JP2017500870A - ウイルスベクター産生系 - Google Patents

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Abstract

本発明は、関心のあるヌクレオチドに機能的に連結された結合部位を含む核酸配列であって、関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制されるように該結合部位がＲＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる、核酸配列に関する。
【選択図】図４

Description

本発明はウイルスベクターの製造に関する。より詳細には、本発明は、ウイルスベクター産生細胞における、ウイルスベクターによりコードされる関心のあるヌクレオチドの翻訳の修飾に関する。
遺伝子治療は、疾患を治療するために遺伝物質を使用することを広く含む。それは、欠損遺伝子（例えば、突然変異を含有するもの）を有する細胞における、それらの遺伝子の機能的コピーでの補充、不適切に機能する遺伝子の不活性化、および新たな治療用遺伝子の導入を含む。
治療用遺伝物質は、核酸の導入を可能にするベクターを使用して、宿主の標的細胞内に取り込まれうる。そのようなベクターは一般にウイルスおよび非ウイルスの範疇に分類されうる。
ウイルスは、その複製周期の一部として、その遺伝物質を宿主の標的細胞内に自然に導入する。操作されたウイルスベクターは、関心のあるヌクレオチド（ＮＯＩ）を標的細胞へ送達することを可能にするために、この能力を利用する。現在のところ、多数のウイルスが遺伝子治療用のベクターとして操作されている。これらには、レトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびワクシニアウイルスが含まれる。
関心のあるヌクレオチドを保持させるための修飾に加えて、ウイルスベクターは、典型的には、複製欠損型となるように更に操作される。したがって、組換えベクターは標的細胞に直接感染しうるが、感染性ビリオンの後代を産生し得ない。他のタイプのウイルスベクターは癌細胞内のみで条件的に複製可能であり、更に毒性トランスジーン（毒性導入遺伝子）またはプロ酵素をコードしうる。
レトロウイルスベクターは種々の遺伝障害に対する療法として開発されており、臨床試験における益々増大する有望さを現在示している（例えば、Ｇａｌｙ，Ａ．およびＡ．Ｊ．Ｔｈｒａｓｈｅｒ（２０１０）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１（６）：５４５−５５０；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｂ．Ｌ．Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．Ｋａｌｏｓ，Ａ．ＢａｇｇおよびＣ．Ｈ．Ｊｕｎｅ（２０１１）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６５（８）：７２５−７３３；Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ，Ｐ．Ａ．（２０１２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９（２）：１２１−１２６；Ｃａｒｔｉｅｒ，Ｎ．，Ｓ．Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａ，Ｃ．Ｃ．Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａｅ，Ｐ．Ｂｏｕｇｎｅｒｅｓ，Ｍ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．Ｖ．Ｋａｌｌｅ，Ａ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｃａｖａｚｚａｎａ−ＣａｌｖｏおよびＰ．Ａｕｂｏｕｒｇ（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ５０７：１８７−１９８；Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，Ｉ．Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｆ．Ｂｏｕｌａｄ，Ｓ．Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｐ．Ｇｉａｒｄｉｎａ，Ａ．Ｍａｇｇｉｏ，Ｒ．Ｇａｌａｎｅｌｌｏ，Ｆ．ＬｏｃａｔｅｌｌｉおよびＥ．Ｙａｎｎａｋｉ（２０１０）Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １２０２：５２−５８；ＤｉＧｉｕｓｔｏ，Ｄ．Ｌ．，Ａ．Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｌ．Ｌｉ，Ｈ．Ｌｉ，Ｓ．Ｌｉ，Ａ．Ｒａｏ，Ｓ．Ｍｉ，Ｐ．Ｙａｍ，Ｓ．Ｓｔｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｋａｌｏｓ，Ｊ．Ａｌｖａｒｎａｓ，Ｓ．Ｆ．Ｌａｃｅｙ，Ｊ．Ｋ．Ｙｅｅ，Ｍ．Ｌｉ，Ｌ．Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ｄ．Ｈｓｕ，Ｓ．Ｊ．Ｆｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｊ．ＲｏｓｓｉおよびＪ．Ａ．Ｚａｉａ（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２（３６）：３６ｒａ４３ならびにＳｅｇｕｒａ ＭＭ，Ｍ．Ｍ．，Ｇａｉｌｌｅｔ Ｂ，Ｇａｒｎｉｅｒ Ａ．（２０１３）Ｅｘｐｅｒｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｙ）。
そのようなベクターの重要な例には、ガンマ−レトロウイルスベクター系（ＭＭＬＶに基づくもの）、霊長類レンチウイルスベクター系（ＨＩＶ−１に基づくもの）および非霊長類レンチウイルスベクター系（ＥＩＡＶに基づくもの）が含まれる。
逆遺伝学は、ウイルスに基づくこれらのベクターが高度に操作されることを可能にしており、その結果、適当なＤＮＡ配列での哺乳類細胞のトランスフェクションにより、大きな異種配列（約１０ｋｂ）をコードするベクターの製造が可能となっている（Ｂａｎｎｅｒｔ，Ｋ．（２０１０）Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：３４７−３７０に概説されている）。
研究段階でのレトロウイルスベクターの操作および使用は、典型的には、例えばＧＦＰまたはｌａｃＺをコードするレポーター−遺伝子ベクターの製造を含む。これらの臨床的に無関係なベクターの力価は、通常、粗回収物１ｍＬ当たり１×１０６〜１×１０７ 導入単位（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｕｎｉｔ）（ＴＵ／ｍＬ）の範囲である。更に、この物質の濃縮および精製は１×１０１０ ＴＵ／ｍＬを超える実施用ストックを与えうる。しかし、治療的に重要なＮＯＩをコードするベクターの製造は、これらのレポーターベクターと比較して実質的に低い力価を与えることが多い。
この結果を潜在的にもたらす幾つかの要因が存在する。
１．治療用ゲノムのサイズ。非常に大きなゲノムがレトロウイルスによりパッケージングされうるが、逆転写および／または組込み段階はサイズの増加と共に低効率になると考えられる。
２．ベクターゲノムＲＮＡの安定性。これはＮＯＩにおける予測されない不安定性要素の存在により低減されうる。
３．ベクターゲノムＲＮＡ内の最適ではないヌクレオチド使用。野生型ウイルスゲノムは、しばしば、あるヌクレオチド偏向を有する（例えば、ＨＩＶはＡＴに富む）。ベクターゲノムはそれほどＡＴには富まない傾向にあり、このことはパッケージングおよび／または成熟後段階に影響を及ぼしうる。
４．ウイルス産生細胞におけるＮＯＩの発現。（過剰）発現タンパク質はベクタービリオン構築および／または感染性に間接的または直接的な影響を及ぼしうる。
本発明者らは、ウイルスベクター産生細胞内のＮＯＩによりコードされるタンパク質の発現が治療用ベクター力価に悪影響を及ぼしうることを実験的に示した（図３ｉおよび３ｉｉを参照されたい）。
ＮＯＩによりコードされるタンパク質（関心のあるタンパク質；ＰＯＩ）の、ベクタービリオン内への取り込みもベクター粒子の下流プロセシングに影響を及ぼしうる。例えば、膜貫通ＰＯＩをコードするＮＯＩはウイルスベクタービリオン内の膜貫通タンパク質の高い表面発現を招いて、ビリオンの物理的特性を潜在的に改変しうる。更に、この取り込みは送達部位における患者の免疫系にＰＯＩを提示する可能性があり、これはインビボの治療用遺伝子の導入および／または長期発現に負の影響を及ぼしうる。ＮＯＩは、産生、精製、回収および免疫原性に影響を及ぼしうる望ましくない二次タンパク質または代謝産物の産生をも誘導する可能性があり、したがって、これを最小にすることが望ましい。
標的細胞におけるＮＯＩの有効な発現を維持する一方でウイルスベクター産生細胞におけるＮＯＩの発現を抑制可能にすることが明らかに必要とされている。どのようなメカニズムが用いられるにせよ、ウイルスベクター粒子の構築およびそれによる機能性の「天然」経路が妨げられる必要がある。これは容易なことではない。なぜなら、ビリオン内にパッケージングされるウイルスベクターゲノム分子はＮＯＩ発現カセットを必然的にコードする必要があるからである。換言すれば、ベクターゲノム分子およびＮＯＩ発現カセットは機能的に連結されているため、ＮＯＩ発現カセットの修飾は、細胞内でベクターゲノム分子を産生する能力に悪影響を及ぼしうる。ＮＯＩ発現カセットを抑制するために物理的転写遮断（例えば、ＴｅｔＲレプレッサー系）を用いた場合には、立体障害によりベクターゲノム分子の産生も抑制される可能性がある。また、制御メカニズムの修飾もビリオン成熟および放出後のベクターゲノム分子の機能性（すなわち、標的細胞の導入の指令に関するもの）に悪影響を及ぼすものであってはならない。例えば、レトロウイルスベクターゲノムＲＮＡ分子は逆転写および組込みの過程を可能にするものでなければならず、ＮＯＩ発現カセットに対するいずれの修飾も導入過程におけるこれらの段階を妨げるものであってはならない。
ウイルスベクター産生細胞内のＮＯＩ発現の抑制は更なる利点を示しうる。ＮＯＩ発現がベクター産生細胞の生存性の低減を招く場合、その抑制は、大きな細胞数を要する大規模製造に有益となりうる。細胞死による細胞残渣の減少は粗ベクター回収物における不純度をも低減するであろう。ベクタープラットフォーム（すなわち、同じベクター系内でコードされる種々の治療用遺伝子）のプロセシング（加工）、精製および濃縮は標準化可能であろう。すなわち、ウイルスベクター産生細胞内で発現される唯一の異種遺伝子が、ベクター産生に要求されるものであれば、下流プロセシングは、治療用ベクターのプラットフォーム全体のために、より容易に最適化されて、ベクター調製物の非常に類似した物理的仕様をもたらしうるであろう。インビボでの産生ベクターに対する免疫応答の変動性および該ベクターの毒性は最小化可能であり、このことは、標的細胞における、より持続的な治療用ＮＯＩ発現をもたらしうる。
この問題に対して可能な解決策の一つは、産生細胞内でのＮＯＩの発現を限定する組織特異的プロモーターである。尤も、これらのプロモーターの漏出性（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）はトランスジーンタンパク質の不利なレベルを招きうるであろう。しかし、構成的プロモーターを使用して、標的細胞におけるＮＯＩの、より大きな及びより頑強な発現が達成されうる。実際、インビボにおける有効性のためには、そのような頑強な発現がに要求されうる。また、組織特異的プロモーターは、前臨床および臨床開発中に動物モデルからヒトへと治療用ベクター産物を追跡する場合、それほど予測可能ではないかもしれない。
発明の陳述
前記のとおり、ウイルスベクター産生細胞におけるウイルスベクター発現カセットによりコードされる関心のあるタンパク質（ＰＯＩ）の発現はウイルスベクター治療用物質の製造に幾つかの問題をもたらしうる。特に、そのような発現はウイルスベクターの力価の低減、ならびにウイルスベクター粒子内へのＮＯＩコード化タンパク質の望ましくない取り込み又は該タンパク質との結合を招きうる。
本発明者らは、真核細胞培養内で異種翻訳制御系を使用することで、ＮＯＩの翻訳を抑制し従ってＮＯＩによってコードされるタンパク質の発現を抑制または予防（阻止）することにより、この問題が克服されうることを、本発明において示した。本発明者らは、驚くべきことに、この系の使用が、パッケージング可能なベクターゲノム分子の産生もベクター粒子の活性も妨げず、標的細胞におけるＮＯＩの長期発現を妨げないことを、本発明において見出した。
１つの態様においては、本発明は、関心のあるヌクレオチドに機能的に連結された結合部位を含む核酸配列であって、関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または予防（阻止）されるように該結合部位がＲＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる、核酸配列を提供する。
好ましい実施形態においては、ＲＮＡ結合タンパク質はトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）、例えば細菌トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質である。
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列を含むウイルスベクターに関する。
本発明のもう１つの態様は、ウイルスベクターの産生に要求される成分をコードする核酸配列のセットを含むウイルスベクター産生系に関するものであり、ここで、ベクターゲノム配列は本発明の核酸配列を含む。
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列を含む本発明のウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築物に関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明のＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列を含む本発明のウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築物に関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明のＤＮＡ構築物の一部または全部ならびにＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質およびＥｎｖタンパク質またはそれらの機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物を含む本発明のウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築物のセットに関する。Ｒｅｖを発現するＤＮＡ構築物も該ウイルスベクター産生系において使用されうる。
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列、ウイルスベクター産生系またはＤＮＡ構築物の全部もしくは一部を含むウイルスベクター産生細胞に関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列、ウイルスベクター産生系またはＤＮＡ構築物の一部もしくは全部をウイルスベクター産生細胞内に導入し、ウイルスベクターの産生に適した条件下で、該産生細胞を培養することを含む、ウイルスベクターの製造方法に関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明のウイルスベクター産生系により、本発明のウイルスベクター産生細胞を使用して、または本発明の製造方法により製造されるウイルスベクターに関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明のウイルスベクターが導入された細胞に関する。
本発明のもう１つの態様は、医薬品における使用のための、本発明の核酸配列、ウイルスベクターまたは導入細胞に関する。
本発明のもう１つの態様は、医薬品における、本発明の核酸配列、ウイルスベクターまたは導入細胞の使用に関する。
本発明のもう１つの態様は、関心のあるヌクレオチドをそれを要する標的部位に送達するための医薬の製造のための、本発明の核酸配列、ウイルスベクターまたは細胞の使用に関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列、ウイルスベクターまたは導入細胞を、それを要する対象に投与することを含む治療方法に関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列、ウイルスベクターまたは導入細胞を、医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物に関する。
本発明のもう１つの態様は、核酸結合部位に機能的に連結されている場合に関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または予防されるように相互作用しうる核酸結合部位および／または核酸結合タンパク質を特定する方法に関するものであり、ここで、該方法は、レポーター遺伝子に機能的に連結された核酸結合部位および核酸結合タンパク質の両方を含む細胞におけるレポーター遺伝子の発現を分析することを含む。
発明の概括
治療用レトロウイルスベクターを高い又は更には中等度の力価で製造する際の重大な制約は、特にトランスジーン（導入遺伝子）が強力な構成的プロモーターにより駆動される場合の、産生細胞におけるトランスジーン／ＮＯＩによりコードされるタンパク質の不利な発現でありうる。あるトランスジーンタンパク質は、直接的および間接的の両方で、活性感染性ベクター粒子を産生する細胞の能力に様々な影響を及ぼしうる。細胞代謝、ウイルスベクター粒子構築および／または粒子活性はトランスジーン産物の個々の（既知または未知の）作用により影響されうる。産生細胞におけるトランスジーン発現をサイレンシングするための組織特異的プロモーターがこの問題の解決策として使用されているが、このアプローチの重大な欠点は、しばしば、組織特異的プロモーターからの遺伝子発現が構成的プロモーターからのものほどは頑強ではなく、ベクター開発中に利用される種々の動物モデルにおいて、より低い予測可能性またはより高い変動性を示しうることである。
本発明者らは、驚くべきことに、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、細菌ｔｒｐオペロン調節タンパク質、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質、ＴＲＡＰ）およびそれが結合するＲＮＡ標的の新規使用がＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクター産生細胞におけるトランスジーン翻訳を抑制または予防することを、本発明において見出した。ＴＲＡＰの場合、トランスジーン翻訳のこの低減または予防は、あるＮＯＩをコードするベクターに関するベクター力価の、１００倍もの改善をもたらしうる。この系はベクター産生細胞内トランスジーン抑制系（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍ）またはＴＲＩＰ系と称される。
本発明者らは、ＮＯＩ ｍＲＮＡの翻訳を抑制することにより真核細胞産生系におけるＲＮＡ（レトロウイルス）ベクター力価を増加させるための、細菌翻訳抑制系の使用を初めて実証するものである。ＲＮＡ結合タンパク質に対する結合部位（例えば、ＴＲＡＰ結合配列、ｔｂｓ）をＮＯＩ翻訳開始コドンの上流に配置することは、ベクターＲＮＡの産生または安定性に有害な影響を全く及ぼすことなく、内部発現カセットから誘導されるｍＲＮＡの翻訳の特異的抑制を可能にする。本発明者らはまた、レトロウイルスベクターの産生および機能がベクターゲノム内のｔｂｓの存在によって最低限度で影響されるらしいことを示している。これは、逆転写酵素（ＲＴ）がｔｂｓからＴＲＡＰを追い出しうること、またはビリオン内にパッケージングされる長いベクターゲノムＲＮＡのコンテキスト（ｃｏｎｔｅｘｔ）においてはＴＲＡＰがｔｂｓに効率的に結合しないことのいずれかを示唆している。本発明者らはまた、ＡＡＶのようなＤＮＡウイルスベクターのＮＯＩ発現カセット内に配置されるｔｂｓの類似配置が、活性ウイルスベクタービリオンの産生を維持する一方で、ＴＲＡＰによるＮＯＩ翻訳抑制を可能にすることを示している。
ＮＯＩの翻訳開始コドンとｔｂｓとの間のヌクレオチドの数は、好ましくは、ｍＲＮＡ翻訳の抑制の度合に影響を及ぼすことなく、０〜１２ヌクレオチドで変動可能である。いずれの理論によっても束縛されるものではないが、ｔｂｓ結合ＴＲＡＰは、４０Ｓスキャニングリボソーム複合体を、それが開始コドンに到達する前に物理的に遮断することにより（これが生じないならば、より安定でより高いアフィニティの翻訳装置が形成するであろう）、翻訳開始を抑制しうる。
また、本発明者らは、マルチシストロンｍＲＮＡにおけるＮＯＩの翻訳を抑制するために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の下流にｔｂｓが配置されうることを見出している。実際、これは、ｔｂｓ結合ＴＲＡＰが４０Ｓリボソームの通過を遮断しうること、すなわち、完全翻訳複合体が形成される前に、ＩＲＥＳ要素が、４０ＳリボソームサブユニットをｍＲＮＡへとＣＡＰ非依存的に隔離するように機能することの更なる証拠となる（ＩＲＥＳ翻訳開始に関する総説は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓ．（２０１２）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０（１１）：５５８−５６６を参照されたい）。ＮＯＩの開始コドンとＩＲＥＳとの間に配置されたｔｂｓ配列は非抑制翻訳レベルに若干の影響を及ぼしたが、ＴＲＡＰによって機能的に作用される能力を維持した。この知見は、ウイルスベクターゲノムから発現される単一ｍＲＮＡからの複数のオープンリーディングフレームをＴＲＩＰ系が抑制することが可能であることを示している。これは、複数の治療用遺伝子をコードするベクターを製造する場合、特に、トランスジーン産物の全てがベクター力価に或る程度の負の影響を及ぼしうる場合、ＴＲＩＰ系の有用な特徴であろう。
ｔｂｓ配列の更なる特徴づけは、ＲＮＡ結合タンパク質としてのＴＲＡＰに関して、好ましくは、少なくとも８個のＲＡＧＮＮ反復を含有するｔｂｓ配列でＴＲＩＰ系が最大限度に働くことを明らかにした。尤も、１つの実施形態においては、頑強なトランスジーン抑制を尚も得るために７個の反復（リピート）が使用可能であり、もう１つの実施形態においては、ベクター力価をレスキューしうるレベルまでのトランスジーンの十分な抑制を可能にするために６個の反復が使用可能である。ＴＲＡＰ媒介性抑制を維持するためにＲＡＧＮＮコンセンサス配列は改変されうるが、好ましくは、選択された厳密な配列は、非抑制状態の高レベルの翻訳を確保するために最適化されうる。例えば、ｔｂｓ配列は、スプライシング部位、不安定な配列またはステム−ループ［これは、ＴＲＡＰの非存在下（すなわち、標的細胞内）でｍＲＮＡの翻訳効率を阻害しうる］を除去することにより最適化されうる。与えられたｔｂｓのＲＡＧＮＮ反復の配置に関しては、ＲＡＧ反復間のＮ「スペーシング」ヌクレオチドの数は好ましくは２である。しかし、少なくとも２個のＲＡＧ反復間に２個を超えるＮスペーサーを含有するｔｂｓも許容される（インビトロ結合研究による判定によれば、３個のＮを含有する反復の５０％もが機能的ｔｂｓを与えうる；Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｙ．Ｊ．，Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１７）：５１５９−５１６３）。実際、本発明者らは、１１×ＲＡＧＮＮ ｔｂｓ配列がＲＡＧＮＮＮ反復での３個までの置換を許容し、ＴＲＡＰ結合と協同して何らかの潜在的に有用な翻訳遮断活性を尚も保有しうることを示している。
ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）オープンリーディングフレームは哺乳類（例えば、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））細胞における発現に関してコドンが最適化されうる。なぜなら、細菌遺伝子配列は哺乳類細胞における発現に非最適である可能性があるからである。該配列は、潜在的な不安定配列およびスプライシング部位を除去することによっても最適化されうる。ＴＲＡＰタンパク質上のＣ末端で発現されるＨＩＳ−タグの使用は翻訳抑制に関する利点をもたらすようであり、所望により使用されうる。このＣ末端ＨＩＳ−タグは真核細胞におけるＴＲＡＰの溶解性または安定性を改善しうるが、改善される機能的利点は排除され得ない。それでも、ＨＩＳタグ付きＴＲＡＰおよびタグ無しＴＲＡＰの両方がトランスジーン発現の頑強な抑制を可能にした。ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）転写単位内の或るシス作用性配列も最適化されうる。例えば、ＥＦ１ａプロモーター駆動性構築物は、一過性トランスフェクションの状況において、低い投入量のＴＲＡＰプラスミドで、ＣＭＶプロモーター駆動性構築物より良好な抑制を可能にする。
トランスジーン翻訳の抑制を最大にするためには、ＴＲＩＰ系内のＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）の頑強な発現が望ましい。高レベルのＲＮＡ結合タンパク質プラスミドを含むための要件は一過性ベクター産生系内の他のベクター産生構築物のトランスフェクションに悪影響を及ぼしうると予想されていた。これは、ゲノム構築物の量／比が典型的には追加的プラスミドの非存在下で最適化されるからであり、大量のＲＮＡ結合タンパク質コード化プラスミドをコトランスフェクトするための要件はこれらの最適比に悪影響を及ぼして、ベクター力価の低減を招きうるであろう。しかし、一過性トランスフェクションプロトコルを用いた場合、僅か１対１０のＴＲＡＰ対レトロウイルスベクターゲノムプラスミドの比が、最高に近いレベルのトランスジーン抑制を可能にすることが示された。更に、１対５ものＴＲＡＰ対レトロウイルスベクターゲノムプラスミドの比を用いた場合、問題の無いＮＯＩを発現するベクターが、最高に近い力価で産生された。したがって、レトロウイルスベクター産生構築物の一過性トランスフェクション中のこれらの比較的低い投入量でのＴＲＡＰ発現プラスミドの添加は、そのような構築物の予め最適化された比に悪影響を及ぼす可能性が低い。ＴＲＡＰ発現プラスミド対ＤＮＡウイルスベクター成分プラスミド（例えばＡＡＶ）の比も最適化されている。
これらの重要な知見は、一過性トランスフェクションベクター産生プロトコル中にＴＲＩＰ系が使用されうることを示している。ＴＲＩＰ系は安定産生系にも使用可能であり、したがってウイルスベクター製造に広範に適用可能である。
発明の詳細な説明
次に、非限定的な例により、本発明の種々の好ましい特徴および実施形態を記載する。
本発明の実施は、特に示されていない限り、当業者の能力の範囲内の化学、分子生物学、微生物学および免疫学の通常の技術を用いる。そのような技術は文献に説明されている。例えば、以下のものを参照されたい：Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５および定期的な補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．９，１３および１６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．ＣｒａｂｔｒｅｅおよびＡ．Ｋａｈｎ（１９９６）ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．ＰｏｌａｋおよびＪａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ（１９９０）Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＤ．Ｍ．Ｊ．ＬｉｌｌｅｙおよびＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。これらの一般的テキストのそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする。
１つの態様においては、本発明は、関心のあるヌクレオチドに機能的に連結された結合部位を含む核酸配列を提供し、ここで、関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または予防されるように、該結合部位はＲＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる。
「ＲＮＡ結合タンパク質」なる語は、核酸配列に結合しうるタンパク質として理解されるべきである。本発明の文脈においては、ＲＮＡ結合タンパク質のその結合部位配列への結合は、該結合部位が機能的に連結されている関心のあるヌクレオチドの翻訳をウイルスベクター産生細胞において抑制または予防する効果をもたらす。
好ましい実施形態においては、ＲＮＡ結合タンパク質はトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）、例えば細菌トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質である。
もう１つの実施形態においては、ＲＮＡ結合タンパク質は細菌保存炭素固定調節系タンパク質Ａ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｓｔｏｒａｇｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）（ＣｓｒＡ）である。
もう１つの実施形態においては、ＲＮＡ結合タンパク質は単純ヘルペスウイルス１ＲＮＡ結合タンパク質ＵＳ１１である。
トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）
トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）は、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において詳細に特徴づけられている細菌タンパク質である。それは、転写減衰または翻訳制御メカニズムのいずれかに関与することにより、ｔｒｐＥＤＣＦＢＡオペロンから指令されるトリプトファン生合成を調節する（Ｇｏｌｌｎｉｃｋ，Ｂ．，ＡｎｔｓｏｎおよびＹａｎｏｆｓｋｙ（２００５）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：４７−６８に概説されている）。
ＴＲＡＰは、その天然コンテキストにおいて、以下の３つの異なるメカニズムによりトリプトファンの生合成および輸送を調節する。
１．ｔｒｐＥＤＣＦＢＡオペロンの転写の減衰（Ｓｈｉｍｏｔｓｕ Ｈ，Ｋ．Ｍ．，Ｙａｎｏｆｓｋｙ Ｃ，Ｈｅｎｎｅｒ ＤＪ．（１９８６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６６：４６１−４７１）。
２．ｔｒｐＥおよびｔｒｐＤシャイン−ダルガルノ遮断性ヘアピンの形成の促進（Ｙａｋｈｎｉｎ Ｈ，Ｂ．Ｊ．，Ｙａｋｈｎｉｎ ＡＶ，Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３（２０）：５９１８−５９２６）。
３．ｔｒｐＧおよびｙｈａＧリボソーム結合部位へのリボソームの接近の遮断（Ｙａｎｇ Ｍ，ｄ．Ｓ．Ａ．，ｖａｎ Ｌｏｏｎ ＡＰＧＭ，Ｇｏｌｌｎｉｃｋ Ｐ．（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７：４２７２−４２７８）。
バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）においては、ＴＲＡＰは単一遺伝子（ｍｔｒＢ）によりコードされ、機能的タンパク質は、トロイド環として配置された１１個の同一サブユニットから構成される（Ａｎｔｓｏｎ ＡＡ，Ｄ．Ｅ．，Ｄｏｄｓｏｎ Ｇ，Ｇｒｅａｖｅｓ ＲＢ，Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｇｏｌｌｎｉｃｋ Ｐ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４０１（６７５０）：２３５−２４２）。それは、隣接サブユニット間のポケット内の１１個までのトリプトファン分子に結合することにより、ＲＮＡと相互作用するように活性化される。標的ＲＮＡはこの四元（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ）環構造の外側を包囲する（Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｈｉｒｅ ＳＪ，Ｙａｎｏｆｓｋｙ Ｃ．（１９９４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９：１６５９７−１６６０４）。
理論により束縛されることを望むものではないが、トリプトファン合成のセンシングおよび制御の天然メカニズムにおいては、ＴＲＡＰは、新たに合成されたＲＮＡリーダー内の結合部位に結合することにより、転写終結のレベルで作用すると理解される。これは、重複する抗ターミネーター配列を不安定化させて、下流ｒｈｏ非依存的ターミネーターを活性にして、短いＲＮＡのみの産生をもたらす。トリプトファンが細菌内で限定的である場合、ＴＲＡＰ環は、もはや、そのＲＮＡ結合部位に結合できない。したがって、抗ターミネーターが活性化され、トリプトファン合成遺伝子オペロンへと転写が継続する。ＴＲＡＰは転写レベルでも作用可能であり、ＲＮＡ転写産物の５’−ＵＴＲ内のＴＲＡＰの結合部位へのＴＲＡＰのトリプトファン依存的結合は抗シャイン−ダルガルノ配列を遊離させ、これは、翻訳のリボソームイニシエーションが抑制されるように、シャイン−ダルガルノ配列と共に安定なステムを形成しうる。最後に、他の状況においては、ＴＲＡＰがその核酸結合部位に結合すると、それは、４０Ｓスキャニングリボソーム複合体を、それが開始コドンに到達する前に物理的に遮断することにより（これが生じないならば、より安定でより高いアフィニティの翻訳装置が形成するであろう）、翻訳開始を抑制しうる。
本発明の１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは配列：ＭＮＱＫＨＳＳＤＦＶＶＩＫＡＶＥＤＧＶＮＶＩＧＬＴＲＧＴＤＴＫＦＨＨＳＥＫＬＤＫＧＥＶＩＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＶＲＧＥＡＬＩＱＴＡＹＧＥＭＫＳＥＫＫ（配列番号１）を含みうる。
本発明の好ましい実施形態においては、配列番号１は、Ｃ末端において、６個のヒスチジンアミノ酸でタグ化されている（ＨＩＳ×６ タグ）。
もう１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはアミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは配列：ＭＫＥＧＥＥＡＫＴＳＶＬＳＤＹＶＶＶＫＡＬＥＮＧＶＴＶＩＧＬＴＲＧＱＥＴＫＦＡＨＴＥＫＬＤＤＧＥＶＷＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＶＲＧＡＳＥＩＨＴＫＨＧＭＬＦＳＧＲＧＲＮＥＫＧ（配列番号２）を含みうる。
もう１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはデスルホトマクルム・ヒドロサーマレ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｅ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは配列：ＭＮＰＭＴＤＲＳＤＩＴＧＤＹＶＶＶＫＡＬＥＮＧＶＴＩＩＧＬＴＲＧＧＶＴＫＦＨＨＴＥＫＬＤＫＧＥＩＭＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＩＲＧＲＡＥＬＬＴＫＨＧＫＩＲＴＥＶＤＳ（配列番号３）を含みうる。
もう１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはビー・ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは配列：ＭＹＴＮＳＤＦＶＶＩＫＡＬＥＤＧＶＮＶＩＧＬＴＲＧＡＤＴＲＦＨＨＳＥＫＬＤＫＧＥＶＬＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＶＲＧＫＡＹＩＱＴＲＨＧＶＩＥＳＥＧＫＫ（配列番号４）を含みうる。
もう１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはビー・ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｓ７２Ｎに由来する。例えば、ＴＲＡＰは配列：ＭＹＴＮＳＤＦＶＶＩＫＡＬＥＤＧＶＮＶＩＧＬＴＲＧＡＤＴＲＦＨＨＳＥＫＬＤＫＧＥＶＬＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＶＲＧＫＡＹＩＱＴＲＨＧＶＩＥＮＥＧＫＫ（配列番号５）を含みうる。
もう１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはビー・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは配列：ＭＮＶＧＤＮＳＮＦＦＶＩＫＡＫＥＮＧＶＮＶＦＧＭＴＲＧＴＤＴＲＦＨＨＳＥＫＬＤＫＧＥＶＭＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＶＫＩＲＧＫＡＩＩＱＴＳＹＧＴＬＤＴＥＫＤＥ（配列番号６）を含みうる。
もう１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはカルボキシドテルムス・ヒドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは配列：ＭＶＣＤＮＦＡＦＳＳＡＩＮＡＥＹＩＶＶＫＡＬＥＮＧＶＴＩＭＧＬＴＲＧＫＤＴＫＦＨＨＴＥＫＬＤＫＧＥＶＭＶＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＩＲＧＫＡＥＩＹＴＫＨＧＶＩＫＮＥ（配列番号７）を含みうる。
１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質遺伝子ファミリーｍｔｒＢ（ＴｒｐＢＰスーパーファミリー、例えば、ＮＣＢＩ保存ドメインデータベース＃ｃｌ０３４３７）によりコードされる。
好ましい実施形態においては、ＴＲＡＰは６個のヒスチジンアミノ酸（ＨＩＳ×６タグ）でＣ末端においてタグ化されている。
好ましい実施形態においては、ＴＲＡＰは、配列番号１〜７のいずれかに対して５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、機能的に連結されたＮＯＩの発現がウイルスベクター産生細胞において修飾、例えば抑制または予防されるようにＲＮＡ結合部位と相互作用しうる。
好ましい実施形態においては、ＴＲＡＰは、配列番号１〜７のいずれかに対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、機能的に連結されたＮＯＩの発現がウイルスベクター産生細胞において修飾、例えば抑制または予防されるようにＲＮＡ結合部位と相互作用しうる。
もう１つの実施形態においては、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）は、機能的に連結されたＮＯＩの発現がウイルスベクター産生細胞において修飾、例えば抑制または予防されるようにＲＮＡ結合部位と相互作用しうるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされうる。例えば、ＴＲＡＰは、配列番号１〜７のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされうる。
本発明における使用のためのＲＮＡ結合タンパク質、例えばＴＲＡＰの全変異体、断片またはホモログは、ＮＯＩ（これはマーカー遺伝子でありうる）の翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または予防されるように本発明の結合部位に結合する能力を保有する。
核酸結合部位
「結合部位」なる語は、あるタンパク質と相互作用しうる核酸配列として理解されるべきである。本発明の核酸結合部位は、本発明のＲＮＡ結合タンパク質、例えばトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）と相互作用しうるものでありうる。
ＴＲＡＰの場合、ＴＲＡＰに結合しうるコンセンサス核酸結合部位配列は、複数回（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２回以上）反復する［ＲＡＧＮＮ］であり、そのような配列は天然ｔｒｐオペロンにおいて見出される。天然の状況においては、時にはＡＡＧＮＮが許容され、時には追加的な「スペーシング」Ｎヌクレオチドが機能的配列を与える。インビトロ実験は、少なくとも６個またはそれ以上のコンセンサス反復がＴＲＡＰ−ＲＮＡ結合に要求されることを示している（Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｙ．Ｊ．，Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１７）：５１５９−５１６３）。したがって、好ましくは、１つの実施形態においては、ｔｂｓ内に６個以上の連続的［ＲＡＧＮ ＞２］配列が存在し、ここで、ＲはＤＮＡにおけるＴまたはＧおよびＲＮＡにおけるＵまたはＧでありうる。
本発明の１つの実施形態においては、ＴＲＡＰ結合部位は配列ＲＡＧＮ ＞２（例えば、ＲＡＧＮ２−３）を含む。したがって、疑義を回避するために示すと、この核酸結合部位は、例えば、配列ＵＡＧＮＮ、ＧＡＧＮＮ、ＴＡＧＮＮ、ＵＡＧＮＮＮ、ＧＡＧＮＮＮまたはＴＡＧＮＮＮのいずれかを含む。
「Ｎ」は、配列内のその位置におけるいずれかのヌクレオチドを特定するものとして理解されるべきである。例えば、これはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵでありうるであろう。そのようなヌクレオチドの数は好ましくは２であるが、１１×反復ｔｂｓの、３個までの、例えば１個、２個または３個のＲＡＧ反復が３個のスペーシングヌクレオチドにより分離されていることが可能であり、翻訳抑制を招く何らかのＴＲＡＰ結合活性を尚も保有しうる。好ましくは、翻訳抑制を招く最大ＴＲＡＰ結合活性を保有させるために、１１×反復ｔｂｓにおいて、１個以下のＮ３スペーサーが使用される。
もう１つの実施形態においては、核酸結合部位はＲＡＧＮ ＞２の複数反復（例えば、ＲＡＧＮ２−３の複数反復）を含む。
もう１つの実施形態においては、核酸結合部位は配列ＲＡＧＮ２の複数反復を含む。
もう１つの実施形態においては、核酸結合部位は、ＲＡＧＮ ＞２の、少なくとも６個の反復（例えば、ＲＡＧＮ２−３の、少なくとも６個の反復）を含む。
もう１つの実施形態においては、核酸結合部位は、ＲＡＧＮ２の、少なくとも６個の反復を含む。例えば、核酸結合部位は、ＲＡＧＮ２の、６、７、８、９、１０、１１、１２個またはそれ以上の反復を含みうる。
もう１つの実施形態においては、核酸結合部位は、ＲＡＧＮ ＞２の、少なくとも８個の反復（例えば、ＲＡＧＮ２−３の、少なくとも８個の反復）を含む。
好ましくは、核酸結合部位に存在するＲＡＧＮＮＮ反復の数は１以下である。
もう１つの実施形態においては、核酸結合部位は、ＲＡＧＮ ＞２の、１１個の反復（例えば、ＲＡＧＮ２−３の、１１個の反復）を含む。好ましくは、この核酸結合部位に存在するＲＡＧＮＮＮ反復の数は３以下である。
もう１つの実施形態においては、核酸結合部位は、ＲＡＧＮ ＞２の、１２個の反復（例えば、ＲＡＧＮ２−３の、１２個の反復）を含む。
好ましい実施形態においては、核酸結合部位は、ＲＡＧＮ２の、８〜１１個の反復（例えば、ＲＡＧＮ２の、８、９、１０または１１個の反復）を含む。
例えば、ＴＲＡＰ結合部位は以下の配列のいずれかを含みうる：
ＧＡＧＵＵＵＡＧＣＧＧＡＧＵＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＵＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＵＧＧＡＧＣＵ（配列番号８）；または
ＧＡＧＵＵＵＡＧＣＧＧＡＧＵＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＵＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＣＵ（配列番号９）。
「ＲＡＧＮ ＞２の反復」は、一般的なＲＡＧＮ ＞２（例えばＲＡＧＮ２−３）モチーフが反復していることであると理解されるべきである。このモチーフの基準を満足する種々のＲＡＧＮ ＞２配列が、核酸結合部位を構成するために加わりうる。生じる核酸結合部位は、このモチーフの要件を満足するただ１個の配列の反復に限定されるとは意図されないが、この可能性も該定義に含まれる。例えば、「ＲＡＧＮ ＞２の、６個の反復」は以下の配列を含むが、それらに限定されるものではない：
ＵＡＧＵＵ−ＵＡＧＵＵ−ＵＡＧＵＵ−ＵＡＧＵＵ−ＵＡＧＵＵ−ＵＡＧＵＵ（配列番号１０）；
ＵＡＧＵＵ−ＵＡＧＵＵ−ＧＡＧＵＵ−ＵＡＧＵＵ−ＧＡＧＵＵ−ＵＡＧＵＵ（配列番号１１）；
ＧＡＧＵＵＵ−ＧＡＧＵＵ−ＧＡＧＵＵ−ＧＡＧＵＵＵ−ＧＡＧＵＵ−ＧＡＧＵＵ（配列番号１２）；および
ＵＡＧＵＵＵ−ＧＡＧＵＵ−ＵＡＧＵＵ−ＧＡＧＵＵＵ−ＵＡＧＵＵ−ＧＡＧＵＵ（配列番号１３）（ここにおけるダッシュ記号は、明確化のために、該反復間に含まれているに過ぎない）。
１個のＲＡＧＮＮＮ反復と７個のＲＡＧＮＮ反復とを含有する８反復ｔｂｓはＴＲＡＰ媒介性抑制活性を保有する。１以上のＲＡＧＮＮＮ反復を含有する８個未満の反復のｔｂｓ配列（例えば、７または６反復ｔｂｓ配列）はより低いＴＲＡＰ媒介性抑制活性を有しうる。したがって、８個未満の反復が存在する場合、ｔｂｓはＲＡＧＮＮ反復のみを含むを含むことが好ましい。
ＲＡＧＮＮ反復コンセンサスにおける使用のための好ましいヌクレオチドは以下のとおりである：
・ＮＮスペーサー位置の少なくとも１つにおけるピリミジン；
・ＮＮスペーサー位置の最初の位置におけるピリミジン；
・ＮＮスペーサー位置の両方におけるピリミジン；
・Ｒ位におけるＧ。
ＮＮスペーサー位置がＡＡである場合、Ｒ位にＧが使用されることも好ましい（すなわち、コンセンサス配列における反復としてＴＡＧＡＡは使用されないことが好ましい）。
「相互作用しうる」は、細胞、例えばウイルスベクター産生真核細胞において生じる条件下、核酸結合部位がタンパク質、例えばＴＲＡＰに結合しうることとして理解されるべきである。ＲＮＡ結合タンパク質、例えばＴＲＡＰとのそのような相互作用は、核酸結合部位が機能的に連結されているＮＯＩの翻訳の抑制または予防をもたらす。
「機能的に連結」は、記載されている成分が、それらの意図される様態でそれらが機能することを可能にする関係で存在することとして理解されるべきである。したがって、ＮＯＩに機能的に連結されている本発明のＲＮＡ結合部位は、ＲＮＡ結合タンパク質、例えばＴＲＡＰがＲＮＡ結合部位に結合した場合にＮＯＩの翻訳が修飾されるように位置する。
与えられたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＮＯＩ翻訳開始コドンの上流のＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ結合配列；ｔｂｓ）と相互作用しうる核酸結合部位の配置は、そのＯＲＦに由来するｍＲＮＡの特異的翻訳抑制を可能にする。翻訳開始コドンおよびＴＲＡＰ結合部位を分離しているヌクレオチドの数は、抑制の度合に影響を及ぼすことなく、様々となることが可能であり、例えば０〜１２ヌクレオチドでありうる。もう１つの例として、翻訳開始コドンおよびＴＲＡＰ結合部位を分離するために０〜４３ヌクレオチドが使用されうる。
ＮＯＩの翻訳の抑制または予防は、同等の時点で本発明の核酸結合部位の非存在下で発現される量と比較した場合の、ウイルスベクター産生中に翻訳されるＮＯＩの産物（例えば、タンパク質）の量の変化として理解されるべきである。翻訳のそのような変化は、ＮＯＩによりコードされるタンパク質の発現の、結果として生じる抑制または予防をもたらす。
本発明の１つの実施形態においては、関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または予防されるように、核酸結合部位はＲＮＡ結合タンパク質、例えばトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）と相互作用しうる。
ベクター産生中のいずれかの与えられた時点でのＮＯＩの翻訳は、ベクター産生における同じ時点で本発明の核酸配列の非存在下で翻訳される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％に低減されうる。
ベクター産生中のいずれかの与えられた時点でのＮＯＩの翻訳は、ベクター産生における同じ時点で本発明の核酸配列の非存在下で翻訳される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％未満に低減されうる。
ＮＯＩの翻訳の予防（阻止）は、翻訳の量を実質的にゼロに低減することとして理解されるべきである。
ベクター産生中のいずれかの与えられた時点でのＮＯＩからのタンパク質の発現は、ベクター産生における同じ時点で本発明の核酸配列の非存在下で発現される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％に低減されうる。
ベクター産生中のいずれかの与えられた時点でのＮＯＩからのタンパク質の発現は、ベクター産生における同じ時点で本発明の核酸配列の非存在下で発現される量の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％未満に低減されうる。
ＮＯＩからのタンパク質の発現の予防（阻止）は、発現されるタンパク質の量を実質的にゼロに低減することとして理解されるべきである。
ＮＯＩの翻訳の分析および／または定量のための方法は当技術分野でよく知られている。
細胞溶解細胞からのタンパク質産物は、クーマシーまたは銀染色による可視化を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のような方法を用いて分析されうる。あるいは、タンパク質産物は、タンパク質産物に結合する抗体プローブを使用するウエスタンブロット法または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて分析されうる。無傷細胞におけるタンパク質産物は免疫蛍光による分析されうる。
関心のあるヌクレオチド
本発明の１つの実施形態においては、関心のあるヌクレオチドは、ＲＮＡ結合タンパク質、例えばトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）を欠く標的細胞において翻訳される。
「標的細胞」は、それにおいてＮＯＩを発現させることが望ましい細胞として理解されるべきである。ＮＯＩは、本発明のウイルスベクターを使用して標的細胞内に導入されうる。標的細胞への送達はインビボ、エクスビボまたはインビトロで行われうる。
好ましい実施形態においては、関心のあるヌクレオチドは治療効果をもたらす。
ＮＯＩは治療または診断用途を有しうる。適当なＮＯＩには、酵素、補因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、操作された免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、免疫共刺激分子、免疫調節分子、キメラ抗原受容体、標的タンパク質のトランスドメイン陰性突然変異体、毒素、条件的毒素、抗原、腫瘍抑制タンパク質、増殖因子、膜タンパク質、受容体、血管作動性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、ならびにそれらの誘導体（例えば、関連レポーター基を有する誘導体）をコードする配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＮＯＩはマイクロＲＮＡをもコードしうる。理論により束縛されることを望むものではないが、マイクロＲＮＡのプロセシングはＴＲＡＰにより抑制されると考えられている。
１つの実施形態においては、ＮＯＩは神経変性障害の治療において有用でありうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩはパーキンソン病の治療において有用でありうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、ドーパミン合成に関与する酵素をコードしうる。例えば、該酵素は以下のものの１以上でありうる：チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼＩおよび／または芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ。３つ全ての遺伝子の配列が入手可能である（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｘ０５２９０、Ｕ１９５２３およびＭ７６１８０）。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２）をコードしうる。もう１つの実施形態においては、ウイルスゲノムは、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードするＮＯＩおよびＶＭＡＴ２をコードするＮＯＩを含みうる。そのようなゲノムはパーキンソン病の治療において、特にＬ−ＤＯＰＡの末梢投与と共に使用されうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは治療用タンパク質または治療用タンパク質の組合せをコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ−１β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インスリン増殖因子−２、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＦＧ−ＡおよびＰＤＦＧ−Ｂのヘテロおよびホモ二量体からなる群から選択されるタンパク質をコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子４、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、レスチン（ｒｅｓｔｉｎ）、インターフェロン−α、インターフェロン誘導性タンパク質、ｇｒｏ−ベータおよびチューブダウン（ｔｕｂｅｄｏｗｎ）−１、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−１２、レチノイン酸、抗ＶＥＧＦ抗体またはそれらのフラグメント（断片）／変異体、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦ受容体タンパク質、例えばＵＳ ５，９５２，１９９およびＵＳ ６，１００，０７１に記載されているもの、ならびに抗ＶＥＧＦ受容体抗体からなる群から選択される抗血管新生タンパク質をコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）をコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、通常は眼細胞において発現されるタンパク質をコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、通常は光受容細胞および／または網膜色素上皮細胞において発現されるタンパク質をコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、ＲＰＥ６５、アリール炭化水素相互作用性受容体タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）、ＣＲＢ１、レシチン網膜アセチルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）、光受容体特異的ホメオボックス（ＣＲＸ）、網膜グアニル酸シクラーゼ（ＧＵＣＹ２Ｄ）、ＲＰＧＲ相互作用タンパク質１（ＲＰＧＲＩＰ１）、ＬＣＡ２、ＬＣＡ３、ＬＣＡ５、ジストロフィン、ＰＲＰＨ２、ＣＮＴＦ、ＡＢＣＲ／ＡＢＣＡ４、ＥＭＰ１、ＴＩＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＥＬＯＶＬ４、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ２Ａ、ＶＭＤ２、ＲＬＢＰ１、ＣＯＸ−２、ＦＰＲ、ハルモニン（ｈａｒｍｏｎｉｎ）、Ｒａｂエスコート（ｅｓｃｏｒｔ）タンパク質１、ＣＮＧＢ２、ＣＮＧＡ３、ＣＥＰ ２９０、ＲＰＧＲ、ＲＳ１、ＲＰ１．ＰＲＥＬＰ、グルタチオン経路酵素およびオプチシン（ｏｐｔｉｃｉｎ）を含む群から選択されるタンパク質をコードしうる。
他の実施形態においては、ＮＯＩはヒト第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子をコードしうる。
他の実施形態においては、ＮＯＩはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードしうる。
他の実施形態においては、ＮＯＩは、ＳＧＳＨ、ＳＵＭＦ１、ＧＡＡ、共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２）、アデノシンデアミナーゼ、ＷＡＳタンパク質、グロビン、アルファガラクトシダーゼＡ、δ−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）シンターゼ、δ−アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ＡＬＡＤ）、ヒドロキシメチルビラン（ＨＭＢ）シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＲＯ）シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＲＯ）デカルボキシラーゼ、コプロポルフィリノーゲン（ＣＯＰＲＯ）オキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン（ＰＲＯＴＯ）オキシダーゼ、フェロケラターゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸スルファターゼ、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、ヘパラン−α−グルコサミニド Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、３ Ｎ−アセチルグルコサミン ６スルファターゼ、ガラクトース−６−硫酸スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−スルファターゼ、β−グルクロニダーゼおよびヒアルロニダーゼをコードしうる。
ＮＯＩに加えて、該ベクターはまた、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたは調節ｓｈＲＮＡを含む又はコードしうる（Ｄｉｃｋｉｎｓら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８９−１２９５，Ｓｉｌｖａら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８１−１２８８）。
適応症
本発明の、レトロウイルスおよびＡＡＶベクターを含むベクターは、ＷＯ １９９８／０５６３５、ＷＯ １９９８／０７８５９、ＷＯ １９９８／０９９８５に挙げられている障害の治療において有用な１以上のＮＯＩを送達するために使用されうる。関心のあるヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。そのような疾患の例を以下に記載する。
サイトカインおよび細胞増殖／分化活性；免疫抑制または免疫刺激活性（例えば、ヒト免疫不全ウイルス感染を含む免疫不全の治療、リンパ球増殖の調節、癌および多数の自己免疫疾患の治療、ならびに移植拒絶反応の予防または腫瘍免疫の誘導のためのもの）；造血の調節（例えば、骨髄またはリンパ系疾患の治療）；骨、軟骨、腱、靭帯および神経組織の成長の促進（例えば、創傷治癒、熱傷、潰瘍および歯周病および神経変性の治療のためのもの）；卵胞刺激ホルモンの抑制または活性化（生殖能力の調節）；走化性／ケモキネシス活性（例えば、特定の細胞型を損傷または感染部位に動員するためのもの）；止血および血栓溶解活性（例えば、血友病および脳卒中の治療のためのもの）；抗炎症活性（例えば、敗血症性ショックまたはクローン病の治療のためのもの）；マクロファージ抑制および／またはＴ細胞抑制活性、したがって抗炎症活性；抗免疫活性（すなわち、炎症に関連しない応答を含む、細胞性および／または体液性免疫応答に対する抑制効果）；細胞外マトリックス成分およびフィブロネクチンに接着するマクロファージおよびＴ細胞の能力の抑制、ならびにＴ細胞におけるアップレギュレーションｆａｓ受容体発現に応答する障害。
悪性障害、例えば癌、白血病、良性および悪性腫瘍の増殖、浸潤および広がり、血管新生、転移、腹水および悪性胸水。
自己免疫疾患、例えば関節炎、例えば関節リウマチ、過敏症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、コラーゲン疾患および他の疾患。
血管疾患、例えば動脈硬化症、アテローム硬化性心疾患、再灌流障害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性障害、呼吸窮迫症候群、心血管作用、末梢血管疾患、片頭痛およびアスピリン依存性抗血栓症、脳卒中、脳虚血、虚血性心疾患または他の疾患。
胃腸管の疾患、例えば消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病および他の疾患。
肝疾患、例えば肝線維症、肝硬変または他の疾患。
腎および泌尿器疾患、例えば甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他の疾患。
耳、鼻および咽喉障害、例えば中耳炎または他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患。
歯科および口腔障害、例えば歯周病、歯周炎、歯肉炎または他の歯科／口腔疾患。
精巣疾患、例えば精巣炎または精巣上体−精巣炎、不妊症、睾丸外傷または他の精巣疾患。
婦人科疾患、例えば胎盤機能不全、胎盤不全、習慣流産、子癇、子癇前症、子宮内膜症およびその他の婦人科疾患。
眼科学的障害、例えば後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜炎、視神経炎、緑内障、例えば開放隅角緑内障および若年性先天性緑内障、眼内炎症、例えば網膜炎または嚢胞様黄斑浮腫、交感性眼炎、強膜炎、網膜色素変性症、黄斑変性、例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および若年性黄斑変性、例えばベスト病、ベスト卵黄様黄斑変性、スタルガルト病、アッシャー症候群、ドイン蜂巣状網膜ジストロフィー、ソービー黄斑ジストロフィー、若年性網膜分離症、錐体桿体ジストロフィー、角膜ジストロフィー、フックスジストロフィー、レーバー先天性黒内障、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、アディー症候群、小口病、変性眼底疾患、眼外傷、感染によって引き起こされる眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、過剰瘢痕化、例えば緑内障濾過手術後のもの、眼用インプラントに対する反応、角膜移植片拒絶反応、ならびに他の眼疾患、例えば糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞、ＲＬＢＰ１関連網膜ジストロフィー、脈絡膜欠如および色盲。
神経学的および神経変性障害、例えばパーキンソン病、パーキンソン病の治療からの合併症および／または副作用、エイズ関連認知症症候群ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シデナム舞踏病、アルツハイマー病および他のＣＮＳ変性疾患、病態または障害、脳卒中、ポリオ後症候群、精神障害、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性汎脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ポンペ病、ギラン・バレー症候群、シドナム舞踏病、重症筋無力症、擬似腫瘍大脳、ダウン症候群、ハンチントン病、ＣＮＳ圧迫またはＣＮＳ外傷またはＣＮＳ感染、筋委縮およびジストロフィー、中枢および末梢神経系の疾患、病態または障害、運動ニューロン疾患、例えば筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋委縮症、脊髄および剥離損傷。
他の疾患および病態、例えば嚢胞性線維症、ムコ多糖症、例えばサンフィリポ症候群Ａ、ＡＤＡ−ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、ポルフィリン症、血友病Ａ、血友病Ｂ、外傷後炎症、出血、凝血および急性期応答、悪液質、食欲不振、急性感染症、敗血症性ショック、感染性疾患、手術の合併症または副作用、骨髄移植または他の移植合併症および／または副作用、遺伝子治療の合併症および副作用、例えばウイルスキャリアまたはエイズの感染によるもの、体液性および／または細胞性免疫応答を抑制または阻害するためのものによって生じるもの、天然または人工細胞、組織および器官、例えば角膜、骨髄、臓器、臓器、レンズ、ペースメーカー、天然または人工皮膚組織の移植の場合の移植拒絶の予防および／または治療のためのものによって生じるもの。
ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある他の実施形態においては、ＮＯＩはマイクロＲＮＡを含む。マイクロＲＮＡは生物において天然で産生される小さなＲＮＡの非常に大きな群であり、それらの少なくとも一部は標的遺伝子の発現を調節する。マイクロＲＮＡファミリーの当初のメンバーはｌｅｔ−７およびｌｉｎ−４である。ｌｅｔ−７遺伝子は、蠕虫の発生中に内因性タンパク質コード化遺伝子の発現を調節する小さな高度に保存されたＲＮＡ種をコードしている。該活性ＲＮＡ種は最初は〜７０ｎｔの前駆体として転写され、これは〜２１ｎｔの成熟形態へと転写後プロセシングされる。ｌｅｔ−７およびｌｉｎ−４は共にヘアピンＲＮＡ前駆体として転写され、これらはダイサー酵素によりそれらの成熟形態へとプロセシングされる。
該ベクターは、ＮＯＩに加えて、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたは調節ｓｈＲＮＡを含み又はコードしうる（Ｄｉｃｋｉｎｓら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８９−１２９５，Ｓｉｌｖａら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８１−１２８８）。
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により引き起こされる転写後遺伝子スプライシング（ＰＴＧＳ）は、外来遺伝子の発現を制御するための保存された細胞防御メカニズムである。ウイルスまたはトランスポゾンのような要素のランダムな組込みは、相同一本鎖ｍＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡの配列特異的分解を活性化するｄｓＲＮＡの発現を引き起こすと考えられている（Ｒａｌｐｈら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１：４２９−４３３）。ＲＮＡｉのメカニズムは約２１〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）のＲＮＡの二本鎖への長いｄｓＲＮＡのプロセシングを含む。これらの産物は、ｍＲＮＡ分解の配列特異的メディエーターである低分子干渉またはサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称される。分化哺乳類細胞においては、３０ｂｐを超えるｄｓＲＮＡはインターフェロン応答を活性化して、タンパク質合成の阻止および非特異的ｍＲＮＡ分解を招くことが判明している（Ｓｔａｒｋら，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７：２２７−６４（１９９８））。しかし、この応答は、培養哺乳類細胞内で遺伝子機能が分析されることを可能にする２１ｎｔのｓｉＲＮＡ二本鎖を使用することにより迂回されうる（Ｅｌｂａｓｈｉｒら，ＥＭＢＯ Ｊ．Ｄｅｃ ３；２０（２３）：６８７７−８８（２００１），Ｈｕｔｖａｇｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ａｕｇ ３，２９３（５５３１）：８３４−８．Ｅｕｐｕｂ Ｊｕｌ １２（２００１））。
ベクター
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列を含むウイルスベクターに関する。
ベクターは、１つの環境からもう１つの環境への実体の導入を可能にし又は促進する手段である。例示すれば、本発明においては、組換え核酸技術において使用される幾つかのベクターは、核酸のセグメント（例えば異種ＤＮＡセグメント、例えば異種ｃＤＮＡセグメント）のような実体が標的細胞内に導入されることを可能にする。ベクターは、異種核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞内に維持する目的、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡのセグメントを含むベクターの複製または核酸のセグメントによりコードされるタンパク質の発現を促進する目的を達成しうる。
本発明のベクターは、例えば、複製起点、所望により、該ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、および所望により、該プロモーターの調節因子を備えたウイルスベクターでありうる。ベクターは、１以上の選択可能なマーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）および／または追跡可能なマーカー遺伝子（例えば、ＧＦＰをコードする遺伝子）を含有しうる。ベクターは、例えば、標的細胞に感染させ、および／または導入するために使用されうる。
本発明のベクターは、インビトロで和合性標的細胞においてＮＯＩを複製するために使用されうる。したがって、本発明は、インビトロで和合性標的細胞内に本発明のベクターを導入し、ＮＯＩの発現をもたらす条件下、該標的細胞を増殖させることによる、インビトロでのタンパク質の製造方法を提供する。タンパク質は、当技術分野でよく知られた方法により標的細胞から回収されうる。適当な標的細胞には、哺乳類細胞系および他の真核細胞系が含まれる。
ベクターは発現ベクターでありうる。本明細書に記載されている発現ベクターは、転写されうる配列を含有する核酸の領域を含む。したがって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡをコードする配列がこの定義に含まれる。好ましくは、発現ベクターは、標的細胞によるコード配列の発現をもたらしうる制御配列に機能的に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む。
ウイルスベクター
本発明の１つの実施形態においては、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターはベクター、ベクタービリオンまたはベクター粒子とも称されうる。
もう１つの実施形態においては、ウイルスベクターはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスに由来する。
本発明の抑制系は任意のウイルスベクター系に有益であると予想される。該系は、関心のあるヌクレオチドが例えばウイルスベクター産生細胞に又はビリオン構築中に有害な影響をもたらす場合に特に有用であろう。
もう１つの実施形態においては、レトロウイルスは泡沫状ウイルスに由来する。
もう１つの実施形態においては、レトロウイルスベクターはレンチウイルスに由来する。
もう１つの実施形態においては、レンチウイルスベクターはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する。
ベクター力価
ウイルスベクターの力価を決定する多数の異なる方法が存在する、と当業者は理解するであろう。力価は、しばしば、導入単位／ｍＬ（ＴＵ／ｍＬ）として記載される。力価は、感染粒子の数を増加させることにより、およびベクター調製物の特異的活性を増加させることにより増加しうる。
レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター
本発明のレトロウイルスベクターは任意の適当なレトロウイルスから誘導（由来）されうる又は誘導可能でありうる。多数の異なるレトロウイルスが特定されている。具体例には以下のものが含まれる：マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウイルス−２９（ＭＣ２９）およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）。レトロウイルスの詳細な一覧はＣｏｆｆｉｎら（１９９７）“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ，ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ，ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８−７６３において見出されうる。
レトロウイルスは大雑把には２つの範疇、すなわち、「単純」および「複合」に分類されうる。レトロウイルスは更に７つの群に分類されうる。これらの群のうちの５つは、発癌能を有するレトロウイルスに相当する。残りの２つの群はレンチウイルスおよびスプーマウイルスである。これらのレトロウイルスの概説はＣｏｆｆｉｎら（１９９７），前掲に記載されている。
レトロウイルスおよびレンチウイルスゲノムの基本構造は多数の共通の特徴を有し、それらには、例えば、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ（それらの間または内部に、ゲノムがパッケージングされることを可能にするパッケージングシグナルが位置する）、プライマー結合部位、標的細胞ゲノム内への組込みを可能にする組込み部位、ならびにウイルス粒子の構築に必要なポリペプチドであるパッケージング成分をコードするｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子が挙げられる。レンチウイルスは追加的な特徴、例えば、ＨＩＶにおけるｒｅｖ遺伝子およびＲＲＥ配列を有し、これらは、感染標的細胞の核から細胞質への、組込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写産物の効率的な輸出を可能にする。
プロウイルスにおいては、これらの遺伝子は両端で、長末端反復（ＬＴＲ）と称される領域に隣接している。ＬＴＲはプロウイルスの組込みおよび転写をもたらす。ＬＴＲはエンハンサー−プロモーター配列としても働き、ウイルス遺伝子の発現を制御しうる。
ＬＴＲはそれら自体が同一の配列であり、Ｕ３、ＲおよびＵ５と称される３つの要素に分類されうる。Ｕ３はＲＮＡの３’末端に特有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両端において反復する配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に特有の配列に由来する。それらの３つの要素のサイズはレトロウイルスよって大きく変動しうる。
本発明の典型的なレトロウイルスベクターにおいては、複製に必須の領域をコードする１以上のタンパク質の少なくとも一部が該ウイルスから除去されうる。、例えば、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖは存在しないこと又は機能的でないことが可能である。これは該ウイルスベクターを複製欠損型にする。
また、標的の非分裂細胞に導入可能であり、および／またはウイルスゲノムを宿主ゲノム内に組込むことが可能な本発明の候補核酸結合配列を含むベクターを作製するために、ウイルスゲノムの部分は、ベクターゲノム内のレポーター遺伝子および調節制御領域に機能的に連結された本発明の候補核酸結合配列をコードするライブラリーにより置換されうる。
レンチウイルスはレトロウイルスの、より大きな群の一部である。レンチウイルスの詳細な一覧はＣｏｆｆｉｎら（１９９７）“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ，ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ，ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８−７６３に見出されうる。簡潔に説明すると、レンチウイルスは霊長類群および非霊長類群に分類されうる。霊長類レンチウイルスの例には、ヒト自己免疫不全症候群（エイズ）の原因因子であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。非霊長類レンチウイルス群には、原型「スローウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。
レンチウイルスファミリーは、レンチウイルスが分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する能力を有する点で、レトロウイルスとは異なる（Ｌｅｗｉｓら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ １１（８）：３０５３−３０５８ならびにＬｅｗｉｓおよびＥｍｅｒｍａｎ（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（１）：５１０−５１６）。これとは対照的に、ＭＬＶのような他のレトロウイルスは非分裂細胞または遅く分裂する細胞（例えば、筋肉、脳、肺および肝組織を構成する細胞）には感染できない。
本明細書中で用いるレンチウイルスベクターは、レンチウイルスから誘導可能な少なくとも１つの成分部分を含むベクターである。好ましくは、その成分部分は、該ベクターが細胞に感染し、遺伝子を発現し、または複製される生物学的メカニズムに関与する。
レンチウイルスベクターは霊長類レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）または非霊長類レンチウイルスに由来しうる。
非霊長類レンチウイルスの例は、霊長類に天然で感染しないレンチウイルス科の任意のメンバーであることが可能であり、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）を包含しうる。
一般的には、典型的なレトロウイルスベクター産生系は必須ウイルスパッケージング機能からのウイルスゲノムの分離を含む。図１に示されているとおり、これらの成分は、別々のＤＮＡ発現カセット（あるいは、プラスミド、発現プラスミド、ＤＮＡ構築物または発現構築物として知られている）上で産生細胞に付与される。
ベクターゲノムはＮＯＩを含む。ベクターゲノムは、典型的には、パッケージングシグナル（ψ）、ＮＯＩを保持する内部発現カセット、（所望により）転写後要素（ＰＲＥ）、３’−ｐｐｕおよび自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲを要する。ベクターゲノムＲＮＡおよびＮＯＩ ｍＲＮＡの両方の適切なポリアデニル化ならびに逆転写の過程のために、Ｒ−Ｕ５領域が必要である。ベクターゲノムは、所望により、ＷＯ ２００３／０６４６６５に記載されているオープンリーディングフレームを含みうる。
パッケージング機能はｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む。これらは産生細胞によるベクター粒子の産生のために必要である。ゲノムへのトランスでのこれらの機能の付与は複製欠損型ウイルスの産生を促進する。
ガンマ−レトロウイルスベクターの産生系は、典型的には、ゲノム、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ発現構築物を要する３成分系である。ＨＩＶ−１に基づくレンチウイルスベクターの産生系は更に、ベクターゲノムがｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を含むための、トランスで付与されるアクセサリー遺伝子ｒｅｖを要する。ＥＩＡＶに基づくレンチウイルスベクターは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する場合には、ｒｅｖを要さない（ＷＯ ２００３／０６４６６５を参照されたい）。
通常、ベクターゲノムカセット内でコードされる「外部」プロモーター（これはベクターゲノムカセットを駆動する）および「内部」プロモーター（これはＮＯＩカセットを駆動する）の両方は、その他のベクター系成分を駆動するものと同様に、強力な真核またはウイルスプロモーターである。そのようなプロモーターの例には、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＴＫ、ＳＶ４０およびユビキチンプロモーターが含まれる。強力な「合成」プロモーター、例えば、ＤＮＡライブラリーにより作製されたプロモーター（例えば、ＪｅＴプロモーター）が、転写を駆動するために使用されうる。あるいは、転写を駆動するためには、例えば以下のような組織特異的プロモーターが使用されうる：ロドプシン（Ｒｈｏ）、ロドプシンキナーゼ（ＲｈｏＫ）、錐体−桿体ホメオボックス含有遺伝子（ＣＲＸ）、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、アストロサイト特異的グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター、Ｆｌｔ−１プロモーター、ＩＮＦ−βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＳＰ−Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＷＡＳＰプロモーター、ＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモーター、ＳＶ４０／ＣＤ４３、ＳＶ４０／ＣＤ４５、ＮＳＥ／ＲＵ５’プロモーター、ＩＣＡＭ−２プロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、エンドグリンプロモーター、エラスターゼ−１プロモーター、デスミンプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＤ１４プロモーターおよびＢ２９プロモーター。
レトロウイルスベクターの産生（製造）はこれらのＤＮＡ成分での産生細胞の一過性トランスフェクションまたは安定なプロデューサー細胞系（ＰＣＬ）の使用を含み、ここで、該成分は産生細胞ゲノム内に組込まれる（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｈ．Ｊ．，Ｍ．Ａ．Ｌｅｒｏｕｘ−Ｃａｒｌｕｃｃｉ，Ｃ．Ｊ．Ｓｉｏｎ，Ｋ．Ａ．ＭｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓおよびＰ．Ａ．Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６（６）：８０５−８１４ Ｅｐｕｂ ２００９ Ｍａｒ ２００５）。もう１つのアプローチは、安定なパッケージング細胞（該細胞内にパッケージング成分が安定に組込まれている）を使用すること、および次いで必要に応じて、ベクターゲノムプラスミドにおける一過性トランスフェクションを行うことである。本発明のウイルスベクターを作製するためには、産生細胞は、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰタンパク質）を発現する能力を有する必要がある。したがって、本発明の１つの実施形態においては、産生細胞はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）構築物を安定に発現する。本発明のもう１つの実施形態においては、産生細胞はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）構築物を一過性に発現する。本発明のもう１つの実施形態においては、産生細胞はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）構築物を安定に発現し、そしてまた、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）構築物を一過性に発現する。
ＴＲＩＰ系は主にレトロウイルスベクターの製造に関して記載されているが、他のウイルスベクターにも類似戦略が適用されうることに留意すべきである。
本発明の１つの実施形態においては、ウイルスベクターはＥＩＡＶに由来する。ＥＩＡＶはレンチウイルスの最も単純なゲノム構造を有し、本発明における使用に特に好ましい。ＥＩＡＶは、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子に加えて、３つの他の遺伝子、すなわち、ｔａｔ、ｒｅｖおよびＳ２をコードしている。ＴａｔはウイルスＬＴＲの転写活性化因子として作用し（ＤｅｒｓｅおよびＮｅｗｂｏｌｄ（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４（２）：５３０−５３６ ならびにＭａｕｒｙら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００（２）：６３２−６４２）、ｒｅｖはｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を介してウイルス遺伝子の発現を調節し、統合する（Ｍａｒｔａｒａｎｏら（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２−３１１１）。これらの２つのタンパク質の作用メカニズムは霊長類ウイルスにおける同様のメカニズムに大雑把には類似していると考えられている（Ｍａｒｔａｒａｎｏら（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２−３１１１）。Ｓ２の機能は未知である。また、ＥＩＡＶタンパク質Ｔｔｍが特定されており、これは、膜貫通タンパク質の開始部位におけるｅｎｖコード配列へとスプライシングされるｔａｔの第１エキソンによりコードされている。本発明のもう１つの実施形態においては、ウイルスベクターはＨＩＶに由来する。ＨＩＶがＥＩＡＶと異なるのは、それがＳ２をコードしていないが、ＥＩＡＶとは違って、それがｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆをコードしている点である。
「組換えレトロウイルスまたはレンチウイルスベクター」（ＲＲＶ）なる語は、標的細胞に感染しうるウイルス粒子内へのＲＮＡゲノムのパッケージングをパッケージング成分の存在下で可能にするのに十分なレトロウイルス遺伝情報を有するベクターを意味する。標的細胞への感染は逆転写および標的細胞ゲノム内への組込みを含みうる。ＲＲＶは、該ベクターにより標的細胞へと送達されるべき非ウイルスコード配列を保持する。ＲＲＶは、標的細胞内で感染性レトロウイルス粒子を産生する非依存的複製の能力を有さない。通常、ＲＲＶは機能的ｇａｇ／ｐｏｌおよび／もしくはｅｎｖ遺伝子、ならびに／または複製に必須の他の遺伝子を欠く。
好ましくは、本発明のＲＲＶベクターは最小ウイルスゲノムを有する。
本明細書中で用いる「最小ウイルスゲノム」なる語は、標的細胞への関心のあるヌクレオチド配列の感染、導入および送達のための必要な機能性を付与するのに必須の要素を保有させながら非必須要素を除去するためにウイルスベクターが操作されていることを意味する。この方法の更なる詳細はＷＯ １９９８／１７８１５およびＷＯ ９９／３２６４６に見出されうる。最小ＥＩＡＶベクターはｔａｔ、ｒｅｖおよびＳ２を欠き、これらの遺伝子のいずれもが産生系においてトランスで付与されない。最小ＨＩＶベクターはｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔおよびｎｅｆを欠く。
しかし、産生細胞内でベクターゲノムを産生させるために使用される発現プラスミドは、産生細胞／パッケージング細胞におけるゲノムの転写を指令するための、レトロウイルスゲノムに機能的に連結された転写調節制御配列を含む。これらの調節配列は、転写されるレトロウイルス配列に関連した天然配列、すなわち、５’Ｕ３領域であることが可能であり、あるいはそれらは異種プロモーター、例えば別のウイルスプロモーター、例えばＣＭＶプロモーター（後記）であることが可能である。幾つかのレンチウイルスベクターゲノムは効率的なウイルス産生のための追加的配列を要する。例えば、特にＨＩＶの場合には、ＲＲＥ配列が含まれうる。しかし、ＲＲＥの必要性（およびトランスで付与されるｒｅｖに対する依存性）はコドン最適化によって低減または排除されうる。この方法の更なる詳細はＷＯ ２００１／７９５１８において見出されうる。ｒｅｖ／ＲＲＥ系と同じ機能を果たす代替的配列も公知である。例えば、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の機能的類似体がメイソン・ファイザー（Ｍａｓｏｎ Ｐｆｉｚｅｒ）サルウイルスにおいて見出される。これは構成的輸送要素（ＣＴＥ）として公知であり、感染細胞内の因子と相互作用すると考えられているゲノム内のＲＲＥ型配列を含む。該細胞因子はｒｅｖ類似体とみなされうる。したがって、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の代替物としてＣＴＥが使用されうる。公知の又は利用可能となる任意の他の機能的等価体が本発明に関連がありうる。例えば、ＨＴＬＶ−１のＲｅｘタンパク質はＨＩＶ−１のＲｅｖタンパク質に機能的に取って代わりうることが公知である。ＲｅｖおよびＲＲＥは、本発明の方法において使用されるベクターにおいて存在しないか又は非機能的であることが可能であり、二者択一で、ｒｅｖおよびＲＲＥ、または機能的に等価な系が存在することが可能である。
ＳＩＮベクター
本発明の方法において使用されるベクターは、好ましくは、ウイルスエンハンサーおよびプロモーター配列が欠失した自己不活性化（ＳＩＮ）配置で使用される。ＳＩＮベクターは製造可能であり、野生型ベクターの場合に類似した有効性でインビボ、エクスビボまたはインビトロで非分裂標的細胞に導入されうる。ＳＩＮプロウイルスにおける長末端反復（ＬＴＲ）の転写不活性化は複製可能ウイルスによる動員を妨げるはずである。これは、ＬＴＲのシス作用性効果を排除することにより内部プロモーターからの遺伝子の調節発現をも可能にするはずである。
例えば、自己不活性化レトロウイルスベクター系は、転写エンハンサーまたはエンハンサーおよびプロモーター（３’ＬＴＲのＵ３領域内のもの）を欠失させることにより構築されている。ベクターの逆転写および組込みのラウンドの後、これらの変化が５’および３’ＬＴＲの両方にコピーされて、転写的に不活性なプロウイルスを与える。しかし、そのようなベクターにおけるＬＴＲに対して内部のいずれかのプロモーターは転写的に尚も活性であろう。この戦略は、内部に位置する遺伝子からの転写の際のウイルスＬＴＲにおけるエンハンサーおよびプロモーターの効果を排除するために用いられている。そのような効果には、転写の増強または転写の抑制が含まれる。この戦略は、ゲノムＤＮＡ内への３’ＬＴＲから下流転写を排除するためにも用いられうる。これは、いずれかの内因性癌遺伝子の偶発的活性化を予防することが重要なヒト遺伝子治療において特に関心が持たれる。Ｙｕら（１９８６）ＰＮＡＳ ８３：３１９４−９８；Ｍａｒｔｙら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７２：８８５−７；Ｎａｖｉａｕｘら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５７０１−５；Ｉｗａｋｕｍａら（１９９９）Ｖｉｒｏｌ．２６１：１２０−３２；Ｄｅｇｌｏｎら（２０００）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：１７９−９０。ＳＩＮレンチウイルスベクターはＵＳ ６，９２４，１２３およびＵＳ ７，０５６，６９９に記載されている。
非複製型レンチウイルスベクター
複製欠損型レンチウイルスベクターのゲノムにおいては、ｇａｇ／ｐｏｌおよび／またはｅｎｖの配列が突然変異している、存在しない、および／または機能的でないことが可能である。
本発明の典型的なレンチウイルスベクターにおいては、ウイルス複製に必須のタンパク質に関する１以上のコード領域の少なくとも一部が該ベクターから除去されうる。これはウイルスベクターを複製欠損型にする。非分裂標的細胞に導入可能であり、および／またはウイルスゲノムを標的細胞ゲノム内に組込むことが可能なＮＯＩを含むベクターを作製するために、ウイルスゲノムの部分も、関心のあるヌクレオチド（ＮＯＩ）により置換されうる。
１つの実施形態においては、レンチウイルスベクターは、ＷＯ ２００６／０１０８３４およびＷＯ ２００７／０７１９９４に記載されている非組込み性ベクターである。
もう１つの実施形態においては、該ベクターは、ウイルスＲＮＡを欠損している又は欠いている配列を送達する能力を有する。もう１つの実施形態においては、送達されるべきＲＮＡ上に位置する異種結合ドメイン（ｇａｇにとって異種）およびＧａｇまたはＧａｇＰｏｌ上の同族（コグネイト）結合ドメインが、送達されるべきＲＮＡのパッケージングを確保するために使用されうる。これらのベクターは共にＷＯ ２００７／０７２０５６に記載されている。
アデノウイルスベクター
本発明のもう１つの実施形態においては、ベクターはアデノウイルスベクターでありうる。アデノウイルスは、ＲＮＡ中間体を介しては複製されない二本鎖線状ＤＮＡウイルスである。遺伝子配列に基づいて６個の亜群に分類されるアデノウイルスの５０以上の異なるヒト血清型が存在する。
アデノウイルスは二本鎖ＤＮＡ非エンベロープウイルスであり、これは、ヒトおよび非ヒト由来の広範な細胞型にインビボ、エクスビボおよびインビトロで導入されうる。これらの細胞には、呼吸気道上皮細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、滑膜細胞、初代乳腺上皮細胞および有糸分裂後終末分化細胞、例えばニューロンが含まれる。
アデノウイルスベクターは非分裂細胞にも導入可能である。これは、肺上皮内の罹患細胞が遅い代謝回転速度を有する嚢胞性線維症のような疾患の場合に非常に重要である。実際、罹患成人嚢胞性線維症患者の肺内への嚢胞性線維症トランスポーター（ＣＦＴＲ）のアデノウイルス媒介性導入を利用する幾つかの治験が進行中である。
アデノウイルスは遺伝子治療用および異種遺伝子発現用のベクターとして使用されている。大きな（３６ｋｂ）ゲノムは８ｋｂまでの外来インサートＤＮＡを収容可能であり、相補細胞系において効率的に複製されて、１０１２導入単位／ｍｌまでの非常に高い力価を示しうる。したがって、アデノウイルスは、初代非複製細胞における遺伝子の発現を研究するための最良の系の１つである。
アデノウイルスゲノムからのウイルス遺伝子または外来遺伝子の発現は複製細胞を要さない。アデノウイルスベクターは受容体媒介性エンドサイトーシスにより細胞に侵入する。細胞内に一旦入れば、アデノウイルスベクターは宿主染色体内にはめったに組込まれない。それよりむしろ、それらは宿主核内で線状ゲノムとしてエピソーム的に（宿主ゲノムから独立して）機能する。
アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、本発明において使用される魅力的なベクター系である。なぜなら、それは高い組込み頻度を有し、それは非分裂細胞に感染可能だからである。このため、それは哺乳類細胞内への遺伝子の送達に有用となる。ＡＡＶは広範な感染宿主域を有する。ｒＡＡＶベクターの作製および使用に関する詳細は米国特許第５，１３９，９４１号および米国特許第４，７９７，３６８号（それぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
組換えＡＡＶベクターはマーカー遺伝子およびヒト疾患に関与する遺伝子のインビトロ、エクスビボおよびインビボ導入のために成功裏に使用されている。
大きなペイロード（ｐａｙｌｏａｄ；負荷）（８〜９ｋｂまで）を効率的に組込みうる或るＡＡＶベクターが開発されている。１つのそのようなベクターはＡＡＶ５カプシドおよびＡＡＶ２ ＩＴＲを有する（Ａｌｌｏｃｃａ Ｍら，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（２００８）１１８：１９５５−１９６４）。
単純ヘルペスウイルスベクター
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ニューロンに自然感染するエンベロープ二本鎖ＤＮＡウイルスである。それは外来ＤＮＡの大きな断片を収容可能であり、このため、それはベクター系として魅力的なものとなり、ニューロンへの遺伝子送達用のベクターとして使用されている（Ｍａｎｓｅｒｖｉｇｉｅｔら Ｏｐｅｎ Ｖｉｒｏｌ Ｊ．（２０１０）４：１２３−１５６）。
治療方法におけるＨＳＶの使用は、株を、それが溶解サイクルを確立し得ないように弱毒化することを要する。特に、ＨＳＶベクターをヒトにおける遺伝子治療に使用する場合には、ポリヌクレオチドは、好ましくは、必須遺伝子内に挿入されるべきである。これは、ウイルスベクターが野生型ウイルスと遭遇すると、野生型ウイルスへの異種遺伝子の導入が組換えにより生じうるからである。しかし、ポリヌクレオチドが必須遺伝子内に挿入される限り、この組換え導入は受容ウイルスにおける必須遺伝子を欠失させ、複製可能野生型ウイルス集団内への異種遺伝子の「脱出」を防ぐであろう。
ワクシニアウイルスベクター
本発明のベクターはワクシニアウイルスベクター、例えばＭＶＡまたはＮＹＶＡＣでありうる。ワクシニアベクターの代替物には、鶏痘またはカナリア痘（ＡＬＶＡＣとして公知である）のようなアビポックスベクター、およびそれらに由来する株であって、ヒト細胞に感染し、ヒト細胞において組換えタンパク質を発現するが、複製不能であるものが含まれる。
バキュロウイルスベクター
また、本発明のベクターはバキュロウイルスベクターでありうる。哺乳類細胞におけるコード化ＮＯＩの発現を可能にするバキュロウイルスの修飾は当技術分野でよく知られている。これは、例えば、ＮＯＩの上流の哺乳類プロモーターの使用により達成されうる。
複数のＮＯＩをコードするベクター
１つの実施形態においては、ベクターは２以上のＮＯＩを含み、ここで、１以上のＮＯＩは本発明の核酸結合部位に機能的に連結されている。
配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
前記のとおり、本発明のベクターは２以上のＮＯＩを含みうる。これらのＮＯＩが発現されるためには、ベクターゲノム内に２以上の転写単位（各ＮＯＩにつき１個）が存在しうる。しかし、レトロウイルスベクターは、それが遺伝的に単純な状態で維持されている場合、最高の力価および最強の遺伝子発現特性を与えることが、文献から明らかであり（ＷＯ ９６／３７６２３；Ｂｏｗｔｅｌｌら，１９８８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，２４６４；Ｃｏｒｒｅｌｌら，１９９４ Ｂｌｏｏｄ ８４，１８１２；ＥｍｅｒｍａｎおよびＴｅｍｉｎ １９８４ Ｃｅｌｌ ３９，４５９；Ｇｈａｔｔａｓら，１９９１ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，５８４８；Ｈａｎｔｚｏｐｏｕｌｏｓら，１９８９ ＰＮＡＳ ８６，３５１９；Ｈａｔｚｏｇｌｏｕら，１９９１ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６６，８４１６；Ｈａｔｚｏｇｌｏｕら，１９８８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６３，１７７９８；Ｌｉら，１９９２ Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．３，３８１；ＭｃＬａｃｈｌｉｎら，１９９３ Ｖｉｒｏｌ．１９５，１；Ｏｖｅｒｅｌｌら，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８，１８０３；Ｓｃｈａｒｆｍａｎら，１９９１ ＰＮＡＳ ８８，４６２６；Ｖｉｌｅら，１９９４ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １，３０７；Ｘｕら，１９８９ Ｖｉｒｏｌ．１７１，３３１；Ｙｅｅら，１９８７ ＰＮＡＳ ８４，５１９７）、したがって、ポリシストロンメッセージにおける第２（および後続）のコード配列の翻訳を開始するために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用することが好ましい（Ａｄａｍら １９９１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，４９８５）。
レトロウイルスベクター内へのＩＲＥＳ要素の挿入はレトロウイルス複製サイクルに適合し、単一プロモーターからの複数のコード領域の発現を可能にする（Ａｄａｍら（前記）；Ｋｏｏら（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８６：６６９−６７５；Ｃｈｅｎら １９９３ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６７：２１４２−２１４８）。ＩＲＥＳ要素は、それがウイルスタンパク質のキャップ（ｃａｐ）非依存的翻訳を促進する、ピコルナウイルスの非翻訳５’末端において、最初に見出された（Ｊａｎｇら（１９９０）Ｅｎｚｙｍｅ ４４：２９２−３０９）。ＩＲＥＳ要素は、ＲＮＡにおけるオープンリーディングフレーム間に位置する場合、ＩＲＥＳ要素におけるリボソームの進入およびそれに続く下流の翻訳開始を促進することにより、下流オープンリーディングフレームの効率的発現を可能にする。
ＩＲＥＳの概説はＭｏｕｎｔｆｏｒｄおよびＳｍｉｔｈ（ＴＩＧ Ｍａｙ １９９５ ｖｏｌ １１，Ｎｏ ５：１７９−１８４）に示されている。多数の異なるＩＲＥＳ配列が公知であり、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｇｈａｔｔａｓ，Ｉ．Ｒ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：５８４８−５８５９（１９９１））；ＢｉＰタンパク質［ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９１（１９９１）］；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のアンテナペディア遺伝子（エキソンｄおよびｅ）［Ｏｈら，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，６：１６４３−１６５３（１９９２）］からのもの、ならびにポリオウイルス（ＰＶ）におけるもの［ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３２０−３２５（１９８８）；また、ＭｏｕｎｔｆｏｒｄおよびＳｍｉｔｈ，ＴＩＧ １１，１７９−１８４（１９８５）も参照されたい］を包含する。
ＰＶ、ＥＭＣＶおよびブタ水疱病ウイルス由来のＩＲＥＳ要素はレトロウイルスベクターにおいて既に使用されている（Ｃｏｆｆｉｎら，前記）。
「ＩＲＥＳ」なる語は、ＩＲＥＳとして働く又はＩＲＥＳの機能を改善する任意の配列または配列の組合せを含む。
ＩＲＥＳはウイルス由来（例えば、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＰＶ ＩＲＥＳまたはＦＭＤＶ ２Ａ様配列）または細胞由来（例えば、ＦＧＦ２ ＩＲＥＳ、ＮＲＦ ＩＲＥＳ、Ｎｏｔｃｈ ２ ＩＲＥＳまたはＥＩＦ４ ＩＲＥＳ）でありうる。
ＩＲＥＳが各ポリヌクレオチドの翻訳を開始しうるためには、それはベクターゲノムにおいて該ポリヌクレオチドの間または前に位置するべきである。
プロモーター
ＮＯＩの発現は、プロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節シグナルを含む制御配列を使用して制御されうる。原核プロモーターおよび真核細胞において機能的なプロモーターが使用されうる。組織特異的または刺激特異的プロモーターが使用されうる。２以上の異なるプロモーターからの配列要素を含むキメラプロモーターも使用されうる。
適当なプロモーター配列は強力プロモーターであり、それらには、ウイルス、例えばポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムに由来するもの、あるいは、異種哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーター、ＥＦ１ａ、ＣＡＧ、ＴＫ、ＳＶ４０、ユビキチン、ＰＧＫまたはリボソームタンパク質プロモーターが含まれる。あるいは、転写を駆動するために、例えば以下のような組織特異的プロモーターが使用されうる：ロドプシン（Ｒｈｏ）、ロドプシンキナーゼ（ＲｈｏＫ）、錐体−桿体ホメオボックス含有遺伝子（ＣＲＸ）、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、アストロサイト特異的グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ヒトα１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター、Ｆｌｔ−１プロモーター、ＩＮＦ−βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＳＰ−Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＷＡＳＰプロモーター、ＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモーター、ＳＶ４０／ＣＤ４３、ＳＶ４０／ＣＤ４５、ＮＳＥ／ＲＵ５’プロモーター、ＩＣＡＭ−２プロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、エンドグリンプロモーター、エラスターゼ−１プロモーター、デスミンプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＤ１４プロモーターおよびＢ２９プロモーター。
遺伝子の転写は、エンハンサー配列をベクター内に挿入することにより、更に増強されうる。エンハンサーは比較的、配向および位置に非依存的であるが、真核細胞ウイルス由来のエンハンサー、例えば、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ １００〜２７０）、およびＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーを使用することが可能である。エンハンサーはプロモーターに対して５’または３’側の位置においてベクター内にスプライシングされうるが、好ましくは、プロモーターから５’側の部位に位置する。
プロモーターは、適当な標的細胞における発現を確保または増強するための特徴を更に含みうる。例えば、該特徴は保存領域、例えばプリブナウボックス（Ｐｒｉｂｎｏｗ Ｂｏｘ）またはＴＡＴＡボックスでありうる。プロモーターは、ヌクレオチド配列の発現のレベルに影響を及ぼす（例えば、該レベルを維持、増強または低減する）他の配列を含有しうる。適当な他の配列には、Ｓｈ１−イントロンまたはＡＤＨイントロンが含まれる。他の配列には、誘導可能要素、例えば、温度、化学物質、光またはストレスにより誘導可能な要素が含まれる。また、転写または翻訳を増強するための適当な要素が存在しうる。
トランスジーンを駆動する組織特異的プロモーターを含む構成的および／または強力プロモーターが望ましい場合、そして特に、産生細胞におけるトランスジーンタンパク質の発現がベクター力価の減少を招く、および／またはトランスジーン由来タンパク質のウイルスベクター送達ゆえにインビボで免疫応答を惹起する場合に、ＲＮＡ結合タンパク質−結合部位（例えば、ＴＲＡＰ−ｔｂｓ）相互作用は、レトロウイルスベクターの産生のためのトランスジーンタンパク質抑制系の基礎を形成するのに有用でありうる。図４は、これがその好ましい形態においてどのように適用されうるかの一例を示す。
パッケージング配列
本発明の文脈において用いる「パッケージングシグナル」なる語は互換的に「パッケージング配列」または「ｐｓｉ」とも称され、ウイルス粒子形成中にレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成に要求される非コード化シス作用性配列に関して用いられる。ＨＩＶ−１においては、この配列は、主要スプライスドナー部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇａｇ開始コドンまで伸長する遺伝子座に位置づけられている。ＥＩＡＶにおいては、パッケージングシグナルはＧａｇの５’コード領域内へのＲ領域を含む。
本明細書中で用いる「拡張パッケージングシグナル」または「拡張パッケージング配列」なる語は、ｇａｇ遺伝子内へと更に拡張された、ｐｓｉ配列の周囲の配列の使用に関するものである。これらの追加的パッケージング配列の含有はウイルス粒子内へのベクターＲＮＡの挿入の効率を増加させうる。
ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ＲＮＡカプシド形成決定因子は離散的および不連続的であり、ゲノムｍＲＮＡの５’末端の１つの領域（Ｒ−Ｕ５）、およびｇａｇの近位３１１ｎｔ内に位置づけられるもう１つの領域を含む（Ｋａｙｅら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．Ｏｃｔ；６９（１０）：６５８８−９２（１９９５））。
ウイルスベクター産生系および細胞
本発明のもう１つの態様は、ウイルスベクターの産生に必要な成分をコードする核酸配列のセットを含むウイルスベクター産生系に関するものであり、ここで、該ベクターゲノム配列は本発明の核酸配列を含む。
「ウイルスベクター産生系」または「ベクター産生系」または「産生系」は、ウイルスベクター産生のための必要な成分を含む系として理解されるべきである。
したがって、該ベクター産生系は、ウイルスベクター粒子の産生に必要な成分をコードする核酸配列のセットを含む。１つのそのような核酸配列は、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子を含みうる。好ましい実施形態においては、ＲＮＡ結合タンパク質は細菌ＴＲＡＰである。
本発明の１つの実施形態においては、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであり、ウイルスベクター産生系は更に、ＧａｇおよびＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質ならびにＥｎｖタンパク質またはそれらの機能的代替物をコードする核酸配列と、本発明の結合部位を含むベクターゲノム配列とを含む。該産生系は、所望により、Ｒｅｖタンパク質をコードする核酸配列を含みうる。
本発明のウイルスベクター産生系のもう１つの実施形態においては、ウイルスベクターはレトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来する。
もう１つの実施形態においては、ウイルスベクターはレンチウイルスに由来する。もう１つの実施形態においては、ウイルスベクターはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する。
本発明のもう１つの態様は本発明のウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築物に関する。そのようなＤＮＡ構築物（例えば、プラスミド）は、本発明の核酸配列を含むベクターゲノム構築物を含みうる。
本発明のもう１つの態様は、本発明のＲＮＡ結合タンパク質、例えばＴＲＡＰをコードする核酸配列を含む、本発明のウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築物に関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明のＤＮＡ構築物と、ＧａｇおよびＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質ならびにＥｎｖタンパク質またはそれらの機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物とを含む、本発明のウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築物のセットに関する。
本発明の１つの実施形態においては、ＤＮＡ構築物のセットは更に、ＲＮＡ結合タンパク質、例えばＴＲＡＰをコードするＤＮＡ構築物を含む。
本発明の１つの実施形態においては、ＤＮＡ構築物のセットは更に、Ｒｅｖタンパク質またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物を含む。
本発明の１つの態様は、本発明の核酸配列、ウイルスベクター産生系またはＤＮＡ構築物の一部もしくは全部を含むウイルスベクター産生細胞に関する。
「ウイルスベクター産生細胞」は、ウイルスベクターまたはウイルスベクター粒子を産生しうる細胞として理解されるべきである。ウイルスベクター産生細胞は「プロデューサー細胞」または「パッケージング細胞」でありうる。ウイルスベクター系の、１以上のＤＮＡ構築物は、ウイルスベクター産生細胞内に安定に組込まれ、またはエピソーム的に維持されうる。あるいは、ウイルスベクター系のＤＮＡ成分の全てはウイルスベクター産生細胞内に一過性にトランスフェクトされうる。更にもう１つの代替形態においては、該成分の幾つかを安定に発現する産生細胞が、残りの成分で一過性にトランスフェクトされうる。
ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）をコードするＤＮＡ発現カセットはウイルスベクター産生細胞内に安定に組込まれ、またはエピソーム的に維持されうる。あるいは、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）をコードするＤＮＡ発現カセットはウイルスベクター産生細胞内に一過性にトランスフェクトされうる。
したがって、本発明の１つの実施形態においては、該産生細胞はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）構築物を安定に発現する。本発明のもう１つの実施形態においては、該産生細胞はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）構築物を一過性に発現するであろう。
要求される抑制のレベルはＮＯＩによって様々でありうる。したがって、該産生細胞において要求されるＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）のレベルもＮＯＩに左右されうる。したがって、幾つかの場合には、安定な及び一過性のＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）発現の組合せが望まれうる。安定発現は産生細胞における継続したレベルのＲＮＡ結合タンパク質発現をもたらし、一方、一過性発現は、より短い期間の、増加したレベルのＲＮＡ結合タンパク質発現をもたらしうる。例えば、より問題のある／毒性のトランスジーンの抑制は、ベクター産生中の既存（例えば、安定発現によりもたらされる）および高レベルの両方のＲＮＡ結合タンパク質から利益を得ることが可能である。
したがって、本発明のもう１つの実施形態においては、該産生細胞はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）構築物を安定に発現し、そしてまた、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）構築物を一過性に発現する。一過性発現は、安定発現によってもたらされるものより高いレベルの短期間のＲＮＡ結合タンパク質発現をもたらしうる。
「安定発現」は、安定発現をもたらす構築物からのＲＮＡ結合タンパク質の発現が長期間にわたって実質的に変動しないこととして理解されるべきである。
「一過性発現」は、一過性発現をもたらす構築物からのＲＮＡ結合タンパク質の発現が長期間にわたって安定でないこととして理解されるべきである。好ましくは、一過性発現をもたらすＲＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは産生細胞ゲノム内に組込まれず、産生細胞内にエピソーム的に維持されない。
本明細書中で用いる「パッケージング細胞」は、感染性ベクター粒子の産生に必要な要素を含有するがベクターゲノムを欠く細胞を意味する。典型的には、そのようなパッケージング細胞は、ウイルス構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ）を発現しうる１以上の発現カセットを含有する。
プロデューサー細胞／パッケージング細胞は任意の適当な細胞型のものでありうる。プロデューサー細胞は一般に哺乳類細胞であるが、例えば昆虫細胞でありうる。
本明細書中で用いる「プロデューサー／産生細胞」または「ベクター産生細胞」は、レトロウイルスベクター粒子の産生およびＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）の発現に必要な要素の全てを含有する細胞を意味する。
産生細胞は安定プロデューサー細胞系であることが可能であり、または一過性に誘導されることが可能である。
本発明の１つの実施形態においては、エンベロープおよびヌクレオカプシド、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）、および存在する場合のｒｅｖヌクレオチド配列は全て、プロデューサーおよび／またはパッケージング細胞内に安定に組込まれる。しかし、これらの配列のいずれかの１以上はエピソーム形態で存在することも可能であり、遺伝子発現はエピソームから生じることが可能であり、あるいは産生細胞内に一過性にトランスフェクトされることが可能であろう。
ベクター産生細胞は、インビトロで培養された細胞、例えば組織培養細胞系でありうる。適当な細胞系には、哺乳類細胞、例えばマウス線維芽細胞由来の細胞系またはヒト細胞系が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、ベクター産生細胞はヒト細胞系に由来する。
１つの実施形態においては、本発明のベクターは、ＮＯＩに機能的に連結された本発明の結合部位、ｇａｇ−ｐｏｌ成分、エンベロープおよびＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）を含むベクターゲノムを発現する４つの転写単位を、その産生系として使用する。エンベロープ発現カセットはＶＳＶ−Ｇのような幾つかの異種エンベロープの１つを含みうる。所望により、ｒｅｖ成分も含まれうる。
ウイルスベクターの製造方法
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列、ウイルスベクター産生系またはＤＮＡ構築物の一部もしくは全部をウイルスベクター産生細胞内に導入し、ウイルスベクターの産生に適した条件下、該産生細胞を培養することを含む、ウイルスベクターの製造方法に関する。
適当な「産生細胞」は、適当な条件下で培養された場合にウイルスベクターまたはウイルスベクター粒子を産生しうる細胞である。それらは一般に哺乳類またはヒト細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＣＡＰ、ＣＡＰ−ＴまたはＣＨＯ細胞であるが、例えば昆虫細胞、例えばＳＦ９細胞でありうる。
産生細胞はまた、鳥類細胞、例えばＥＢ６６（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）細胞でありうる。鳥類細胞は、ウイルスに基づくヒト用および獣医学用ワクチン、例えばインフルエンザおよびニューカッスル病ウイルスワクチンに特に有用でありうる。
産生細胞内に核酸を導入する方法は当技術分野でよく知られており、既に記載されている。
１つの実施形態においては、産生細胞はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質；ＴＲＡＰ）を含む。
本発明のもう１つの態様は、本発明のウイルスベクター産生系により、本発明のウイルスベクター産生細胞を使用して、または本発明の製造方法により製造されるウイルスベクターに関する。
１つの実施形態においては、ウイルスベクター粒子は核酸結合部位を含む。ウイルスベクター粒子はレトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来しうる。レトロウイルスベクター粒子はレンチウイルスに由来しうる。レンチウイルスベクター粒子はＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来しうる。
レンチウイルスベクターの製造方法および特にレンチウイルスベクターのプロセシングはＷＯ ２００９／１５３５６３に記載されている。
本発明のもう１つの態様は、本発明のウイルスベクターが導入された細胞に関する。
「ウイルスベクター粒子が導入された細胞」は、ウイルスベクター粒子によって運ばれる核酸が導入された細胞、特に標的細胞として理解されるべきである。
シュードタイピング
１つの好ましい態様においては、本発明のウイルスベクターはシュードタイピング（偽型化）されている。これに関して、シュードタイピングは１以上の利点をもたらしうる。例えば、ＨＩＶに基づくベクターのｅｎｖ遺伝子産物はこれらのベクターを、ＣＤ４と称されるタンパク質を発現する細胞のみに感染することに制限するであろう。しかし、これらのベクター内のｅｎｖ遺伝子が他のエンベロープウイルスからのｅｎｖ配列で置換されている場合、それらはより広い感染スペクトルを有しうる（ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９−２４２）。例えば、研究者は、ＨＩＶに基づくベクターをＶＳＶ由来の糖タンパク質でシュードタイピングしている（ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９−２４２）。
もう１つの代替形態においては、Ｅｎｖタンパク質は修飾Ｅｎｖタンパク質、例えば突然変異体または操作されたＥｎｖタンパク質でありうる。修飾は、標的化能を導入するために、または毒性を低減するために、または別の目的のために行われ、または選択されうる（Ｖａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎら １９９６ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：２０５６−６４；Ｎｉｌｓｏｎら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３（４）：２８０−２８６；およびＦｉｅｌｄｉｎｇら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１（５）：１８０２−１８０９およびそれらにおいて引用されている参考文献）。
ベクターは、選ばれた任意の分子でシュードタイピングされうる。
ＶＳＶ−Ｇ
ラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、あるエンベロープウイルスおよびウイルスベクタービリオンをシュードタイピングしうることが示されたエンベロープタンパク質である。
レトロウイルスエンベロープタンパク質の非存在下、ＭｏＭＬＶに基づくレトロウイルスベクターをそれがシュードタイピングしうることはＥｍｉら（（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：１２０２−１２０７）により最初に示された。ＷＯ １９９４／２９４４４０は、レトロウイルスベクターがＶＳＶ−Ｇで成功裏にシュードタイピング（シュードタイプ化）されうることを教示している。これらのシュードタイプ化ＶＳＶ−Ｇベクターは、広範な哺乳類細胞に導入するために使用されうる。その後、Ａｂｅら（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（８）６３５６−６３６１は、非感染性レトロウイルス粒子がＶＳＶ−Ｇの付加により感染性にされうることを教示している。
Ｂｕｒｎｓら（（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３−７）はレトロウイルスＭＬＶをＶＳＶ−Ｇで成功裏にシュードタイピングし、これは、天然形態のＭＬＶと比較して変化した宿主域を有するベクターを与えた。ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化ベクターは、哺乳類細胞だけでなく、魚類、爬虫類および昆虫に由来する細胞系にも感染することが示されている（Ｂｕｒｎｓら（１９９３）前掲）。それらは、種々の細胞系に関して、通常のアンホトロピックエンベロープより効率的であることも示されている（Ｙｅｅら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９５６４−９５６８，Ｅｍｉら（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：１２０２−１２０７）。ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、あるレトロウイルスをシュードタイピングするために使用されうる。なぜなら、その細胞質尾部はレトロウイルスのコアと相互作用しうるからである。
ＶＳＶ−Ｇタンパク質のような非レトロウイルスシュードタイピングエンベロープの提供は、感染性の低下を伴うことなくベクター粒子が高い力価まで濃縮されうるという利点をもたらす（Ａｋｋｉｎａら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２５８１−５）。レトロウイルスエンベロープタンパク質は超遠心分離中のセン断力に耐えることができないようである。なぜなら、おそらく、それらは、非共有結合により結合した２つのサブユニットからなるからであろう。そららのサブユニット間の相互作用は遠心分離により破壊されうる。一方、ＶＳＶ糖タンパク質は単一の単位から構成されている。したがって、ＶＳＶ−Ｇタンパク質シュードタイピングは潜在的な利点をもたらしうる。
ＷＯ ２０００／５２１８８は、膜関連ウイルスエンベロープタンパク質として水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を有する、安定なプロデューサー細胞系からのシュードタイプ化レトロウイルスベクターの作製を記載しており、ＶＳＶ−Ｇタンパク質の遺伝子配列を提供している。
ロスリバーウイルス
非霊長類レンチウイルスベクター（ＦＩＶ）をシュードタイピングするために、ロスリバーウイルスエンベロープが使用されており、全身投与後、主に肝臓に導入された（Ｋａｎｇら（２００２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６（１８）：９３７８−９３８８）。効率は、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化ベクターで得られたものより２０倍大きいと報告された。そして、肝毒性を示唆する肝酵素の血清レベルによる測定では、それはそれほど大きな細胞毒性を引き起こさなかった。
バキュロウイルスＧＰ６４
バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質は、臨床的および商業的用途に必要な高力価ウイルスの大規模製造において使用されるウイルスベクターのためのＶＳＶ−Ｇの代替物となることが示されている（Ｋｕｍａｒ Ｍ，Ｂｒａｄｏｗ ＢＰ，Ｚｉｍｍｅｒｂｅｒｇ Ｊ（２００３）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（１）：６７−７７）。ＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化ベクターと比較して、ＧＰ６４シュードタイプ化ベクターは、類似した広い指向性および類似した天然力価を有する。ＧＰ６４の発現は細胞を殺さないため、ＧＰ６４を構成的に発現する２９３Ｔに基づく細胞系が作製されうる。
代替エンベロープ
ＥＩＡＶをシュードタイピングするために使用された場合に合理的な力価を与える他のエンベロープには、モコラ（Ｍｏｋｏｌａ）、狂犬病、エボラおよびＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）が含まれる。４０７０Ａでシュードタイピングされたレンチウイルスの、マウスへの静脈内注入は、肝臓において最大の遺伝子発現をもたらした。
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡを含みうる。それらは一本鎖または二本鎖でありうる。遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドが同一ポリペプチドをコードしうる、と当業者により理解されるであろう。また、本発明のポリペプチドが発現されることになるいずれかの特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映させるために、通常の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を当業者が行いうる、と理解されるべきである。
該ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能ないずれかの方法により修飾されうる。そのような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増加させるために行われうる。
ＤＮＡポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチドは組換え法、合成法または当業者に利用可能ないずれかの手段により製造されうる。それらはまた、標準的な技術によってクローニングされうる。
より長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段を用いて、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を用いて製造される。これは、クローニングしたい標的配列に隣接するプライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレオチドのもの）のペアを作製し、動物またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと該プライマーを接触させ、所望の領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅された断片を（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することにより）単離し、増幅されたＤＮＡを回収することを含む。該プライマーは、増幅されたＤＮＡが適当なベクター内にクローニングされうるように適当な制限酵素認識部位を含有するように設計されうる。
タンパク質
本明細書中で用いる「タンパク質」なる語は一本鎖ポリペプチド分子および複数のポリペプチドの複合体（この場合、個々の構成ポリペプチドは共有的手段または非共有的手段により連結されている）を含む。本明細書中で用いる「ポリペプチド」および「ペプチド」なる語は、単量体がアミノ酸でありペプチド結合またはジスルフィド結合により互いに連結された重合体を意味する。
変異体、誘導体、類似体、ホモログおよび断片
本明細書に記載されている特定のタンパク質およびヌクレオチドに加えて、本発明はそれらの変異体、誘導体、類似体、ホモログおよび断片の使用をも含む。
本発明の場合には、いずれかの与えられた配列の変異体は、問題のポリペプチドまたはポリヌクレオチドがその内因性機能の少なくとも１つを保有するように残基（アミノ酸残基も核酸残基も含む）の特定の配列が修飾されている配列である。変異体配列は、天然に存在するタンパク質において存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、修飾、置換および／または変異により得られうる。
本発明のタンパク質またはポリペプチドに関して本明細書中で用いる「誘導体」なる語は、生じるタンパク質またはポリペプチドがその内因性機能の少なくとも１つを保有する限り、配列からの又は配列に対する、１つ（以上）のアミノ酸残基の、いずれかの置換、変異、修飾、置き換え、欠失および／または付加を含む。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して本明細書に記載されている「類似体」なる語は、いずれかの模倣体、すなわち、それが模倣しているポリペプチドまたはポリヌクレオチドの内因性機能の少なくとも１つを有する化合物を含む。
典型的には、アミノ酸置換は、要求される活性または能力を修飾配列が保有する限り、例えば、１、２または３個から１０または２０個までの置換として行われうる。アミノ酸置換は、天然に存在しない類似体の使用を含みうる。
本発明において使用されるタンパク質は、サイレントな変化をもたらし機能的に同等なタンパク質を与えるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換をも有しうる。内因性機能が保有される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換が行われうる。例えば、負荷電アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正荷電アミノ酸はリジンおよびアルギニンを含み、類似した親水性値を有する無荷電極性頭部基を有するアミノ酸はアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンを含む。
保存的置換が、例えば以下の表に従い行われうる。第２列における同じ分類におけるアミノ酸、および好ましくは、第３列における同じ行におけるアミノ酸が互いに置換されうる。
Figure 2017500870
「ホモログ」なる語は、野生型アミノ酸配列および野生型ヌクレオチド配列に対して或る相同性（ホモロジー）を有する実体を意味する。「相同性」なる語は「同一性」と同等でありうる。
この文脈においては、相同配列は、対象配列に対して少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％または９０％同一でありうる、好ましくは少なくとも９５％または９７％または９９％同一でありうるアミノ酸配列を含むとみなされる。典型的には、ホモログは対象アミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。類似性（すなわち、類似した化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関しても相同性が考慮されうるが、本発明の文脈においては、配列同一性に関して相同性を表すことが好ましい。
この文脈においては、相同配列は、対象配列に対して少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％または９０％同一でありうる、好ましくは少なくとも９５％または９７％または９９％同一でありうるヌクレオチド配列を含むとみなされる。類似性に関しても相同性が考慮されうるが、本発明の文脈においては、配列同一性に関して相同性を表すことが好ましい。
相同性比較は、目により、またはより通常には、容易に利用可能な配列比較プログラムの補助により行われうる。これらの商業的に入手可能なコンピュータプログラムは２以上の配列の間の相同性または同一性の割合（％）を計算しうる。
相同性の割合（％）は連続的アミノ酸にわたって計算されうる。すなわち、一方の配列を他方の配列とアライメント（整列）し、一方の配列における各アミノ酸を他方の配列における対応アミノ酸と、１残基ごとに同時に、直接的に比較する。これは「非ギャップ化（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アライメントと称される。典型的には、そのような非ギャップ化アライメントは比較的短い残基数のみにわたって行われる。
これは非常に簡単で一貫した方法であるが、それは例えば以下のような場合を考慮していない。すなわち、ヌクレオチド配列において１つの挿入または欠失が存在する場合、それが存在しなければ同一ペアである配列において、該挿入または欠失は、後続コドンの、アライメントからの脱落を引き起こして、グローバルアライメントが行われた場合に相同性（％）における大きな減少を潜在的に引き起こしうる。したがって、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアを過度に不利にすることなく、考えられうる挿入および欠失を考慮した最適アライメントを与えるように設計される。これは、局所的相同性（ローカルホモロジー）を最大にすることを試みるために配列アライメント内に「ギャップ」を挿入することにより達成される。
しかし、より複雑なこれらの方法は、アライメントにおいて生じる各ギャップに「ギャップ・ペナルティ」を割り当てるものであり、この場合、同一アミノ酸の数が同じとなる場合、可能な限り少ないギャップを有する配列アライメント（これは、それらの２つの比較配列間の、より高い関連性を反映する）が、多数のギャップを有するものより高いスコアを得る。「アフィン・ギャップ・コスト（ａｆｆｉｎｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ）」は典型的に用いられ、これは、ギャップの存在に関しては比較的高いコストを課し、ギャップにおける各後続残基に関しては、より小さいペナルティを課すものである。これは、最もよく用いられるギャップ・スコア化（スコアリング）法である。高いギャップ・ペナルティは、もちろん、より少数のギャップを有する最適化アライメントを与えるであろう。ほとんどのアライメントプログラムは、ギャップペナルティが修飾されることを可能にする。しかし、そのようなソフトウェアを配列比較に使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列に関するデフォルト・ギャップ・ペナルティはギャップに関しては−１２であり、各伸長に関しては−４である。
したがって、最大相同性（％）の計算は、まず、ギャップ・ペナルティを考慮した最適アライメントの生成を要する。そのようなアライメントを行うための適当なコンピュータプログラムとしては、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）が挙げられる。配列比較を行いうる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９９） 前掲−Ｃｈ．１８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールスイートが含まれるが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは共に、オフラインおよびオンライン検索のために利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９９）前掲，ｐ．７−５８〜７−６０を参照されたい）。しかし、幾つかのアプリケーションに関しては、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと称されるもう１つのツールも、タンパク質およびヌクレオチド配列の比較のために利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ（１９９９）１７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ（１９９９）１７７（１）：１８７−８を参照されたい）。
最終的な相同性（％）は同一性に関して測定されうるが、アライメントプロセス自体は、典型的には、オール・オア・ナッシング（全か無か）のペア比較に基づくものではない。実際には、化学的類似性または進化距離に基づいて各ペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケール化（ｓｃａｌｅｄ）類似性スコアマトリックスが一般に使用される。一般に使用されるそのようなマトリックス（行列）の一例は、ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルトマトリックスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、公的デフォルト値またはカスタム記号比較表（提供されている場合）を使用する（更なる詳細は使用マニュアルを参照されたい）。幾つかのアプリケーションに関しては、ＧＣＧパッケージには公的デフォルト値を、あるいは他のソフトウェアの場合にはデフォルトマトリックス、例えばＢＬＯＳＵＭ６２を使用することが好ましい。
該ソフトウェアが最適アライメントを一旦生成したら、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）を計算することが可能である。該ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一部としてこれを行い、数的結果を与える。
「断片」も変異体であり、この語は、典型的には、機能的に又はアッセイにおいて関心が持たれるポリペプチドまたはポリヌクレオチドの選択された領域を意味する。したがって、「断片」は、完全長ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部であるアミノ酸または核酸配列を意味する。
そのような変異体は、標準的な組換えＤＮＡ技術、例えば部位特異的突然変異誘発を用いて製造されうる。挿入を行いたい場合には、該挿入の両側の天然に存在する配列に対応する５’および３’隣接（フランキング）領域と共に該挿入をコードする合成ＤＮＡが作製されうる。該隣接領域は、天然に存在する配列内の部位に対応する簡便な制限部位を含有しており、その結果、該配列は適当な酵素で切断され、該合成ＤＮＡは該切断物内に連結されうる。ついで該ＤＮＡは本発明に従い発現されてコード化タンパク質を与える。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作のための当技術分野で公知の多数の標準的な技術の単なる例示に過ぎず、他の公知技術も使用されうる。
本発明のＲＮＡ結合タンパク質の全ての変異体、断片またはホモログは、ＮＯＩの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または予防されるように本発明の同族（コグネイト）結合部位に結合する能力を保有する。
本発明の結合部位の全ての変異体断片またはホモログは、ＮＯＩの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または予防されるように同族ＲＮＡ結合タンパク質に結合を能力を保有する。
コドン最適化
本発明において使用されるポリヌクレオチド（ＮＯＩおよび／またはベクター産生系の成分を含む）はコドンが最適化されうる。コドン最適化はＷＯ １９９９／４１３９７およびＷＯ ２００１／７９５１８に既に記載されている。細胞が異なれば、個々のコドンの該細胞の使用頻度も異なる。このコドン偏向は細胞型における個々のｔＲＮＡの相対存在量における偏向に対応する。配列内のコドンを、対応ｔＲＮＡの相対存在量に合致するようにそれが調整されるように変化させることにより、発現を増強することが可能である。同様に、対応ｔＲＮＡが個々の細胞型において稀有であることが知られているコドンを意図的に選択することにより発現を低減することが可能である。このように、翻訳制御度の付加が利用可能である。
ＨＩＶおよび他のレンチウイルスを含む多数のウイルスは多数の稀有コドンを利用しており、一般的に利用される哺乳類コドンに一致するようにこれらを変化させることにより、関心のある遺伝子、例えばＮＯＩまたはパッケージング成分の、哺乳類プロデューサー細胞内の発現の増強が達成されうる。コドン使用頻度表は哺乳類細胞および種々の他の生物に関して当技術分野で公知である。
ウイルスベクター成分のコドン最適化は多数の他の利点を有する。それらの配列の改変により、プロデューサー細胞／パッケージング細胞におけるウイルス粒子の構築に要求されるウイルス粒子のパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列において、それらからＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）が除去される。同時に、パッケージング成分のアミノ酸配列コード化配列は保有されており、その結果、該配列によってコードされるウイルス成分は同じままであり、またはパッケージング成分の機能が損なわれない程度に少なくとも十分に類似したままである。レンチウイルスベクターにおいては、コドン最適化は輸出のためのＲｅｖ／ＲＲＥの必要性を克服して、最適化配列をＲｅｖ非依存的にする。コドン最適化はベクター系内の種々の構築物間（例えば、ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖオープンリーディングフレームにおける重複領域間）の相同組換えをも低減する。したがって、コドン最適化の全体的な効果はウイルス力価の顕著な増加および安全性の改善である。
１つの実施形態においては、ＩＮＳに関連したコドンのみがコドン最適化される。しかし、遥かに好ましく実用的な実施形態においては、幾つかの例外、例えば、ｇａｇ−ｐｏｌのフレームシフト部位を含む配列を除き（後記を参照されたい）、該配列はそれらの全体においてコドン最適化される。
ｇｇａ−ｐｏｌ遺伝子は、ｇａｇ−ｐｏｌタンパク質をコードする２つの重複したリーディングフレームを含む。両方のタンパク質の発現は翻訳中のフレームシフトに依存している。このフレームシフトは翻訳中のリボソーム「スリッページ」の結果として生じる。このスリッページは少なくとも部分的にはリボソーム停止（ｓｔａｌｌｉｎｇ）ＲＮＡ二次構造により引き起こされると考えられている。そのような二次構造はｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子におけるフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶの場合、重複領域はｇａｇの開始位置の下流のヌクレオチド１２２２（ここで、ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）からｇａｇの終結位置（ｎｔ１５０３）まで伸長している。したがって、フレームシフト部位およびそれらの２つのリーディングフレームの重複領域にわたる２８１ｂｐの断片は、好ましくは、コドン最適化されない。この断片の保有は、Ｇａｇ−Ｐｏｌタンパク質の、より効率的な発現を可能にするであろう。
ＥＩＡＶの場合には、重複の開始位置はｎｔ１２６２（ここで、ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）に位置するとみなされている。該重複の終結位置は１４６１ｂｐに位置する。該フレームシフト部位およびｇａｇ−ｐｏｌ重複が維持されることを保証するために、野生型配列はｎｔ１１５６から１４６５まで保持されている。
最適コドン使用頻度からの誘導体化が、例えば、簡便な制限部位を収容するために実施可能であり、保存的アミノ酸変化がＧａｇ−Ｐｏｌタンパク質内に導入されうる。
１つの実施形態においては、コドン最適化は、軽度に発現される哺乳類遺伝子に基づく。第３の塩基、そして時には第２および第３の塩基が改変されうる。
遺伝暗号の縮重性ゆえに、多数のｇａｇ−ｐｏｌ配列が当業者により得られうると理解されるであろう。また、コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ配列を作製するための出発点として使用されうる多数のレトロウイルス変異体が記載されている。レンチウイルスゲノムは非常に可変性でありうる。例えば、尚も機能的であるＨＩＶ−１の多数の擬似種が存在する。これはＥＩＡＶにも当てはまる。これらの変異体は、導入プロセスの特定の部分を増強するために使用されうる。ＨＩＶ−１変異体の例は、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖにおけるＬｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ，ＬＬＣにより運営されているＨＩＶ Ｄａｔａｂａｓｅｓにおいて見出されうる。ＥＩＡＶクローンの詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおけるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースにおいて見出されうる。
コドン最適化ｇａｇ−ｐｏｌ配列に関する戦略は任意のレトロウイルスに関して用いられうる。これは、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含む全てのレンチウイルスに適用されるであろう。また、この方法は、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶおよびヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶおよび他のレトロウイルスからの遺伝子の発現を増強するために使用されうるであろう。
コドン最適化はｇａｇ−ｐｏｌ発現をＲｅｖ非依存的にしうる。しかし、レンチウイルスベクターにおける抗ｒｅｖまたはＲＲＥ因子の使用を可能にするためには、ウイルスベクター産生系を完全にＲｅｖ／ＲＲＥ非依存的にすることが必要であろう。したがって、ゲノムが修飾されることも必要である。これは、ベクターゲノム成分を最適化することにより達成される。好都合なことに、これらの修飾はまた、プロデューサー細胞および導入細胞の両方において全ての追加的タンパク質が存在しない、より安全な系の産生をもたらす。
用途
本発明のもう１つの態様は、医薬品における使用のための、本発明のウイルスベクターまたは本発明のウイルスベクターが導入された細胞もしくは組織に関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明のウイルスベクターまたは本発明のウイルスベクターが導入された細胞もしくは組織の、医薬品における使用に関する。
本発明のもう１つの態様は、関心のあるヌクレオチドをそれを要する標的部位に送達するための医薬の製造のための、本発明のウイルスベクター、本発明の産生細胞、または本発明のウイルスベクターが導入された細胞もしくは組織の使用に関する。
本発明のウイルスベクターまたは導入細胞のそのような使用は、既に記載されているとおり、治療目的または診断目的のためのものでありうる。
治療用ベクター
レトロウイルス治療用ベクター
１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、パーキンソン病を治療するために、ドーパミン合成経路の３つの酵素をコードする３つの遺伝子を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ＊）遺伝子のトランケート化形態（これは、ＴＨのフィードバック調節に関与するＮ末端の１６０アミノ酸を欠いている）、ヒト芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）およびヒトＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ＣＨ１）遺伝子を含みうる。それらの３つの酵素は３つの別々のオープンリーディングフレームにおいてレトロウイルスベクターによりコードされうる。あるいは、該レトロウイルスベクターは第１オープンリーディングフレームにおけるＴＨおよびＣＨ１酵素ならびに第２オープンリーディングフレームにおけるＡＡＤＣ酵素の融合体をコードしうる。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターにより駆動可能であり、発現カセットは１以上のＩＲＥＳ要素を含みうる。該レトロウイルスベクターは直接注射により脳の線条体内に投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、光受容体および支持網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に矯正用ＭＹＯ７Ａ遺伝子を導入し、それにより、アッシャー（Ｕｓｈｅｒ）１Ｂ症候群に関連した視力の悪化を軽減または逆転させるために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡであり、これはＭＹＯ７Ａタンパク質（長さが１００ｍｂを超える大きな遺伝子）をコードしている。この大きなＭＹＯ７Ａ遺伝子の発現はＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ／ＭＹＯ７Ａキメラプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正用ＡＴＰ結合カセット遺伝子ＡＢＣＡ４（ＡＢＣＲとしても公知である）を光受容体に導入し、それにより、シュタルガルト病を招く病態生理を軽減または逆転させるために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＡＢＣＡ４ ｃＤＮＡであり、これはＡＢＣＡ４タンパク質をコードしている。ＡＢＣＡ４遺伝子の発現はＣＭＶプロモーター、光受容体特異的プロモーター、例えばロドプシンキナーゼまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、湿潤型（ｗｅｔ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者の眼における異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならびに／または乾燥型（ｄｒｙ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異常な血管増殖を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このレトロウイルスベクターは、抗血管新生タンパク質、例えばアンジオスタチンおよび／またはエンドスタチンをコードする遺伝子を送達する。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。１つの実施形態においては、該レトロウイルスベクターは、網膜色素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）配置でヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子を発現する。該抗血管新生遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、湿潤型（ｗｅｔ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における浮腫における異常な血管増殖の再発を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このレトロウイルスベクターは、抗血管新生タンパク質、例えばアンジオスタチンおよび／またはエンドスタチンをコードする遺伝子を送達する。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。１つの実施形態においては、該レトロウイルスベクターは、網膜色素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配置でヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子を発現する。該抗血管新生遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、移植前のドナー角膜への抗血管新生遺伝子の送達により、血管新生の結果としての角膜移植片拒絶を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇ、エボラまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。１つの実施形態においては、該レトロウイルスベクターは、角膜移植片へのエクスビボ送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配置で抗血管新生遺伝子、例えばヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子を発現する。該レトロウイルスベクターは角膜移植組織にエクスビボで適用可能であり、導入ドナー組織は移植前に貯蔵されることも可能である。該抗血管新生遺伝子の発現は構成的プロモーター、例えばＣＭＶプロモーターにより駆動可能であるが、代替的プロモーターを使用することも可能である。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、湿潤型（ｗｅｔ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者の眼における異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならびに／または乾燥型（ｄｒｙ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異常な血管増殖を予防するために設計された遺伝子治療として使用されうる。このレトロウイルスベクターは、ｆｍｓ様チロシンキナーゼの可溶性形態（可溶性Ｆｌｔ−１）をコードする遺伝子を送達する。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。可溶性Ｆｌｔ−１遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、湿潤型（ｗｅｔ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者の眼における異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならびに／または乾燥型（ｄｒｙ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異常な血管増殖を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このレトロウイルスベクターは、色素上皮由来因子タンパク質（ＰＥＤＦ）をコードする遺伝子を送達する。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。ＰＥＤＦ遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、湿潤型（ｗｅｔ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者の眼における異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならびに／または乾燥型（ｄｒｙ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異常な血管増殖を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このレトロウイルスベクターは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のインヒビター、例えば抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその結合性フラグメント、ＶＥＧＦ特異的アプタマーまたはＶＥＧＦ遮断性ペプチドもしくはポリペプチド、限定的なものではないが例えばＶＥＧＦ受容体の可溶性形態、および／または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のインヒビター、例えば抗ＰＤＧＦ抗体もしくはその結合性フラグメント、ＰＤＧＦ特異的アプタマーまたはＰＤＧＦ遮断性ペプチドもしくはポリペプチド、限定的なものではないが例えばＰＤＧＦ受容体の可溶性形態をコードする遺伝子を送達する。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。１つの実施形態においては、該レトロウイルスベクターは、網膜色素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配置でＶＥＧＦのインヒビターおよびＰＤＧＦのインヒビターを発現する。該遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正用遺伝子卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）およびＶＭＤ２の疾患関連形態に特異的なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードするカセット、または矯正用ペリフェリン２コード化ＲＤＳ遺伝子およびＲＤＳの疾患関連形態に特異的なｍｉＲＮＡをコードするカセットを、網膜色素上皮細胞に導入し、それにより、ベスト病またはベスト卵黄様黄斑変性（ＢＶＭＤ）を招く病態生理を軽減または逆転させるために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正用レチンアルデヒド結合タンパク質１遺伝子ＲＬＢＰ１を網膜色素上皮細胞に導入し、それにより、ＲＬＢＰ１関連網膜ジストロフィーを招く病態生理を軽減または逆転させるために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＲＬＢＰ１ ｃＤＮＡであり、これはＲＬＢＰ１タンパク質をコードしている。ＲＬＢＰ１遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、緑内障を治療するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このレトロウイルスベクターは、眼圧を低下させるように作用するＣＯＸ−２および／またはプロスタグランジンＦ２α受容体（ＦＰＲ）をコードする遺伝子を送達する。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。１つの実施形態においては、該レトロウイルスベクターは、眼の前房への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配置でＣＯＸ−２およびプロスタグランジンＦ２α受容体（ＦＰＲ）遺伝子を発現する。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動されうる。該レトロウイルスベクターは経角膜注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、アッシャー（Ｕｓｈｅｒ）１ｃを招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用ホルモニン（ｈｏｒｍｏｎｉｎ）遺伝子を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はホルモニンｃＤＮＡであり、これはホルモニンタンパク質をコードしている。ホルモニン遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、コロイデレミアを招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用Ｒａｂエスコート（ｅｓｃｏｒｔ）タンパク質１（ＲＥＰ１）遺伝子を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＲＥＰ１ ｃＤＮＡであり、これはＲＥＰ１タンパク質をコードしている。ＲＥＰ１遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、色盲を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用環状ヌクレオチド感受性チャネルベータ２（ＣＮＧＢ２）および／または環状ヌクレオチド感受性チャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）遺伝子を眼内に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＣＮＧＢ２および／またはＣＮＧＡ３遺伝子であり、これらはＣＮＧＢ２および／またはＣＮＧＡ３タンパク質をコードしている。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用ＣＥＰ２９０遺伝子を眼内に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＣＥＰ２９０遺伝子であり、これは２９０ｋＤａの中心体タンパク質をコードしている。ＣＥＰ２９０遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、Ｘ連鎖網膜色素変性を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用網膜色素変性ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＰＧＲ）遺伝子を眼内に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＲＰＧＲ ｃＤＮＡであり、これはＲＰＧＲタンパク質をコードしている。ＲＰＧＲ遺伝子の発現はＣＭＶプロモータまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、Ｘ連鎖網膜分離症を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用レチノスキシン１（ＲＳ１）遺伝子を眼内に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＲＳ１ ｃＤＮＡであり、これはＲＳ１タンパク質をコードしている。ＲＳ１遺伝子の発現はＣＭＶプロモータまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、網膜色素変性を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用網膜色素変性１（ＲＰ１）遺伝子を眼内に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＲＰ１ ｃＤＮＡであり、これはＲＰ１タンパク質をコードしている。ＲＰ１遺伝子の発現はＣＭＶプロモータ、光受容体特異的プロモーター、例えばロドプシンキナーゼまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）２型を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）遺伝子を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＲＰＥ６５ ｃＤＮＡであり、これはＲＰＥ６５タンパク質をコードしている。ＲＰＥ６５遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、湿潤型（ｗｅｔ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、乾燥型（ｄｒｙ−ｆｏｒｍ）ＡＭＤ、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用ヒトプロリン／アルギニンリッチ末端ロイシンリッチ反復タンパク質（ＰＲＥＬＰ；ｐｒｏｌｉｎｅ／ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｅｎｄ ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＰＲＥＬＰ ｃＤＮＡであり、これはＰＲＥＬＰタンパク質をコードしている。ＰＲＥＬＰ遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ミオシリンの発現をノックダウンすることにより若年性開放隅角緑内障を招く病態生理を軽減または逆転させるために、合成ミオシリン特異的ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を眼内に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。合成ミオシリン特異的ｍｉＲＮＡの発現はＣＭＶプロモータまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、遺伝子増強および／またはノックダウンにより網膜色素変性を招く病態生理を軽減または逆転させるために、グルタチオン生合成経路からの律速性酵素、グルタミン酸−システインリガーゼ（ＧＣＬ）および／またはグルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）、および／または合成ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）特異的ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を眼内に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうる、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。ＧＣＬおよび／またはＧＳＳ遺伝子および／または合成ＧＧＴ特異的ｍｉＲＮＡの発現はＣＭＶプロモータまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。１つの実施形態においては、該レトロウイルスベクターは、１以上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してマルチシストロン配置で該遺伝子および／または該合成ｍｉＲＮＡを発現しうる。該レトロウイルスベクターは眼の前房への直接送達により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、神経変性障害、例えば前頭側頭葉認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および運動ニューロン障害、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このレトロウイルスベクターは、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム、例えばＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦ１８９でありうる、あるいはＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−ＤでありうるＶＥＧＦタンパク質をコードする遺伝子であって、神経保護作用を有する遺伝子を送達する。該レトロウイルスベクターは、狂犬病（Ｒａｂｉｅｓ）ＧまたはＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該遺伝子の発現はＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは大筋肉群内への直接注射により、または髄腔内もしくは脳室内注射による脳脊髄液内への直接注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、嚢胞性線維症を治療するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このレトロウイルスベクターは、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子を送達する。該レトロウイルスベクターは、Ｆｌｕ−ＨＡ、センダイウイルスエンベロープＦもしくはＨＮ，エボラ、バキュロウイルスＧＰ６４または代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該遺伝子の発現はＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは噴霧器の使用により鼻腔内に、または肺内への気管支肺胞洗浄による直接送達により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、サンフィリポ症候群Ａを招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）および／またはスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）遺伝子を脳内に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうる、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子は、ＳＧＳＨタンパク質をコードするＳＧＳＨ ｃＤＮＡ、および／またはＳＵＭＦ１タンパク質をコードするＳＵＭＦ１遺伝子である。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。１つの実施形態においては、該レトロウイルスベクターは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配置でＳＧＳＨおよびＳＵＭＦ−１遺伝子を発現しうる。該レトロウイルスベクターは直接脳内注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ポンペ病を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用酸−アルファグリコシダーゼ（ＧＡＡ）遺伝子を大筋肉群および／または肺内に導入するために使用されうる。このレトロウイルスベクターは、ＧＡＡタンパク質をコードする遺伝子を送達する。該レトロウイルスベクターは、Ｆｌｕ−ＨＡ、センダイウイルスエンベロープＦもしくはＨＮ，エボラ、バキュロウイルスＧＰ６４、狂犬病Ｇ、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該遺伝子の発現はＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは、（ｉ）大筋肉群内への直接注射により、および／または（ｉｉ）噴霧器の使用により鼻腔内に、または肺内への気管支肺胞洗浄による直接送達により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ＣＤ１９特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ１９）をコードする核酸配列を自己または同種異系Ｔ細胞に導入するためにエクスビボで使用されうる。ついで、これらの導入Ｔ細胞は、ＣＤ１９を発現する癌および白血病を治療するために対象内に注入される。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。ＣＡＲをコードする核酸配列の発現はＥＦ１α、ＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、５Ｔ４特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を自己または同種異系Ｔ細胞に導入するためにエクスビボで使用されうる。ついで、これらの導入Ｔ細胞は、５Ｔ４を発現する癌および白血病を治療するために対象内に注入される。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。５Ｔ４ ＣＡＲをコードする核酸配列の発現はＥＦ１α、ＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
当業者に公知のとおり、ある範囲の癌または白血病関連ポリペプチドに特異的であるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が製造されうる。本発明のレトロウイルスベクターは、いずれかの癌または白血病関連ポリペプチドに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を自己または同種異系Ｔ細胞に導入するためにエクスビボで使用されうる。ついで、これらの導入Ｔ細胞は、ＣＡＲが結合する癌または白血病関連ポリペプチドを発現する癌および白血病を治療するために対象内に注入される。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該ＣＡＲをコードする核酸配列の発現はＥＦ１α、ＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＣＡＲにより標的化されうる適当な癌または白血病関連ポリペプチドには、メソセリン、葉酸受容体α、免疫グロブリンのカッパ軽鎖、ＣＤ３０、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１３８、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＣＤ３３、ＣＤ２２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、例えばＥＧＦＲ ＶＩＩＩ、ＩＬ−１３Ｒα２、ＣＤ２０、ＥｒｂＢ、例えばＨｅｒ２、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ルイスＹ抗原および線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＢ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、罹患白血病または癌細胞上で発現されるペプチド−ＭＨＣに特異的であるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列を自己または同種異系Ｔ細胞に導入するためにエクスビボで使用されうる。ついで、これらの導入Ｔ細胞は、ＴＣＲが結合するペプチド−ＭＨＣの発現に関連した疾患、癌または白血病を治療するために対象内に注入される。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。ＴＣＲをコードする核酸配列の発現はＥＦ１α、ＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。本発明のベクターによりコードされるＴＣＲは一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）または二量体ＴＣＲ（ｄＴＣＲ）でありうる。当業者に公知のとおり、適当なｄＴＣＲには、ＷＯ ２００３／０２０７６３に記載されているものが含まれ、適当なｓｃＴＣＲには、ＷＯ １９９９／０１８１２９に記載されているものが含まれる。この実施形態の特定の態様においては、ＴＣＲでトランスフェクトされたＴ細胞は、骨髄腫および肉腫を含む、エイズ、白血病および癌を治療するために使用されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、Ｘ連鎖重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を治療するために、共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２）をコードする遺伝子を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。本発明のレトロウイルスベクターは、骨髄幹細胞に導入するためにエクスビボで使用されうる。ついで、これらの導入骨髄幹細胞は、該疾患を治療するために対象に注入されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ＡＤＡ重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を治療するために、アデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。本発明のレトロウイルスベクターは、骨髄幹細胞に導入するためにエクスビボで使用されうる。ついで、これらの導入骨髄幹細胞は、該疾患を治療するために対象に注入されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）を治療するために、ＷＡＳタンパク質をコードする遺伝子を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。本発明のレトロウイルスベクターは、骨髄幹細胞に導入するためにエクスビボで使用されうる。ついで、これらの導入骨髄幹細胞は、該疾患を治療するために対象に注入されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、鎌状赤血球症またはサラセミアを治療するために、野生型β−グロビン、野生型胎児グロビンおよび突然変異「抗鎌状」グロビンを含む幾つかのグロブリンの１つをコードする遺伝子を導入するために使用されうる。当業者に公知のとおり、抗鎌状グロビンの例には、ＷＯ ２０１４／０４３１３１およびＷＯ １９９６／００９３８５に記載されているものが含まれるが、これらに限定されるものではない。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。本発明のレトロウイルスベクターは、骨髄幹細胞に導入するためにエクスビボで使用されうる。ついで、これらの導入骨髄幹細胞は、該疾患を治療するために対象に注入されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、血友病Ａを治療するために、矯正用遺伝子第ＶＩＩＩ因子を肝臓、筋肉または脂肪細胞に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子は第ＶＩＩＩ因子である。第ＶＩＩＩ因子遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、血友病Ｂを治療するために、矯正用遺伝子第ＩＸ因子を肝臓、筋肉または脂肪細胞に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子は第ＩＸ因子である。第ＩＸ因子遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ファブリー病を治療するために、アルファガラクトシダーゼＡ（α−ＧＡＬ Ａ）をコードする遺伝子を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＧＬＡ ｃＤＮＡであり、これはα−ＧＡＬ Ａタンパク質をコードしている。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。本発明のレトロウイルスベクターは、造血ＣＤ３４＋幹細胞に導入するためにエクスビボで使用されうる。ついで、これらの導入造血ＣＤ３４＋幹細胞は、該疾患を治療するために対象に注入されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ポルフィリン症の一形態を治療するために、欠損酵素をコードする遺伝子を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子は、以下の表から選択される治療されるポルフィリン症のタイプに関連した欠損酵素をコードする遺伝子である。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
Figure 2017500870
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ムコ多糖症の一形態を治療するために、欠損酵素をコードする遺伝子を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ−Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子は、以下の表から選択される治療されるムコ多糖症のタイプに関連した欠損酵素をコードする遺伝子である。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
Figure 2017500870
Figure 2017500870
レトロウイルス治療用ベクターの製造
本発明のレトロウイルスベクターは以下の４つのプラスミドでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより製造されうる：
（１）ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる結合部位および必要なトランスジーンをコードする組換えレトロウイルスベクターゲノムプラスミド、
（２）合成レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ発現プラスミド、
（３）例えばＶＳＶ−Ｇを発現しうるエンベロープ（ｅｎｖ）発現プラスミド、
（４）ＲＮＡ結合タンパク質発現プラスミド。
あるいは、ＨＩＶのような本発明のレトロウイルスベクターは以下の５つのプラスミドでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより製造されうる：
（１）ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる結合部位、必要なトランスジーンおよびＲＲＥをコードする組換えＨＩＶベクターゲノムプラスミド、
（２）合成レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ発現プラスミド、
（３）例えばＶＳＶ−Ｇを発現しうるエンベロープ（ｅｎｖ）発現プラスミド、
（４）ＲＮＡ結合タンパク質発現プラスミド、
（５）ＲＥＶ発現プラスミド。
あるいは、一過性トランスフェクション系は、本発明のＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）を安定に発現する細胞系を利用しうる。
あるいは、本発明のレトロウイルスベクターは、（１）ｇａｇ／ｐｏｌ、（２）ｅｎｖおよび（３）ＲＮＡ結合タンパク質、そしてＨＩＶベクターの場合にはＲｅｖを安定に発現するパッケージング細胞を使用することにより製造可能であり、ここで、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる結合部位および必要なトランスジーンをコードし、そしてＨＩＶベクターの場合にはＲＲＥ配列を含む組換えレトロウイルスベクターゲノムをコードするプラスミドは、一過性トランスフェクションによりそのような細胞に導入される。
あるいは、本発明のレトロウイルスベクターは、（１）ｇａｇ／ｐｏｌ、（２）ｅｎｖ、（３）ＲＮＡ結合タンパク質、（４）ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる結合部位および必要なトランスジーンをコードする組換えＥＩＡＶベクターゲノムを安定に発現するプロデューサー細胞において製造されうる。
あるいは、本発明のＨＩＶベクターは、（１）ｇａｇ／ｐｏｌ、（２）ｅｎｖ、（３）ＲＮＡ結合タンパク質、（４）ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる結合部位、必要なトランスジーンおよびＲＲＥ配列をコードする組換えＨＩＶベクターゲノム、ならびに（５）ＲＥＶを安定に発現するプロデューサー細胞において製造されうる。
ＡＡＶ治療用ベクター
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、パーキンソン病を治療するために、ドーパミン合成経路の３つの酵素をコードする３つの遺伝子を導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はヒトチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ＊）遺伝子のトランケート化形態（これは、ＴＨのフィードバック調節に関与するＮ末端の１６０アミノ酸を欠いている）、ヒト芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）およびヒトＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ＣＨ１）遺伝子を含みうる。それらの３つの酵素は３つの別々のオープンリーディングフレームにおいてＡＡＶベクターによりコードされうる。あるいは、該ＡＡＶベクターは第１オープンリーディングフレームにおけるＴＨおよびＣＨ１酵素ならびに第２オープンリーディングフレームにおけるＡＡＤＣ酵素の融合体をコードしうる。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターにより駆動可能であり、発現カセットは１以上のＩＲＥＳ要素を含みうる。該ＡＡＶベクターは直接注射により脳の線条体内に投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、光受容体および支持網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に矯正用ＭＹＯ７Ａ遺伝子を導入し、それにより、アッシャー（Ｕｓｈｅｒ）１Ｂ症候群に関連した視力の悪化を軽減または逆転させるために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡであり、これはＭＹＯ７Ａタンパク質（長さが１００ｍｂを超える大きな遺伝子）をコードしている。この大きなＭＹＯ７Ａ遺伝子の発現はＣＭＶプロモーター、ＣＭＶ／ＭＹＯ７Ａキメラプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、矯正用ＡＴＰ結合カセット遺伝子ＡＢＣＡ４（ＡＢＣＲとしても公知である）を光受容体に導入し、それにより、シュタルガルト病を招く病態生理を軽減または逆転させるために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＡＢＣＡ４ ｃＤＮＡであり、これはＡＢＣＡ４タンパク質をコードしている。ＡＢＣＡ４遺伝子の発現はＣＭＶプロモーター、光受容体特異的プロモーター、例えばロドプシンキナーゼまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、湿潤型（ｗｅｔ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者の眼における異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならびに／または乾燥型（ｄｒｙ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異常な血管増殖を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このＡＡＶベクターは、抗血管新生タンパク質、例えばアンジオスタチンおよび／またはエンドスタチンをコードする遺伝子を送達する。１つの実施形態においては、該ＡＡＶベクターは、網膜色素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配置でヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子を発現する。該抗血管新生遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、移植前のドナー角膜への抗血管新生遺伝子の送達により、血管新生の結果としての角膜移植片拒絶を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。１つの実施形態においては、該ＡＡＶベクターは、角膜移植片へのエクスビボ送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配置で抗血管新生遺伝子、例えばヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子を発現する。該ＡＡＶベクターは角膜移植組織にエクスビボで適用可能であり、導入ドナー組織は移植前に貯蔵されることも可能である。該抗血管新生遺伝子の発現は構成的プロモーター、例えばＣＭＶプロモーターにより駆動可能であるが、代替的プロモーターを使用することも可能である。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、湿潤型（ｗｅｔ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者の眼における異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならびに／または乾燥型（ｄｒｙ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異常な血管増殖を予防するために設計された遺伝子治療として使用されうる。このＡＡＶベクターは、ｆｍｓ様チロシンキナーゼの可溶性形態（可溶性Ｆｌｔ−１）をコードする遺伝子を送達する。可溶性Ｆｌｔ−１遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、湿潤型（ｗｅｔ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者の眼における異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならびに／または乾燥型（ｄｒｙ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異常な血管増殖を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このＡＡＶベクターは、色素上皮由来因子タンパク質（ＰＥＤＦ）をコードする遺伝子を送達する。ＰＥＤＦ遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、湿潤型（ｗｅｔ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者の眼における異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならびに／または乾燥型（ｄｒｙ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異常な血管増殖を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このＡＡＶベクターは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のインヒビター、例えば抗ＶＥＧＦ抗体もしくはその結合性フラグメント、ＶＥＧＦ特異的アプタマーまたはＶＥＧＦ遮断性ペプチドもしくはポリペプチド、限定的なものではないが例えばＶＥＧＦ受容体の可溶性形態、および／または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のインヒビター、例えば抗ＰＤＧＦ抗体もしくはその結合性フラグメント、ＰＤＧＦ特異的アプタマーまたはＰＤＧＦ遮断性ペプチドもしくはポリペプチド、限定的なものではないが例えばＰＤＧＦ受容体の可溶性形態をコードする遺伝子を送達する。１つの実施形態においては、該ＡＡＶベクターは、網膜色素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配置でＶＥＧＦのインヒビターおよびＰＤＧＦのインヒビターを発現する。該遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、矯正用遺伝子卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）およびＶＭＤ２の疾患関連形態に特異的なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードするカセット、または矯正用ペリフェリン２コード化ＲＤＳ遺伝子およびＲＤＳの疾患関連形態に特異的なｍｉＲＮＡをコードするカセットを、網膜色素上皮細胞に導入し、それにより、ベスト病またはベスト卵黄様黄斑変性（ＢＶＭＤ）を招く病態生理を軽減または逆転させるために使用されうる。該遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、矯正用レチンアルデヒド結合タンパク質１遺伝子ＲＬＢＰ１を網膜色素上皮細胞に導入し、それにより、ＲＬＢＰ１関連網膜ジストロフィーを招く病態生理を軽減または逆転させるために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＲＬＢＰ１ ｃＤＮＡであり、これはＲＬＢＰ１タンパク質をコードしている。ＲＬＢＰ１遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、緑内障を治療するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このＡＡＶベクターは、眼圧を低下させるように作用するＣＯＸ−２および／またはプロスタグランジンＦ２α受容体（ＦＰＲ）をコードする遺伝子を送達する。１つの実施形態においては、該ＡＡＶベクターは、眼の前房への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配置でＣＯＸ−２およびプロスタグランジンＦ２α受容体（ＦＰＲ）遺伝子を発現する。該遺伝子の発現はＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動されうる。該ＡＡＶベクターは経角膜注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、アッシャー（Ｕｓｈｅｒ）１ｃを招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用ホルモニン（ｈｏｒｍｏｎｉｎ）遺伝子を導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はホルモニンｃＤＮＡであり、これはホルモニンタンパク質をコードしている。ホルモニン遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、コロイデレミアを招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用Ｒａｂエスコート（ｅｓｃｏｒｔ）タンパク質１（ＲＥＰ１）遺伝子を導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＲＥＰ１ ｃＤＮＡであり、これはＲＥＰ１タンパク質をコードしている。ＲＥＰ１遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、色盲を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用環状ヌクレオチド感受性チャネルベータ２（ＣＮＧＢ２）および／または環状ヌクレオチド感受性チャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）遺伝子を眼内に導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＣＮＧＢ２および／またはＣＮＧＡ３遺伝子であり、これらはＣＮＧＢ２および／またはＣＮＧＡ３タンパク質をコードしている。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用ＣＥＰ２９０遺伝子を眼内に導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＣＥＰ２９０遺伝子であり、これは２９０ｋＤａの中心体タンパク質をコードしている。ＣＥＰ２９０遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、Ｘ連鎖網膜色素変性を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用網膜色素変性ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＰＧＲ）遺伝子を眼内に導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＲＰＧＲ ｃＤＮＡであり、これはＲＰＧＲタンパク質をコードしている。ＲＰＧＲ遺伝子の発現はＣＭＶプロモータまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、Ｘ連鎖網膜分離症を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用レチノスキシン１（ＲＳ１）遺伝子を眼内に導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＲＳ１ ｃＤＮＡであり、これはＲＳ１タンパク質をコードしている。ＲＳ１遺伝子の発現はＣＭＶプロモータまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、網膜色素変性を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用網膜色素変性１（ＲＰ１）遺伝子を眼内に導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＲＰ１ ｃＤＮＡであり、これはＲＰ１タンパク質をコードしている。ＲＰ１遺伝子の発現はＣＭＶプロモータ、光受容体特異的プロモーター、例えばロドプシンキナーゼまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）２型を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）遺伝子を導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＲＰＥ６５ ｃＤＮＡであり、これはＲＰＥ６５タンパク質をコードしている。ＲＰＥ６５遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶは、湿潤型（ｗｅｔ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、乾燥型（ｄｒｙ−ｆｏｒｍ）ＡＭＤ、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用ヒトプロリン／アルギニンリッチ末端ロイシンリッチ反復タンパク質（ＰＲＥＬＰ；ｐｒｏｌｉｎｅ／ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｅｎｄ ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＰＲＥＬＰ ｃＤＮＡであり、これはＰＲＥＬＰタンパク質をコードしている。ＰＲＥＬＰ遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、ミオシリンの発現をノックダウンすることにより若年性開放隅角緑内障を招く病態生理を軽減または逆転させるために、合成ミオシリン特異的ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を眼内に導入するために使用されうる。合成ミオシリン特異的ｍｉＲＮＡの発現はＣＭＶプロモータまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、遺伝子増強および／またはノックダウンにより網膜色素変性を招く病態生理を軽減または逆転させるために、グルタチオン生合成経路からの律速性酵素、グルタミン酸−システインリガーゼ（ＧＣＬ）および／またはグルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）、および／または合成ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）特異的ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を眼内に導入するために使用されうる。ＧＣＬおよび／またはＧＳＳ遺伝子および／または合成ＧＧＴ特異的ｍｉＲＮＡの発現はＣＭＶプロモータまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。１つの実施形態においては、該ＡＡＶベクターは、１以上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してマルチシストロン配置で該遺伝子および／または該合成ｍｉＲＮＡを発現しうる。該ＡＡＶベクターは眼の前房への直接送達により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、神経変性障害、例えば前頭側頭葉認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および運動ニューロン障害、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このＡＡＶベクターは、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム、例えばＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦ１８９でありうる、あるいはＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−ＤでありうるＶＥＧＦタンパク質をコードする遺伝子であって、神経保護作用を有する遺伝子を送達する。該遺伝子の発現はＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは大筋肉群内への直接注射により、または髄腔内もしくは脳室内注射による脳脊髄液内への直接注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症を治療するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子を送達する。該遺伝子の発現はＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは噴霧器の使用により鼻腔内に、または肺内への気管支肺胞洗浄による直接送達により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、サンフィリポ症候群Ａを招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）および／またはスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）遺伝子を脳内に導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子は、ＳＧＳＨタンパク質をコードするＳＧＳＨ ｃＤＮＡ、および／またはＳＵＭＦ１タンパク質をコードするＳＵＭＦ１遺伝子である。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。１つの実施形態においては、該ＡＡＶベクターは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配置でＳＧＳＨおよびＳＵＭＦ−１遺伝子を発現しうる。該ＡＡＶベクターは直接脳内注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、ポンペ病を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用酸−アルファグリコシダーゼ（ＧＡＡ）遺伝子を大筋肉群および／または肺内に導入するために使用されうる。このＡＡＶベクターは、ＧＡＡタンパク質をコードする遺伝子を送達する。該遺伝子の発現はＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは、（ｉ）大筋肉群内への直接注射により、および／または（ｉｉ）噴霧器の使用により鼻腔内に、または肺内への気管支肺胞洗浄による直接送達により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、血友病Ａを治療するために、矯正用遺伝子第ＶＩＩＩ因子を肝臓、筋肉または脂肪細胞に導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子は第ＶＩＩＩ因子である。第ＶＩＩＩ因子遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、血友病Ｂを治療するために、矯正用遺伝子第ＩＸ因子を肝臓、筋肉または脂肪細胞に導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子は第ＩＸ因子である。第ＩＸ因子遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、ポルフィリン症の一形態を治療するために、欠損酵素をコードする遺伝子を導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子は、以下の表から選択される治療されるポルフィリン症のタイプに関連した欠損酵素をコードする遺伝子である。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
Figure 2017500870
Figure 2017500870
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、ムコ多糖症の一形態を治療するために、欠損酵素をコードする遺伝子を導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子は、以下の表から選択される治療されるムコ多糖症のタイプに関連した欠損酵素をコードする遺伝子である。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
Figure 2017500870
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、湿潤型（ｗｅｔ−ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における浮腫における異常な血管増殖の再発を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このＡＡＶベクターは、抗血管新生タンパク質、例えばアンジオスタチンおよび／またはエンドスタチンをコードする遺伝子を送達する。１つの実施形態においては、該ＡＡＶベクターは、網膜色素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配置でヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子を発現する。該抗血管新生遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、神経変性障害、例えば前頭側頭葉認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および運動ニューロン障害、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このＡＡＶベクターは、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム、例えばＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦ１８９でありうる、あるいはＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−ＤでありうるＶＥＧＦタンパク質をコードする遺伝子であって、神経保護作用を有する遺伝子を送達する。該遺伝子の発現はＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは、髄腔内もしくは脳室内注射による、脊髄を浸す脳脊髄液内への直接注射により投与されうる。
治療方法
本発明のもう１つの態様は、本発明のウイルスベクターを、または本発明のウイルスベクターが導入された細胞を、それを要する対象に投与することを含む治療方法に関する。
本明細書における治療に対する全ての言及は、治癒的、対症療法的および予防的治療を含むと理解されるべきである。尤も、本発明の文脈においては、予防（阻止）に対する言及は、より一般的には、予防的治療に関連したものである。治療は、予防または疾患進行の減速（遅延）をも含む。哺乳動物の治療が特に好ましい。ヒトに対する治療および獣医学的治療は共に本発明の範囲内である。
１つの実施形態においては、本発明のウイルスベクターまたはウイルスベクター粒子はワクチンとしての使用のためのものでありうる。該ワクチンは、例えば、ヒト用または獣医学用の、ウイルスに基づくワクチン（例えば、インフルエンザおよびニューカッスル病ウイルスワクチン）でありうる。
ワクチンが、トランスジーンを保持する修飾されたコンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ウイルスである場合に、本発明は特に有用でありうる。
前記のとおり、ワクチンとしての使用のためのウイルスベクターおよびウイルスベクター粒子の製造においては、トリ産生細胞が使用されうる。
医薬組成物
本発明のもう１つの態様は、本発明のウイルスベクターを、または本発明のウイルスベクターが導入された細胞もしくは組織を、医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物に関する。
本発明は、遺伝子治療により個体を治療するための医薬組成物を提供し、ここで、該組成物はベクターの治療的有効量を含む。
該組成物は、医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバント（補助剤）を含みうる。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な医薬慣例に基づいて行われうる。該医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤を、あるいはそれらに加えて、いずれかの適当な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤、および標的部位内へのベクターの進入を補助または増進しうる他の担体物質（例えば、リピッド（脂質）デリバリーシステム）を含みうる。
適当な場合には、該組成物は以下のいずれかの１以上により投与されうる：吸入；坐剤またはペッサリーの形態；ローション剤、溶液（水剤）、クリーム剤、軟膏剤または散布剤の形態で局所的に；皮膚パッチの使用により；賦形剤、例えばデンプンまたはラクトースを含有する錠剤の形態で、あるいは単独での又は賦形剤と混合されたカプセル剤または胚珠状物（ｏｖｕｌｅ）において、あるいは香味または着色剤を含有するエリキシル剤、溶液（水剤）または懸濁剤の形態で経口的に。あるいは、それらは、非経口的に、例えば海綿体内、静脈内、筋肉内、頭蓋内、眼内または皮下に注射されうる。非経口投与の場合、該組成物は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩または単糖類を含有しうる無菌水溶液の形態で最良に使用されうる。頬側または舌下投与の場合には、該組成物は、通常の方法で製剤化されうる錠剤またはトローチ剤（ロゼンジ）の形態で投与されうる。
本発明のベクターは、エクスビボで、標的細胞または標的組織に導入した後、該標的細胞または組織を、それを要する患者に導入するためにも使用されうる。そのような細胞の一例は自己Ｔ細胞でありうる。そのような組織の一例はドナー角膜でありうる。
スクリーニング方法
本発明のもう１つの態様は、核酸結合部位および／または同族（コグネイト）核酸結合タンパク質を特定する方法に関するものであり、それらは、核酸結合部位に機能的に連結されている場合の関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または予防されるように相互作用することが可能であり、ここで、該方法は、レポーター遺伝子に機能的に連結された核酸結合部位と核酸結合タンパク質との両方を含む細胞において、該レポーター遺伝子の発現を分析することを含む。
該方法は、本発明において有用な新規ＲＮＡ結合タンパク質およびそれらの対応結合部位の特定を可能にしうる。該方法は、既知ＲＮＡ結合タンパク質または結合部位の変異体の特定をも可能にしうる。
１つの実施形態においては、該方法は、ＴＲＡＰと相互作用する結合部位の特定を可能にする。
もう１つの実施形態においては、該方法は、ＴＲＡＰに結合しうる結合部位と相互作用する核酸結合タンパク質の特定を可能にする。
１つの実施形態においては、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質をコードしている。
もう１つの実施形態においては、レポーター遺伝子は、陽性細胞増殖選択マーカー、例えば、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）（ゼオシン）に対する細胞の耐性を可能にするｓｈ ｂｌｅ遺伝子産物をコードしている。
もう１つの実施形態においては、レポーター遺伝子は、陰性細胞増殖選択マーカー、例えば、ガンシクロビル（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）の存在下で細胞死を引き起こすＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子産物をコードしている。
機能性の改善のためのＴＲＡＰ結合部位（ｔｂｓ）のスクリーニングの一例は以下のとおりでありうる。
・配列ＲＡＧＮＮの、８個の反復、またはＲＡＧＮＮおよびＲＡＧＮＮＮの、合計８個の反復を含む縮重ＤＮＡライブラリーを合成する。
・該ライブラリーをＧＦＰのようなレポーター遺伝子カセットの５’ＵＴＲ内（好ましくは、ＯＲＦの１２ヌクレオチド以内）にクローニングする。該ライブラリー連結レポーター遺伝子は、所望により、レトロウイルスベクターゲノム内にクローニングされ、レトロウイルスベクターライブラリーが作製されうる。
・ライブラリー連結レポーター遺伝子カセットを細胞系内に安定に導入し（これはトランスフェクションまたはレトロウイルスベクター送達により達成されうる）、単一クローンを単離する。
・対照ＤＮＡ（例えば、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ）またはＴＲＡＰ発現プラスミドＤＮＡを使用する並行トランスフェクションによりクローンをスクリーニングする。両方のシナリオにおいてレポーター遺伝子発現を測定し、高い非抑制レポーター遺伝子レベル（対照）および低い抑制レポーター遺伝子レベル（ＴＲＡＰ）を示すクローンを特定する。
・候補クローンからの標的細胞ゲノムＤＮＡからのｔｂｓ配列のＰＣＲ増幅および配列決定により配列を特定する。
典型的なレトロウイルスベクター成分を示す図。現在使用されている治療用レトロウイルスベクター系は、それが由来する野生型ウイルスゲノムから高度に操作されている。ガンマ−レトロウイルスベクターは、典型的には、ベクターゲノム、Ｇａｇ／Ｐｏｌおよびエンベロープ発現構築物を要する３または４成分系を使用して製造され、ＨＩＶに基づくレンチウイルスベクターの場合には、アクセサリー遺伝子Ｒｅｖも必要である。ＥＩＡＶに基づくレンチウイルスベクターは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がＲＲＥに取って代わっている場合にはＲｅｖを要さない。ベクターゲノムは、典型的には、パッケージングシグナル（ψ）、ＮＯＩ、（所望により使用されうる）転写後要素（ＰＲＥ）、３’ｐｐｕおよび自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲを要する。ベクターゲノムＲＮＡおよびトランスジーンｍＲＮＡの両方の適切なポリアデニル化ならびに逆転写の過程のためにＲ−Ｕ５領域が必要である。通常、ゲノムカセット内でコードされる「外部」および「内部」の両方のプロモーター（Ｐｒｏ）は、その他のベクター系成分を駆動するものと同様に、強力な真核生物またはウイルスプロモーターである。 ベクターを産生する産生細胞の能力に対するＮＯＩトランスジーン産物の負の影響の規模を決定するためのベクターゲノムプラスミド混合実験を記載する図。ベクターゲノム混合実験において、ベクターパッケージング成分および２つのタイプのベクターゲノムプラスミド（１つのレポーター遺伝子ベクターゲノムプラスミド、および細胞のベクター産生性に対するトランスジーン産物の影響を試験するためのＮＯＩトランスジーンをコードするベクター）での細胞のコトランスフェクションによりベクター粒子を産生させる。ｌａｃＺまたはＧＦＰレポータータンパク質の発現はベクター力価に影響を及ぼさないため、これらは対照ベクターとして使用される。該細胞のベクター産生性に負の影響を及ぼしうるＮＯＩトランスジーンをコードする第２のベクターゲノムプラスミドの導入はｌａｃＺ−ベクター産生にバイスタンダー効果を及ぼすであろう。ＮＯＩトランスジーンの発現は主に内部発現カセットから生じ、これは、典型的には、強力な構成的プロモーターにより駆動される。ビリオン当たり２コピーのベクターゲノムＲＮＡ分子をパッケージングする結果が考えられうること、そしてただ１つのベクターＲＮＡが逆転写され、標的細胞内に組込まれることから、ｌａｃＺ−ベクターと第２のゲノムを混合する希釈効果が存在するであろう。この希釈効果は、比例的に更に多量の第２のゲノムプラスミドがｌａｃＺ−ベクターゲノムプラスミドと混合された場合、より明らかとなる。したがって、第２のベクターゲノムプラスミドがＧＦＰのものである「希釈」対照が要求され、ＧＦＰはベクター力価に負の影響を及ぼさないことも公知である。したがって、ベクター産生性に対する与えられたＮＯＩトランスジーン産物の影響は、ＬａｃＺ：ＧＦＰベクターゲノム混合対照に対して測定されうる。混合実験から産生されたベクターは、典型的には、ｌａｃＺ−ベクターの測定（例えば、ベクター−導入細胞のＸ−ｇａｌ染色）により力価測定される。 図３ｉ．産生中のベクターゲノム混合はベクター力価に対するトランスジーンタンパク質発現の影響を示す。Ａ．ｌａｃＺコード化ベクターゲノム成分を、一過性ベクター産生中に、もう１つのベクターゲノムと１：１または１：５の比で混合し、標的細胞上のＸ−ｇａｌアッセイによりベクター力価に対する影響をアッセイした。ＧＦＰ発現はベクター力価に影響を及ぼさず、したがって、種々の比における力価低減のレベルはｌａｃＺゲノムの希釈のベースライン効果を示す。したがって、ｌａｃＺ力価に対する他のベクタートランスジーンの影響がｌａｃＺ：ＧＦＰ混合物に対して測定されうる。Ｂ．この実験は、ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）、ＳｔａｒＧｅｎ（商標）、ＵｓｈＳｔａｔ（登録商標）およびＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）ゲノムからのトランスジーンタンパク質の効果がベクター力価に７〜１００倍影響を及ぼすことを示している。外部および内部プロモーター要素は共にＣＭＶである。図３ｉｉ．産生中のＣＯＸ２および／またはＦＰＲゲノムならびにｌａｃＺゲノム混合はベクター力価に対するトランスジーンタンパク質発現の影響を示す。ｌａｃＺコード化ベクターゲノム成分を、一過性トランスフェクションベクター産生中に、ＧＦＰまたは治療用ベクターゲノムと１：１または１：５の比で混合し、標的細胞上のＸ−ｇａｌアッセイによりｌａｃＺベクター力価に対する影響をアッセイする。ＧＦＰ発現はベクター力価に影響を及ぼさず、したがって、ｌａｃＺの力価はｌａｃＺゲノムの希釈のベースライン効果を示す。したがって、ｌａｃＺ力価に対する他のベクタートランスジーンの影響が１：１および１：５の比のｌａｃＺ／ＧＦＰ混合物に対して測定されうる。試験された治療用ベクターは単一トランスジーンベクターまたはビシストロン（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ベクター（ＩＲＥＳ要素を保持するもの）のいずれかであった。ｌａｃＺ力価に対するＣＯＸ−２およびＦＰＲの影響は相加的でありうる。 レトロウイルスベクター産生細胞におけるトランスジーン発現の抑制におけるＴＲＩＰ系の一例。ＴＲＡＰまたはコドン最適化ＴＲＡＰ（ｃｏＴＲＡＰ）（ここで、ベクターゲノム発現カセットのトランスジーンの５’ＵＴＲ内にｔｂｓが挿入されている）を発現するレトロウイルスベクター産生細胞。ＴＲＡＰはｔｂｓに結合し、トランスジーンタンパク質の翻訳を遮断する。ベクターＲＮＡ分子もＴＲＡＰに結合しうるが、驚くべきことに、これはベクタービリオンの単一ラウンドのライフサイクルを妨げない。すなわち、逆転写および組込み工程はベクター粒子により正常に行われる。 ＧＦＰ−プラスミドトランスフェクト化細胞集団のフローサイトメトリー分析においてＧＦＰ陽性細胞またはＭＦＩのいずれかの数のみを用いた場合の制約。これらの図は、実質的に異なるＧＦＰ発現レベルを有する集団を比較する実験における潜在的結果を示す。実験Ａ／Ｂにおいては、どちらのＧＦＰ陽性集団も同じＭＦＩを有し、実験Ｃ／Ｄにおいては、ＧＦＰ陽性集団は類似した数の細胞を含有するが、１０倍異なるＭＦＩを示す。シナリオＡは、ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］を使用した場合に実際に実証されており、ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰおよびｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］でコトランスフェクトされた場合、非常に少数（＜１％）の非常に高発現性のＧＦＰ陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が一貫して観察されている。このことは、ＥＦ１ａプロモーターがこの小さな亜集団において活性でない可能性があることを示唆している。したがって、これは、集団における発現の尺度としてＭＦＩのみを使用した場合にＧＦＰ−抑制分析を歪曲する。したがって、発現スコア（％ ＧＦＰ陽性×ＭＦＩ）がゲート化（ｇａｔｅｄ）集団内のＧＦＰタンパク質発現の全体的なレベルをより有効に示す。 ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置の評価のための蛍光レポーター遺伝子構築物。まず、簡単な評価のために、ｐＯＮＹ８．４ＲＣ−ＧＦＰからｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰを作製した。この後、ベクター活性に対するＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置の効果を評価するために、非ＳＩＮ ＥＩＡＶベクターゲノムｐＯＮＹ８．４ＲＣ−ｔｂｓＧＦＰを作製した。評価のために初めに使用されたｔｂｓ配列［ＲＡＧＮＮ］１１は翻訳開始コドンの前の４１ｎｔの近位および９ｎｔの遠位配列に隣接していた。 一過性トランスフェクション評価研究において及び安定なＨＥＫ２９３Ｔ−ＴＲＡＰ［Ｈ６］細胞系を作製するために使用されたＴＲＡＰ発現プラスミド。初期実験は、Ｃ末端ＨＩＳ６−タグの存在下／非存在下のバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のコドン／配列最適化ＴＲＡＰの発現を駆動するためにｐＣＩ−Ｎｅｏバックボーンを使用した。ついでＣＭＶプロモーターを置換するためにＥＦ１ａプロモーター配列を使用して、ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］を得た。ＣＭＶプロモーター駆動性構築物（この場合には３’ＵＴＲが異なる）とは対照的に、両方のＥＦ１ａプロモーター駆動性構築物の３’ＵＴＲが同一となるように、ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］におけるＨ６配列のオリゴ−アダプター置換により、ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰプラスミドを作製した。ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ−ｉＢｓｒは合成により完全に再誘導された。これは、ＴＲＡＰ［Ｈ６］およびブラスチシジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）耐性マーカーをコードするマルチシストロン（ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｍＲＮＡを発現する。Ｂｓｒの翻訳を駆動するためにＥＭＣＶ ＩＲＥＳを使用した。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるトランスジーン発現のＴＲＡＰ媒介性抑制の第１の一過性トランスフェクション評価研究からの選ばれた写真。ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰのｔｂｓ含有５’ＵＴＲからの発現をｐＣＩ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］が特異的に抑制しうることを示す写真による証拠。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるトランスジーン発現のＴＲＡＰ媒介性抑制の第１の一過性トランスフェクション評価研究からのフローサイトメトリーデータの概要。Ａ．別々の軸上にプロットされた陽性ＧＦＰ集団の百分率（％）および蛍光強度（ＡｒｂＵ）の中央値のヒストグラム。ＴＲＡＰもＴＲＡＰ［Ｈ６］もｐＣＭＶ−ＧＦＰからのＧＦＰ発現に全く影響を及ぼさなかった。ＴＲＡＰ［Ｈ６］は、１：１の比で、および用量依存的に、ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰからのＧＦＰ発現を有意に低減した。ＴＲＡＰは、ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰからの発現を抑制する能力が、より低いようであった。Ｂ．ＴＲＡＰ媒介性抑制の規模をより良好に評価するために、各コトランスフェクト化細胞培養に関して発現スコアを導いた。陽性細胞の百分率（％）にＭＦＩを掛け算すると、培養当たりに産生されたＧＦＰの総量の近似値が得られる。発現スコアにより判定された場合のＴＲＡＰ［Ｈ６］によるＧＦＰ抑制の最大レベルはこの実験においては２５倍までであった。Ｃ．ｐＣＩ−ｃｏＴＲＡＰまたはｐＣＩ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］で１：１の比でコトランスフェクトされたレポータープラスミドの代表的なフローサイトメトリードットプロット。Ｄ．ＴＲＡＰ発現プラスミドの非存在下のもの（スタッファー）と比較された、ＧＦＰ−レポータープラスミドおよびＥＦ１ａプロモーターまたはＣＭＶプロモーター駆動性ＴＲＡＰ［Ｈ６］プラスミドでのコトランスフェクト化ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＧＦＰ蛍光強度の中央値。ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］をＧＦＰ：ＴＲＡＰの１：０．１のモル比で使用した場合に、ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰからの最大に近いＧＦＰ抑制が可能であったが、これはｐＣＩ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］では可能でなかった。 ＨＩＳ６タグ付きＴＲＡＰおよびタグ無しＴＲＡＰの機能比較。Ａ．別々の軸上でプロットされた陽性ＧＦＰ集団の百分率（％）および蛍光強度（ＡｒｂＵ）の中央値のヒストグラム。ＨＩＳ６タグ付き若しくはタグ無しＴＲＡＰ発現またはスタッファープラスミドをＧＦＰレポータープラスミドのいずれかと、示されている比（括弧内）で、三重重複でコトランスフェクトした。トランスフェクト化細胞をフローサイトメトリーにより分析した。Ｂ．発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）は集団におけるＧＦＰのＴＲＡＰ媒介性抑制の効果の全体的な評価を示す。ＨＩＳ６ Ｃ末端タグは、ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰによるＧＦＰ発現を抑制するＴＲＡＰの能力における少なくとも２倍の増加をもたらす。 トランスジーン発現を抑制する種々のＴＲＡＰホモログの能力およびＨＥＫ２９３Ｔ−ＴＲＡＰ細胞系の評価。Ａ．デスルホトマクルム・ヒドロサーマレ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｅ）およびアミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）からのＴＲＡＰ ＯＲＦをコドン／配列最適化し、ｐＥＦ１ａ−プラスミドバックボーン内にクローニングした。ＴＲＡＰ発現またはスタッファープラスミドをＧＦＰレポータープラスミドのいずれかと共に、示されている比（括弧内）で、三重重複でコトランスフェクトした。トランスフェクト化細胞をフローサイトメトリーにより分析した。各トランスフェクション条件ごとに平均発現スコアを得た。Ｂ．４個のＨＥＫ２９３Ｔ−ＴＲＡＰ［Ｈ６］細胞系を、三重重複の一過性トランスフェクションによるｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰからのトランスジーン発現を抑制するそれらの能力に関して比較した。ｐＣＭＶ−ＧＦＰまたはｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰをスタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と共にコトランスフェクトした。細胞をフローサイトメトリーにより分析し、各条件ごとに平均発現スコアを得た。ｐＣＭＶ−ＧＦＰ／スタッファーの発現スコアをその他の条件の発現スコアで割り算することにより、平均抑制倍率を得た。 レトロウイルスベクター産生におけるＴＲＡＰ−ｔｂｓ系の評価からのフローサイトメトリーデータの概要。Ａ．別々の軸上にプロットされた陽性ＧＦＰ集団の百分率（％）および蛍光強度（ＡｒｂＵ）の中央値のヒストグラム。ＴＲＡＰ［Ｈ］発現プラスミドを単一ＧＦＰレポータープラスミドまたは非ＳＩＮ ＥＩＡＶベクターゲノムプラスミド（図６を参照されたい）のいずれかと共に、示されている比で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にコトランスフェクトした。非ＳＩＮ ＥＩＡＶベクターゲノムプラスミドとのＧａｇ／ＰｏｌおよびＶＳＶＧ発現プラスミドの追加的なコトランスフェクションによりベクター産生が達成された。ベクターの産生中のＧＦＰ抑制は単一ＧＦＰレポーターの状況に非常に類似しており、ＴＲＡＰおよびｔｂｓ配列の両方の存在に左右された。Ｂ．発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）は集団におけるＧＦＰのＴＲＡＰ媒介性抑制の効果の全体的な評価を示す。Ｃ．Ｄ１７細胞に対するベクター力価。ｐＯＮＹ８．４ＲＣ−（ｔｂｓ）ＧＦＰベクタートランスフェクションから得られたベクター上清を使用してＤ１７細胞に導入し、４日後にフローサイトメトリーを行った。驚くべきことに、ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置はベクター力価に最小の影響を及ぼした。このことは、ベクター粒子の単一ラウンドのライフサイクルがベクターＲＮＡゲノム上の推定ＴＲＡＰ／ｔｂｓ相互作用によっては影響されなかったことを示している。 ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置におけるトランスジーンＡＵＧコドンとｔｂｓとの間の短いスペーシングの要件の試験からのフローサイトメトリーデータの概要。Ａ．ｐＯＮＹ８．４ＲＣ−ｔｂｓＧＦＰに基づくベクターゲノムにおいて試験されたスペーシング変異体を示す図。完全長ベクターゲノムＲＮＡから誘導されうる、すなわち、「外部」ＣＭＶプロモーター（図６を参照されたい）から駆動されうるいずれかのＧＦＰ発現に関する制御のために、「ヌル」変異体においてはＡＵＧが終止コドンに改変された。５’ステム−ループ（ＳＬ）配列をバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるｔｒｐオペロンリーダー配列から誘導した。下線付きヌクレオチドはコザック配列を示す。これらのスペーサー変異体ベクターレポータープラスミドをスタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と共に、示されているモル比（括弧内）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に三重重複でコトランスフェクトした。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。Ｂ．各条件ごとの全体的なＧＦＰ発現を、平均発現スコアを得ることにより評価した。ＧＦＰ抑制の効率はスペーシング変異体＋１１〜＋１に関して実質的に同じであった。「０」変異体はＴＲＡＰ［Ｈ６］の非存在下のＧＦＰ発現に関して若干欠損しているようであった。意外にも、５’ＳＬ変異体はＴＲＡＰ媒介性抑制に対して完全に不応答性であった。このことは、５’ＳＬがこの系におけるＴＲＡＰ−ｔｂｓ相互作用を阻止することを示唆している。 図１４ｉ．ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置が機能するのに必要なＴＲＡＰ結合配列におけるＲＡＧＮＮ反復の最小数を定める。Ａ．評価のためにｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰ内にクローニングされたｔｂｓ変異体配列。該研究において評価された初期ｔｂｓ配列は、ＴＧスペーサーをＡＡへと変化するように第１０および第１１ ＲＡＧＮＮ反復間で最適化された配列であった。したがって、変異体ｔｂｓ×１１Ｍおよびｔｂｓ×１０Ｍは、潜在的な隠れたＳＤ部位が除去されるように設計された。ＧＦＰレポーターの良好な翻訳コンテキストを維持しながら、ＲＡＧＮＮ反復をｔｂｓ×１１Ｍ変異体の３’末端から順次欠失させた（１１〜４反復のみ）。反復−変異体ｔｂｓ−ＧＦＰレポータープラスミドをスタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と共に、１０：１ ＧＦＰ：ＴＲＡＰプラスミドの比で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に三重重複でコトランスフェクトした。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。Ｂ．別々の軸上にプロットされた陽性ＧＦＰ集団の百分率（％）および蛍光強度（ＡｒｂＵ）の中央値のヒストグラム。Ｃ．各条件ごとの平均発現スコアを計算し、トランスフェクト化集団内の全体的なＧＦＰ発現の尺度として使用した。Ｄ．スタッファープラスミドでトランスフェクトされた各ｔｂｓ変異体に関する発現スコアをｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］トランスフェクションのもので割り算することにより、抑制倍率を得た。８ ＲＡＧＮＮ反復で最大抑制が可能であり、７ ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓは最大に近い抑制を可能にした。６ ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓは中等度レベルのトランスジーン抑制を可能にし、一方、５および４ ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓ配列は最低限度の機能性を示した。図１４ｉｉ．１１ ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓのバックグラウンドにおいて１以上のＲＡＧＮＮＮ反復を含有するｔｂｓ配列の機能性の評価。Ａ．この実験においてＮ２×１１と称されるｔｂｓ×１１Ｍ配列を、より多数のＲＡＧＮＮＮ反復がｔｂｓの中心部から漸進的にＲＡＧＮＮ反復に取って代わる修飾のための基本体として使用した。したがって、該変異体は漸進的に１、３、５、７または１０個のＲＡＧＮＮＮ反復を含有していた（３’末端ｃｔヌクレオチドはスペーサーとはみなされないため、Ｎ３×１１は１０個のＮＮＮスペーシングヌクレオチドを含有する）。これらのｔｂｓ変異体を治療用ベクターゲノムプラスミドｐＯＮＹＫ−ｔｂｓＣＯＸ２（図１８ｉを参照されたい）内にクローニングして、既存ｔｂｓを置換する。Ｂ．これらのｔｂｓ変異体含有ベクターゲノムプラスミドを使用して、ＥＩＡＶベクターパッケージング成分との及びスタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］との５：１のベクターゲノム：ＴＲＡＰプラスミド比でのコトランスフェクションにより、ベクターを作製した。ＣＯＸ−２に対する免疫ブロット法を産生終了細胞からの細胞ライセート上で行った。図１４ｉｉｉ．１１ ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓのバックグラウンドにおいて１以上のＲＡＧＮＮＮ反復を含有するｔｂｓ配列の機能性の評価：トランスフェクションの８時間後のベクター産生細胞におけるＣＯＸタンパク質レベル。予め、産生終了細胞（トランスフェクション後４８時間まで）におけるＣＯＸ２レベルを分析した（図１４ｉｉＢを参照されたい）。ＴＲＡＰ−ｔｂｓ媒介性抑制がベクター産生中に一時的に異なるかどうかを試験するために、トランスフェクションの８時間後、免疫ブロットによりＣＯＸ２レベルに関して産生細胞を分析した。Ｎ３Ｎ２ ｔｂｓ変異体をコードする種々の構築物からのＣＯＸ２の発現のパターンは、トランスフェクションの８時間後には、トランスフェクションの４８時間までに観察されたもの（図１４ｉｉＢを参照されたい）と同じであった。これは、与えられたｔｂｓ配列上のＴＲＡＰの抑制の度合がベクター産生中に明白には変化しないことを示している。図１４ｉｖ．１１ ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓのバックグラウンドにおいて１以上のＲＡＧＮＮＮ反復を含有するｔｂｓ配列の機能性の評価：ベクター力価。図１４ｉｉおよび図１４ｉｉｉに関連した実験においてＥＩＡＶ−ｔｂｓＣＯＸ２産生細胞から得られた粗ベクター上清をＤＮＡ組込みアッセイにより力価測定して、ベクター活性に対する産生中のＣＯＸ２抑制の影響を判定した。該データは、産生中のＣＯＸ２の僅かな抑制のみ（図１４ｉｉＢおよび図１４ｉｉｉにおけるＮ３Ｎ２×１１［３］を参照されたい）が、ＥＩＡＶ−ＣＯＸ２ベクター力価を実質的に増強するために要求されることを示している。図１４ｖ．×７および×８ ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓのバックグラウンドにおいて１以上のＲＡＧＮＮＮ反復を含有するｔｂｓ配列の機能性の評価。Ａ．これまでのデータは、８または７個のＲＡＧＮＮ反復を含むｔｂｓを使用して、最大レベルまたは最大に近いレベルのトランスジーン抑制が生じうることを示している。単一ＲＡＧＮＮＮ反復を８×ＲＡＧＮＮおよび７×ＲＡＧＮＮ ｔｂｓ内に挿入して、より短いこれらのｔｂｓ配列の機能に対する影響を評価した。これらを、×１１、×７、×６および×５反復を含むＲＡＧＮＮ含有ｔｂｓと共に比較した。これらのｔｂｓ変異体を治療用ベクターゲノムプラスミドｐＯＮＹＫ−ｔｂｓＣＯＸ２（図１８ｉを参照されたい）内にクローニングして、既存のｔｂｓを置換した。Ｂ．これらのｔｂｓ変異体含有ベクターゲノムプラスミドを使用して、ＥＩＡＶベクターパッケージング成分との及びスタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］との５：１のベクターゲノム：ＴＲＡＰプラスミド比でのコトランスフェクションにより、ベクターを作製した。ＣＯＸ−２に対する免疫ブロット法をベクター産生中の早い時点（すなわち、トランスフェクションの８時間まで）の細胞ライセート上で行った。該データは、ＲＡＧＮＮＮ反復が、７×ＲＡＧＮＮを含む×８反復ｔｂｓ以内で「許容」されうることを示している。 遺伝子発現のＩＲＥＳ依存的ＴＲＡＰ／ｔｂｓ調節を試験するためのＩＲＥＳ−ｔｂｓ ＧＦＰレポータープラスミドの構築。Ａ．遠位シストロン（ＧＦＰ）からの発現がＴＲＡＰによる抑制の度合を示すように、ＩＲＥＳ−ｔｂｓ ＧＦＰレポーター構築物を作製した。ｐＣＭＶ−Ｖｉ−ｔｂｓｘ１１ＧにおけるｔｂｓとＩＲＥＳ要素との間の距離は４４ｎｔ（スペーシングヌクレオチドをコードする）であり、一方、ｐＣＭＶ−Ｖｉ−ｔｂｓｘ４Ｇにおいてはこの距離を４ｎｔへと低減した。ｐＣＭＶ−ＶｉＧＦＰを「無ｔｂｓ」対照としてクローニングした。Ｂ．ＩＲＥＳ−ｔｂｓ ＧＦＰレポータープラスミドをスタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と共に１０：１のＧＦＰ−レポーター：ＴＲＡＰプラスミド比でＨＥＫ２９３Ｔ内に三重重複でコトランスフェクトした。単一ＯＲＦ ＧＦＰレポータープラスミドをＴＲＡＰ媒介性抑制に関する対照として同時に含めた。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。各条件ごとの平均発現スコアを計算し、トランスフェクト化集団における全体的なＧＦＰ発現の尺度として使用した。ＴＲＡＰは、ＩＲＥＳから導かれるＧＦＰ発現を、５’ＣＡＰ媒介性発現と類似した規模で抑制することが可能であった。 ＴＲＩＰ系を使用する、ＷＰＲＥを含有するＥＩＡＶ ＳＩＮ−ベクターの製造。ベクターゲノムプラスミドｐＯＮＹ８．９ＲＣ−ｔｂｓＧＦＰ（＋ＷＰＲＥ）をＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置に対するＷＰＲＥのいずれかの影響に関して試験した。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］またはスタッファープラスミドと共にベクターゲノムｐＯＮＹ８．４ＲＣ−ｔｂｓＧＦＰまたはｐＯＮＹ８．９ＲＣ−ｔｂｓＧＦＰ（＋ＷＰＲＥ）でコトランスフェクトされた細胞集団に関する発現スコアを得た。％ ＧＦＰおよび蛍光強度値中央値の掛け算からスコアを導出して、全集団におけるＧＦＰ発現の尺度を得た。 図１７ｉ．ｔｂｓを含有するように修飾されたＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）に基づく治療用ベクターゲノムの図。血友病Ａの治療用ベクターであるＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）はヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子をコードしている。第ＶＩＩＩ因子はベクタービリオン粒子内へのＶＳＶ−Ｇの取り込みを妨げてベクター活性を劇的に低減することが公知である。ｔｂｓまたはスクランブル化（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ｔｂｓを該ベクターゲノム内にクローニングして、それぞれＲｅＱｕｉｎａｔｅ−ｔｂｓおよびＲｅＱｕｉｎａｔｅ−ｃｏｎベクターを得た。図１７ｉｉ．ＴＲＩＰ系を使用するＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）力価の改善。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＴＲＩＰ系を使用して、標準的なベクタープロトコルに従い、ＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）に基づくベクターを製造した。ベクターゲノムプラスミドをｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と５：１の比でＥＩＡＶベクターパッケージング成分と共にコトランスフェクトした。ベクター上清を集め、組込みアッセイにより力価測定し、遠心分離により〜７０倍濃縮し、ついでＰＥＲＴアッセイを行い、ついでＶＳＶ−Ｇおよびｐ２６（ＥＩＡＶカプシド）に対する免疫ブロットを行った。Ａ．ＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）−ｔｂｓベクター力価はＤＮＡ組込みアッセイによる判定でＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）と比較して３０倍増加し、これはベクター産生中のＴＲＡＰの存在に左右された。ベクターの粒子対感染性の比も改善された（非表示データ）。Ｂ．濃縮ベクターサンプルにおけるＶＳＶ−Ｇの免疫ブロット。ベクター力価はベクタービリオン内へのＶＳＶ−Ｇの取り込みの度合と相関した。ｈ第ＶＩＩＩ因子は、レトロウイルスベクタービリオン内に取り込まれるＶＳＶ−Ｇの量を劇的に抑制することが公知である。Ｃ．ベクターコア（ｐ２６−カプシド）の免疫ブロットは、ウェル当たりに等しい数のベクタービリオンがローディングされたことを示している。 図１８ｉ．ＣＯＸ２またはＦＰＲのいずれかをコードするベクターゲノムの図。ｔｂｓ×１１Ｍ変異体を単一遺伝子発現ベクター内にクローニングした。５’ＵＴＲ配列＋／−ｔｂｓ×１１Ｍは、ＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）研究において使用された対照スクランブル化ｔｂｓ含有５’ＵＴＲとは完全に異なる。図１８ｉｉ．ＴＲＩＰ系を使用して改善された単一遺伝子ＣＯＸ２ベクター力価。単一遺伝子ＣＯＸ−２に基づくベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でＴＲＩＰ系を使用して製造した。ベクターゲノムプラスミドをｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と５：１の比で、ＥＩＡＶベクターパッケージング成分と共にコトランスフェクトした。ベクター上清を回収し、等しい体積の粗回収上清を使用する組込みアッセイにより力価測定し、産生終了細胞ライセートを免疫ブロット上で抗ＣＯＸ−２抗体によりプローブした。組込み終了アッセイ細胞（すなわち、ＣＯＸ−２ベクター調製物が導入されたもの）も免疫ブロットによりＣＯＸ−２発現に関して分析した。Ａ．ＣＯＸ２ベクター力価はＤＮＡ組込みアッセイによる判定で１００倍増加し、これはベクター産生中のＴＲＡＰおよびｔｂｓの存在に左右された。Ｂ．産生終了細胞内のＣＯＸ−２の免疫ブロットは、ベクター力価がＣＯＸ−２レベルと逆相関したことを示している。Ｃ．回収上清の体積当たりの活性ベクター粒子の増加は標的細胞内のＣＯＸ−２の導入および発現の増加をもたらした。図１８ｉｉｉ．ＴＲＩＰ系を使用して改善された単一遺伝子ＦＰＲベクター力価。単一遺伝子ＦＰＲに基づくベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でＴＲＩＰ系を使用して製造した。ベクターゲノムプラスミドをｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と５：１の比で、ＥＩＡＶベクターパッケージング成分と共にコトランスフェクトした。ベクター上清を回収し、等しい体積の粗回収上清を使用する組込みアッセイにより力価測定した。ＦＰＲベクター力価はＤＮＡ組込みアッセイによる判定で２４倍増加し、これはベクター産生中のＴＲＡＰおよびｔｂｓの存在に左右された。 図１９ｉ．ＣＯＸ−２またはＦＰＲ ＯＲＦをコードするベクターゲノムの図。示されているとおり、マルチシストロンベクターゲノムプラスミド内にｔｂｓ×１１Ｍ変異体をクローニングした。ＣＯＸ−２およびＦＰＲを上流または下流のいずれかの位置に配置し、ｔｂｓ×１１Ｍ配列を両方の位置に挿入するか、いずれの位置にも挿入しなかった。図１９ｉｉ．ＴＲＩＰ系を使用して改善されたマルチシストロンＣＯＸ２／ＦＰＲベクター力価。図１９ｉにおけるマルチシストロンベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でＴＲＩＰ系を使用して製造した。ベクターゲノムプラスミドをｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と５：１の比で、ＥＩＡＶベクターパッケージング成分と共にコトランスフェクトした。ベクター上清を回収し、等しい体積の粗回収上清を使用する組込みアッセイにより力価測定し、産生終了細胞ライセートを免疫ブロット上で抗ＣＯＸ−２抗体によりプローブした。ＣＯＸ−２／ＦＰＲマルチシストロンベクター力価は〜１００倍増加し、ＦＰＲ／ＣＯＸ−２マルチシストロンベクター力価はＤＮＡ組込みアッセイによる判定で〜５０倍増加し、これはベクター産生中のＴＲＡＰおよびｔｂｓの存在に左右された。産生終了細胞におけるＣＯＸ−２の免疫ブロットが示すところによると、ベクター力価はＣＯＸ−２レベルと逆相関し、ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置は同じｍＲＮＡ転写産物上の複数部位におけるトランスジーン抑制が可能であった。 図２０ｉ．ＴＲＩＰ系における使用のために修飾されたＯＸＢ−１０２ベクターゲノムの図。示されているとおり、マルチシストロンベクターゲノムプラスミド内にｔｂｓ×１１Ｍ変異体をクローニングした。上流ＴＨ−ＣＨ１融合遺伝子のみを、ｔｂｓ×１１Ｍ配列を含むように修飾した。図２０ｉｉ．ＴＲＩＰ系におけるベクター産生中の「問題の無い」トランスジーンの抑制。図２０ｉにおけるベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でＴＲＩＰ系を使用して製造した。ベクターゲノムプラスミドをｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と５：１の比で、ＥＩＡＶベクターパッケージング成分と共にコトランスフェクトした。ベクター上清を回収し、抗ＴＨ抗体を使用する免疫蛍光アッセイにより力価測定し（Ａ）、産生終了細胞ライセートを免疫ブロット上で抗ＴＨおよび抗ＣＨ１抗体によりプローブした（Ｂ）。ＴＲＡＰ／ｔｂｓ系による産生細胞におけるトランスジーンの抑制は明らかであったが、標的細胞におけるトランスジーン発現には影響を及ぼさなかった。このことは、検出可能なＴＲＡＰ関連活性が標的細胞に導入されなかったこと、およびトランスジーンカセットの５’ＵＴＲ内でコードされるｔｂｓがＴＲＩＰ産生細胞のもの以外の細胞における融合トランスジーンの頑強な発現を可能にしたことを示している。 図２１ｉ．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＴＲＡＰ抑制機能性に関して試験された種々の細菌種からのトリプトファンＲＮＡ結合ホモログの一覧。該研究において試験されたＴＲＡＰホモログの名称、系統およびＮＣＢＩ参照番号（図１１Ａに関連した追加的情報）。図２１ｉｉ．×１１−および×１２ＲＡＧＮＮ反復含有ｔｂｓ−ＧＦＰレポーターカセット上の抑制機能に関する種々のＴＲＡＰホモログおよびＳ７２Ｎ変異体の試験。６Ｈｉｓタグ付きＴＲＡＰホモログをｐＥＦ１ａ発現プラスミド内にクローニングし、ｐＣＭＶ−ｔｂｓｘ１１−ＧＦＰまたはｐＣＭＶ−ｔｂｓｘ１２−ＧＦＰレポータープラスミドのいずれかと共に、１：５（ｐＴＲＡＰ：ｐＲｅｐｏｒｔｅｒ）の比でＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にコトランスフェクトした。「ＴＲＡＰ無し」対照には、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを使用して、ＴＲＡＰ変異体を比較するためにＧＦＰ発現の「オン（ｏｎ）」レベルを得た。トランスフェクションの２日後に細胞をフローサイトメトリーにより分析し、［Ａ］（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）においてＧＦＰ発現スコアを得た。［Ｂ］は、各ｔｂｓ−ＧＦＰレポーターごとの「ＴＲＡＰ無し」対照に対する抑制倍率として、これらのデータを示す。（図１１Ａに関する追加的情報）。図２１ｉｉｉ．新規抑制系における種々のＴＲＡＰホモログの機能性の概要。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において×１１−または×１２−ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓ−ＧＦＰレポーターカセットを使用した場合の種々のホモログおよびＳ７２Ｎ変異体の抑制倍率の概要。該ホモログは、バシラス・サチリス（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＲＡＰと比較して多様なアミノ配列変異（５６〜７８％）を表す（１００％；アライメントはＨｉｓ−タグを含む）。（図１１Ａに関連した追加的情報）。 図２２ｉ．安定細胞系を単離するために使用されたＴＲＡＰ発現カセット。ＩＲＥＳ−Ｂｓｒ配列がＴＲＡＰ［Ｈ６］とポリアデニル化シグナルとの間に挿入されるようにｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］を修飾した。プラスミドの線状化中に細菌配列を該ＤＮＡ配列から除去し、バシラス・サチリス（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＲＡＰをコードするこのカセットを低継代ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に安定にトランスフェクトした。（図１１Ａに関連した追加的情報）。図２２ｉｉ．ＧＦＰレポータープラスミドのトランスフェクションによるＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ細胞クローンのスクリーニング。Ａ．サブクローン細胞の二重重複プレートをｐＣＭＶ−ＧＦＰまたはｐＣＭＶ−ｔｂｓｘ１１ＧＦＰのいずれかで三重重複でトランスフェクトし、２日後、細胞上でＦＡＣＳを行った。各サブクローンに関する発現スコアを計算し（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）、各サブクローンごとにｐＣＭＶ−ＧＦＰ（すなわち、ｔｂｓ無し）に関する発現スコアをｐＣＭＶ−ｔｂｓ×１１ＧＦＰに関する発現スコアで割り算することにより、抑制倍率を計算した（「抑制倍率」と表示されている棒グラフ、右側の軸）。（図１１Ｂに関連した追加的情報）。Ｂ．クローン細胞ライセートにおけるＴＲＡＰの免疫ブロット。ＴＲＡＰ［Ｈ６］を発現する１１個のサブクローンに関する結果が示されており、抗ＨＩＳ６抗体により単量体ＴＲＡＰが検出された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］で一過性にトランスフェクトし、ライセートを免疫ブロットのための陽性対照として使用した。（図１１Ｂに関連した追加的情報）。図２２ｉｉｉ．ＴＲＡＰを安定に発現する産生細胞を使用して改善されたＥＩＡＶベクター力価；ＥＩＡＶ−［ｔｂｓ］ＧＦＰおよびＥＩＡＶ−［ｔｂｓ］ｈｕＦＶＩＩＩベクターゲノムの５０：５０の混合物を産生中に使用する事例研究。Ａ．混合ベクターゲノムでトランスフェクトされたベクター産生細胞に関するＧＦＰ発現スコア。５０：５０の比のベクターゲノムプラスミドＥＩＡＶ−［ｔｂｓ］ＧＦＰおよびＥＩＡＶ−［ｔｂｓ］ｈｕＦＶＩＩＩと共にＥＩＡＶ−ベクターパッケージング成分ｐＧａｇＰｏｌ、ｐＶＳＶＧで細胞をトランスフェクトした。したがって、産生細胞におけるｈｕＦＶＩＩＩの発現は混合ベクター粒子の力価に負の影響を及ぼすであろう（ＥＩＡＶ−［ｔｂｓ］ｈｕＦＶＩＩＩはＲｅＱｕｉｎａｔｅ−ｔｂｓと同じである；図１７ｉを参照されたい）。ゲノムは標準体であるか、またはトランスジーンの上流にｔｂｓを含有していた。示されている場合には、ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（＋ＴＲＡＰ ＴＸＮ）またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（−）も加えた。産生細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞または安定ＴＲＡＰ細胞系２Ｆ、１０Ｈ、７Ｅおよび３Ｄであった。産生終了細胞に関してＧＦＰ発現スコアを計算した（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）。Ｂ．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に関する混合ＥＩＡＶ−［ｔｂｓ］ＧＦＰ／ｈｕＦＶＩＩＩ粗ベクター回収物のベクター力価。［Ａ］におけるベクター産生細胞からの粗ベクター上清をＨＥＫ２９３Ｔ細胞上で滴定し、ＦＡＣＳにより力価を測定した。ｈｕ第ＶＩＩＩ因子の発現はＥＩＡＶベクタービリオン活性に影響を及ぼすことが知られており（図１７ｉｉを参照されたい）、したがって、トランスジーン発現が産生細胞において（［Ａ］におけるＧＦＰによる測定で）抑制される場合にのみ、（［Ｂ］におけるＧＦＰによる測定で）ベクター力価は改善されうる。図２２ｉｖ．安定または一過性ＴＲＩＰ系において産生された混合ＥＩＡＶ−［ｔｂｓ］ＧＦＰ｜ＥＩＡＶ−［ｔｂｓ］ｈｕＦＶＩＩＩベクター粒子内へのＶＳＶＧの取り込みの改善。ＥＩＡＶ−［ｔｂｓ］ＧＦＰ｜ＥＩＡＶ−［ｔｂｓ］ｈｕＦＶＩＩＩベクターゲノム混合実験における産生細胞からのベクター上清を遠心分離により濃縮し、抗ＶＳＶＧ抗体を使用する免疫ブロットにより分析した。ウェルごとに等しい体積の濃縮調製物をローディングした。図２２ｖ．ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ安定細胞系を使用して改善された、治療用トランスジーンコード化レンチウイルスベクターの産生。Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（商標）のスケールでＥＩＡＶ−ｔｂｓＣＯＸ２を製造するために、標準物（ＴＲＡＰ無し）および一過性トランスフェクト化ＴＲＡＰ（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にけるもの）と共に、ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ［３Ｄ］細胞系（バシラス・サチリス（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＲＡＰ［Ｈ６］を安定に発現する）を使用した。ベクターをＤＮＡ組込みアッセイにより力価測定し、ＴＵ／ｍＬをＥＩＡＶ−ＧＦＰベクター力価（１００％と設定）と比較した。ＥＩＡＶ−ＣＯＸ２ベクターに関しては、ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ［３Ｄ］細胞の使用は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における一過性トランスフェクト化ＴＲＡＰと比較して、ベクター力価の更なる回収を可能にする。 図２３ｉ．種々の長さのｔｂｓ配列におけるＲＡＧＮＮ反復の「Ｒ」および「ＮＮ」位におけるヌクレオチドの選択の重要性の試験。Ｒ位がＧである場合にＮＮ配列がＧＧ、ＡＡ、ＴＴ［ＵＵ］またはＣＣである１１×ＲＡＧＮＮ反復の試験は、ＮＮ位にはピリミジンが好ましいことを示した。機能性の一般的順位はＴ［Ｕ］＞Ｃ＞Ｇ＞Ａであった。最初の（Ｒ）における最も機能的なヌクレオチドを試験するために、×１１、×８または×６反復を含むｔｂｓ内のｘＡＧＡＡ反復内に各ヌクレオチドＧ、Ａ、Ｔ［Ｕ］またはＣを挿入した。図２３ｉｉ．ＲＡＧＴＴ反復の「Ｒ」位におけるＧ｜Ｔ優先性の試験、およびＮＮスペーサー内のＴとのヌクレオチドペア形成の試験。高抑制性ｔｂｓ（１１×ＧＡＧＴＴ）の場合において、ＴＡＧＴＴ反復をこの×１１ ｔｂｓ配列と漸進的に交換した。ＴＡＧＴＴ反復の増加（ＧＡＧＴＴ反復の置換）は該ｔｂｓの抑制機能を多少は低減した。少なくとも１つがＮ＝ＴであるＧＡＧＮＮ反復の試験は、最初のＮ（ＲＡＧＮＮの４位）が好ましくはＴ［Ｕ］またはピリミジンである場合に最大抑制が達成されることを示した。これは、ＲＡＧＮＮの重要な特徴が最初のＮスペーサーにおけるピリミジンおよびＲ位におけるＧ＞Ｔであることを示した。（ＧＡＧＡＴは試験されなかった。なぜなら、このＲＡＧＮＮ配列の縦列反復はトランスジーンＯＲＦの上流に複数のＡＴＧコドンを与え、これがトランスジーンの発現を減衰させる可能性があるからである）。 図２４ｉ．ＴＲＡＰによる抑制活性を試験するために、ＧＦＰトランスジーンの５’ＵＴＲ内のｔｂｓの位置およびコピー数を変化させた。ＣＡＰ部位に対して種々の位置においてｐＣＭＶ−ＧＦＰ内にｔｂｓ×１１Ｍ配列をクローニングした：０ｎｔ［１］、３４ｎｔ［２］、５４ｎｔ［３］ ７４ｎｔ［４］または１１４ｎｔ［５］。構築物［２］を構成する３４ｎｔのリーダー上に付加された付加的配列（有効な標準的なｔｂｓ×１１Ｍレポーター）をＣＭＶｐ ５’ＵＴＲから誘導した。また、構築物［６］においては、ｔｂｓとＡＵＧとの間の配列が４３ｎｔへと増加された。最後に、ｔｂｓの２コピーが５’ＵＴＲ内に配置され、それらの間に３４ｎｔスペーサーが存在する［７］。図２４ｉｉ．ＴＲＡＰによる抑制活性の効果に関する、ＧＦＰトランスジーンの５’ＵＴＲ内のｔｂｓの種々の配置の試験。図２４ｉにおける７個のｔｂｓ変異体ＧＦＰレポーター構築物を、以下の３つの条件下でＴＲＡＰにより抑制されるそれらの能力に関して試験した：ＴＲＡＰ無し（ＨＥＫ２９３Ｔ）、一過性コトランスフェクト化ＴＲＡＰ（ＨＥＫ２９３Ｔ＋ＴＲＡＰ）および最大ＴＲＡＰ抑制条件（ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ［内因性ＴＲＡＰ］＋コトランスフェクト化ＴＲＡＰ）。トランスフェクションの２日後、ＧＦＰ発現を測定するために、培養をフローサイトメトリーにより分析し、ＧＦＰ発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）を得た。 図２５ｉ．ＨＩＶに基づくＧＦＰベクターの製造へのＴＲＩＰ系の適用。［Ａ］ＧＦＰをコードするＨＩＶ−１に基づくレンチウイルスベクターバックボーン内にｔｂｓ（×１１Ｍ変異体）を挿入し、それを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞 ＋／− ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］における粗ベクター調製物を得た。［Ｂ］産生終了細胞をＦＡＣＳにより分析してＧＦＰ発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ；「発現スコア」と表示された棒グラフ）を得た。粗ベクター上清をＨＥＫ２９３Ｔ細胞上のＤＮＡ組換えアッセイにより力価測定した（「力価」と表示された棒グラフ）。ＧＦＰ発現は、ＴＲＡＰの存在下、ＨＩＶ−ｔｂｓＧＦＰベクターを放出する産生細胞において＞１００倍抑制されたが、ベクター力価は影響されなかった（なぜなら、ＧＦＰタンパク質はベクター産生に有害ではないからである）。ＣＭＶ−ＣＭＶプロモーター、ψ−パッケージングシグナル、ＲＲＥ−ｒｅｖ応答要素、ｗＰＲＥ−ウッドチャックＨＢＶ転写後要素、ｐｐｕ−ポリプリントラクト、ＳＩＮ−自己不活性化Ｕ３／ＬＴＲ。図２５ｉｉ．ＨＩＶに基づく治療用ベクター製造へのＴＲＩＰ系の適用。［Ａ］５Ｔ４−ＣＡＲをコードするＨＩＶ−１に基づくレンチウイルスベクターバックボーン内にｔｂｓ（×１１Ｍ変異体）を挿入し、それを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞 ＋／− ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］における粗ベクター調製物を得た。［Ｂ］ＦＡＣＳ（ＨＩＶ−ＧＦＰ；左側の２本の棒グラフ）またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞上のＤＮＡ組込みアッセイ（ＨＩＶ−５Ｔ４．ＣＡＲ；右側の２本の棒グラフ）により粗ベクター上清を力価測定した。ＴＲＩＰ系は、ＴＲＡＰ共発現の非存在下の産生と比較して、ＨＩＶ−５Ｔ４．ＣＡＲベクター力価の１０倍の改善を可能にした。ＣＭＶ−ＣＭＶプロモーター、ψ−パッケージングシグナル、ＲＲＥ−ｒｅｖ応答要素、ｗＰＲＥ−ウッドチャックＨＢＶ転写後要素、ｐｐｕ−ポリプリントラクト、ＳＩＮ−自己不活性化Ｕ３／ＬＴＲ。 標準的またはＴＲＡＰ−ｔｂｓ配置成分でトランスフェクト化されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるトランスジーンｍＲＮＡレベルの分析。ｐＣＭＶ−ＧＦＰまたはｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰ ＋／− ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］のいずれかでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクト化し、４８時間後、ＧＦＰタンパク質（［Ａ］；ＦＡＣＳ）および細胞質内のＧＦＰ ｍＲＮＡレベル（［Ｂ］；ＧＦＰ特異的プライマー／ＦＡＭ−プローブセットを使用する、抽出されＤＮアーゼ処理された細胞質ＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ）に関して細胞を分析した。ＴＲＡＰ−ｔｂｓ配置を使用した場合には、細胞においてＧＦＰタンパク質の＞１００倍の抑制が生じるが、ＧＦＰ ｍＲＮＡレベルは明白には影響されないことを、これらのデータは示している。［Ｂ］Ｃｔは、シグナルが初めて検出されたＰＣＲサイクルを反映しており、Ｃｔが低くなればなるほど、標的は豊富になる。したがって、存在量は各サイクルごとに〜１．５倍増加し、４０は検出不能シグナルである。−ＲＴ条件は最小プラスミドＤＮＡ汚染を示す。 図２７ｉ．ＴＲＡＰ−ｔｂｓコードするＨＩＶ−１に基づくベクターは、構成的または組織特異的プロモーターにより駆動されるビシストロントランスジーンカセットを調節した。ホタルルシフェラーゼ（１位）およびＧＦＰ（２位）をコードするビシストロントランスジーンカセットが構成的ＣＭＶプロモーターにより転写され、ＴＲＡＰ−ｔｂｓにより翻訳レベルで示差的に調節される、４個の構築物を作製した。両方のトランスジーンＯＲＦまたは第１もしくは第２トランスジーンのみの上流にｔｂｓ配列を挿入し、あるいはいずれのｔｂｓ配列も存在させなかった。また、組織特異的プロモーター（光受容体細胞に限局されたＶＭＤ２プロモーター、または肝臓特異的であるｍＡｌｂＡＴプロモーター）が利用される２個の構築物を作製した。完全長ベクターＲＮＡ転写産物からの低レベル発現が測定されうるように内部プロモーターが存在しない対照構築物を作製した。図２７ｉｉ．ＴＲＡＰ−ｔｂｓをコードするＨＩＶ−１に基づくベクターからのトランスジーン発現の評価は、ＨＥＫ２９３Ｔ産生細胞において構成的または組織特異的プロモーターにより駆動されるビシストロントランスジーンカセットを調節した。ＨＩＶ−１ビシストロンベクターゲノム（図２７ｉ）、ｐＧａｇＰｏｌ、ｐＲｅｖおよびｐＶＳＶＧで、ならびにｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（＋ＴＲＡＰ）またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（対照）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をコトランスフェクトした。ゲノム対ＴＲＡＰプラスミド比は５対１であった。ｐＧＬ３−対照（ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ発現プラスミド）は全てのトランスフェクション混合物において全ＤＮＡ塊に対して１：４０の比で存在した。二重重複９６ウェルプレート上でトランスフェクションを三重重複で行った。１個の９６ウェルプレートを、トランスフェクションの２日後、フローサイトメトリーによる産生終了細胞の分析のために使用して、ＧＦＰ発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）を得た。第２のプレートを使用して、トランスフェクションの２日後、二重ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のための細胞ライセートを得た。図２７ｉｉｉ．マルチシストロントランスジーンをコードするレトロウイルス（レンチウイルス）ベクターの製造に適用された場合のＴＲＩＰ系の抑制能を要約する図。配列内リボソーム進入部位［ＩＲＥＳ］を使用する２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からのトランスジーン発現を抑制するためにＴＲＩＰ系を使用するレンチウイルスベクター産生細胞の一例。該ベクターゲノム発現カセットは強力なプロモーター［Ｅｘｔ Ｐｒｏ］により駆動されて、豊富な量のベクターゲノムＲＮＡを生成する。内部プロモーター［Ｉｎｔ Ｐｒｏ］は、豊富なレベルのトランスジーンコード化／発現ｍＲＮＡを与える強力／構成的プロモーター、または最小／トランスジーン非コード化／発現ｍＲＮＡレベルを与える漏出性であってもなくてもよい組織特異的プロモーターでありうる。ＴＲＡＰ結合配列［ｔｂｓ］は一方または両方のＯＲＦ位置の上流に挿入されうる。したがって、産生細胞内のＴＲＡＰの発現は豊富な又は低レベルのトランスジーンｍＲＮＡからのタンパク質産生を抑制するであろう。また、該ベクターゲノムＲＮＡはトランスジーンタンパク質を（典型的には低レベルで）Ｃａｐ依存的に又は（ＩＲＥＳから；典型的には中等度レベルないし高レベルで）Ｃａｐ非依存的に発現しうる。したがって、内部プロモーターが活性であるか否かに無関係に、トランスジーン発現はベクター産生中に可能でありうる。したがって、ＴＲＩＰ系は、組織特異的プロモーターを使用した場合より良好に、この発現を抑制しうる。Ｅｘｔ Ｐｒｏ−外部プロモーター；ψ−パッケージングシグナル；ＲＲＥ−ｒｅｖ応答要素；ｃｐｐｔ／ＣＴＳ−中央ポリプリントラクト／中央ターミネーター配列；Ｉｎｔ Ｐｒｏ−内部プロモーター；ｔｂｓ−ＴＲＡＰ結合配列；ＯＲＦ−オープンリーディングフレーム；ＩＲＥＳ−配列内リボソーム進入部位；ＷＰＲＥ−ウッドチャック肝炎転写後調節要素；ｐｐｕ−ポリプリントラクト；Δ；部分欠失Ｕ３（ベクターパッケージングおよびＴＲＡＰ発現カセットは図に示されていないが、この例のＴＲＩＰ系ベクター産生細胞内に存在するとみなされることに注意されたい）。 図２８ｉ．ＴＲＩＰＡＡＶ系の開発。ＡＡＶに基づくベクターの製造のためのＴＲＡＰ−ｔｂｓ配置の適用。標準的なＡＡＶベクター系はアデノウイルスＥ１発現細胞（例えば、ＨＥＫ２９３に基づく細胞）におけるベクターの産生のために以下の３個のＤＮＡ成分を利用する：ゲノム（所望により、自己相補性［ｓｃ］ＡＡＶベクターゲノムを得るために１つのｔｒｓが欠失しうる［Δｔｒｓ］）、ＲｅｐＣａｐおよびヘルパー機能（この非限定的な例においては、ヘルパー機能はアデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡにより付与される）。ＴＲＩＰＡＡＶ系はＴＲＡＰ−ｔｂｓ配置を利用する。ＡＡＶベクターゲノムを修飾して、トランスジーンカセットの５’ＵＴＲ内にｔｂｓを挿入し、ＴＲＡＰ発現プラスミドのコトランスフェクションおよび／またはＴＲＡＰを安定に発現する細胞系の使用によりベクター産生中にＴＲＡＰ発現カセットを共導入する。ＴＲＡＰは、所望により、Ｈｉｓ６タグ化されうる。ＩＴＲ−逆末端反復；Ｐｒｏ−真核プロモーター要素；ｔｂｓ−ＴＲＡＰ結合配列；ｐＡ−ポリアデニル化シグナル；［ＩＴＮ］−随意的イントロン。この図は正確な縮尺で示されているわけではない。図２８ｉｉ．ＴＲＩＰＡＡＶ系を使用するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｓｃＡＡＶベクタートランスジーン発現の抑制。血清型２ｓｃＡＡＶ−ＧＦＰゲノムをコードするプラスミド（＋／− ｔｂｓ）を、ＴＲＡＰ−ｔｂｓ媒介性トランスジーン抑制に対するそれらの影響を測定するための種々の成分と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にコトランスフェクトした。ｐｓｃＡＡＶ−［ｔｂｓ］ＧＦＰ｜ｐＲｅｐＣａｐ２｜ｐＨｅｌｐｅｒ｜ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］またはｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔの（−）質量比は、示されているとおりにｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］の投入量を変化させる場合以外は、１０ｃｍ ＴＣプレート当たり２｜２｜２｜２μｇであった。ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰ対照プラスミド（隣接ＡＡＶ２ ＩＴＲを欠く）を同じ条件に付して抑制レベルを比較した。ｐｓｃＡＡＶ２−［ｔｂｓ］ＧＦＰプラスミドからのＧＦＰ発現はｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰより大きかったが、これは恐らく、より安定なｍＲＮＡ転写産物（３’ＵＴＲ配列およびポリＡシグナルは構築物間で異なっていた）によるものであろう。ＴＲＡＰは、ｐＲｅｐＣａｐ２およびｐＨｅｌｐｅｒの存在下（すなわち、ｓｃＡＡＶベクター産生中）、ｐｓｃＡＡＶ２−ｔｂｓＧＦＰからのＧＦＰ発現を３００倍以上抑制することが可能であった。ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］対ｐｓｃＡＡＶ２−ｔｂｓＧＦＰの等しい質量比は、用いたトランスフェクション条件下、最大抑制を可能にした。ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］の質量投入を１０倍減少させても、１−Ｌｏｇのオーダーの測定可能なＧＦＰ抑制が尚も可能であった。ｐｓｃＡＡＶ−ＧＦＰでは抑制は観察されなかった。図２８ｉｉｉ．標準的およびＴＲＩＰＡＡＶ系を使用するｓｃＡＡＶ−［ｔｂｓ］ＧＦＰベクター産生の比較。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における等しい質量のゲノム、ｐＲｅｐＣａｐ２、ｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの一過性コトランスフェクションにより、ｓｃＡＡＶ−（ＣＭＶ）−ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ−（ＣＭＶ）−ｔｂｓＧＦＰベクターを製造した。トランスフェクションの約５３時間後、細胞を回収し、凍結−解凍サイクルに付してＡＡＶビリオンを放出させた。Ｖｉｒａｂｉｎｄ（商標）キットを使用してＡＡＶビリオンを精製して、それぞれの１０ｃｍプレートからのベクターを含有する１００μＬのＰＢＳを得た。フローサイトメトリーによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞（「ＨＥＫ２９３Ｔ」と表示されている棒グラフ）またはＨＥＰＧ２細胞（「ＨＥＰＧ２」と表示されている棒グラフ）上でベクター調製物を力価測定した。それぞれのベクター産生細胞に関するＧＦＰ発現スコアが共にプロットされている（「ＧＦＰ発現スコア」と表示されている棒グラフ）。ＡＡＶベクター産生細胞におけるＧＦＰ発現は＞３００倍抑制され、ＴＲＩＰＡＡＶ系のＴＲＡＰ−ｔｂｓ配置はＡＡＶベクター産生の基本的な生物学には影響を及ぼさないことを、データは示しており、このことは、問題のある／細胞毒性トランスジーンがＡＡＶベクター産生中に阻止されうることを示唆している。図２８ｉｖ．バルナーゼを使用する、問題のある／細胞毒性トランスジーンをコードするＡＡＶベクターのモデル化。Ａ．ベクターゲノムｓｃＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｔｂｓＢａｒｎａｓｅは、細菌ＲＮアーゼであるバルナーゼ（Ｂａｒｎａｓｅ）をコードしており、そのＯＲＦはヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。トランスジーンカセットの５’ＵＴＲ内にｔｂｓを挿入した。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＣＭＶプロモーターの漏出性（ｌｅａｋｙ）発現ゆえに、細菌におけるプラスミド増殖を補助するために、バルスター（Ｂａｒｓｔａｒ）（バルナーゼの天然インヒビター）のための細菌発現カセットがプラスミドバックボーン内に存在する。バルスターＯＲＦは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化される。Ｂ．ＧＦＰ発現に対するバルナーゼの効果をモニターするために、ゲノム混合トランスフェクションにおいてｐｓｃＡＡＶ−ＣＭＶ−ＧＦＰプラスミドを使用した。図２８ｖ．ｐｓｃＡＡＶ−ＣＭＶ−ｔｂｓＢａｒｎａｓｅおよびｐｓｃＡＡＶ−ＣＭＶ−ＧＦＰベクターゲノムプラスミドの５０：５０の混合物ならびにｐＲｅｐＣａｐ２およびｐＨｅｌｐｅｒでのＨＥＫ２９３ＴまたはＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲｉＰ［３Ｄ］細胞のトランスフェクションによりゲノム混合を行った。ゲノムプラスミドはそれぞれ、１μｇ／１０ｃｍ プレートで存在するか［ｉ］、あるいはｐｓｃＡＡＶ−ＣＭＶ−ＧＦＰのみが２μｇ／１０ｃｍ プレートで存在し［ｉｉ］、追加的なＴＲＡＰ発現プラスミドは存在しなかった。トランスフェクションの２４時間後、これらの培養におけるＧＦＰ発現の写真を撮影した。 図２９ｉ．ＴＲＩＰＡｄｅｎｏ系の開発。アデノウイルスに基づくベクターの製造へのＴＲＡＰ−ｔｂｓ配置の適用。標準的アデノウイルスベクターは第１世代（Ｅ１／Ｅ３領域において欠失している）、第２世代（Ｅ１／Ｅ２／Ｅ３／Ｅ４において欠失している）およびヘルパー依存的「中身抜き（ｇｕｔｔｅｄ）」ベクターに分類される。また、Ｅ１活性腫瘍溶解性ベクターは、Ｅ３領域内にコードされる毒性トランスジーンを含有しうる。例えば、毒性遺伝子の発現はアデノウイルス主要後期プロモーターまたは異種プロモーターおよびアデノウイルスコード化または異種ポリアデニル化シグナルによって支配されうる。これらのタイプのベクターゲノムＴＲＩＰＡｄｅｎｏ系形態はトランスジーンコード化転写産物の５’ＵＴＲ内にｔｂｓを保持する。ベクター産生中に、ＴＲＡＰ発現プラスミドのコトランスフェクションおよび／またはＴＲＡＰを安定に発現する細胞系の使用により、ＴＲＡＰ発現カセットを共導入する。ＴＲＡＰは、所望により、Ｈｉｓ６でタグ化されうる。ＩＴＲ−逆末端反復；ψ−パッケージングシグナル；Ｐｒｏ−真核プロモーター要素；ｔｂｓ−ＴＲＡＰ結合配列；ｐＡ−ポリアデニル化シグナル；［ＩＴＮ］−随意的イントロン。この図は正確な縮尺で示されているわけではない。図２９ｉｉ．ＴＲＡＰ−ｔｂｓ配置を使用するＨＥＫ２９３Ｔ細胞における第１世代アデノウイルスベクターゲノム成分からのＧＦＰトランスジーンの抑制。ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（＋ＴＲＡＰ）またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（−）と共に、ｐＡｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰまたはｐＡｄ−ＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰシャトルプラスミド（アデノウイルスベクターゲノムの左側を含有する）でＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし［Ａ］、４８時間後、フローサイトメトリーを行った［Ｂ］。また、並行トランスフェクションはＲＡＰＡｄ（登録商標）−バックボーン（ｐａｃＡｄ５ ９．２−１００；アデノウイルスベクターゲノムの右側を含有する）を含んでいて、ＲＡＰＡｄ（登録商標）キットを使用する第１世代アデノウイルスベクターの産生を模擬した（ここで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、該ベクターゲノムの組換えが生じる）。各条件下でＧＦＰ発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）を得た。ｔｂｓが該シャトルプラスミド内に存在した場合およびＴＲＡＰが発現された場合にのみ、ＧＦＰの１００倍以上の抑制が観察された。ＩＴＲ−逆末端反復；ＣＭＶ−ＣＭＶプロモーター；ψ−パッケージングシグナル；ｔｂｓ−ＴＲＡＰ結合配列；ｐＡ−ポリアデニル化シグナル。この図は正確な縮尺で示されているわけではない。図２９ｉｉｉ．ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ細胞におけるＡｄｅｎｏ（アデノ）−ｔｂｓＧＦＰ（Ｅ１／Ｅ３欠失）ベクター増幅中のＧＦＰトランスジーンの抑制。ｐＲＡＰＡｄ（登録商標）−バックボーンおよびｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］の存在下のｐＡｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰまたはｐＡｄ−ＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰシャトルのコトランスフェクションにより作製されたＡｄｅｎｏ−ＣＭＶ−ＧＦＰおよびＡｄｅｎｏ−ＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰベクターのストック（図２９ｉｉを参照されたい）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ［３Ｄ］細胞（ＴＲＡＰ［Ｈ６］を安定に発現する）のいずれかに０．０１のＭＯＩで導入した。［Ａ］ベクター増幅中のＧＦＰ発現を評価するために、導入後の種々の時点で同型培養をフローサイトメトリーにより分析した。各条件ごとにＧＦＰ発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）を得た。［Ｂ］時間経過終了同型培養を凍結−解凍してベクター粒子を放出させ、細胞残渣を遠心分離により除去し、粗上清をＨｅＬａ細胞上で力価測定した。
実施例
プロトコル、データ分析および報告の説明
（ｔｂｓ）ＧＦＰレポーターおよびＴＲＡＰ発現プラスミドの一過性コトランスフェクション
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（リポフェクタミン）２０００ＣＤを使用して、ＴＲＡＰ発現プラスミドを伴うｐＣＭＶ−ＧＦＰまたはｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰ（またはそれらの変異体）でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性コトランスフェクションにより、ＴＲＡＰ−ｔｂｓ配置の試験を行った。ＤＮＡの量を１０ｃｍプレート（トランスフェクションの２４時間前に３．５×１０６個の細胞が予め播かれたもの）当たり６．１μｇの全ＤＮＡに正規化するために、スタッファーＤＮＡ（ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ）を使用した。マルチウェルプレートを使用する場合には、これらのパラメータを組織培養容器面積に応じて縮小した。トランスフェクションを三重重複で行った。ＧＦＰ−レポータープラスミド対ＴＲＡＰ発現プラスミドのモル比が各実験において示されている。トランスフェクションの〜１８時間後に培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後に生細胞に関してＧＦＰ分析を行った。
典型的なレトロ（レンチ）ウイルスベクター産生プロトコル
３つのベクター成分を使用するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによるベクター産生を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤを使用して行った。ｐＤＮＡの比は１０ｃｍプレート（トランスフェクションの２４時間前に３．５×１０６個の細胞が予め播かれたプレート）当たり４μｇのベクターゲノム、２μｇのＧａｇＰｏｌ、０．１μｇのＶＳＶＧプラスミドであった。これらのパラメータを容器面積に応じて比例的に増減した。ＴＲＡＰプラスミドまたはスタッファープラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）のトランスフェクションを、示されているモル比のベクターゲノムで行った。例えば、ベクターゲノムプラスミド対ＴＲＡＰプラスミドのモル比が１０対１の場合、質量比は４μｇ ベクターゲノム対０．２８μｇ ＴＲＡＰプラスミドであった。トランスフェクションの２日後、新鮮培地の交換の前に６時間にわたって、１０ｍＭの最終濃度の酪酸ナトリウムを加えた。２０〜２４時間後、ベクター含有回収上清を採取した。ＧＦＰコード化ベクターの産生の場合、トランスフェクションの４８時間後、ＧＦＰ分析を生細胞に関して行った。免疫ブロット法のためのベクター産生終了細胞サンプルを、典型的には、分画バッファー（１３０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］，２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．２％ ＩＥＧＰＡＬ）を使用して調製し、遠心分離により核を取り出した。ベクター回収上清を０．４５μｍフィルターで濾過し、ベクター力価測定アッセイの前に−８０℃で保存した。標的細胞の導入および分析（３日後のフローサイトメトリーによるもの（後記を参照されたい））により、ＧＦＰコード化ベクターを力価測定した。導入の１０日後に宿主細胞ＤＮＡのｑＰＣＲにより（ＤＮＡ組込みアッセイ；後記を参照されたい）、または導入の３日後にトランスジーン産物に対する免疫蛍光により、治療用ベクターを力価測定した。
トランスフェクト化細胞集団内の全体的なＧＦＰタンパク質の評価
ＧＦＰ陽性細胞の分析を主としてフローサイトメトリーにより行った。これは、該集団におけるＧＦＰ陽性細胞の比率および細胞当たりのＧＦＰ発現の度合（蛍光強度の中央値により測定される）の両方の高感度定量を可能にした。ＧＦＰ陽性細胞数の百分率に蛍光強度の中央値（ＭＦＩ；任意単位）を掛け算して「発現スコア」を得ることにより、トランスフェクト化集団における全体的なＧＦＰ発現の規模の報告を行ったことに注目すべきである。この尺度は、トランスフェクト化細胞集団内の全体的なＧＦＰタンパク質発現レベルの、より良好な表現である、と本発明者らは考えている。それはトランスフェクト化集団内のＧＦＰ発現レベルの正規分布を本質的に前提としており、したがって「曲線下面積」を近似している。これを行ったのは、陽性比率またはＭＦＩのいずれかのみに基づくＧＦＰ発現の報告が、分析されている集団のそれらの「記述」において制限されたからである（説明は図５を参照されたい）。したがって、「抑制倍率」がＧＦＰ翻訳に対するＴＲＡＰの影響の尺度であり、「スタッファー」対照の発現スコアを関連ＴＲＡＰ−発現プラスミド試験サンプルの発現スコアにより割り算することにより計算された。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法
標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法を、主として、ベクター回収後のベクター産生終了細胞に関して行った。ベクター粒子の免疫ブロット分析では、〜２ｍＬの濾過ベクター上清を微量遠心管内で２１，０００ｒｐｍで４℃で１〜２時間、遠心分離した後、「ペレット」を２０〜３０μＬのＰＢＳに再懸濁させた。これらの濃縮ベクター調製物をＰＥＲＴアッセイ（後記）により定量し、７×１０４ ＰＥＲＴ予測ＴＵのベクターをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェルごとにローディングした。約１×１０６個のベクター産生終了細胞を２００μｌの分画バッファー中で細胞溶解し、遠心分離により核を取り出した。タンパク質サンプルをＢｉｏＲａｄアッセイにより定量し、典型的には５μｇのタンパク質を、予め形成された１２〜１５ウェルの４〜２０％ アクリルアミドゲル上にローディングした。タンパク質を氷上で３時間にわたって４５Ｖでニトロセルロース上にトランスファーした。ブロットを５％ 乳ＰＢＳ／ｔｗｅｅｎ―２０中で４℃で一晩ブロッキングした。一次抗体およびＨＲＰ二次抗体（ブロッキングバッファー中で典型的には１：１００希釈）でブロットをプローブした。免疫ブロットをＥＣＬ検出およびそれに続くＸ線フィルム露出により分析した。
レトロウイルスベクター力価測定
・組込みアッセイ
回収された濾過ベクター上清を培地中で１：５希釈した後、０．５ｍＬの体積を用いて、８μｇ／ｍＬ ポリブレンの存在下、１２ウェルスケールで１×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。培養を１０日間継代（２〜３日ごとに１：５分割）した後、１×１０６ 細胞ペレットから宿主ＤＮＡを抽出した。ＥＩＡＶパッケージングシグナル（ψ）に対して設定されたＦＡＭプライマー／プローブを使用して定量ＰＣＲを行い、以下の因子を用いてベクター力価（ＴＵ／ｍＬ）を計算した：導入体積、ベクター希釈度、細胞当たりに検出されたψコピー数、および特徴づけられた「単一コピーψ」細胞系対照の細胞当たりに検出されたψコピー数。
・ＧＦＰ−レポーターアッセイ
回収された濾過ＧＦＰコード化ベクター上清を培地内で１：１０〜１：１６０の範囲で希釈した後、０．２５ｍＬの体積を用いて、２４ウェルスケールで、８μｇ／ｍＬ ポリブレンの存在下、５×１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞または３．７４×１０４個のＤ１７細胞に導入した。導入の３日後、ＦＡＣＳ ＶｅｒｓｅまたはＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを製造業者により推奨された設定で用いて、培養をフローサイトメトリーにより分析した。１０，０００個の事象を捕捉し、ＳＳＣ／ＦＳＣ ２Ｄプロットおよび／またはＴｏＰｒｏ３染色に基づいてＤＥＡＤ／ＬＩＶＥ混合対照を使用して死細胞をアウトゲート（ｏｕｔ−ｇａｔｅ）した。
・免疫蛍光（ＩＦ）アッセイ（生物学的力価測定）
回収された濾過ＯＸＢ−１０２コード化ベクター上清を培地内で１：２〜１：８で希釈した後、０．５ｍＬの体積を用いて、１２ウェルスケールで、８μｇ／ｍＬ ポリブレンの存在下、１×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。培養を３日間インキュベートした後、固定され透過処理された細胞上のＩＦに付した。チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対する一次抗体およびＡｌｅｘａ−４８８二次抗体を共に、透過処理バッファー中で１：５００希釈で使用した。
・ＬａｃＺ−レポーターアッセイ
ＬａｃＺ−ベクター混合実験のために、回収された濾過ベクター上清を１０−５の係数まで１０倍系列希釈した後、１０−２、１０−３、１０−４および１０−５希釈ベクターの０．５ｍＬの体積を用いて、導入の２４時間前に７．５×１０４個の細胞が予め播かれた１２ウェルプレート上のＤ１７細胞に導入した。導入の３日後に、固定およびＸ−ｇａｌ添加ならびにそれに続く青色コロニー計数により培養を分析して、力価（ＬＦＵ ＴＵ／ｍＬ）を得た。
・ＰＥＲＴアッセイ
ＰＥＲＴアッセイは他の文献に記載されている（Ａｒｎｏｌｄ ＢＡら，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２５：９８−１０６）。ＰＥＲＴ予測力価（ＰＥＲＴ−ＴＵ／ｍＬ）は、ＰＥＲＴアッセイにおいてｑＲＴ−ＰＣＲ標準曲線として使用されたＧＦＰコード化ＥＩＡＶベクター調製物の生物学的力価に関連したＲＴ活性に基づく任意物理的粒子力価である。
ベクターゲノム混合実験による産生細胞におけるトランスジーン産物の発現によるレトロ／レンチウイルスベクター産生に対する影響の評価
細胞からのレトロウイルスベクター産生に対するＮＯＩトランスジーン産物の負の影響の度合を評価するために、図２に概説されているとおり、単純なベクターゲノム混合実験を行った。前記の「レトロ（レンチ）ウイルスベクター産生プロトコル」は、図１に記載されているベクターパッケージング成分と共に、レポーター遺伝子ベクターゲノムプラスミド（例えば、ｌａｃＺまたはＧＦＰトランスジーン）と、ＮＯＩを発現するベクターゲノムプラスミドとの混合物を使用して行われうる。ベクター産生細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｔにおけるレポータータンパク質ｌａｃＺまたはＧＦＰの発現は、産生されるベクター粒子の力価または特異的活性に悪影響を及ぼさないことが、一般に受け入れられている。したがって、これらのレポーターをコードするベクターは高い力価で製造されうる。したがって、そのようなレポーター遺伝子を有するベクターゲノムをコードするプラスミドと、ベクター力価に影響を及ぼすトランスジーンをコードするベクターゲノムのプラスミドとを混合することは、標的細胞における読取り（ｒｅａｄ−ｏｕｔ）としてレポーター遺伝子活性を用いたベクターの力価測定によるその影響の或る程度の測定を可能にする。これは、「問題のある」トランスジーンタンパク質の影響からのレポーター遺伝子ベクター力価に対する「バイスタンダー」効果が存在するからである。なぜなら、全てのベクター粒子は同じ細胞において生じ、ビリオン構築のために同じ細胞装置／経路を利用するからである。トランスフェクション時に用いられるレポーター対ＮＯＩベクターゲノムプラスミドの比は典型的には１：１〜１：５である。レトロウイルスベクター粒子はビリオン当たり２コピーのゲノムＲＮＡをパッケージングするため、問題の無い２つのタンパク質（例えば、ＬａｃＺおよびＧＦＰ）が産生細胞において２つの異なるベクターゲノムプラスミドから発現された場合であっても、レポーター特異的ベクター力価に対する「希釈」効果が存在することに注目されたい。例えば、ｌａｃＺおよびＧＦＰベクターゲノムプラスミドの１：１の比を用いる場合、確率の法則により、ビリオンの２５％は２コピーのｌａｃＺベクターＲＮＡを含有することになり、２５％は２コピーのＧＦＰベクターＲＮＡを含有することになり、残りの５０％のビリオンは各ベクターＲＮＡの１つを含有することになる。後者のシナリオにおいては、それらの２つのゲノムＲＮＡ分子の１つだけがＤＮＡへと逆転写されることになり、したがって、５０：５０の確率で、いずれかのレポーターベクターゲノムが標的細胞内に組込まれて、該レポーターの発現をもたらす。総合すると、これは、ベクターゲノムの、２つのプラスミドが、１：１の比で混合され、特異的レポーターベクター力価が、単一ベクターゲノム調製物の産生と比べて２倍減少することを意味している。より大きな混合比（例えば、１：５）を用いた場合には、希釈効果はより大きくなる。この理由により、２つのレポーターベクターゲノムプラスミドの混合は、評価中のＮＯＩトランスジーンを発現するベクターゲノムプラスミドとのレポーターベクターゲノムプラスミドのいずれかの混合と共に、希釈効果に関する「混合」対照として用いられる。
例えば、図３ｉおよび３ｉｉは、標的細胞におけるＸ−ｇａｌ染色に基づくベクター力価読取りによる、ｌａｃＺレポーターベクターゲノムプラスミドを使用した種々のベクターゲノムプラスミド混合実験からのデータを示す。ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）、ＳｔａｒＧｅｎ（商標）、ＵｓｈＳｔａｔ（登録商標）およびＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）のもの並びにＣＯＸ−２および／またはＦＰＲを発現するベクターを含む、試験されたベクターゲノムプラスミドの大多数は、使用される試験ベクタープラスミドに対するｌａｃＺベクタープラスミドの比に応じて、７〜１００倍、ベクター力価に影響を及ぼす。これらのデータは、ベクター産生細胞におけるトランスジーンタンパク質発現が、レポーター遺伝子ベクターと比べて臨床的に関連のあるベクターで観察される低いベクター力価に有意に寄与することを明らかに示している。
レトロウイルスベクター産生に関する本発明の説明：ベクター産生細胞内翻訳抑制（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｅｌｌ）［ＴＲＩＰ］系
図４は、レトロ／レンチウイルスベクター産生に適用された場合のベクター産生細胞内翻訳抑制［ＴＲＩＰ］系の簡略図を示す。他のウイルスベクター系（例えば、アデノウイルスおよびＡＡＶベクターに基づくベクター）におけるトランスジーン翻訳を抑制するのに必要な成分を示すＴＲＩＰ系は、ウイルス特異的パッケージング成分を含むように示されうる。全てのそのようなＴＲＩＰ系は、必要なベクター成分に加えて、以下の２つの成分を含有しなければならない：ＴＲＡＰの存在下でＰＯＩの産生が抑制されるようにＮＯＩトランスジーンの５’ＵＴＲ内に挿入されるＴＲＡＰ結合部位（ｔｂｓ）およびＴＲＡＰ発現カセット。ベクターゲノム分子内の複数のＮＯＩ ＯＲＦはＴＲＡＰにより調節されうる。すなわち、ベクターゲノムはマルチシストロンである（例えば、ＩＲＥＳを含有する）ことが可能であり、２以上のＯＲＦが、その翻訳開始コドンの上流（例えば、ＩＲＥＳと下流ＯＲＦとの間）に挿入されたＴＲＡＰ結合部位を有しうる。
中心的な実験の説明
ＧＦＰプラスミドおよびＧＦＰ発現レンチウイルスベクターゲノムプラスミドの使用によるＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置の初期試験
実施例１．ＴＲＡＰ発現プラスミドでの一過性コトランスフェクションにおけるＧＦＰ発現調節の試験
図６に記載されているとおり、ＧＦＰレポーター構築物ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰを構築した。５’ＵＴＲが（５’から３’へと）４１ｎｔのリーダー、５５ｎｔのｔｂｓおよびＧＦＰ ＡＴＧコドンの直上流にコザックコンセンサス配列をコードする９ｎｔの領域をコードするように、ＴＲＡＰ結合配列（ｔｂｓ）を該構築物内に挿入した。これらのＧＦＰレポーター構築物は２つのＣＭＶプロモーター間の領域の欠失により実験用ＥＩＡＶベクターゲノムｐＯＮＹ８．４ＲＣ−ＧＦＰから誘導された（図６を参照されたい）。
蛍光遺伝子発現レポーターの詳細に関して、より詳細には、ＧＦＰレポーター遺伝子は、遺伝子調節の比較的早い評価がフローサイトメトリーにより実施可能となるように、初期評価実験のために選択された。ＧＦＰがベクター産生に毒性または有害であることは知られていないが、ＴＲＡＰ／ｔｂｓによる遺伝子発現調節に関する高感度モデルとして使用された。更に、既存ベクターゲノムｐＯＮＹ８．４ＲＣ−ＧＦＰが操作のために利用可能であった。図６に示されているとおり、このベクターは３’ＬＴＲ内の野生型ＥＩＡＶ Ｕ３、および内部トランスジーンカセットの上流のＤｓＲＥＤ−ｅｘｐｒｅｓｓ ＯＲＦを利用する。したがって、このベクターゲノムプラスミドはベクター産生細胞におけるＧＦＰおよびＤｓＲｅｄ−ｅｘｐｒｅｓｓの両方の発現が可能である。
全てのこれらのレポーター構築物は、強力なＣＭＶプロモーターからの転写から誘導されるｍＲＮＡのポリアデニル化を可能にする野生型ＥＩＡＶ ＬＴＲを含有していた。したがって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰおよび対照プラスミドｐＣＭＶ−ＧＦＰの両方からのＧＦＰの発現は頑強であった（図８および９を参照されたい）。
該ＴＲＡＰ発現構築物は、ヒト細胞における高発現のためのバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのコドン／配列最適化ＴＲＡＰ ＯＲＦを使用して作製した。より詳細には、図７は、一過性トランスフェクション実験において初期に評価されたＴＲＡＰ発現プラスミドのタイプを示す。ＴＲＡＰタンパク質は細菌由来であるため、公に入手可能なヌクレオチド配列は、ｍｔｒＢ／ＴｒｐＢＰ「転写減衰タンパク質遺伝子ファミリー」オペロン内でコードされる細菌配列のものである。しかし、哺乳類細胞における発現を潜在的に増強するために、そしてスプライス−ドナー／アクセプター部位のようないずれかの準最適配列を排除するために、ＴＲＡＰヌクレオチド配列をホモサピエンス（ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）における発現に関してコドン／配列最適化した。該合成配列は、ｐＣＩ−ｃｏＴＲＡＰを得るためのｐＣＩ−ＮＥＯ内へのクローニングのために設計された。ＳａｐＩ部位は、消化および再環化がＴＲＡＰタンパク質のＣ末端へのＨＩＳ６−タグの融合を可能にするように、配置された。これはｐＣＩ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］を最終的に与えた。非コドン最適化ＴＲＡＰ発現プラスミドを使用した過去の報告も、ＴＲＡＰ機能への悪影響を伴うことなくＣ末端ＨＩＳ６−タグ付きＴＲＡＰを使用している。商業的に入手可能なＴＲＡＰ抗体は現在存在しないため、ＨＩＳ６−タグ付きＴＲＡＰを使用して実験中のＴＲＡＰの発現のレベルを決定した。
実験の第１セットはタグ無しＴＲＡＰおよびＣ末端ＨＩＳ６−タグ付きＴＲＡＰの両方を使用した。ＴＲＡＰ ＋／− ＨＩＳ６−タグプラスミドおよびｔｂｓ−ＧＦＰレポーター構築物でのコトランスフェクション実験は、両形態のＴＲＡＰがＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰからのＧＦＰ発現を抑制しうることを示した（図８および９）。ＴＲＡＰプラスミドおよびレポーターが１：１の比でコトランスフェクトされた場合、ＴＲＡＰおよびＴＲＡＰ［Ｈ６］はＧＦＰ発現をそれぞれ３倍および２７倍抑制した（図９Ｂ）。この用量の１０分の１（すなわち、１０：１の分子比（レポーター：ＴＲＡＰ））でＴＲＡＰプラスミドをコトランスフェクトした場合でさえも、幾らかの最小抑制が観察された。ＴＲＡＰのいずれの形態もｐＣＭＶ−ＧＦＰのＧＦＰ発現に影響を及ぼさなかったが、このことは、ｔｂｓがＴＲＡＰ媒介性抑制に必須であったことを示している。
実施例２．ＴＲＡＰ発現プラスミド発現の最適化
ｐＣＩ−Ｎｅｏに基づくプラスミドからの発現は他のＣＭＶ駆動性ＤＮＡカセットの影響下にあるか、またはそれと競合しうる。この理由により、ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰで１／１０の用量でコトランスフェクトされたｐＣＩ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］はこのタイプの競合の影響下にあった可能性があると仮定した。なぜなら、ＤＮＡ負荷を正規化するためのスタッファーＤＮＡとしてｐＣＩ−Ｎｅｏをも使用したからである（この実験後、全ての他の実験のための標準的なスタッファーＤＮＡとしてｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを使用した）。したがって、ＥＦ１ａ駆動性構築物ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］を前記のとおりに作製し、種々の比のｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰとのコトランスフェクションにおいて試験した。図９Ｄは、ＧＦＰレポーター構築物と共にｐＣＩ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］またはｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］のいずれかでコトランスフェクトされた細胞におけるＧＦＰの抑制を要約している。これらのデータは、ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］が１／１０の用量のｔｂｓ−ＧＦＰレポーターＤＮＡと共にコトランスフェクト可能であり、ｐＣＩ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］とは対照的に、１：１の比で観察されたＧＦＰ抑制レベルを維持しうることを示している（この場合には、ＭＦＩデータを比較した）。したがって、ＥＦ１ａ−プロモーターは、ＴＲＡＰ発現の駆動において、より好ましい可能性がある。
ｐＣＩ−ｃｏＴＲＡＰおよびｐＣＩ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］をクローニングする方法により、これらの構築物の３’ＵＴＲは同一ではなかった（図７）。したがって、それらの２つの構築物の間の機能性における観察された相違（図９）に関する考えられうる理由は、いずれかのアミノ酸相違によるものではなくＴＲＡＰ ｍＲＮＡ／タンパク質レベルによるものであった可能性がある。ＴＲＡＰ上のＣ末端ＨＩＳ６タグが機能性に重要であるかどうかを評価するために、ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］から該配列を除去することによりｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰを構築した（図７）。これらの構築物はＨＩＳ６タグ配列以外は同一である。ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］およびｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰを、種々の比のｔｂｓ−ＧＦＰレポータープラスミドとのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のコトランスフェクションにより、直接的に比較した（図１０）。
これらのデータは、ＨＩＳ６タグ付きおよびタグ無しの両方のＴＲＡＰタンパク質が、ｔｂｓ含有ＧＦＰレポータープラスミドと共に１：１または１：０．１のモル比で供給された場合に、ほとんど検出不能なレベルまでＧＦＰ発現を抑制しうることを示している。該タグ無しＴＲＡＰ形態は、発現の全測定において、ＴＲＡＰ［Ｈ６］より２倍低い、抑制における有効性を示した。したがって、ＨＩＳ６タグはタグ無しＴＲＡＰと比較して何らかの最低限の利点をもたらしうる。これは、タンパク質の安定性および／または溶解度／フォールディングおよび／または機能性（例えば、ＲＮＡ結合）の増強によるものかもしれない。
実施例３．種々のＴＲＡＰホモログの評価
バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＴＲＡＰに加えて、２つの他のＴＲＡＰホモログが、ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰおよびＴＲＡＰ発現プラスミドでコトランスフェクトされた細胞からのＧＦＰ発現の抑制を媒介することが示された（図１１Ａ）。デスルホトマクルム・ヒドロサーマレ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｅ）およびアミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）からのＴＲＡＰ遺伝子をコドン／配列最適化し、ｐＥＦ１ａに基づく発現プラスミド内にクローニングした。これらの変異体は共にＣ末端ＨＩＳ６タグを含んでいた。これらのＴＲＡＰ変異体はバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＲＡＰのものに対してそれぞれ７５％および５５％のアミノ酸相同性を有していた。３つ全ての変異体は２ ＬｏｇのオーダーでＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現抑制が可能であった。このことは、わずか５５％の配列相同性を有するＴＲＡＰホモログがＴＲＩＰ系において機能しうることを示している。３つ全てのホモログは、ＲＮＡおよびトリプトファン結合部位に関与する配列において保存されていた（非表示データ）。
実施例３ｂ．種々のＴＲＡＰホモログおよび変異体の評価
バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のほかの細菌株からのＴＲＡＰのホモログが該抑制系において機能しうるかどうかを試験するために、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＲＡＰに対して種々の配列同一性を有する５つのＴＲＡＰ変異体をＮＣＢＩデータベースから特定した（図２１ｉ）。それらの変異体は細菌系統にわたる広範な異なるＴＲＡＰ変異体を代表するものであった。これらのＴＲＡＰ変異体の遺伝子配列をヒト細胞における高発現のためにコドン最適化し、Ｃ末端ＨＩＳ６を含有させ（ＴＲＡＰ媒介性抑制を増強することが既に示されているバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＲＡＰ［Ｈ６］に類似している；図１０）、ｐＥＦ１ａ−プロモータープラスミド内にクローニングした（図７）。ビー・ハロジュランス（Ｂ．Ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）ＴＲＡＰ変異体は天然１２マーを形成し（Ｂａｙｆｉｅｌｄ，Ｏ．Ｗ．ら（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４４３０９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４４３０９）、このことは、潜在的にｔｂｓ内の１２個のＲＡＧＮＮ反復がこのＴＲＡＰに結合しうることを示している。天然１１マーＴＲＡＰ形態の人工１２マー形態が該タンパク質のＣ末端における修飾により操作されうることも示されている。バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴＲＡＰのＳ７２Ｎ修飾はＸ線結晶学による判定で１２マータンパク質を与えることが示されている（Ｂａｙｆｉｅｌｄ，Ｏ．Ｗ．ら（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４４３０９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４４３０９）。尤も、これらの変異体の１１マーまたは１２マーが細胞環境において形成されるかどうかは知られていない。バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴＲＡＰ−Ｓ７２Ｎ変異体も構築し、その他のＴＲＡＰホモログと共に、ＴＲＡＰ−抑制系における潜在的機能に関して試験した。１１×ＲＡＧＮＮまたは１２×ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓを含有する２つのＧＦＰレポータープラスミドを使用した。１２マーＴＲＡＰはｐＣＭＶ−ｔｂｓｘ１２ＧＦＰレポーターからのトランスジーン発現を、ｐＣＭＶ−ｔｂｓｘ１１ＧＦＰレポーター上の１１マーより大きな度合で抑制しうると仮定した。
種々のＴＲＡＰホモログおよびバシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴＲＡＰ−Ｓ７２Ｎ変異体の比較からのデータを図２１ｉｉＡ〜Ｂに示す。該ホモログおよびバシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴＲＡＰ−Ｓ７２Ｎ変異体の全てはＧＦＰの少なくとも１０倍の抑制が可能であった。これらのＴＲＡＰホモログ間の比較的低いアミノ酸配列相同性（バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）との比較で５６〜７８％；図２１ｉｉｉを参照されたい）を考慮すると、これは、多様な細菌種からのＴＲＡＰタンパク質が、哺乳類細胞におけるｔｂｓ ＲＮＡ配列との相互作用に要求される類似した四次構造を形成することを示唆している。全てのホモログが、ＲＮＡとの接触およびＬ−トリプトファン結合に重要であることが知られているアミノ酸残基を含有していた。しかし、Ｌ−トリプトファン結合突然変異体は、バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＲＡＰ Ｔ３０Ｖのように（Ｌ−トリプトファンの非存在下でさえも）ｔｂｓ−ＲＮＡに構成的に結合し（Ｙａｋｈｎｉｎら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：４５１９−４５２４）、同様にＴＲＡＰ媒介性抑制配置において機能すると予想される。
実施例４．安定ＨＥＫ２９３Ｔ−ＴＲＡＰ細胞系におけるトランスジーン抑制の評価
安定ＴＲＡＰ発現細胞系の場合のトランスジーン発現のＴＲＡＰ媒介性抑制を評価するために、構築物ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］−ｉＢｓｒを作製し、これを使用して、ブラスチシジン選択によりＨＥＫ２９３Ｔ細胞に安定にトランスフェクトした（図１１Ｂ）。〜１００個の安定クローンから、４個のサブクローニングされたＨＥＫ２９３Ｔ−ＴＲＡＰ［Ｈ６］細胞系２Ｆ、１０Ｈ、７Ｅおよび３Ｄを単離し、トランスフェクト化ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰからのＧＦＰ発現を抑制するそれらの能力に関して試験した。ＴＲＡＰ［Ｈ６］の内因性レベルが、一過性トランスフェクト化ＴＲＡＰ発現プラスミドで観察されたものと同じレベルのＧＦＰ抑制を達成しうるかどうかを評価するために、培養をスタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］プラスミドのいずれかでコトランスフェクトした。安定ＴＲＡＰ発現細胞系は、ＴＲＡＰ発現プラスミドで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、内因性ＴＲＡＰからの類似レベルのトランスジーン抑制（２Ｌｏｇのオーダー）が可能であることを、これらのデータは示している。しかし、追加的なＴＲＡＰ発現プラスミドが一過性にトランスフェクトされた場合に、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＴＲＡＰ［Ｈ６］クローンにおいて、より一層大きなレベルのトランスジーン抑制が観察された（４Ｌｏｇのオーダー）。この理由は、おそらく、ＨＥＫ２９３Ｔ−ＴＲＡＰ［Ｈ６］クローン細胞における既存のＴＲＡＰプールによるものであろう。更に詳細に説明すると、一過性トランスフェクト化シナリオにおいては、ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰおよびｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］のコトランスフェクションの後の早い時点で、ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰ由来ｍＲＮＡのＴＲＡＰ媒介性抑制が生じうる前に不十分なＴＲＡＰ［Ｈ６］タンパク質が蓄積して、少量であるが測定可能な量のＧＦＰ発現をもたらすであろう。この少量のＧＦＰ発現はＨＥＫ２９３Ｔ−ＴＲＡＰ［Ｈ６］細胞においては観察されない。なぜなら、ＴＲＡＰ［Ｈ６］の既存プールはデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）ｔｂｓＧＦＰ ｍＲＮＡに対して直接作用しうるからである。この効果は、追加的なＴＲＡＰ発現プラスミドと協同して、安定ＴＲＡＰ細胞系におけるＧＦＰ発現における遥かに大きな「抑制倍率」を可能にする。これは、安定細胞系におけるＴＲＡＰ［Ｈ６］発現の最大量が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにおいて観察されるものほどは高くないことを示唆している（これはＴＲＡＰ［Ｈ６］に対する免疫ブロットにより確認されている；非表示データ）。しかし、トランスジーン発現を２Ｌｏｇ以上抑制する安定ＴＲＡＰ［Ｈ６］細胞系の能力は、ベクター力価を改善するのに十分である可能性がある。
実施例４ｂ．ＴＲＡＰ［Ｈ６］を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞系の開発およびベクターの産生におけるそれらの使用
この実施例は、実施例４に示されているものに基づくものであり、安定ＴＲＡＰ［Ｈ６］細胞系をどのようにして開発したかに関する更なる情報を提供する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］−ｉＢｓｒ発現カセット（図２２ｉ）で安定にトランスフェクトし、ブラスチシジン選択によりクローンを単離した。これらの安定発現ＴＲＡＰ［Ｈ６］（バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））クローンを２回サブクローニングし、ついでｐＣＭＶ−ＧＦＰ（無抑制）またはｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰでのトランスフェクションにより抑制機能に関してスクリーニングした。発現スコア（図２２ｉｉＡ；ＭＦＩ×％ＧＦＰ）を得ることにより、細胞集団における全ＧＦＰ発現を推定した。４つのクローン（２Ｆ、１０Ｈ、７Ｅおよび３Ｄ）が２−Ｌｏｇまでの抑制活性および低い絶対的ＧＦＰ発現スコアを抑制条件下（すなわち、ＴＲＡＰの存在下）で有すると確認された。安定クローンにおけるＧＦＰトランスジーンの抑制レベルは、細胞において検出されたＴＲＡＰ［Ｈ６］のレベルと合理的に良く相関した（図２２ｉｉＢ）。これらのデータは、ＴＲＡＰ発現がＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して毒性ではないこと、および「ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ」細胞（ＴＲＡＰを安定に発現するもの；「ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＡＰ」としても公知である）が、ＴＲＡＰプラスミドの一過性トランスフェクションにおいて既に観察されているものと同様にトランスジーン発現を抑制しうることを示している。
本発明者らは、もう１つの例において、ＴＲＩＰがＲｅＱｕｉｎａｔｅ（ｈｕ第ＶＩＩＩ因子を発現するＥＩＡＶベクター）のベクター力価を標準的なベクター産生系と比較して改善しうることを示す（図１７）。ｈｕ第ＶＩＩＩ因子はＥＩＡＶベクタービリオン内へのＶＳＶＧの取り込みを妨げる。安定ＴＲＩＰ系（すなわち、組込みＴＲＡＰカセット）は、一過性ＴＲＩＰ系（すなわち、ベクター成分との「ｐＴＲＡＰ」プラスミドのコトランスフェクション）と比較して、トランスジーン抑制のタイミングにおける改善をもたらしうると理論化される。これは、安定細胞におけるＴＲＡＰタンパク質の既存プールは、トランスジーンを抑制するために直ちに利用可能となり、一方、一過性系においては、トランスジーンｍＲＮＡを抑制するために十分なレベルのＴＲＡＰタンパク質が存在するまで「ｐＴＲＡＰ」が発現されることが必要だからである。したがって、この早い時点で、トランスジーンの幾らかの「漏出（ｌｅａｋｙ）」発現が生じて、おそらく、活性なベクター産生に負の影響を及ぼしうる。これを試験するために、ベクター混合実験を行った。この実験においては、ベクター成分 ＋／− ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］での細胞のトランスフェクション中に、ＥＩＡＶ−［ｔｂｓ］ＧＦＰおよびＥＩＡＶ−［ｔｂｓ］ＦＶＩＩＩ（ＲｅＱｕｉｎａｔｅ−ｔｂｓとしても公知である）ゲノムを５０：５０で混合した。したがって、全般的なＥＩＡＶベクタービリオン活性に対するｈｕＦＶＩＩＩ発現のいずれかの負の影響がＥＩＡＶ−ＧＦＰベクター力価に関して測定可能であろう。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ならびに安定ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ細胞系２Ｆ、１０Ｈ、７Ｅおよび３Ｄを試験した。産生終了細胞をフローサイトメトリーによりＧＦＰ発現から分析し（図２２ｉｉｉＡ）、産生した粗ベクターを新鮮なＨＥＫ２９３Ｔ細胞上で力価測定し、同様にフローサイトメトリーにより分析した（図２２ｉｉｉＢ）。
図２２ｉｉｉＡにおけるデータは、ＴＲＡＰを発現する安定細胞が一過性ＴＲＩＰ系の場合より大きなトランスジーン抑制を可能にすることを示している。ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ−１０Ｈにおいては、ＧＦＰ発現は１０００倍低減した（図２２ｉｉｉＡ；ＥＩＡＶ−ＧＦＰおよびＥＩＡＶ−ｔｂｓＧＦＰゲノムの比較）。産生細胞におけるＧＦＰ（そしてその延長線上で考えて、ｈｕＦＶＩＩＩ）抑制の度合は、産生したベクターの力価と相関した（図２２ｉｉｉＢ）。総合すると、安定ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ細胞系は一過性ＴＲＩＰ系より〜３倍大きな力価を示した。安定ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ細胞系（＋ ＴＲＡＰ ＴＸＮ）における追加的ＴＲＡＰ発現はトランスジーン発現の更なる抑制を可能にしたが、これはこの特異的トランスジーンコード化ベクターの力価における更なる改善には転換しなかった。したがって、ＴＲＡＰ（最大ＴＲＡＰタンパク質自体ではない）の既存プールが本実施例における一過性系（すなわち、ｈｕＦＶＩＩＩを発現するベクター）と比べた場合のベクター力価における改善の原因となっている可能性がある。より問題のある／毒性のトランスジーンは、ベクター産生中に、既存および高レベルの両方のＴＲＡＰから利益を受けることが可能である。
ＥＩＡＶ−［ｔｂｓ］ＧＦＰ｜ＥＩＡＶ−［ｔｂｓ］ｈｕＦＶＩＩＩ産生細胞から回収されたベクター粒子含有上清を免疫ブロット法によりＶＳＶＧ含量に関して分析した（図２２ｉｖ）。これらのデータは、ｔｂｓが該ベクターゲノム上で利用され、ベクター産生中にＴＲＡＰが（トランス − ＨＥＫ２９３Ｔ ＋ ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］で、または安定ＴＲＡＰ発現により）供給された場合にのみ、ＶＳＶＧがベクター粒子内に取り込まれうることを示している。
実施例５．ＧＦＰコード化レンチウイルスベクターの産生に関するＴＲＩＰ系の試験
この実験の目的は、ベクターゲノム内のｔｂｓの存在の潜在的影響を評価することであった。更に拡張すると、ＴＲＡＰはベクターゲノムＲＮＡ分子内（およびトランスジーンｍＲＮＡ上）のｔｂｓに結合可能であり、したがって、デノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）ベクタービリオン内にパッケージングされうるため、逆転写の過程が悪影響を受けると合理的に予想された。ＴＲＡＰ−ｔｂｓ相互作用は特に高いアフィニティ（ｎＭの範囲）で生じ、ＲＴ段階中に逆転写酵素がこの相互作用を破壊しうるかどうかは知られていなかった。産生細胞におけるベクタートランスジーンの抑制にＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置を適用するために、ＥＩＡＶベクターゲノムｐＯＮＹ８．４ＲＣ−ｔｂｓＧＦＰをｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰから構築した。（図６を参照されたい）。ゲノムｐＯＮＹ８．４ＲＣ−ｔｂｓＧＦＰまたはｐＯＮＹ８．４ＲＣ−ＧＦＰ、パッケージング成分（ＧａｇＰｏｌおよびＶＳＶＧ）を使用して、ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生させ、ｐＣＩ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］の存在下または非存在下でコトランスフェクトした（この実験はｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］の構築の前に行った）。産生終了細胞をＧＦＰ発現に関してフローサイトメトリーにより分析し（図１２ＡおよびＢ）、ベクター上清を使用してＤ１７細胞に導入した（図１２Ｃ）。
ｔｂｓの非存在下のベクターゲノムとは対照的に、該ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置は、ｔｂｓ含有ベクターゲノムの内部トランスジーンカセットからのＧＦＰを、ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰに類似したレベルまで抑制することが可能であった（図１２Ａ）。ＤｓＲｅｄ−Ｘの発現はＴＲＡＰによっては影響されなかったが、このことは、完全長ベクターゲノムＲＮＡが産生され、翻訳可能であったことを示している（非表示データ）。ＴＲＡＰによるベクターゲノムプラスミドからのＧＦＰの抑制倍率は５０〜１００倍であった（図１２Ｂ）。該抑制倍率は、ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰで観察されたものより低かったが、これは、該ベクターゲノムから観察されたＧＦＰの、より低い非抑制レベルによるものであった可能性があり、これは、おそらく、外部ＣＭＶｐ駆動性ベクターゲノムＲＮＡとの競合の結果であったでろう。これらのデータはまた、ベクター産生中の酪酸ナトリウム（ＣＭＶプロモーターの公知活性化因子）の添加がＴＲＩＰ系に影響を及ぼさないようであったことを示している（この実験においては、ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰトランスフェクションにも酪酸ナトリウムを加えた）。
図１２Ｃは、ｔｂｓ含有ＧＦＰベクターが標準的なＧＦＰベクターに非常に類似した力価で産生されうることを示している。すなわち、ＴＲＡＰタンパク質の存在下で産生されたｐＯＮＹ８．４ＲＣ−ｔｂｓＧＦＰは１．４×１０６ ＴＵ／ｍｌを示し、一方、ＴＲＡＰタンパク質の非存在下で産生されたｐＯＮＹ８．４ＲＣ−ＧＦＰは１．８×１０６ ＴＵ／ｍｌを示した。これらのデータは、トランスジーンが翻訳的にサイレンシングされたレトロウイルスベクターの製造においてＴＲＩＰ系が使用されうることを初めて示すものである。
ＴＲＡＰ媒介性抑制のためのｔｂｓ配列要件の基本的特徴づけ
実施例６．ｔｂｓと翻訳開始コドンとの間の短い間隔要件の試験
ＴＲＡＰ結合部位（ｔｂｓ）において重要な配列の特徴づけにおける最初の実験は、ｔｂｓとＡＵＧ翻訳開始コドンとの間の短い間隔（スペーシング）距離が翻訳抑制に重要であるかどうかという疑問を検討した。ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰおよびｐＯＮＹ８．４ＲＣ−ｔｂｓＧＦＰ内のｔｂｓの配置においては、ｔｂｓはＧＦＰ ＡＵＧ翻訳開始コドンから９ヌクレオチド離れている。Ｔｅｔ−ＯＮ／ＯＦＦのような他の人工遺伝子調節系においては、間隔パラメータは機能性に寄与することが示されている。短距離の間隔の重要性を評価するために、これらのスペーサーヌクレオチドの１〜９個が漸進的に欠失した一連の変異体を構築した。また、２つの他の変異体においては、間隔を１０および１１ヌクレオチドまで増加させた。最後に、インビボの転写減衰メカニズムのためのＴＲＡＰ−ｔｂｓ結合に重要であることが示されているバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｔｒｐＥＤＣＦＢＡオペロンから得られた５’近位ステムループ（ＳＬ）配列（ＭｃＧｒａｗ ＡＰ，Ｍ．Ａ．，Ｍａｊｏｒ Ｆ，Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ ＰＣ，Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ．（２００９）ＲＮＡ １５（１）：５５−６６）に、標準的なｔｂｓ−９ｎｔ−ＡＵＧ配置を付加した。該ＳＬ突然変異体を含めたのは、ＴＲＡＰ媒介性抑制が増強されうるかどうかを試験するためであった。これらの変異体をベクターゲノムｐＯＮＹ８．４ＲＣ−ｔｂｓＧＦＰ内にクローニングし、翻訳抑制における微妙な相違がより容易に定量されうるように、限られた量のｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（１：０．０５の比）でコトランスフェクトした。
この実験の結果を図１３Ｂに示す。スペーサー欠失変異体またはスペーサー増加変異体はいずれも、９ｎｔスペーサーと比べて変化したＴＲＡＰ媒介性抑制を全く示さなかった。「０」変異体は、その他の変異体＋１１〜＋１と比べてＧＦＰ発現における約２倍の低減を示したが、これはＴＲＡＰの存在下または非存在下で生じた。このことは、この変異体ｍＲＮＡから翻訳されうるＧＦＰの全般的能力がそれほど効率的でなかったことを示している（おそらく、最適コザックコンセンサス配列の欠失によるものであろう）。興味深いことに、天然ｔｒｐオペロンからの５’ステムループの存在は、ＴＲＡＰと協同して翻訳を抑制するｔｂｓの機能性を完全に除去した。この予想外の結果が示唆するところによると、インビボでの機能性を可能にするＳＬ−ｔｂｓ配置のその他の特徴がどのようなものであっても、それらは、この人工配置から欠けているか、または適切な配列間隔／コンテキストでは存在せず、あるいはバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＳＬ−ｔｂｓへのＴＲＡＰ結合は、転写減衰においては、翻訳減衰とは異なるメカニズムに従っており、後者はＳＬに非依存的である。全てのこれらのデータは、この人工系におけるｔｂｓへのＴＲＡＰ結合により導かれる翻訳抑制がｔｂｓと翻訳開始コドンとの間の短い距離によっては改変されないことを示唆している。
実施例６ｂ．ＴＲＡＰ媒介性抑制に対するトランスジーンカセットの５’ＵＴＲ内のｔｂｓの位置の影響の試験
ＴＲＡＰ媒介性抑制活性に関するトランスジーンの５’ＵＴＲ内のｔｂｓの位置の重要性を更に特徴づけるために、ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰの一連の５’ＵＴＲ変異体を構築した。この場合、Ｃａｐ部位およびＡＵＧ開始コドンからのｔｂｓの相対距離を変化させた（図２４ｉ）。また、ｔｂｓの２コピーがそれらの２つのｔｂｓ配列の間の３４ｎｔの介在配列と共に５’ＵＴＲ内に挿入されたもう１つの構築物を作製した。これを構築したのは、ＴＲＡＰ−ｔｂｓ媒介性抑制が単一コピーのｔｂｓ配置と比べて増強されうるかどうかを試験するためであった。
図２４ｉにおける７個のｔｂｓ変異体ＧＦＰレポーター構築物を、以下の３つの条件下、ＴＲＡＰにより抑制されるそれらの能力に関して試験した：ＴＲＡＰ無し（ＨＥＫ２９３Ｔ）、ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（ＨＥＫ２９３Ｔ ＋ ＴＲＡＰ）での一過性コトランスフェクション、および最大ＴＲＡＰ抑制条件（ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ［内因性ＴＲＡＰ］ ＋ コトランスフェクト化ＴＲＡＰ）。該５’ＵＴＲ ｔｂｓ変異体の全てはＴＲＡＰ［Ｈ６］によって１０〜１００倍抑制可能であった。上流ＵＴＲの長さをゼロまで減少させる（すなわち、該ＵＴＲ全体が単一ｔｂｓのみから構成された）ことはＴＲＡＰ媒介性抑制に影響を及ぼさないようであった。構築物＃［１］はＴＲＡＰによる〜２−ＬｏｇのＧＦＰ抑制が可能であった。尤も、ＧＦＰの非抑制レベルはその他の構築物より低かった。
ｔｂｓとＡＵＧ開始コドンとの間の間隔を９から４３ｎｔへと増加させることは、ｔｂｓによる１０倍のＴＲＡＰ媒介性抑制を尚も可能にした。二重ｔｂｓコード化５’ＵＴＲ変異体（図２４ｉｉ、構築物＃［７］）は、単一ｔｂｓ含有変異体と比較して、ＴＲＡＰ媒介性抑制を改善しなかった。
これらのデータは、［１］単一ｔｂｓが５’ＵＴＲ内のいずれかの部位に挿入されて、トランスジーンの或る程度のＴＲＡＰ媒介性抑制を可能にしうること、［２］最大ＴＲＡＰ媒介性抑制を促進するために、ｔｂｓをＡＵＧ開始コドンの近くに挿入することが好ましいこと、および［３］ｔｂｓの上流の５’ＵＴＲ配列の長さが、抑制の大きさに影響を及ぼすことなく、ゼロまで低減されうることを示している。
実施例７．翻訳のＴＲＡＰ媒介性抑制に必要なｔｂｓ内の［ＲＡＧＮＮ］反復の最小数の特定
ＴＲＡＰ媒介性抑制を可能にするのに必要な［ＲＡＧＮＮ］反復の最小数を特定するために、次の実験を行った。文献における１つの報告は、ＴＲＡＰ結合を可能にするには僅か５個の反復で十分でありうることを示すためにインビトロ結合を用いた（Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｙ．Ｊ．，Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１７）：５１５９−５１６３）。１〜７個の反復が漸進的に欠失した一連のｔｂｓ欠失変異体を作製した（図１４ｉＡ）。全ての変異体において、最適コザック配列は維持された。また、ｔｂｓにおいて、第１０反復と第１１反復との間でＴＧ＞ＡＡの変化を施した。これを行ったのは、この領域が非正準（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）スプライスドナー部位を含有しうること（これは後に間違いであることが判明した）（非表示データ）を他の研究が示唆した後であった。該変異体ｔｂｓ ＧＦＰレポーター構築物をｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（前者は後者に対して１０：１のモル過剰であった）またはｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にコトランスフェクトし、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより測定した（図１４ｉＢ）。ｔｂｓ×１１Ｍ変異体はＧＦＰ発現の１０００倍の抑制を可能にしたことから、ｔｂｓに対するＴＧ＞ＡＡの修飾はＴＲＡＰ媒介性抑制における検出可能な効果を及ぼさなかった。変異体ｔｂｓ×１０Ｍ、ｔｂｓ×９およびｔｂｓ×８もＧＦＰ発現における１０００倍の抑制を可能にし、一方、ｔｂｓ×７は５００倍の抑制を可能にした（図１４ｉＣおよびＤ）。ｔｂｓ×６を与えるもう１つのＲＡＧＮＮ反復の欠失は、この変異体がＧＦＰ発現を３０倍抑制することが可能であったため、機能性における更なる低減をもたらした。変異体ｔｂｓ×５およびｔｂｓ×４は無ｔｂｓ配列と比べて無視しうるほどの抑制を示した。ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置による最も高いレベルの抑制は少なくとも７個（好ましくは少なくとも８個）のＲＡＧＮＮ反復を要し、一方、６個の反復はトランスジーン発現における幾らかの有用なノックダウンを可能にしうることを、これらのデータは明らかに示している。
実施例８．ｔｂｓ内で許容される［ＲＡＧＮＮＮ］反復の数の特定
一般的な一致した見解によると、ＲＡＧ反復間にＮ２スペーサーを含有するｔｂｓへのＴＲＡＰ結合が最適であるが、インビトロのｔｂｓ−ＴＲＡＰ結合研究は、ｔｂｓのＲＡＧ反復間の３ヌクレオチドのヌクレオチドスペーサーも許容されうることを示唆している（Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｙ．Ｊ．，Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１７）：５１５９−５１６３）。実際、インビボで見出される天然ｔｂｓ配列は、２ヌクレオチドより長いスペーサーを有することがたまにある。尤も、これは、インビボでのＴＲＡＰ／ｔｂｓ相互作用が、他のタンパク質相互作用および／または選択圧が働きうる特異的細胞条件下で進化してきたことによる可能性がある。生物学的機能性に合致するためには、天然ＴＲＡＰ／ｔｂｓ相互作用は最大効率であることを要しない可能性がある。しかし、人工ＴＲＩＰ系においては、ＴＲＡＰ／ｔｂｓ相互作用は最大限度に効率的であることが望ましい。１１×ＲＡＧＮＮ ｔｂｓ配列の機能性がＲＡＧＮＮＮ反復での系列的置換に対してどの程度許容性であるのかを試験するために、一連の変異体ｔｂｓ配列を設計し（図１４ｉｉＡ）、ＣＯＸ２トランスジーンを発現するＥＩＡＶベクターゲノム内にクローニングした（図１８ｉを参照されたい）。これらは、図１４ｉＡにおいて最初に試験されたｔｂｓ×１１Ｍ配列に基づくものであった。ＲＡＧＮＮＮ反復が中心位置から外側へとｔｂｓ×１１Ｍ内のＲＡＧＮＮ反復に取って代わって、１×、３×、５×、７×、そして最終的に１１×ＲＡＧＮＮＮ反復を含有するｔｂｓ配列を与えた（Ｎ３×１１Ｍ ｔｂｓ配列に関しては、最も３’側の遠位反復スペーサーはスペーサーとみなされないため、１０個のＮＮＮスペーサーのみが有効に存在することに注意されたい）。これらのベクターゲノムプラスミドをＥＩＡＶベクターパッケージング成分 ＋／ ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に一過性にコトランスフェクトし、ベクター上清を回収した（これらのＣＯＸ２ベクターのベクター力価は後記に示されている）。産生終了細胞ライセートをＣＯＸ２に対する免疫ブロットにより分析して、スタッファープラスミド（非抑制）と比較した場合の該細胞におけるトランスジーン抑制を測定した（図１４ｉｉＢ）。
１１×反復ｔｂｓ内の３個までのＲＡＧＮＮＮ反復はベクター産生細胞におけるトランスジーン発現の幾らかの検出可能な抑制を可能にすることを該データは示している。これは、ＴＲＩＰ系の非存在下のベクター力価に対するトランスジーンタンパク質の影響の大きさによっては、幾つかの場合には、ベクター力価を改善するのに十分であるかもしれない。ｔｂｓ内の単一ＲＡＧＮＮＮ反復はＮ２×１１反復ｔｂｓと同程度に機能的であるようである。
実施例８ｂ．ｔｂｓ内に許容される［ＲＡＧＮＮＮ］反復の数の特定
ＴＲＡＰ媒介性抑制を可能にするコンセンサス反復ＲＡＧＮ２−３におけるＲＡＧ反復間のスペーサーを含むＮの数に関して、更なる研究を行った。図１４ｉＢはトランスフェクションの約２日後の産生終了細胞におけるＣＯＸ２発現分析を示す。Ｎ３Ｎ２ ｔｂｓ変異体のコンテキストにおけるトランスジーン（ＣＯＸ２）発現がトランスフェクション後の早い時点で（後の時点と比較して）異なっていたかどうかを試験するために、トランスフェクションの８時間後の産生細胞ライセートをＣＯＸ２に対する免疫ブロット法により分析した（図１４ｉｉｉ）。ベクター産生中の早い時点および遅い時点の両方においてＣＯＸ２発現の類似パターンがＮ３Ｎ２ ｔｂｓ変異体から生じることを、これらのデータは示している。すなわち、与えられたｔｂｓ変異体に関するＴＲＡＰ−ｔｂｓ媒介性抑制はベクター産生の経過中に類似しているようである。
Ｎ３Ｎ２ ｔｂｓ変異体含有ベクターゲノムの、異なるレベルのＣＯＸ２抑制の、ベクター力価に対する影響を測定するために、粗上清回収物をＤＮＡ組込みアッセイに付した。図１４ｉｖはこれらのデータを示し、明らかなＣＯＸ２抑制が産生細胞において認められたＮ３Ｎ２ ｔｂｓ変異体、すなわち、「Ｎ３Ｎ２×１１［３］」、「Ｎ３Ｎ２×１１［１］」および「Ｎ２×１１［０］」に関しては、ベクター力価が増加したことを示している。これは、ＲＡＧＮＮから構成される×１１ ｔｂｓ内の３個までの反復がＲＡＧＮＮＮ反復で置換可能であり、ベクター力価の改善をもたらす幾らかのＴＲＡＰ媒介性抑制活性を維持しうることを証明している。しかし、ベクター産生の増加以外の理由（すなわち、ベクター投与中にトランスジーンに対する免疫応答を招きうるベクター産物に関連したトランスジーンタンパク質の著しい減少）により、ＲＡＧＮＮ ×８〜１１ ｔｂｓ配置が尚も優先されることに注目すべきである。
ＲＡＧＮＮ×７〜８ ｔｂｓ変異体は最大に近いＴＲＡＰ媒介性抑制活性を保有することが既に示された（図１４ｉ）。より短いこれらのｔｂｓ変異体内のＲＡＧＮＮＮによる単一ＲＡＧＮＮ反復置換の影響を試験するために、第２の一連のＮ３Ｎ２ ｔｂｓ変異体を構築し、ＣＯＸ２ベクターゲノム内に挿入した（図１４ｖＡ）。これらのベクターゲノムプラスミドをＥＩＡＶベクターパッケージング成分 ＋／ ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に一過性にコトランスフェクトし、トランスフェクションの８時間後、細胞ライセートをＣＯＸ２に対する免疫ブロットにより分析して、スタッファープラスミド（非抑制）と比較した場合の該細胞におけるトランスジーン抑制を測定した（図１４ｖＢ）。これらのデータは、１個のＲＡＧＮＮＮ反復および７個のＲＡＧＮＮ反復を含有する８反復ｔｂｓがＴＲＡＰ媒介性抑制活性を保有することを示している。１以上のＲＡＧＮＮＮ反復を含有する８個未満の反復ｔｂｓの配列はより低いＴＲＡＰ媒介性抑制活性を有しうる。
実施例８ｃ．ＲＡＧＮＮ反復コンセンサスの５つの位置における好ましいヌクレオチドの特徴づけ
ｔｂｓのＲＡＧＮＮコンセンサス反復を更に特徴づけるために、全てのＧＡＧｘｘ反復から構成される×１１反復ｔｂｓのコンテキストにおける各ヌクレオチド（Ｇ｜Ａ｜Ｔ［Ｕ］｜Ｃ）を用いて、ＮＮスペーサーを試験した。これらのｔｂｓ変異体をｐＣＭＶ−［ｔｂｓ］ＧＦＰ内にクローニングして×１１Ｍ ｔｂｓに取って代え、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞 ＋／− ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］の一過性コトランスフェクションにより試験した。４８時間後、細胞をフローサイトメトリーにより分析し、ＧＦＰ発現スコアを計算した（図２３ｉ）。これはＮＮ位におけるピリミジンの優先性を示した。機能性の一般的順位はＴ［Ｕ］＞Ｃ＞Ｇ／Ａであった。最初の（Ｒ）位における最も機能的なヌクレオチドを試験するために、各ヌクレオチドＧ、Ａ、Ｔ［Ｕ］またはＣを、×１１、×８または×６反復を含むｔｂｓ内のｘＡＧＡＡ反復内に挿入した。これは、最弱のスペーサー反復（ＮＮ＝ＡＡ）のコンテキストにおいては、Ｇが最初の位置において最も機能的であることを示した。［ＴＡＧＡＡ］×１１の最初の位置におけるＴ［Ｕ］は最低限度に機能的であるに過ぎず、これらのｘＡＧＡＡ反復のいずれにおいてもＡおよびＣは機能的でなかった。したがって、縦列ｘＡＧＡＡ反復含有ｔｂｓのコンテキストにおいては、ｘはＴではなく、Ｇでなければならない。
次に、ＲＡＧＮＮ反復コンセンサスの第１位におけるＧまたはＴの相対的優先性を試験した。高度に機能的なｔｂｓ（１１×ＧＡＧＴＴ）のコンテキストにおいて、ＧＡＧＴＴ反復をＴＡＧＴＴ反復で漸進的に置換した。ＴＡＧＴＴ反復を増加させる（ＧＡＧＴＴ反復を置換する）ことはｔｂｓの抑制機能を僅かに低減したに過ぎなかった。図２３ｉの結果を考慮すると、これは、ＲＡＧＮＮ反復コンセンサスにおいては、可変性ヌクレオチドのうち、機能性のために最も重要な位置がＮＮスペーサーであり、それに次いでＲであることを示唆している。該データは、ＮＮ位におけるピリミジンが最も好ましいことを示した。
ＲＡＧＮＮ反復コンセンサスのこの特徴を更に特徴づけるために、もう１つの一連のｔｂｓ変異体を構築した。この場合、ＧＡＧｘｘのコンテキストにおける少なくとも１つはＮ＝Ｔであった（図２３ｉｉ）。これは、最初のＮ（ＲＡＧＮＮの第４位）が好ましくはピリミジンであり、より一層好ましくはＴ［Ｕ］である場合に最大抑制が達成されることを示した。このＲＡＧＮＮ配列の縦列反復はトランスジーンＯＲＦの上流に複数のＡＴＧコドンを与え、これは下流トランスジーンの発現を低減する可能性があるため、ＧＡＧＡＴは試験しなかったことに注意されたい。
これらの知見の多くは、インビトロまたはインビボで試験されたＴＲＡＰ−ｔｂｓ相互作用に関する公開されている報告に合致している［細菌］（Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｙ．Ｊ．，Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１７）：５１５９−５１６３）。尤も、幾つかの相違が見られる。例えば、本研究においては、ＲＡＧＣＣ反復はＴＲＡＰ抑制の非常に有効なメディエーターであることが判明したが、他の研究は、このスペーサーが二次構造ゆえに活性を低減することを示唆している（Ｘｉｒａｓａｇａｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ ２７３（４２）：２７１４６−２７１５３，Ｏｃｔ １９９８）。このことは、ＴＲＡＰの存在下で特異的ｔｂｓにより可能となる抑制の大きさを試験するためには、ＲＡＧＮＮ反復を含む特異的ｔｂｓ配列が、ベクター産生のために意図される細胞（限定的なものではないが、典型的にはＨＥＫ２９３に基づく細胞）において、ＴＲＡＰ−ｔｂｓ抑制系内で実験的に試験される必要があることを示している。総合すると、本研究におけるデータは、ＲＡＧＮＮ反復コンセンサスの好ましいヌクレオチドが以下のとおりであることを示している：
・ＮＮスペーサー位置の少なくとも１つにおけるピリミジン；
・ＮＮスペーサー位置の最初の位置におけるピリミジン；
・ＮＮスペーサー位置の両方におけるピリミジン；
・好ましくはＲ位におけるＧ。
実施例９．翻訳がＩＲＥＳに依存的であるトランスジーンカセットにおけるＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置の試験
マルチシストロンベクターは、患者における標的細胞へ２以上の遺伝子を送達する際の有用な手段である。したがって、ＴＲＩＰ系（ＩＲＥＳに依存的なものを含む）を使用してベクターゲノム内の複数のトランスジーンを抑制することができれば好都合であろう。遠位ＯＲＦが配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に依存的であるトランスジーン発現カセットにＴＲＩＰ系が適用されうるかどうかを試験するために、図１５Ａに記載されているビシストロンベクターを構築した。簡潔に説明すると、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素をコードする配列をｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰ内に挿入して、ｐＣＭＶ−Ｖｉ−ｔｂｓｘ１１ＧＦＰ内にコードされるビシストロン遺伝子カセットＶＥＧＦ−ＩＲＥＳ−ｔｂｓＧＦＰを得た。４個のみの［ＲＡＧＮＮ］反復を含有する又は反復を含有しない２つの更なる対照構築物を作製した。これらはＴＲＡＰにより抑制可能であるとは予想されなかった。該構築物をスタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］のいずれかと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にコトランスフェクトし、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより評価した。これらのデータを図１５Ｂに示す。ビシストロンカセットにおける遠位からのＧＦＰ発現のレベルは単一シストロン構築物のものより約７倍低かったが、これはビシストロン遺伝子配置には非典型的である。ｐＣＭＶ−Ｖｉ−ｔｂｓｘ１１ＧＦＰトランスフェクト化細胞におけるＧＦＰ発現のレベルは更に２倍低かったが、このことは、該ｔｂｓ配列の配置がＩＲＥＳ依存的翻訳効率を若干低減したことを示している。ｐＣＭＶ−Ｖｉｔｂｓｘ１１Ｇ ＋ ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］でトランスフェクトされた細胞におけるＧＦＰ発現のレベルはスタッファープラスミドの場合より１７倍低かったが、このことは、該ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置が配列内リボソーム進入のコンテキストにおいて機能しうることを示している。更に、この機能性はｔｂｓの存在およびＴＲＡＰタンパク質の存在に依存的であった。なぜなら、該対照および４×反復構築物はＴＲＡＰに対して有意には応答しなかったからである。これらのデータは、ＩＲＥＳ依存的翻訳の制御による遺伝子発現の調節におけるＴＲＡＰ／ｔｂｓの新規使用を初めて示すものである（図１９ｉおよび１９ｉｉにおけるデータは、ＴＲＩＰ系を使用してマルチシストロンｍＲＮＡ内の複数のＯＲＦが同時に抑制されうることを更に実証している）。
ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置によるＷＰＲＥ含有ＳＩＮベクターからの産生細胞におけるＧＦＰトランスジーンの抑制
実施例１０．ＴＲＩＰ系を使用するＷＰＲＥを含有するＳＩＮ−レンチウイルスベクターの製造
ウッドチャック転写後要素（ＷＰＲＥ）をも含有するＳＩＮ−ベクターの製造（産生）にＴＲＩＰ系を適用した。ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置を使用するトランスジーン翻訳抑制を例示するために使用した初期ベクターゲノム（ｐＯＮＹ８．４ＲＣ−ｔｂｓＧＦＰ）はＳＩＮベクターではなく、転写後調節要素（ＰＲＥ）（現在のレトロウイルスベクターおよび他のウイルスベクター系に典型的な特徴である）を含有しなかった。ＷＰＲＥは、ポリアデニル化部位におけるリードスルーを低減することにより機能することが示されている（Ｈｉｇａｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ，Ｕ．Ｆ．，Ｐｅｒｕｍｂｅｔｉ Ａ，Ｊｉａｎｇ Ｇ，Ｚａｒｚｕｅｌａ Ａ，Ｃｈａｎｇ ＬＪ，Ｋｏｈｎ ＤＢ，Ｍａｌｉｋ Ｐ．（２００７）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １４（１７）：１２９８−１３０４）。しかし、初期報告は、ＷＰＲＥが他の様態でＲＮＡレベルで作用しうることを示唆した。ＷＰＲＥを含有するＳＩＮ−ベクターゲノムからのトランスジーン発現を抑制するためにＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置が使用されうるかどうかを試験するために、ベクターゲノムｐＯＮＹ８．９ＲＣＴＧ（＋ＷＰＲＥ）を構築し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現において試験した。図１６は、ＳＩＮ−ベクターゲノム上のＷＰＲＥの含有がＴＲＩＰ系に悪影響を及ぼさないことを示した。ｐＯＮＹ８．４ＲＣ−ｔｂｓＧＦＰおよびｐＯＮＹ８．９ＲＣＴＧ（＋ＷＰＲＥ）からのＧＦＰ抑制は同等であった。
治療用トランスジーンを発現するベクターの産生力価を増加させるためのＴＲＩＰ系の使用
実施例１１．ＴＲＩＰ系を使用するｈｕ第ＶＩＩＩ因子発現ベクターの製造
血友病Ａの治療のために開発されたＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）はＨＥＫ２９３Ｔ細胞において製造することが困難である。なぜなら、トランスジーンｈｕ第ＶＩＩＩ因子はベクタービリオン内へのＶＳＶＧエンベロープの取り込みを著しく抑制することが示されているからである。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において活性でない組織特異的プロモーターがｈｕ第ＶＩＩＩ因子の発現の駆動のために使用されない限り、ＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）のベクター力価は低い（混合実験データに関しては、図３ｉを参照されたい）（Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ ＰＡ，Ｓ．Ｃ．，Ｗｉｌｋｅｓ ＦＪ，Ｃｕｓｔａｒｄ ＥＪ，Ｂｅａｒｄ ＧＬ，Ｋｉｎｇｓｍａｎ ＳＭ，Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ ＫＡ（２００８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５（４）：２８９−２９７）。ＨＥＫ２９３Ｔ産生細胞におけるｈｕ第ＶＩＩＩ因子発現を抑制することによりベクター力価が増加しうるかどうかを試験するために、ＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）にＴＲＩＰ系を適用した。ベクターゲノムＲｅＱｕｎｉａｔｅ−ｔｂｓおよびＲｅＱｕｎｉａｔｅ−ｃｏｎを構築した（図１７ｉ）。この場合、元のＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）ゲノム内の５’ＵＴＲをｔｂｓ−ＧＦＰレポーターベクター（図６に示されている）からの同じ５’ＵＴＲで置換した。ＲｅＱｕｎｉａｔｅ−ｃｏｎベクターゲノムは、ｔｂｓがスクランブル化（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）されている以外はＲｅＱｕｉｎａｔｅ−ｔｂｓと同じ５’ＵＴＲを含有していた。ｔｂｓ陰性ｍＲＮＡからのｈｕ第ＶＩＩＩ因子の翻訳が、ｔｂｓ含有ｍＲＮＡと比較して配列の長さおよびヌクレオチド含量の点で類似した５’ＵＴＲのコンテキストとなるように、これを行った。ベクターゲノムプラスミドＤＮＡをｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］に対して５倍モル過剰で使用して、これらのベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞において作製した。濾過されたベクター上清をＤＮＡ組込みアッセイに付して、力価を決定した。また、ベクター上清を〜１００倍濃縮し、ＰＥＲＴアッセイに付して粒子数を定量し、免疫ブロット法により同数のベクター粒子をＶＳＶＧ含量に関して分析した。これらの分析からのデータを図１７ｉｉに示す。ＴＲＩＰ系は、ＴＲＡＰ［Ｈ６］およびＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）の存在下で産生されたＲｅＱｕｉｎａｔｅ−ｔｂｓと比較して、ｈｕ第ＶＩＩＩ因子発現ベクターゲノムのＤＮＡ組込み力価を３０倍改善した。ベクター粒子内へのＶＳＶＧの取り込みの度合は、該ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置を使用して著しく増加し、これはベクター力価と密接に相関した。興味深いことに、ＲｅＱｕｎｉａｔｅ−ｃｏｎで作製されたベクター粒子内へのＶＳＶＧの取り込みは若干増加し、＋／− ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］において、ベクター力価における僅かな付随的増加が観察された。これは、この構築物からのｈｕ第ＶＩＩＩ因子の準最適発現によるものであった可能性がある。
実施例１２．ＴＲＩＰ系を使用するＣＯＸ２および／またはＦＲＰ発現ベクターの製造
緑内障を治療するためのレトロウイルスベクターの開発に関連して、幾つかのトランスジーンが、眼圧を低減するために評価されている。それらには、ＰＴＧＦＲ遺伝子によりコードされるプロスタグランジンＦ２αの受容体であるプロスタグランジンＦ受容体（ＦＰＲ）、およびプロスタグランジン生合成における律速酵素であるシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）が含まれる。これらの遺伝子の両方の同時送達（別々の単一遺伝子ベクターによるもの、またはビシストロン遺伝子ベクターによるもの）は緑内障患者に有益であると期待される。しかし、これらのトランスジーンをコードするベクターの力価はマーカー遺伝子ベクター力価と比べて著しく低いことが判明している。この影響の少なくとも一部はトランスジーン産物によるものであることが示されている。なぜなら、ベクター産生中のｌａｃＺ−ベクターゲノムとのこれらのベクターゲノムの混合はｌａｃＺ−ベクター力価の減少を引き起こすからである（図３ｉｉを参照されたい）。
ＴＲＩＰ系が緑内障ベクター力価を増加させうるかどうかを試験するために、ｔｂｓ×１１ｍ変異体配列（図１４ｉＡを参照されたい）を、図１８ｉに示されている単一トランスジーンベクターゲノム内にクローニングした。ウイルスベクター調製物をＨＥＫ２９３Ｔにおいて作製し、同時にまた、ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］またはスタッファープラスミドをベクターゲノム：ＴＲＡＰプラスミドの１：０．２のモル比でコトランスフェクトした。ベクター調製物を標準的なＤＮＡ組込みアッセイにより力価測定し（図１８ｉｉＡ）、細胞ライセートをＣＯＸ−２ベクター産生細胞およびＣＯＸ−２ベクター導入細胞の両方から採取して、標的細胞におけるｔｂｓ含有転写単位からのＣＯＸ−２の発現を評価した。これらの分析からのデータをそれぞれ図１８ｉｉＢおよび１８ｉｉＣに示す。ｔｂｓ−ＣＯＸ−２ベクターの力価は未修飾ＣＯＸ−２ベクターのものより１００倍高く（図１８ｉｉＡ）、産生細胞におけるＣＯＸ−２のレベルは力価と逆相関した（図１８ｉｉＢ）。ＣＯＸ−２発現は、ＴＲＩＰ系を使用して産生されたベクターが導入された標的細胞内のみで頑強に検出可能であったが、このことは、ｔｂｓ配列が標的細胞におけるトランスジーンの発現に影響を及ぼさなかったことを示している（図１８ｉｉＣ）。ＴＲＩＰ系を使用して産生されたＦＰＲ−ベクターの力価は標準的ベクターと比べて２４倍増加した（図１８ｉｉｉ）。この場合も、これは該系におけるＴＲＡＰおよびｔｂｓの両方に依存的であった。
ＣＯＸ−２およびＦＰＲの両方を発現するマルチシストロンベクターを試験するために、ｔｂｓ×１１Ｍ配列を、図１９ｉに示されているベクターゲノムプラスミド内クローニングした。ＣＯＸ−２およびＦＲＰを＋／− ｔｂｓ位でコードするビシストロンベクターゲノムプラスミドを作製した。ウイルスベクター調製物をＨＥＫ２９３Ｔにおいて標準条件下で産生させ、同時にまた、ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］またはスタッファープラスミドをベクターゲノム：ＴＲＡＰプラスミドの１：０．２のモル比でコトランスフェクトした。ベクター調製物を標準的なＤＮＡ組込みアッセイにより力価測定し、細胞ライセートをベクター産生細胞から採取した（図１９ｉｉ）。ＦＰＲに対する商業的に入手可能な抗体が存在しないため、ＣＯＸ−２に対する抗体のみを使用して、細胞ライセートの免疫ブロット法を行った。これらのデータは、ＴＲＩＰ系を使用してマルチシストロンｍＲＮＡが２以上のＯＲＦ位置において同時に抑制されうることを示している。この抑制の結果はベクター力価における１００倍の増加を可能にした（ｐＫＣＭＶ−ＣＯＸ２−ｉ−ＦＰＲ［＋スタッファー］とｐＫＣＭＶ−ｔｂｓＣＯＸ２−ｉ−ｔｂｓＦＰＲ［＋ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］］との比較）。
実施例１３．ＴＲＩＰ系を使用するＯＸＢ−１０２ベクターの製造
ＯＸＢ−１０２は、パーキンソン病の治療のために開発されているＥＩＡＶベクターであり、それは、ドーパミン生合成に関与する３つのタンパク質、すなわち、チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼおよび芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼを発現する（ＷＯ ２０１３／０６１０７６に記載されている）。既に記載されているとおり、これらの酵素はベクター力価に悪影響を及ぼさないことが公知であるが、ベクターの処理／濃度の観点、およびより低い免疫原性のベクター調製物を患者に投与するという観点からは、ベクター産生細胞におけるトランスジーン発現を抑制することが有益でありうる。したがって、ｔｂｓ×１１Ｍ配列を、図２０ｉに示されているマルチシストロンＯＸＢ−１０２ベクターゲノムプラスミドの５’近位ＯＲＦ内にクローニングした。得られたベクターにおける融合遺伝子チロシンヒドロキシラーゼ：ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ１（ＴＨ−ＣＨ１）の翻訳はベクター産生細胞のみにおいてＴＲＡＰにより抑制されると予測された。ウイルスベクター調製物をＨＥＫ２９３Ｔにおいて産生させ、同時にまた、ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］またはスタッファープラスミドをベクターゲノム：ＴＲＡＰプラスミドの１：０．２のモル比でコトランスフェクトした。ベクター調製物を標準的なＤＮＡ組込みアッセイにより力価測定し、細胞ライセートをベクター産生細胞から採取した。図２０ｉｉＡおよび２０ｉｉＢは、ＴＨおよびＣＨ１の両方に対する抗体を使用する免疫ブロットによる判断で、ＴＨ−ＣＨ１融合タンパク質がベクター産生細胞において抑制されるが（図２０ｉｉＢ）、抗ＴＨ抗体を使用する免疫染色による判断で、導入細胞において容易に検出されることを実際に示している。
実施例１４．ＴＲＩＰ系を使用するＨＩＶ−１に基づくレンチウイルスベクターの製造
本発明者らは、ＨＩＶに基づくレンチウイルスベクターの製造（産生）におけるＴＲＩＰ系の有用性を実証しようと努力した。ｔｂｓ×１１Ｍ配列を、ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰをコードする標準的なＨＩＶ−１ベクターゲノム内にクローニングした（図２５ｉＡ）。１０ｃｍプレート（トランスフェクションの２４時間前に３．５×１０６ 細胞／プレートで播かれたもの）当たり２５μＬのリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００ＣＤを使用して、４．５μｇのベクターゲノム、１．５μｇのｇａｇｐｏｌ、１．１μｇのｒｅｖ、０．７μｇのｖｓｖｇ、および０．５６μｇのｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（＋ＴＲＡＰ）または０．５６μｇのｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（−）の質量比のパッケージング成分プラスミドでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性コトランスフェクションにより、ＧＦＰコード化ベクターを産生させた。培養を一晩インキュベートした後、酪酸ナトリウムを１０ｍＭの最終濃度まで５時間加えた。ついで培地を交換し、培養をトランスフェクションの２日後までインキュベートし、その時点で粗ベクター上清を回収し、濾過（０．２μｍ）し、−８０℃で保存した。産生終了細胞をフローサイトメトリーに分析し、ＧＦＰ発現スコアを計算した。ベクター上清をＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトランスダクションにより力価測定し、ついでフローサイトメトリーによる分析を行った。図２５ｉｉＢは産生終了細胞のＧＦＰ発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）および得られたベクター力価の両方を示す。記載されているｔｂｓ配列をＨＩＶ−１ベクターゲノムが含有する場合およびＴＲＡＰが共導入された場合にのみ、ＧＦＰ発現は２−Ｌｏｇ抑制された。しかし、ベクター力価はこれらの修飾によっては影響されなかった。これらのデータは、原則として、ＴＲＩＰＬｅｎｔｉ（レンチ）系を使用して、いずれかのトランスジーンが、ＨＩＶ−１に基づくベクター産生細胞において抑制されうることを示している。
治療用遺伝子をコードするＨＩＶ−１に基づくベクターの力価が、ＴＲＩＰＬｅｎｔｉ系を使用して改善されうるかどうかを評価するために、ｔｂｓ×１１Ｍ ｔｂｓを、５Ｔ４−ＣＡＲをコードするＨＩＶ−１ベクターゲノムのトランスジーンカセット（図２５ｉｉＡ）の５’ＵＴＲ内に挿入した。この治療用ベクターはＴ細胞の遺伝的修飾のためのものであり、抗原５Ｔ４を発現する腫瘍細胞を該Ｔ細胞が標的とし殺すことを可能にする。得られたベクターＨＩＶ−ｔｂｓ−ｈ５Ｔ４．ＣＡＲを、（ＧＦＰベクターに関する）前記と同じ条件下で、すなわち、ベクター成分 ＋／− ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のコトランスフェクションにより産生させた。ベクター上清をＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＤＮＡ組込みアッセイにより力価測定した。図２５ｉｉＢはこの実験の結果を示す。ＴＲＡＰ［Ｈ６］を産生細胞内で共発現させた場合、対照（ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ）と比較して、ＨＩＶ−ｔｂｓ−ｈ５Ｔ４．ＣＡＲの力価は３０倍大きかった。これらのデータは、産生細胞における５Ｔ４．ＣＡＲの発現が活性なベクターの産生に有害であること、および、ＴＲＩＰ系がトランスジーン発現の抑制によりこの問題を克服することを示している。
実施例１５．ＴＲＩＰ−ｔｂｓ配置は細胞質におけるトランスジーンｍＲＮＡレベルに影響を及ぼさない
ＴＲＡＰ−ｔｂｓ配置は極めて強力なトランスジーン抑制を可能し、専ら翻訳レベルで作用すると考えられている。ｔｂｓをコードするｍＲＮＡの定常状態プールがＴＲＡＰの存在下で影響されるかどうか（例えば、考えられうる不安定化効果）（これは、トランスジーン発現の抑制にも寄与しうるであろう）を試験するために、トランスジーン細胞質ＲＮＡの相対レベルを、ｐＣＭＶ−［ｔｂｓ］ＧＦＰ ＋／− ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において測定した。細胞をトランスフェクトし、トランスフェクションの２日後にＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより測定した（図２６Ａ）、同型培養を分画し、核を除去し、全細胞質ＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮＡｅａｓｙキットを使用して精製した。ＲＮＡをＤＮＡアーゼ処理した後、ＧＦＰ標的配列に対するＦＡＭ−プローブ／プライマーセットを使用してｑＲＴ−ＰＣＲを行った（図２６Ｂ）。これまでのデータと合致して、ＴＲＡＰ−ｔｂｓ配置はＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現を２−Ｌｏｇ抑制することが可能であった。しかし、細胞質内のＧＦＰ ｍＲＮＡの検出レベルは全ての条件にわたって僅か〜２倍変動したに過ぎなかった（全てのＣｔ値は１．５サイクル未満で変動した）。これらのデータは、ＴＲＡＰ媒介性トランスジーン抑制の最も考えられうるメカニズムが翻訳におけるものであることを証明している。
実施例１６．構成的プロモーターをコードするＨＩＶ−１に基づくベクターからのベクター産生細胞におけるＴＲＡＰ／ｔｂｓ媒介性ビシストロントランスジーン抑制と、組織特異的プロモーターをコードするＨＩＶ−１に基づくベクターからの該抑制との比較
転写レベルにおけるトランスジーン抑制と比較してＴＲＡＰ媒介性抑制（翻訳レベルのもの）を試験するために、組織特異的プロモーター（ＶＭＤ２；光受容体細胞発現（Ｅｓｕｍｉ，Ｎ．ら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１９０６４−７３），ｍＡｌｂＡＴ；肝細胞発現（Ｋｒａｍｅｒ，Ｍ．Ｇ．ら（２００３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７：３７５−３８５））または構成的ＣＭＶプロモーターによりトランスジーン転写が駆動されるＨＩＶ−１に基づくベクターゲノムを構築した。該トランスジーンカセットはビシストロンであり、第１ ＯＲＦにおいてはホタル（ホチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ））ルシフェラーゼを、そして第２ ＯＲＦにおいてはＧＦＰをコードしており、それらの２つのＯＲＦの間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が挿入されている。単一ｔｂｓ（×１１Ｍ）配列を両方のレポーター遺伝子の上流に挿入した。第１または第２ ＯＲＦのみがＴＲＡＰ−ｔｂｓにより調節される代替的ＣＭＶプロモーター構築物、およびいずれのｔｂｓ配列をも含有しない又はプロモーターを含有しない対照を作製した（図２７ｉ）。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてベクター粒子を作製するために７個のベクターゲノムを使用した。ベクターゲノムプラスミド ＋ パッケージング成分およびｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（対照）のいずれかで細胞をコトランスフェクトした。また、ｐＧＬ３−対照（ＳＶ４０プロモーター駆動性レニラ・レニフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ルシフェラーゼ）を加えて（全ＤＮＡに対して１：４０の比）、トランスフェクション効率対照を得た。プラスミドの比は以下のとおりであった：ゲノム（４．５）｜ＧａｇＰｏｌ（１．５）｜Ｒｅｖ（１．１）｜ＶＳＶＧ（０．７）｜ＴＲＡＰ／Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（０．５６）｜ｐＧＬ３対照（０．２３）。トランスフェクションは９６ウェルの規模で二重重複プレートにおいて行い、各条件を三重重複で行った。トランスフェクションの１日後、培養を１０ｍＭ 酪酸ナトリウムで５〜６時間誘導した（典型的なベクター産生法）後、培地を新鮮培地と交換した。産生終了細胞をフローサイトメトリーにより分析してＧＦＰ発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）を得て、第２位における発現を測定し、あるいは産生終了細胞をＤｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）レポーターアッセイプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従い受動細胞溶解（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ）バッファー中で細胞溶解して、第１位における発現を測定した。Ｄｙｎｅｘ ＭＬＸプレートリーダーを、製造業者の方法を用いて前記プロトコルに従い使用して、ホタルルシフェラーゼ発現に関してライセートを分析した。
ベクター産生細胞におけるビシストロンカセットに関する発現データを図２７ｉｉに示す。予想どおり、ＴＲＡＰが供給された場合のｐＨＩＶ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ｉＧＦＰからは、ｔｂｓの非存在ゆえに、ルシフェラーゼまたはＧＦＰのいずれの抑制も観察されなかった。ｐＨＩＶ−ＣＭＶ−ｔｂｓＬｕｃ−ｉｔｂｓＧＦＰおよびｐＨＩＶ−ＣＭＶ−ｔｂｓＬｕｃ−ｉＧＦＰからはルシフェラーゼ発現の抑制が観察されたが、ｐＨＩＶ−ＣＭＶ−Ｌｕｃ−ｉｔｂｓＧＦＰからは観察されなかった。
興味深いことに、プロモーター非含有ゲノムｐＨＩＶ−Ｎｕｌｌ−ｔｂｓＬｕｃ−ｉｔｂｓＧＦＰはＣＭＶｐ変異体より１００倍低いレベルでルシフェラーゼを発現したが、この発現レベルはＴＲＡＰにより抑制可能であった。より低いレベルの（ＴＲＡＰの非存在下の）このルシフェラーゼ発現は完全長ベクターゲノムＲＮＡからＣＡＰ依存的に（すなわち、完全長ベクターＲＮＡの５’末端からのリボソームスキャニングにより）誘導される可能性がある。したがって、ＴＲＡＰは完全長ベクターゲノムＲＮＡ上のｔｂｓに結合し、より長いこのＲＮＡおよび内部転写産物からのトランスジーン発現を阻止しうる。これは、高レベルのＧＦＰがｐＨＩＶ−Ｎｕｌｌ−ｔｂｓＬｕｃ−ｉｔｂｓＧＦＰにより発現された事実によって更に実証される。これは、おそらく、ＩＲＥＳ要素がＧＦＰ翻訳のみを駆動することによるものであろう。ＴＲＡＰは、ｐＨＩＶ−Ｎｕｌｌ−ｔｂｓＬｕｃ−ｉｔｂｓＧＦＰに由来する完全長ベクターゲノムＲＮＡからのＧＦＰのこの発現を抑制することが可能であった。これは、ルシフェラーゼ発現が（ＣＭＶｐ構築物と比べて）低いにもかかわらず、組織特異的構築物ｐＨＩＶ−ＶＭＤ２−ｔｂｓＬｕｃ−ｉｔｂｓＧＦＰおよびｐＨＩＶ−ｍＡｌｂ−ｈＡＡＴ−ｔｂｓＬｕｃ−ｉｔｂｓＧＦＰが、（ＴＲＡＰの非存在下）ｐＨＩＶ−Ｎｕｌｌ−ｔｂｓＬｕｃ−ｉｔｂｓＧＦＰと比べて類似レベルのＧＦＰを産生したことにより裏付けられ、このことは、ＧＦＰ発現の大部分が内部プロモーター駆動性カセットに由来していなかったことを示している。このレベルの（完全長ベクターゲノムＲＮＡからの）ＧＦＰ発現はＴＲＡＰによって効率的に抑制可能であった。最後に、ｐＨＩＶ−ＶＭＤ２−ｔｂｓＬｕｃ−ｉｔｂｓＧＦＰおよびｐＨＩＶ−ｍＡｌｂ−ｈＡＡＴ−ｔｂｓＬｕｃ−ｉｔｂｓＧＦＰからのルシフェラーゼ発現のレベルはｐＨＩＶ−Ｎｕｌｌ−ｔｂｓＬｕｃ−ｉｔｂｓＧＦＰの場合より〜２倍高かった。このことは、これらの組織特異的プロモーターがＨＥＫ２９３Ｔにおいて若干漏出性であることを示している。この低レベルのルシフェラーゼ発現でさえもＴＲＡＰによって抑制された。
これらの観察を、図２７ｉｉｉに示す図に要約する。これらのデータは、ＴＲＩＰ系がマルチシストロントランスジーンを同時に抑制することが可能であり、組織特異的プロモーターの使用と比較した場合の利点を有することを示している。レトロウイルスベクター産生の場合、大量の完全長ベクターゲノムＲＮＡが細胞内で転写される必要があるが、ここで、本発明者らは、特にＩＲＥＳ要素が使用された場合、トランスジーンタンパク質の翻訳がこの完全長分子から可能であることを示している。ＴＲＩＰ系は翻訳レベルで抑制を媒介するため、それは完全長ベクターゲノムＲＮＡおよび内部由来トランスジーンカセットｍＲＮＡからのトランスジーン発現を抑制しうる。
実施例１７．ＤＮＡに基づくウイルスベクターの産生におけるＴＲＡＰ／ｔｂｓ媒介性トランスジーン抑制の有用性の実証；事例研究１−ＡＡＶに基づくベクター
以下の研究はＴＲｉＰＡＶＶベクター産生系を示し、これは、レトロ／レンチウイルスのようなＲＮＡに基づくウイルスベクター系に関して記載されているのと同様にしてＴＲＡＰ−ｔｂｓ配置を使用する。図２８ｉはＴＲｉＰＡＶＶ系の非限定的な一例を示し、これは、以下の発現カセットを含有する産生細胞（例えば、アデノウイルスＥ１発現細胞；ＨＥＫ２９３に基づく細胞、ＰＥＲ．Ｃ６に基づく細胞）を含む：［１］トランスジーンの５’ＵＴＲ内（および／またはＩＲＥＳと下流トランスジーンとの間）にｔｂｓが挿入されるように修飾されたＡＡＶベクターゲノム、［２］ｒｅｃａｐ発現プラスミド、［３］ヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、ＶＡ遺伝子）、および［４］ＴＲＡＰ発現カセット（一過性にトランスフェクトされた又は安定なＴＲＡＰ細胞系）。
トランスジーン発現がＡＡＶベクター産生細胞において抑制されうるかどうかを試験するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶ−（ＣＭＶ）−ｔｂｓＧＦＰベクター（血清型２）の産生にＴＲｉＰＡＡＶ系を適用した。まず、ＴＲＡＰ媒介性抑制に対するｒｅｃａｐおよびアデノウイルスヘルパー機能の共発現の影響を試験し、ｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰレポータープラスミドと比較した（図２８ｉｉ）。ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］、ｐＲｅｐＣａｐ２ およびｐＨｅｌｐｅｒ（ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］に関して特記されているもの以外は全て、２μｇ／１０ｃｍプレートの等しい質量比におけるもの；図２８ｉｉを参照されたい）の種々の組合せにおけるｐｓｃＡＡＶ−ＧＦＰまたはｐｓｃＡＡＶ−ｔｂｓＧＦＰまたはｐＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰのいずれかでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を三重重複でトランスフェクトした。予想どおり、ＴＲＡＰの発現は、ｔｂｓを欠くｐｓｃＡＡＶ−ＧＦＰによるＧＦＰ発現には影響を及ぼさなかった。ｐｓｃＡＡＶ−ｔｂｓＧＦＰからのＧＦＰ発現はＴＲＡＰの存在下（１：１の比のＴＲＡＰおよびｓｃＡＡＶベクターゲノムプラスミド）で約３−Ｌｏｇ抑制された。ｐＨｅｌｐｅｒまたはｐＲｅｐＣａｐ２の共発現はＴＲＡＰ媒介性抑制のこのレベルに影響を及ぼさなかった。ｐｓｃＡＡＶ−ｔｂｓＧＦＰ、ｐＲｅｐＣａｐ２、ｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］を全て一緒に（すなわち、ｓｃＡＡＶ−ｔｂｓＧＦＰベクター粒子が産生される条件下で）トランスフェクトした場合、ＴＲＡＰによるＧＦＰ抑制のレベルは３００倍を超えた。ｓｃＡＡＶ−ｔｂｓＧＦＰ産生の条件下のｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（ゲノムとの比は１：１［２μｇ］〜１０：１［０．２μｇ］）の、１０倍の力価は、より大量のＴＲＡＰプラスミドの投入で、３−Ｌｏｇの抑制が可能でありうることを示している。ＴＲｉＰＡＡＶ系を使用してＡＡＶベクターゲノム内のトランスジーンカセットの発現が少なくとも３００倍抑制されうること、およびパッケージング／ヘルパー機能自体はＴＲＡＰ媒介性抑制を抑制しないことを、これらのデータは示している。
ＴＲｉＰＡＡＶ系を使用して機能的ＡＡＶベクター粒子が産生されうることを実証するために、ｐｓｃＡＡＶ２−ＧＦＰゲノム（＋／− ｔｂｓ）、ｐＲｅｐＣａｐ２、ｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（ＴＲＡＰ）またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（−）（２μｇの全ＤＮＡ）で細胞をトランスフェクトすることにより、ｓｃＡＡＶ２−［ｔｂｓ］ＧＦＰベクター粒子を１０ｃｍプレートの規模で産生させた。〜５３時間後、細胞を凍結−解凍し、ベクター粒子を、Ｖｉｒａｂｉｎｄ（商標）キットを使用して精製し、１００μＬ ＰＢＳの最終体積まで濃縮し、ついでＨＥＫ２９３ＴおよびＨＥＰＧ２細胞のトランスダクションにより力価測定した（図２８ｉｉｉ）。これらのデータは、ＡＡＶ−ＧＦＰベクターがＴＲｉＰＡＡＶ系において、標準的な方法の場合と同等の力価まで産生されうることを示しており、このことは、ｔｂｓ修飾およびＴＲＡＰの共発現がＡＡＶベクターの生物学を本質的に妨げないことを示している。したがって、ＴＲｉＰＡＡＶ系を使用してＡＡＶベクター産生細胞におけるトランスジーン発現の強力な抑制が可能であること、およびトランスジーン産物の活性がＡＡＶベクター粒子の力価または効力に有害である場合、この活性は著しく低減することを、この研究は示している。
ＴＲｉＰＡＡＶベクター系が、ＡＡＶベクターゲノムによりコードされる非常に毒性／問題のあるトランスジーンを産生細胞において抑制しうることを実証するために、ｓｃＡＡＶ２−ｔｂｓＢａｍａｓｅを構築した（図２８ｉｖＡ）。バルナーゼ（Ｂａｒｎａｓｅ）は、発現されると真核細胞に対して毒性である強力な細菌ＲＮアーゼであり、サイレンシングされない限りＡＡＶベクターの産生を妨げることが示されている（Ｃｈｅｎ Ｈ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ．，１，ｅ５７；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１２．４８，Ｎｏｖ ２０１２）。ＨＥＫ２９３ＴおよびＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲｉＰ［３Ｄ］細胞系をｐＲｅｐＣａｐ２およびｐＨｅｌｐｅｒパッケージング成分（ｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］を伴わない）でトランスフェクトした。ただし、ＧＦＰ発現に対するバルナーゼの効果を観察するために、等しい質量のｐｓｃＡＡＶ２−ＧＦＰ（図２８ｉｖＢ）およびｐｓｃＡＡＶ２−ｔｂｓＢａｒｎａｓｅゲノムプラスミドを混合し、あるいはｐｓｃＡＡＶ−（ＣＭＶ）−ＧＦＰのみをトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、これらの培養の写真を撮影し、これらを図２８ｖ：ｉ〜ｉｉに示す。ｐｓｃＡＡＶ−（ＣＭＶ）−ＧＦＰのみでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＴおよびＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲｉＰ［３Ｄ］培養は高レベルのＧＦＰ発現を示した（図２８ｖ：ｉｉ）。しかし、ｐｓｃＡＡＶ−（ＣＭＶ）−ＧＦＰゲノムおよびｐｓｃＡＡＶ−（ＣＭＶ）−ｔｂｓＢａｒｎａｓｅでコトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ培養は無視しうるレベルのＧＦＰを発現したが（図２８ｖ：ｉ）、このことは、おそらくトランスジーンｍＲＮＡおよびリボソームＲＮＡの分解ゆえに、バルナーゼ発現がタンパク質発現の低減の全体的な影響をもたらしていたことを示している。これとは対照的に、同じＤＮＡ混合物でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲｉＰ培養は相当なＧＦＰ発現を可能にしたが、このことは、これらの細胞におけるＴＲＡＰ［Ｈ６］の内因性レベルがバルナーゼ発現を抑制していたことを示している。より一層大きなレベルの内因性ＴＲＡＰを含有する安定細胞系を単離することによりバルナーゼ抑制を改善することが可能でありうる。ウイルスベクター産生中に発現される毒性トランスジーンタンパク質としてのバルナーゼのモデル化は最悪の場合のシナリオに相当し、この場合、デノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）タンパク質合成（ウイルスベクター成分を含む）が有効に阻止される。ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲｉＰ細胞におけるＧＦＰ発現の中等度の回復が観察されたことを考慮すると、これは、ＡＡＶベクター成分タンパク質の発現も生じたこと、およびバルナーゼをコードするＡＡＶベクター粒子の産生が安定なＴＲＡＰ細胞系において可能であることを示唆している。
実施例１８．ＤＮＡに基づくウイルスベクターの産生におけるＴＲＡＰ／ｔｂｓ媒介性トランスジーン抑制の有用性の実証；事例研究２−アデノウイルスに基づくベクター
以下の研究はＴＲＩＰＡｄｅｎｏベクター産生系を示し、これは、レトロ／レンチウイルスのようなＲＮＡに基づくウイルスベクター系に関して及びＤＮＡに基づくＡＡＶベクター（実施例１７）に関して記載されているのと同様にしてＴＲＡＰ−ｔｂｓ配置を使用する。図２９ｉはＴＲＩＰＡｄｅｎｏ系の非限定的な一例を示し、これは、以下の発現カセットを含有する産生細胞（例えば、アデノウイルスＥ１発現細胞；ＨＥＫ２９３に基づく細胞、ＰＥＲ．Ｃ６に基づく細胞）を含む：［１］トランスジーンの５’ＵＴＲ内（および／またはＩＲＥＳと下流トランスジーンとの間）にｔｂｓが挿入されるように修飾されたアデノウイルスに基づくベクターゲノム、および［２］ＴＲＡＰ発現カセット（一過性にトランスフェクトされた又は安定なＴＲＡＰ細胞系）。所望により、Ｅ１欠失ヘルパーウイルスがヘルパー依存的ベクター産生のために共導入されうる。
哺乳類細胞においてベクターＤＮＡ組換え中にＴＲＩＰＡｄｅｎｏ系においてトランスジーン発現が抑制されて、完全長Ａｄｅｎｏ−ｔｂｓＴｒａｎｓｇｅｎｅベクターゲノムが得られうることを実証するために、ｐＡｄｅｎｏ−ＣＭＶ−ＧＦＰおよびｐＡｄｅｎｏ−ｔｂｓＧＦＰシャトルプラスミド（ＲＡＰＡｄ（登録商標）キット，Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ）を構築した（図２９ｉｉＡ）。これらは、該トランスジーンカセットをコードするアデノウイルスゲノム（Ｅ１欠失体）の左側を含有していた。これらのシャトルプラスミドをｐＥＦ１ａ−ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（ＴＲＡＰ）またはｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ（−）と共に、そして並行トランスフェクションにおいてｐａｃＡｄ５ ９．２−１００（ＲＡＰＡｄ（登録商標）キット，Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ）（これは、該シャトルにおけるＡｄ５配列に対する重複相同性、およびＡｄ５ゲノム（Ｅ３欠失体）から右側ＩＴＲまでの残部を含む）（図２９ｉｉＢ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にコトランスフェクトした。シャトルプラスミド対ＴＲＡＰプラスミドの質量比は５：１であった。同型培養を４８時間インキュベートし、ついでフローサイトメトリーによりＧＦＰ発現に関して分析し（ＧＦＰ発現スコアを得た；ＭＦＩ×％ＧＦＰ）、あるいは細胞変性効果が観察されるまで（〜１４日）、インキュベートした。細胞を凍結−解凍し、細胞残渣を除去することにより、粗Ａｄｅｎｏ−ＣＭＶ−ＧＦＰおよびＡｄｅｎｏ ＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰベクターストックを調製し、ついでＨｅＬａ細胞上での力価測定を行った。
図２９ｉｉＢにおけるデータはトランスフェクションの４８時間後の培養における全体的なＧＦＰ発現を示し、トランスジーン５’ＵＴＲ内にｔｂｓが存在する場合かつＴＲＡＰの存在下でのみ、Ａｄシャトルプラスミドからのトランスジーン発現が２−Ｌｏｇ抑制されうることを示している。ｐａｃＡｄ５ ９．２−１００でのコトランスフェクションは抑制レベルに影響を及ぼさなかったが、このことは、哺乳類細胞においてベクターＤＮＡ組換え中にトランスジーン発現を抑制することが可能であることを示している。これは哺乳類細胞におけるアデノウイルスベクターの製造における大きな進歩に相当する。なぜなら、毒性トランスジーン発現はベクター組換え体の回収の可能性をなくしうるからである。
ＴＲＩＰＡｄｅｎｏ系がＡｄベクター増幅中にトランスジーン発現を抑制しうるかどうかを試験するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ［３Ｄ］細胞（ＴＲＡＰ［Ｈ６］を安定に発現する）にＡｄｅｎｏ−ＣＭＶ−ＧＦＰおよびＡｄｅｎｏ−ＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰを０．０１のＭＯＩで導入した。同型培養をベクター増幅中のＧＦＰ発現に関して接種後の種々の時点で分析し、ＧＦＰ発現スコアを得た（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）。この実験の結果は図２９ｉｉｉに示されており、ＧＦＰ発現が、ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ［３Ｄ］細胞系においてのみ、Ａｄｅｎｏ−ＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰの増幅中に＞４００倍抑制されることを示している（図２９ｉｉｉＡ）。予想どおり、それらの細胞系のいずれにおいてもＡｄｅｎｏ−ＣＭＶ−ＧＦＰの増幅中のＧＦＰ発現は類似していた（すなわち、抑制されなかった）。
ＴＲＡＰの存在下で産生されたＡｄｅｎｏ−ＣＭＶ−ＧＦＰおよびＡｄｅｎｏ−ＣＭＶ−ｔｂｓＧＦＰのベクターストックを、接種の４８時間後に細胞から回収し、残渣を除去し、ＨｅＬａ細胞上で力価測定を行った（図２９ｉｉｉＢ）。ＨＥＫ２９３ＴまたはＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ［３Ｄ］細胞において産生されたベクターの力価は同等であったが、このことは、ｔｂｓ修飾およびＴＲＡＰの発現がアデノウイルスベクターの生物学を本質的に妨げないことを示している。したがって、ＴＲＩＰＡｄｅｎｏ系を使用してアデノウイルスベクター産生細胞におけるトランスジーン発現の強力な抑制が可能であること、およびトランスジーン産物の活性がアデノウイルスベクター粒子の力価または効力に有害である場合、この活性は著しく低減することを、この研究は示している。
前記の本明細書に挙げられている全ての刊行物を参照により本明細書に組み入れることとする。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明の記載されている態様の種々の修飾および変更が当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求している本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連分野における当業者に明らかである、本発明を実施するための記載されている態様の種々の修飾が、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。

Claims (52)

  1. 関心のあるヌクレオチドに機能的に連結された結合部位を含む核酸配列であって、関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制されるように該結合部位がＲＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる、核酸配列。
  2. ＲＮＡ結合タンパク質がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）である、請求項１記載の核酸配列。
  3. ＲＮＡ結合タンパク質を欠く標的細胞において、関心のあるヌクレオチドが翻訳される、請求項１または２記載の核酸配列。
  4. ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２−３の複数の反復を含む、請求項1〜３のいずれか１項記載の核酸配列。
  5. ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２の複数の反復を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸配列。
  6. ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２の、少なくとも６個の反復を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の核酸配列。
  7. ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２−３の、少なくとも８個の反復を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸配列。
  8. ＲＡＧＮＮＮの反復の数が１以下である、請求項７記載の核酸配列。
  9. ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２の、８〜１１個の反復を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の核酸配列。
  10. ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２−３の、１１個の反復を含み、ここで、ＲＡＧＮＮＮの反復の数が３以下である、請求項１〜９のいずれか１項記載の核酸配列。
  11. 関心のあるヌクレオチドが治療効果をもたらす、請求項１〜１０のいずれか１項記載の核酸配列。
  12. 核酸配列がＲＲＥ配列またはその機能的代替物を更に含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の核酸配列。
  13. 請求項１〜１２のいずれか１項記載の核酸配列を含むウイルスベクター。
  14. ２以上の、関心のあるヌクレオチドを含み、少なくとも１つの、関心のあるヌクレオチドが、請求項１〜１２のいずれか１項に定められている結合部位に機能的に連結されている、請求項１３記載のウイルスベクター。
  15. レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスに由来する、請求項１３または１４記載のウイルスベクター。
  16. レンチウイルスに由来する、請求項１５記載のレトロウイルスベクター。
  17. ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する、請求項１６記載のレンチウイルスベクター。
  18. ウイルスベクターの産生に要求される成分をコードする核酸配列のセットを含むウイルスベクター産生系であって、ベクターゲノムが請求項１〜１２のいずれか１項記載の核酸配列を含む、ウイルスベクター産生系。
  19. ウイルスベクターがレトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来する、請求項１８記載のウイルスベクター産生系。
  20. ウイルスベクターがレトロウイルスベクターであり、ウイルスベクター産生系が、ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質ならびにＥｎｖタンパク質またはそれらの機能的代替物をコードする核酸配列を更に含む、請求項１９記載のウイルスベクター産生系。
  21. ウイルスベクター産生系が、ｒｅｖまたはその機能的代替物をコードする核酸配列を更に含む、請求項２０記載のウイルスベクター産生系。
  22. ウイルスベクターがレンチウイルスに由来する、請求項１９〜２１のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系。
  23. ウイルスベクターがＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する、請求項２２記載のウイルスベクター産生系。
  24. ＲＮＡ結合タンパク質がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）である、請求項１８〜２３のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系。
  25. 請求項１８〜２４のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系における使用のための、請求項１〜１２のいずれか１項記載の核酸配列を含むＤＮＡ構築物。
  26. 請求項１８〜２４のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系における使用のための、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列を含むＤＮＡ構築物。
  27. 該構築物が、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）をコードする核酸配列を含む、請求項２６記載のＤＮＡ構築物。
  28. 請求項１８〜２４のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築物のセットであって、請求項２５記載のＤＮＡ構築物、ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質をコードするＤＮＡ構築物ならびにＥｎｖタンパク質またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物を含む、ＤＮＡ構築物のセット。
  29. 請求項２６または２７記載のＤＮＡ構築物を更に含む、請求項２８記載のＤＮＡ構築物のセット。
  30. ｒｅｖ配列またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物を更に含む、請求項２８または２９記載のＤＮＡ構築物のセット。
  31. 請求項１〜１２のいずれか１項記載の核酸配列、請求項１８〜２４のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系または請求項２５〜３０のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物を含むウイルスベクター産生細胞。
  32. 請求項３１記載のウイルスベクター産生細胞であって、該細胞が、請求項１〜１２のいずれか１項に定められている結合部位と相互作用しうるＲＮＡ結合タンパク質をコードするベクターで一過性にトランスフェクトされている、前記細胞。
  33. 請求項３１記載のウイルスベクター産生細胞であって、該細胞が、請求項１〜１２のいずれか１項に定められている結合部位と相互作用しうるＲＮＡ結合タンパク質を安定に発現する、前記細胞。
  34. 請求項３１記載のウイルスベクター産生細胞であって、該細胞が、請求項１〜１２のいずれか１項に定められている結合部位と相互作用しうるＲＮＡ結合タンパク質を安定に発現し、別の構築物から該ＲＮＡ結合タンパク質を一過性に発現する、前記細胞。
  35. ＲＮＡ結合タンパク質がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）である、請求項３１〜３４のいずれか１項記載のウイルスベクター産生細胞。
  36. 請求項１〜１２のいずれか１項記載の核酸配列、請求項１８〜２４のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系または請求項２５〜３０のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物をウイルスベクター産生細胞内に導入し、ウイルスベクターの産生に適した条件下で、該産生細胞を培養することを含む、ウイルスベクターの製造方法。
  37. 該ウイルスベクター産生細胞が、請求項１〜１２のいずれか１項に定められている結合部位と相互作用しうるＲＮＡ結合タンパク質を含む、請求項３６記載の製造方法。
  38. ＲＮＡ結合タンパク質がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）である、請求項３７記載の製造方法。
  39. 請求項１８〜２４のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系により製造されるウイルスベクターであって、請求項３１〜３５のいずれか１項記載のウイルスベクター産生細胞を使用して、または請求項３６〜３８のいずれか１項記載の製造方法により製造される該ウイルスベクター。
  40. 請求項１〜１２のいずれか１項記載の核酸配列を含む、請求項３９記載のウイルスベクター。
  41. レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来する、請求項３９または４０記載のウイルスベクター。
  42. レンチウイルスに由来する、請求項４１記載のレトロウイルスベクター。
  43. ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する、請求項４２記載のレンチウイルスベクター。
  44. 請求項１３〜１７または３９〜４３のいずれか１項記載のウイルスベクターが導入された細胞。
  45. 医薬品における使用のための、請求項１３〜１７もしくは３９〜４３のいずれか１項記載のウイルスベクターまたは請求項４４記載の細胞。
  46. 関心のあるヌクレオチドをそれを要する標的部位へ送達するための医薬の製造のための、請求項１３〜１７もしくは３９〜４３のいずれか１項記載のウイルスベクターまたは請求項４４記載の細胞の使用。
  47. 請求項１３〜１７もしくは３９〜４３のいずれか１項記載のウイルスベクターまたは請求項４４記載の細胞を、それを要する対象に投与することを含む治療方法。
  48. 請求項１３〜１７もしくは３９〜４３のいずれか１項記載のウイルスベクターまたは請求項４４記載の細胞を、医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物。
  49. 核酸結合部位に機能的に連結されている場合に、関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制されるように相互作用しうる核酸結合部位および／または核酸結合タンパク質を特定する方法であって、レポーター遺伝子に機能的に連結された核酸結合部位および核酸結合タンパク質の両方を含む細胞におけるレポーター遺伝子の発現を分析することを含む方法。
  50. 前記核酸結合タンパク質がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）である、請求項４９記載の核酸結合部位を特定する方法。
  51. 核酸結合部位がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）に結合しうる、請求項４９記載の核酸結合タンパク質を特定する方法。
  52. レポーター遺伝子が蛍光タンパク質をコードする、請求項４９〜５１のいずれか１項記載の方法。
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