JP2023500368A - 初代乳房上皮細胞培養培地、培養方法、及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
ヒト初代乳房上皮細胞の分離及び初代乳房上皮細胞培養培地の最適化
(1)ヒト初代乳房上皮細胞の分離
説明を受けた上で同意した5人の乳房腫瘍患者の癌組織から、外科的切除によって乳癌組織試料を得た(すなわちHMFL-XN1、HMFL-XN3、HMFL-XN4、HMFL-XN6、及びHMFL-XN8)。試料の1つ(HMFL-XN1)を以下に説明する。上述の組織試料を、外科的摘除又は生検後の30分以内に採集した。より詳細には、滅菌環境において、非壊死部位からの組織試料を0.5cm3を超える体積で切り取り、予冷した20mLのDMEM/F12培地(Corning Inc.製)中に入れた。この培地を蓋付きの50mLのプラスチック製滅菌遠心分離チューブ内に入れて、氷上で研究室に輸送した。ここで、DMEM/F12培地は、100U/mLのペニシリン及び100U/mLのストレプトマイシンを含有していた(以下、輸送液と呼ぶ)。
Matrigel(登録商標)(BD Biosciences製)を無血清DMEM/F12培地中に1:100で希釈して、細胞外マトリックス希釈液を調製し、これを48ウェル培養プレートに1ウェル当たり200μlで加えて、培養プレートのウェルの底部を完全に覆った。得られたものを37℃のインキュベーター内で1時間放置した。1時間後に、細胞外マトリックス希釈液を除去して、Matrigelでコーティングされたプレートを得た。
ヒト初代乳房上皮細胞の培養
(1)初代乳房上皮細胞培養培地の調製
最初に、実施例1の工程(2)と同様にして基礎培地を調製した。基礎培地に、ヒトアンフィレグリン(R&D Systems製)を20ng/mlの最終濃度で添加し、EGF(Peprotech製)を10ng/mlの最終濃度で添加し、B27(Thermo Fisher SCIENTIFIC製)を1:50の希釈比で添加し、ヒトニューレグリン1(Peprotech製)を10nMの最終濃度で添加し、FGF7(R&D Systems製)を10ng/mlの最終濃度で添加し、TGFβ1阻害剤A8301(MCE製)を500nMの最終濃度で添加し、P38/MAPK阻害剤SB202190(MCE製)を500nMの最終濃度で添加して、初代乳房上皮細胞培養培地を調製した。
実施例1の工程(1)と同じ方法を使用して、癌組織に由来する乳房上皮細胞及び傍癌組織に由来する乳房上皮細胞を、それぞれ同じ乳癌患者の癌組織及び傍癌乳房組織から分離した。傍癌乳房組織試料を、乳癌組織から少なくとも5cm離れた乳房組織から採集した。次に、癌組織に由来する乳房腫瘍細胞を血球計算盤で計数した後に、Matrigel(登録商標)(BD Biosciences製)でコーティングされた12ウェルプレートへと1ウェル当たり4×104個の細胞の密度で接種した。2mLの調製された初代乳房上皮細胞培養培地を12ウェルプレートに加え、これを37℃にて5%のCO2濃度、及び20%の酸素濃度の条件下で培養した。
乳癌組織に由来する初代乳房腫瘍細胞(HMFL-XN30)を、実施例1の工程(1)と同じ方法を使用して乳癌患者の癌組織から分離した。次に、等しい細胞数(1ウェル当たり4×104個の細胞)の初代乳房腫瘍細胞HMFL-XN30を、Matrigel(登録商標)(BD Biosciences製)でコーティングされた12ウェルプレートへと接種した。2mLの調製された初代乳房上皮細胞培養培地を12ウェルプレートに加え、等しい数の乳房腫瘍細胞を、それぞれ20%の酸素濃度の条件(正常酸素条件)及び2%の酸素濃度の条件(低酸素条件)下で培養した。7日目まで培養した後に、顕微鏡写真(100倍の倒立位相差顕微鏡下)を撮影した。図1(E)及び図1(F)は、それぞれ正常酸素条件及び低酸素条件下で癌組織に由来する乳房上皮細胞を培養することによって得られた細胞の比較である。図1(E)及び図1(F)から、本発明の培養培地及び培養方法を使用した場合に、癌組織に由来する初代乳房上皮細胞の高効率培養が正常酸素条件(20%の酸素濃度)及び低酸素条件(2%の酸素)の両方で達成され得ることを確認することができる。
癌組織に由来する初代乳房腫瘍細胞(HMFL-XN30、HMFL-XN22)を、実施例1の工程(1)と同じ方法を使用して2人の乳癌患者の癌組織から分離した。次に、等しい数(1ウェル当たり4×104個の細胞)の初代乳房腫瘍細胞HMFL-XN30を、それぞれMatrigel(登録商標)(BD Biosciences製)でコーティングされた12ウェルプレート及び何の処理もなされていない12ウェルプレートへと接種した。2mLの調製された初代乳房上皮細胞培養培地を12ウェルプレートに加え、等しい数の初代乳房腫瘍細胞を20%の酸素濃度の条件下で培養した。10日目まで培養した後に写真を撮影した。HMFL-XN22(P3)は、分離後にそれぞれMatrigelでコーティングされた条件及びMatrigelでコーティングされていない条件下で3回目の継代まで連続培養した乳房腫瘍細胞HMFL-XN22であった。残りの工程は、HMFL-XN30の工程と同じである。
乳癌組織に由来する初代乳房腫瘍細胞に対するアンフィレグリンの増殖効果
(1)初代乳房上皮細胞培養培地を、実施例2の工程(1)と同様にして調製した。さらに、アンフィレグリンを含まない別の初代培地を、初代乳房上皮細胞培養培地の処方からアンフィレグリンを除くことによって調製した。
乳癌組織に由来する初代乳房腫瘍細胞の連続培養及びそれについての成長曲線の作成
(1)初代乳房上皮細胞培養培地を、実施例2の工程(1)と同様にして調製した。コントロールとして、条件付き細胞リプログラミング技術用の別の培養培地(以下、「条件付き細胞リプログラミング培地」とも呼ぶ)を調製した。調製工程については、Liu et al., Nat Protoc., 12(2): 439-451, 2017を参照のこと。培養培地の処方を表2に示す。さらに、別のコントロールとして、乳腺オルガノイド用の培養培地(以下、「オルガノイド培地」とも呼ぶ)を調製した。調製工程については、非特許文献3を参照のこと。培養培地の処方を表3に示す。
A.本発明の技術:初代乳房腫瘍細胞を、Matrigel(登録商標)(BD Biosciences製)でコーティングされた12ウェルプレートへと1ウェル当たり4×104個の細胞の密度で接種し、2mLの本発明の初代乳房上皮細胞培養培地を使用して培養した;
B.条件付き細胞リプログラミング技術:初代乳房腫瘍細胞を、γ線照射されたマウス線維芽細胞系統J2細胞(Kerafastから購入)へと1ウェル当たり4×104個の細胞の密度で接種し、12ウェルプレートにおいて条件付き細胞リプログラミング培地(詳細な手順は、非特許文献4を参照)を使用して培養した;
C.初代乳房腫瘍細胞を、Matrigel(登録商標)(BD Biosciences製)でコーティングされた12ウェルプレートへと1ウェル当たり4×104個の細胞の密度で接種し、12ウェルプレートにおいて2mLのオルガノイド培地を使用して培養した。
細胞集団の倍加数=[log(N/X0)]/log2
(式中、Nは継代する細胞数であり、X0は最初の接種時の細胞数である)(Greenwood et al., Environ Mol Mutagen 2004, 43(1): 36-44を参照)。
腫瘍組織由来の初代乳房腫瘍細胞の免疫マーカーの特定
(1)初代乳房腫瘍細胞培養培地を、実施例2の工程(1)と同様にして調製した。
癌組織に由来する初代乳房腫瘍細胞の遺伝子突然変異及び核型分析
(1)遺伝子突然変異分析:乳房腫瘍細胞(HMFL-XN10、HMFL-XN12)を、実施例4の工程(3)に従って本発明の方法によって連続培養し、3回目の継代までin vitroで培養した乳房腫瘍細胞(P3)及び乳癌患者に直接由来する継代されていない癌腫瘍細胞(P0)を遠心分離によって収集し、細胞のゲノムDNAをDNeasy血液・組織キット(DNeasy blood & tissue kit)(QIAGEN製)を使用して抽出した。細胞を提供した患者から2mLの末梢血を収集し、同じ方法によってバックグラウンドコントロールとしてゲノムDNAを抽出した。引き続き、細胞及び血液試料のゲノムDNAに対して全エクソームシーケンシングを行い(詳細な手順については、非特許文献3を参照)、シーケンシングの結果を腫瘍の高頻度突然変異遺伝子について分析した。MuSiCソフトウェアを使用して、腫瘍の高頻度突然変異を分析した。MuSiCは、腫瘍試料を提供する患者の末梢血の遺伝子突然変異をバックグラウンドとして、遺伝子上の各突然変異型について統計的検定を行い、バックグラウンドよりも有意に高い突然変異率を有する遺伝子を検出した。分析結果は図7(A)に示されている。図7(A)のベン図は、本発明の技術を使用することによって培養した異なる継代の乳房腫瘍細胞が有する高頻度突然変異遺伝子の数のアラインメントを示している。HMFL-XN10(P3)は、本発明の培養方法によって3回目の継代まで培養した乳癌患者からの乳房腫瘍細胞の高頻度突然変異分析を表し、HMFL-XN10(P0)は、同じ乳癌患者に由来する最初に分離された継代されていない乳房腫瘍細胞の分析を表している。上記の分析結果は、https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.htmlで利用可能なソフトウェアを使用して作成された。腫瘍の高頻度突然変異分析の結果は、2つの群の高頻度突然変異遺伝子が実質的に同じであったことを示している。HMFL-XN12細胞及びHMFL-XN10細胞は、同じ方法を使用して並行して操作されていた。図7(A)により、本発明の技術によって培養した癌組織由来の乳房腫瘍細胞が、患者の癌組織の元の遺伝子突然変異特徴を維持し得ることが確認される。
マウスにおける癌組織由来の初代乳房腫瘍細胞の異種移植腫瘍形成実験
乳房腫瘍細胞(HMFL-XN5、HMFL-XN29)を、実施例1における工程(1)と同じ方法を使用することによって、2症例の病理学的に診断されたトリプルネガティブ乳癌患者の癌組織から分離して得た。HMFL-XN5及びHMFL-XN29を、それぞれ実施例2の工程(2)の方法に従って培養し、乳房腫瘍細胞の数が1×107個に達したとき、乳房腫瘍細胞を消化し、実施例4の工程(3)に記載されるように本発明の同じ方法を使用して収集した。本発明の乳房腫瘍細胞培養培地及びMatrigel(登録商標)(BD Biosciences製)を1:1の比率で混合し、Matrigelと混合した100μLの培養培地を使用して5×106個の乳房腫瘍細胞を再懸濁し、得られたものを6週齢の雌の高度免疫不全マウス(NCG)(南京モデル動物研究センター(Nanjing Model Animal Research Center)から購入)の乳房脂肪パッド及び右前肢の腋窩にそれぞれ注射した。乳房腫瘍細胞から生成されたマウスにおける腫瘍の体積及び成長速度を3日ごとに観察して写真撮影した。
癌組織由来の乳房腫瘍細胞の薬物感受性機能的試験
乳癌患者の外科的切除試料を例に取ると、患者由来の乳房腫瘍試料から培養した乳房腫瘍細胞を使用して、様々な薬物に対する患者の腫瘍細胞の感受性を試験することができることが確認される。
(1)薬物貯蔵プレートを勾配希釈法によって調製した:10μLの試験される薬物ストック溶液(薬物ストック溶液の濃度は、人体における薬物の最大血中濃度Cmaxの2倍に基づいて決定された)をそれぞれ取り、20μLのDMSOを含む0.5mLのEPチューブに加え、上記のEPチューブからの10μLの溶液を、20μLのDMSOを入れた2つ目の0.5mLのEPチューブへとピペットで移した。つまり、薬物を1:3の比率で希釈した。上記の方法を繰り返して段階的に希釈し、投薬に必要とされる7個の濃度を得た。異なる濃度の薬物を384ウェルの薬物貯蔵プレートに加えた。等容量のDMSOを、コントロールとして溶剤コントロール群の各ウェルに加えた。この実施例において、試験される薬物は、エピルビシン(MCE製)、ラパチニブ(MCE製)、ドセタキセル(MCE製)、及びタモキシフェン(MCE製)であった。
Claims (10)
- 初代乳房上皮細胞を培養する初代細胞培養培地であって、前記培地がアンフィレグリンを含むことを特徴とする、初代細胞培養培地。
- 前記アンフィレグリンの含有量は、10ng/ml~100ng/mlであることを特徴とする、請求項1に記載の初代細胞培養培地。
- 前記培地は、上皮成長因子、インスリン、B27、ROCKキナーゼ阻害剤Y27632、ニューレグリン1、線維芽細胞成長因子7、TGFβタイプI受容体阻害剤A8301、及びP38/MAPK阻害剤SB202190の1つ以上又は全てを更に含むことを特徴とする、請求項1に記載の初代細胞培養培地。
- 上皮成長因子の含有量は、2.5ng/ml以上、好ましくは2.5ng/ml~20ng/mlであり、
インスリンの含有量は、1μg/ml~10μg/mlであり、
B27は、1:25~1:100の最終濃度で希釈され、
Y27632の含有量は、5μM~15μMであり、
ニューレグリン1の含有量は、5nM~20nMであり、
線維芽細胞成長因子7の含有量は、2.5ng/ml~20ng/mlであり、
A8301の含有量は、100nM~500nMであり、
SB202190の含有量は、100nM~500nMであることを特徴とする、請求項3に記載の初代細胞培養培地。 - 前記培地は、血清、ウシ脳下垂体抽出物、Wntアゴニスト、R-スポンジンファミリータンパク質、BMP阻害剤、線維芽細胞成長因子10、ニコチンアミド、及びN-アセチルシステインを含まないことを特徴とする、請求項1に記載の初代細胞培養培地。
- 前記初代乳房上皮細胞は、乳房腫瘍細胞、正常乳房上皮細胞、又は乳房上皮幹細胞であることを特徴とする、請求項1~5のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地。
- 初代乳房上皮細胞の培養方法であって、以下の工程:
(1)請求項1~6のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地を調製する工程と、
(2)培養容器を細胞外マトリックスゲル希釈剤でコーティングする工程と、
(3)コーティングされた前記培養容器において初代乳房上皮細胞を接種し、前記細胞を、正常酸素条件又は低酸素条件下で前記初代細胞培養培地を使用することによって培養し、前記初代乳房上皮細胞が前記培養容器の底部面積の80%~90%を占める細胞密度まで成長したときに前記細胞を消化して継代する工程と、
を含むことを特徴とする、培養方法。 - 前記細胞外マトリックスゲルは、低成長因子型のものであり、
前記細胞外マトリックスゲルは、無血清培地で希釈され、前記細胞外マトリックスゲルの希釈比は、1:50~1:400であり、
前記コーティングする工程は、希釈された前記細胞外マトリックスゲルを前記培養容器へと加えて、前記培養容器の底部を完全に覆い、30分間以上放置することを含むことを特徴とする、請求項7に記載の培養方法。 - 乳房疾患を治療する薬物の有効性を評価する方法であって、以下の工程:
(1)請求項7又は8に記載の培養方法を使用することによって乳房上皮細胞を培養する工程と、
(2)試験する薬物を選択する工程と、
(3)基準として前記薬物の最大血漿濃度Cmaxに基づき、初期濃度としてCmaxの2倍~5倍を取り、前記薬物を種々の薬物濃度勾配へと希釈する工程と、
(4)工程(1)において培養した前記乳房上皮細胞を消化して単一細胞懸濁液にし、細胞外マトリックスゲルを含む請求項1~6のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地で前記単一細胞懸濁液を希釈し、希釈された前記細胞懸濁液を1ウェル当たり1000個~10000個の細胞の密度でマルチウェルプレートに加え、一晩付着させる工程と、
(5)工程(4)において得られた付着細胞に前記薬物を勾配希釈で添加する工程と、
(6)細胞生存率を検出する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。 - 細胞生存率の検出において、細胞生存率検出試薬を各ウェルに加え、均一に振盪した後に、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの化学発光強度を測定し、測定値に基づいて薬物用量-効果曲線をプロットし、細胞の増殖に対する各薬物の阻害強度を計算することを特徴とする、請求項9に記載の方法。
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