JP2004352690A - 魚類冷水病ワクチン - Google Patents
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Abstract
【課題】安全性及び経済性に優れた魚類冷水病ワクチンを提供する。
【解決手段】フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体を有効成分とする魚類冷水病ワクチン。
【選択図】 なし
【解決手段】フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体を有効成分とする魚類冷水病ワクチン。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、魚類冷水病ワクチン及びこれを用いた魚類冷水病の予防法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
冷水病は、フラボバクテリウム サイクロフィラム Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ （フレキシバクター サイクロフィルス又はサイトファーガー サイクロフィルスと呼ばれることもある）を原因菌とし、サケ、マス、アユ、フナ等の魚類に低水温期に発病する病気である。もともとは北米のマス類の病気で、低水温期の稚魚に発生し、死亡率は２０〜５０％であり、死亡しない魚でも体表に潰瘍などの後遺症が残るという問題がある。
【０００３】
斯かる冷水病の治療手段としては、これまでに、スルフィソゾールナトリウム等の抗菌剤の経口投与や、水温を上昇させる等が行われているが、薬物投与は食用魚としては好ましくなく、水温を２５℃以上に上昇させるのは経済的に負担が大きすぎる。従って、魚類の冷水病への対処法としては、ワクチンの投与、特に手間や経済性の点から浸漬ワクチンによる予防治療が重用視されている。
しかしながら、冷水病に対するワクチンは現在まで開発されていない。
【０００４】
一方、魚類の表皮は粘液により物理的に処理される他、微生物を洗い流す作用もあると考えられ、浸漬ワクチンにおけるワクチンの侵入門戸となる体表粘液中には様々な生体防御関連タンパク質が知られている。例えば、アユの体表粘液中にはウサギ赤血球のみを認識して凝集するレクチン様物質やＶｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍのリポ多糖に対する親和性物質が存在することが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
しかしながら、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体や当該菌体由来リポ多糖類と魚類の体表粘液との親和性については何ら報告されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安全性及び経済性に優れた魚類冷水病ワクチンを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、浸漬投与が可能で、上記課題を解決できる魚類冷水病ワクチンを得るべく、魚類の体表粘液とフラボバクテリウム サイクロフィラム菌体との親和性について種々検討した結果、フラボバクテリウム サイクロフィラム菌体又は当該菌体由来リポ多糖類がウサギ赤血球膜に対して高い親和性を有し、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体が浸漬投与においても高いワクチン効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体を有効成分とする魚類冷水病ワクチンを提供するものである。
【０００８】
また本発明は、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体を含有する魚類冷水病ワクチン組成物を提供するものである。
【０００９】
さらに本発明は、上記ワクチン又はワクチン組成物を懸濁させた水中に魚類を浸漬することを特徴とする魚類冷水病の予防法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のワクチンは、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体を有効成分とするものである。
フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類には、後記実施例１に示すようにウサギ赤血球又は赤血球膜に対して凝集活性を有することが示され、ウサギ赤血球又は赤血球膜と親和性があることが見出された。従って、ワクチン中にウサギ赤血球膜を共存させることによって、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類の魚類体表面への吸着が可能となる。
【００１１】
本発明で用いられるフラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体は、培養した菌体を生菌のまま使用してもよいが、加熱、紫外線照射等の物理的処理、ホルマリン、クロロホルム、フェノール、ベータプロピオンラクトン、チメロサール等の化学的処理を施して不活化させてから投与するのが好ましい。
また菌体は、ワクチン活性の点から、対数増殖期に採取したものを使用するのが好ましい。
【００１２】
フラボバクテリウム サイクロフィラム菌体由来リポ多糖類は、培養した菌体から、フェノール・水抽出法等の常法に従って抽出・精製すればよい。
例えば、菌体を培養後、集菌して、ｐＨ６．８〜７．８のリン酸緩衝食塩水等を用いて、遠心洗浄（８，０００〜１０，０００ｒｐｍ、２０〜４０分間）し、洗浄後、遠心管に菌体を量り取り、蒸留水とフェノール（１：１）を加え混合し、６０〜７０℃で、５〜１５分間インキュベートし、インキュベート後、氷中で冷却し、２，０００〜４，０００ｒｐｍ、２０〜４０分間遠心する。遠心後、上澄みをパスツールピペットで取り出し、蒸留水を加えて遠心洗浄を繰り返した後、上澄みを２〜６℃、３〜５日間透析し、凍結乾燥することにより粗リポ多糖を得ることができる。
【００１３】
本発明のリポ多糖類は、魚類中で、冷水病に対して特異的な防御免疫反応を誘導できるものであればよく、上記のように粗精製リポ多糖類の他、更に精製を行った精製リポ多糖類、更にはこれらの免疫原性断片でもよい。
【００１４】
尚、フラボバクテリウム サイクロフィラム菌の培養は、当該菌を適当な培地に接種し常法に従って培養すればよい。培地中には、資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有させておくのが好ましい。この炭素源及び窒素源については特に制限はないが、その例としては、窒素源としてトリプトン、各種動物血清、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンミール、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベータ、アミフレックス及びアジプロン、ゼスト、アジックスなどが挙げられる。また、炭素源としては、資化し得る炭素源、例えば、アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、蔗糖、麦芽糖、可溶性デンプン、乳糖、廃糖蜜や資化し得る有機酸、例えば酢酸等が挙げられる。また、その他、リン酸、Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋，Ｍｎ２＋，Ｚｎ２＋，Ｃｏ２＋，Ｎａ＋，Ｋ＋などの無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加することもできる。またＴＹ培地、サイトファーガー（ＣＹＴ）培地等の市販の培地、改変サイトファーガー（ＭＣＹＴ）培地、及びこれらに牛胎児血清を添加した培地を用いることもできる。
培養条件は、ｐＨ６．８〜７．８、４〜２０℃で、特に１５〜１８℃が好ましい。
【００１５】
本発明で用いられるウサギ赤血球膜は、通常行われる赤血球膜の調製法に従って調製したものを用いればよい。例えば、ウサギ耳静脈から採取した血液、市販のウサギ保存血液又は脱繊維素血液を蒸留水や低張液等を用いて溶血させながら遠心洗浄（２，０００〜４，０００ｒｐｍ、１０〜２０分間）し、上澄みを除去した後、残った沈殿物をホモジナイズして蒸留水で遠心洗浄を繰り返し行うことにより得ることができる。なお、遠心処理した赤血球膜をさらに超音波破壊処理して用いてもよい。
【００１６】
本発明のワクチンは、上記のフラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体が用いられるが、当該複合体は、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類と、ウサギ赤血球膜とを任意の割合で混合して調製されるものである。好ましくは、ウサギ赤血球膜１に対して、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類を０．０３〜３の割合で混合するのが好ましい。
【００１７】
フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体は、そのままワクチンとして使用してもよいが、薬学的に許容される液状又は固体状の担体とともにワクチン組成物として使用してもよい。
また、斯かるワクチン組成物には、必要に応じてフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等の鉱物オイル、植物オイル、動物オイル等の公知のアジュバントを添加するのが好ましい。
【００１８】
当該ワクチン組成物の形態としては、経口投与用組成物、注射用組成物、魚類浸漬用組成物、飼料組成物等が挙げられる。液状の担体としては水、生理食塩水等が挙げられる固体状の担体としては、タルク、シュークロースなどの賦形剤が挙げられる。飼料組成物とするには、通常の魚類の飼料に本菌の不活化菌体又はその成分を混合すればよい。
【００１９】
本発明のワクチン又はワクチン組成物の魚類への投与は、経口、浸漬、腹腔内筋肉内等、限定されないが、特に飼育水のような水中にワクチンを懸濁させ魚類を浸漬する浸漬投与が好ましい。ここで、水は対象となる魚類が生育できる水であればよく、淡水又は海水の何れでもよい。
【００２０】
本発明のワクチン又はワクチン組成物の対象魚類としては、本菌による冷水病になる魚類であれば制限されず、例えばアユ、フナ、ヤマメ、ニジマス、ギンザケ等のサケマス類等が挙げられる。
【００２１】
投与する魚齢は特に限定されないが、冷水病に羅患する前、例えば稚魚の段階が好ましい。その投与量は、体重１ｋｇあたり菌体若しくは菌体由来リポ多糖類として約１ｍｇ〜１００ｍｇが好ましい。投与回数は１回でもよいが、複数回、例えば２〜１０回が好ましく、また毎日投与でもよいが、１〜１４日間隔をあけて投与してもよい。尚、浸漬投与においては、１Ｌの水中に、菌体若しくは菌体由来リポ多糖類として約０．１ｍｇ〜０．１ｇを添加し、０．５〜６時間魚類を泳がせて浸漬するのが好ましい。また、魚を入れ替えることによって、同じワクチンを数回繰り返して使用することができる。
【００２２】
【実施例】
参考例１ アユ体表粘液の凝集活性
（１）供試魚
供試魚は岡山県津山市の岡山県水産試験場魚病指導センターから平均体重６．６ｇのアユを用いた。供試魚は水温１５℃で流水飼育して用いた。
【００２３】
（２）アユ体表粘液の採取及び調製
アユ体表粘液は供試魚５尾をバットの上に乗せ、スライドガラスを用い両面の体表から６０μＬかき集めた。採取した粘液をマイクロチューブに移し、ＰＢＳ２４０μＬで希釈した。希釈した後、ホモジナイズし４℃、５，０００ｒｐｍ、５分間遠心洗浄を行った。洗浄後、上澄みを取り出し使用時まで氷水で保存した。
【００２４】
（３）供試菌
岡山県水産試験場魚病指導センターから分与されたＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＰＨ０００３、ＰＨ０００４、ＰＨ０００７、ＰＨ００１０、ＰＨ９３０４、ＯＨ００１６、ＺＨ０００１、Ａ−２株、及び共立製薬から分与されたＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍホルマリン不活化菌（ＦＫＣ）ＳＧ ９９０３０２株を用いた。供試菌株を表１に示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】
（４）培地の作製
改変サイトファーガ培地及び改変サイトファーガ液体培地を用いた。なお改変サイトファーガ培地はトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）２．０ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）０．５ｇ、魚肉エキス（和光純薬）０．２ｇ、酢酸ナトリウム（和光純薬）０．２ｇ、塩化カルシウム・２水和物（和光純薬）０．２６ｇ、寒天（和光純薬）１５．０ｇを蒸留水１，０００ｍＬに溶解したものをオートクレイブで滅菌し、シャーレに２０ｍＬずつ分注した。改変サイトファーガ培地はトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）２．０ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）０．５ｇ、魚肉エキス（和光純薬）０．２ｇ、酢酸ナトリウム（和光純薬）０．２ｇ、塩化カルシウム・２水和物（和光純薬）０．２６ｇを蒸留水１，０００ｍＬに溶解後、坂口フラスコに２００ｍＬに分注し、オートクレイブで滅菌した。
【００２７】
（５）Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＬＰＳの粗精製及び調製
フェノール・水抽出法を用いてＬＰＳの粗精製を行った。供試菌は改変サイトファーガ液体培地を用いて１５℃、１１０ｒｐｍ、１００時間振とう培養を行った。培養後、高速冷却遠心機で４℃、７，５００ｒｐｍ、３０分間遠心し、集菌した。集菌後、リン酸二水素ナトリウム・１２水（和光純薬）３．０ｇ、リン酸二水素カリウム（和光純薬）０．７ｇ、塩化ナトリウム（和光純薬）６．４ｇを蒸留水１，０００ｍＬに懸濁し、ｐＨを７．０に調節したＰＢＳを用いて４℃、１０，０００ｒｐｍ、３０分間遠心洗浄を３回行った。洗浄後、ガラスの遠心管に菌体を１ｇ量り取り蒸留水１７．５ｇとフェノール（和光純薬）１７．５ｇを加え混合し、ウォーターバスインキュベーターを用いて６５℃、１０分間インキュベートした。インキュベート後、氷中で冷却し４℃、３，０００ｒｐｍ、３０分間遠心した。遠心後、上澄みをパスツールピペットで取り出し、同量の蒸留水を加え再度遠心した。この操作を三回繰り返した後、それぞれ取り出した上澄みをセルロースチューブに詰め、４℃で５日間透析した。透析後、ＯＤ２６０に調整した凝集活性試験に用いた。また共立製薬から分与されたＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＦＫＣ ＳＧ ９９０３０２からも同様の方法を用いて精製した。
【００２８】
（６）各種動物赤血球浮遊液の調製
市販のガチョウ、モルモット、ウマ、ウシ、ウサギ、ヒツジ保存血（日本バイオテスト研究所）を用いた。各種動物保存血は、ＰＢＳを用いて２，０００ｒｐｍ、５分間で遠心洗浄を三回行った。洗浄後、赤血球が２％になるようにＰＢＳを用いて希釈しこれを赤血球浮遊液とした。
【００２９】
（７）ウサギ赤血球膜の精製及び調製
ウサギ耳静脈から採取した血液３０ｍＬを蒸留水を用いて溶血させながら遠心洗浄し、上澄みを除去した。残った沈殿物をホモジナイズし、蒸留水で遠心洗浄を行った。この操作を沈殿物が肉眼的に白くなるまで繰り返した後、３０ｍＬの蒸留水に懸濁しこれをウサギ赤血球膜とした。
【００３０】
（８）各種動物赤血球に対するアユ体表粘液の凝集活性試験
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて行った。９６穴Ｖ型マイクロプレート全てのウェルにドロッパーを用いて、希釈液としてＰＢＳを１滴ずつ加えた。ダイリュウターをバーナーの炎で熱した後、蒸留水で冷却し先端を調整したアユ体表粘液に浸して２５μＬとり、左端のウェルに入れて２０〜３０回転させダイリュウターの先端部がウェルの側壁に触れないように引き上げ、右のウェルに移り同様の手順を繰り返し２倍希釈系列を作製した。なお右端はバックグラウンドとするためこの手順を行わない。粘液希釈を行ったウェルにガチョウ、モルモット、ウマ、ウシ、ウサギ、ヒツジ赤血球浮遊液をドロッパーを用いて１滴加え、プレートを振とうさせ十分混合させた後、３７℃、２時間反応させ４℃に２４時間放置し凝集の有無を判定した。
【００３１】
（９）ウサギ赤血球膜に対するアユ体表粘液の凝集活性試験
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて前述と同様の方法で行った。なお、希釈液はＰＢＳを用いて粘液の２倍希釈系列を作製し、ウェルにはウサギ赤血球膜を一滴加えた。
【００３２】
（１０）Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳに対するアユ体表粘液の凝集活性試験
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて前述と同様の方法で行った。なお、希釈液はＰＢＳを用いて粘液の２倍希釈系列を作製し、ウェルには粗ＬＰＳを一滴加えた。
【００３３】
（１１）結果
各種動物赤血球に対するアユ体表粘液の凝集活性試験の結果を表２に示す。
すなわち、アユ体表粘液の凝集能はウサギ赤血球とのみ６４倍の反応が認められ、他の動物赤血球との凝集は検出限界以下だった。
【００３４】
【表２】
【００３５】
ウサギ赤血球膜に対するアユ体表粘液の凝集活性試験の結果を表３に示す。
すなわち、アユ体表粘液の凝集能はウサギ赤血球膜に対して３２倍であった。
【００３６】
【表３】
【００３７】
Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳに対するアユ体表粘液の凝集活性試験を表４に示す。
すなわち、ＳＧ ９９０３０２で１６倍、ＰＨ０００７、ＺＨ０００１及びＡ−２で８倍、ＰＨ０００３、ＰＨ０００４及びＰＨ９３０４で４倍、ＯＨ００１６で２倍であった。
【００３８】
【表４】
【００３９】
実施例１ Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体及び粗リポ多糖の凝集活性
（１）供試菌、培地の作製、Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌液の調製、Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＬＰＳの粗精製及び調製、各種動物赤血球浮遊液の調製、ウサギ赤血球膜の精製及び調製は、参考例１と同様に行った。
【００４０】
（２）各種動物赤血球に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体の凝集活性試験
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて参考例１と同様の方法で行った。なお、希釈液にはＰＢＳを用いて、Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体の２倍希釈系列を作製し、ウェルにはガチョウ、モルモット、ウマ、ウシ、ウサギ、ヒツジ赤血球浮遊液を一滴加えた。
【００４１】
（３）ウサギ赤血球に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳ凝集活性試験
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて前述と同様の方法で行った。なお、希釈液はＰＢＳを用いてＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳの２倍希釈系列を作製し、ウェルにはウサギ赤血球浮遊液を一滴加えた。
【００４２】
（４）ウサギ赤血球膜に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体の凝集活性試験
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて前述と同様の方法で行った。なお、希釈液はＰＢＳを用いてＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体の２倍希釈系列を作製し、ウェルにはウサギ赤血球膜を一滴加えた。
【００４３】
（５）ウサギ赤血球膜に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳの凝集活性試験
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて前述と同様の方法で行った。なお、希釈液は蒸留水を用いて、Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳの２倍希釈系列を作製し、ウェルにはウサギ赤血球膜を一滴加えた。
【００４４】
（６）結果
各種動物赤血球に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体の凝集活性試験の結果を表５に示す。
すなわち、Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体は菌株ごとに差があるがウサギ赤血球とのみ強い反応が認められ、他の動物赤血球との凝集は検出限界以下だった。
【００４５】
【表５】
【００４６】
ウサギ赤血球に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳの凝集活性試験の結果を表６に示す。
すなわち、ＰＨ０００４、ＰＨ０００７、ＰＨ００１０、ＯＨ００１６及びＳＧ ９９０３０２で１２８倍の強い凝集活性を示し、以下ＰＨ０００３、ＺＨ０００１、Ａ−２で６４倍、ＰＨ９３０４で３２倍であった。
【００４７】
【表６】
【００４８】
ウサギ赤血球膜に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体の凝集活性試験の結果を表７に示す。
すなわち、ＯＨ００１６、ＺＨ０００１、Ａ−２で１６倍の強い凝集活性を示し、以下ＰＨ０００３、ＰＨ０００４、ＰＨ０００７、ＰＨ００１０の８倍、ＰＨ９３０４の順であった
【００４９】
【表７】
【００５０】
ウサギ赤血球膜に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳの凝集活性試験の結果を表８に示す。
すなわち、ＳＧ ９９０３０２及びＰＨ００１０株で６４倍の強い凝集活性を示し、以下ＰＨ０００７、Ａ−２株で３２倍、ＰＨ０００３、ＰＨ９３０４、ＺＨ０００１株で１６倍、ＰＨ０００４、ＯＨ００１６株で８倍であった。
【００５１】
【表８】
【００５２】
実施例２ ウサギ赤血球膜混合Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳの免疫応答及び感染防御効果
（１）供試魚
供試魚は岡山県津山市の岡山県水産試験場指導センターで免疫を行った平均体重９．５１ｇのアユを用いた。供試魚は２００ ｌ容パンライト水槽を用いて、水温１５℃で流水飼育した。
【００５３】
（２）Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＬＰＳの粗精製及び調製
供試菌株にはＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＦＫＣ ＳＧ ９９０３０２を用いた。参考例１と同様の方法を用いてから精製し、抽出１〜３回目を全て混合し蒸留水を用いて３０ｍＬにメスアップし、免疫処理に用いた。
【００５４】
（３）ウサギ赤血球膜の精製及び調製
参考例１と同様の方法を用いて精製及び調製した。
【００５５】
（４）ウサギ赤血球膜混合Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳの調製
抽出１〜３回目を全て混合した粗ＬＰＳをウサギ赤血球膜を用いて３０ｍＬにメスアップし、免疫処理に用いた。
【００５６】
（５）Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＦＫＣ（Ｆｏｍａｌｉｎ Ｋｉｌｌｅｄ Ｃｅｌｌｓ）の作製及び調製
Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＰＨ０００７株を１５℃、１１０ｒｐｍ、１００ｈ振とう培養した。振とう培養後、菌液に対して１％のホルムアルデヒド（和光純薬）を加え撹拌し、４℃、２４ｈ放置した。放置後、高速冷却遠心機で４℃、７，５００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、集菌した菌をＰＢＳを用いて遠心洗浄を三回行った。洗浄後、ＰＢＳで菌体を１０ｍｇ／ｍＬに調製した。
【００５７】
（６）免疫
供試魚はＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳ及びウサギ赤血球膜混合Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳを蒸留水を用いて２Ｌにメスアップした希釈液に３０分間浸漬し、一週間後にもう一度３０分間浸漬した。また対照区として無処理のアユを用いた。
【００５８】
（７）抗血清の作製
採血はアユ尾部の血管より１ｍＬ容注射器を用いて行った。採血後、３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心により血漿を分離した。
【００５９】
（８）凝集反応法による血中抗体価の測定
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて参考例１の方法で行った。なお、希釈液としてＰＢＳを用いて抗血清の２倍希釈系列を作製し、ウェルにはＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＦＫＣを一滴加えた。また、補体の非動化は抗血清を４４℃で２０分間インキュベートし行った。
【００６０】
（９）結果
凝集反応法による血中抗体価の測定結果を図１に示す。
すなわち、ウサギ赤血球膜混合粗ＬＰＳ浸漬区で１：３．２７２、Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳ浸漬区で１：２．６６７、対照区で１：１．５５２であった。
【００６１】
実施例３ 実験的感染による感染防御効果
（１）供試魚、免疫
実施例２と同様方法で免疫を行った。
【００６２】
（２）浸漬攻撃試験法による実験的感染
免疫処理２週間後、浸漬攻撃試験は供試魚を飼育していたパンライト水槽の飼育水と冷水病羅病魚を飼育したパンライト水槽の飼育水と入れ換え行った。攻撃試験後２２日間における生存率を求めた。
【００６３】
（３）結果
感染実験後の生存率は、ウサギ赤血球膜混合粗ＬＰＳ浸漬区で９０％と高く、Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳ浸漬区は７７．５％、対照区（無処理）は３２．５％であった。
【００６４】
【発明の効果】
本発明魚類冷水病ワクチンは、浸漬投与が可能であることから、これを用いれば、サケ、マス、アユ等の魚類冷水病を安全且つ経済的に防止できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、凝集反応法による血中抗体価の測定結果を示したグラフである。
Ａ：Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳ浸漬区、Ｂ：ウサギ赤血球膜混合粗ＬＰＳ浸漬区、Ｃ：対照区
【発明の属する技術分野】
本発明は、魚類冷水病ワクチン及びこれを用いた魚類冷水病の予防法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
冷水病は、フラボバクテリウム サイクロフィラム Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ （フレキシバクター サイクロフィルス又はサイトファーガー サイクロフィルスと呼ばれることもある）を原因菌とし、サケ、マス、アユ、フナ等の魚類に低水温期に発病する病気である。もともとは北米のマス類の病気で、低水温期の稚魚に発生し、死亡率は２０〜５０％であり、死亡しない魚でも体表に潰瘍などの後遺症が残るという問題がある。
【０００３】
斯かる冷水病の治療手段としては、これまでに、スルフィソゾールナトリウム等の抗菌剤の経口投与や、水温を上昇させる等が行われているが、薬物投与は食用魚としては好ましくなく、水温を２５℃以上に上昇させるのは経済的に負担が大きすぎる。従って、魚類の冷水病への対処法としては、ワクチンの投与、特に手間や経済性の点から浸漬ワクチンによる予防治療が重用視されている。
しかしながら、冷水病に対するワクチンは現在まで開発されていない。
【０００４】
一方、魚類の表皮は粘液により物理的に処理される他、微生物を洗い流す作用もあると考えられ、浸漬ワクチンにおけるワクチンの侵入門戸となる体表粘液中には様々な生体防御関連タンパク質が知られている。例えば、アユの体表粘液中にはウサギ赤血球のみを認識して凝集するレクチン様物質やＶｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍのリポ多糖に対する親和性物質が存在することが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
しかしながら、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体や当該菌体由来リポ多糖類と魚類の体表粘液との親和性については何ら報告されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、安全性及び経済性に優れた魚類冷水病ワクチンを提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、浸漬投与が可能で、上記課題を解決できる魚類冷水病ワクチンを得るべく、魚類の体表粘液とフラボバクテリウム サイクロフィラム菌体との親和性について種々検討した結果、フラボバクテリウム サイクロフィラム菌体又は当該菌体由来リポ多糖類がウサギ赤血球膜に対して高い親和性を有し、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体が浸漬投与においても高いワクチン効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち本発明は、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体を有効成分とする魚類冷水病ワクチンを提供するものである。
【０００８】
また本発明は、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体を含有する魚類冷水病ワクチン組成物を提供するものである。
【０００９】
さらに本発明は、上記ワクチン又はワクチン組成物を懸濁させた水中に魚類を浸漬することを特徴とする魚類冷水病の予防法を提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のワクチンは、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体を有効成分とするものである。
フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類には、後記実施例１に示すようにウサギ赤血球又は赤血球膜に対して凝集活性を有することが示され、ウサギ赤血球又は赤血球膜と親和性があることが見出された。従って、ワクチン中にウサギ赤血球膜を共存させることによって、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類の魚類体表面への吸着が可能となる。
【００１１】
本発明で用いられるフラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体は、培養した菌体を生菌のまま使用してもよいが、加熱、紫外線照射等の物理的処理、ホルマリン、クロロホルム、フェノール、ベータプロピオンラクトン、チメロサール等の化学的処理を施して不活化させてから投与するのが好ましい。
また菌体は、ワクチン活性の点から、対数増殖期に採取したものを使用するのが好ましい。
【００１２】
フラボバクテリウム サイクロフィラム菌体由来リポ多糖類は、培養した菌体から、フェノール・水抽出法等の常法に従って抽出・精製すればよい。
例えば、菌体を培養後、集菌して、ｐＨ６．８〜７．８のリン酸緩衝食塩水等を用いて、遠心洗浄（８，０００〜１０，０００ｒｐｍ、２０〜４０分間）し、洗浄後、遠心管に菌体を量り取り、蒸留水とフェノール（１：１）を加え混合し、６０〜７０℃で、５〜１５分間インキュベートし、インキュベート後、氷中で冷却し、２，０００〜４，０００ｒｐｍ、２０〜４０分間遠心する。遠心後、上澄みをパスツールピペットで取り出し、蒸留水を加えて遠心洗浄を繰り返した後、上澄みを２〜６℃、３〜５日間透析し、凍結乾燥することにより粗リポ多糖を得ることができる。
【００１３】
本発明のリポ多糖類は、魚類中で、冷水病に対して特異的な防御免疫反応を誘導できるものであればよく、上記のように粗精製リポ多糖類の他、更に精製を行った精製リポ多糖類、更にはこれらの免疫原性断片でもよい。
【００１４】
尚、フラボバクテリウム サイクロフィラム菌の培養は、当該菌を適当な培地に接種し常法に従って培養すればよい。培地中には、資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有させておくのが好ましい。この炭素源及び窒素源については特に制限はないが、その例としては、窒素源としてトリプトン、各種動物血清、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンミール、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチベータ、アミフレックス及びアジプロン、ゼスト、アジックスなどが挙げられる。また、炭素源としては、資化し得る炭素源、例えば、アラビノース、キシロース、グルコース、マンノース、蔗糖、麦芽糖、可溶性デンプン、乳糖、廃糖蜜や資化し得る有機酸、例えば酢酸等が挙げられる。また、その他、リン酸、Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋，Ｍｎ２＋，Ｚｎ２＋，Ｃｏ２＋，Ｎａ＋，Ｋ＋などの無機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加することもできる。またＴＹ培地、サイトファーガー（ＣＹＴ）培地等の市販の培地、改変サイトファーガー（ＭＣＹＴ）培地、及びこれらに牛胎児血清を添加した培地を用いることもできる。
培養条件は、ｐＨ６．８〜７．８、４〜２０℃で、特に１５〜１８℃が好ましい。
【００１５】
本発明で用いられるウサギ赤血球膜は、通常行われる赤血球膜の調製法に従って調製したものを用いればよい。例えば、ウサギ耳静脈から採取した血液、市販のウサギ保存血液又は脱繊維素血液を蒸留水や低張液等を用いて溶血させながら遠心洗浄（２，０００〜４，０００ｒｐｍ、１０〜２０分間）し、上澄みを除去した後、残った沈殿物をホモジナイズして蒸留水で遠心洗浄を繰り返し行うことにより得ることができる。なお、遠心処理した赤血球膜をさらに超音波破壊処理して用いてもよい。
【００１６】
本発明のワクチンは、上記のフラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体が用いられるが、当該複合体は、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類と、ウサギ赤血球膜とを任意の割合で混合して調製されるものである。好ましくは、ウサギ赤血球膜１に対して、フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類を０．０３〜３の割合で混合するのが好ましい。
【００１７】
フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体は、そのままワクチンとして使用してもよいが、薬学的に許容される液状又は固体状の担体とともにワクチン組成物として使用してもよい。
また、斯かるワクチン組成物には、必要に応じてフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等の鉱物オイル、植物オイル、動物オイル等の公知のアジュバントを添加するのが好ましい。
【００１８】
当該ワクチン組成物の形態としては、経口投与用組成物、注射用組成物、魚類浸漬用組成物、飼料組成物等が挙げられる。液状の担体としては水、生理食塩水等が挙げられる固体状の担体としては、タルク、シュークロースなどの賦形剤が挙げられる。飼料組成物とするには、通常の魚類の飼料に本菌の不活化菌体又はその成分を混合すればよい。
【００１９】
本発明のワクチン又はワクチン組成物の魚類への投与は、経口、浸漬、腹腔内筋肉内等、限定されないが、特に飼育水のような水中にワクチンを懸濁させ魚類を浸漬する浸漬投与が好ましい。ここで、水は対象となる魚類が生育できる水であればよく、淡水又は海水の何れでもよい。
【００２０】
本発明のワクチン又はワクチン組成物の対象魚類としては、本菌による冷水病になる魚類であれば制限されず、例えばアユ、フナ、ヤマメ、ニジマス、ギンザケ等のサケマス類等が挙げられる。
【００２１】
投与する魚齢は特に限定されないが、冷水病に羅患する前、例えば稚魚の段階が好ましい。その投与量は、体重１ｋｇあたり菌体若しくは菌体由来リポ多糖類として約１ｍｇ〜１００ｍｇが好ましい。投与回数は１回でもよいが、複数回、例えば２〜１０回が好ましく、また毎日投与でもよいが、１〜１４日間隔をあけて投与してもよい。尚、浸漬投与においては、１Ｌの水中に、菌体若しくは菌体由来リポ多糖類として約０．１ｍｇ〜０．１ｇを添加し、０．５〜６時間魚類を泳がせて浸漬するのが好ましい。また、魚を入れ替えることによって、同じワクチンを数回繰り返して使用することができる。
【００２２】
【実施例】
参考例１ アユ体表粘液の凝集活性
（１）供試魚
供試魚は岡山県津山市の岡山県水産試験場魚病指導センターから平均体重６．６ｇのアユを用いた。供試魚は水温１５℃で流水飼育して用いた。
【００２３】
（２）アユ体表粘液の採取及び調製
アユ体表粘液は供試魚５尾をバットの上に乗せ、スライドガラスを用い両面の体表から６０μＬかき集めた。採取した粘液をマイクロチューブに移し、ＰＢＳ２４０μＬで希釈した。希釈した後、ホモジナイズし４℃、５，０００ｒｐｍ、５分間遠心洗浄を行った。洗浄後、上澄みを取り出し使用時まで氷水で保存した。
【００２４】
（３）供試菌
岡山県水産試験場魚病指導センターから分与されたＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＰＨ０００３、ＰＨ０００４、ＰＨ０００７、ＰＨ００１０、ＰＨ９３０４、ＯＨ００１６、ＺＨ０００１、Ａ−２株、及び共立製薬から分与されたＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍホルマリン不活化菌（ＦＫＣ）ＳＧ ９９０３０２株を用いた。供試菌株を表１に示す。
【００２５】
【表１】
（４）培地の作製
改変サイトファーガ培地及び改変サイトファーガ液体培地を用いた。なお改変サイトファーガ培地はトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）２．０ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）０．５ｇ、魚肉エキス（和光純薬）０．２ｇ、酢酸ナトリウム（和光純薬）０．２ｇ、塩化カルシウム・２水和物（和光純薬）０．２６ｇ、寒天（和光純薬）１５．０ｇを蒸留水１，０００ｍＬに溶解したものをオートクレイブで滅菌し、シャーレに２０ｍＬずつ分注した。改変サイトファーガ培地はトリプトン（Ｄｉｆｃｏ）２．０ｇ、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）０．５ｇ、魚肉エキス（和光純薬）０．２ｇ、酢酸ナトリウム（和光純薬）０．２ｇ、塩化カルシウム・２水和物（和光純薬）０．２６ｇを蒸留水１，０００ｍＬに溶解後、坂口フラスコに２００ｍＬに分注し、オートクレイブで滅菌した。
【００２７】
（５）Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＬＰＳの粗精製及び調製
フェノール・水抽出法を用いてＬＰＳの粗精製を行った。供試菌は改変サイトファーガ液体培地を用いて１５℃、１１０ｒｐｍ、１００時間振とう培養を行った。培養後、高速冷却遠心機で４℃、７，５００ｒｐｍ、３０分間遠心し、集菌した。集菌後、リン酸二水素ナトリウム・１２水（和光純薬）３．０ｇ、リン酸二水素カリウム（和光純薬）０．７ｇ、塩化ナトリウム（和光純薬）６．４ｇを蒸留水１，０００ｍＬに懸濁し、ｐＨを７．０に調節したＰＢＳを用いて４℃、１０，０００ｒｐｍ、３０分間遠心洗浄を３回行った。洗浄後、ガラスの遠心管に菌体を１ｇ量り取り蒸留水１７．５ｇとフェノール（和光純薬）１７．５ｇを加え混合し、ウォーターバスインキュベーターを用いて６５℃、１０分間インキュベートした。インキュベート後、氷中で冷却し４℃、３，０００ｒｐｍ、３０分間遠心した。遠心後、上澄みをパスツールピペットで取り出し、同量の蒸留水を加え再度遠心した。この操作を三回繰り返した後、それぞれ取り出した上澄みをセルロースチューブに詰め、４℃で５日間透析した。透析後、ＯＤ２６０に調整した凝集活性試験に用いた。また共立製薬から分与されたＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＦＫＣ ＳＧ ９９０３０２からも同様の方法を用いて精製した。
【００２８】
（６）各種動物赤血球浮遊液の調製
市販のガチョウ、モルモット、ウマ、ウシ、ウサギ、ヒツジ保存血（日本バイオテスト研究所）を用いた。各種動物保存血は、ＰＢＳを用いて２，０００ｒｐｍ、５分間で遠心洗浄を三回行った。洗浄後、赤血球が２％になるようにＰＢＳを用いて希釈しこれを赤血球浮遊液とした。
【００２９】
（７）ウサギ赤血球膜の精製及び調製
ウサギ耳静脈から採取した血液３０ｍＬを蒸留水を用いて溶血させながら遠心洗浄し、上澄みを除去した。残った沈殿物をホモジナイズし、蒸留水で遠心洗浄を行った。この操作を沈殿物が肉眼的に白くなるまで繰り返した後、３０ｍＬの蒸留水に懸濁しこれをウサギ赤血球膜とした。
【００３０】
（８）各種動物赤血球に対するアユ体表粘液の凝集活性試験
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて行った。９６穴Ｖ型マイクロプレート全てのウェルにドロッパーを用いて、希釈液としてＰＢＳを１滴ずつ加えた。ダイリュウターをバーナーの炎で熱した後、蒸留水で冷却し先端を調整したアユ体表粘液に浸して２５μＬとり、左端のウェルに入れて２０〜３０回転させダイリュウターの先端部がウェルの側壁に触れないように引き上げ、右のウェルに移り同様の手順を繰り返し２倍希釈系列を作製した。なお右端はバックグラウンドとするためこの手順を行わない。粘液希釈を行ったウェルにガチョウ、モルモット、ウマ、ウシ、ウサギ、ヒツジ赤血球浮遊液をドロッパーを用いて１滴加え、プレートを振とうさせ十分混合させた後、３７℃、２時間反応させ４℃に２４時間放置し凝集の有無を判定した。
【００３１】
（９）ウサギ赤血球膜に対するアユ体表粘液の凝集活性試験
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて前述と同様の方法で行った。なお、希釈液はＰＢＳを用いて粘液の２倍希釈系列を作製し、ウェルにはウサギ赤血球膜を一滴加えた。
【００３２】
（１０）Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳに対するアユ体表粘液の凝集活性試験
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて前述と同様の方法で行った。なお、希釈液はＰＢＳを用いて粘液の２倍希釈系列を作製し、ウェルには粗ＬＰＳを一滴加えた。
【００３３】
（１１）結果
各種動物赤血球に対するアユ体表粘液の凝集活性試験の結果を表２に示す。
すなわち、アユ体表粘液の凝集能はウサギ赤血球とのみ６４倍の反応が認められ、他の動物赤血球との凝集は検出限界以下だった。
【００３４】
【表２】
ウサギ赤血球膜に対するアユ体表粘液の凝集活性試験の結果を表３に示す。
すなわち、アユ体表粘液の凝集能はウサギ赤血球膜に対して３２倍であった。
【００３６】
【表３】
Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳに対するアユ体表粘液の凝集活性試験を表４に示す。
すなわち、ＳＧ ９９０３０２で１６倍、ＰＨ０００７、ＺＨ０００１及びＡ−２で８倍、ＰＨ０００３、ＰＨ０００４及びＰＨ９３０４で４倍、ＯＨ００１６で２倍であった。
【００３８】
【表４】
実施例１ Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体及び粗リポ多糖の凝集活性
（１）供試菌、培地の作製、Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌液の調製、Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＬＰＳの粗精製及び調製、各種動物赤血球浮遊液の調製、ウサギ赤血球膜の精製及び調製は、参考例１と同様に行った。
【００４０】
（２）各種動物赤血球に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体の凝集活性試験
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて参考例１と同様の方法で行った。なお、希釈液にはＰＢＳを用いて、Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体の２倍希釈系列を作製し、ウェルにはガチョウ、モルモット、ウマ、ウシ、ウサギ、ヒツジ赤血球浮遊液を一滴加えた。
【００４１】
（３）ウサギ赤血球に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳ凝集活性試験
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて前述と同様の方法で行った。なお、希釈液はＰＢＳを用いてＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳの２倍希釈系列を作製し、ウェルにはウサギ赤血球浮遊液を一滴加えた。
【００４２】
（４）ウサギ赤血球膜に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体の凝集活性試験
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて前述と同様の方法で行った。なお、希釈液はＰＢＳを用いてＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体の２倍希釈系列を作製し、ウェルにはウサギ赤血球膜を一滴加えた。
【００４３】
（５）ウサギ赤血球膜に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳの凝集活性試験
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて前述と同様の方法で行った。なお、希釈液は蒸留水を用いて、Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳの２倍希釈系列を作製し、ウェルにはウサギ赤血球膜を一滴加えた。
【００４４】
（６）結果
各種動物赤血球に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体の凝集活性試験の結果を表５に示す。
すなわち、Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体は菌株ごとに差があるがウサギ赤血球とのみ強い反応が認められ、他の動物赤血球との凝集は検出限界以下だった。
【００４５】
【表５】
ウサギ赤血球に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳの凝集活性試験の結果を表６に示す。
すなわち、ＰＨ０００４、ＰＨ０００７、ＰＨ００１０、ＯＨ００１６及びＳＧ ９９０３０２で１２８倍の強い凝集活性を示し、以下ＰＨ０００３、ＺＨ０００１、Ａ−２で６４倍、ＰＨ９３０４で３２倍であった。
【００４７】
【表６】
ウサギ赤血球膜に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ菌体の凝集活性試験の結果を表７に示す。
すなわち、ＯＨ００１６、ＺＨ０００１、Ａ−２で１６倍の強い凝集活性を示し、以下ＰＨ０００３、ＰＨ０００４、ＰＨ０００７、ＰＨ００１０の８倍、ＰＨ９３０４の順であった
【００４９】
【表７】
ウサギ赤血球膜に対するＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳの凝集活性試験の結果を表８に示す。
すなわち、ＳＧ ９９０３０２及びＰＨ００１０株で６４倍の強い凝集活性を示し、以下ＰＨ０００７、Ａ−２株で３２倍、ＰＨ０００３、ＰＨ９３０４、ＺＨ０００１株で１６倍、ＰＨ０００４、ＯＨ００１６株で８倍であった。
【００５１】
【表８】
実施例２ ウサギ赤血球膜混合Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳの免疫応答及び感染防御効果
（１）供試魚
供試魚は岡山県津山市の岡山県水産試験場指導センターで免疫を行った平均体重９．５１ｇのアユを用いた。供試魚は２００ ｌ容パンライト水槽を用いて、水温１５℃で流水飼育した。
【００５３】
（２）Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＬＰＳの粗精製及び調製
供試菌株にはＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＦＫＣ ＳＧ ９９０３０２を用いた。参考例１と同様の方法を用いてから精製し、抽出１〜３回目を全て混合し蒸留水を用いて３０ｍＬにメスアップし、免疫処理に用いた。
【００５４】
（３）ウサギ赤血球膜の精製及び調製
参考例１と同様の方法を用いて精製及び調製した。
【００５５】
（４）ウサギ赤血球膜混合Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳの調製
抽出１〜３回目を全て混合した粗ＬＰＳをウサギ赤血球膜を用いて３０ｍＬにメスアップし、免疫処理に用いた。
【００５６】
（５）Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＦＫＣ（Ｆｏｍａｌｉｎ Ｋｉｌｌｅｄ Ｃｅｌｌｓ）の作製及び調製
Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＰＨ０００７株を１５℃、１１０ｒｐｍ、１００ｈ振とう培養した。振とう培養後、菌液に対して１％のホルムアルデヒド（和光純薬）を加え撹拌し、４℃、２４ｈ放置した。放置後、高速冷却遠心機で４℃、７，５００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、集菌した菌をＰＢＳを用いて遠心洗浄を三回行った。洗浄後、ＰＢＳで菌体を１０ｍｇ／ｍＬに調製した。
【００５７】
（６）免疫
供試魚はＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳ及びウサギ赤血球膜混合Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳを蒸留水を用いて２Ｌにメスアップした希釈液に３０分間浸漬し、一週間後にもう一度３０分間浸漬した。また対照区として無処理のアユを用いた。
【００５８】
（７）抗血清の作製
採血はアユ尾部の血管より１ｍＬ容注射器を用いて行った。採血後、３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心により血漿を分離した。
【００５９】
（８）凝集反応法による血中抗体価の測定
凝集活性試験はマイクロタイター法を用いて参考例１の方法で行った。なお、希釈液としてＰＢＳを用いて抗血清の２倍希釈系列を作製し、ウェルにはＦ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ ＦＫＣを一滴加えた。また、補体の非動化は抗血清を４４℃で２０分間インキュベートし行った。
【００６０】
（９）結果
凝集反応法による血中抗体価の測定結果を図１に示す。
すなわち、ウサギ赤血球膜混合粗ＬＰＳ浸漬区で１：３．２７２、Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳ浸漬区で１：２．６６７、対照区で１：１．５５２であった。
【００６１】
実施例３ 実験的感染による感染防御効果
（１）供試魚、免疫
実施例２と同様方法で免疫を行った。
【００６２】
（２）浸漬攻撃試験法による実験的感染
免疫処理２週間後、浸漬攻撃試験は供試魚を飼育していたパンライト水槽の飼育水と冷水病羅病魚を飼育したパンライト水槽の飼育水と入れ換え行った。攻撃試験後２２日間における生存率を求めた。
【００６３】
（３）結果
感染実験後の生存率は、ウサギ赤血球膜混合粗ＬＰＳ浸漬区で９０％と高く、Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳ浸漬区は７７．５％、対照区（無処理）は３２．５％であった。
【００６４】
【発明の効果】
本発明魚類冷水病ワクチンは、浸漬投与が可能であることから、これを用いれば、サケ、マス、アユ等の魚類冷水病を安全且つ経済的に防止できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、凝集反応法による血中抗体価の測定結果を示したグラフである。
Ａ：Ｆ． ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍ粗ＬＰＳ浸漬区、Ｂ：ウサギ赤血球膜混合粗ＬＰＳ浸漬区、Ｃ：対照区
Claims (5)
- フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体を有効成分とする魚類冷水病ワクチン。
- 浸漬ワクチンである請求項１記載の魚類冷水病ワクチン。
- フラボバクテリウム サイクロフィラムの菌体又は菌体由来リポ多糖類とウサギ赤血球膜との複合体を含有する魚類冷水病ワクチン組成物。
- 浸漬用のワクチン組成物である請求項３記載の魚類冷水病ワクチン組成物。
- 請求項２記載のワクチン又は請求項４記載のワクチン組成物を懸濁させた水中に魚類を浸漬することを特徴とする魚類冷水病の予防法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003154706A JP4150631B2 (ja) | 2003-05-30 | 2003-05-30 | 魚類冷水病ワクチン |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP2003154706A JP4150631B2 (ja) | 2003-05-30 | 2003-05-30 | 魚類冷水病ワクチン |
Publications (2)
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