CZ2008697A3 - Kombinace monoklonálních protilátek nebo jejich Fab fragmentu pro použití jako lécivo a farmaceutický prípravek tyto protilátky nebo jejich Fab fragmenty obsahující - Google Patents

Abstract

Kombinace monoklonálních protilátek proti rustovým faktorum IGF-2 a BMP-4 nebo jejich Fab fragmentu pro použití jako lécivo, zejména pro použití pri lécbe karcinomu, výhodne dlaždicového karcinomu hlavy a krku. Rešení dále zahrnuje také farmaceutický prípravek obsahující monoklonální protilátky proti IGF-2 a BMP-4 a prípadne také cytostatikum. Monoklonální protilátky jsou s výhodou humanizované a mohou být dále navázány na nosic z rozpustného polymeru.

Description

Kombinace monoklonálních protilátek nebo jejich Fab fragmentů pro použití jako léčivo a farmaceutický přípravek tyto protilátky nebo jejich Fab fragmenty obsahující

Oblast techniky

Vynález se týká monoklonálních protilátek proti růstovým faktorům IGF-2 a BMP-4 pro použití v kombinaci jako léčivo, zejména při léčbě karcinomů, s výhodou dlaždicových karcinomů.

Stav techniky

Dlaždicové karcinomy představují celosvětově 6. nejčastější typ zhoubného bujení. Přes veškerý pokrok ve včasné diagnostice a terapii je jejich léčba devastující a velmi málo efektivní (Argirís, A., Eng, C.: Epidemiology, staging, and screening of head and neck cancer. In Brockstein, B., Masters, G., eds. Head and Neck Cancer. Boston, Kluwer Academie Publishers, 2003. pp. 15-60). Podobně jako u jiných typů nádorů hrají při vzniku těchto tumorů významnou roli kmenové buňky. Ty se podílejí nejen na vzniku nádoru, ale i na jeho šíření organismem pacienta a jsou odpovědné za resistenci nádoru vůči chemoterapii. Kvůli svým biologickým vlastnostem mohou být odpovědné i za opětovné vzplanutí onemocnění po jeho zdánlivém vyléčení (Motlík, 1, Klíma, J., Dvořánková, B., Smetana, K. Jr.: Porcine epidermal stem cells as a biomedical model for wound healing and normal/malignant epithelial cell propagation. Theriogenology 67:105-111,2007).

Zdravé tkáňové kmenové buňky potřebují pro zachování svých kmenových vlastností vhodné prostředí, tzv. niché. Ačkoliv toto mikroprostředí je intenzivně studováno, je jeho reprodukce v podmínkách ex vivo problematická. Tato skutečnost brání širšímu zavedení tkáňových kmenových buněk do klinické medicíny, protože expanze kmenových buněk je ve tkáňové kultuře dosud obtížná. Rada studií naznačuje, že vhodné mikroprostředí pro fungování nádorových kmenových buněk představuje stroma nádoru. To je tvořeno řadou buněčných typů včetně fibroblastů. Stroma nádoru potom ovlivňuje výživu nádorových buněk stimulací vrůstání cév do nitra nádoru a dokonce se zdá, že i celkové biologické chováni šíření nádoru je ovlivněno aktivitou stromatu (Condon, M., S.: The role of the stromal microenvironment in prostatě cancer. Sem. Cancer Biol. 15: 132-137, 2005; Ailles, L., E., Weissman, I., L.: Cancer stem cells in solid tumors. Current Opinion Biotechnol. 18:460-466,2007).

-2 '

Experimentálně bylo stanoveno, že fibroblasty stromatu karcinomů basocelulámího i spinocelulárního typu vycházejících z dlaždicových epitelů mají vysokou biologickou aktivitu. Dokonce jsou schopny měnit biologické vlastnosti diferencovaných keratinocytů směrem k buňkám blízkým keratinocytům nádorovým včetně tzv. epiteiiálněmesenchymálního přechodu. Tento jev je odpovědný za šíření nádorového klonu organismem pacienta. Biologickou aktivitu si fibroblasty nádorového stromatu zachovávají, i když jsou permeabilní membránou odděleny od keratinocytů. Lze tedy předpokládat, že za popsaný jev je odpovědná produkce cytokinů a růstových faktorů fibroblasty nádorového stromatu (Lacina, L., Dvořánková, B., Smetana, K. Jr. , Chovanec, M., Plzák, J., Tachezy, R., Kideryová, L, Kučerová, L., Čada, Z., Bouček, J., Kodet, R., André, S., Gabius, H.-J.: Markér profiling of normál keratinocytes identifies the stroma from squamous cell carcinoma of the oral cavity as a modulátory microenvironment in co-culture. Int. Radiation. Biol. 83: 837-848, 2007; Lacina, L., Smetana, K., Jr., Dvořánková, B., Pytlík, R„ Kideryová, L., Kučerová, L., Plzáková, Z., Štork, J„ Gabius, H.-J., André, S.: Stromal fibroblasts from basal cell carcinoma affect phenotype of normál keratinocytes Brit. J. Dermatol. 156: 819-829,2007).

Zablokování vlivu nádorového stromatu na nádorové kmenové buňky by tedy mohlo inhibovat růst nádorového klonu a šíření nádoru (Hofmeister, V., Schrama, D., Becker, J„ C.: Anti-cancer therapies targeting the tumor stroma, Cancer Immunol. Immunother. 57: 1-17, 2008; Kenny, P., A., Lee, G., Y., Bissell, M., J.: Targeting the tumor microenvironment Front. Biosci. 12: 3468-3474,2007).

Předkládaný vynález řeší výše uvedený problém zablokování vlivu nádorového stromatu na nádorové kmenové buňky.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je kombinace pro použití jako léčivo, obsahující monoklonální protilátky proti 1GF-2 a proti BMP-4 nebo jejich Fab fragmenty.

Význakem předkládaného vynálezu je kombinace monoklonálních protilátek proti IGF-2 a proti BMP-4 nebo jejich Fab fragmentů pro použití pfi léčbě karcinomu.

Ve výhodném provedení je význakem překládaného vynálezu kombinace monoklonálních protilátek proti 1GF-2 a proti BMP-4 nebo jejich Fab fragmentů pro použití při léčbě dlaždicového karcinomu, zejména dlaždicového karcinomu hlavy a krku.

Význakem vynálezu je dále to, že monoklonální protilátky mohou být humanizované.

Dalším význakem vynálezu je to, že monoklonální protilátky mohou být navázány na nosič z rozpustného hydrofilního polymeru. Rozpustným hydrofilním polymerem podle vynálezu může být např. N-(2-hydroxypropyl)metakrylamid, N,O-dimetakryloylhydroxylamin. Předmětem předkládaného vynálezu je dále farmaceutický přípravek obsahující monoklonální protilátky proti IGF-2 a proti BMP-4 nebo jejich Fab fragmenty, Monoklonální protilátky mohou být humanizované.

Ve výhodném provedení obsahuje farmaceutický přípravek monoklonální protilátky nebo jejich Fab fragmenty navázané na nosič z rozpustného hydrofilního polymeru. Výhodněji obsahuje farmaceutický přípravek dále cytostatika.

Farmaceutický přípravek lze připravit např. rozpuštěním lyofilizovaných protilátek proti IGF- 2 (80-250 mg) a proti BMP-4 (3-10 mg) v 500 - 1000 ml infuzního roztoku (např. Ringerův,

Hartmanův, Darrowův či 5% roztok glukózy). Takovýto farmaceutický přípravek pak může být intravenózně aplikován pacientovi.

Původci tohoto vynálezu bylo zjištěno, že ovlivnění pronádorově působících růstových faktorů IGF-2 (Insulin-like growth factor-2; Brady, G., Crean, S., Naik, P,. Kapas, S.: Upregulation of IGF-2 and IGF-1 receptor expression in oral cancer cell lineš. Int. J. Oncol. 3T. 875-881, 2007) a BMP-4 (Bone morphogenetic factor-4; Hamada, S., Satoh, K., Hirota, M., Kimura, K.,, Kanno, A., Masamune, A., Shimosegawa, T.: Bone morphogenetic protein 4 induces epithelial-mesenchymal transition through MSX2 induction on pancreatic cancer cell line. J. Cell. Physiol. 213: 768-774, 2007) má významný terapeutický efekt. Navíc bylo zjištěno, že pronádorově působící IGF-2 a BMP-4 nejsou významně exprimovány zdravým epitelem, ale jsou přítomny v nádorovém ložisku (viz Tab.l v příkladu 1).

Současná inhibice aktivity IGF-2 a BMP-4 tak potlačí pozitivní vliv stromatu na nádorovou kmenovou buňku a změní tak mikroprostředí nádoru směrem ke stimulaci zvýšené diferenciace buněk nádorového klonu. Uvedená terapeutická modalita zlepší efektivitu již dříve využívaných léčebných postupů (chirurgické odstranění nádoru, ozáření, chemoterapie). Výše uvedené růstové faktory se uplatňují zejména při vývoji savčího zárodku, jejich význam u zdravého jedince je postnatálně nízký (Gilbert, S., E.: Developmental Biology. Sinauer Associates, Sunderland, MA, 2000). Aplikace inhibitorů účinků BMP-4 a IGF-2 pacientovi by proto byla provázena minimem vedlejších účinků. Vzhledem k možnému riziku alergizace pacienta myší monoklonální protilátkou je možno využít technologie humanizovaných protilátek (Nissim, A., Chemajovski Y. Historical development of monoclonal antibody

- 4 therapeutics. In Chemajovski, Y. and Nissim, A. eds. Therapeutic Antibodies. Handbook of

Experimental Pharmacology, Springer Verlag, Berlin-Heidelberg, 2008, pp. 3-18),

Vzhledem ktomu, že je známo, že se díky odlišnosti stavby nádorových cév syntetické polymery hromadí v místě nádoru, je možno Fab fragmenty, celé molekuly monoklonální protilátky či molekuly humanizované protilátky navázat na rozpustný hydrofilní polymerní nosič. Tím lze dosáhnout vyšší koncentrace terapeutické protilátky v nádorovém stromatu. Pokud konjugát obsahuje i cytostatikum, lze tím dosáhnout lokálně vysoké koncentrace účinné látky v nádoru (Ulbrich, K., Pechar, M., Strohalm, J., Šubr, V., Říhová, B.: Synthesis of biodegradable polymers for controlled drug release. Ann N Y Acad Sci. 831:47-56,1997),

Příklady

Příklad 1:

Fibroblasty stromatu dlaždicového karcinomu byty izolovány jak bylo detailně popsáno (Lacina, L., Dvořánková, B., Smetana, K. Jr. , Chovanec, M., Plzák, J., Tachezy, R., Kideryová, L, Kučerová, L., Čada, Z., Bouček, J., Kodet, R., André, S., Gabius, H.-J.: Markér profiling of normál keratinocytes identifies the stroma from squamous cell carcinoma of the oral cavity as a modulátory microenvironment in co-culture. Int. Radiation. Biol. 83: 837-848, 2007; Lacina, L., Smetana, K., Jr., Dvořánková, B., Pytlík, R., Kideryová, L., Kučerová, L., Plzáková, Z., Štork, J., Gabius, H.-J., André, S.: Stromal fibroblasts from basal cell carcinoma affect phenotype of normál keratinocytes Brit. J. Dermatol. 156: 819-829, 2007). V krátkosti, nádorová tkáň byla za sterilních podmínek desintegrována. Z fragmentů tkáně migrovaly buňky, jejichž fenotyp byl kontrolován. V okamžiku, kdy měly tyto buňky pouze známky fibroblastů (Vimentin+/CD34-/CD68+) byla migrace přerušena a buňky byly dále kultivovány pro další užití. Celková RNA z těchto buněk byla isolována kitem „RNeasy® Micro Kit“ (QIAGEN lne., USA) a ve dvou krocích přepsána do cRNA kitem „Illumina® TotalPrep RNA Amplifícatton Kit“ (Ambion lne., USA). Podobně byla získána i RNA z normálních zdravých fibroblastů a přepsána do cRNA. Kromě toho byla stejně získána RNA z normálních a nádorových fibroblastů kultivovaných pod vlivem normálních keratinocytů. Tato RNA byla rovněž přepsána do cRNA. Pomocí systému BeadStation 500 (Illumina, San Diego, CA, USA) byl hodnocen transkripční profil všech studovaných typů fibroblastů. Důraz byl kladen na rozdíl v transkripci růstových faktorů u fibroblastů nádorového stromatu a fibroblastů netransformovaného epitelu. Transkripce 560 genů byla u nádorových fibroblastů

-5 snížena či zvýšena ve srovnání s normálními fibroblasty. Na základě tohoto výsledku lze očekávat, že vliv fibroblastů nádorového stromatu na nádorový klon bude velmi komplexní. Na základě analýzy zapojení jednotlivých růstových faktorů do signalizačních kaskád nádorového klonu byly vybrány 2 produkty následujících genů, jejichž ovlivnění by mohlo mít významný terapeutický efekt (viz tabulka).

Tabulka 1:

Gen	Růstový faktor	Význam	SCCF: HF mRNA in viiro	SCCF: HF IMCCH in vitro	Normální tkáň IMCCH biopsie	Nádorové stroma IMCCH biopsie
1GF2	1GF-2	pronádorový Brady et al., 2007	15	2		+
BMP4	BMP-4	pronádorový Hamada et al., 2007	10	2		+

1GF-2- Insulin like growth factor-2

BMP-4- Bone morphogenetic factor-4 lMCCH-imunocytochemický průkaz proteinu

SCCF: HF- poměr transkripce u nádorových stromálních (SCCF) a normálních lidských (HF) fibroblastů

Příklad 2:

Buňky stromatu dlaždicového karcinomu byly připraveny a kultivovány dle detailního návodu (Lacina, L., Dvořánková, B., Smetana, K. Jr. , Chovanec, M., Plzák, J., Tachezy, R., Kideryová, L, Kučerová, L., Čada, Z., Bouček, J., Kodet, R., André, S., Gabius, H.-J.: Markér profiling of normál keratinocytes identifies the stroma from squamous cell carcinoma of the oral cavity as a modulátory microenvironment in co-culture. Int. Radiation. Biol. 83: 837-848, 2007; Lacina, L., Smetana, K., Jr., Dvořánková, B., Pytlík, R., Kideryová, L., Kučerová, L., Plzáková, Z., Štork, J., Gabius, H.-J., André, S.: Stromal fibroblasts from basal cell carcinoma affect phenotype of normál keratinocytes Brit. J. Dermatol. 156: 819-829, 2007). Zkráceně, stromální fibroblasty byly vysety v hustotě 20000 buněk/cm² v kultivačním mediu obsahujícím obvykle Eaglovo minimální esenciální medium (MEM) s neesenciálními aminokyselinami a pyruvátém sodným, glutaminem (0,3 mg/ml), 10% telecím sérem, . ( i

-6 hydrokortisonem (0,5 μΜ/ml), penicilinem (200 jednotek/ml), streptomycinem (0.1 mg/ml), insulinem (5 pg/ml), choleratoxinem (ΙΟ’¹⁰ M) a epidermálním růstovým faktorem (10 ng/ml) a HEPES (10 mM). Toto medium (kondicionované medium) bylo použito ke kultivaci lidských ínterfolikulámich keratinocytů bez podpůrných buněk (20000 buněk/cm²) na sklech potažených kolagenem. Kultivace probíhala při teplotě 37 °C a zvýšeném parciálním tlaku (5%) CO2. V paralelní skupině byly kultivovány keratinocyty v kondicionovaném mediu a monoklonálními protilátkami proti IGF-2 (klon 75015) v koncentraci 20 pg/ml kultivačního media a BMP-4 (klon 66119) v koncentraci 3 pg/ml kultivačního media (R&D Systems, Minneapolis, MN 55413, USA). Kromě toho byly paralelně kultivovány i stejné keratinocyty ve výše popsaném mediu bez přídavků. Kultivace všech experimentálních skupin probíhala 6 dní. Potom byla skla vyňata, buňky fixovány paraformaldehydem a pomocí imunocytochemie byly znázorněny antigeny (keratin 8, keratin 19 a vimentin). Výsledky jsou uvedeny v tabulce:

Studovaný znak	Samotné medium (%)	Kondicionované medium (%)	Kondicionované medium + anti-IGF-2 anti-BMP-4 (%)
Keratin 8	0	5	0
Keratin 19	0	90	0
Vimentin	0	5	0

Příklad 3

Keratinocyty byly kultivovány spolu s podpůrnými buňkami linie 3T3 (Lacina, L., Dvořánková, B., Smetana, K. Jr. , Chovanec, M., Plzák, J., Tachezy, R., Kideryová, L, Kučerová, L., Čada, Z., Bouček, J., Kodet, R., André, S,, Gabius, H.-J.: Markér profiling of normál keratinocytes identifies the stroma from squamous cell carcinoma of the oral cavity as a modulátory microenvironment in co-culture. Int. Radiation. Biol. 83: 837-848, 2007). 3T3 •Ί fibroblasty v hustotě 7000 buněk/cm a proliferací zastavenou mitomycinem-c v koncentraci 25 pg/ml (po dobu 6 hod) byly kokultivovány s lidskými interfolikulámími keratinocyty

Λ v hustotě 20000 buněk/cm ve výše popsaném kultivačním mediu s přídavkem BMP-4 (koncentrace 30 ng/ml, R&D Systems) a IGF-2 (koncentrace 5 ng/ml, R&D Systems). V kontrolním experimentu byly kultivovány keratinocyty s3T3 bez růstových faktorů a /

-7 keratinocyty s 3T3 v kondicionovaném mediu (viz výše). Další zpracování vzorků bylo identické s příkladem 1. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.

Studovaný znak	Samotné medium (%)	Kondicionované medium (%)	Samotné medium + IGF-2+ BMP-4 (%)
Keratin 8	0	5	0
Keratin 19	5	30	20
Vimentin	5	40	40

Příklady 2 a 3 ukazují, že BMP-4 a IGF-2 hrají důležitou roli ve změně fenotypu normálních keratinocytů směrem k nádorovému proagresivnímu fenotypu. Zablokováním jejich aktivity se tento fenotyp normalizuje. Tato skutečnost ukazuje, že mesenchymálně-epitelová interakce hraje důležitou roli v existenci a progresi dlaždicových karcinomů a její inhibice například pomocí specifických protilátek včetně protilátek humanizovaných a Fab fragmentů a protilátek navázaných na polymerní rozpustné nosiče či jiných inhibitorů by mohla být využita pro terapeutické účely jako adjuvantní léčebná modalita.

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kombinace pro použití jako léčivo, vyznačená tím, že obsahuje monoklonální protilátky proti IGF-2 a proti BMP-4 nebo jejich Fab fragmenty.
2. 2. Kombinace podle nároku 1 pro použití při léčbě karcinomu.
3. 3. Kombinace podle nároku 1 pro použití při léčbě dlaždicového karcinomu, s výhodou dlaždicového karcinomu hlavy a krku.
4. 4. Kombinace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačená tím, že monoklonální protilátky nebo jejich Fab fragmenty jsou humanizované.
5. 5. Kombinace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačená tím, že monoklonální protilátky nebo jejich Fab fragmenty jsou navázány na nosič z rozpustného hydrofilního polymeru.
6. 6. Farmaceutický přípravek, vyznačený tím, že obsahuje monoklonální protilátky proti IGF-2 a proti BMP-4 nebo jejich Fab fragmenty.
7. 7. Farmaceutický přípravek podle nároku 6, vyznačený tím, že monoklonální protilátky nebo jejich Fab fragmenty jsou humanizované.
8. 8. Farmaceutický přípravek podle nároku 6 nebo 7, vyznačený tím, že monoklonální protilátky nebo jejich Fab fragmenty jsou navázané na nosič z rozpustného hydrofilního polymeru.
9. 9. Farmaceutický přípravek podle nároku 8, vyznačený tím, že dále obsahuje cytostatikum.