまたは複数の制限部位は、独立して非コード領域に位置するか、挿入されている。一実施形態では、挿入される遺伝物質はＬ５遺伝子の機能を変化させることも、妨害することもない。
導入遺伝子がアデノウイルスゲノムのＬ５遺伝子の近傍にあると、ウイルスの安定性および複製に干渉する可能性が低くなるため、この位置に１つまたは複数の導入遺伝子を挿入するのが特に有利である。一実施形態では、Ｌ５の後に位置する遺伝子が主要後期プロモーターの制御下またはＥ４プロモーターの制御下にあり得る。一実施形態では、Ｌ５の後に位置する遺伝子が外来性プロモーターの制御下にあり得る。一実施形態では、Ｌ５の前に位置する遺伝子が主要後期プロモーターまたはＥ３プロモーターの制御下にあり得る。一実施形態では、Ｌ５開始コドンの直前に位置する遺伝子が主要後期プロモーターの制御下にあり得、一般に、Ｌ５の発現を可能にする調節エレメントを含んでいる必要がある。
いくつかの状況では、ファイバー遺伝子に隣接させて導入遺伝子を挿入する、例えば、導入遺伝子がＬ５遺伝子に直接隣接するか、その数塩基以内にあるのが有利であり得る。一実施形態では、ゲノムのＥ３側でＬ５遺伝子に隣接させ、例えば、ファイバー部位の後の場合とは異なるレベルの導入遺伝子発現を可能にする。
一実施形態では、導入遺伝子遺伝子をＬ５遺伝子に隣接して位置させることによってほかにも、ファイバータンパク質の発現の調節が可能になり、さらにはウイルス活性の調節が可能になる。
したがって、一実施形態では、導入遺伝子を例えばゲノムのＥ３側、ゲノムのＥ４側またはその両方で、ファイバー遺伝子と隣接する位置に挿入する。
一実施形態では、１つまたは複数の導入遺伝子を独立してゲノムＤＮＡと同じ方向に挿入する。一実施形態では、１つまたは複数の導入遺伝子を独立してゲノムＤＮＡと反対方向に挿入する。
一実施形態では、３’アームは５’から３’の方向に、ファイバー遺伝子、次いでＥ４部位、例えばＥ４領域またはそのフラグメント、次いでＩＴＲ（逆方向反復領域）を含む。
一実施形態では、３’アームは５’から３’の方向に、Ｅ３部位、例えばＥ３領域またはそのフラグメントあるいはＥ３領域が欠失している場合はＥ３部位、次いでファイバー遺伝子、次いでＥ４領域またはＥ４部位としても知られるそのフラグメント、次いでＩＴＲを含む。一実施形態では、３’アームは２Ｋｂ〜５Ｋｂの範囲内にある。一実施形態では、ファイバー遺伝子には制限部位、例えばＦｓｅＩが、特にファイバーのＥ３側で隣接している。一実施形態では、ファイバー遺伝子には制限部位、例えばＳｇｆＩおよび／またはＳｂｆ１が、例えばファイバー遺伝子のＥ４側で隣接している。一実施形態では、ファイバー遺伝子が２つの制限部位、例えばＦｓｅＩによって、特にファイバーのＥ３側で挟まれており、ＳｇｆＩおよび／またはＳｂｆ１が、例えばファイバー遺伝子のＥ４側に位置している。
一実施形態では、Ｅ４部位は、例えば本明細書の図面、実施例および／または配列に開示される位置に、ＡｃＩＩ部位をさらに含む。
一実施形態では、５’アームおよび３’アームはそれぞれ、効率的な相同組換えを促進するのに十分な長さ、例えば約２Ｋｂ〜５Ｋｂなどの長さである。
５’アームおよび／または３’アームは合成されたものであり得る。合成５’アームおよび／または３’アームを用いると、ライゲーションの前に独自の制限部位をアームに導入してシャトルベクターを形成することが可能になる点で有利である。
一実施形態では、本開示によるシャトルベクター（例えば、ＥｎＡｄシャトルベクター）において、ＰｓｐＯＭＩが第三の制限酵素部位である。本明細書で使用されるＰｓｐＯＭＩは、以下の配列−Ｇ／ＧＧＣＣＣ−において制限酵素により切断される制限部位を指す。同じ配列を切断するＡｐａＩおよびＢｓｐ１２０Ｉなどの他の制限酵素に置き換えることも可能である。
一実施形態では、１つまたは複数の独自の制限部位をアデノウイルスシャトルベクター内に導入する方法が提供され、この方法は：
ａ）シャトルベクター内の２つの切取り制限部位およびその部位の間のＤＮＡ配列を特定する段階と、
ｂ）段階ａ）で特定された切取り制限部位でシャトルベクターを消化してＤＮＡのセクションを切り取る段階と、
ｃ）段階ｂ）のシャトルベクターから切り取られたセクションと実質的に同一であり、さらに１つまたは複数の独自の制限部位を含む、ＤＮＡフラグメントを合成する段階と、
ｄ）消化された段階ｂ）のシャトルベクターおよび段階ｃ）のＤＮＡフラグメントを精製する段階と、
ｅ）段階ｄ）のＤＮＡフラグメントと段階ｄ）のシャトルベクターとをライゲートする段階と、
ｆ）ライゲートしたシャトルベクターで細胞を形質転換し、選択培地で増殖させ、コロニーをスクリーニングすることにより、正確に組み立てられたシャトルベクターを特定する段階と
を含む。
一実施形態では、切取り制限部位はＡｃｌＩである。同じ配列において切断する他の制限酵素に置き換えることも可能である。本明細書で使用されるＡｃｌＩは、以下の配列−ＡＡ／ＣＧＴＴ−において制限酵素により切断される制限部位を意味する。
ＡｃｌＩとＰｓｐＯＭＩはファイバー遺伝子に隣接し、この領域の切取りおよび切り取られる領域と実質的に同一のＤＮＡフラグメントの挿入を可能にするため、ＡｃｌＩをＰｓｐＯＭＩと一緒に用いてＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクター内に独自の制限部位を導入する。
ライゲーション
本明細書で使用される１段階の三者ライゲーションは、３つのＤＮＡ配列を単一の段階で一緒にライゲートして環状ＤＮＡを形成することを指す。一実施形態では、スクリーニングを実施して、ＤＮＡシャトルベクターが、しかるべき方向を向いた３つすべての配列から構成されていることを確認する。
本明細書で使用されるしかるべき方向は、本開示によるアデノウイルスの組立て／構築に用いるのに適した方向を指すものとする。
本明細書で使用される等しい割合は、全体の体積または濃度が変化しても、使用されるＤＮＡフラグメント（配列）の比がほぼ同じであることを指す。一実施形態では、等しい割合は、ベクターフラグメントと５’アームと３’アームの比が１：１：１であることを指す。本明細書で使用されるライゲーション比は、ライゲートするＤＮＡのフラグメントを準備する比または割合を意味する。
一実施形態では、各フラグメントに使用する第一の制限酵素と第二の制限酵素は同じものであり、１段階の三者ライゲーションの前にベクターフラグメントを脱リン酸化する。
本明細書で使用される脱リン酸化は、加水分解によりリン酸（ＰＯ４ ３−）基がＤＮＡから除去されることを指す。脱リン酸化すると、ＤＮＡフラグメントの５’末端と３’末端が互いにライゲートするのではなく、異なるＤＮＡフラグメント（通常、脱リン酸化されていないＤＮＡフラグメント）と自由にライゲートする状態を維持する可能性が高くなる点で有利である。一実施形態では、脱リン酸化により、のちのライゲーション段階の成功率が高くなる。
本明細書で使用される「ライゲーション」または「ライゲートすること」は、例えばリガーゼ酵素を用いて、ＤＮＡ分子の２つの末端を共有結合させることを指す。
一実施形態では、１段階の３者ライゲーションにＤＮＡリガーゼを２部、リガーゼ緩衝液を４部、５’アーム、３’アームおよびベクターフラグメントをそれぞれ２部用いる。
本明細書で使用される部は、体積などの量を指し、混合物中の全体の割合が同じである限り、その絶対量は変化してもよく、単なる具体例を挙げれば、１部が１０ｍｌであるとき、ＤＮＡリガーゼを２０ｍｌ、リガーゼ緩衝剤を４０ｍｌ、５’アームを２０ｍｌ、３’アームを２０ｍｌ用いる。
一実施形態では、溶出したＤＮＡ約２μｌにＤＮＡが約４０ｎｇ含まれている。一実施形態では、ＤＮＡを約１２０ｎｇライゲートする。一実施形態では、ライゲートしたＤＮＡ １２０ｎｇは、５’アーム、３’アームおよびベクターフラグメントそれぞれ約４０ｎｇからなる。
本明細書で使用されるＤＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を触媒することによってＤＮＡ分子をライゲートする（ＤＮＡ分子の連活を容易にする）酵素を指す。一実施形態では、ＤＮＡリガーゼはＴ４ ＤＮＡリガーゼである。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼはバクテリオファージＴ４に由来する酵素である。
本明細書で使用されるリガーゼ緩衝液は、例えば塩化マグネシウムとＡＴＰ、例えば５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＡＴＰなどを含有する、緩衝溶液を指す。
本明細書で使用される環状化または環状は、直鎖状ＤＮＡの末端同士が連結されて環またはループを形成することを指す。
一実施形態では、１段階の３者ライゲーションを少なくとも３０分間、例えば、少なくとも５０分間、例えば約１時間など、より具体的には５１分間、５２分間、５３分間、５４分間、５５分間、５６分間、５７分間、５８分間、５９分間、６０分間、６１分間、６２分間、６３分間、６４分間、６５分間、６６分間、６７分間、６８分間、６９分間または７０分間実施する。
一実施形態では、１段階の３者ライゲーションを室温前後、例えば約１５〜２５℃など、例えば１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃または２４℃などで実施する。１６〜２４℃が好ましい。
一実施形態では、アデノウイルスシャトルベクターを作製する方法は：
ａ）アデノウイルスゲノム内の適切な制限部位を特定する段階と、
ｂ）例えばゲノムの５’末端および３’末端を増幅し、その中にあるＩＴＲ上流の各末端に連結用の制限部位を挿入することによって、５’ＰＣＲアームおよび３’ＰＣＲアームを作製する段階と、
ｃ）低コピー細菌複製起点と、選択マーカー遺伝子と、末端の連結用の制限部位とを有し、５’アームと３’アームとのライゲーションを可能にする連結用の制限部位で終わっているベクターフラグメントを選択して増幅する段階と、
ｄ）段階ｂ）の５’ＰＣＲアームおよび３’ＰＣＲアームを約３７℃で約２時間、二重消化する段階であって、緩衝剤、制限酵素およびヌクレアーゼフリー水で二重消化を実施した後、約６５℃で約２０分間、熱不活性化して、５’アームおよび３’アームを得る段階と、
ｅ）段階ｂ）のベクターフラグメントを約３７℃で約２時間、単一消化する段階であって、緩衝剤、制限酵素およびヌクレアーゼフリー水で単一消化を実施した後、約３７℃で約１時間、アルカリ仔ウシホスファターゼで処理する段階と、
ｆ）段階ｄ）およびｅ）の消化産物の全量を約０．８％のアガロースゲルで分離し、ゲル精製し、溶出緩衝液で溶離する段階と、
ｇ）段階ｆ）の消化された３’アーム、５’アームおよびベクターフラグメントを、ＤＮＡリガーゼおよびリガーゼ緩衝液を用いる１段階の３者ライゲーションにより、室温で約１時間、５’アームと３’アームとベクターフラグメントの１：１：１のライゲーション比でライゲートする段階と、
ｈ）ライゲートしたシャトルベクターで細胞を形質転換し、選択培地で増殖させ、コロニーをスクリーニングすることにより、正確に組み立てられたシャトルベクターを特定する段階と
を含む。
一実施形態では、上記の方法の段階ａ）は任意選択であり、必要な制限部位および／または導入遺伝子を用いて３’アームおよび／５’アームを合成する。
一実施形態では、ＥｎＡｄシャトルベクターを作製する方法は：
ａ）アデノウイルスゲノム内の適切な制限部位を特定する段階と、
ｂ）ゲノムの５’末端および３’末端を増幅し、ＩＴＲ上流の各末端に連結用の制限部位を挿入することによって、５’ＰＣＲアームおよび３’ＰＣＲアームを作製する段階と、
ｃ）低コピー細菌複製起点と、選択マーカー遺伝子と、末端の連結用の制限部位とを有し、５’アームと３’アームとのライゲーションを可能にする連結用の制限部位で終わっているベクターフラグメントを選択して増幅する段階と、
ｄ）段階ｂ）のＤＮＡ ２０μｌ、緩衝液４ ４μｌ、ＡｓｃＩ ２μｌ、ＰｓｐＯＭ１ ２μｌおよびヌクレアーゼフリー水８μｌまたはこれに相当するものを用いて、５’ＰＣＲアームおよび３’ＰＣＲアームを３７℃で２時間、二重消化した後、６５℃で２０分間、熱不活性化させて、５’アームおよび３’アームを得る段階と、
ｅ）段階ｂ）のＤＮＡ ２０μｌ、緩衝液４ ４μｌ、ＡｓｃＩ ２μｌおよびヌクレアーゼフリー水８μｌまたはこれに相当する濃度でベクターフラグメントを２時間、３７℃で単一消化した後、３７℃で１時間、アルカリ仔ウシホスファターゼ１μｌで処理する段階と、
ｆ）段階ｄ）およびｅ）の消化産物の全量を０．８％アガロースゲルで分離し、ゲル精製し、溶出緩衝液４０μｌまたはこれに相当するもので溶離する段階と、
ｇ）段階ｆ）の消化された３’アーム、５’アームおよびベクターフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２μｌおよびリガーゼ緩衝液４μｌを用いる１段階の３者ライゲーションにより、室温で１時間、５’アーム、３’アームおよびベクターをそれぞれ２μｌとする１：１：１のライゲーション比でライゲートする段階と、
ｈ）ライゲートしたシャトルベクターで細胞を形質転換し、選択培地で増殖させ、コロニーをスクリーニングすることにより、正確に組み立てられたシャトルベクターを特定する段階と
を含む。
一実施形態では、上記の方法の段階ａ）は任意選択であり、必要な制限部位および／または導入遺伝子を用いて３’アームおよび／５’アームを合成する。
当業者には、上記のものに代わる緩衝液、リガーゼおよび体積を用いてもよく、絶対体積よりも割合の方が重要であることが理解されよう。
本明細書で使用される増幅は、通常はＰＣＲを用いて、単一または数コピーのＤＮＡを例えば数桁以上増加させて、特定のＤＮＡ配列を数千〜数百万コピー生成する工程を意味する。
本明細書で使用される単一消化は、ＤＮＡ配列内の所与の部位を標的とすることが知られている単一の制限酵素でＤＮＡを消化することを意味する。
本明細書で使用される二重消化は、ＤＮＡ配列内の異なる部位を標的とすることが知られている２つの異なる制限酵素でＤＮＡを消化することを意味する。
本明細書で使用される「正確に組み立てられた」は、複数のＤＮＡが意図した通りの方向および位置に正確にライゲートされて、所望のシャトルベクターが得られたことを意味する。
本明細書で使用される形質転換は、細胞がその周囲の環境から外来遺伝物質（外来性ＤＮＡ）を直接取り込んで組み込み、発現することによって、遺伝的に変化すること意味する。
本明細書で使用される「増殖させること」は、当業者により一般に理解されている通りに培養することを意味する。
本明細書で使用されるスクリーニングは、所望の特性を有する細胞および／またはＤＮＡ構築物を特定することを意味する。用いられる典型的な方法としては、特に限定されないが、制限部位にまたがるプライマーを用いるＰＣＲ、制限消化、ＤＮＡシーケンシングが挙げられる。
本明細書で使用される上流は、読取り（すなわち、５’から３’）の方向に向かって前の位置を意味する。本明細書で使用される下流は、読取り（すなわち、５’から３’）の方向に向かって後を意味する。
本明細書で使用される切取りは、除去を意味する。
一実施形態では、プラスミドまたはシャトルベクターは、ＤＮＡ構築物に導入された１つまたは複数のポリアデニル化配列をさらに含む。
本明細書で使用される「合成（された）」は、例えば、ＤＮＡフラグメントが自動合成などで合成化学技術によって作製されたことを指す。
本明細書で使用されるＤＮＡフラグメントは、ＤＮＡ、特に、本明細書に開示される方法によって操作された後に得られるアデノウイルスゲノムＤＮＡまたはＤＮＡ配列を指す。一実施形態では、サイレントな塩基変化が許容される。
本明細書で使用されるサイレントな塩基変化は、遺伝暗号の冗長性により、コードされるアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド変化を指す。
本明細書で使用される「実質的に同一である」は、ＤＮＡフラグメントが、１つまたは複数の新規な制限部位が付加されていること除いて、あるシャトルベクターと同一であることを意味する。
本明細書で使用される精製は、例えば目的外のＤＮＡを除去することにより、目的のＤＮＡの不純物を取り除くことを意味する。
一実施形態では、この方法は、例えば本開示のシャトルベクターをより多く得るために、それを増殖させるさらなる段階を含む。
一実施形態では、ライゲートしたＤＮＡを細菌細胞（１つまたは複数）に形質転換し、例えば、ライゲートしたＤＮＡを約１２０ｎｇ形質転換する。一実施形態では、細菌細胞は、Ａｇｉｌｅｎｔ社から入手可能なＸＬ−１０などのウルトラコンピテント細菌細胞である。あるいは、シャトルベクターとの相同組換えによって調製したプラスミドを例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で複製してもよく、これにより、シャトルベクターの組み立てを繰り返す必要性が回避される。
シャトルベクター内でのＤＮＡフラグメントの複製
一実施形態では、この方法は、特に制限部位および／または導入遺伝子を導入するために、例えばＤＮＡフラグメントのセクションを切り取った後に、それをシャトルベクター内にライゲートする段階を含む。一実施形態では、用いる割当ては、ＤＮＡフラグメントとシャトルベクターがそれぞれ３：１のライゲーションである。本明細書で使用される３：１のフラグメントとシャトルベクターのライゲーション比は、ＤＮＡフラグメント３部に対してシャトルベクターが１部であることを意味する。
一実施形態では、ＤＮＡフラグメントは合成されたものであるか、ＰＣＲ産物である。本明細書で使用されるＰＣＲ産物は、ＤＮＡフラグメントがＰＣＲを用いて作製されたものであることを意味する。
シャトルベクターの改変に関するさらなる詳細については実施例および図面に記載する。
このように本開示は、本質的に組み立てユニットによるものであり、当業者がアデノウイルスゲノムを随意に操作することを可能にするアデノウイルスシャトルベクターおよびプラスミドを初めて提供するものである。
プラスミドの調製
本明細書で使用されるプラスミドは、細胞内の染色体ＤＮＡから物理的に分離しており、同ＤＮＡから独立して複製することができる小型のＤＮＡ分子を指す。本開示の目的には、プラスミドは、一般に細菌複製起点と選択マーカー遺伝子とを含むベクターフラグメントに連結されたアデノウイルスゲノムを実質的にすべて含む、環状ＤＮＡベクターである（図２を参照されたい）。
本開示によるプラスミドは一般に、直線化したシャトルベクターとアデノウイルスゲノムとの相同組換えによって調製される。この文脈でのアデノウイルスゲノムは、すべてまたはほぼすべてのアデノウイルスゲノムを指す。当業者には、この段階がアデノウイルス再組み立ての一部であり、一般に本開示のアデノウイルス構築物を実現する前の段階であることがわかるであろう。したがって、組換え段階に用いるアデノウイルスゲノムは一般に、可能性としては最終的なアデノウイルス内に存在することになる導入遺伝子を除いて、機能的要素をすべて含む。
一実施形態では、相同組換えを実施する方法は：
ａ）シャトルベクターを第三の制限酵素部位で消化することによって直線化する段階と、
ｂ）エレクトロコンピテント細胞内で、直線化したシャトルベクターとアデノウイルスとの相同組換えを実施する段階と、
ｃ）細胞を選択培地で増殖させ、コロニーをスクリーニングすることにより、正確に組み換えられたプラスミドを特定する段階と
を含む。
本明細書で使用される直線化は、通常、ＤＮＡ構築物を単一の制限酵素で消化することによって、環状ＤＮＡを直鎖状ＤＮＡにする工程を指す。
一実施形態では、３．５：１．５のシャトルベクターとゲノムの比で相同組換えを実施する。
本明細書で使用されるエレクトロコンピテントは、エレクトロポレーションによって形質転換される細胞を意味する。適切なエレクトロコンピテント細胞としては、特に限定されないが、ＢＪ５１８３細胞が挙げられる。
本明細書で使用される「正確に組み換えられた」は、相同組換えを実施したプラスミドが所望のＤＮＡ配列を獲得したことを意味する。
一実施形態では、この方法は、プラスミドの目的の制限部位に導入遺伝子カセットを導入するさらなる段階を含む。目的の制限部位は、ゲノムの導入遺伝子カセットの挿入が可能な位置に存在することが確認される部位を指す。目的の制限部位は通常、本明細書に開示される方法によりシャトルベクターおよび／またはプラスミド内に導入された独自の制限部位である。
一実施形態では、プラスミド内に導入遺伝子カセットを導入する段階は、直線化したプラスミドと導入遺伝子カセットとの間でライゲーションを実施することを含む。
一実施形態では、プラスミド内に導入遺伝子カセットを導入する段階は：
−プラスミドおよび導入遺伝子カセットを直線化することと、
−直線化したＤＮＡを分離することと、
−分離した直線化したＤＮＡを生成することと、
−プラスミドと導入遺伝子カセットとをライゲートすることと、
−ライゲートしたＤＮＡを例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換することと、
−正確に形質転換されたコロニーを選択することと
を含む。
本明細書で使用される導入遺伝子カセットは、例えば、導入遺伝子が活性化される場所および時期を決定する制御配列であるプロモーターまたはｍＲＮＡ分子がスプライスソームによって切断される時期を決定する制御配列であるスプライス部位、通常目的のタンパク質のｃＤＮＡに由来し、任意選択でポリＡ配列および停止配列を含むタンパク質コード配列（すなわち、導入遺伝子）を任意選択で含むＤＮＡのセグメントを指す。図７に一般的な導入遺伝子カセットを示す。
一実施形態では、導入遺伝子カセットは外来性プロモーター、例えば哺乳動物プロモーターを含む。
一実施形態では、導入遺伝子カセットは、内部リボソーム進入配列などの調節エレメントを含む。
一実施形態では、導入遺伝子カセットはポリＡ配列を含む。
一実施形態では、制限酵素を用いてゲノムを配列の３’末端および５’末端で切断して、複製起点と選択マーカー遺伝子を含むベクターフラグメントＤＮＡを切り取ることにより、プラスミドからウイルスまたはウイルスベクターを回収することができる。一実施形態では、同じ制限酵素が両部位を切断する。次いで、直線化したＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞などの適切な宿主細胞内に挿入して、最終的なウイルスまたはウイルスベクターを作製することができる。
導入遺伝子
一実施形態では、導入遺伝子カセット内の１つまたは複数の導入遺伝子は、治療用のタンパク質、ペプチドまたはＲＮＡ、例えば抗体または抗体ドメイン、プロドラッグ変換酵素、免疫調節物質、酵素、ｓｉＲＮＡ、転写因子、細胞内シグナル伝達タンパク質または表面膜タンパク質または抗原などをコードする、目的の治療遺伝子から選択される。
本明細書で使用される抗体は、免疫系が細菌およびウイルスなどの外来病原体を識別し中和するのに用いるＢ細胞によって産生される大型のＹ字状タンパク質を意味する。抗体は外来抗原に固有の部分を認識する。モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ダイアボディ、キメラ抗体、ヒト化抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、ラクダ抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｃフラグメントおよび一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）抗体を含めたＦｖ分子を含めた、多岐にわたる様々な形態の抗体を使用し得る。
本明細書で使用されるプロドラッグは、不活性な（または完全には活性化されていない）誘導体として投与され、のちに多くの場合、通常の代謝過程により、またはしかるべき酵素の使用により、体内で活性な薬理作用物質に変換される分子を指す。したがって、プロドラッグは、意図する薬物の一種の前駆物質としての役割を果たす。プロドラッグ変換酵素は、プロドラッグをその薬理学的に活性な形態に変換する酵素としての役割を果たす。一実施形態では、本開示によるウイルス構築物は、プロドラッグおよびしかるべき変換酵素をコードしｉｎ ｖｉｖｏで発現する。
本明細書で使用される免疫調節物質は、免疫応答の調節物質を意味する。免疫調節物質は、免疫応答の質および量を免疫強化、免疫抑制または免疫寛容の誘導の形で所望の方向で、または所望のレベルに調節するよう機能する。一実施形態では、免疫調節物質は免疫刺激剤、例えば、ＣｐＧに富むＤＮＡ配列などのアジュバントである。
本明細書で使用される酵素は、特異的化学反応を触媒し、例えば、反応の過程でそれ自体は変化することなく化学反応の進行速度を調節するのに適したタンパク質を指す。一実施形態では、酵素は生体内での反応を触媒することができる。
本明細書で使用されるレポーター遺伝子は、真核細胞内に容易に検出される産物を産生し、目的遺伝子の存在または活性を判定するマーカーとして使用され得る遺伝子を指す。一実施形態では、レポーター遺伝子ＤＮＡは、目的のＤＮＡ配列に近接して連結しているか、これと結合している。一実施形態では、レポーター遺伝子は、例えばルシフェラーゼおよびＧＦＰなどの蛍光タンパク質である。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの撮像および位置特定のためのレポーター遺伝子、特に限定されないが、例えばヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）、細胞内金属タンパク質（例えば、フェリチン、チロシナーゼ）、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１−ｔｋ）、ＧＦＰをはじめとするフルオロフォア、ルシフェラーゼ、エストロゲン受容体およびその他の誘導性レポーター遺伝子などをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子は、ルシフェラーゼまたはｅＧＦＰなどのレポーター遺伝子でも造影物質でもない。
本明細書で使用される外来性哺乳動物プロモーターは、通常、目的遺伝子の上流に位置し、遺伝子の転写を調節するＤＮＡエレメントを指す。
本明細書で使用される調節エレメントは、主要後期プロモーターなどの内在性プロモーターまたは発現、例えば多数の遺伝子の発現を調節するその他のＤＮＡ配列、例えばポリシストロニック配列などのいずれかの使用を可能にするＤＮＡ配列を指す。
本明細書で使用される内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列の中央での翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列を指す。
本明細書で使用されるポリＡ配列は、通常、ＡＡＴＡＡＡ部位を含み、転写された後、新生ｍＲＮＡ分子を切断しポリアデニル化する多タンパク質複合体によって認識され得るＤＮＡ配列を指す。
本明細書で使用される目的（治療）遺伝子は、例えば発現後に薬理効果（一般に有益な薬理効果）を生じさせるのに適した遺伝子を意味し、特に、その腫瘍溶解性ウイルス活性などの活性は、本開示のＤＮＡ構築物またはアデノウイルスの有用性または治療効果を増大させ得る。
そのものが腫瘍もしくは免疫応答を調節するよう作用して治療的に作用する分子または治療用分子の活性を直接的もしくは間接的に阻害、活性化もしくは増強する薬剤である分子をコードする様々な異なるタイプの導入遺伝子（およびその組合せ）が考えられる。
コードされ得る分子としては、タンパク質リガンドまたはリガンドの結合フラグメント、抗体（例えば、完全長またはフラグメント、例えばＦｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２またはこれより小さい特異的結合フラグメントなど）をはじめとする標的特異的結合タンパク質またはペプチド（例えば、ファージディスプレイなどの技術によって選択され得るもの）、天然または合成の結合受容体、リガンドまたはフラグメント、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ分子などの標的をコードする遺伝子の転写または翻訳を調節する特異的分子、転写因子などが挙げられる。分子は、例えばその活性、安定性、特異性などを増大させる他のペプチド配列との融合タンパク質の形態であり得る。一実施形態では、リガンドと免疫グロブリンＦｃ領域とを融合して二量体を形成し、安定性を増大させ得る、またはエフェクター機能をもたらし得る。一実施形態では、導入遺伝子は融合タンパク質、例えば樹状細胞などの抗原提示細胞に対する特異性を有する抗体または抗体フラグメントと融合したもの、例えば抗ＤＥＣ−２０５、抗マンノース受容体、抗デクチンなどをコードし得る。
一実施形態では、インサートはほかにも、例えば、本発明によるアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを感染させた細胞を検出して腫瘍の撮像またはリンパ管およびリンパ節の排液などを実施するために用いることができる、レポーター遺伝子をコードし得る。
一実施形態では、コードされるタンパク質はヒトタンパク質、例えば、以下に挙げる分子に対するヒト抗体もしくは天然のリガンドまたは以下に挙げる分子を標的とするｓｉＲＮＡ分子あるいは腫瘍抗原である。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は、Ｔ細胞共刺激受容体またはそのリガンド、例えば、特に限定されないが、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳリガンドなどをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は、Ｔ細胞共抑制分子またはそのリガンド（チェックポイント阻害受容体およびリガンド）、例えば、特に限定されないが、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム細胞死−１（ＰＤ−１）、ＰＤ−リガンド−１（Ｂ７−Ｈ１としても知られるＰＤ−Ｌ１）、ＰＤ−リガンド−２（Ｂ７−ＤＣとしても知られるＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４などのその他のＢ７受容体スーパーファミリーメンバー、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）、阻害受容体Ｉｇ様転写産物−３（ＩＬＴ−２）、ＩＬＴ−３、ＩＬＴ−４、Ｔ細胞免疫グロブリンムチンタンパク質−３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、ＬＩＧＨＴ（リンホトキシンと相同であり、誘導性発現を示し、ヘルペスウイルス侵入メディエーターに対してＨＳＶ糖タンパク質Ｄと競合し、Ｔリンパ球によって発現される受容体）、ＣＤ１６０などをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は、調節性Ｔ細胞（天然のＴｒｅｇおよび誘導されたＴｒｅｇ、Ｔｒ１など）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）をはじめとする免疫抑制性免疫細胞によって発現される分子、例えば、特に限定されないが、ＣＤ１６、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３３２、ＣＤ１２７、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ１６２、ＣＤ３０１ａ、ＣＤ３０１ｂおよびガレクチン−３などをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は、樹状細胞（およびその他の抗原提示細胞）受容体またはそのリガンド、例えば、特に限定されないが、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ−３）、ＦＬＴ−３リガンド、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）およびそのリガンド（例えば、ＴＬＲ−９、ＴＬＲ−５のリガンドであるフラジェリン）、ＣＣＲ７（ＣＤ１９７）、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ８３、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、ＣＤ１２３（ＩＬ−３Ｒα）、ＣＤ１７２ａ（ＳＩＲＰα）、ＣＤ２０５（ＤＥＣ２０５）、ＣＤ２０７（ランゲリン）、ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＣＤ２７３（Ｂ７−ＤＣ）、ＣＤ２８１（ＴＬＲ１）、ＣＤ２８３（ＴＬＲ３）、ＣＤ２８６（ＴＬＲ６）、ＣＤ２８９（ＴＬＲ９）、ＣＤ２８７（ＴＬＲ７）、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）、ＧＩＴＲリガンド、ＩＦＮ−α２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬＴ１（ＣＤ８５ｈ）、ＩＬＴ２（ＣＤ８５ｊ）、ＩＬＴ３（ＣＤ８５ｋ）、ＩＬＴ４（ＣＤ８５ｄ）、２７Ｄ６ ５１４８、４２Ｄ１ ５１４９、ＩＬＴ５（ＣＤ８５ａ）、ＩＬＴ７（ＣＤ８５ｇ）、ＴＳＬＰ受容体、ＣＤ１４１（ＢＤＣＡ−３）、ＣＤ３０３（ＣＬＥＣ４ｃ、ＢＤＣＡ−２）、ＣＡＤＭ１（ＮＥＣＬ２）、ＣＬＥＣ９ａ、ＸＣＲ１、ＣＤ３０４（ニューロピリン−１、ＢＤＣＡ−４）などをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は、抗原処理メディエーターおよび抗原提示メディエーター、例えば、特に限定されないが、ＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＴＩＩＡ）、ガンマ−ＩＦＮ誘導性リソソームチオール還元酵素（ＧＩＬＴ）などをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は、サイトカインまたはその受容体、例えば、特に限定されないが、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ＲＡ）、インターフェロン−α（ＩＦＮα）、インターフェロン−β（ＩＦＮβ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦβ−様々なサブタイプ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は、ケモカインまたはケモカイン受容体、例えば、特に限定されないが、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＲＴＨ２などをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は、転写因子をはじめとする転写調節因子、例えば、特に限定されないが、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ６、ＣＴＩＩＡ、ＭｙＤ８８、ＮＦκＢファミリーメンバーなどをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は、プロドラッグ変換酵素をはじめとする酵素、例えば、特に限定されないが、シトシンデアミナーゼおよびチロシンキナーゼなどをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は、細胞内輸送分子または細胞機能調節因子、例えば、特に限定されないが、熱ショックタンパク質−７０（ＨＳｐ７０）、細胞の生死の調節因子（例えば、サバイビン）などをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は、腫瘍細胞または腫瘍微小環境受容体および産物、例えば、特に限定されないが、ＥＧＦリガンドおよび受容体：アンフィレギュリン、ベータセルイン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｉｎ）（ＢＴＣ）、ニューロレグリン−１ａ（ＮＲＧ１ａ）、ＮＲＧ１ｂ、ＮＲＧ３、トランスフォーミング増殖因子−ａ（ＴＧＦａ）、ＬＲＩＧ１（ロイシンリッチリピートおよびＩｇ様ドメイン含有−１）、ＬＲＩＧ３、ＥＧＦ、ＥＧＦ−Ｌ６、エピジェン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ４）などをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は、特に限定されないが、ヘッジホッグ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、Ｗｎｔ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦｂ、ＰＤＧＦ、Ｎｏｔｃｈなどの分子のファミリーに対するリガンドおよび受容体である。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は細胞内腫瘍細胞酵素、例えば、特に限定されないが、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）などをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は、免疫細胞による認識のための抗原、例えば、特に限定されないが、抗原（例えば、サイトメガロウイルス抗原、インフルエンザ抗原、Ｂ型肝炎表面およびコア抗原、ジフテリアトキソイド、Ｃｒｍ１９７、破傷風トキソイド）となる感染性生物の外来免疫原性タンパク質、既知のＴ細胞もしくは抗体エピトープである上記抗原由来のペプチドまたは遺伝子操作された上記抗原の複合体もしくは多量体などをコードする。
一実施形態では、導入遺伝子（１つまたは複数）は、抗原となる腫瘍由来タンパク質、既知のＴ細胞または抗体エピトープである上記抗原由来のペプチドまたは遺伝子操作された上記抗原の複合体もしくは多量体などをコードする。このような抗原としては、例えば、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、イディオタイプ、ＨＰＶ Ｅ６およびＥ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ Ａ３、ｐ５３非変異体、ｐ５３変異体、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＤ２、ＰＳＭＡ、ＰＣＳＡ、ＰＳＡ、ｇｐ１００、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２ ＰＡＰ ＭＬ−ＩＡＰ ＡＦＰ ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ Ａ１、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ １、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ−β、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１（Ｃｈｅｅｖｅｒら，２００９）を挙げ得る。
本明細書で使用されるｐＮＧ−６２は、ＣｏｌｏＡｄ２．４ゲノムと、ＧＦＰをコードする遺伝子を含む導入遺伝子カセットとを含むプラスミドを意味する（配列番号３５、図３０を参照されたい）。
アデノウイルスの調製
本開示はほかにも、初期遺伝子、例えばウイルス複製に不可欠な遺伝子、特にＥ１および／またはＥ３がインタクトで維持され得る組換えアデノウイルスあるいは意図する目的に従ってウイルス複製に不可欠な遺伝子を欠失させたアデノウイルスベクターを作製する方法を提供する。したがって、本開示は、生存腫瘍溶解性ウイルスの遺伝子操作を容易にし、例えば、同ウイルスのこれまで不可能であった領域に治療用タンパク質を装備させることを可能にする。
本開示による最終的なアデノウイルスは、しかるべき制限酵素を用いてプラスミドからゲノムＤＮＡを切り取った後、例えば完了させるライゲーション段階を実施して、ゲノムを直線化することにより提供され得る。このように、制限酵素を用いてゲノムを配列の３’末端および５’末端で切断して、複製起点と選択マーカー遺伝子とを含むベクターフラグメントＤＮＡを切り取ることにより、プラスミドからウイルスまたはウイルスベクターを回収し得る。一実施形態では、同じ制限酵素が両部位を切断する。次いで、直線化したＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞などの適切な内に挿入して、最終的なウイルスまたはウイルスベクターを作製することができる。
シャトルベクター、プラスミドおよびアデノウイルス
一実施形態では、例えば本開示の方法で中間体として得られる、アデノウイルスシャトルベクターが提供される。
本開示のシャトルベクターは、ウイルスファイバー遺伝子を含む３’アームを含む。この方法に関連して上に記載したシャトルベクターの詳細は、シャトルベクター自体の実施形態にも関連する。本開示のシャトルベクターは、例えば約９Ｋｂ〜約１１．９Ｋｂの範囲内にある、比較的多量のアデノウイルスゲノムＤＮＡを含む。一実施形態では、シャトルベクターの５０％以上、例えば６０％、７０％、７５％または８０％がアデノウイルスゲノムＤＮＡである。一実施形態では、シャトルベクターは全体で約１５Ｋｂ以下、例えば１４Ｋｂ、１３Ｋｂまたは１２Ｋｂである。これに対して、先行技術のベクターの主要部分は導入遺伝子および調節エレメントである。
一態様では、
ａ）複製起点、選択マーカーを含むベクターフラグメントと、
ｂ）少なくともファイバー遺伝子（Ｌ５）と、任意選択でさらにＥ３部位、Ｅ４または前記部位の両方とを含む、３’アームと
を含む、ベクターが提供される。
一実施形態では、シャトルベクターは導入遺伝子および／または導入遺伝子に関連する任意の調節エレメントを含まず、例えば、プロモーター、ＩＲＥＳ配列も同様である。これには、本開示で使用されるシャトルベクターが、単にウイルスに１つの導入遺伝子を導入するのではなく、ウイルスの柔軟な遺伝子操作が容易になるようウイルスゲノムに諸機序を導入するために開発されたという理由がある。
一実施形態では、シャトルベクターは、アデノウイルスゲノムの「中央の配列」が存在しないように適切な制限部位（第三の制限酵素部位として上に記載したもの）によりアデノウイルスゲノムの３’アームと直接連結したアデノウイルスゲノムの５’アームを含む、環状ＤＮＡシャトルベクターである。３’アームと５’アームはともに、本明細書ではシャトルベクターの主要フラグメントと呼ばれる。主要フラグメントの３’末端および５’末端はさらに、連結用の制限部位により、低コピー細菌複製起点と選択マーカー遺伝子とを含むベクターフラグメントと連結される（図６および８を参照されたい）。
あるいは上記のように、シャトルベクターは、例えばシャトルベクターの３’アーム内に、１つまたは複数の導入遺伝子を含み得る。
一実施形態では、シャトルベクターは５’アームをさらに含む。シャトルベクターに使用する５’アームは、例えば、本発明の方法と関連して記載されている、他の箇所で定義される関連する構成要素と同じものである。
一実施形態では、シャトルベクターは、例えば、当業者が精通する標準的な技術を用いてゲノムに導入された、少なくとも１つの独自の制限部位を含む。
一実施形態では、シャトルベクターは配列番号２の配列を有する。一実施形態では、シャトルベクターは配列番号１５の配列を有する。一実施形態では、シャトルベクターは配列番号１７の配列を有する。一実施形態では、シャトルベクターは配列番号２６の配列を有する。
一実施形態では、本発明の方法によって得られるアデノウイルスプラスミドが提供される。
さらなる態様では、
ａ）Ｌ５遺伝子とＥ３部位とＥ４部位とを含む、アデノウイルスゲノムと、
ｂ）Ｌ５遺伝子と、Ｅ３部位、Ｅ４部位およびＥ３部位とＥ４部位のそれぞれからなる群より選択される部位との間の位置にある少なくとも１つの独自の制限部位と、
ｃ）低コピー細菌複製起点と、
ｄ）選択マーカー遺伝子と
を含む、プラスミドが提供される。
新規なプラスミドは、後期発現Ｌ５ファイバー遺伝子の近傍にある新規な独自の制限部位をもたらす点で有利である。導入遺伝子をこの位置に挿入すると、ウイルスの安定性および複製に干渉する可能性が低くなる。一実施形態では、プラスミドは、当業者が精通する標準的な技術を用いてゲノムに導入された少なくとも１つの独自の制限部位を含む。一実施形態では、プラスミドは導入遺伝子カセットをさらに含む。一実施形態では、プラスミドは配列番号２８の配列を有する。一実施形態では、プラスミドは配列番号３０の配列を有する。一実施形態では、プラスミドは配列番号３１の配列を有する。
さらなる態様では、本発明によるプラスミドから得られるアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが提供される。
一実施形態では、アデノウイルスまたはウイルスベクターは、例えばゲノムを全く欠失させずに挿入することが可能な、小型の導入遺伝子を含む。一実施形態では、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、ゲノムを全く欠失させずに挿入することが可能な小型の導入遺伝子、例えば合計４．５ｋｂ以下の１つまたは複数の遺伝子を含み得る。
一実施形態では、本開示による方法により、または本開示のプラスミドから得られるアデノウイルスまたはウイルスベクターは、大型の導入遺伝子を含み得る。一実施形態では、複製能を有するアデノウイルスは、例えば、複製に不可欠ではない遺伝子が除去されている、例えばＥ３および／またはＥ４ｏｒｆ４領域の一部または全部が欠失しているため、ゲノム内に追加のスペース（ＥｎＡｄなど）を有する。一実施形態では、ゲノム内のスペースが、例えばＥ３および／またはＥ４ｏｒｆ４領域の一部または全部を欠失させることにより生じたものである、条件付きで複製するアデノウイルスが提供される。
一実施形態では、非複製型アデノウイルス（すなわち、複製するのにパッケージング細胞系を必要とするアデノウイルス）は、１つまたは複数の遺伝子、例えば欠失させる初期遺伝子、例えばＥ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４（Ｅ４ｏｒｆ４など）から独立して選択される１つまたは複数の遺伝子の一部または全部を有する。
一実施形態では、設計されるウイルスは複製能を有する生存ウイルスである。
一実施形態では、設計されるウイルスは複製欠損ウイルスベクターである。一実施形態では、本開示のウイルスベクターのＥ１遺伝子が欠失している。一実施形態では、本明細書で使用されるウイルスベクターは、遺伝物質、例えば導入遺伝子を、その複製および／または発現が可能な哺乳動物細胞などの別の細胞内に人為的に運搬する運搬体として用いられるＤＮＡ分子を指す。
一実施形態では、設計される本開示のアデノウイルス構築物は、１つまたは複数の導入遺伝子を含む。
一実施形態では、本開示によるウイルスまたはウイルスベクターのＥ４遺伝子が一部または全部欠失しており、例えば遺伝子のＥ４ｏｒｆ４セクションなどが欠失している。
一実施形態では、本開示によるウイルスまたはウイルスベクターのＥ３遺伝子が一部または全部欠失している。
一実施形態では、本開示によるウイルスまたはウイルスベクターのＥ３遺伝子およびＥ４遺伝子の一部または全部が欠失している。
一実施形態では、本開示によるウイルスまたはウイルスベクターのＬ５遺伝子が一部または全部欠失している。本開示のウイルスでは、Ｌ５機能がウイルス複製に不可欠であるため、この機能が保持される限り、Ｌ５を一部欠失させることが可能である。
一実施形態では、本開示によるウイルスまたはウイルスベクターのＥ２領域が一部または全部欠失している。
一実施形態では、例えば本開示のアデノウイルスプラスミドから得られる、本開示のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが提供される。
一実施形態では、例えば本発明によるプラスミドから得られる本開示のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの治療への使用が提供される。別の態様では、本発明によるプラスミドから得られるアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの治療への使用が提供される。
当業者には、本発明のプラスミドから作製されるアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを治療剤、例えば腫瘍溶解剤としても、またはワクチンとしても、またはパッケージング細胞の補助がなければウイルスが複製することができない遺伝子送達ベクターとしても使用し得ることが理解されよう。
さらなる態様では、例えば本発明によるプラスミドから得られる本開示のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの癌治療への使用が提供される。
別の態様では、例えば本発明によるプラスミドから得られる本開示のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターのワクチン療法への使用が提供される。
本明細書で使用される「によって得られる」は、本開示の方法を用いて作製される実体の特徴を有する任意のプラスミドまたはアデノウイルスを意味する。実施形態では、本明細書で使用される「から得られる」は、本発明のプラスミドから切り取ったアデノウイルスゲノムから作製することができる任意のアデノウイルスを意味する。
一実施形態では、本開示のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、ゲノムを全く欠失させずに挿入することが可能な小型の導入遺伝子、例えば合計４．５ｋｂ以下の１つまたは複数の遺伝子を含み得る。
一実施形態では、例えば本発明によるプラスミドから得られる本開示のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの治療への使用が提供される。
製剤および治療法
さらなる態様では、例えば本発明によるプラスミドから得られる本開示のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターと、薬学的に許容される添加剤とを含む、組成物が提供される。
当業者には、本発明のプラスミドから作製されるアデノウイルスを治療剤、例えば腫瘍溶解剤として、またはワクチンとして、またはパッケージング細胞の補助がなければウイルスが複製することができない遺伝子送達ベクター、すなわちウイルスベクターとして使用し得ることが理解されよう。
一実施形態では、本発明によるプラスミドから得られるアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの、癌治療のための薬剤製造への使用が提供される。
本明細書で使用されるワクチン主体の治療法は、治療利益が得られるよう抗原に対する免疫応答を誘導するか、確立された免疫応答を量的／または質的に修正するための、１つまたは複数の抗原をコードする導入遺伝子を含む本発明のアデノウイルスベクターの送達（例えば、筋肉内、皮下、真皮内、局所、舌下、鼻腔内、経口、経膣または経直腸）または一連のこのような送達を意味する。この場合、当業者に理解されるように、各送達は、免疫調節剤、例えばアジュバント、免疫調節ペプチド、タンパク質または小分子を用いて製剤化されたものであっても、これらの送達とともに実施するものであってもよい。
一実施形態では、有効量の本開示によるプラスミドから得られるアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターおよび薬学的に許容される添加剤が提供される。
薬学的に許容される添加剤または担体は、それ自体が組成物を投与する個体に有害な抗体の産生を誘導するものであってはならず、また有毒であってはならない。適切な担体は、大型で代謝される速度の遅い高分子、例えばタンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子などであり得る。
薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩などの鉱酸塩または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩などの有機酸の塩を使用することができる。
治療用組成物中の薬学的に許容される担体はさらに、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含有し得る。さらに、このような組成物中に湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝物質などの補助物質が存在してもよい。このような担体により、患者に摂取させる錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液体、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤および懸濁剤として医薬組成物を製剤化することが可能にある。
投与に適した形態としては、例えば注射または注入による非経口投与、例えばボーラス注射または持続注入による非経口投与に適した形態が挙げられる。製品が注射用または注入用である場合、それは、油性または水性を溶媒とする懸濁液、溶液または乳濁液の形態をとり得るほか、懸濁化剤、保存剤、安定剤および／または分散剤などの製剤用剤を含有し得る。あるいは、ウイルスは、使用前にしかるべき無菌液体で再構成する乾燥形態であり得る。
製剤化されれば、本発明の組成物を対象に直接投与することができる。治療する対象は動物であり得る。しかし、１つまたは複数の実施形態では、組成物はヒト対象への投与に適合させたものである。
本開示による製剤では、最終製剤のｐＨがウイルスの等電点の値と同じではないのが適切であり、例えば、製剤のｐＨが７である場合、８〜９またはそれ以上のｐＨが適切であり得る。理論に束縛されることを望むものではないが、これにより、最終的には最終製剤に安定性の改善がもたらされる可能性があり、例えば、ウイルスが溶解した状態で保たれるものと考えられる。
本発明の医薬組成物は、特に限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、経皮（例えば、国際公開第９８／２０７３４号を参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、膣内または経直腸の各経路を含めた様々な経路で投与し得る。このほか、ハイポスプレーを用いて本発明の医薬組成物を投与してもよい。通常、治療用組成物は液体の溶剤または懸濁剤のいずれかとして注射用に調製され得る。このほか、注射前に液体溶媒に溶解または懸濁させるのに適した固体形態を調製してもよい。
組成物の直接送達は一般に、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内への注射によって達成され得るか、組織の間質腔に送達され得る。このほか、組成物を病巣に投与することができる。投薬治療は、単回投与計画であっても複数回投与計画であってもよい。
組成物中の有効成分はウイルスであることが理解されよう。このため、消化管内での分解を受けやすい。したがって、消化管を利用する経路によって組成物を投与する場合、組成物は、ウイルスを分解から保護するが、消化管から吸収されてからウイルスを放出する薬剤を含有する必要がある。
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．１９９１）では、薬学的に許容される担体に関して徹底的に論じられている。
一実施形態では、製剤が局所投与のための製剤として提供される。
適切な吸入製剤としては、吸入粉末剤、噴射ガスを含有する定量噴霧剤または噴射剤ガスを含まない吸入液剤が挙げられる。活性物質を含有する本開示による吸入粉末剤は、上記の活性物質のみからなるものであっても、上記の活性物質と生理的に許容される添加剤の混合物からなるものであってもよい。
このような吸入粉末剤は、単糖（例えば、グルコースまたはアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖および多糖（例えば、デキストラン）、ポリアルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）またはこれらを互いに混合したものを含み得る。単糖または二糖を使用するのが適切であり、特に水和物形態のラクトースまたはグルコースの使用が適切であるが、これに限定されない。
肺に沈着させる粒子は、粒子径を１０ミクロン未満、例えば１〜９ミクロンなど、例えば０．１〜５μｍ、特に１〜５μｍにする必要がある。有効成分（ウイルスなど）の粒子径は最も重要である。
吸入噴霧剤の調製に使用し得る噴射ガスは当該技術分野で公知である。適切な噴射ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタンまたはイソブタンなどの炭化水素およびハロゲン化炭化水素、例えばメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパンまたはシクロブタンの塩素化および／またはフッ素化誘導体などから選択される。上記の噴射ガスは、それ単独で用いても、その混合物として用いてもよい。
特に適切な噴射ガスは、ＴＧ１１，ＴＧ１２，ＴＧ１３４ａおよびＴＧ２２７から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）およびＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）ならびにその混合物が特に適切である。
噴射ガス含有吸入噴霧剤はほかにも、共溶媒、安定剤、界面活性剤、抗酸化剤、滑沢剤およびｐＨ調整手段などの他の成分を含有し得る。これらの成分はいずれも当該技術分野で公知である。
本発明による噴射剤ガス含有吸入噴霧剤は、活性物質を最大５重量％含有し得る。本発明による噴霧剤は、有効成分を例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％または０．５〜１重量％含有する。
あるいは、肺への局所の投与はほかにも、例えば噴霧器、例えばコンプレッサと接続された噴霧器（例えば、Ｐａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ社（リッチモンド、バージニア州Ｖ）製のＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（商標）コンプレッサと接続されたＰａｒｉ ＬＣ−Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（商標）噴霧器）などの装置を用いる、液体の液体製剤または懸濁液製剤の投与であり得る。
本発明のウイルスは、溶媒に分散させて、例えば溶液または懸濁液の形態で送達することができる。ウイルスは、しかるべき生理溶液、例えば、生理食塩水をはじめとする薬理学的に許容される溶媒または緩衝液に懸濁させることができる。当該技術分野で公知の緩衝液は、ｐＨが約４．０〜５．０になるように、水１ｍｌ当たりエデト酸二ナトリウムを０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇ、ＮａＣｌを８．０ｍｇ〜９．０ｍｇ、ポリソルベートを０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇ、無水クエン酸を０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇおよびクエン酸ナトリウムを０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇ含有し得る。懸濁液には、例えば、現場で無菌等張担体で希釈する凍結乾燥ウイルスを用い得る。
治療用の懸濁剤または液体製剤はほかにも、１つまたは複数の添加剤を含有し得る。添加剤は当該技術分野で周知であり、緩衝剤（例えば、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤および炭酸水素緩衝剤）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトールおよびグリセロールがこれに含まれる。液剤または懸濁剤をリポソームまたは生分解性マイクロスフェアに封入することができる。製剤は一般に、実質的に無菌の形態で提供される。
無菌製造工程は、当業者が精通する方法による、ウイルスの作製および製剤に使用する緩衝溶媒／溶液のろ過による滅菌、無菌溶媒／溶液へのウイルスの無菌懸濁および無菌容器への製剤の分配を含み得る。
噴霧、非経口、局所および経口のための用量を含む本開示による製剤は、例えば、単回投与単位として（例えば密閉したプラスチック容器またはバイアルの形態などで）提供され得る。一実施形態では、各バイアルは、ある体積、例えば２ｍＬの体積の緩衝溶媒／溶液中に単位用量を含む。
本明細書では、溶媒、溶液、担体などは、文脈からそうでないことが明らかでない限り、互換的に使用される。
一実施形態では、単位用量を含む本開示による製剤をホイルの包みに包装する。
一実施形態では、治療に使用する本開示によるウイルス構築物、製剤を非経口投与する。一実施形態では、本開示によるウイルス構築物、製剤を局所的に、例えば、鼻腔内、結腸、肺、眼球などに投与する。一実施形態では、本開示によるウイルス構築物、製剤を経口投与する。
一実施形態では、本明細書に開示されるウイルスは、噴霧による送達に適し得る。
したがって、治療、例えば癌治療に使用するための本開示のアデノウイルスまたはこれを含む組成物の、特に、必要とする患者に治療有効量を投与することによる使用が提供される。このほか、本開示のアデノウイルスの薬剤製造への使用が提供される。
本明細書の文脈において、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」は「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」であると解釈される。
このほか、特定の要素を含む本発明の諸態様は、関連する要素から「なる」または関連する要素から「実質的になる」代替の実施形態に及ぶものとする。
技術的に適切である場合、本発明の実施形態を組み合わせてもよい。
特許および特許出願などの技術参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に具体的かつ明確に記載される実施形態は、単独で、または１つもしくは複数のさらなる実施形態と組み合わせて、権利放棄の基礎となり得る。
補正の基礎となり得る配列および図面には本開示の諸態様が記載される。図面および配列の開示は本開示全般に適用されるものであって、単なる極めて具体的な特徴の組合せとして解釈されることを意図するものではない。優先出願である英国特許第１３２２８５１．５号が参照により本明細書に組み込まれ、同じく国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７２９１９号の内容が、その配列表を含め参照により本明細書に組み込まれる。
Figure 2017501695
Figure 2017501695
実施例１．ＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターの構築
ｐ１５Ａ細菌複製起点と、カナマイシン耐性カセットと、第三の制限酵素部位ＰｓｐＯＭＩによって連結されたＣｏｌｏＡｄ１の５’アームおよび３’アームとを含む、「ＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクター」と称する１１９７８ｂｐのシャトルベクターを構築した（図６を参照されたい）。
ＰＣＲにより３つのＤＮＡフラグメント：
１）ＣｏｌｏＡｄ１の５’４６２７ｂｐに対応し、５’ＡｓｃＩ制限部位と３’ＰｓｐＯＭＩ制限部位とを有する、「ＣｏｌｏＡｄ１の５’アーム」、
２）ＣｏｌｏＡｄ１ゲノムの３’４４８２ｂｐに対応し、５’ＰｓｐＯＭＩ制限部位と３’ＡｓｃＩ制限部位とを有する、「ＣｏｌｏＡｄ１の３’アーム」および
３）ＡｓｃＩ制限部位（複数）と隣接する、低コピーｐ１５Ａ複製起点とカナマイシン耐性カセットとを含むベクターフラグメント
を合成した。
ゲノム配列に望ましくない変化を導入せずにシャトルベクターを直線化し、ＣｏｌｏＡｄ１ゲノムと組み換えてプラスミドを形成させるのに適した制限部位として、５’アームおよび３’アーム内の第三の制限部位ＰｓｐＯＭＩを選択した。
この制限部位は、図４に示される通り、シャトルベクターが約４〜５ｋｂの３’アームおよび５’アームを有するように、ＣｏｌｏＡｄ１ゲノムの５’末端のほかにもゲノムの３’末端、特に３’ＩＴＲＳおよび５’ＩＴＲＳの末端から約４〜５ｋｂの付近に来るよう設計されたものである。
ＰＣＲによるフラグメント合成の詳細
ＰＣＲ増幅に使用したプライマーを表１に記載する。
Figure 2017501695
１）５’アームの作製
Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢおよびＥ２Ｂ領域ならびにＣｏｌｏＡｄ１の５’末端を増幅するため、天然のＣｏｌｏＡｄ１に対してプライマー０１９８（配列番号５）および０２００（配列番号７）を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応には、表２に従って反応体積５０μｌを用い、ＰＣＲ産物の模式図を図１０Ａに示す。
Figure 2017501695
２）３’アームの作製
Ｅ３、ファイバーおよびＥ４領域ならびにＣｏｌｏＡｄ１の３’末端を作製するため、天然のＣｏｌｏＡｄ１に対してプライマー０１９８（配列番号５）および０２０１（配列番号８）を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応には、下の表３に詳述するように、反応体積５０μｌを用い、ＰＣＲ産物の模式図を図１０Ｂに示す。
Figure 2017501695
３）ベクターフラグメントの作製
ベクターフラグメントに対してプライマー０１９６（配列番号３）および０１９７（配列番号４）を用いて第三のＰＣＲを実施して、ｐ１５Ａ起点と、カナマイシン耐性遺伝子とを含み、５’および３’ＡｓｃＩ制限部位を有する、約３ｋｂのフラグメントを作製した（図１０Ｃ）。ＰＣＲ反応には、表４に詳述するように、反応体積５０μｌを用いた。
Figure 2017501695
ＰＣＲ増幅にはいずれも表５のプロトコルを用いた
Figure 2017501695
以下のように増幅を３０サイクルの実施した：［段階１］×１，［段階２、段階３、段階４］×３０、［段階５］×１。
次いで、各ＰＣＲ産物１μｌを１％アガロースゲルで１時間、１５０Ｖで泳動した（図１１Ａ）。各ＰＣＲ産物の全量をスピンカラム法により製造業者のプロトコル通りに精製し、溶出緩衝液４０μｌに溶出させた。
増幅率を高めるため、５’アームおよび３’アームのＰＣＲを繰り返し実施した。既に詳述したものと同じプログラムおよび混合物を使用し、産物１μｌを０．８％ゲルで１時間、１５０Ｖで泳動した（図１１Ｂ）。各ＰＣＲ産物の全量を０．８％アガロースからのゲル抽出により精製し、溶出緩衝液４０μｌに溶出させた。
ＰＣＲ増幅を実施した後、３つのＰＣＲフラグメントを「くっつけ」てＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターを形成するべく、多数の方法を試みた。１つの方法では、２段階の反応を用いてＰＣＲ産物をライゲートするべく試みた。この方法は、最初に５’アームと３’アームとをライゲートした後、２回目のライゲーション反応によりベクターをライゲートするものであったが、成功しなかった（詳細については以下を参照されたい）。
２つ目の方法では、１段階の３者ライゲーションで３つのＰＣＲ産物をライゲートするべく試みた。この方法を用いてライゲーションを成功させる条件を決定するため、総ＤＮＡ量、ＤＮＡフラグメントの比、ライゲーションの時間と温度およびベクターのリン酸化状態を様々に変化させた。いくつかの組合せを試みて不成功に終わったのち、機能的な方法論を打ち立てた。
１段階の３者ライゲーションによるＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターの形成
下の表に従って、ＰｓｐＯＭＩおよびＡｓｃＩを用いた５’アームおよび３’アームのＰＣＲ産物（約４．６ｋｂおよび約４．５ｋｂ）の二重消化（表６を参照されたい）ならびにＡｓｃＩのみによるｐ１５ａ−ＫＡＮベクターのＰＣＲ産物（約３ｋｂ）の消化（表７を参照されたい）を３７℃で２時間実施した。
Figure 2017501695
Figure 2017501695
５’アームおよび３’アームの消化物を６５℃で２０分間、熱失活させた。ｐ１５Ａ−Ｋａｎベクターフラグメントを３７℃で１時間、１μｌアルカリ仔ウシホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理した。
処理した各制限消化物１μｌを０．８％アガロースゲルで泳動した（図１２）。消化産物の全量を０．８％アガロースゲルで分離し、ゲル精製し、溶出緩衝液４０μｌに溶出させた。
精製した消化産物にＴ４ ＤＮＡリガーゼ２μｌおよびリガーゼ緩衝液４μｌを用いて、表８のように様々な比のフラグメントで、１段階の３者ライゲーションを室温で１時間実施した。
Figure 2017501695
ライゲーション混合物全体をＸＬ−１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテント細胞と氷上で３０分間インキュベーションした後、４２℃で３０秒間、熱ショックを加えることにより、細菌に形質転換した。ＬＢ＋Ｋａｎプレートに各形質転換培養物５００μｌを散布し、３７℃で一晩インキュベートした。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２μｌを加えた脱リン酸化ｐ１５Ａ−ｋａｎベクター６μｌを用いた対照をＬＢ＋Ｋａｎプレートに散布した。一晩インキュベートした後、対照プレート以外のプレートにはいずれもコロニーが認められた。
コロニーの診断的ＰＣＲスクリーニングおよび制限消化
各プレートから４コロニーを選択して取り出し、ＬＢブロス４ｍｌ中において、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。
ミニプレップによりＤＮＡを精製した。ミニプレップでは、製造業者のミニプレッププロトコル通りに、アルカリ溶菌により細菌からＤＮＡを回収し、ＤＮＡ結合カラムでＤＮＡを精製した。ＤＮＡは緩衝液４０μｌに溶出させた。
１２個の精製ＤＮＡ試料に診断的ＰＣＲを実施して、約１２ｋｂのＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクター産物が存在し、５’アームおよび３’アームがともに正確な方向で含まれているかどうかを判定した（図１３）。各構築物には、ライゲーションが起こったと思われる連結点にまたがるプライマーを用いた３つのＰＣＲを個別に用いた。反応に用いたプライマーの配列を下の表９に示す。
Figure 2017501695
下の表１０〜１２に詳細に記載する混合物に従ってＰＣＲ反応物を設定した。
Figure 2017501695
Figure 2017501695
Figure 2017501695
ＴＡＱポリメラーゼＰＣＲミックス（Ｑｉａｇｅｎ社、番号２０１４４３）の製造業者の使用説明書に従ってＰＣＲプログラムを設定した。
ＰＣＲ産物１μｌを１％アガロースゲルで１時間、１５０Ｖで泳動した（図１４）。
大きさおよび方向が正しい構築物では、図１３の模式図に詳細に記載される１．３ｋｂ、１．４ｋｂおよび１．１ｋｂの３つのＰＣＲ産物が予想された。正しい大きさの産物を示したのは試料１３、１４および１６のみであった（図１４）。これらの構築物はいずれも１：１：１のライゲーション比を用いて得られたものである。１：１：６および１：１：１２の比を用いた構築物では正しい大きさのフラグメントは得られなかった（図１４の番号１７〜２４）。１：１：１のライゲーションの試料に１２ｋｂのＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターが存在することを確認するため、選択した構築物にＰｓｐＯＭＩによる制限消化およびＰｓｐＯＭＩとＡｓｃＩによる二重消化を３７℃で１時間実施した。用いた消化反応物を表１３および表１４に詳細に記載する。
Figure 2017501695
Figure 2017501695
各消化物１μｌを０．８％ゲルで１時間、１５０Ｖで泳動した（図１５）。
大きさおよび方向が正しい構築物では、ＰｓｐＯＭＩ消化により約１２ｋｂの単一バンドが得られることが予想され、ＰｓｐＯＭＩ／ＡｓｃＩ消化により約３ｋｂのバンドおよび約４．７ｋｂのバンドが得られることが予想された。二重消化では、約４．７ｋｂのバンドは、この大きさの５’アームおよび３’アームが両方存在するため、強度が約３ｋｂのバンドの約２倍になると予想された。構築物１３および１６は、ＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターに対応する正しい消化バンドパターンを示した（図８）。
次いで番号１６の構築物の配列を決定したところ、配列番号２のＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターの構築に成功したことが確認された。
実施例２．ＣｏｌｏＡｄ２．４シャトルベクターの構築
実施例１で作製したＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターには、ゲノム内に１回のみ現れ、シャトルベクターに存在するＣｏｌｏＡｄ１ゲノム内の任意の領域の改変（例えば、Ｅ１領域の改変）を可能にする、１１個の固有（天然）の制限部位が含まれていた。シャトルベクターに存在する各部位およびＣｏｌｏＡｄ１遺伝子の位置を示す制限酵素地図を図６に示す。
ＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターでは、２つの固有（天然）の制限部位（ＰｓｐＯＭＩおよびＡｃｌＩ）がそれぞれ４６３４および６８５１の位置でファイバー（Ｌ５）遺伝子に隣接している。これらは、ＣｏｌｏＡｄ１ゲノム内で２７８３９および３００６５の位置でファイバー（Ｌ５）遺伝子に隣接する元のＰｓｐＯＭＩおよびＡｃｌＩに対応している（図９）。ＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターでは、これらの部位により、この領域のＤＮＡ配列を切り取って、改変された配列または異なる配列に置き換える、あるいはこの領域に単なる付加によりＤＮＡ配列を挿入することが可能になる。
ＰｓｐＯＭＩとＡｃｌＩ制限部位との間のＤＮＡ配列を合成ＤＮＡフラグメントに置き換えることによって、ＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターからＣｏｌｏＡｄ２．４シャトルベクターを作製した。合成ＤＮＡフラグメントの配列は、ファイバー遺伝子下流に追加の１９ｂｐ（ＧＣＧＡＴＣＧＣＴＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧ−配列番号２９、図３）を含むことを除いて、ＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクター内の置き換わる配列と同じであった。この追加の塩基は、新規な独自のＳｇｆＩ制限部位およびＳｂｆＩ制限部位を含むものであった（図１７）。
ＰｓｐＯＭＩ部位およびＡｃｌＩ部位に隣接する合成ＤＮＡフラグメントはＭＷＧ Ｅｕｒｏｆｉｎｓ社に注文したものである（図１８、配列番号２７））。この合成フラグメントは５．１７ｋｂのＡｍｐＲ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫプラスミドの形で供給された。
ＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターおよび合成フラグメントを含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを表１５に詳細に記載する反応物中において、３７℃で１時間消化した。
Figure 2017501695
消化したシャトルベクターおよび合成フラグメントをともに０．８％アガロースゲルで分離し、しかるべき大きさのフラグメントをゲル精製し、ヌクレアーゼフリー水４０μｌに溶出させた。
インサートとシャトルベクターが３：１のライゲーション比を用いて、反応物１０μｌ中、３μｌ：１μｌの体積で１時間、１×リガーゼ緩衝液およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌにより室温にて合成フラグメントをＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクター内にライゲートした。
ライゲーション混合物２μｌを製造業者のプロトコルに従って、４２℃の熱ショックによりＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。形質転換後、ＬＢカナマイシンプレートから５つのコロニーを選択して取り出し、カナマイシンを含有するＬＢブロス３ｍｌ中において、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。各培養物にミニプレップを製造業者のプロトコル通りに実施し、精製されたＤＮＡを緩衝液４０μｌに溶出させた。
独自の制限部位ＳｂｆＩおよびＳｇｆＩを含むＣｏｌｏＡｄ２．４シャトルベクターの構築を確認するため、５例の試料それぞれに制限酵素分析を実施した。下の表１６に詳細に記載する通りにＥｃｏＲＶおよびＳｂｆＩによる制限消化を設定した。
Figure 2017501695
５例いずれの消化物からも、正しい大きさのフラグメント、すなわち３ｋｂのバンドおよび９ｋｂのバンドが得られた（図１９）。
ＣｏｌｏＡｄ２．４シャトルベクターであると推定された番号５をグリセロールストックからの細菌中で増幅させ、ＤＮＡを回収し、マキシプレップにより精製した。この番号５の構築物の配列を決定し、ＣｏｌｏＡｄ２．４シャトルベクター（配列番号２６）の構築が成功したことを確認した。
実施例３．ＣｏｌｏＡｄ２．０シャトルベクターの構築
実施例１で構築したＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターからＣｏｌｏＡｄ２．０シャトルベクター（配列番号１５、図２０）を作製した。ＣｏｌｏＡｄ２．０シャトルベクターの作製に用いた方法は、ＣｏｌｏＡｄ２．４シャトルベクターの作製に用いた方法、すなわち、実施例２で詳述したＰｓｐＯＭＩ制限部位とＡｃｌＩ制限部位との間への合成ＤＮＡフラグメントのライゲーションを用いた方法と同じであった。
ＣｏｌｏＡｄ２．０シャトルベクターの構築に用いた合成ＤＮＡフラグメントの配列は、Ｆｉｂｒｅ（Ｌ５）遺伝子上流に独自の制限部位ＦｓｅＩを含む追加の９ｂｐのほか、ファイバー遺伝子下流に２つのポリアデニル化配列と独自の制限部位ＳｇｆＩ、ＮｏｔＩおよびＳｂｆＩとを含む追加の１２３ｂｐを含むことを除いて、ＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクター内の置き換わる配列とほぼ同じものであった（配列番号１６、図２１）。
表１７の混合物に詳細に記載するように酵素ＦｓｅＩ、ＡｓｃＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂｆＩまたはＰｓｐＯＭＩを用いて１時間、３７℃で実施した制限消化のパネルにより、ＣｏｌｏＡｄ２．０シャトルベクターの構築を確認した。
Figure 2017501695
各消化物２μｌを１％アガロースゲルで分離した。いずれの構築物も各消化物について正しいバンドパターンを示した（図２２）。番号４のＣｏｌｏＡｄ２．０シャトルベクター構築物を選択して配列を決定したところ、ＣｏｌｏＡｄ２．０シャトルベクター（配列番号１５）の構築に成功したことが確認された。
実施例４．ＣｏｌｏＡｄ２．１シャトルベクターの構築
ＰｓｐＯＭＩ制限部位とＡｃｌＩ制限部位との間のＤＮＡ配列を、２回のＰＣＲ反応によって作製したＤＮＡフラグメント（配列番号１８）に置き換えることにより、ＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクター（実施例１で得られたもの）からＣｏｌｏＡｄ２．１シャトルベクター（配列番号１７、図２３）を作製した。得られたＤＮＡフラグメントは、ファイバー遺伝子上流に追加の９ｂｐ（ＡＧＣＧＧＣＣＧＣ−配列番号１９、図３）を含むことを除いて、ＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクター内の置き換わる配列と同じであった。この追加の塩基は独自のＮｏｔＩ制限部位を含むものであった（図２４Ｃ）。
ＮｏｔＩ制限部位をＰＣＲによりＰｓｐＯＭＩ−ＡｃｌＩ隣接配列内に導入するのに、２回のＰＣＲ反応が必要であった。１番目のＰＣＲ（ＰＣＲ１）では５’ＰｓｐＯＭＩ制限部位と導入された３’ＮｏｔＩ部位とを含むフラグメントが生じ（図２４Ａ）、２番目のＰＣＲ（ＰＣＲ２）では導入された５’ＮｏｔＩ部位と３’ＡｃｌＩ部位とを含むフラグメントが生じた（図２４Ｂ）。これらのＰＣＲ産物をＮｏｔＩ部位でライゲートすることにより、ＣｏｌｏＡｄ２．０シャトルベクター構築に用いるＣｏｌｏＡｄ２．０のＤＮＡフラグメントを作製した（図２４Ｃ）。
２回のＰＣＲ反応に使用したプライマーを表１８に示す。
Figure 2017501695
ＣｏｌｏＡｄ１ゲノム鋳型ＤＮＡにプライマー０２７４（配列番号２０）および０２７５（配列番号２１）を用いてＰＣＲ１を実施した。ＰＣＲ１の反応には、下の表１９に従って反応体積５０μｌを用い、ＰＣＲ１産物の模式図を図２４Ａに示す（配列番号２４）。
Figure 2017501695
ＣｏｌｏＡｄ１ゲノム鋳型ＤＮＡにプライマー０２７６（配列番号２２）および０２７７（配列番号２３）を用いてＰＣＲ２を実施した。ＰＣＲ２の反応には、下の表２０に従って反応体積５０μｌを用い、ＰＣＲ２産物の模式図を図２４Ｂに示す（配列番号２５）。
Figure 2017501695
ＰＣＲ反応はいずれも、表２１に詳細に記載するプログラムに従って実施した。
Figure 2017501695
以下のように増幅を３０サイクル実施した：［段階１］×１、［段階２、段階３、段階４］×３０、［段階５］×１。
ＰＣＲ産物の全量をスピンカラム法により製造業者のプロトコル通りに精製し、溶出緩衝液４０μｌに溶出させた。
次いで、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩによるＰＣＲ１産物の消化（表２２）のほか、ＢｇｌＩＩおよびＮｏｔＩを用いたクローニングベクターの消化（表２３を参照されたい）を３７℃で１時間実施した。
Figure 2017501695
Figure 2017501695
消化したベクターおよびＰＣＲ１の産物を０．８％アガロースゲルで分離し、しかるべき大きさのフラグメントをゲル精製し、ヌクレアーゼフリー水４０μｌに溶出させた。
インサートとベクターが３：１のライゲーション比を用いて、反応物２０μｌ中、１０μｌ：１μｌの体積で１時間、１×リガーゼ緩衝液およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌにより室温にてＰＣＲ１の産物をベクター内にライゲートした。
ライゲーション混合物６μｌを製造業者のプロトコルに従って、４２℃の熱ショックによりＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。形質転換後、ＬＢカナマイシンプレートから５つのコロニーを選択して取り出し、カナマイシンを含有するＬＢブロス３ｍｌ中において、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。各培養物にミニプレップを製造業者のプロトコル通りに実施し、精製されたＤＮＡを緩衝液４０μｌに溶出させた。
ベクターがＰＣＲ１の産物を含むことを確認するため、５例の試料それぞれに制限酵素分析を実施した。ＳｐｅＩおよびＡｓｃＩによる制限消化を３７℃で１時間、表２４に詳細に記載する通りに設定した。
Figure 2017501695
５例いずれの消化物からも、正しい大きさのフラグメント、すなわち１．５ｋｂのバンドおよび４ｋｂのバンドが得られた。
ＰＣＲ２の産物および新たに作製したＰＣＲ１の産物を含むベクターを３７℃で１時間、表２５に詳細に記載する通りにＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。
Figure 2017501695
消化したＰＣＲ１のフラグメントを含むベクターおよびＰＣＲ２の産物を０．８％アガロースゲルで分離し、しかるべき大きさのフラグメントをゲル精製し、ヌクレアーゼフリー水４０μｌに溶出させた。
インサートとベクターが３：１のライゲーション比を用いて、反応物２０μｌ中、１０μｌ：１μｌの体積で１時間、１×リガーゼ緩衝液およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌにより室温にてＰＣＲ２の産物をベクター内にライゲートした。
ライゲーション混合物６μｌを製造業者のプロトコルに従って、４２℃の熱ショックによりＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。形質転換後、ＬＢカナマイシンプレートから５つのコロニーを選択して取り出し、カナマイシンを含有するＬＢブロス３ｍｌ中において、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。各培養物にミニプレップを製造業者のプロトコル通りに実施し、精製されたＤＮＡを緩衝液４０μｌに溶出させた。
ベクターがＰＣＲ１の産物およびＰＣＲ２の産物の両方からなるＤＮＡフラグメントを含むことを確認するため、５例の試料それぞれに制限酵素分析を実施した。表２６に詳細に記載する通り、ＰｓｐＯＭＩおよびＡｃｌＩによる制限消化を３７℃で１時間、表２６に詳細に記載する通りに設定した。
Figure 2017501695
５例いずれの消化物からも、正しい大きさのフラグメント、すなわち２．３ｋｂのバンドおよび３．１５ｋｂのバンドが得られた。ベクター内のＰｓｐＯＭＩ部位とＡｃｌＩ部位との間のＤＮＡフラグメントの配列が正確であることを確認するため、番号５の試料の配列を決定した（配列番号１８）。
次いで、実施例１で構築したＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターからＣｏｌｏＡｄ２．１シャトルベクターを作製した。２回のＰＣＲ反応によって作製されたＤＮＡフラグメントをＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクター内にライゲートするのに用いた方法は、実施例２で合成ＤＮＡフラグメントをライゲートしてＣｏｌｏＡｄ２．４シャトルベクターを作製した方法と同じであった。
表２７の混合物に詳細に記載する通りに酵素ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩを用いた制限消化を３７℃で１時間実施することにより、ＣｏｌｏＡｄ２．１シャトルベクターの構築を確認した。
Figure 2017501695
各消化物２μｌを１％アガロースゲルで分離したところ、いずれの構築物もＣｏｌｏＡｄ２．１シャトルベクターに対応する正しいバンドパターンを示した（図２５）。番号４のＣｏｌｏＡｄ２．１シャトルベクター試料を選択して配列を決定し、ＣｏｌｏＡｄ２．１シャトルベクター（配列番号１７）の構築に成功したことを確認した。
実施例５．相同組換えによるＣｏｌｏＡｄ２．４、ＣｏｌｏＡｄ２．０またはＣｏｌｏＡｄ２．１プラスミドの構築
相同組換えによりＣｏｌｏＡｄ２．０、ＣｏｌｏＡｄ２．４およびＣｏｌｏＡｄ２．１シャトルベクターからＣｏｌｏＡｄ２．０（配列番号３０）、ＣｏｌｏＡｄ２．４（配列番号２８）およびＣｏｌｏＡｄ２．１（配列番号３１）プラスミドを作製した。この方法の模式図による概要を図５に示す。
ＣｏｌｏＡｄ２．０、ＣｏｌｏＡｄ２．４およびＣｏｌｏＡｄ２．１シャトルベクター内のＰｓｐＯＭＩ部位により、エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのＣｏｌｏＡｄ１ゲノムとの相同組換えのためにシャトルベクターを直線化することが可能であった。
以下の反応物を用いて、ＣｏｌｏＡｄ２．４シャトルベクター（配列番号２６）（６８．６ｎｇ／μｌ）を３７℃で１時間、ＰｓｐＯＭＩにより消化した。
Figure 2017501695
消化物５０μｌをＣＩＰ（仔ウシアルカリホスファターゼ）１μｌ で１時間、３７℃にて処理した。
消化物をプールし、Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｅｌｕｔｅ ＭｉｎｉｐｒｅｐカラムでＮＦＷ ４０μｌにより溶出させて精製した。
エレクトロコンピテントＢＪ５１８３細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ社）４０μｌ中、ＣｏｌｏＡｄ２．４シャトルベクター３．５μｌ（２３．４ｎｇ／μｌ）とＣｏｌｏＡｄ１ １．５μｌ（３６ｎｇ／μｌ）との組換えを実施した。このほか、ＢＪ５１８３細胞４０μｌ中、直線化したベクター（ＣｏｌｏＡｄ２．４ベクター）３．５μｌでネガティブ対照を実施した。エレクトロポレーションにより製造業者のプロトコル（Ａｇｉｌｅｎｔ社、番号２００１５４）通りに組換えを実施した。
培養物５μｌを希釈し、ＬＢ寒天＋カナマイシン上に散布し、３７℃で一晩インキュベートした。
ネガティブ対照では、ＬＢ＋Ｋａｎプレートに通常の大きさのコロニーはほとんど見られなかったのに対して、組換えのプレートには多数の小さいコロニーと少数の大型ないし中型のコロニーが見られた（図２７Ａ）。実験プレートから４８個のコロニーを選択して取り出し、ＬＢブロス＋Ｋａｎ ３ｍｌに、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩播種した。
ミニプレップにより製造業者のプロトコル通りに細菌からＤＮＡを精製し、ヌクレアーゼフリー水４０μｌに溶出させた。
ＤＮＡ試料中に組換えが存在するかどうかを判定するため、下の表２９の反応物を用いて、候補試料をＥｃｏＲＶおよびＳｂｆＩで消化した。
Figure 2017501695
消化物を０．８％アガロースゲルで１時間、１５０Ｖで泳動した（図２７Ｂ）。
ＥｃｏＲＶ／ＳｂｆＩによる消化の後、番号３、８および１０の組換えが正しいバンドを示し、それぞれ２μｌを製造業者のプロトコルに従ってＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞５０μｌに形質転換した。細胞５０μｌをＬＢ／カナマイシンプレートに播き、３７℃で一晩インキュベートした。
番号８のプレートから７つのコロニーを取り出し、カナマイシンを添加したＬＢブロス３ｍｌ中において、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩インキュベートした。組換えコロニーにミニプレップを製造業者のプロトコル通りに実施し、ＤＮＡをＮＦＷ ４０μｌに溶出させた。下の表３０の消化反応物を用いて、３７℃で１時間、診断的制限酵素消化を設定した。
Figure 2017501695
Figure 2017501695
消化物を０．８％アガロースゲルで泳動した（図２８）。
構築物のうち、消化した番号４の組換えＣｏｌｏＡｄ２．４プラスミドに正しい制限パターンが認められた。そこで、このプラスミドをグリセロールストックから増幅し、マキシプレップによりＤＮＡを精製し、配列を決定した（配列番号２８）。これにより、ＣｏｌｏＡｄ２．４プラスミドの作製に成功したことが確認された（図２６）。
図２に示されるＣｏｌｏＡｄ２．０（配列番号３０）、ＣｏｌｏＡｄ２．４（配列番号２８）およびＣｏｌｏＡｄ２．１（配列番号３１）プラスミドはいずれも、上記の方法を用いて構築に成功した。
全てのプラスミドに配列決定を実施し、ＣｏｌｏＡｄ１ゲノム配列内に不必要な変化が起こっていないことを確認した。
実施例６．成功しなかったシャトルベクターの２段階ライゲーション
実施例１に記載したＣｏｌｏＡｄ１の５’アームおよび３’アームのＰＣＲ産物２０μｌを３７℃で２時間、下の表３２に詳細に記載する通りにＰｓｐＯＭＩにより消化した。
Figure 2017501695
消化物を０．８％アガロースゲルで分離し、ゲル精製し、溶出緩衝液３０μｌに溶出させた。溶出させた産物の全量をライゲーション反応に用いた。
５’アームおよび３’アーム（約４．６ｋｂおよび約４．５ｋｂ）のフラグメントを、体積１０μｌ（低）または２５μｌ（高）を用いた１：１の比で２．５時間、室温でライゲートした。
Figure 2017501695
ライゲーション反応物を７０℃で５分間、熱失活させ、ライゲーションの各組にプライマー０１９９（配列番号６）またはプライマー０１９８（配列番号５）を用いてＰＣＲを２回実施し、約９．１ｋｂのフラグメントを増幅した。
各ＰＣＲ産物１μｌを０．８％アガロースゲルで泳動した（図２９Ａ）。
低体積ライゲーション後のＰＣＲ産物を全量、０．８％アガロースゲルで分離し、ゲル精製し、溶出緩衝液４０μｌに溶出させた。
ライゲートされた９ｋｂのＰＣＲ産物および前もってＰＣＲで増幅した約３ｋｂのｐ１５Ａ−Ｋａｎベクターに以下の混合物を用いて、３７℃で２時間、酵素ＡｓｃＩで制限消化した。
Figure 2017501695
ＡｓｃＩで消化した約９ｋｂのフラグメントを６５℃で２０分間、熱失活させ、ＡｓｃＩで消化したｐ１５ａ ＫＡＮベクターを３７℃で１時間、ＣＩＰ １μｌで処理した。
消化産物１μｌを１％アガロースゲルで泳動して、相対ＤＮＡ濃度を評価した（図２９Ｂ）。
次いで、各産物の全量をスピンカラム法により精製し、溶出緩衝液４０μｌに溶出させた。
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ２μｌおよびリガーゼ緩衝液４μｌを用いて、約９ｋｂのフラグメント（５’アーム−３’アーム）とｐ１５Ａ−Ｋａｎベクターとの間のライゲーションを室温で１．５時間、以下の比、１：１（５μｌ）、１：２（２μｌ：４μｌ）、１：３（２μｌ：６μｌ）、１：３（４μｌ：１２μｌ）、および１：３（３μｌ：９μｌ）で実施した。
各ライゲーション混合物の全量をＸＬ−１０ Ｇｏｌｄウルトラコンピテント細胞５０μｌに製造業者のプロトコル通りに（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、番号２００３１４）熱ショックにより形質転換した。
各培養物５００μｌをＬＢ＋カナマイシンプレートに散布し、３７℃で一晩インキュベートした。プレート上にコロニーが認められ、これをＬＢブロス中において、３７℃、２５０ｒｐｍで増幅した。ミニプレップにより製造業者のプロトコル通りに細菌からＤＮＡを精製した。
精製したＤＮＡについて、実施例１に詳述したものと同じ診断的ＰＣＲおよび制限消化法によりＣｏｌｏＡｄ１シャトルベクターの有無を分析した。
大きさおよび方向が正確な正しい構築物では、診断的ＰＣＲにより１．３ｋｂ、１．４ｋｂおよび１．１ｋｂのバンドが得られることが予想され、制限消化により、ＰｓｐＯＭＩでは単一の約１２ｋｂのバンドが得られ、ＰｓｐＯＭＩ／ＡｓｃＩでは約３ｋｂのバンドおよび約４．７ｋｂのバンドが得られることが予想された。いずれの診断的方法でも正しいバンドを示した試料はみられなかった（図１６）。
実施例７．レポーター遺伝子カセットを含むＣｏｌｏＡｄ２．４プラスミド（ｐＮＧ−６２）の構築
実施例５で作製したＣｏｌｏＡｄ２．４プラスミドを用いて、ＣｏｌｏＡｄ２．４プラスミドの固有の制限部位ＳｇｆＩとＳｂｆＩとの間にレポーター遺伝子の導入遺伝子カセットを含む、ｐＮＧ−６２と称するプラスミド（配列番号３５、図３０）を構築した。導入遺伝子カセットは、分岐スプライスアクセプター配列（ｂＳＡ）、蛍光レポーター遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびＳＶ４０後期ポリＡ配列（ＰＡ）からなるものであった。
１）導入遺伝子カセットの構築
導入遺伝子カセットの構築には、３’ＳＶ４０後期ポリＡ配列を有するＧＦＰ配列を含むクローニングベクター（ｍｐＳＦ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−ＰＡ）をＰＣＲ鋳型として用いた。
ＰＣＲにより、ＧＦＰ遺伝子の５’末端に分岐スプライスアクセプター（ｂＳＡ）およびＫＯＺＡＫ配列５’−ＴＧＣＴＡＡＴＣＴＴＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＡＧＧＣＣＧＣＣ−３’（配列番号３６）を付加した。このほかＰＣＲプライマーにより、ｂＳＡ配列の開始位置の前に５’ＳｇｆＩ部位、ＳＶ４０ポリＡ配列の後に３’ＳｂｆＩ部位をそれぞれ導入して、導入遺伝子カセットＰＣＲ産物を得た（図３１、配列番号３７）。ＰＣＲ産物の増幅に用いたＰＣＲプライマーを表３５に詳細に記載する。
Figure 2017501695
表３６に詳細に記載するＰＣＲ反応のために体積５０μｌの反応物を用いた。
Figure 2017501695
表３７のプログラムに従ってＰＣＲ増幅を実施した。
Figure 2017501695
ＰＣＲ産物をスピンカラムにより精製し、ＮＦＷ ４０μｌに溶出させた。ＰＣＲ産物およびＳｇｆＩ制限部位とＳｂｆＩ制限部位とを含むサブクローニングベクターを３７℃で１時間、酵素ＳｇｆＩおよびＳｂｆＩ（表３８）で消化した。
Figure 2017501695
消化産物を１％アガロースゲルで分離し、しかるべき大きさのフラグメントをゲル精製し、ヌクレアーゼフリー水４０μｌに溶出させた。
消化し精製したＰＣＲ産物を、インサートとベクターが３：１のライゲーション比を用いて、反応物１０μｌ中、３μｌ：１μｌの体積で１時間、１×リガーゼ緩衝液およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌにより室温にて直線化したベクター内にライゲートした。
ライゲーション反応物１μｌをＸＬ Ｇｏｌｄ細胞５０μｌに形質転換し、１００μｌをＬＢ＋アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）プレートに散布した。一晩増殖させた後、プレート上に５０超のコロニーが認められた。５つのコロニーを取り出し、アンピシリンを含有するＬＢブロス ３ｍｌ中で一晩培養した。ミニプレップによりＤＮＡを精製し、緩衝液４０μｌに溶出させた。
ベクター内に導入遺伝子カセットが存在することを確認するため、構築物を表３９の制限酵素ＳｇｆＩおよびＳｂｆＩで診断的に消化した。
Figure 2017501695
５つの構築物ではいずれも、消化により正しい大きさのフラグメント、すなわち１．１ｋｂのバンドおよび４．７ｋｂのバンドが得られた（図３２）。そこで、番号１の構築物の配列を決定し、ＧＦＰ導入遺伝子カセットの構築に成功したことを確認した（図３１、配列番号３７）。
２）プラスミドＮＧ−６２の構築
表４０に示す反応物を用いて、ＧＦＰ導入遺伝子カセットを含む番号１の構築物（５７６ｎｇ／μｌ）およびＣｏｌｏＡｄ２．４プラスミド（５８３ｎｇ／μｌ）を３７℃で２時間、ＳｇｆＩおよびＳｂｆＩで消化した。
Figure 2017501695
消化物を０．８％アガロースゲルで分離し、しかるべき大きさのフラグメントをゲルから切り取った。次いで、ＱＩＡＥＸ ＩＩキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＣｏｌｏＡｄ２．４プラスミドを精製し、ｑｕｉｃｋ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＧＦＰ導入遺伝子カセットを精製した。
インサートとベクターが１．５：１のライゲーション比（２．２５μｌ：３．７μｌ）または２：１のライゲーション比（３μｌ：４μｌ）のいずれかを用いて、ＣｏｌｏＡｄ２．４プラスミド（１８ｎｇ／μｌ）内に導入遺伝子カセット（４０ｎｇ／μｌ）をライゲートした。１０μｌの反応の体積にて１×リガーゼ緩衝液およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌを用いて反応を実施した。ライゲーションは１６℃で１６時間実施した。
ライゲーション混合物４μｌをＸＬ−Ｂｌｕｅ細胞５０μｌに製造業者のプロトコル通りに（Ａｇｉｌｅｎｔ社）に形質転換し、カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレートに形質転換物の全量を散布した。一晩増殖させた後、全コロニーをプレートから取り出し、カナマイシンを含有するＬＢブロス３ｍｌ中において、２５０ｒｐｍ、３７℃で一晩培養した。
ミニプレップによりＤＮＡを精製し、緩衝液４０μｌに溶出させた。
ｐＮＧ−６２プラスミドが作製されたかどうかを判定するため、表４１に詳細に記載する酵素ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＶを用いた制限消化により、構築物をスクリーニングした。
Figure 2017501695
消化産物を０．８％アガロースゲルで分離した。スクリーニングした構築物のうち、１．５：１の比のライゲーションで得られた番号１、２および３の構築物ならびに２：１の比のライゲーションで得られた番号１、２および４の構築物が、プラスミドｐＮＧ−６２で予測されるパターン、１２．３ｋｂ、９．７ｋｂ、５．５ｋｂおよび３．１ｋｂに対応するバンドサイズを示した（図３３Ａ）。
ｐＮＧ−６２であると推定された番号２（１．５：１）および番号１（２：１）の構築物についてはさらに、酵素ＢｇｌＩＩまたは酵素ＮｈｅＩとＥｃｏＲＶで診断的に制限消化した（図３３Ｂ）後、配列決定を実施した。これにより、プラスミドｐＮＧ−６２（配列番号３５、図３０）の構築に成功したことが確認された。
実施例８．ＮＧ−６２ウイルスの産生および導入遺伝子の発現
実施例７で作製したプラスミドｐＮＧ−６２を直線化し、これを用いて、導入された制限部位ＳｇｆＩとＳｂｆＩとの間にあり、ファイバー（Ｌ５）遺伝子の下流に挿入されたレポーター遺伝子（ＧＦＰ）の導入遺伝子カセットを有するＣｏｌｏＡｄ１ゲノムを含む生存ＣｏｌｏＡｄ１ウイルス粒子を作製した。
酵素ＡｓｃＩによる制限消化により、プラスミドｐＮＧ−６２（６８５ｎｇ／μｌ）を直線化してＮＧ−６２ウイルスゲノム（配列番号３８）を作製した。制限消化反応を表４２に従って設定し、３７℃で２時間実施した。
Figure 2017501695
消化したｐＮＧ−６２ ＤＮＡをヌクレアーゼフリー水５０μｌで希釈し、次いでフェノール／クロロホルム抽出により精製した。次いで、抽出したＮＧ−６２ ＤＮＡを分子生物学グレードの９５％超エタノール３００μｌ／３Ｍ酢酸ナトリウム１０μｌ中において、−２０℃で１６時間、沈殿させた。
沈殿したＤＮＡを１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによりペレット化し、７０％エタノール５００μｌで洗浄した後、再び１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。洗浄されたＤＮＡペレットを空気乾燥させ、リポフェクタミントランスフェクション試薬１５μｌを含有するＯｐｔｉＭＥＭ ５００μｌに再懸濁させ、室温で３０分間、インキュベートした。次いで、集密度７０％まで増殖させたＨｅｋ２９３細胞を含むＴ−２５フラスコにトランスフェクション混合物を滴加した。細胞をトランスフェクション混合物とともに３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした後、細胞に細胞培地（２％ＦＢＳを添加したグルタミン含有高グルコースＤＭＥＭ）４ｍｌを加え、フラスコを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
トランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞を２４時間毎にモニターし、４８〜７２時間毎に追加の培地を添加した。細胞単層における有意な細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察することにより、ウイルスの産生をモニターした。ＣＰＥが観察されたら、凍結融解を３サイクル実施することにより、Ｈｅｋ２９３細胞からウイルスを回収した。回収したＮＧ−６２ウイルスを用いてＡＤ２９３細胞に感染させ、感染から２４時間および４８時間後、細胞単層における有意なＣＰＥが観察されたことにより生存ウイルスの産生が確認された（図３４Ａ）。このほか免疫蛍光撮像により、感染ＡＤ２９３細胞内でウイルスからＧＦＰ導入遺伝子が高い生産性で発現しているのが確認された（図３４Ｂ）。
参考文献
Ｓｈｅｎｋ，（２００１）“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，” ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋｎｉｐｅ，ｅａ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，ｐｐ．２２６５−２２６７．
Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ（２００４）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｄ５ ｇｅｎｏｍｅ ｔｈａｔ ｕｔｉｌｉｚｅ ｔｈｅ Ａｄ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｏｌ．１２（６）ｐｐ１０５２−６３．
Ｃｈｅｅｖｅｒ Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ ｐｒｉｏｒｉｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ：ａ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｐｉｌｏｔ ｐｒｏｊｅｃｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００９；１５：５３２３−５３３７．

Claims (30)

  1. 選択マーカー遺伝子と低コピー細菌複製起点とを含むシャトルベクターを調製する方法であって、前記アデノウイルスゲノムが、５’ＩＴＲと３’ＩＴＲとＬ５遺伝子とを含み、前記方法が、
    ａ）アデノウイルスシャトルベクターを調製する段階であって、以下の３つのフラグメント：
    ｉ）選択マーカー遺伝子と低コピー細菌複製起点とを含むベクターフラグメントであって、前記ベクターフラグメントの５’末端が、第一の制限酵素部位から始まり、第二の制限酵素部位内のベクターフラグメントの３’末端で終わる、ベクターフラグメント、
    ｉｉ）５’ＩＴＲを含む前記アデノウイルスゲノムの５’末端を含む５’アームであって、前記５’アームの５’末端が、第二の制限酵素部位から始まり、第三の制限酵素部位を有する前記５’アームの３’末端で終わる、５’アーム、
    ｉｉｉ）３’ＩＴＲとＬ５遺伝子とを含む前記アデノウイルスゲノムの３’末端を含む３’アームであって、前記３’アームの５’末端が、第三の制限酵素部位から始まり、第一の制限酵素部位を有する前記３’アームの３’末端で終わる、３’アーム
    を等しい割合でライゲートすることと、
    前記第一の制限酵素部位で前記３’アーム（フラグメントｉｉｉ）の３’末端と前記ベクターフラグメント（フラグメントｉ）の５’末端とを連結し、
    前記第二の制限酵素部位で前記ベクターフラグメント（フラグメントｉ）の３’末端と前記５’アーム（フラグメントｉｉ）の５’末端とを連結し、
    前記第三の制限酵素部位、少なくとも前記Ｌ５遺伝子で前記５’アーム（フラグメントｉｉ）の３’末端と前記３’アーム（フラグメントｉｉｉ）の５’末端とを連結する、
    １段階の３者ライゲーションを実施して、第一の制限酵素部位、次いでベクターフラグメント、次いで第二の制限酵素部位、次いで５’アーム、次いで第三の制限酵素部位、次いで３’アームの順で配置される環状シャトルベクターを形成することと
    を含む、段階ならびに
    ｂ）前記シャトルベクターの前記Ｌ５遺伝子と、Ｅ３部位、Ｅ４部位または前記部位の両方を含む（またはこれらからなる）群より選択される部位との間の位置に少なくとも１つの独自の制限部位および／または導入遺伝子を導入する段階を含む、
    方法。
  2. 前記５’アームが、アデノウイルスゲノムの約２．４〜４．７ｋｂの５’末端を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記３’アームが、アデノウイルスゲノムの約３．３〜４．８ｋｂの３’末端を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記３者ライゲーションを、フラグメントｉ）、ｉｉ）およびｉｉｉ）について１：１：１の比で実施する、請求項１または２に記載の方法。
  5. 前記１段階の３者ライゲーションを少なくとも５０分間実施する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記１段階の３者ライゲーションを、２０〜２５℃などの室温前後で実施する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記独自の制限部位が、ＮｏｔＩまたはＳｂｆＩとＳｇｆＩまたはＦｓｅＩとＮｏｔＩとＳｂｆＩとＳｇｆＩなどのように、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂｆＩおよびＳｇｆＩから独立して選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記第一の制限酵素部位と前記第二の制限酵素部位が同じものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記ベクターフラグメントを脱リン酸化する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記複製起点がｐ１５Ａである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記選択マーカー遺伝子がＫａｎＲである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記アデノウイルスゲノムが、複製可能なアデノウイルスに由来するものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 段階ａ）または段階ｂ）のシャトルベクターとアデノウイルスゲノムとの間で相同組換えを実施してプラスミドを形成する段階ｃ）をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  14. 段階ｃ）を３．５：１．５の比で実施する、請求項７に記載の方法。
  15. 段階ｃ）をエレクトロコンピテントＢＪ５１８３細胞で実施する、請求項６または７に記載の方法。
  16. 前記アデノウイルスゲノムが、ＥｎＡｄ１、ＯｖＡｄ１、ＯｖＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ５およびＡｄ１１から選択される、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
  17. アデノウイルス、例えば、複製可能なアデノウイルスまたは複製欠損アデノウイルスベクターを作製するさらなる段階を含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. アデノウイルスを医薬組成物として製剤化するさらなる段階を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法から得られる、シャトルベクター、プラスミド、アデノウイルスまたは医薬組成物。
  20. ａ）Ｌ５遺伝子、Ｅ３部位および／またはＥ４部位を含む、アデノウイルスゲノムと、
    ｂ）前記Ｌ５遺伝子と、前記Ｅ３部位、前記Ｅ４部位および前記Ｅ３部位と前記Ｅ４部位のそれぞれを含む（またはこれらからなる）群より選択される部位との間の位置にある、少なくとも１つの独自の制限部位と、
    ｃ）低コピー細菌複製起点と、
    ｄ）選択マーカー遺伝子と
    を含む、アデノウイルスプラスミド。
  21. 前記アデノウイルスゲノムが、サブグループＢアデノウイルスゲノム、例えばＥｎＡｄ、ＯｖＡｄ１、ＯｖＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ１１およびＡｄ５、例えばＥｎＡｄなどである、請求項１４に記載のアデノウイルスプラスミド。
  22. 前記独自の制限部位が、ＦｓｅＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂｆＩおよびＳｇｆＩから独立して選択される、請求項１８または１９に記載のアデノウイルスプラスミド。
  23. 前記独自の制限部位が、前記Ｌ５遺伝子と前記Ｅ３部位との間の位置にあり、例えば、前記独自の制限部位がＮｏｔＩである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のアデノウイルスプラスミド。
  24. 前記Ｌ５遺伝子と前記Ｅ４部位との間の位置に少なくとも２つの独自の制限部位が存在し、例えば、前記２つの独自の制限部位がＳｂｆＩとＳｇｆＩである、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のアデノウイルスプラスミド。
  25. 前記Ｌ５遺伝子と前記Ｅ４部位との間の位置に３つの独自の制限部位が存在する、請求項２２に記載のアデノウイルスプラスミド。
  26. 前記３つの独自の制限部位が、ＳｂｆＩ、ＳｇｆＩおよびＦｓｅＩのそれぞれ１つずつである、請求項２３に記載のアデノウイルスプラスミド。
  27. 少なくとも１つの独自のＥ１制限部位をさらに含む、請求項１８〜２６のいずれか１項に記載のアデノウイルスプラスミド。
  28. 導入遺伝子カセットをさらに含む、例えば、特に治療用のタンパク質、ペプチドまたはＲＮＡ、例えば抗体または抗体ドメイン、プロドラッグ変換酵素、免疫調節物質、酵素、ｓｉＲＮＡ、転写因子、細胞内シグナル伝達タンパク質または表面膜タンパク質または抗原などをコードする、目的の治療遺伝子；およびレポーター遺伝子または造影物質、例えばルシフェラーゼまたはｅＧＦＰなどから独立して選択される、１つまたは複数の導入遺伝子を含む、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載のアデノウイルスプラスミド。
  29. 治療における、アデノウイルスまたは請求項２９に記載のアデノウイルスを含む医薬組成物。
  30. 治療有効量の請求項２９に記載のアデノウイルスまたは医薬組成物を投与すること含む、患者の治療方法。
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