JP2016535591A - 腫瘍微細環境のための試験管内モデル - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年10月21日に出願された米国特許仮出願第61/893,402号の利益を主張し、その全体は参照によって本明細書に組み入れられる。
本発明は、国立衛生研究所の国立癌研究所によって授与された契約番号HSN261201300024Cのもとで政府の支援によって行われた。政府は本発明に特定の権利を有する。
本発明は一般に腫瘍の微細環境を試験管内で模倣する方法に関する。本発明はまたそのような系で薬剤または化合物を調べ、有望な抗癌剤標的を特定する方法にも関する。
上述の方法のいずれも、さらに、細胞培養容器内の表面上に、少なくとも1つの細胞外マトリクス成分上に、または多孔性膜の第1の表面上に少なくとも1つの間質細胞型を播くことを含むことができる。或いは、少なくとも1つの間質細胞型は腫瘍細胞型とともに少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む溶液に懸濁されて少なくとも1つの間質細胞型、少なくとも1つの腫瘍細胞型及び少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創ることができ、該懸濁液を細胞培養容器内の表面上に、または多孔性膜の第1の表面上に堆積させることができる。
少なくとも1つの腫瘍細胞型は、癌腫、肉腫、リンパ腫、腺癌、混合中胚葉性腫瘍、癌肉腫、奇形癌、またはそれらの組み合わせに由来する細胞を含むことができる。
内皮細胞は、微細血管内皮細胞、大血管内皮細胞、内皮前駆細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
少なくとも1つの間質細胞型は、線維芽細胞、免疫細胞、周皮細胞、炎症性細胞、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
本明細書で記載される方法はさらに、1以上の追加の細胞型を細胞培養容器の表面上に、少なくとも1つの細胞外マトリクス成分上に、多孔性膜の第1のまたは第2の表面上に、第1の多孔性膜の第1のまたは第2の表面上に、または第2の多孔性膜の第1のまたは第2の面上に播くこと;または上容量部内での培養培地にて若しくは下容量部内での培養培地にて1以上の追加の細胞型を懸濁させることを含むこともできる。
1以上の細胞外マトリクス成分は細胞培養容器内の表面上に播かれる細胞型によって(たとえば、少なくとも1つの腫瘍細胞型によって)産生され得る。細胞外マトリクスが細胞培養容器内の表面上に播かれる細胞型(単数)または細胞型(複数)によって産生される場合、該細胞外マトリクスは本明細書では「内在性の」細胞外マトリクスと呼ばれる。
本発明の方法では標準の培養培地を使用することができる。培養培地の組成は培養される特定の細胞型に応じて変化するであろう。
培養培地の流れを誘導することが可能である好適な流動装置を用いて剪断応力を適用することができ、その際、流れは、培養される細胞型(単数)または細胞型(複数)が腫瘍の微細環境にて生体内でさらされる流れを模倣する。たとえば、流動装置は円錐平板装置または平行平板流動装置であることができる。
流れは予め測定された血行動態パターンに由来することができる。
図5〜図10は腫瘍の微細環境を試験管内で模倣する例となる方法を説明する模式図である。図5〜図10のそれぞれでは、細胞培養容器1は培養培地3を含有する。
本発明はさらに腫瘍の転移を模倣する方法に関する。腫瘍の転移を模倣する方法には腫瘍の転移を試験管内で模倣する方法及び腫瘍の転移を動物で模倣する方法が含まれる。
腫瘍の転移を試験管内で模倣する方法が提供される。方法は、上述の方法のいずれか1つに従って培養された少なくとも1つの腫瘍細胞型の細胞を、臓器または組織をモデル化する試験管内の系に導入することを含む。たとえば、臓器または組織をモデル化する試験管内の系は、肝臓、膵臓、骨、肺、血管、リンパ系、脳、筋肉、膀胱、腎臓、腸、結腸、胆嚢、皮膚または骨をモデル化する試験管内の系であることができる。
本発明はまた、腫瘍の転移を模倣する方法も提供する。方法は上述の方法のいずれかに従って培養された少なくとも1つの細胞型の細胞を動物に導入することを含む。動物は、哺乳類、たとえば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギまたはヒツジであることができる。或いは、動物は鳥類または魚類であることができる。
本発明は、腫瘍を有する対象に投与される化学療法計画を選択する方法を提供する。方法は、本明細書で記載される方法のいずれかに従って、腫瘍に対する効果について薬剤または化合物を試験管内で調べること、または腫瘍の転移に対する効果について薬剤または化合物を試験管内で調べることを含む。少なくとも1つの腫瘍細胞型は対象の腫瘍に由来する腫瘍細胞を含む。方法はさらに、試験管内の試験の結果に基づいて対象に薬剤または化合物を投与するかどうかを決定することを含む。
薬剤及び化合物
本発明の方法と剪断応力の適用の非存在下での同じ方法との間で腫瘍の微細環境のマーカーまたは腫瘍転移のマーカーのレベルまたは局在を比較することが関与する本発明の方法では、マーカーは、細胞増殖、細胞浸潤、血管形成、腫瘍形成、細胞単層完全性、内皮細胞のバリア機能、透過性、炎症、細胞死、アポトーシス、壊死、収縮、細胞の移動またはそれらの組み合わせのマーカーを含むことができる。
上で言及したように、肝臓をモデル化する試験管内の系はUS2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載されている。これらの出版物で記載された肝臓をモデル化する試験管内の系を、生体内での病態条件または生理的条件を模倣する方法で使用することができる。製薬業界及び生物製薬業界によって標準の試験管内モデルとして現在使用されている静置モデルとは異なって、US2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された方法は培養された細胞に対して剪断力を適用し、種々の因子の生体内での病的濃度または生理的濃度を用いて生体内での病的状態または生理的状態を再現する。たとえば、標準の静置モデルで使用される濃度と比べて有意に低下しているインスリンとグルコースの生体内での生理的濃度で肝細胞を維持することができる試験管内肝細胞モデルが記載される。さらに高い濃度のインスリンとグルコースがそのようなモデルで使用されると、肝細胞は脂肪肝疾患の多数の特徴を呈する。
US2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された方法を用いて模倣することができる肝臓の病的状態には、脂肪肝疾患、C型肝炎、B型肝炎、肝線維症、細菌感染、ウイルス感染、肝硬変、及びアルコール性肝疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
US2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された方法を用いて模倣することができる生理的状態には、当該病的状態に相当する生理的状態が挙げられる。たとえば、脂肪肝疾患に相当する生理的状態は健常な肝臓の状態であり、アテローム性硬化症に相当する生理的状態はアテローム性保護状態であることができる。
US2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された方法で使用することができる流動装置は、「流動装置」と題する節で上文にて記載されたのと同じである。
US2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された方法で使用することができる血行動態パターンは病的状態または疾患を促進する状態を有する対象(単数)または対象(複数)に由来することができる。疾患を促進する状態は、萎縮、結石、分離芽腫、病的収縮、病的拡張、憩室、過形成、ポリープ、脱出、破裂、動静脈瘻、または突起(たとえば、左動脈の突起)を含むことができる。
US2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された方法で使用することができる細胞型には初代細胞及び不死化細胞が含まれる。初代細胞または不死化細胞は、病的状態または生理的状態を有する少なくとも1人の対象から単離された細胞、病的状態のリスク因子を有する少なくとも1人の対象から単離された細胞、病的状態に関連する単一ヌクレオチド多型を持つ少なくとも1人の対象から単離された細胞、薬剤毒性に関連する特定された遺伝子型を持つ少なくとも1人の対象から単離された細胞、または薬剤毒性に関連する単一ヌクレオチド多型を持つ少なくとも1人の対象から単離された細胞を含むことができる。
US2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された方法では標準の細胞培養培地を使用することができる。
US2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された方法で使用するための因子の生理的な生体内濃度は当該技術で周知であり、生体内濃度を決定する方法も同様である。因子の生体内濃度を決定する方法は米国薬局方及び他の文献にて利用可能である。
US2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された方法で使用するための細胞外マトリクス成分は、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、またはそれらの組み合わせを含むことができる。コラーゲンは好まれる細胞外マトリクス成分であり、好ましくは、特定の病的状態または生理的状態のために播かれる細胞型(単数)または細胞型(複数)の生体内環境に存在するコラーゲンの型である。
薬剤または化合物の試験に関与するUS2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された方法で使用するための薬剤または化合物は任意の薬剤または化合物を含むことができる。
培養培地に因子を加えること、または培養培地に薬剤若しくは化合物を加えることが関与するUS2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された方法のいずれでも、培養培地に因子を加えるステップまたは培養培地に薬剤若しくは化合物を加えるステップは、培養培地に対象に由来する血清を加えることを含むことができ、その際、血清は因子、薬剤または化合物を含む。
US2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された効果について薬剤または化合物を調べる方法では、効果は、生理的状態に対する効果または病的状態に対する効果を含むことができる。たとえば、生理的状態または病的状態に対する効果は、毒性効果、保護効果、病的効果、疾患を促進する効果、炎症効果、酸化効果、小胞体ストレス効果、ミトコンドリアストレス効果、アポトーシス効果、壊死効果、リモデリング効果、増殖性効果、たとえば、タンパク質の阻害若しくはタンパク質の活性化のようなタンパク質の活性に対する効果、または、たとえば、遺伝子の発現の上昇若しくは遺伝子の発現の低下のような遺伝子の発現に対する効果であることができる。
US2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された方法はさらに、細胞容器の内外に培養培地、因子、薬剤または化合物を潅流させることを含むことができる。
US2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された方法に関して、「因子」という用語は、病的状態または生理的状態の作出に寄与する生物物質を意味する。好ましくは、因子は、剪断力の適用の非存在下での少なくとも1つの播かれた細胞型または培養培地における病的状態または生理的状態のマーカーのレベルと比べて、剪断力の適用の際、少なくとも1つの播かれた細胞型または培養培地における病的状態または生理的状態のマーカーのレベルの変化を提供する。
US2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された方法を用いて肝臓の生理的な試験管内モデルを創ることができる。そのような方法では、肝細胞が細胞培養容器内の表面上に播かれ、剪断力は播かれた肝細胞に間接的に適用される。たとえば、肝細胞は好適に多孔性膜の第1の表面に播かれ、その際、第1の表面が細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように細胞培養容器にて多孔性膜を懸濁させ、それによって細胞培養容器内で肝細胞を含む下容量部と多孔性膜の第2の表面を含む上容量部を定義する。剪断力は容器の上容量部における多孔性膜の第2の表面に適用される。従って、装置における細胞の配置は肝小葉の生体内での微細構造に基づく。
US2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された方法を用いて脂肪肝疾患の試験管内モデルを創り出すこともできる。肝細胞内での脂質の調節は複雑で動的な過程である。トリグリセリドの蓄積は、高脂肪食からの高脂肪酸の摂取、高い末梢脂質分解、または高いデノボ脂質生成の結末として生じ得る。インスリン及びグルコースは、高いデノボ脂質生成の重要な調節因子であり、トリグリセリドの合成を刺激すると共にβ酸化により脂肪酸代謝を阻害することによって肝細胞内でのトリグリセリド含量の上昇に寄与する。
本明細書で記載される本発明の目的では、「血行動態」という用語は、当該の腫瘍または組織にて生体内の血流を模倣する血流を意味する。たとえば、腫瘍の微細血管における血流の場合、加速度/減速度、流れ反転、前方基本流等は動脈の血行動態の流れを特徴づける幾つかのパラメータである。たとえば、肝臓のようないくつかの組織では、一定の血流を用いて生体内での血行動態を特徴付けてもよい。
播くのに使用した多孔性膜は、TRANSWELL細胞培養インサートの多孔性膜(Corningで特注のポリカーボネート、10μmまたは18μmの膜厚及び0.4μmの孔径、75mmのインサート直径)であった。細胞を播くためのインサートを調製するために多孔性膜の両面をゼラチン(0.14%の無菌水溶液)で被覆した。多孔性膜は培養にて細胞型を分離するが、膜の孔を介して細胞/細胞の相互作用が生じるのを可能にする。
上述のように且つ図9で説明したように調製された三者混合培養物を血行動態剪断応力の7日後に室温(RT)にて20分間4%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences)で固定し、カルシウムとマグネシウムを伴ったリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、処理されるまで4℃で保存した。試料を0.1%Tritonで20分間透過化し、室温にて1時間、F−アクチンを染色するALEXA FLUOR488(蛍光染料)標識したファロイジン(1:100;Life Technologies)及びTO−PRO−3染色(1:2000;Life Technologies)で染色した。PBSで3回洗浄した後、FLUOROMOUNT G(水性検体培地、Southern Biotech)を用いて試料をカバーグラスの間で標本にした。20倍の油浸対物レンズを用いたNikon ECLIPSE Ti共焦点顕微鏡によって画像を撮った。
腫瘍の毛細血管血行動態に暴露した場合の複数のマトリクス条件でヒトの肺癌細胞株A549(ATCC,Manassas,VA)の増殖速度を測定した。細胞は図9で示したように播いた。3×103個/cm2の当初の播種密度で細胞培養インサートの多孔性膜上にHs888Luヒト肺線維芽細胞を播いた。実施例1にて上述のように二次膜を適用し、次いで3×103個/cm2の当初密度で実施例1にて上述のように3つのマトリクス条件:(1)二次膜に直接播かれた細胞(マトリクスなし);(2)コラーゲンの単層上に播かれた細胞(コラーゲン層);または(3)コラーゲンサンドイッチの播かれた細胞;のそれぞれにてA549腫瘍細胞を播いた。静置環境における48時間のインキュベートの後、5×104個/cm2の当初播種密度で細胞培養インサートの多孔性膜の上面上に皮膚微細血管の内皮細胞を播いた。静置条件下で、または血行動態の流れと輸送に供して、培養物を7日まで培養した。静置培養については、製造元(Molecular Probes,Eugene,OR)の指示書に従ってCYQUANT細胞増殖アッセイキットを用いて、播種の時(0日目)及び2、4及び7日目に細胞の数を測定した。血行動態の流れと輸送に供した培養については、培養物を血行動態の流れと輸送に供した日((0日目)及び血行動態の流れと輸送の2、4及び7日目に細胞の数を測定した。データを図14A及び14Cに示し、それは3つのマトリクス条件のそれぞれについて2つ組培養物に由来する細胞の平均数として提示される。各条件について、マトリクスなしで且つ血行動態の流れと輸送の非存在下でのプラスチック二次元(2D)組織培養ディッシュで増殖したA549の増殖速度と増殖速度を比較した。
多孔性膜上の内皮細胞を固定し、内皮接合タンパク質VEカドヘリンについて免疫染色し、共焦点顕微鏡によって単層を調べることによって、実施例1にて上述した方法に従って培養された内皮細胞の内皮細胞密度及び単層の完全性を評価することができる。
実施例1にて上述の方法を用いて培養された腫瘍細胞の形態を評価するために、E−カドヘリンについて及び蛍光標識したファロイジンを用いてアクチンについて多孔性膜上の腫瘍細胞を免疫染色することによって腫瘍細胞の形態を確定することができる。多孔性膜の孔を介した侵襲性構造(浸潤突起)の拡張を定量するために、培養物を固定し、E−カドヘリン(腫瘍細胞について)及びVE−カドヘリン(内皮細胞について)について免疫染色し、多孔性膜の断面を共焦点顕微鏡によって分析することができる。
生体内の腫瘍/脈管構造の領域では、腫瘍細胞からの多数の増殖因子の分泌のために、血管透過性の上昇が生じる(Mukaidaら,2012;Bradfordら,2013)。実施例1にて上述の三者混合培養系における内皮細胞のバリア機能を腫瘍細胞が変えることを実証するために、透過性アッセイを行って内皮単層の透過性の上昇を測定した。このアッセイでは、西洋ワサビのペルオキシダーゼ(HRP)を上容量部に加え、腫瘍細胞の存在下及び非存在下にてHRPの蓄積を、経時測定した。
次世代のRNA配列決定(RNAseq)を用いて、3つの異なる条件下:(1)静置二次元培養にて;(2)胸腺欠損ヌードマウスの皮下で増殖させた異種移植片にて;及び(3)実施例1で上述のように、且つ血行動態条件に供して生成された三者混合培養にて増殖させたA549腫瘍細胞のトランスクリプトームを比較した。血行動態条件下で2、4及び7日間増殖させた腫瘍細胞からRNAを単離した。この比較は、血行動態条件に供した三者混合培養のトランスクリプトームは、試験管内の静置2D培養よりも生体内異種移植にさらに密接に類似することを示した。
生体内の腫瘍/脈管構造の領域では、腫瘍細胞の増殖及び浸潤は腫瘍細胞に極めて近接した内皮細胞によって調節される。実施例1に記載された方法に従って培養された内皮細胞及び腫瘍細胞双方の定性的な及び定量的な遺伝子発現及びサイトカイン分泌のプロファイルを生成することができる。そのようなアッセイを用いて血管形成因子及び腫瘍形成因子の発現をモニターし、そのようなアッセイは、たとえば、次世代のmRNA配列決定及びサイトカインや増殖因子の分泌プロファイリングを用いて測定されるような腫瘍の分子活性のマーカーを増強することによって、腫瘍に由来する血行動態の流れのもとで培養された内皮細胞が腫瘍細胞の分子署名を変えることを実証する。
実施例1で上述し、且つ図9にて示されたように生成された三者混合培養にて増殖させたA549腫瘍細胞に対する抗癌剤の効果を評価した。以下の薬剤:NSCLCに対する最先端の化学療法剤であるシスプラチン(Rossiら,2012;国立癌研究所,非小細胞肺癌の治療(PDQ(登録商標)));及びNSCLC及び他の癌に対する臨床試験中であるMEK(AZD6244/セルメチニブ)及びAKT(MK−2206)の2つの実験的小分子アロステリック阻害剤(Leijenら,2011;国立癌研究所,ADZ6244の無作為フェーズII試験;Yapら,2011;国立癌研究所,進行性非小細胞肺癌患者の治療におけるMK2206及びエルロチニブ塩酸塩)を選択した。調べた3つの薬剤のそれぞれについて、及び血行動態条件に供した三者混合培養にて臨床的に関連するヒト患者のCmaxで増殖阻害が起きた。
実施例1で上述されたように生成された三者混合培養にて増殖させた腫瘍細胞、間質線維芽細胞及び/または微細血管内皮細胞に対するその効果について追加の抗癌剤を調べることができる。ヒトにおける生体内の治療Cmaxの濃度範囲の範囲内である培養培地における濃度で三者混合培養に抗癌剤を導入することができる。たとえば、抗増殖性化学療法剤であるカルボプラチン(Sigma−Aldrich)及びEGFR阻害剤であるエルロチニブ(Cayman Chemical)を調べることができる。これら2つの薬剤は肺癌の治療に一般的に使用され、その薬物動態は臨床試験を介して特徴がはっきりしており、それら双方は肺癌患者の生存を改善することが示されている。カルボプラチンは迅速に分裂する細胞を無差別に殺傷する従来の化学療法剤であるのに対してエルロチニブは広く毒性ではない標的化療法である。
脈管構造を介した腫瘍細胞の遠位臓器への転移は癌の死亡率の主要な原因である。その豊富な血液供給のために、肝臓は腫瘍転移の一般的な部位である。ヒトの腫瘍細胞(たとえば、A549腫瘍細胞または膵臓腫瘍細胞)を静置2D条件下または異種移植片として実施例1にて上述された方法に従って培養する。次いで腫瘍細胞を取り出し、試験管内の肝臓モデル系、たとえば、双方のその内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられるUS2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載されたような試験管内の肝臓モデル系に加える。たとえば、US2013/0309677及びPCT2013/0158939にて記載された試験管内の肝臓モデル系では、肝細胞はコラーゲンゲルに挟まれ、多孔性膜の第1の表面上に播かれる。任意で類洞内皮細胞を多孔性膜の第2の表面上に播く。追加の非実質肝細胞を任意で多孔性膜の第1または第2の表面上に播く。次いで、肝臓における生体内での血流を模倣する剪断応力を多孔性膜の第2の面上の非実質肝細胞に適用し、培養培地を上容量部及び下容量部の内外に潅流させる。図11はそのような系の模式図を提供する。
生体内で代謝表現型を、経時維持する生理的なパラメータがないことがある程度原因で、静置肝細胞培養法は試験管内と生体内の乏しい相関を伴う。生理的な血行動態及び輸送を復元することは、標準の静置肝細胞のコラーゲンゲル構成に比べて試験管内の肝細胞の表現型及び機能を保持する。
(i)動物の手術及び肝細胞の単離
実験で使用された動物はすべてHemoShearの動物実験委員会によって認可されたプロトコールに従って処理した。20mL/分の流速を用いたSeglenの2ステップコラゲナーゼ潅流法(Seglen,その内容が参照によって本明細書に組み入れられるHepatocyte Suspensions and Cultures as Tools in Experimental Carcinogegnesis,J.Toxicology & Environmental Health,5(2−3):551−560(1979))の改変によって肝細胞をオスFischerラット(250g〜350g)から単離した。手短には、イソフルランでラットを麻酔し、その後、腹腔を切開し、流出のために門脈で切除を行いながら下大静脈にカニューレを入れた。肝臓を2ステップで潅流し、先ず、Ca++を含まない緩衝液で血液を洗い出し、細胞間接合を壊し、その後、Ca++を含有する緩衝液におけるコラゲナーゼで細胞外コラーゲンマトリクスを消化した。肝臓を好適に潅流した後、無菌のフードにてペトリディッシュ内でそれを切除し、被膜を取り除いた。2回の連続した65gの遠心分離とそれぞれ90%PERCOLL(ポリビニルピロリドン(PVP)で被覆した直径15〜30nm(水中では23%w/w)のコロイド状シリカ粒子;細胞を単離するのに使用することができる密度勾配を確立するのに使用される)による10分間の遠心が続く10分間の洗浄サイクルによって濃縮された肝細胞集団(約95%の純度)を得た。トリパンブルー排除試験によって肝細胞の生存率を測定し、85%を超える生存率の細胞を使用する。
[肝細胞の培養培地]図20〜24で示すデータについては、ラット肝細胞の培養培地は、高グルコース(17.5mM)を含有し、ウシ胎児血清(播種時では10%及び24時間後の維持のためには2%に低下させた)によって補完されたDMEM/F12の基礎培地を含有した。培地はまた、ゲンタマイシン(50μg/ml)、ITS(インスリン濃度2μMol)、1%のNEAA、1%のGLUTAMAX及びデキサメタゾン(播種時1μM及び24時間後の維持については250nM)も含有した。
[RT−PCR]培養期間の終了時(7または14日)に健常条件及び脂肪変性条件もとで実行された装置からの肝細胞からRNAを抽出し、このRNAでRT−PCRを行うことによって代謝遺伝子、毒性遺伝子及びインスリン/グルコース/脂質経路の遺伝子における変化を評価した。TRANSWELLSを装置から取り出し、PBSで洗浄した後、多孔性膜から細胞を剥ぎ取った。PURELINK RNAミニキット(細胞から全RNAを精製するためのキット)を用いて全RNAを単離し、ISCRIPT cDNA合成キット(cDNA合成キット)を用いてcDNAに逆転写した。代謝遺伝子CYP1A1、CYP1A2、CYP3A2、MDR、及びGST、並びにインスリン/グルコース/脂質経路の遺伝子GPAT、ACC1、IRS−2、PPAR−γ、SREBP、ChREBP、LXR、SCD1、CPT1についてプライマーを設計した。プライマーの配列を表3にて以下で示す。
(ii)制御された血行動態は、従来の静置単独培養条件に比べて肝細胞の表現型、分極した形態及び輸送体の局在を維持する。
新しく単離されたラットの初代肝細胞を入手し、多孔性膜上のコラーゲンゲルサンドイッチに播いた。1日後、培養を37℃のCO2インキュベータにて標準の静置条件下で継続した、または血行動態流れ技術に導入し、0.6ダイン/cm2の所定の間接的な剪断率での制御された血行動態のもとで維持した。培地は静置培養では48時間ごとに交換し、装置では連続的に潅流した。7日後、培養物を取り出し、4%のパラホルムアルデヒドで固定した後、肝細胞の分化マーカー、E−カドヘリンとHNF−4αに対する抗体で免疫染色し、共焦点顕微鏡によって視覚化した。静置コラーゲンゲルサンドイッチ培養におけるE−カドヘリンの染色パターン(図20A)は、形態学的解析(隣接するグラフ)によって確認され、定量された高いレベルの細胞質E−カドヘリンを示し、表在性の膜分布を壊した。制御された血行動態のもとでは(図20B)、肝細胞は、E−カドヘリンの異なる表在性の膜局在と低い細胞質レベルを特徴とするさらに分化した形態を示した。HNF4αの染色パターンは、制御された血行動態のもとでの細胞が、生体内で見られるものに類似して核に限定された染色を保持した(図20D)一方で、7日までのさらに拡散した染色パターンを有する静置培養における細胞による局在パターン(図20C)ではっきり分かる差異を示した。コラーゲンゲルサンドイッチにおける培養の5〜7日後に出現する輸送体多剤耐性タンパク質−2(MRP−2)の分極形態と細管状の局在は14日までの静置培養で失われる(図20E)が、細管状のネットワークパターンは制御された血行動態のもとで安定であり、広範囲である(図20F)。生体内のラット肝臓の切片(図21B)と一緒にMRP−2及びHNF−4αについて同時染色された制御された血行動態のもとで維持された14日目の培養(図21A)は非常に類似した染色パターンを示す。制御された血行動態のもとでの7日目の培養の透過電子顕微鏡像(図21C)は、毛細胆管及び密着結合の存在を確認することに加えて、たとえば、粗面小胞体及び滑面小胞体及びミトコンドリアのような細胞内成分の保持を明らかにしている。
静置条件下または制御された血行動態(0.6ダイン/cm2)のもとで肝細胞を2週間培養し、4、7、11及び14日目に培地を採取した。尿素及びアルブミンについてのアッセイを培地で行い、値は、播いた細胞の当初の数に基づいて100万個の細胞当たりの24時間にわたる産生率に対して正規化した。14日間にわたる種々の時点での培地試料から推定され且つμg/106個の播いた肝細胞/日として表された分泌されたアルブミンによって反映される肝細胞の機能(図22A)は、静置培養(点線)に比べて制御された血行動態(実線)のもとで有意に高いレベル(3〜4倍)を示した(7日目:97.96±11.34対25.84±8.22,p=0.00001;14日目:87.80±8.62対33.93±4.39,p=0.0001)。制御された血行動態(実線)のもとでμg/106個の播いた肝細胞/日として表された肝細胞による尿素の分泌(図22B)は培養の2週間にわたって一貫して静置培養(点線)よりも4〜5倍高いことも見いだされた(7日目:622.78±33.96対139.76±13.37,p=2.7×10−9;14日目:667.71±84.37対178.68±6.13,p=1×10−6)。
静置条件下または制御された血行動態(0.6ダイン/cm2)のもとで肝細胞を7日間培養した。これらの条件に由来する7日目のRNA試料で選択した代謝遺伝子(表3)についてQRT−PCRを行った。値はすべて7日目の静置培養に対して正規化した。制御された血行動態のもとで培養された肝細胞は、静置培養よりも一貫して高く(n=11、静置培養に比べた倍率変化:Cyp1A1 約54,p=0.0003;Cyp1A2 約64,p=0.005,Cyp2B1 約15,p=0.001:図23A,Cyp2B2 約2.7,p=0.09及びCyp3A2 約4,p=0.075:図23B)、且つ生体内のレベルに近い遺伝子発現レベルを生じた。興味深いことに、静置培養では時間をかけて上昇することが知られるフェーズIIの酵素GSTのPiサブユニットの遺伝子の発現レベルは、静置培養(図23C)に比べて生体内の肝臓(−4.9倍、p=0.152)及び制御された血行動態のもとで培養された肝細胞(−2.3倍、p=0.025)双方で低かった。
代謝遺伝子及び代謝タンパク質の増加が代謝活性の変化につながったことを検証するために、ラット初代肝細胞を前に記載されたように制御された血行動態(0.6ダイン/cm2)のもとで円錐平板装置にて、及び静置コラーゲンゲル培養にて培養した。5日後、それらを未処理のままにした、または0.1%のDMSO、1A/1B誘導因子3−コラントレン(3−MC、静置培養では1μM及び制御された血行動態のもとでは0.1μM)または3A誘導因子デキサメタゾン(静置培養では50μM及び制御された血行動態のもとでは02.5μM)で処理した。48時間後、7日目に、異なる作用剤で処理した相当する静置培養と並行して、大まかに2.0cm2の面積である制御された血行動態のもとで培養された肝細胞を含有する装置からの多孔性膜の断片を切り出し、標準の24穴プレートに移し、Cyp p450酵素の基質で処理した。市販のP450−GLOキットを用いて7日目にチトクロームp450アッセイを行った。4時間後、培地を96穴プレートに移し、チトクロームp450の活性を反映する発光性代謝体についてアッセイした。生細胞の正確な表現を得、且つ総タンパク質の測定に対するコラーゲンゲルの交絡効果を回避するために、値は、CELLTITER−GLOアッセイによって評価された細胞のATP含量に対して標準化した。
上述のように単離し、播いたラット初代肝細胞を制御された血行動態のもとで円錐平板装置にて7日間培養した後、PBSで洗浄し、調節性ホルモンであるインスリン(2nM)またはグルカゴン(100nM)の存在下または非存在下で基質のグリセロール(2mM)または乳酸塩(20mM)及びピルビン酸塩(2mM)と共にインキュベートした。AMPLEXREDアッセイによって4時間後上清にて測定されたグルコースのレベルは、基質の非存在下ではインスリンはグルコースのレベルを27%低下させる一方でグルカゴンはそれを51%上昇させることを示した。基質グリセロールの存在下では、肝細胞によって産生されるグルコースは67%増加した。グルカゴンの添加はグルコースのレベルをさらに15%高めた一方で、インスリンはグルコースのレベルを38%低下させた。乳酸塩及びピルビン酸塩を基質として使用した場合、肝細胞によって産生されるグルコースはグルカゴンの存在下で80%増加した一方で、インスリンはグルコースのレベルを25%低下させた。これらのデータを表6にて要約する。
ヒト肝細胞を、上述した操作条件下の制御された血行動態のもとで円錐平板装置にて、または静置条件下で(対照)7日間培養した後、既知のCYP誘導性薬剤、フェノバルビタール(静置条件では500μM及び制御された血行動態の条件では50μM)またはリファンピシン(静置条件では25μM及び制御された血行動態の条件では2.5μM)に72時間暴露した。次いで肝細胞をPBSで洗浄し、上述のようなCYP基質のカクテルを含有する培地と共に4時間インキュベートした。次いで培養上清を回収し、特定のCYP酵素の比活性を評価する代謝体の形成について解析した。結果を細胞のタンパク質含量に対して標準化し、ピコモル/分/タンパク質のmgとして表した。0.1%DMSOによるビヒクル処理の対照は、静置条件に比べて制御された血行動態の条件下では高いレベルのCYP2B6、CYP2C9及びCYP3A4を示した(それぞれタンパク質の7.7対4.6、4.6対0.5及び7.6対0.7ピコモル/分/mg)。静置条件下での高い濃度(500μM)に比べて制御された血行動態の条件下での低い濃度(50uM)のフェノバルビタールによる処理もCYP2B6、CYP2C9及びCYP3A4の匹敵するまたは高いレベルの酵素活性を生じた(それぞれタンパク質の45.9対34.3、16.3対0.9及び16.3対3.8ピコモル/分/mg)。同様に、静置条件下での高い濃度(25μM)に比べて制御された血行動態の条件下での低い濃度(2.5μM)のリファンピシンによる処理もCYP2B6、CYP2C9及びCYP3A4の匹敵するまたは高いレベルの酵素活性を生じた(それぞれタンパク質の87.3対131.1、1.4対16.0及び11.5対23.1ピコモル/分/mg)。これらの結果を図35にて示す。
上述のように融解し、播かれた凍結保存のヒト初代肝細胞を制御された血行動態のもとで円錐平板装置にて、または静置条件下で(対照)7日間培養した後、異なる濃度(0.1μM、1μM及び10μM)のクロルプロマジンまたはビヒクル対照に72時間暴露した。エチジウム/カルセイン染色によって肝細胞にて生死染色を行った。肝細胞はまたMTT試薬とも1時間インキュベートして生存率を評価した。追加の断片からRNAを抽出し、RT−PCRを行って選択した毒性遺伝子及び代謝遺伝子を評価した。静置条件下で培養した肝細胞は調べた濃度すべてにてどんな毒性も示さなかった。しかしながら、制御された血行動態のもとで培養された肝細胞は1μMで30.3%の毒性及び10μuMで46.4%の毒性といった用量依存性の毒性を示した(図36B)。1μMでは、制御された血行動態の装置のもとで培養された肝細胞への毒性も生死染色によって検出された(図36A)。
上述のように単離され、播かれたラット初代肝細胞を制御された血行動態の条件下での円錐平板装置にて、または静置条件下で7日間培養した。肝細胞をPBSで洗浄し、直ちにビヒクル(蒸留水)またはクロルプロマジン(1μM)と共に4時間インキュベートした。上清を回収し、上述のようにmiRNA122のレベルを測定した。静置条件下では、1μMでのクロルプロマジンはビヒクル対照に比べて上清におけるmiRNA122のレベルに変化を生じないことが分かった。それに反して、制御された血行動態の条件下で培養し、クロルプロマジン(1μM)と共に4時間インキュベートした肝細胞は有意に高いレベル(ビヒクル対照の6倍)でmiRNAを放出した。これらの結果を図38にて示す。
上述のように単離され、播かれたラット初代肝細胞を制御された血行動態の条件下での円錐平板装置にて5日間培養した後、4μMまたは40uMのトログリタゾンに48時間暴露した。肝細胞をPBSで洗浄し、直ちに基質10uMの二酢酸カルボキシ−2,7−ジクロロフルオレセイン(CDFDA)と共にインキュベートした。基質の高度に蛍光性のMrp−2基質カルボキシ−2,7−ジクロロフルオレセイン(CDF)への加水分解及び毛細胆管構造へのその能動的な分泌を可能にする非蛍光性基質CDFDAへの20分間の暴露の間に共焦点顕微鏡によって細胞を画像化表示した。4uMのトログリタゾンは視覚的に拡張した細管状構造を伴った細管状パターンの変化を生じることが見いだされた。これらの変化は40uMのトログリタゾンでさらにはるかに顕著であり、広範だった(図39)。制御された血行動態の条件下で培養された場合の生体内/臨床的な血漿Cmaxでのトログリタゾンに対するラット肝細胞の毒性反応は酸化ストレスに関連する遺伝子の上方調節及びMRP3遺伝子とMRP4遺伝子の代償性の上方調節に関連した(図40)。
新しく単離されたイヌ初代肝細胞を、ヒト肝細胞について上述のものに類似する操作条件下で制御された血行動態の条件のもとでの円錐平板装置にて培養し、または静置条件下(対照)で培養した。7日後、培養物を固定し、それぞれアクチン細胞骨格及び核についてファロイジン及びDraq5によって染色した。細胞からRNAを回収し、特定の代謝遺伝子についてRT−PCRを行った。イヌ肝細胞は、7日目で多角形形状の分極形態を保持し、静置対照よりも有意に高いレベルでCYP1A1及びCYP3A12を発現する(それぞれ6.7倍及び7.4倍)ことが分かった。これらの結果は図41にて示す。
非アルコール性の脂肪肝疾患(NAFLD)は肝不全の最も一般的な原因であり、肥満、インスリン抵抗性及び2型糖尿病に関連する。脂肪肝における変化は、肝細胞内での脂肪小胞の早期の蓄積(肝臓脂肪症)からその後の肝臓の代謝機能の喪失及び炎症性の変化へと進行し、最終的には線維症及び肝硬変につながる。脂肪肝疾患の動物生体内モデルは、糖尿病を反映する高血糖及び高インスリン血症を誘導する高脂肪餌または低脂肪高炭水化物餌を上手く使用してトリグリセリドの蓄積を誘導している。しかしながら、試験管内のモデルは通常、遊離の脂肪酸(オレイン酸、パルミチン酸またはリノール酸)の過剰負荷のみを用いて脂肪の変化を誘導し、疾患の病態形成で重要な役割を担い得る高レベルのグルコース及びインスリンに対する肝細胞のデノボ応答を捕捉しないかもしれない。肝細胞の静置培養はまた、顕著に低下したインスリン応答を有することが知られ、標準の培養培地は通常、基本的な肝細胞の生存及び機能のために高い生理的ではないレベルのホルモンを必要とする。それに反して、本明細書で記載されるモデルは、薬剤及びホルモンに対するさらに生理的な応答を保ち、グルコース及びインスリンの生体内の濃度レベルに近い濃度で我々が基本的な肝機能を維持するのを可能にし(実施例12で上述のように)、さらに、高レベルのグルコース及びインスリンを特徴とする糖尿病のような環境を創り出すことによって脂肪肝で見られる病的な応答を我々が引き出すのを可能にする。
(i)動物の手術及び肝細胞の単離
実施例12で上述のように動物の手術及び肝細胞の単離を行った。
[健常な肝細胞の培養培地]健常な肝細胞の培養培地は、ウシ胎児血清(播種時10%で24時間後維持のために2%に低下させた)で補完した低グルコース(5.5mM)を含有するDMEM/F12の基本培地を含有した。さらに、培地は、ゲンタマイシン(50μg/ml)、ITS(インスリン、トランスフェリン、及びセレニウム;2nMのインスリン濃度)、1%非必須アミノ酸(NEAA)、1%GLUTAMAX(L−アラニル−L−グルタミンを含有する培地補助剤)、及びデキサメタゾン(図25及び26に示すデータについては播種時1μM及び24時間後維持のために250nM;図27〜34で示すデータについては実験全体を通して100nM)を含有した。
健常対照に対する脂肪肝モデルで生じる変化を調べるために以下を評価した:
(a)代謝遺伝子及びインスリン/グルコース/脂質経路の遺伝子における変化(RT−PCR)、
(b)オイルレッドアッセイ、ナイルレッド染色及び総トリグリセリドの測定による肝細胞内での細胞内脂質の蓄積、
(c)肝細胞の分化した機能における変化(尿素及びアルブミンの分泌)、
(d)代謝活性における変化(チトクロームp450アッセイ)及び
(e)透過電子顕微鏡(TEM)による肝細胞内での形態的変化。
[ナイルレッド染色]図27A及び27Bは、健常培地(図27A)及び脂肪肝培地(図27B)で培養した肝細胞のナイルレッド、ファロイジン及びDRAQ5による染色を示す。図27Bに見ることができるように、脂肪肝培地(高濃度のグルコース及びインスリンを含有する)で培養された肝細胞は多数の脂質液滴を蓄積する。
要約すれば、生体内様の肝細胞の表現型及び応答を保ち、高グルコース/インスリンの環境の存在下で病的な脂肪症の変化を誘導することによって肝脂肪症のモデルを創り出す系を開発した。制御された血行動態のもとでのラット肝細胞はインスリン及びグルコースに対するその応答を保持し、血行動態の流れのもとで培養された肝細胞は高いグルコース及びインスリンの(病的な)状態で培養すると脂肪症の変化を発症する。脂肪症には2つの重要な遺伝子(SREBP及びGPAT)の上方調節と共にデノボ脂質形成が介在し、脂質蓄積及びトリグリセリド含量の上昇は代謝遺伝子の発現及び活性の付随する低下を伴う。PPAR−γアゴニストであるピオグリタゾンによる処理は高いグルコース及びインスリンの条件下での脂質の蓄積及び代謝活性の喪失を防ぐのに役立つ。これらのデータは、そのために現在何も存在していない食事で誘導される非アルコール性の脂肪肝疾患(NAFLD)の新規で且つ重要な新しい試験管内モデルを実証している。
人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する肝細胞は、薬剤応答における変動を排除すること及び遺伝子型の変異を検討することについて解決の可能性を提供するが、それらが標準の静置培養系で示す胎児表現型及び不適切な代謝プロファイルの理由で、幅広い支持は得られていない。実施例12で上述したデータは、静置培養の条件下では迅速に脱分化することが知られるラット及びヒトの初代肝細胞が制御された血行動態の条件下で培養されると成熟した分化した表現型を安定的に保持し、さらに生理的な薬剤及びホルモンへの応答を生じることを明らかにしている。たとえば、流れ、血行動態及び輸送のような生理的特性が維持されれば、iPSCは同様に応答し、分化した肝臓の表現型及びそれらが生体内で示す薬剤への応答を示すことが発見された。
(i)iPSC由来の肝細胞
iPSC由来の肝細胞はCellular Dynamics Internationalから購入した。
iPSC由来の肝細胞の静置培養用の培養培地は供給業者の推奨どおりだった。円錐平板装置にて制御された血行動態の条件下で培養される細胞については、播種の時点では、ウシ胎児血清(10%)及びデキサメタゾン(1μM)で補完されたWilliamsE培地の基本培地を用いた。FBSを含有しないが、ウシ血清アルブミン(0.125%)で補完された維持培地を24時間後使用した。培地はまたゲンタマイシン(25μg/ml)、ITS(インスリン濃度、2nM)、1%NEAA、1%GLUTAMAX、HEPES(30mM)及びデキサメタゾン(100nM)も含有した。
ヒト初代肝細胞については、コラーゲン被覆及び播種の条件は実施例12で上述したものと同一だった。推奨された培地を用い、供給業者のプロトコールどおりにiPSC由来の肝細胞を分離し、播いた。iPSC由来の肝細胞を静置条件下で培養し、または制御された血行動態の条件下での培養のために24時間後、円錐平板装置に移した。
(i)制御された血行動態の条件下で培養された人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する肝細胞は、分極形態を保持し、静置培養に比べて重要な代謝遺伝子の高い発現を示す
制御された血行動態のもとで円錐平板装置にて10日間培養されたiPSC由来の肝細胞は、分極形態を保持し(図42)、静置培養に比べて重要な代謝遺伝子の高い発現を示す(CYP1A1について104倍、CYP1A2について91倍、CYP3A4について8.8倍、CYP2B6について8.2倍、CYP2C9について2.3倍及びCYP2D6について2.3倍)。構成的なアンドロスタン受容体CARの発現は静置条件下で培養された細胞より6.0倍高く、肝臓特異的なタンパク質アルブミンの発現は静置条件下で培養された細胞より2.2倍高かった。これらの結果は図43に示す。
Andriani F, Perego P, Carenini N, Sozzi G, Roz L. Increased Sensitivity to Cisplatin in Non−Small Cell Lung Cancer Cell Lines after FHIT Gene Transfer. Neoplasia N Y N. 2006 Jan;8(1):9−17.
Claims (223)
- 腫瘍微細環境の試験管内での模倣方法であって、前記方法が、
細胞培養容器に培養培地を加えることと、
細胞培養容器内の表面上に少なくとも1つの腫瘍細胞型を播くことと、
前記少なくとも1つの腫瘍細胞型に剪断応力を間接的に適用することとを含み、前記剪断応力は流動装置によって誘導される前記培養培地の流れから生じ、前記流れは前記腫瘍細胞が前記腫瘍微細環境にて生体内で間接的にさらされる流れを模倣し、前記流れは時変性である、前記模倣方法。 - 前記細胞培養容器内の前記表面上に少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を堆積させ、前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分上に前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を播くこと;または
少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む溶液にて少なくとも1つの腫瘍細胞型を懸濁させて前記少なくとも前記1つの腫瘍細胞型と前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創り出し、前記細胞培養容器内の前記表面上に前記懸濁液を堆積させること;
及び
前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分と前記少なくとも1つの腫瘍細胞型に前記剪断応力を間接的に適用することとを含む請求項1に記載の方法。 - さらに、多孔性膜の第1の表面上に少なくとも1つの腫瘍細胞型を播くことと、多孔性膜の第2の表面上に前記剪断応力を適用することによって前記少なくとも1つの腫瘍細胞型に前記剪断応力を間接的に適用することとを含む請求項1に記載の方法。
- 腫瘍微細環境の試験管内での模倣方法であって、前記方法が、
細胞培養容器に培養培地を加えることと、
前記細胞培養容器内の多孔性膜の第1の表面上に少なくとも1つの腫瘍細胞型を播くことと、
前記多孔性膜の第2の表面上に剪断応力を適用することによって前記少なくとも1つの腫瘍細胞型に剪断応力を間接的に適用することとを含み、前記剪断応力は流動装置によって誘導される前記培養培地の流れから生じ、前記流れは前記腫瘍細胞が前記腫瘍微細環境にて生体内で間接的にさらされる流れを模倣する、前記模倣方法。 - 腫瘍微細環境の試験管内での模倣方法であって、前記方法が、
細胞培養容器に培養培地を加えることと、
前記細胞培養容器内の多孔性膜の第1の表面上に前記少なくとも1つの腫瘍細胞型または間質細胞型を播くことと、
前記多孔性膜の第2の表面上に剪断応力を適用することによって前記少なくとも1つの腫瘍細胞型に剪断応力を間接的に適用することとを含み、前記剪断応力は流動装置によって誘導される前記培養培地の流れから生じ、前記流れは前記腫瘍細胞が前記腫瘍微細環境にて生体内で間接的にさらされる流れを模倣する、前記模倣方法。 - 前記第1の表面が前記細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように前記細胞培養容器にて前記多孔性膜を懸濁させ、それによって前記細胞培養容器内で前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を含む下容量部と前記多孔性膜の第2の表面を含む上容量部を定義し、前記剪断応力が前記容器の前記上容量部における前記多孔性膜の前記第2の表面に適用される請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記多孔性膜の前記第1の表面上に少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を堆積させ、前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分上に前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を播くこと;または
前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む溶液に前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を懸濁させて前記少なくとも1つの腫瘍細胞型と前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創り出し、前記多孔性膜の前記第1の表面上に前記懸濁液を堆積させることを含み、
前記第1の表面が前記細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように前記細胞培養容器にて前記多孔性膜を懸濁させ、それによって前記細胞培養容器内で前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分と前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を含む下容量部と前記多孔性膜の第2の表面を含む上容量部を定義し、前記剪断応力が前記容器の前記上容量部における前記多孔性膜の前記第2の表面に適用される請求項3〜5のいずれか1項に記載の方法。 - さらに、前記多孔性膜の前記第2の表面上に内皮細胞を播くことと、前記播かれた内皮細胞に前記剪断応力を適用することとを含み、前記少なくとも1つの腫瘍細胞型が前記多孔性膜の第1の表面上に播かれる請求項3〜7のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記多孔性膜の前記第2の表面上に少なくとも1つの間質細胞型を播くことと、前記播かれた間質細胞型に前記剪断応力を適用することとを含む請求項3〜7のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記多孔性膜の前記第2の表面上に内皮細胞を播くことを含む請求項9に記載の方法。
- 播く前に前記少なくとも1つの間質細胞型を前記内皮細胞と混合することと、前記少なくとも1つの間質細胞型と前記内皮細胞の前記播かれた混合物に前記剪断応力を適用することとを含む請求項10に記載の方法。
- 前記多孔性膜の前記第2の表面上に前記少なくとも1つの間質細胞型と前記内皮細胞を順次播くことを含む請求項10に記載の方法。
- 前記多孔性膜の前記第2の表面上に前記少なくとも1つの間質細胞型を播くことと、前記播かれた間質細胞型の上に続いて前記内皮細胞を播くことと、前記播かれた内皮細胞に前記剪断応力を適用することとを含む請求項12に記載の方法。
- 前記多孔性膜の前記第2の表面上に前記内皮細胞を播くことと、前記播かれた内皮細胞の上に続いて前記少なくとも1つの間質細胞型を播くことと、前記播かれた間質細胞型に前記剪断応力を適用することとを含む請求項12に記載の方法。
- 前記多孔性膜が第1の多孔性膜であり、前記方法が、前記第1の多孔性膜の第1の表面上に少なくとも1つの腫瘍細胞型を播くことと、前記第1の多孔性膜の第2の表面上に少なくとも1つの間質細胞型を播くことと、前記播かれた間質細胞型の上に第2の多孔性膜を置いて前記第2の多孔性膜の第1の表面が前記播かれた間質細胞と接触するようにさせることと、前記第2の多孔性膜の第2の表面に前記剪断力を適用することとを含む請求項3〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多孔性膜が第1の多孔性膜であり、前記方法が、前記第1の多孔性膜の前記第1の表面上に前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を堆積させ、前記前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分の上に前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を播くこと、または
前記第1の多孔性膜の前記第1の表面上に前記少なくとも1つの腫瘍細胞型と前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む前記懸濁液を堆積させること、及び
前記第1の多孔性膜の第2の表面上に少なくとも1つの間質細胞型を播くことと、前記播かれた間質細胞型の上に第2の多孔性膜を置いて前記第2の多孔性膜の第1の表面が前記播かれた間質細胞と接触するようにさせることと、前記第2の多孔性膜の第2の表面に前記剪断力を適用することとを含む請求項7に記載の方法。 - さらに、前記第2の多孔性膜の前記第2の表面上に内皮細胞を播くことと、前記播かれた内皮細胞に前記剪断力を適用することとを含む請求項15または16に記載の方法。
- 前記多孔性膜が第1の多孔性膜であり、前記方法が、
前記第1の多孔性膜の第1の表面上に少なくとも1つの間質細胞型を播くことと、
前記播かれた間質細胞型の上に第2の多孔性膜を置いて前記第2の多孔性膜の第1の表面が前記播かれた間質細胞と接触するようにさせることと、
前記第2の多孔性膜の第2の表面上に少なくとも1つの腫瘍細胞型を播くことと、
前記第1の多孔性膜の前記第2の表面に前記剪断応力を適用することによって前記少なくとも1つの腫瘍細胞型に前記剪断応力を間接的に適用することとを含む請求項5に記載の方法。 - 腫瘍微細環境の試験管内での模倣方法であって、前記方法が、
細胞培養容器に培養培地を加えることと、
前記細胞培養容器内の第1の多孔性膜の第1の表面上に少なくとも1つの間質細胞型を播くことと、
前記播かれた間質細胞型の上に第2の多孔性膜を置いて前記第2の多孔性膜の第1の表面が前記播かれた間質細胞と接触するようにさせることと、
前記第2の多孔性膜の第2の表面上に少なくとも1つの腫瘍細胞型を播くことと、
前記第1の多孔性膜の前記第2の表面に剪断応力を適用することによって前記少なくとも1つの腫瘍細胞型に剪断応力を間接的に適用することとを含み、前記剪断応力は流動装置によって誘導される前記培養培地の流れから生じ、前記流れは前記腫瘍細胞が前記腫瘍微細環境にて生体内で間接的にさらされる流れを模倣する、前記模倣方法。 - 前記第1の多孔性膜の前記第1の表面が前記細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように前記細胞培養容器にて前記第1の多孔性膜を懸濁させ、それによって前記細胞培養容器内で少なくとも前記1つの腫瘍細胞型と前記第2の多孔性膜と少なくとも1つの間質細胞型を含む下容量部と前記第1の多孔性膜の第2の表面を含む上容量部を定義し、前記剪断応力が前記容器の前記上容量部における前記第1の多孔性膜の前記第2の表面に適用される請求項18または19に記載の方法。
- さらに、前記第2の多孔性膜の前記第2の表面上に前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を堆積させ、前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分上に前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を播くこと、または
少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む溶液に少なくとも1つの腫瘍細胞型を懸濁させて少なくとも1つの腫瘍細胞型と少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創り出し、前記第2の多孔性膜の前記第2の表面上に前記懸濁液を堆積させることを含む請求項18〜20のいずれか1項に記載の方法。 - さらに、前記第1の多孔性膜の前記第2の表面上に内皮細胞を播くことと、前記播かれた内皮細胞に前記剪断応力を適用することとを含む請求項18〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法がさらに、前記播かれた間質細胞型上に前記第2の多孔性膜を置く前に、少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む溶液に前記第2の多孔性膜を浸漬させることを含む請求項15〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法がさらに、前記内皮細胞と共に少なくとも1つの腫瘍細胞型を同時播種することを含む請求項8、10〜14、17、22及び23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記同時播種が、播く前に前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を前記内皮細胞と混合することを含む請求項24に記載の方法。
- 前記同時播種が、前記少なくとも1つの腫瘍細胞型及び前記内皮細胞を順次播くことを含む請求項26に記載の方法。
- 前記同時播種が、前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を播き、その後前記内皮細胞を播くことを含む請求項26に記載の方法。
- 前記同時播種が、前記内皮細胞を播き、その後前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を播くことを含む請求項26に記載の方法。
- 前記同時播種が、約100:1〜約3:1の比率で前記内皮細胞及び前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を播くことを含む請求項24〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 前記同時播種が、約50:1〜約10:1の比率で前記内皮細胞及び前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を播くことを含む請求項29に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの腫瘍細胞型が膠芽細胞腫に由来する細胞を含む請求項24〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 腫瘍に対する効果について薬剤又は化合物を調べる試験管内の方法であって、前記方法が
請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法に従って前記腫瘍の微細環境を模倣することと、
前記培養培地に薬剤または化合物を添加することと、
前記薬剤または化合物に直接的にまたは間接的に暴露される前記少なくとも1つの腫瘍細胞型に前記剪断応力を間接的に適用することとを含み、前記薬剤または化合物の存在下での少なくとも1つの腫瘍細胞型における変化が、前記薬剤または化合物が前記腫瘍に対して効果を有することを示す、前記試験管内の方法。 - 前記剪断応力の適用の際の、前記少なくとも1つの腫瘍細胞型、少前記なくとも1つの間質細胞型若しくは前記内皮細胞における前記腫瘍微細環境のマーカーのレベル若しくは局在または前記培養培地における前記腫瘍微細環境のマーカーのレベルの、前記剪断応力の適用の非存在下での前記少なくとも1つの腫瘍細胞型、前記少なくとも1つの間質細胞型若しくは前記内皮細胞における前記腫瘍微細環境のマーカーのレベル若しくは局在または前記培養培地における前記腫瘍微細環境のマーカーのレベルと比べた変化が、前記腫瘍微細環境の模倣を裏付ける請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記細胞培養容器内で注入口と排出口とを含む請求項1〜33のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記細胞培養容器の内外に培養培地を潅流することを含む請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞培養容器が、前記上容量部と前記下容量部を定義する前記細胞培養容器の部分内で注入口と排出口とをさらに含む請求項6〜17及び20〜35のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記上容量部の内外に培養培地を潅流することを含む請求項6〜17及び20〜36のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記下容量部の内外に培養培地を潅流することを含む請求項6〜17及び20〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記多孔性膜、前記第1の多孔性膜、または前記第2の多孔性膜を、前記培養培地の流体連通と前記多孔性膜の対向する面に播かれた細胞間での物理的な相互作用及び連通とを可能にするように適合させる請求項3〜38のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記細胞培養容器内の前記表面上に、前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分上に若しくは前記多孔性膜の前記第1の表面上に少なくとも1つの間質細胞型を播くこと、または
前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む前記溶液に前記腫瘍細胞型と共に少なくとも1つの間質細胞型を懸濁させて、前記少なくとも1つの間質細胞型と前記少なくとも1つの腫瘍細胞型と前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創り出し、前記細胞培養容器内の前記表面上若しくは前記多孔性膜の前記第1の表面上に前記懸濁液を堆積させることを含む請求項1〜14及び24〜39のいずれか1項に記載の方法。 - さらに、前記第1の多孔性膜の前記第1の表面上に少なくとも1つの間質細胞型を播くこと、または前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む前記溶液に前記腫瘍細胞型と共に少なくとも1つの間質細胞型を懸濁させて、前記少なくとも1つの間質細胞型と前記少なくとも1つの腫瘍細胞型と前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創り出し、前記第1の多孔性膜の前記第1の表面上に前記懸濁液を堆積させることを含む請求項15〜17及び24〜39のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記第2の多孔性膜の前記第2の表面上に少なくとも1つの間質細胞型を播くこと、または前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む前記溶液に前記腫瘍細胞型と共に少なくとも1つの間質細胞型を懸濁させて、前記少なくとも1つの間質細胞型と前記少なくとも1つの腫瘍細胞型と前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創り出し前記、第2の多孔性膜の前記第2の表面上に前記懸濁液を堆積させることを含む請求項18〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの腫瘍細胞型、前記内皮細胞、または前記少なくとも1つの間質細胞型が不死化細胞を含む請求項1〜42のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの腫瘍細胞型、前記内皮細胞、または前記少なくとも1つの間質細胞型が初代細胞を含む請求項1〜43のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が動物に由来する細胞を含む請求項1〜44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記動物が遺伝子操作された動物である請求項45に記載の方法。
- 前記動物がヒトである請求項45に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの腫瘍細胞型が、癌腫、肉腫、リンパ腫、腺癌、混合中胚葉性腫瘍、癌肉腫、奇形癌、またはそれらの組み合わせに由来する細胞を含む請求項1〜47のいずれか1項に記載の方法。
- 前記癌腫に由来する細胞が、腺癌に由来する細胞、扁平上皮癌に由来する細胞、またはそれらの組み合わせに由来する細胞を含み、肉腫に由来する細胞が、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、中皮肉腫(中皮腫)、線維肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、神経膠腫、星状細胞腫、粘液肉腫、間葉腫瘍、混合中胚葉性腫瘍、またはそれらの組み合わせに由来する細胞を含み、またはリンパ腫に由来する細胞がホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、またはそれらの組み合わせに由来する細胞を含む請求項48に記載の方法。
- 前記血管肉腫に由来する細胞が血管内皮腫、リンパ管肉腫、それらの組み合わせに由来する細胞を含む請求項49に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの腫瘍細胞が、結合組織の腫瘍、内皮または中皮の腫瘍、リンパ組織の腫瘍、筋肉の腫瘍、上皮組織の腫瘍、神経組織の腫瘍、アミン前駆体の取り込み及び脱カルボシキル化(APUD)の系の腫瘍、神経堤に由来する細胞の腫瘍、生殖腺の腫瘍、またはそれらの組み合わせに由来する請求項1〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合組織の腫瘍が、成人の線維組織、胚性(粘液腫)の線維組織、脂肪組織、軟骨組織、骨、脊索、線維性組織球腫の腫瘍またはそれらの組み合わせを含み;前記内皮または中皮の腫瘍が、血管腫瘍、リンパ管腫瘍、中皮腫瘍またはそれらの組み合わせを含み;前記リンパ組織の腫瘍が、形質細胞腫、ホジキン腫瘍、非ホジキン腫瘍、またはそれらの組み合わせを含み;前記筋肉の腫瘍が、平滑筋腫瘍、横紋筋腫瘍、またはそれらの組み合わせを含み;前記上皮組織の腫瘍が、重層扁平組織の腫瘍、腺上皮の腫瘍、移行上皮の腫瘍、胎盤腫瘍、精巣腫瘍、またはそれらの組み合わせを含み;前記神経組織の腫瘍が、グリア細胞の腫瘍、神経細胞の腫瘍、髄膜の腫瘍、神経鞘の腫瘍、またはそれらの組み合わせを含み;前記アミン前駆体の取り込み及び脱カルボシキル化(APUD)の系の腫瘍が、下垂体腫瘍、副甲状腺腫瘍、甲状腺腫瘍、気管支表層腫瘍、副腎髄質腫瘍、膵臓腫瘍、胃または腸の腫瘍、頸動脈小体の腫瘍、または化学受容体系の腫瘍、またはそれらの組み合わせを含み;前記神経堤に由来する細胞の腫瘍が、色素産生細胞の腫瘍、末梢神経系のシュワン細胞の腫瘍、メルケル細胞の腫瘍、またはそれらの組み合わせを含み;前記生殖腺の腫瘍が、卵巣の腫瘍、精巣の腫瘍、精上皮腫、未分化胚細胞腫、絨毛腫、胚性癌腫、内胚葉洞腫瘍、奇形癌腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫瘍、男化腫瘍、顆粒膜/卵胞膜腫瘍、門細胞腫、脂質細胞腫瘍、またはそれらの組み合わせを含む請求項51に記載の方法。
- 前記成人の線維組織の腫瘍が線維腫または線維肉腫を含み;前記胚性(粘液腫)の線維組織の腫瘍が粘液腫または粘液肉腫を含み;前記脂肪組織の腫瘍が脂肪腫または脂肪肉腫を含み;前記軟骨組織の腫瘍が軟骨腫または軟骨肉腫を含み;前記骨の腫瘍が骨腫または骨肉腫を含み;前記脊索の腫瘍が軟骨腫を含み;または前記線維性組織球腫が悪性線維性組織球腫を含む請求項52に記載の方法。
- 前記血管の腫瘍が、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫または血管肉腫を含み;前記リンパ管腫瘍がリンパ管腫またはリンパ管肉腫を含み、または前記中皮腫瘍が中皮腫を含む請求項52に記載の方法。
- 前記平滑筋の腫瘍が平滑筋種または平滑筋肉腫を含み;または前記横紋筋の腫瘍が横紋筋腫または横紋筋肉腫を含む請求項52に記載の方法。
- 前記重層扁平組織の腫瘍が乳頭腫、脂漏性角化症、皮膚付属器腫瘍、扁平上皮癌または類表皮癌を含み;前記腺上皮の腫瘍が肝臓、腎臓または胆管の腺上皮の腫瘍を含み;前記移行上皮の腫瘍が移行細胞乳頭腫または移行細胞癌を含み;前記胎盤腫瘍が胞状奇胎または絨毛腫を含み;または前記精巣腫瘍が精上皮腫または胎児性細胞癌を含む請求項52に記載の方法。
- 前記肝臓の腺上皮の腫瘍が肝細胞腺腫または肝細胞癌を含み;前記腎臓の腺上皮の腫瘍が尿細管腺腫、腎細胞癌または副腎腫を含み;前記胆管の腺上皮の腫瘍が胆管腺腫または胆管癌を含む請求項56に記載の方法。
- 前記グリア細胞の腫瘍が神経膠腫または膠芽細胞腫を含み;前記神経細胞の腫瘍が神経節細胞腫、神経芽細胞腫または髄芽細胞腫を含み;前記髄膜の腫瘍が髄膜腫を含み;または前記神経鞘の腫瘍がシュワン鞘腫、神経鞘腫、神経線維腫、髄膜腫または神経線維肉腫を含む請求項52に記載の方法。
- 前記下垂体腫瘍が好塩基球腺腫、好酸球腺腫または色素嫌性腺腫を含み;前記副甲状腺腫瘍が副甲状腺腺腫または副甲状腺癌を含み;前記甲状腺腫瘍が甲状腺のC細胞過形成または髄質癌を含み;前記気管支表層腫瘍が気管支カルチノイドまたは燕麦細胞癌を含み;前記副腎髄質腫瘍が褐色細胞腫を含み;前記膵臓腫瘍が島細胞腺腫、インスリノーマ、ガストリノーマまたは島細胞癌を含み;前記胃または腸の腫瘍がカルチノイドを含み;または前記頸動脈小体の腫瘍、化学受容体系の腫瘍が化学受容体腫、傍神経節腫またはカルチノイドを含む請求項52に記載の方法。
- 前記色素産生細胞の腫瘍が母斑または黒色腫を含み;前記末梢神経系のシュワン細胞の腫瘍がシュワン鞘腫または神経鞘腫を含み;または前記メルケル細胞の腫瘍がメルケル細胞腫瘍を含む請求項52に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの腫瘍細胞型が、肺、乳房、結腸、直腸、前立腺、膀胱、骨、膵臓、肝臓、胆管、卵巣、精巣、子宮、胎盤、脳、軟骨、平滑筋、横紋筋、体腔の膜表層、線維組織、血管、リンパ管、リンパ節、脂肪組織、脳の神経性結合組織、腎臓、下垂体、副甲状腺、甲状腺、気管支表層、副腎髄質、胃、大腸、小腸、頸動脈小体、化学受容体系、皮膚、胆嚢の腫瘍、またはそれらの組み合わせに由来する細胞を含む請求項1〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの腫瘍細胞型が、非小細胞肺腺癌の細胞、乳癌の細胞、膵臓癌の細胞、前立腺癌の細胞、卵巣癌の細胞、結腸癌の細胞、またはそれらの組み合わせを含む不死化細胞株を含む請求項1〜61のいずれか1項に記載の方法。
- 前記不死化細胞株が、ヒト非小細胞肺腺癌の細胞株A549、ヒト乳癌の細胞株MDA−MB−231、ヒト膵臓癌の細胞株BxPC−3、ヒト前立腺癌の細胞株DU145、ヒト前立腺癌の細胞株LNCaP、ヒト卵巣癌の細胞株SKOV−3、ヒト直腸癌の細胞株COLO−205またはそれらの組み合わせを含む請求項62に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの腫瘍細胞型が、生検、腫瘍切除、採血、またはそれらの組み合わせによって対象から得られる初代腫瘍細胞を含む請求項1〜61のいずれか1項に記載の方法。
- 前記初代腫瘍細胞が、ステージIの腫瘍、ステージIIの腫瘍、ステージIIIの腫瘍またはステージIVの腫瘍から得られる請求項64に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの腫瘍細胞型が、ヒト対象に由来する腫瘍を担うヒト化マウスに由来する腫瘍細胞を含む請求項1〜61、64及び65に記載の方法。
- 前記ヒト化マウスが、非肥満糖尿病性重症複合免疫不全(NOD/SCID)マウス、NOD/Shi−scid/IL−2Rγヌル(NOG)マウスまたはNOD SCID IL−2Rγノックアウト(NSG)マウスを含む請求項66に記載の方法。
- 前記内皮細胞が、微細血管内皮細胞、大血管内皮細胞、内皮前駆細胞、またはそれらの組み合わせを含む請求項8、10〜14、17及び22〜67のいずれか1項に記載の方法。
- 前記内皮細胞が腫瘍に由来する内皮細胞を含み、または前記内皮細胞が中に腫瘍が存在する臓器若しくは組織に由来する内皮細胞を含む請求項8、10〜14、17及び22〜68のいずれか1項に記載の方法。
- 前記内皮細胞が、肺、乳房、結腸、直腸、前立腺、膀胱、骨、膵臓、肝臓、胆管、卵巣、精巣、子宮、胎盤、脳、軟骨、平滑筋、横紋筋、体腔の膜表層、線維組織、血管、リンパ管、リンパ節、脂肪組織、脳の神経性結合組織、腎臓、下垂体、副甲状腺、甲状腺、気管支表層、副腎髄質、胃、大腸、小腸、頸動脈小体、化学受容体系、皮膚、胆嚢の腫瘍、またはそれらの組み合わせに由来する内皮細胞を含む請求項8、10〜14、17及び22〜69のいずれか1項に記載の方法。
- 前記内皮細胞が微細血管内皮細胞を含み、前記微細血管内皮細胞が、肺の微細血管内皮細胞、乳腺の微細血管内皮細胞、膵臓の微細血管内皮細胞、前立腺の微細血管内皮細胞、卵巣の微細血管内皮細胞、結腸の微細血管内皮細胞、皮膚の微細血管内皮細胞、またはそれらの組み合わせを含む請求項68〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記内皮細胞が人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する細胞を含む請求項8、10〜14、17及び22〜71のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの間質細胞型が、線維芽細胞、免疫細胞、周皮細胞、炎症性細胞、またはそれらの組み合わせを含む請求項9〜72のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの間質細胞型が免疫細胞を含み、前記免疫細胞がマクロファージ、リンパ球、樹状細胞、またはそれらの組み合わせを含む請求項73に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの間質細胞型が炎症性細胞を含み、前記炎症性細胞がB細胞、T細胞またはそれらの組み合わせを含む請求項73または74に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの間質細胞型が人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する細胞を含む請求項9〜75のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、播く前に前記少なくとも1つの間質細胞型を前記少なくとも1つの腫瘍細胞型と混合することを含む請求項40〜76のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの間質細胞型が約0.1:1〜約3:1の比率で前記少なくとも1つの腫瘍細胞型と混合される請求項77に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの間質細胞型が約0.2:1〜約2:1の比率で少なくとも1つの腫瘍細胞型と混合される請求項78に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの間質細胞型が約0.25:1の比率で前記少なくとも1つの腫瘍細胞型と混合される請求項78に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの間質細胞型が約1:1の比率で前記少なくとも1つの腫瘍細胞型と混合される請求項78に記載の方法。
- 前記方法が、前記少なくとも1つの腫瘍細胞型と前記少なくとも1つの間質細胞型を順次播くことを含む請求項40〜76のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を播くことと、前記播かれた腫瘍細胞型の上に前記少なくとも1つの間質細胞型を続いて播くこととを含む請求項82に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの間質細胞型を播くことと、前記播かれた間質細胞型の上に前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を続いて播くこととを含む請求項82に記載の方法。
- さらに、前記細胞培養容器の表面上に、前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分上に、前記多孔性膜の前記第1または第2の表面上に、前記第1の多孔性膜の前記第1または第2の表面上に、または前記第2の多孔性膜の前記第1または第2の表面上に1以上の追加の細胞型を播くこと、または前記上容量部内の前記培養培地にてまたは前記下容量部内の前記培養培地にて1以上の追加の細胞型を懸濁させることを含む請求項1〜84のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む溶液にて前記少なくとも1つの腫瘍細胞型と共に1以上の追加の細胞型を懸濁させて、前記1以上の追加の細胞型と前記少なくとも1つの腫瘍細胞型と前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を含む懸濁液を創り出すことと、前記細胞培養容器内の前記表面上に、前記多孔性膜の前記第1の表面上に、前記第1の多孔性膜の前記第1の表面上に、または前記第2の多孔性膜の前記第2の表面上に前記懸濁液を堆積させることとを含む請求項2、7〜14、16、17、及び21〜85のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1以上の追加の細胞型が初代細胞を含む請求項85または86に記載の方法。
- 前記1以上の追加の細胞型が不死化細胞を含む請求項85〜87のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1以上の追加の細胞型が動物の細胞型を含む請求項85〜88のいずれか1項に記載の方法。
- 前記動物の細胞型がヒトの細胞型である請求項89に記載の方法。
- 前記1以上の追加の細胞型が前記細胞培養容器の底面に接着させる細胞型を含む請求項85〜90のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1以上の追加の細胞型が、線維芽細胞、免疫細胞、周皮細胞、炎症性細胞、またはそれらの組み合わせを含む請求項85〜91のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの間質細胞型または前記1以上の追加の細胞型が線維芽細胞を含み、前記線維芽細胞が胚性間質線維芽細胞を含む請求項73または92に記載の方法。
- 前記胚性間質線維芽細胞がヒト胚性間質線維芽細胞の細胞株IMR−90を含む請求項93に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの間質細胞型または前記1以上の追加の細胞型が線維芽細胞を含み、前記線維芽細胞がヒトの肺線維芽細胞の細胞株Hs888Luを含む請求項73または92に記載の方法。
- 前記1以上の追加の細胞型が免疫細胞を含み、前記免疫細胞がマクロファージ、リンパ球、樹状細胞、またはそれらの組み合わせを含む請求項92〜95のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫細胞がリンパ球を含み、前記リンパ球が前記上容量部内の前記培養培地に懸濁される請求項96に記載の方法。
- 前記1以上の追加の細胞型が炎症性細胞を含み、前記炎症性細胞がB細胞、T細胞またはそれらの組み合わせを含む請求項92〜97のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、細胞型(単数)または細胞型(複数)を培養するステップを含む請求項1〜98のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、外から添加された細胞外マトリクスの実質的な非存在下で前記細胞型(単数)または細胞型(複数)を培養することを含む請求項1、3〜6、8〜15、17〜20及び22〜100のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分がコラーゲン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、またはそれらの組み合わせを含む請求項2、7〜14、16、17及び21〜99のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分がコラーゲンを含む請求項101に記載の方法。
- 前記コラーゲンが、コラーゲンI型、コラーゲンII型、コラーゲンIII型、コラーゲンIV型、コラーゲンV型、コラーゲンVI型、コラーゲンVII型、コラーゲンVIII型、コラーゲンIX型、コラーゲンX型、コラーゲンXI型、コラーゲンXII型、コラーゲンXIII型、コラーゲンXIV型、コラーゲンXV型、コラーゲンXVI型、コラーゲンXVII型、コラーゲンXVIII型、コラーゲンXIX型、コラーゲンXX型、コラーゲンXXI型、コラーゲンXXII型、コラーゲンXXIII型、コラーゲンXXIV型、コラーゲンXXV型、コラーゲンXXVI型、コラーゲンXXVII型、コラーゲンXXVIII型、またはそれらの組み合わせを含む請求項102に記載の方法。
- 前記コラーゲンが、コラーゲンI型を含む請求項103に記載の方法。
- 前記コラーゲンの濃度が約1mg/mL〜約10mg/mLである請求項102〜104のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コラーゲンの濃度が約2mg/mL〜約5mg/mLである請求項105に記載の方法。
- 前記コラーゲンの濃度が約2mg/mLである請求項105に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分が生物供給源から精製された脱細胞化された細胞外マトリクスを含む請求項2、7〜14、16、17及び21〜107のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生物供給源がヒトの胎盤を含む請求項108に記載の方法。
- 前記細胞型(単数)または細胞型(複数)が少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を分泌する請求項1〜109のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの腫瘍細胞型が少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を分泌する請求項110に記載の方法。
- 前記方法がさらに、前記細胞培養容器内の表面上に線維芽細胞、軟骨細胞または骨芽細胞を播くことを含み、前記前記線維芽細胞、軟骨細胞または骨芽細胞が少なくとも1つの細胞外マトリクス成分を分泌する請求項1〜111のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分が約0.1kPa〜約25kPaのヤング率を有する請求項2、7〜14、16、17及び21〜112のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分が約0.15kPa〜約15kPaのヤング率を有する請求項113に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分が約3kPa〜約12kPaのヤング率を有する請求項113に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分のヤング率が均一ではない請求項2、7〜14、16、17及び21〜115のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法がさらに、前記少なくとも1つの腫瘍細胞型の上に少なくとも1つの細胞外マトリクス成分の追加の層を堆積させて、前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分が前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を実質的に取り囲むようにすることを含む請求項2、7〜14、16、17及び21〜116のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分の追加の層が、前記細胞培養容器内の前記表面上に、前記多孔性膜の前記第1の表面上に、前記第1の多孔性膜の前記第1の表面上に、または前記第2の多孔性膜の前記第2の表面上に堆積させた少なくとも1つの細胞外マトリクス成分のヤング率とは異なるヤング率を有する請求項117に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの細胞外マトリクス成分の追加の層のヤング率が均一ではない請求項117または118に記載の方法。
- 前記培養培地が、GM−CSF、TGF−β、またはそれらの組み合わせを含む請求項1〜119のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培養培地が、血清、血液、血液細胞、血液成分、免疫細胞、馴化培養培地、またはそれらの組み合わせを含む請求項1〜120のいずれか1項に記載の方法。
- 前記血清、血液、血液細胞、血液成分、または免疫細胞がヒトまたは動物に由来する請求項121に記載の方法。
- 前記動物が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、鳥類または魚類を含む請求項122に記載の方法。
- 前記免疫細胞が、B細胞、樹状細胞、顆粒球、先天性のリンパ系細胞、巨核球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、T細胞、胸腺細胞またはそれらの組み合わせを含む請求項121〜123のいずれか1項に記載の方法。
- 前記血液細胞が血小板、赤血球、またはそれらの組み合わせを含む請求項121〜124のいずれか1項に記載の方法。
- 前記血液成分が、凝固因子、リポタンパク質、トリグリセリド、またはそれらの組み合わせを含む請求項121〜125のいずれか1項に記載の方法。
- 前記馴化培養培地が、腫瘍細胞を含む培養物、内皮細胞を含む培養物、間質細胞型を含む培養物、またはそれらの組み合わせに由来する馴化培養培地を含む請求項121〜126のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、請求項1〜127のいずれか1項に記載の方法に従って第1の細胞培養容器にて前記腫瘍微細環境を試験管内で模倣することと、請求項1〜127のいずれか1項に記載の方法に従って第2の細胞培養容器にて前記腫瘍微細環境を試験管内で模倣することと、前記第1の細胞培養容器にて培養された前記少なくとも1つの腫瘍細胞型の細胞を前記第2の細胞培養容器に移すこととを含む請求項1〜127のいずれか1項に記載の方法。
- 前記移すことが前記第1の細胞培養容器にて培養された前記少なくとも1つの腫瘍細胞型の細胞を前記第2の細胞培養容器に手動で移すことを含む請求項128に記載の方法。
- 前記第1の細胞培養容器の排出口が前記第2の細胞培養容器の注入口に接続され、前記方法がさらに、前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を含む培養培地をポンプで前記第1の細胞培養容器から出して前記第2の細胞培養容器に入れることを含む請求項128に記載の方法。
- 前記方法がさらに、臓器または組織をモデル化する試験管内の系で培養された細胞を前記細胞培養容器に導入することを含む請求項1〜130のいずれか1項に記載の方法。
- 試験管内での腫瘍転移の模倣方法であって、請求項1〜131のいずれか1項に記載の方法に従って培養された前記少なくとも1つの腫瘍細胞型の細胞を、臓器または組織をモデル化する試験管内の系に導入することを含む、前記模倣方法。
- 前記臓器または組織をモデル化する試験管内の系が、肝臓、膵臓、骨、肺、血管、リンパ系、脳、筋肉、膀胱、腎臓、腸、結腸、胆嚢、皮膚または骨をモデル化する請求項131または132に記載の方法。
- 前記臓器または組織をモデル化する試験管内の系が肝臓をモデル化する請求項133に記載の方法。
- 前記肝臓をモデル化する試験管内の系が培養培地と多孔性膜を含む別の細胞培養容器を含み、肝細胞が前記多孔性膜の第1表面上に播かれ、前記第1の表面が前記細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように前記別の細胞培養容器にて前記多孔性膜を懸濁させ、それによって前記細胞培養容器内で前記肝細胞を含む下容量部と前記多孔性膜の第2の表面を含む上容量部を定義し;剪断応力が前記上容量部における前記多孔性膜の前記第2の表面に適用され、前記剪断応力は前記肝細胞が生体内でさらされる流れを模倣し;前記前記別の細胞培養容器が前記上容量部と前記下容量部を定義する前記細胞培養容器の部分内にて注入口をさらに含む請求項134に記載の方法。
- 肝臓をモデル化する試験管内の系に前記少なくとも1つの腫瘍細胞型の前記細胞を導入することが、前記肝臓をモデル化する試験管内の系の前記下容量部に少なくとも1つの腫瘍細胞型の細胞を移すことを含む請求項135に記載の方法。
- 前記肝臓をモデル化する試験管内の系に前記少なくとも1つの腫瘍細胞型の細胞を導入することが、前記肝臓をモデル化する試験管内の系の前記上容量部に前記少なくとも1つの腫瘍細胞型の細胞を移すことを含む請求項135に記載の方法。
- さらに、前記試験管内の系の前記下容量部への前記少なくとも1つの腫瘍細胞型の細胞の移動を評価することを含む請求項137に記載の方法。
- 前記移すことが、前記肝臓をモデル化する試験管内の系の前記下容量部または前記上容量部に前記少なくとも1つの腫瘍細胞型の細胞を手動で移すことを含む請求項136〜138のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの腫瘍細胞型を含む前記細胞培養容器がさらに、前記下容量部を定義し、少なくとも1つの腫瘍細胞型を含有する前記細胞培養容器の前記部分内で排出口を含み、前記排出口が前記肝臓をモデル化する試験管内の系の前記別の細胞培養容器の注入口に接続され、前記移すことが前記少なくとも1つの腫瘍細胞を含む前記細胞培養容器の前記下容量部から前記培養培地をポンプで取り出し、前記肝臓をモデル化する試験管内の系の前記別の細胞培養容器の前記上容量部または下容量部に入れることを含む請求項136〜138のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの腫瘍細胞を含む前記細胞培養容器がさらに、前記上容量部を定義する前記細胞培養容器の部分内で排出口を含み、前記排出口が前記肝臓をモデル化する試験管内の系の前記別の細胞培養容器の注入口に接続され、前記移すことが前記細胞培養容器の前記上容量部から前記培養培地をポンプで取り出し、前記肝臓をモデル化する試験管内の系の前記別の細胞培養容器の前記上容量部又または下容量部に入れることを含む請求項136〜138のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜131のいずれか1項に記載の方法に従って培養された前記少なくとも1つの腫瘍細胞型の細胞を動物に導入することを含む腫瘍転移の模倣方法。
- 前記動物が哺乳類である請求項142に記載の方法。
- 前記哺乳類が、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、またはヒツジである請求項143に記載の方法。
- 前記動物が鳥類または魚類である請求項144に記載の方法。
- 前記マウスがヒト化マウスであり、前記少なくとも1つの腫瘍細胞型がヒトの腫瘍細胞型を含む請求項144に記載の方法。
- 前記ヒト化マウスが、非肥満糖尿病性重症複合免疫不全(NOD/SCID)マウス、NOD/Shi−scid/IL−2Rγヌル(NOG)マウスまたはNOD SCID IL−2Rγノックアウト(NSG)マウスを含む請求項146に記載の方法。
- 試験管内での腫瘍転移の模倣方法であって、
培養培地を細胞培養容器に加えることと、
前記細胞培養容器内の多孔性膜の第1の表面上に少なくとも1つの細胞型を播くことであって、前記第1の表面が前記細胞培養容器の底面の近傍にあり、底面に対して離れた関係であるように前記細胞培養容器にて前記多孔性膜を懸濁させ、それによって前記細胞培養容器内で前記少なくとも1つの細胞型を含む下容量部と前記多孔性膜の第2の表面を含む上容量部を定義する、播くことと;
前記少なくとも1つの細胞型に剪断応力を間接的に適用することであって、前記剪断応力は流動装置によって誘導される前記培養培地の流れから生じ、前記流れは前記細胞が生体内でさらされる流れを模倣する、適用することと;
ヒトまたはヒト化動物に由来する腫瘍細胞を前記上容量部または前記下容量部に導入することを含む、前記模倣方法。 - 前記少なくとも1つの細胞型が肝細胞または平滑筋細胞を含む請求項148に記載の方法。
- 前記方法がさらに、前記多孔性膜の前記第2の表面上に第2の細胞型を播くことを含む請求項148または149に記載の方法。
- 前記第2の細胞型が内皮細胞を含む請求項150に記載の方法。
- 前記ヒト化動物がヒト化マウスである請求項148〜151のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒト化マウスが、非肥満糖尿病性重症複合免疫不全(NOD/SCID)マウス、NOD/Shi−scid/IL−2Rγヌル(NOG)マウスまたはNOD SCID IL−2Rγノックアウト(NSG)マウスを含む請求項152に記載の方法。
- 薬剤または化合物を腫瘍の転移に対する効果について調べる試験管内の方法であって、前記方法が
請求項132〜141及び148〜153のいずれか1項に記載の方法に従って腫瘍の転移を試験管内で模倣することと、
前記培養培地に薬剤または化合物を加えることとを含み、
前記薬剤または化合物の存在下での前記臓器または組織をモデル化する試験管内の系における前記少なくとも1つの腫瘍細胞型の細胞の変化が、前記薬剤または化合物が腫瘍の転移に対する効果を有することを示す、前記方法。 - 腫瘍を有する対象に投与する化学療法計画の選択方法であって、
前記方法が、
請求項32〜131のいずれか1項に記載の方法に従って前記腫瘍に対する効果について薬剤または化合物を試験管内で調べること、または請求項154に記載の方法に従って腫瘍の転移に対する効果について薬剤または化合物を試験管内で調べることであって、前記少なくとも1つの腫瘍細胞型が前記対象の腫瘍に由来する腫瘍細胞を含む、調べることと、
前記試験管内で調べた前記結果に基づいて前記対象に前記薬剤または化合物を投与するかどうかを判定することとを含む、
前記選択方法。 - さらに、前記試験管内で調べた前記結果に基づいて前記対象に投与される薬剤または化合物の用量を選択することを含む請求項155に記載の方法。
- さらに、前記試験管内で調べた前記結果に基づいて前記対象に投与される前記薬剤または化合物の投与率を選択することを含む請求項155または156に記載の方法。
- 前記培養培地における前記薬剤または化合物の濃度が生体内で効果を達成する前記薬剤または化合物の濃度範囲の範囲内である請求項32〜147及び154〜157のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培養培地における前記薬剤または化合物の濃度が前記薬剤または化合物についての生体内での治療用Cmaxの濃度範囲の範囲内である請求項32〜147及び154〜157のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培養培地における前記薬剤または化合物の濃度が前記薬剤または化合物についての生体内での治療用Cmaxとほぼ同じである請求項159に記載の方法。
- 前記培養培地における前記薬剤または化合物の濃度が、前記薬剤または化合物についての生体内での治療用Cmaxの濃度範囲よりも約2倍〜約20倍低い請求項32〜147及び154〜157のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培養培地における前記薬剤または化合物の濃度が、前記薬剤または化合物についての生体内での治療用Cmaxの濃度範囲よりも約5倍〜約15倍低い請求項161に記載の方法。
- 前記培養培地における前記薬剤または化合物の濃度が、前記薬剤または化合物についての生体内での治療用Cmaxの濃度範囲よりも約10倍低い請求項161に記載の方法。
- 前記効果が、毒性効果、保護効果、病的効果、疾患を促進する効果、炎症効果、酸化効果、小胞体ストレス効果、ミトコンドリアストレス効果、アポトーシス効果、壊死効果、自己貪食性効果、免疫原性細胞死効果、フェロトーシス効果、リモデリング効果、増殖性効果、血管形成に対する効果、タンパク質の活性に対する効果、または遺伝子の発現に対する効果を含む請求項32〜147及び154〜163のいずれか1項に記載の方法。
- 前記効果がタンパク質の活性に対する効果を含み、前記効果はタンパク質の阻害またはタンパク質の活性化を含む請求項164に記載の方法。
- 前記効果が遺伝子の発現に対する効果を含み、前記効果は遺伝子の発現の上昇または遺伝子の発現の低下を含む請求項164に記載の方法。
- 前記薬剤が抗癌剤を含む請求項32〜147及び154〜166のいずれか1項に記載の方法。
- 前記抗癌剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生剤、トポイソメラーゼ阻害剤、コルチコステロイド、抗微小管剤、キナーゼ阻害剤、経路阻害剤、分化誘導剤、ホルモン療法、免疫療法、L−アスパラギナーゼ、キレート剤、ATP模倣体、生物医薬品、またはこれらの組み合わせを含む請求項167に記載の方法。
- 前記抗癌剤がアルキル化剤を含み、前記アルキル化剤が、アルトレタミン、ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、サイクロホスファミド、ダカルバジン、イフォスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、オキサラプラチン、パリフォサミド、ストレプトゾシン、テモゾロミド、チオテパ、若しくはそれらの組み合わせを含み;前記抗癌剤が代謝拮抗剤を含み、前記代謝拮抗剤が、アザチオプリン、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メルカプトプリン、メソトレキセート、ネララビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、プララトレキセート、ラルチトレキセド、チオグアニン、若しくはそれらの組み合わせを含み;前記抗癌剤が抗腫瘍抗生剤を含み、前記抗腫瘍抗生剤が、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン、リファムピシン、若しくはそれらの組み合わせを含み;前記抗癌剤がトポイソメラーゼ阻害剤を含み、前記トポイソメラーゼ阻害剤が、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド、ミトキサントロン、エチリノテカン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、アモナフィド、若しくはそれらの組み合わせを含み;前記抗癌剤がコルチコステロイドを含み、前記コルチコステロイドが、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、コルチゾールコハク酸ナトリウム、若しくはそれらの組み合わせを含み;前記抗癌剤が抗微小管剤を含み、前記抗微小管剤が、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、イキサベピロン、エリブリンメシル酸塩、カバジタキセル、若しくはそれらの組み合わせを含み;前記抗癌剤がキナーゼ阻害剤を含み、前記キナーゼ阻害剤が、受容体または非受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤、セリン/スレオニン−特異的なキナーゼ阻害剤、二重特異性キナーゼ阻害剤、若しくはそれらの組み合わせを含み;前記抗癌剤が経路阻害剤を含み、前記経路阻害剤が、B細胞リンパ腫2(Bcl−2)ファミリー阻害剤、熱ショックタンパク質90(HSP−90)阻害剤、プロテアソーム阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ポリADPリボースポリメラーゼ(PARP)の阻害剤、ラパマイシンの哺乳類標的(mTOR)の阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)の阻害剤、ヘッジホッグ経路の阻害剤、rhoキナーゼ阻害剤、若しくはそれらの組み合わせを含み;前記抗癌剤が分化誘導剤を含み、前記分化誘導剤が、レチノイド、トレチノイン、ベキサロテン、亜ヒ酸、若しくはそれらの組み合わせを含み;前記抗癌剤がホルモン療法を含み、前記ホルモン療法が、選択的アンドロゲン受容体調節因子(SARM)、アンドロゲン受容体アンタゴニスト、選択的エストロゲン受容体調節因子(SERM)、エストロゲン受容体アンタゴニスト、プロゲスチン、アロマターゼ阻害剤、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)アゴニスト若しくは類似体、ケトコナゾール、アビラテロン、若しくはそれらの組み合わせを含み;前記抗癌剤が免疫療法を含み、前記免疫療法が、モノクローナル抗体、非特異的な免疫療法若しくは補助剤、免疫調節剤、癌ワクチン、標的化免疫療法、若しくはそれらの組み合わせを含み;または前記抗癌剤がキレート剤を含み、前記キレート剤が、ペニシルアミン、ジヒドロ塩化トリエチレンテトラアミン、EDTA、DMSA、メシル酸デフェロキサミン若しくはバチマスタット、若しくはそれらの組み合わせを含む請求項168に記載の方法。
- 前記キナーゼ阻害剤が、表皮増殖因子(EGF)受容体阻害剤、線維芽細胞増殖因子(FGF)受容体阻害剤、血小板由来増殖因子(PDGF)受容体阻害剤、血管内皮増殖因子(VEGF)受容体阻害剤、またはrhoキナーゼ阻害剤を含む請求項169に記載の方法。
- 前記キナーゼ阻害剤が受容体または非受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤を含み、前記受容体または非受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤が、アファチニブ、アレクチニブ、アリセルチブ、アムタチニブ、アパチニブ、アキシチニブ、バフェチニブ、バラセルチブ、バリシチニブ、ボスチニブ、ブリバニブ、ブパルリシブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、セニセルチブ、コビメチニブ、クレノラニブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダコミチニブ、ダヌセルチブ、デサチニブ、ドビチニブ、エピチニブ、エルロチニブ、フォレチニブ、フォスタマチニブ、ガルニセルチブ、ゲフィチニブ、イブルチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、レスタウルチニブ、リニファニブ、リンシチニブ、マシチニブ、モメロチニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、ネラチニブ、ニロチニブ、ニンテダニブ、オランチニブ、パクリチニブ、パゾパニブ、ペリチニブ、ピマセルチブ、ポナチニブ、ポジオチニブ、キザルチニブ、レファメチニブ、レゴラフェニブ、ルキソリチニブ、セルメタニブ、ソラフェニブ、スルファチニブ、スニチニブ、タンズチニブ、テラチニブ、セリアチニブ、チバンチニブ、トファシチニブ、トラメチニブ、バンデタニブ、バタリニブ、ベムラフェニブ、ボラセルチブ、ボリチニブ、若しくはそれらの組み合わせを含み;または前記キナーゼ阻害剤がセリン/スレオニン特異的なキナーゼ阻害剤を含み、前記セリン/スレオニン特異的なキナーゼ阻害剤がMK2206を含む請求項169に記載の方法。
- 前記経路阻害剤がBcl−2ファミリー阻害剤を含み、前記Bcl−2ファミリー阻害剤がナビトクラックス、オバトクラックス、オブリメルソン、シナクラルセット、またはそれらの組み合わせを含み;前記経路阻害剤がHSP−90阻害剤を含み、前記HSP−90阻害剤がタネスピマイシン、レタスピマイシン、ガネテスピブ、またはそれらの組み合わせを含み;前記経路阻害剤がプロテアソーム阻害剤を含み、前記プロテアソーム阻害剤がボルテゾニブ、カルフィルゾニブ、オプロゾニブ、イキサゾニブ、マロゾニブ、デランゾニブ、またはそれらの組み合わせを含み;前記経路阻害剤がサイクリン依存性キナーゼ阻害剤を含み、前記サイクリン依存性キナーゼ阻害剤がフラボピリドール、アルボシジブ、ジナシクリブ、セリシクリブ、パルボシクリブ、またはそれらの組み合わせを含み;前記経路阻害剤がPARPの阻害剤を含み、前記PARPの阻害剤がイニパリブ、ベリパリブ、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、またはそれらの組み合わせを含み;前記経路阻害剤がmTORの阻害剤を含み、前記mTORの阻害剤がデフォロリムス、エベロリムス、シロリムスまたはテムシロリムス、またはそれらの組み合わせを含み;前記経路阻害剤がHDACの阻害剤を含み、前記HDACの阻害剤がベリノスタット、エンチノスタット、モセチノスタット、パノビノスタット、ロミデプシン、ボリノスタット、またはそれらの組み合わせを含み;前記経路阻害剤がヘッジホッグ経路の阻害剤を含み、前記ヘッジホッグ経路の阻害剤がバリデギブ、ビスモデギブ、またはそれらの組み合わせを含み;前記経路阻害剤がrhoキナーゼ阻害剤を含み、前記rhoキナーゼ阻害剤がY27632を含む請求項169に記載の方法。
- 前記ホルモン療法がSARMを含み、前記SARMがエノボサルムを含み;前記ホルモン療法がアンドロゲン受容体アンタゴニストを含み、前記アンドロゲン受容体アンタゴニストがビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、エンザルタミド、またはそれらの組み合わせを含み;前記ホルモン療法がSERMを含み、前記SERMがタモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、またはそれらの組み合わせを含み;前記ホルモン療法がエストロゲン受容体アンタゴニストを含み、前記エストロゲン受容体アンタゴニストがフルベストラントを含み;前記ホルモン療法がプロゲスチンを含み、前記プロゲスチンがメゲストロール酢酸塩を含み;前記ホルモン療法がエストロゲンを含み、前記エストロゲンがエストラムスチンを含み;前記ホルモン療法がアロマターゼ阻害剤を含み、前記アロマターゼ阻害剤がアナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、またはそれらの組み合わせを含み;前記ホルモン療法がGnRHアゴニストまたは類似体を含み、前記GnRHアゴニストまたは類似体がリュープロリド、ゴセレリン、アバレリックス、デガレリックス、トリプトレリン、またはそれらの組み合わせを含む請求項169に記載の方法。
- 前記免疫療法がモノクローナル抗体を含み、前記モノクローナル抗体がリツキシマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、アバゴボマブ、エタラシズマブ、またはそれらの組み合わせを含み;前記免疫療法が非特異的な免疫療法または補助剤を含み、前記非特異的な免疫療法または補助剤がインターロイキン−2(IL−2)、インターフェロン−α、インターフェロン−α2b、ペグインターフェロンα−2b、アバタセプト、アルデスロイキン、またはそれらの組み合わせを含み;前記免疫療法が免疫調節剤を含み、前記免疫調節剤がタリドミド、レナリドミド、またはそれらの組み合わせを含み;前記免疫療法が癌ワクチンを含み、前記癌ワクチンがシプリューセル−T、カルメット−ゲラン桿菌(BCG)ワクチン、またはそれらの組み合わせを含み;前記免疫療法が標的化免疫療法を含み、前記標的化免疫療法がブレンツジマブ、セツキシマブ、イブリツモマブ、イピリムマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、トシツムマブ、トレスツズマブ、トレミリムマブ、シルツキシマブ、トシリズマブ、カナキヌマブ、リリルマブ、ニボルマブ、ピリジズマブ、またはラムブロリズマブ、またはそれらの組み合わせを含む請求項169に記載の方法。
- 前記抗癌剤が生物医薬品を含み、前記生物医薬品が、合成多糖類;合成の、部分合成の若しくはヒト化した免疫グロブリン;組換え治療用タンパク質、またはそれらの組み合わせを含む請求項168に記載の方法。
- 前記薬剤または化合物が、放射線造影剤、放射線同位元素、プロドラッグ、抗体断片、抗体、生きている細胞、治療用薬剤送達のミクロスフェア、マイクロビーズ、ナノ粒子、ゲル、または細胞を含浸させたゲル、またはそれらの組み合わせを含む請求項32〜147及び154〜175のいずれか1項に記載の方法。
- 前記薬剤または化合物を前記培養培地に加えることが、前記薬剤若しくは化合物を含む抗体/薬剤複合体または放出調節剤形を前記培養培地に加えることを含む請求項32〜147及び154〜175のいずれか1項に記載の方法。
- 前記放出調節剤形が経口放出調節剤形を含む請求項177に記載の方法。
- 前記放出調節剤形が放出調節ポリマーを含む請求項177または178に記載の方法。
- 前記放出調節ポリマーが、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、カラーギーナン、キトサン、ヘパリン、デンプン、キサンタンゴム、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリエチレンオキシド、ポロキサマー、プルロニクス、ポリメタクリレート、ポリシアル酸、またはそれらの組み合わせを含む請求項179に記載の方法。
- 前記薬剤または化合物が、前記少なくとも1つの細胞型におけるタンパク質または遺伝子の機能を阻害する、活性化する、または変化させることが可能である請求項32〜147及び154〜180のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法がさらに、前記薬剤または化合物を前記上容量部及び前記下容量部の少なくとも一方に潅流させることを含む請求項32〜147及び154〜181のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法がさらに、前記薬剤または化合物を前記上容量部に潅流させることを含む請求項182に記載の方法。
- 前記方法がさらに、前記薬剤または化合物を前記下容量部に潅流させることを含む請求項182または183に記載の方法。
- 前記流れが以前測定された血行動態のパターンに由来し、一揃いの電子指示書にモデル化され、前記剪断応力が前記一揃いの電子指示書に基づく請求項1〜184のいずれか1項に記載の方法。
- 前記流動装置が、前記細胞培養容器の前記上容量部における前記培養培地に配置されるように適合させた本体と、前記本体を回転させるように適合させたモーターとを含む請求項6〜17及び20〜185のいずれか1項に記載の方法。
- 前記本体が円錐面または平面を有する請求項186に記載の方法。
- 前記本体の前記円錐面または平面を前記細胞培養容器にて且つ前記培養培地に接触して配置するために前記流動装置を適合させる請求項187に記載の方法。
- 前記流動装置が、前記一揃いの電子指示書を受け取るための電子コントローラと、前記電子コントローラによって操作されるモーターとを含む請求項185〜188のいずれか1項に記載の方法。
- 前記流動装置がさらに、前記モーターによって駆動されるために前記モーターに操作可能に接続される剪断応力アプリケータを含む請求項189に記載の方法。
- 前記剪断応力アプリケータが前記モーターに連結された円錐または円板を含む請求項190に記載の方法。
- 前記血行動態のパターンが腫瘍の脈管構造に由来する請求項185〜191のいずれか1項に記載の方法。
- 前記血行動態のパターンが、毛細血管、細動脈、動脈、細静脈、または静脈の少なくとも一部に由来する請求項192に記載の方法。
- 前記血行動態のパターンが、臓器の少なくとも一部に由来し、前記臓器が肝臓、腎臓、肺、脳、膵臓、脾臓、大腸、小腸、心臓、骨格筋、眼、舌、生殖器、または臍帯を含む請求項192または193に記載の方法。
- 前記血行動態のパターンが超音波データの解析に由来する請求項185〜194のいずれか1項に記載の方法。
- 前記血行動態のパターンが磁気共鳴画像診断(MRI)データの解析に由来する請求項185〜194のいずれか1項に記載の方法。
- 前記流れまたは前記血行動態のパターンが時変性である請求項2〜196のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの腫瘍細胞型に適用される前記剪断応力が約0.1ダイン/cm2〜約200ダイン/cm2である請求項1〜197のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの腫瘍細胞型に適用される前記剪断応力が約0.1ダイン/cm2〜約100ダイン/cm2である請求項198に記載の方法。
- 前記剪断応力が約1秒−1〜約1000秒−1の速度で適用される請求項1〜199のいずれか1項に記載の方法。
- 前記流れまたは前記血行動態のパターンが動物に由来する請求項1〜200のいずれか1項に記載の方法。
- 前記動物が遺伝子操作された動物である請求項201に記載の方法。
- 前記動物がヒトである請求項201に記載の方法。
- 前記剪断応力の適用の際の、前記少なくとも1つの腫瘍細胞型における前記腫瘍転移のマーカーのレベル若しくは局在の変化、または前記培養培地における前記腫瘍転移の、前記剪断応力の適用の非存在下での前記少なくとも1つの腫瘍細胞型における前記腫瘍転移のマーカーのレベル若しくは局在または前記培養培地における前記腫瘍転移のマーカーのレベルと比較したマーカーのレベルの変化が、前記腫瘍転移の模倣を裏付ける請求項132〜141及び148〜203のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マーカーが、細胞増殖、細胞浸潤、血管形成、腫瘍形成、細胞単層完全性、内皮細胞のバリア機能、透過性、炎症、細胞死、アポトーシス、壊死、収縮、細胞の移動またはそれらの組み合わせのマーカーを含む請求項33〜141及び148〜204のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マーカーのレベルにおける前記変化が、前記少なくとも1つの腫瘍細胞型または前記内皮細胞における前記マーカーのレベルでの上昇である請求項204または205に記載の方法。
- 前記マーカーのレベルにおける変化が、前記少なくとも1つの腫瘍細胞型または前記内皮細胞における前記マーカーのレベルでの低下である請求項204または205に記載の方法。
- 前記マーカーが、VE−カドヘリン、E−カドヘリン、アクチン、またはそれらの組み合わせを含む請求項204〜207のいずれか1項に記載の方法。
- 前記マーカーが血管形成のマーカーを含み、前記血管形成のマーカーが血管内皮増殖因子(VEGF)−A、VEGF−C、VEGF−D、アンギオポイエチン−1(ANG1)、アンギオポイエチン−2(ANG2)、線維芽細胞増殖因子−2(FGF−2)、胎盤増殖因子(PLGF)、若しくはそれらの組み合わせを含み;前記マーカーが細胞増殖のマーカーを含み、前記細胞増殖のマーカーが、表皮増殖因子(EGF)、表皮増殖因子受容体(EGFR)、MKI67、増殖細胞核抗原(PCNA)、若しくはそれらの組み合わせを含み;前記マーカーが細胞浸潤のマーカーを含み、前記細胞浸潤のマーカーが、ビメンチン(VIM)、カドヘリン1(CDH−1)、カドヘリン2(CDH−2)、若しくはそれらの組み合わせを含み;前記マーカーが炎症のマーカーを含み、前記炎症のマーカーが、インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−8(IL−8)、NF−κB、内皮酸化窒素シンターゼ(eNOS)、Krupple様因子2(KLF2)、単球走化性タンパク質−1(MCP−1)、若しくはそれらの組み合わせを含み;またはそれらの組み合わせを含む請求項204〜208のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法がさらに、細胞密度、単層の完全性、透過性、またはそれらの組み合わせについて前記内皮細胞を解析することを含む請求項8〜14、17及び22〜209のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法がさらに、前記少なくとも1つの腫瘍細胞型、前記内皮細胞、前記少なくとも1つの間質細胞型、または前記1以上の追加の細胞型の形態を解析することを含む請求項1〜210のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、サイトカインの分泌、ケモカインの分泌、液性因子の分泌、微粒子の分泌、増殖因子の分泌、細胞表面からのタンパク質の脱落、化合物の代謝体、免疫細胞、酸化窒素の分泌、血管拡張性タンパク質、血管収縮性タンパク質、miRNA、分泌されたタンパク質、または分泌された生体物質について前記培養培地を分析することを含む請求項1〜211のいずれか1項に記載の方法。
- 前記培養培地が前記細胞表面からのタンパク質の脱落について分析され、前記タンパク質が血管細胞接着分子(VCAM)、E−セレクチン、または細胞内接着分子(ICAM)を含む請求項212に記載の方法。
- 硝酸塩または亜硝酸塩の濃度を測定することによって酸化窒素について前記培養培地が分析される請求項212または213に記載の方法。
- さらに、前記薬剤または化合物から生じる毒性、炎症、透過性、適合性、細胞接着、細胞リモデリング、細胞移動、または表現型の調節について前記少なくとも1つの腫瘍細胞型、前記内皮細胞、前記少なくとも1つの間質細胞型、または前記1以上の追加の細胞型を解析することを含む請求項32〜147及び154〜214のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、前記培地が前記薬剤または化合物を含む場合の前記剪断応力をある時間適用した後の前記細胞型の少なくとも1つを前記培地が前記薬剤または化合物を含まない場合の前記剪断応力をその時間適用した後の前記細胞型の少なくとも1つと比較して、前記細胞型の少なくとも1つに対する前記薬剤または化合物の効果を判定することを含む請求項32〜147及び154〜215のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法がさらに、薬剤標的を特定することを含む請求項1〜216のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法がさらに、薬剤送達モダリティのための標的として前記少なくとも1つの腫瘍細胞型、前記少なくとも1つの間質細胞型、前記内皮細胞、または前記1以上の追加の細胞型の表面タンパク質を特定することを含む請求項1〜217のいずれか1項に記載の方法。
- 前記薬剤送達モダリティが抗体/薬剤複合体、ナノ粒子、化学複合体、またはそれらの組み合わせを含む請求項218に記載の方法。
- 前記ナノ粒子が脂質ナノ粒子を含む請求項219に記載の方法。
- 前記化学複合体がN−アセチルガラクトサミン(GalNAc)を含む請求項219に記載の方法。
- タンパク質、抗体、ペプチドまたは核酸分子がナノ粒子または化学複合体へと複合体かされるまたはそれに組み込まれる請求項219〜221のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核酸がRNAi分子を含む請求項222に記載の方法。
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