JP2010514418A - 腫瘍退縮アデノウイルスの作出およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書に記載される発明は、固形腫瘍の処置における使用のための、増大した効力/増大した治療指数を有する腫瘍退縮アデノウイルスを作出するための方法に関する。
臨床的に有効な腫瘍退縮剤の選択の成功は、正確に標的腫瘍のモデルとなる一方で実験室において日常的に再生可能な細胞または組織の使用に依存している。近年の研究によって、細胞外マトリックス ナノフィブリルの3次元の結合(association)およびそれらが誘導する細胞構造(cellular architecture)が、正常細胞および形質転換された(transformed)細胞の両方の培養における細胞接着、細胞骨格の形成、シグナル伝達および遺伝子発現、形態形成ならびに分化の生理学的パターンを十分に模倣するインビトロ系の発展にとって重大な意味を持つという証拠が提供された。遺伝子発現プロファイリング(GEP)、プロテオミクスおよび細胞機能の分析を含む多くの分析方法によって、単層培養よりも 3D 培養が一般的に良い腫瘍モデルであることが明らかにされている(Birgersdotter et al. (2005) Semin Cancer Bio. 15:405-412; Nelson and Bissell (2005) Semin Cancer Biol 15:342-352)。
本発明は、固形のまたは血液の腫瘍のウイルスに基づく治療に有用な腫瘍退縮アデノウイルスを単離するための方法を提供し、ここで、単離されたアデノウイルスは基準となる1または複数のウイルスと比較して増強された効力を示す。
(a) アデノウイルスの群をプールすること、ここで、該アデノウイルスはアデノウイルス血清型 B、C、D、E および F からなる群から選択される;
(b) 工程(a)からのプールされたアデノウイルス混合物を、活発に増殖する腫瘍細胞の培養物上で継代すること;
(c) 工程(b)からの上清を回収すること;
(d) 静止状態の腫瘍細胞の培養物に、工程(c)で回収した上清を感染させること;
(e) 工程(d)からの細胞培養上清を、CPE の徴候の前に回収すること;
(f) 静止状態の腫瘍細胞の培養物に、工程(e)で回収した上清を感染させること;
(g) 工程(f)からの細胞培養上清を、CPE の徴候の前に回収すること; および
(h) ウイルスを、工程(g)の上清からプラーク精製によって単離すること、
ここで、工程(b)、(d)および(f)における腫瘍細胞は全て細胞外マトリックスの上または中で増殖する。
本明細書において言及される、特許および特許出願を含む全ての刊行物は、各個々の刊行物が引用によりその全体が包含されるよう具体的にかつ個別に意図されるのと同程度に、引用により本明細書に包含される。
他に定義しない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明の属する分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。通常、本明細書において用いられる命名法および以下で説明される実験手法は、当該技術分野において周知かつ一般的に採用されるものである。
1) アラニン(A)、グリシン(G);
2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4) アルギニン(R)、リジン(K);
5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7) セリン(S)、スレオニン(T); および
8) システイン(C)、メチオニン(M)
本発明は、これらに限定されないが、結腸、卵巣、肺、前立腺、乳房および膵臓を含む腫瘍タイプ由来の腫瘍細胞に対して増強された効力および/または増大した選択性を示す腫瘍退縮アデノウイルスの単離のための、アデノウイルス血清型の生物多様性を利用する新規な方法を提供する。
本発明の腫瘍退縮アデノウイルスは、所望の特性、例えば増強された効力または細胞型特異性を有するアデノウイルスを単離するために、突然変異誘発、血清型生物多様性およびストリンジェントな選択条件をユニークに組み合わせる方法である方向性進化(directed evolution)によって作出される。特定の組織を標的とするアデノウイルスのための方向性進化は、選択した組織由来の腫瘍細胞を用いて実施され得る。方向性進化の工程において有用な好ましい腫瘍細胞株は、これらに限定されないが、乳房、結腸、膵臓、肺、前立腺および卵巣由来の腫瘍細胞株を含む。アデノウイルス混合物の“方向性進化”継代に有用な固形腫瘍細胞株の例は、これらに限定されないが、(それぞれ乳房、結腸または膵臓由来の腫瘍を標的とするための) MDA231、HT29 および PC-3 細胞を含む。卵巣組織において増強された効力を示すアデノウイルスの方向性進化に特に好ましいものは、これらに限定されないが、腫瘍細胞株 SKOV3、OVCAR3 および CaOV3 を含む。好ましい態様において、SKOV3 腫瘍細胞は、化学療法に耐性となった卵巣腫瘍において有効性を示す腫瘍退縮アデノウイルスの選択のために用いられる。ATCC などの供給源を通して入手可能な、興味のある標的組織の代表であるあらゆる他の腫瘍細胞株を、本発明のアデノウイルスを単離する際に用いることができる。
本発明は、他の治療上有用な腫瘍退縮アデノウイルスを提供するよう改変された本発明の腫瘍退縮アデノウイルスをも包含する。改変は、これらに限定されないが、以下に記載されるものを含む。
本発明の腫瘍退縮アデノウイルスまたはその変異体もしくは誘導体は、治療標的として興味のある組織由来の腫瘍細胞におけるその溶解能力の試験によって、その治療上の有用性について評価することができる。本発明のアデノウイルスを試験するのに有用な腫瘍細胞株は、以下に限定されるものではないが、これらに限定されないが、DLD-1、HCT116、HT29、LS1034 および SW48 細胞株を含む結腸細胞株; これらに限定されないが、DU145 および PC-3 細胞株を含む前立腺細胞株; これらに限定されないが、Panc-1 細胞株を含む膵臓細胞株; これらに限定されないが、MDA231 細胞株を含む乳房腫瘍細胞株; および、これらに限定されないが、OVCAR-3、CaOV3、BG1、ES-2 および IGROV および SKOV3 細胞株を含む卵巣細胞株を含む。American Type Culture Collection などの供給源を通して入手可能な、興味のある組織標的の代表であるあらゆる他の腫瘍細胞株が、その組織の型の腫瘍の処置における使用に関して本発明のアデノウイルスを同定および評価するのに用いられ得る。あるいは、本発明の腫瘍退縮アデノウイルスの評価は、対応する(matched)ヒト原発性腫瘍および正常な外植片を用いて、例えばウイルス放出(burst)の定量化(米国特許出願第11/136,912号)またはレポーター遺伝子の発現(Lam et al. (2003) Cancer Gene Therapy 10:377-387; Grill et al. (2003) MoI. Therapy 6:609-614)を通して、実施することもできる。実施例 8 を参照されたい。
本発明は、本発明の腫瘍退縮アデノウイルスの腫瘍細胞増殖の阻害のための使用、およびこれらのアデノウイルスに由来するアデノウイルスベクターの、腫瘍の処置において有用な治療タンパク質を送達するための使用を提供する。
本発明はまた、その変異体および誘導体を含む本発明のキメラ/腫瘍退縮アデノウイルスを含む、患者への治療的投与のために製剤された医薬組成物にも関する。治療上の使用に関しては、薬理学的有効量のアデノウイルスを含有する無菌の組成物が、処置、例えば腫瘍状態の処置のために、ヒト患者または獣医学的非ヒト患者に対して投与される。一般的に、組成物は、水性懸濁液において約 1011 以上のアデノウイルス粒子を含む。医薬上許容される担体または賦形剤が、かかる無菌の組成物においてしばしば採用される。様々な水溶液、例えば水、緩衝化した水、0.4% 生理食塩水、0.3% グリシンなどが用いられ得る。これらの溶液は無菌であり、通常は所望のアデノウイルスベクター以外の粒子状物質を含まない。組成物は、生理学的状態に近づける要求に応じて、医薬上許容される補助物質、例えば pH 調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含み得る。アデノウイルスによる細胞の感染を増強する賦形剤が包含され得る(米国特許第6,392,069号を参照)。
本発明のアデノウイルスまたはその医薬組成物は、腫瘍疾患または癌の治療的処置のために投与され得る。治療適用において、組成物は、既に特定の腫瘍疾患に罹患している患者に対して、症状およびその合併症を治癒しまたは少なくとも部分的に抑止するのに十分な量で投与される。これを達成するための適切な量は、“治療上有効量”または“有効量(efficacious dose)”として定義される。この使用について有効な量は、症状の重さ、患者の全身状態(general state)および投与経路に依存する。
本発明はさらに、前述した本発明の組成物の1以上の成分で充填された1以上の容器を含む医薬パックおよびキットに関する。かかる容器には、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって指示された形式での通知が付属していてもよく、それはヒト投与のための製品の製造、使用または販売の該機関による認可を反映する。
方法
標準的な技術が、組換え核酸方法、ポリヌクレオチド合成、ならびに微生物の培養および形質転換のために用いられる(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション)。一般的に、酵素反応および精製工程が、製造者の仕様書にしたがって実施される。技術および手順は一般的に、当該技術分野における常套の方法および本明細書を通して提供される様々な一般的参考文献(一般的には、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. を参照)にしたがって実施される。本明細書において用いられる命名法、および、分析化学、有機合成化学および医薬の製剤および送達ならびに患者の処置における実験手法。アデノウイルス変異体の作成方法は一般的に、当該技術分野において公知である。Mittal, S. K. Virus Res.,1993, vol: 28, pages 67-90; and Hermiston, T. et al., Methods in Molecular Medicine: Adenovirus Methods and Protocols, W.S.M. Wold, ed., Humana Press, 1999 を参照されたい。アデノウイルス 5 のゲノムは Genbank 10 受入 #M73260 として登録されており、該ウイルスは American Type Culture Collection、Rockville、Maryland、U.S.A. から受入番号VR-5の下に入手可能である。
用いられる ヒト Ad 血清型 Ad3 (GB 株)、Ad4 (RI-67 株)、Ad5 (アデノイド 75 株)、Ad9 (Hicks 株)、Ad16 (Ch.79 株); および SKOV3、OVCAR3、CaOV3、IGROV、BG1、ES-2、PC-3、および HT-29 細胞株は、すべて ATCC から購入した。キメラ アデノウイルス ColoAd1 は、米国特許出願第11/136,912号に記載されている。Ad35、Ad11p(Slobitski 株)および Ad40 は、St. Louis University の Dr. William S.M. Wold から寄贈された。用いられる他の細胞は、MDA-231mt1 (Dr. Deb Zajchowski、Berlex Laboratories によって、急速に増殖する、皮下に植え込まれた MDA-231 細胞の異種移植片から単離された細胞株誘導体) および Panc1-sct (Dr. Sandra Biroc、Berlex Laboratories によって、急速に増殖する、皮下に植え込まれた Panc1 細胞の異種移植片から得られた)、HUVEC (Vec Technologies、Rensselaer、NY)、および SAEC (Clonetics、Walkersville、MD)であった。
ウイルスのストックを、293 細胞または SKOV3 細胞いずれかの上で増殖させ、CsCl 勾配上で精製し、分光測定によって(Tollefson, A., Hermiston, T.W., and Wold, W.S.M.; “Preparation and Titration of CsCl-banded Adenovirus Stock”in Adenovirus Methods and Protocols, Humana Press, 1999, pp 1-10, W.S.M. Wold, Ed) および陰イオン交換(AIEX)クロマトグラフィーによって(Kuhn et al. (2006) Gene Therapy)、力価決定した(1mlあたりのウイルス粒子 vp/ml は、本報告を通して用いられる単位である)。ほとんどの Ad 血清型は、用いられる AIEX 方法によって分析された場合、別々の、特徴的な保持特性を有し、ウイルス精製は AIEX によって正確な力価を決定するために必要ではなく、記載された通り粗溶解液の正確な定量化を可能にする(前記)。それ故、純粋なウイルス ストックの分光学的力価を検証するため、粗ウイルス溶解液の力価を決定するため、および全てのウイルス ストックの血清型-関連性を部分的に特徴付けするために、AIEX クロマトグラフィーを用いた。
サブグループ Ad B-F を代表するウイルス血清型、すなわち Ad3、Ad4、Ad5、Ad9、Ad11p、Ad16、Ad35、Ad40、およびキメラ ウイルス ColoAd1 (米国特許出願第11/136,912号) を、出発ウイルス プール中に集合させた。各ウイルス型の 1012 のウイルス粒子を含有する出発プールの一部を、亜硝酸によるランダムな突然変異誘発に供した (Williams et al. (1971) J Gen Virol 11 :95-101; Klessig、 D.F. (1977) J. Virol. 21:1243-1246)。2.5-3 対数の死(2.5-3 logs of kill)の後、亜硝酸の中和によって反応を停止させた。パラレルな(parallel) Ad5 の突然変異誘発されたストックからの 10 のウイルス単離株の各々から、19 K タンパク質の 356 bp の領域を増幅し、配列決定した。配列決定によって、10のうち1の単離株が点突然変異を保有していることが示された。この結果からの外挿によって、ウイルス ゲノムあたり平均しておよそ 10 の突然変異が導入されたことが示される。突然変異誘発されたウイルス血清型のプールを、突然変異誘発プールと称した。次いで、各ウイルス型の 109 のウイルス粒子を含有する出発プールの別の部分を突然変異誘発プールに添加し、各ウイルス型のほぼ等しい数の突然変異誘発および非突然変異誘発ウイルス粒子を含有する結合プールを得た。この結合プールを、感染効率(MOI)=10 で、SKOV3、HT-29 および OVCAR3 細胞のサブコンフルエントな単層を感染させるために用いた。これらの感染条件は、結合(突然変異誘発および非突然変異誘発)ウイルス プール中に存在する全てのウイルス型の間に組換えを起こすために選択された。感染後 24 および 48 時間 (24 および 48 hpi)において、これらの感染した培養物からウイルス溶解液を回収し、次いで共に混合して“再結合プール”を作成した。その後、結合プールの新鮮な一定量をこの再結合プールに添加して、方向性進化のために用いられるウイルス プールを生成した。このプールの力価を、上記の通り、陰イオン交換クロマトグラフィーによって決定した。
個々のウイルスを、各々の選択されたプールから、標準的な方法を用いる SKOV3 細胞上での2巡のプラーク精製によって単離した(Tollefson, A., Hermiston, T.W., and Wold, W.S.M.; “Preparation and Titration of CsCl-banded Adenovirus Stock”in Adenovirus Methods and Protocols, Humana Press, 1999, pp 1-10, W.S.M. Wold, Ed)。手短に言えば、単層としてまたは MATRIGEL(商標)上で増殖させた SKOV3 細胞上での 10 回目の継代から回収された上清の希釈を、標準的なプラークアッセイにおいて SKOV3 細胞を感染させるために用いた。個々のプラークを回収し、これらの回収物から2巡目の個々のプラークを生成するために同一のプラークアッセイ方法を用いた。2巡目のプラーク精製からのプラークは純粋であると考えられ、これらの精製プラークを用いて A549 細胞の感染培養物を調製し、これらの培養物の溶解液の腫瘍退縮効力を、記載された通りに、MTS アッセイによって決定した。
ウイルスの溶解能力を、MTT アッセイの改変(Yan et al. (2003) J Virol 77:2640-2650)を用いて測定した。手短に言えば、MTS アッセイ(Promega, CellTiter 96(登録商標)Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay)を、MTT アッセイの代わりに用いた。なぜなら、細胞による MTS の水性の可溶性ホルマザンへの変換は、時間を減少させかつ MTT アッセイに付随する揮発性の有機溶媒の使用を排除するからである。
単離されたアデノウイルス OvAd1 (配列番号1) および OvAd2 (配列番号2)の配列決定を、以下のように達成した。剪断された精製鋳型 DNA を用いてショットガンライブラリーを調製した。剪断された DNA を、pUC18 ベクターへの挿入の前に 2-4 kb の範囲にサイズ-選択した。ライブラリー構築を、Anderson et al. (1996) Anal. Biochem. 236:107-113 に記載されているダブル-アダプター方法によって行った。DNA サイクル配列決定は、SeqWright に対して提供されるプライマー(M13 フォワード プライマー、5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'(配列番号5); M13 リバース プライマー、5'-CAGGAAACAGCTATGAC (配列番号6))と併せて Big Dye Terminator v3.1 ケミストリーを用いて、PCR 産物について行った。配列描写(Sequence delineation)およびベースコール(base-calling)を、自動化蛍光 DNA シークエンサー、ABI モデル 373Oxl を用いて行った。最終コンティグ組立て(assembly)を含むすべてのデータを、Phred20 点数化基準(scoring criteria)を用いて評価した。配列の組立て(assembly)および編集を、Sequencher 4.5 Software(GeneCodes、Inc.)を用いて行った。配列情報を、Vector NTI プログラム(Informatix)を用いて解析した。
腫瘍量(tumor burden)を軽減する際における OvAd1 および OvAd2 の有効性を、Ad5、Onyx-015、OvAd1、OvAd2、ColoAd1 および PBS の抗癌有効性を比較する SKOV3 腹腔内腫瘍量の研究において示した。該研究は、MF1 ヌードマウス(最初の実行においては群あたり 5 頭; 反復実験においては群あたり 7 頭)を用いて行った。0 日において、SKOV3 細胞を、マウスあたり 5x10e6 細胞で各マウスの腹膜腔内に投与した。3、5、および 7 日において、0.5 ml PBS 中で、ウイルスを 5x10e10 ウイルス粒子で腹腔内に投与するかまたは媒体を投与した。いかなるベクターの投与後にも、急性毒性の兆候(呼吸困難、背を丸める(hunch)、死、星状の被毛(starry coat))は観察されなかった。Ad5 または ONYX-015 ウイルスのいずれかで処理されたマウスにおいて、広範な腹膜器官接着が観察された。これらの接着は致死的であり得る。Ad5-に基づくものでないウイルス(OvAd1、OvAd2、ColoAd1、または Ad11p)はいずれも、いかなる接着の兆候も示さなかった。最後のベクター投与の後1時間、血液サンプルを採取した; 血流中にベクターは検出されず、この事はこれらのウイルスの腹膜漏出がないことを示す。18 日後(対照マウスにおける腫瘍量が過剰になった日)において、全てのマウスを安楽死させ、腫瘍量を測定した。このモデルにおいては、腫瘍量を減少させるのに OvAd1 ウイルスが最も有効であり、有効性において OvAd2 および親のウイルス ColoAd1 および Ad11p がこれに続いた。Ad5 は、腫瘍量を減少させるのに有効であったが、広範な接着をも引き起こした。Onyx-015 は、効果がなかった。(図 6A および 6B を参照されたい)。
手術の間に取り除かれた卵巣の腹水腫瘍細胞サンプルを培地中に置き、等しい数の OvAd1、OvAd2、ColoAd1、Ad3 または Onyx-015 アデノウイルス粒子で感染させた。5 日後に、(細胞溶解アッセイの項において記載される) MTS アッセイを用いて、細胞生存度を測定する。
卵巣腫瘍および対応する正常組織サンプルを手術中に取り除き、別々に培養し、等しい数の OvAd1、OvAd2、Ad5、または Onyx-015 アデノウイルス粒子で感染させる。2-6 日後に、培養上清および細胞を回収し、各サンプルから DNA を精製し、各サンプルにおいてゲノム特異的プローブを用いる Taqman アッセイによって ウイルス ゲノムの数を測定する。
Claims (20)
- 結腸、卵巣、肺、前立腺、乳房または膵臓由来の腫瘍細胞に対して、基準のウイルスと比較して増強された効力を有する腫瘍退縮アデノウイルスを単離する方法であって、以下を含む方法:
(a) アデノウイルスの群をプールすること、ここで、該アデノウイルスはアデノウイルス血清型 B、C、D、E および F からなる群から選択される;
(b) 工程(a)からのプールされたアデノウイルス混合物を、活発に増殖する腫瘍細胞の培養物上で継代すること;
(c) 工程(b)からの上清を回収すること;
(d) 静止状態の腫瘍細胞の培養物に、工程(c)で回収した上清を感染させること;
(e) 工程(d)からの細胞培養上清を、CPE の徴候の前に回収すること;
(f) 静止状態の腫瘍細胞の培養物に、工程(e)で回収した上清を感染させること;
(g) 工程(f)からの細胞培養上清を、CPE の徴候の前に回収すること; および
(h) ウイルスを、工程(g)の上清からプラーク精製によって単離すること、
ここで、工程(b)、(d) および (f) における腫瘍細胞は全て細胞外マトリックスの上または中で増殖する。 - 工程(a)のプールされたアデノウイルス混合物の一部が、継代の前に突然変異誘発される、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)が、工程(c)における回収の前に2回実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記アデノウイルスの群が、ColoAd1 (配列番号3) をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 細胞増殖のために用いられる細胞外マトリックスが、コラーゲンまたは再構成された基底膜(MATRIGEL(商標))である、請求項1に記載の方法。
- 細胞外マトリックスが、MATRIGEL(商標)である、請求項5に記載の方法。
- 請求項6に記載の方法によって単離される、腫瘍退縮アデノウイルス。
- 前記アデノウイルスのヌクレオチド配列が、配列番号1 を含む、請求項7に記載のアデノウイルス。
- 前記アデノウイルスのヌクレオチド配列が、配列番号2 を含む、請求項8に記載のアデノウイルス。
- 請求項7に記載の腫瘍退縮アデノウイルスの保存的に改変された変異体であって、卵巣腫瘍細胞について、もとの腫瘍退縮アデノウイルスと比較して効力が等しいか、より大きな効力を示すか、または増強された治療指数を示す、変異体。
- E1、E2 または E4 からなる群から選択されるアデノウイルスの複製に関与するタンパク質をコードする1以上のアデノウイルスの領域もしくはその部分の欠失を通して、複製欠損性を与えられている、請求項7に記載のアデノウイルス。
- E3 領域またはその部分の除去によって改変される、請求項7または11に記載のアデノウイルス。
- デルタ 24 領域の除去によって改変される、請求項7または11に記載のアデノウイルス。
- 異種性遺伝子をさらに含む請求項7に記載のアデノウイルスであって、前記異種性遺伝子が前記アデノウイルスに感染した細胞の中で発現する、アデノウイルス。
- 前記異種性遺伝子が、チミジンキナーゼである、請求項14に記載のアデノウイルス。
- 前記異種性遺伝子が、サイトカインおよびケモカイン、抗体、細胞死を誘導することが知られている因子、プロドラッグ変換酵素ならびに免疫調節タンパク質からなる群から選択される治療タンパク質をコードする、請求項14に記載のアデノウイルス。
- 癌細胞の増殖を阻害する方法であって、請求項1に記載の方法によって単離されるアデノウイルスを前記癌細胞に感染させることを含む、方法。
- 前記癌細胞が、卵巣癌細胞である、請求項17に記載の方法。
- 前記癌細胞が、薬剤耐性の卵巣癌細胞である、請求項18に記載の方法。
- 前記アデノウイルスのヌクレオチド配列が、配列番号1 または配列番号2 である、請求項17または18に記載の方法。
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