JP2017088532A - 冷水病ワクチン及び冷水病の予防方法 - Google Patents
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Abstract
Description
項2. アユに対する冷水病ワクチンであり、有効成分がコラゲナーゼ又はその抗原性断片である、項1に記載の冷水病ワクチン。
項3. サケ科魚類に対する冷水病ワクチンであり、有効成分が金属プロテアーゼ又はその抗原性断片である、項1に記載の冷水病ワクチン。
項4. 項1に記載の冷水病ワクチンを含む溶液にアユ又はサケ科魚類を浸漬することを特徴とする、アユ又はサケ科魚類の冷水病の予防方法。
項5. フラボバクテリウム サイクロフィラムのホルマリン死菌(FKC)ワクチン又はフラボバクテリウム サイクロフィラム菌体の可溶化(SFP)ワクチンをアユ又はサケ科魚類にさらに作用させる、項4に記載のアユ、サケ科魚類の冷水病の予防方法。
冷水病により死亡したアユから分離したフラボバクテリウム サイクロフィラムWA−1株(NBRC108951)を、MCY寒天培地(1L当たりペプトン2g、イーストエクストラクト0.5g、酢酸ナトリウム0.2g、塩化カルシウム0.2g、寒天15g)に塗布し、18℃で約3日間静置培養すると、やや透明な黄色のコロニーを生じた。当該コロニーを、更にMCY液体培地に植菌し、18℃で約3日間旋回培養(120rpm)すると濁りを生じるので、その培養液を遠心分離(6,000rpm×15分)に供し、菌体を沈殿させた。当該菌体から常法により全ゲノムDNAを単離した。微生物DNAの単離法としては、例えば、サイトウ・ミウラ法等が挙げられる(Saito et al., Biochem. Biophys. Acta, 72 (1963) 619-629)。
プライマーセット(F:tttcgctgcaggatccTATACTTTGCCAGTAGTATTTC(配列番号3)、下線部は制限酵素BamHIの認識配列;R:ccggggtaccgaattcTTATTTTTTAATTATTTTTTTAG(配列番号4)、下線部は制限酵素EcoRIの認識配列)の組合せで、上記実施例1にて抽出したWA−1株のゲノムDNAを鋳型として、DNAポリメラーゼ(KOD Dash、TOYOBO)を用いてPCR増幅を行った(熱変性:96℃×30秒、アニーリング:50℃×15秒、伸張:72℃×3分)。当該PCR産物を1%アガロースゲル電気泳動に供することで、約3.0kbのPCR産物が増幅されていることを確認した。
上記実施例2により、インサートを確認できたプラスミドを用いて、再度、ブレビバチルス チョウシネンシスのコンピテンとセルに導入し、同様の方法により、〜10個のコロニーを得た。これらのコロニーを1つずつ、別々の2SYNm液体培地を入れた試験管に植菌し、24℃×5日間培養し、その培養液を遠心分離(6,000rpm×15分)に供することで培養上清を得た。その培養上清をゼラチンザイモグラフィーに供して、活性を指標として、コラゲナーゼ発現量が多い発現株を選別した。ゼラチンザイモグラフィーは、0.1%ゼラチンを含有する10%ポリアクリルアミドゲルを作製し、培養上清を2×ローディングバッファーと等量混合したサンプルを電気泳動した。電気泳動後のゲルを洗浄バッファー(50mMトリスpH8.0、0.1%Tween20)で2回洗浄し、インキュベーションバッファー(50mMトリスpH8.0、0.1%Tween20、5mM塩化カルシウム)中で24℃×20時間培養することで行った。それによって、コラゲナーゼ周辺のゼラチンが分解され、当該ゲルをCBB染色することで、染色されないクリアゾーンの面積の広さで、大凡のコラゲナーゼの量を推定することができる。コラゲナーゼの発現量が多かったクローンについては、上記液体培養の一部に20%グリセロール(終濃度)を添加し、−80℃で冷凍保存した。
上記実施例3で、良好なコラゲナーゼ発現が確認されたクローンのグリセロールストックから、1Lの2SYNm液体培地に植菌し、37℃×24時間旋回培養した。その後、15℃に温度を下げ、更に8日間培養した(図1)。37℃で培養を続けると、フラボバクテリウム サイクロフィラム由来コラゲナーゼの細胞毒性のためか、宿主菌の増殖が止まることを確認している。培養後の菌液を遠心分離(6,000rpm×15分)に供することで培養上清を得た。その上清を−20℃で冷凍し、ワクチン処理の時まで保存した。
抗冷水病抗体を有するアユ血清の調整:冷水病に罹患し感染耐過したアユの尾柄部から1mL容の注射器を用い採血を行った。採血した血液は4℃で一晩静置し、遠心分離(1,500×g、10分間)に供して、血清を回収した。血清はELISA試験を実施するまで−20℃で保存し、ELISA試験実施時には室温で放置することによって溶解した物を用いた。
抗原でウェルをコーティング:ELISA試験で抗原として用いる冷水病菌をコーティングバッファー(蒸留水1L中、Na2CO3:1.59g、NaHCO3:2.93g、NaN3:0.2g、HClでpHを9.6に調整)に懸濁した(菌体10mg/mL)。また上記実施例4で取得したコラゲナーゼ溶液を上記コーティングバッファーで10倍希釈した。また、対照としてPBSバッファーを用いた。これらの溶液をELISA用96穴マイクロプレート(マキシソープ、ヌンク)に50μLずつ入れ、25℃×1時間静置し、プレート表面を各抗原でコーティングした。
ブロッキング:1%ブロックエース(DSファーマバイオメディカル製)溶液を200μLずつ各ウェルに添加して、25℃×1時間静置した。
ウェルの洗浄:ブロッキング溶液を廃棄した後、洗浄バッファー(蒸留水1L中、Tris:2.4g、NaCl:8.0g、KCl:0.2g、NaN3:0.2g、Tween20:0.5mL、HClでpHを7.4に調整)を200μLずつ各ウェルに添加して、廃棄する操作を4回繰り返した。
一次抗体反応:上記実施例5で採取した血清を洗浄バッファーで10倍に希釈し、各ウェルに50μLずつ添加して、25℃×1時間静置した。
一次抗体の洗浄:一次抗体溶液を廃棄した後、上記洗浄バッファーを200μLずつ各ウェルに添加して、廃棄する操作を4回繰り返した。
二次抗体反応:二次抗体(Anti−Ayu IgM、Mouse,mono、AQD社)を上記洗浄バッファーで2,000倍に希釈し、各ウェルに50μLずつ添加して、25℃×1時間静置した。
二次抗体の洗浄:二次抗体溶液を廃棄した後、上記洗浄バッファーを200μLずつ各ウェルに添加して、廃棄する操作を4回繰り返した。
三次抗体反応:三次抗体(Anti−Mouse IgG、Horse、poly、AP−2000、ベクター社)を上記洗浄バッファーで2,000倍に希釈し、各ウェルに50μLずつ添加して、25℃×1時間静置した。
三次抗体の洗浄:三次抗体溶液を廃棄した後、上記洗浄バッファーを200μLずつ各ウェルに添加して、廃棄する操作を4回繰り返した。
基質分解反応:基質(p−ニトロフェニルリン酸六水和物)10mgを、基質溶解液(ジエタノールアミン:97mL、塩化マグネシウム六水和物:0.1g、NaN3:0.2gを蒸留水800mLに溶解し、塩酸を添加してpH9.5に調整した。その後、蒸留水で1Lにメスアップした)10mLに溶解した。当該基質溶液を各ウェルに100μLずつ添加して、37℃×30分静置した。
反応停止:上記基質分解反応において十分な発色が見られたとき、反応停止液(2N NaOH)を各ウェルに50μLずつ添加した。
吸光度測定:各ウェルの吸光度(Abs.405nm)をマイクロプレートリーダー(NJ−2300、ヌンク)を用いて測定した。
フラボバクテリウム サイクロフィラムの強毒株SG−1株(以下、「SG−1株」と略する。)を、1/2CGY培地(1L当たりバクトカシトン2.5g、ゼラチン1.5g、イーストエクストラクト0.5g、1mM塩化カルシウムを含む)に植菌し、18℃で約2日間旋回しながら後期対数増殖期まで培養した。この菌液をワクチン試験における攻撃菌液又はワクチン作製のための材料として用いた。
上記実施例6で培養したSG−1株の培養液に終濃度0.1%ホルマリンを添加し、24℃×1時間旋回しながらインキュベートすることで、FKCワクチンを製造した。なお、ワクチンに用いる菌株は、SG−1株である必要はなく、アユから分離された病原性を有するフラボバクテリウム サイクロフィラム株であれば良い。
神奈川県水産技術センターで生産されたアユ人工種苗を、上記実施例4で作製したトキソイドワクチン液に5分間浸漬し、ワクチン処理を行った。一度に処理するアユは、ワクチン液重量の1/10程度の重量とした。当該ワクチン処理から2週間経過後に、上記実施例6の方法で培養したSG−1株の培養液にアユを30分浸漬することで、フラボバクテリウム サイクロフィラムに人為的に感染させた。その後、地下水をかけ流しにした水槽でアユを飼育し、人為的感染から2週間の累積死亡率を調べた(図3)。その結果、トキソイドワクチン単独でのワクチン有効率は約60%であった。なお、ワクチン有効率の算出式は以下の通り。
ワクチン有効率(%)=(1−ワクチン区死亡率/ワクチン非処理区死亡率)×100
滋賀県・琵琶湖において採捕された琵琶湖産天然アユは、多くの場合、採捕段階でフラボバクテリウム サイクロフィラムの保菌が認められることから、胸腺が形成され獲得免疫を有するまでの時期(体重3gサイズ以下)に28℃×3日間加温することによって、予めフラボバクテリウム サイクロフィラムを除去した集団を作製し、それをワクチン試験に用いた。
上記実施例6の手法により、SG−1株の培養液を250mL分作製した。当該培養液を遠心分離(6,000rpm×15分)に供することで培養菌体を得た。当該菌体を−20℃で、ワクチン処理の前日まで冷凍保存した。ワクチン処理の前日、保存していた菌体を室温で融解し、5mLの0.5%SDS溶液でピペッティングして菌体を溶解した。この溶液にBenzonase Nuclease(シグマ・アルドリッチ)を5μL添加し、24℃×20時間インキュベートした。DNA分解酵素の作用により溶出したフラボバクテリウム サイクロフィラム由来ゲノムDNAは低分子化し、それに起因する粘性は低下して均質な溶液となった。更に、フラボバクテリウム サイクロフィラムを完全に殺菌するため、終濃度0.1%となるようにホルマリンを添加し、24℃×1時間インキュベートした。この溶液を、SFPワクチン原液とし、ワクチンとして使用する際は2.5Lまで地下水を用いて希釈した。当該SFPワクチンは希釈後であってもエアレーションを行うことによって、無数の泡を形成することから、食品添加用の消泡剤KM−72(信越シリコーン)を適量添加した。
和歌山県沿岸で採捕された海産天然アユを28℃×3日間加温することによって、予めフラボバクテリウム サイクロフィラムを除去した集団を作製し、それをワクチン試験に用いた。
上記実施例4で得た冷水病菌コラゲナーゼを含むブレビバチルス チョウシネンシスの培養上清を限外濾過膜(ビバスピン20−10kカットオフ、GEヘルスケア)を用いて10倍にまで濃縮を行った。濃縮前と後のサンプルを上記実施例3で示したゼラチンザイモグラフィーに供することで、濃縮具合の確認を行った。
Claims (5)
- フラボバクテリウム サイクロフィラムに由来するコラゲナーゼ、金属プロテアーゼ又はそれらの抗原性断片を有効成分とする冷水病ワクチン。
- アユに対する冷水病ワクチンであり、有効成分がコラゲナーゼ又はその抗原性断片である、請求項1に記載の冷水病ワクチン。
- サケ科魚類に対する冷水病ワクチンであり、有効成分が金属プロテアーゼ又はその抗原性断片である、請求項1に記載の冷水病ワクチン。
- 請求項1に記載の冷水病ワクチンを含む溶液にアユ又はサケ科魚類を浸漬することを特徴とする、アユ又はサケ科魚類の冷水病の予防方法。
- フラボバクテリウム サイクロフィラムのホルマリン死菌(FKC)ワクチン又はフラボバクテリウム サイクロフィラム菌体の可溶化(SFP)ワクチンをアユ又はサケ科魚類にさらに作用させる、請求項4に記載のアユ、サケ科魚類の冷水病の予防方法。
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