JP7382660B2 - がん治療用組成物及びその応用、並びに医薬品 - Google Patents

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本願は、２０２０年０７月０６日に中国特許庁へ提出された、出願番号２０２０１０６４１４５６．１、発明の名称「がん治療用組成物及びその応用、並びに医薬品」である中国特許出願に基づき優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に組み込まれる。

本発明は、医薬技術分野に関し、特にがん治療用組成物及びその応用、並びに医薬品に関する。

悪性腫瘍は、現在の社会で人間の生命を脅かす主要な疾患の１つである。腫瘍の成長及び浸潤は血管新生を誘導する必要がある。血管新生を誘導する最も重要な因子は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）であり、腫瘍細胞から分泌されるＶＥＧＦは、血管内皮細胞受容体（ＶＥＧＦＲ）と結合して血管内皮細胞の増殖を促進し、分裂して新しい血管を形成し、腫瘍の成長を促進する（Ｌｅｕｎｇ ＤＷ、 Ｃａｃｈｉａｎｅｓ Ｇ、 Ｋｕａｎｇ ＷＪ、 Ｇｏｅｄｄｅｌ ＤＶ、 Ｆｅｒｒａｒａ Ｎ． Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ ａ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｍｉｔｏｇｅｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９８９； ２４６：１３０６-１３０９． Ｔｉｓｃｈｅｒ Ｅ、 ｅｔ ａｌ． Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ： ａ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． １９８９； １６５：１１９８-１２０６． ）。従って、小分子でＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの活性を標的として腫瘍の血管新生を阻害し、腫瘍細胞を餓死させるのは、近年、腫瘍治療の新しいアプローチとなる。しかしながら、受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤でＶＥＧＦＲを標的とするのは、満足のいく治療効果を生み出さなかった。各種のヒト悪性腫瘍の全体的な奏効率は低く、薬剤耐性の急速な進展などの問題を早急に解決する必要がある。
ＶＥＧＦＲファミリーには、主に、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３の３つの主要メンバーがあり、中でも、ＶＥＧＦＲ２は、主に血管内皮細胞の成長を仲介する。最近の研究では、ＶＥＧＦＲ２は一部の腫瘍細胞でも高度に発現しているため、腫瘍細胞から分泌されるＶＥＧＦは血管新生を誘導するとともに、腫瘍細胞自体または隣接する腫瘍細胞や間葉系細胞に自己分泌または傍分泌で作用し、腫瘍幹細胞の形成及び免疫寛容微小環境の形成を促進することが示されている（Ｋｏｗａｎｅｔｚ Ｍ、 Ｆｅｒｒａｒａ Ｎ． Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ： ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ． Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００６； １２：５０１８-５０２２． Ｗａｌｄｎｅｒ ＭＪ、 ｅｔ ａｌ． ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｌｉｎｋｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｃｏｌｉｔｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２０１０； ２０７：２８５５-２８６８． Ｈａｍｅｒｌｉｋ Ｐ、 ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ ＶＥＧＦ-ＶＥＧＦＲ２-ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｇｌｉｏｍａ ｓｔｅｍ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２０１２； ２０９：５０７-５２０．）。しかし、ＶＥＧＦＲがリガンドと結合して腫瘍細胞の増殖、生存、およびがんの進展を促進する具体的なメカニズムはまだよくわかっていない。

腫瘍細胞が正常細胞と異なる特徴の１つは、がん細胞が十分な酸素の条件下でも好気的解糖を優先的に使用して腫瘍細胞にエネルギーを提供することにある。好気的解糖は、酸化的リン酸化よりもエネルギー生産効率がはるかに低いため、腫瘍細胞がグルコースを輸送する能力を大幅に高める必要があり（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ ｅｔ ａｌ、Ｈａｌｌｍａｒｋｓ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ：ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ、Ｃｅｌｌ、１４４（５）：６４６－６７４（２０１１）、これは、原形質膜トランスポーターの過剰発現によって達成される（Ｇａｎａｐａｔｈｙ Ｖ、 ｅｔ ａｌ 、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ：ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｔｏ Ｗａｒｂｕｒｇ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ＆Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １２１（１）：２９－４０（２００９）。グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ１）は、細胞外ナトリウム濃度に依存してグルコースを細胞に輸送し、グルコース濃度に依存しないアクティブなグルコース輸送体である（Ｗｒｉｇｈｔ ＥＭ、 ｅｔ ａｌ、 Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ、 Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、９１（２）：７３３－７９４（２０１１））。研究によると、ＳＧＬＴ１は、複数のがんで高発現しているとともに、卵巣がん、口腔扁平上皮がん、結腸直腸がん、膵臓がん及び前立腺がんを含むがんの予後不良に関し、ＳＧＬＴ１はＥＧＦＲに結合して安定化し、腫瘍細胞の成長、増殖を促進する（Ｍａｄｕｎｉc Ｊ、 Ｖｒｈｏｖａｃ Ｍａｄｕｎｉc Ｉ、 Ｇａｊｓｋｉ Ｇ、 Ｐｏｐｉc Ｊ、 ＧａｒａｊＶｒｈｏｖａｃ Ｖ． Ａｐｉｇｅｎｉｎ： Ａ ｄｉｅｔａｒｙ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ｗｉｔｈ ｄｉｖｅｒｓｅ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２０１８；４１３：１１－２２．Ｋｏｅｐｓｅｌｌ Ｈ． Ｔｈｅ Ｎａ＋ －Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ＳＧＬＴ１ ａｎｄ ＳＧＬＴ２ ａｒｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１７；１７０：１４８-６５． Ｙａｍａｚａｋｉ Ｙ、 Ｈａｒａｄａ Ｓ、 Ｔｏｋｕｙａｍａ Ｓ． Ｓｏｄｉｕｍ-ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｅｕｒ Ｊ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ２０１８；８２２：２５-３１）。
現在、当分野でＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害薬に耐性のあるがんの治療を解決するのにＳＧＬＴ１阻害剤とＶＥＧＦＲ２阻害剤を組み合わせて使用することは報道されていない。

以上の状況に鑑み、本発明は、がん治療用組成物及びその応用、並びに医薬品を提供する。本発明は、ＳＧＬＴ１とＶＥＧＦＲ２が相互作用し、腫瘍の発症及び進展を促進し、ＶＥＧＦＲ２を標的とする阻害剤とＳＧＬＴ１阻害剤との組成物が相乗的な抗腫瘍効果を有することを見出した。
本発明は、上記の発明目的を達成するために、以下の技術的態様を提供する。

本発明は、ナトリウム／グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ１）阻害剤及び血管内皮細胞増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）阻害剤を含む組成物を提供する。好ましくは、有効成分は、ＳＧＬＴ１阻害剤とＶＥＧＦＲ２阻害剤からなる。
好ましくは、ＳＧＬＴ１阻害剤は、ソタグリフロジ、ミザグリフロジン（Ｍｉｚａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）、ＫＧＡ－２７２７、カナグリフロジン、ダパグリフロジンから選ばれる少なくとも１つであるが、これらに限定されない、当業者によって実行可能であると考えられるＳＧＬＴ１阻害剤がいずれも本発明の保護範囲に含まれる。
好ましくは、ＳＧＬＴ１阻害剤の投与量は、１～１００ｍｇ／ｋｇである。
好ましくは、ＳＧＬＴ１阻害剤の投与量は、１０～５０ｍｇ／ｋｇである。
好ましくは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤は、アパチニブ、アキシチニブ（Ａｘｉｔｉｎｉｂ）、ニンテダニブ（Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ、 ＢＩＢＦ １１２０）、セジラニブ（Ｃｅｄｉｒａｎｉｂ、 ＡＺＤ２１７１）、パゾパニブ塩酸塩（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ ＨＣｌ、 ＧＷ７８６０３４ ＨＣｌ）、スニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ Ｍａｌａｔｅ）、ブリバニブ（Ｂｒｉｖａｎｉｂ、 ＢＭＳ－５４０２１５）、カボザンチニブ（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ （ＸＬ１８４、 ＢＭＳ－９０７３５１）、ブリバニブアラニナート（Ｂｒｉｖａｎｉｂ Ａｌａｎｉｎａｔｅ 、 ＢＭＳ－５８２６６４）、レンバチニブ（Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ、 Ｅ７０８０）、レゴラフェニブ（Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ、 ＢＡＹ ７３－４５０６）、ＥＮＭＤ－２０７６、チボザニブ（Ｔｉｖｏｚａｎｉｂ、 ＡＶ－９５１）、ポナチニブ（Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ 、 ＡＰ２４５３４）、ＥＮＭＤ－２０７６ 酒石酸塩（ＥＮＭＤ－２０７６ Ｌ－（＋）－Ｔａｒｔａｒｉｃ ａｃｉｄ ）、テラチニブ（Ｔｅｌａｔｉｎｉｂ）、タキシフォリン（Ｔａｘｉｆｏｌｉｎ、 Ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）、カボザンチニブリンゴ酸塩（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ ｍａｌａｔｅ、 ＸＬ１８４）、ビタミンＥ（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ）、レゴラフェニブ水合物（Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ Ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）、ニンテダニブエタンスルホン酸塩（Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ Ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ Ｓａｌｔ）、レンバチニブメシル酸塩（ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ Ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セジラニブマレイン酸塩（Ｃｅｄｉｒａｎｉｂ Ｍａｌｅａｔｅ）、フルキンチニブ（Ｆｒｕｑｕｉｎｔｉｎｉｂ）、４－［（１Ｅ）－２－［５－［（１Ｒ）－１－（３，５－ジクロロ－４－ピリジル）エトキシ］－１Ｈ－インダゾール－３－イル］ビニル］－１Ｈ－ピラゾール－１－エタノール（ＬＹ２８７４４５５）、スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、シトラバチニブ（Ｓｉｔｒａｖａｔｉｎｉｂ 、ＭＧＣＤ５１６）、アンロチニブ（Ａｎｌｏｔｉｎｉｂ （ＡＬ３８１８） ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ソラフェニブ、バンデタニブ及びＶＥＧＦＲを標的とするモノクローナル抗体などから選ばれる少なくとも１つである。
ＶＥＧＦＲを標的とするモノクローナル抗体は、例えば、ベバシズマブであるが、これらに限定されない。当業者によって実行可能であると考えられるＶＥＧＦＲを標的とするモノクローナル抗体がいずれも本発明の保護範囲に含まれる。

好ましくは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤の投与量は、１０～５００ｍｇ／ｋｇである。
好ましくは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤の投与量は、１０～１００ｍｇ／ｋｇである。
本発明は、さらに、がん治療用医薬品の調製における該組成物の応用。
好ましくは、がんは、膀胱がん、血液がん、骨がん、脳がん、乳がん、中枢神経系がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胆嚢がん、胃腸がん、外生殖器がん、泌尿生殖器がん、頭部がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、筋肉組織がん、頸部がん、口腔または鼻粘膜がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、脾臓がん、小腸がん、大腸がん、胃がん、精巣がん及び／又は甲状腺がんを含む。
本発明は、さらに、上記組成物を含むがん治療用医薬品を提供する。

好ましくは、医薬品の投与経路は、経口投与であり、剤形は顆粒剤、丸剤、散剤、錠剤、カプセル剤、経口液剤又はシロップ剤を含む。
好ましくは、医薬品の投与経路は、注射であり、剤形は注射液又は粉末注射剤を含む。
本発明は、がん治療用組成物及びその応用、並びに医薬品を提供する。該組成物は、ＳＧＬＴ１阻害剤及びＶＥＧＦＲ２阻害剤を含む。本発明は、以下の技術的効果がある。
本発明は、ＳＧＬＴ１及びＶＥＧＦＲ２が相互作用し、腫瘍の発症及び進展を促進し、且つこのような相互作用が互いに機能を発揮させるのに重要な役割を果たし、ＶＥＧＦＲ２のノックダウンが、腫瘍細胞の増殖および成長シグナルの伝達に影響を与えるだけではなく、ＳＧＬＴ１の機能にも影響を及ばすが、逆に、ＳＧＬＴ１のノックダウンは、低グルコース条件下でのがん細胞の生存に影響を与えるだけではなく、ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路及び細胞増殖にも影響を及ばすことを見出した。
本発明は、さらに、ＶＥＧＦＲ２を標的とする阻害剤とＳＧＬＴ１阻害剤との組成物が相乗的な抗腫瘍効果を有し、ＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１を標的とする阻害剤の組成物をがん治療に使用できることを見出した。

図１は、ＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１の高発現が、肝臓がん、結腸直腸がん患者の予後不良と関連していることを示し、ここで、１Ａは、ＶＥＧＦＲ２の高発現と肝臓がん患者の予後との関係を示し、１Ｂは、ＶＥＧＦＲ２の高発現と結腸直腸がんの患者の予後との関係を示し、１Ｃは、ＳＧＬＴ１の高発現と肝臓がん患者の予後との関係を示し、１Ｄは、ＳＧＬＴ１の高発現と結腸直腸がん患者の予後との関係を示す。 図２は、ＶＥＧＦＲ２とＳＧＬＴ１は、肝臓がん及び結腸直腸がんで正の相関があることを示し、ここで、２Ａは、肝臓がんでのＶＥＧＦＲ２とＳＧＬＴ１の発現が正の相関を示し、２Ｂは、結腸直腸がんでのＶＥＧＦＲ２とＳＧＬＴ１の発現が正の相関があることを示す。 図３は、肝臓がん細胞株においてＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１をノックアウトした損傷細胞の、ヌードマウスでの腫瘍形成能を示す。 図４は、ＳＧＬＴ１をノックダウンするとＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路を損傷し、本発明では、ｐ－ＥＲＫ１／２をマーカーとしてＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路の強度を示すことを示す。 図５は、ＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１をノックダウンすると肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂのアパチニブに対する感受性が高まることを示す。 図６は、ＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１をノックダウンするとＨｅｐ３Ｂ細胞のグルコース欠乏に対する感受性が高まることを示す。 図７は、ＶＥＧＦＲ２とＳＧＬＴ１との間のタンパク質間相互作用を示す。 図８は、ＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤による肝臓がん細胞株ＨｅｐＧ２への処置効果を示す。 図９ａは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤による結腸直腸がん細胞株ＳＷ６２０への処置効果を示す。 図９ｂは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤による子宮頸がん細胞株ＨｅＬａへの処置効果を示す。 図９ｃは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤による卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３への処置効果を示す。 図９ｄは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤による胃がん細胞株ＮＧＣ２７への処置効果を示す。 図９ｅは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤による胆管がん細胞株ＲＢＥへの処置効果を示す。 図９ｆは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤による食道がん細胞株ＫＹＳＥ３０への処置効果を示す。 図１０は、ヌードマウスの肝がんの異種移植腫瘍の治療におけるＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤の有効性を示し、１０Ａは、投与終了後に解剖された各群腫瘍の拡大図であり、１０Ｂは、投与終了後の各群腫瘍重量を示すグラフである。 図１１－１～図１１－６は、それぞれアキシチニブ（図１１－１）、ニンテダニブ（図１１－２）、セジラニブ（図１１－３）、パゾパニブ塩酸塩（図１１－４）、スニチニブリンゴ酸塩（図１１－５）、ブリバニブ（図１１－６）とＳＧＬＴ１阻害剤であるソタグリフロジとの併用による腫瘍抑制効果を示す。 図１１－７～図１１－１２は、それぞれカボザンチニブ（図１１－７）、ブリバニブアラニナート（図１１－８）、レンバチニブ（図１１－９）、レゴラフェニブ（図１１－１０）、ＥＮＭＤ－２０７６（図１１－１１）、チボザニブ（図１１－１２）とＳＧＬＴ１阻害剤であるソタグリフロジとの併用による腫瘍抑制効果を示す。 図１１－１３～図１１－１８は、それぞれポナチニブ（図１１－１３）、ＥＮＭＤ－２０７６酒石酸塩（図１１－１４）、テラチニブ（図１１－１５）、タキシフォリン（図１１－１６）、パゾパニブ（図１１－１７）、カボザンチニブリンゴ酸塩（図１１－１８）とＳＧＬＴ１阻害剤であるソタグリフロジとの併用による腫瘍抑制効果を示す。 図１１－１９～図１１－２４は、それぞれビタミンＥ（図１１－１９）、レゴラフェニブ水合物（図１１－２０）、ニンテダニブエタンスルホン酸塩（図１１－２１）、レンバチニブメシル酸塩（図１１－２２）、セジラニブマレイン酸塩（図１１－２３）、４－［（１Ｅ）－２－［５－［（１Ｒ）－１－（３，５－ジクロロ－４－ピリジル）エトキシ］－１Ｈ－インダゾール－３－イル］ビニル］－１Ｈ－ピラゾール－１－エタノール（図１１－２４）とＳＧＬＴ１阻害剤であるソタグリフロジとの併用による腫瘍抑制効果を示す。 図１１－２５～図１１－３０は、それぞれスニチニブ（図１１－２５）、シトラバチニブ（図１１－２６）、アンロチニブ（図１１－２７）、ソラフェニブ（図１１－２８）、バンデタニブ（図１１－２９）、フルキンチニブ（１１－３０）とＳＧＬＴ１阻害剤であるソタグリフロジとの併用による腫瘍抑制効果を示す。

本発明は、がん治療用組成物及びその応用、並びに医薬品を開示している。当業者は、本明細書を参照し、プロセスパラメータを適切に改良して実現することができる。特に、全ての類似する置換及び改良は、当業者にとっては自明になり、これらは本発明に含まれることを指摘すべきである。本発明に係る方法及び応用は、好ましい実施形態により説明されているが、当業者は、本発明の内容、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に係る方法及び応用に改良又は適当な変更及び組み合わせを加え、本発明に係る技術を実現して適用することができる。
ＴＣＧＡデータ分析によると、悪性腫瘍の予後不良は、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）及びナトリウム／グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ１）の過剰発現に関連していることが分かった。前記がん症は、肝臓がん、乳がん、結腸直腸がんを含む。本発明では、がん細胞でＶＥＧＦＲとＳＧＬＴ１が相互作用し、互いの機能に影響を与えることを見出した。

以下の詳細な説明を通じて、以下の実施形態が本発明において決定されている。
１）肝臓がん及び乳がんにおけるＶＥＧＦＲ２、ＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２の高発現は、がん患者の予後不良に影響を及ぼす。
２）ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路に対するＳＧＬＴ１の影響。
３）肝臓がん細胞におけるＶＥＧＦＲ２チロシンキナーゼ阻害剤の感受性に対するＳＧＬＴ１の阻害効果。
４）ＳＧＬＴ１の正常な機能に対するＶＥＧＦＲ２の影響。
５）ＶＥＧＦＲ２とＳＧＬＴ１の間の相互作用。
６）腫瘍細胞に対するＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１阻害剤の単剤及び組成物の作用効果。
７）ヌードマウス移植腫瘍に対するＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１阻害剤単剤及び組成物の作用効果。
本発明の試験結果は、以下の通りである。
（１）ＶＥＧＦＲ２とＳＧＬＴ１の高発現は、正の相関があるとともにがん患者の予後不良に関連する。
一実施形態において、肝臓がん、乳がん患者のＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１の高発現は、予後不良と正の相関があり、且つＶＥＧＦＲ２の高発現は、ＳＧＬＴ１の高発現とも正の相関がある。他の実施形態において、ＳＧＬＴ１をノックダウンしてＶＥＧＦＲ２シグナル伝達を破壊する場合には、ＶＥＧＦＲ２チロシンキナーゼ阻害剤に対する対応する腫瘍細胞株の感受性が高まるが、更に他の実施形態において、ＶＥＧＦＲ２をノックダウンすると、同様にＳＧＬＴ１機能も損傷し、且つＳＧＬＴ１とＶＥＧＦＲ２の間にも直接的な相互作用がある。これら全てのデータは、ＶＥＧＦＲ２の発現及び血管内皮細胞は、血管新生を誘導して腫瘍の進展を促進し、腫瘍細胞自体でＳＧＬＴ１との相互作用を通じて腫瘍細胞のエネルギー代謝及び増殖シグナルを調節できることを示す。従って、実施形態において、ＳＧＬＴ１は、ＶＥＧＦＲ２の機能に関与するタンパク質であり、ＶＥＧＦＲ２－ＳＧＬＴ１相互作用は、がん治療の新規の標的であり得る。

研究によると、ＶＥＧＦＲ２は、血管内皮細胞で高度に発現しているだけではなく、あるがん細胞でも高度に発現し、ＳＧＬＴ１は、前立腺がんで明確に高発現していることを示す（ＨｕａｎｇＪ、 ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ＶＥＧＦＲ２ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ． ２０１１； ６４：３４３-３４８． Ｂｌｅｓｓｉｎｇ Ａ 、ｅｔ ａｌ．Ｓｏｄｉｕｍ／Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｃｏ－ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｄ Ｐｒｏｓｔａｔｅ、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．Ｔｈｅｒ．４（９）：３０６－３１２（２０１２） ）。本発明は、ＴＣＧＡデータベースからＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２の発現量と肝臓がん及び結腸直腸がん患者の全生存期間に生存分析を行ったところ、ＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１の高発現は、肝臓がん、結腸直腸がん患者の予後不良と正の相関があるが、ＳＧＬＴ２にはそのような相関関係はない。図１Ａ、１Ｂに示すように、例としてのみＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１の高発現がこれらの２つのがん患者の予後不良に関連していることが証明されており、両方の腫瘍細胞自体における発現と予後との関係を示している。これは、本発明に係る実施形態の組成物が肝臓がん及び結腸直腸がんのみに使用されるのに限定するものではない。例えば、他の実施形態において、組成物は子宮頸がん、卵巣がん、胃がん、食管がん、胆管がん細胞株に阻害効果を有意に有し、図９ｂ－９ｆに示すようになる。
更に他の実施形態において、本発明は、ピアソンのカイ二乗検定でＴＣＧＡデータベースから取得されるＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２の、肝臓がん及び乳がん腫瘍患者での発現量データに相関解析を行うことによりＶＥＧＦＲ２とＳＧＬＴ１の発現の間に正の相関があるが、ＳＧＬＴ２の発現量との間に相関関係はなく、図２Ａ、２Ｂに示すようになる。これは、ＶＥＧＦＲ２とＳＧＬＴ１の機能に一定の相関関係がある可能性が高いことを示している。ＴＣＧＡデータから示すＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１の肝臓がんに対する重要性を検証するために、本発明は、肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３ＢにおいてそれぞれＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１をノックダウンしてヌードマウス移植実験を行ったところ、ＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１をノックダウンした細胞株は、ヌードマウスへの移植による腫瘍形成能が有意に低減したことを示し、これらの２つの遺伝子が腫瘍の発症及び進展に重要な役割を果たすことが明らかになり、図３に示すようになる。

（２）ＶＥＧＦＲ２とＳＧＬＴ１は互いの機能に影響を与える。
本発明に記載のデータ解析から導き出された推論によれば、一実施形態において、本発明は、レンチウイルスを使用して細胞を感染させ、用ｓｈＲＮＡ技術を利用して肝臓がんＨｅｐ３Ｂ細胞においてそれぞれＶＥＧＦＲ２、ＳＧＬＴ１及びＳＧＬＴ２をノックダウンし、互いの機能の相互影響を検証する。ＥＲＫ１／２は、ＶＥＧＦＲ２チロシンキナーゼ活性化後の下流分子であり、ＶＥＧＦＲ２が活性化された後にＥＲＫ１／２のリン酸化を引き起こす（Ｇｉａｔｒｏｍａｎｏｌａｋｉ Ａ、 ｅｔ ａｌ． Ｈｙｐｏｘｉａ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＶＥＧＦ／ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ． Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１０； ３０：２８３１-２８３６．）。一実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦＲ２、ＳＧＬＴ１及びＳＧＬＴ２をノックダウンした後のリン酸化ＥＲＫ１／２の強度を評価し、ＳＧＬＴ１／２のノックダウンがＶＥＧＦＲ２シグナルに影響を与えるか否かを判断する。結果は、図４に示すように、ＳＧＬＴ１のノックダウンはＶＥＧＦＲ２のノックダウンと一致し、どちらもＥＲＫ１／２のリン酸化強度のダウンレギュレーションを誘導しているが、ＳＧＬＴ２のノックダウンはその影響がない。ＳＧＬＴ１をノックダウンすることによりＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路の破壊が生じる場合には、ＳＧＬＴ１をノックダウンした対応する細胞はＶＥＧＦＲ２をノックダウンした細胞と同様にＶＥＧＦＲ２阻害剤に対してより感受性が高く、本発明は、ＶＥＧＦＲ２阻害剤であるＡｐａｔｉｎｉｂのみを例として、対照細胞及びＶＥＧＦＲ２、ＳＧＬＴ１及びＳＧＬＴ２をノックダウンした各細胞株を９６ウェルプレートに塗り広げ、異なる濃度のＡｐａｔｉｎｉｂを加えて各群細胞を処置し、ＭＴＴ法により各群細胞に対するＡｐａｔｉｎｉｂのＩＣ５０値を測定する。結果は、図５に示すように、ＳＧＬＴ１のノックダウンは、ＶＥＧＦＲ２のノックダウンと一致し、ＡｐａｔｉｎｉｂのＩＣ５０値を半分以上低減させるが、ＳＧＬＴ２のノックダウンにはそのような効果はない。ＳＧＬＴ１は、は、細胞が濃度勾配に逆らって外部環境からグルコースを吸収するためのエネルギーを提供することはよく知られている（Ｔｈｏｒｅｎｓ Ｂ、 Ｍｕｅｃｋｌｅｒ Ｍ． Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ２１^ｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ－Ｅｎｄｏｃ Ｍ ２０１０；２９８：Ｅ１４１－５． ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｅｎｄｏ．００７１２．２００９）。従って、ＳＧＬＴ１をノックダウンした腫瘍細胞は、低糖培養条件下でグルコース供給の不足により優先的に死滅する。本発明の一実施態様において低糖培地を使用してＶＥＧＦＲ２、ＳＧＬＴ１及びＳＧＬＴ２をノックダウンした肝臓がんＨｅｐ３Ｂ細胞を培養し、細胞状態を光学顕微鏡下で一定の期間毎に観察した結果は、図６に示し、ＶＥＧＦＲ２のノックダウンは、ＳＧＬＴ１のノックダウンと一致しグルコース欠乏に対する細胞の耐性を低減させることができるが、ＳＧＬＴ２をノックダウンしてもそのような効果はない。上記により、本発明は、ＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１の２つの分子の間に機能的相互作用があることを初回に発見している。
本発明は、肝臓がんＨｅｐ３Ｂ細胞のみを例として各遺伝子をノックダウンしてそれらの相互影響を評価し、本発明で得られた結論はこのがんのタイプ及び細胞株に限定されないことを指摘すべきである。

（３）ＶＥＧＦＲ２とＳＧＬＴ１には分子間相互作用がある。
本発明において初回に発見されたＶＥＧＦＲ２とＳＧＬＴ１の間に機能的相互作用がある上で、本発明は、実施形態において、ＶＥＧＦＲ２とＳＧＬＴ１との間の分子間相互作用を共免疫沈降実験により特定する。Ｆｌａｇタグ付きＳＧＬＴ１を発現するプラスミドで単独してトランスフェクションするか、又は無血清ＤＭＥＭ培地で指定されたＧＦＰタグ付きＶＥＧＦＲ２ベクターと混合し、トランスフェクション試薬ＰＥＩを添加した後に共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションする。トランスフェクション６時間後に１０％血清培地に交換し、培地を交換してから２４時間後、培地を捨て、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍｌで洗浄し、細胞を吹いて１５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨てて得られた細胞ペレット沈澱にプロテアーゼ阻害剤混合物が追加されたＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１．０％ Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０（ＮＰ－４０）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム及び０．１％ラウリル硫酸ナトリウムを有する）を加え、シェーカーで４℃、３０分間溶解した。その後、細胞溶解物を１２０００×ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清にＦｌａｇ抗体と結合したＭ２マイクロビーズを加え、４℃で一晩インキュベートした。次いで、サンプルを遠心分離し、ＲＩＰＡバッファーで３回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｅバッファー（Ｂｉｏｒａｄ、ＣＡ）中で煮沸し、８％ ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルでウエスタンブロット解析を行う。ＩＰ＝免疫沈降、ＩＢ＝イムノブロット、及びＩｎｐｕｔ＝免疫沈降に使用されるＨＥＫ２９３全細胞溶解物中で指定された外来タンパク質の発現レベルである。結果は、図７に示す。

（４）ＳＧＬＴ１阻害剤によるＳＧＬＴ１の阻害は、肝臓がん、結腸直腸がん細胞をＶＥＧＦＲ２阻害剤に対して感受性にしている。
図８、図９は、例としてのみ肝臓がんＨｅｐＧ２細胞株、結腸直腸がん細胞株ＳＷ６２０及び他の５つの通常のがん細胞株でＶＥＧＦＲ２阻害剤であるアパチニブ、ＳＧＬＴ１阻害剤であるソタグリフロジ単剤及び組成物のＩＣ５０値を評価することを説明している。これらの結果に基づいて、一実施形態において、ＳＧＬＴ１及びＶＥＧＦＲ２機能の同時阻害は、がん細胞の増殖をより効果的に阻害することができる。他の実施形態において、ソタグリフロジを例としてのＳＧＬＴ１阻害剤は、肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂによるヌードマウスへの移植腫瘍をアパチニブの増殖阻害効果に対して顕著に感受性にしていることは、図１０に示す。実施形態において、患者にソタグリフロジなどのＳＧＬＴ１阻害剤類化合物を静脈内、経口投与してがんを治療することができる。他の実施形態において、ソタグリフロジなどのＳＧＬＴ１阻害剤類化合物をＶＥＧＦＲ２チロシンキナーゼ阻害剤とともに患者に投与してがんを治療することができる。
本発明で提供されるがん治療用組成物及びその応用、並びに医薬品に使用される試薬又は機器は、いずれも市販として購入されることができる。
以下、実施例により本発明をさらに説明する。

実施例１
１、細胞及び試薬
本発明で使用される肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、結腸直腸がん細胞株ＳＷ６２０、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８０、ＬＯＶＯ、ＨＴ２９、ＤＬＤ１、子宮頸がんＨｅＬａ；卵巣がんＳＫＯＶ３、胃がんＮＧＣ２７、胆管がんＲＢＥ、食管がんＫＹＳＥ３０及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、いずれもアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に由来するとともに、５％ＣＯ_２含有３７℃のインキュベーターで培養し、前記細胞株の維持培地は、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｉｃｏ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｉｃｏ）を追加したＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｉｃｏ）である。マウス抗Ｆｌａｇタグ抗体（Ｆ３１６５）、Ｆｌａｇ抗体結合Ｍ２マイクロビーズは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入され、マウス抗ＧＦＰタグ抗体、ウサギＧＡＰＤＨ内部コントロール抗体及びホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ウサギおよびマウスの二次抗体は、博奥龍公司から購入された。Ｓｏｔａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ、アパチニブ及びレンバチニブは、いずれもＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、 ＴＸ）から購入された。抗ｐＥＲＫの抗体（４３７０）は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ、 ＭＡ）から購入された。ＭＴＴキット（カタログ番号 ３０－１０１０Ｋ）は、ＡＴＣＣから購入された。

２、プラスミドの構築
ヒト野生型ＶＥＧＦＲをＰＥＧＦＰ－Ｎ１ベクターにクローン化し、ヒト野生型ＳＧＬＴ１配列をＰＣＤＨ－ＥＦ１－ＣＭＶベクターにクローン化した。次のＳｇｌｔ１－１ ｓｈＲＮＡ配列：５’－ ＡＧＧＡＧＡＧＣＣＴＡＴＧＡＣＣＴＡＴＴＴ－３’、Ｓｇｌｔ１－２ ｓｈＲＮＡ配列：５’－ＧＣＣＴＧＡＴＧ ＣＴＡＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣ－３’、Ｓｇｌｔ２－１ ｓｈＲＮＡ配列：５’－ＧＣＡＴＡＴＴＴＣＣＴＧＣ ＴＧＧＴＣＡＴＴ－３’、Ｓｇｌｔ２－２ ｓｈＲＮＡ配列：５’－ＧＧＴＣＡＴＣＡＣＧＡＴＧＣＣＡＣＡＧＴＡ－３’、Ｖｅｇｆｒ２－１ ｓｈＲＮＡ配列：５’－ＧＡＴＧＡＡＡＧＴＴＡＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴ－３’、Ｖｅｇｆｒ２－２ ｓｈＲＮＡ配列：５’－ＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴＡＣＧＧＴＣＴＡＴＧＣ－３’配列を標的とするｓｈＲＮＡをｐＬＶＸ－ｓｈＲＮＡ２－ｐｕｒｏベクターに構築し、次いでレンチウイルスをパッケージングしてＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２、ＶＥＧＦＲ２のノックダウン細胞株を構築するのに使用された。全てのベクターは、シーケンシングにより正しいプラスミドとして検証された。

３、一過性のトランスフェクション及び共免疫沈降
Ｆｌａｇタグ付きＳＧＬＴ１を発現するプラスミドで単独してトランスフェクションするか、又は無血清ＤＭＥＭ培地で指定されたＧＦＰタグ付きＶＥＧＦＲ２ベクターと混合し、トランスフェクション試薬ＰＥＩを添加した後、共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションする。トランスフェクション６時間後に１０％血清培地に交換し、培地を交換してから２４時間後、培地を捨て、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍｌで洗浄し、細胞を吹いて１５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を捨てて得られた細胞ペレット沈澱にプロテアーゼ阻害剤混合物が追加されたＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１．０％ Ｉｇｅｐａｌ ＣＡ－６３０（ＮＰ－４０）、０．５％デオキシコール酸ナトリウム及び０．１％ラウリル硫酸ナトリウムを有する）を加え、シェーカーで４℃、３０分間溶解した。その後、細胞溶解物を１２０００×ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をＦｌａｇ抗体と結合したＭ２マイクロビーズに加え、４℃で一晩インキュベートした。次いで、サンプルを遠心分離し、ＲＩＰＡバッファーで３回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｅバッファー（Ｂｉｏｒａｄ、ＣＡ）中で煮沸し、８％ ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルでウエスタンブロット解析を行う。

４、ウエスタンブロット解析
ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）解析は、細胞を適当な体積のＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．４、０．１％ ＳＤＳ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１％デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、脱イオン水中）で４℃または氷上で３０分間以上溶解させた。１２０００×ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清はＢＣＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用してタンパク質濃度を測定した後、５×ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを加えて１００℃で１０分間煮沸した。短時間の遠心分離後、サンプルを１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる電気泳動で分離し、ＰＶＤＦ膜にトランスファーし、次いで５％スキムミルクで１時間以上ブロッキングし、その後、４℃で一次抗体と最適濃度で一晩インキュベートした。膜を０．１％ ＰＢＳＴ（１×ＴＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）で毎回１０分間３回洗浄し、その後、二次抗体と室温で１時間インキュベートした。化学発光を増強させることにより信号を可視化した。

５、細胞増殖アッセイ
メーカーが提供するプロトコルによると、検出原理は、生細胞のミトコンドリア内のコハク酸デヒドロゲナーゼが外因性ＭＴＴを水不溶性の青紫色結晶ホルマザン（Ｆｏｒｍａｚａｎ）に還元し、細胞に沈着させることができるが、死んだ細胞はその機能を持たない。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、ホルマザンを細胞に溶解することができ、マイクロプレートリーダーを使用してその光吸収値を５７０ｎｍの波長で測定し、生細胞の数を間接的に反映できる。９６ウェルプレートでは３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイにより細胞増殖を特定した。具体的には、細胞を消化してカウントし、細胞を培地２００μＬあたり５０００個の細胞を含むシステムに再懸濁し、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。翌日、培地を、異なる濃度のソタグリフロジ、アパチニブ、レンバチニブ及びそれらの組成物を含む培地と交換した。医薬品と４８又は７２時間インキュベートした後、ＭＴＴ試薬２０μＬを各ウェルに追加し、２時間インキュベートした。培地を捨て、細胞内のホルマザンペレットをＤＭＳＯ１００μＬに溶解させた。マイクロプレートリーダーにより５７０ｎｍで吸光度を測定した。各群あたり４つのサンプルを使用した。

６、ヌードマウス移植腫瘍への薬効評価
Ｈｅｐ３Ｂ細胞を１０％血清ＤＭＥＭ培地で培養し、対数増殖期に達した後、消化してカウントし、本発明の前期条件下で研究すると、Ｈｅｐ３Ｂ細胞を５×１０^６ｃｅｌｌ／匹でＢａｌｂｃヌードマウス（維通利華から購入される）の脇の下に皮下播種した後、約２１日で移植腫瘍を形成した。従って、本発明は、各ヌードマウスあたり５×１０^６個の細胞の用量を採用し、腫瘍が約２１日で平均体積１００ｍｍ^３に成長した後に群分け投与を開始した。投与は、溶剤対照群、アパチニブ５０ｍｇ／ｋｇ経口投与群、ソタグリフロジ２０ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射投与群、アパチニブ５０ｍｇ／ｋｇ経口投与しながらソタグリフロジ２０ｍｇ／ｋｇ腹腔注射する併用投与群に分けられた。投与周期は、隔日であり、毎週火曜日、金曜日に腫瘍体積を測定し、数式Ｖ＝ａ×ｂ^２／２に従って腫瘍体積を算出した（ａは、腫瘍長径の測定値であり、ｂは、腫瘍短径の測定値である）。測定結果は、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍ ５によりグラフ化して統計解析した。
７、統計解析
ｔ検定を使用してソタグリフロジ、アパチニブ、レンバチニブなどのＳＧＬＴ１及びＶＥＧＦＲ２阻害剤の異なる濃度、異なる組み合わせ条件で処置された細胞増殖の違い及びヌードマウス移植腫瘍増殖の違いを評価した。０．０５未満のＰ値は、統計学的に有意であると定義される。

８、試験結果
図１は、１Ａ、１Ｂは、ＴＣＧＡデータベースから肝臓がん、結腸直腸がん患者のがん組織におけるＶＥＧＦＲ２の発現レベルと患者全生存期間の相関性を分析することにより、ＶＥＧＦＲ２の高発現を示す患者の全生存期間はより短いであると結論付け、１Ｃ、１Ｄは、ＴＣＧＡデータベースから肝臓がん、結腸直腸がん患者のがん組織におけるＳＧＬＴ１の発現レベルと患者全生存期間の相関性を分析することにより、ＳＧＬＴ１高発現を示す患者の全生存期間はより短いであると結論付け、ＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１の高発現は、これらの２つのがん患者の予後不良と関連することを証明し、腫瘍細胞自体の両方の発現と予後の関係を説明した。
図２は、２Ａは、さらにピアソンのカイ二乗検定により分析し、ＴＣＧＡデータベースから肝臓がん患者のがん組織におけるＶＥＧＦＲ２の発現レベルとＳＧＬＴ１の発現レベルが正の相関があることを示し、２Ｂは、さらにピアソンのカイ二乗検定により分析し、ＴＣＧＡデータベースから結腸直腸がん患者のがん組織におけるＶＥＧＦＲ２の発現レベルとＳＧＬＴ１の発現レベルが正の相関があることを示した。ＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１の両方の機能には一定の相関関係がある可能性が高いことを示した。
図３は、肝臓がん細胞株におけるＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１をノックアウトした損傷細胞の、ヌードマウスでの腫瘍形成能を示し、ＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１の２つの遺伝子が腫瘍の発症及び進展に重要な役割を果たすことが明らかになる。
図４は、ｓｈＲＮＡ技術を使用して肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３ＢでＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２及びＶＥＧＦＲ２をノックダウンした後、ウェスタンブロッティング法によりＶＥＧＦＲ２の下流シグナル伝達経路ＥＲＫ１／２のリン酸化強度の変化を検出し、ＳＧＬＴ１のノックダウンはＶＥＧＦＲ２のノックダウンと一致し、ＥＲＫ１／２のリン酸化強度を低減させるが、ＳＧＬＴ２のノックダウンはそのような効果がない。ＳＧＬＴ１のノックダウンは、ＶＥＧＦＲ２のノックダウンと一致しＥＲＫ１／２リン酸化強度ダウンレギュレーションを誘導するが、ＳＧＬＴ２のノックダウンはそのような効果がないことを示した。
図５は、ｓｈＲＮＡ技術を使用して肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３ＢでＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２及びＶＥＧＦＲ２をノックダウンした後に、それぞれＶＥＧＦＲ２阻害剤Ａｐａｔｉｎｉｂで対照群細胞及びＶＥＧＦＲ２、ＳＧＬＴ１及びＳＧＬＴ２をノックダウンした細胞を処置し、各細胞株に対する異なる濃度のａｐａｔｉｎｉｂの増殖阻害を検出し、半数阻害濃度であるＩＣ５０値を計算し、ＳＧＬＴ１のノックダウンは、ＶＥＧＦＲ２のノックダウンと一致しａｐａｔｉｎｉｂのＩＣ５０値を低減させることができるが、ＳＧＬＴ２のノックダウンはそのような効果がない。
図６は、ｓｈＲＮＡ技術を使用して肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３ＢでＳＧＬＴ１、ＳＧＬＴ２及びＶＥＧＦＲ２をノックダウンした後、対照群の細胞及びＶＥＧＦＲ２、ＳＧＬＴ１及びＳＧＬＴ２をノックダウンした細胞について、それぞれ低糖ＤＭＥＭ培地でグルコース欠乏に対する各細胞株の耐性を検出し、ＶＥＧＦＲ２のノックダウンは、ＳＧＬＴ１のノックダウンと一致しグルコース欠乏に対する細胞の耐性を低減させることができるが、ＳＧＬＴ２のノックダウンはそのような効果がない。
図７は、ＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１にはタンパク質相互作用があり、ＦＬＡＧタグ付きＳＧＬＴ１及びタグなしのＶＥＧＦＲ２ベクターを共免疫沈降法で２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションし、２４時間後に細胞を溶解させ、ＦＬＡＧビーズを加えて５時間結合させ、ＶＥＧＦＲ２抗体及びＦｌａｇ抗体を使用してウェスタンブロッティングを行った。結果は、ＶＥＧＦＲ２及びＳＧＬＴ１にはタンパク質相互作用があることを示した。
図８は、ＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤を使用して肝臓がん細胞株ＨｅｐＧ２を処置し、ＭＴＴ法によりそれぞれＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤の単剤及び両方の異なる用量の組成物の併用投与のＶＥＧＦＲ２阻害剤のＩＣ５０値を測定した。組成物が肝がん細胞株に対して有意な阻害効果を有することを証明した。
図９は、図９ａは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤で結腸直腸がん細胞株ＳＷ６２０を処置した効果を示し、図９ｂは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤で子宮頸がん細胞株ＨｅＬａを処置した効果を示し、図９ｃは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤で卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を処置した効果を示し、図９ｄは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤で胃がん細胞株ＮＧＣ２７を処置した効果を示し、図９ｅは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤で胆管がん細胞株ＲＢＥを処置した効果を示し、図９ｆは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤で食道がん細胞株ＫＹＳＥ３０を処置した効果を示し、組成物が結腸直腸がん細胞株、子宮頸がん細胞株、卵巣がん細胞株、胃がん細胞株、胆管がん細胞株、食道がん細胞株に対して有意な阻害効果を有することを証明した。
図１０は、ＶＥＧＦＲ２阻害剤及びＳＧＬＴ１阻害剤を使用して肝臓がん細胞株Ｈｅｐ３Ｂによるヌードマウス移植腫瘍を処置し、ＶＥＧＦＲ２阻害剤（５０ｍｇ／ｋｇ）、ＳＧＬＴ１阻害剤（２０ｍｇ／ｋｇ）単剤及び両方の組成物の併用投与による腫瘍増殖への阻害効果を示した。組成物が腫瘍増殖に対して有意な阻害効果を有することを証明した。

実施例２
図８、図９、図１０は、アパチニブを代表的なＶＥＧＦＲ２阻害剤としてＳＧＬＴ１阻害剤と併用して、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの治療効果があり、本発明では、肝臓がん細胞株を使用して現在、臨床的および臨床試験のすべてのＶＥＧＦＲ２阻害剤とＳＧＬＴ１阻害剤との併用投与の效果を検証した。結果は、アキシチニブ（Ａｘｉｔｉｎｉｂ）（図１１－１）、ニンテダニブ（Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ、 ＢＩＢＦ １１２０） （図１１－２）、セジラニブ（Ｃｅｄｉｒａｎｉｂ、 ＡＺＤ２１７１） （図１１－３）、パゾパニブ塩酸塩（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ ＨＣｌ、 ＧＷ７８６０３４ ＨＣｌ） （図１１－４）、スニチニブリンゴ酸塩（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ Ｍａｌａｔｅ） （図１１－５）、ブリバニブ（Ｂｒｉｖａｎｉｂ、 ＢＭＳ－５４０２１５） （図１１－６）、カボザンチニブ（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ （ＸＬ１８４、 ＢＭＳ－９０７３５１） （図１１－７）、ブリバニブアラニナート（Ｂｒｉｖａｎｉｂ Ａｌａｎｉｎａｔｅ 、 ＢＭＳ－５８２６６４） （図１１－８）、レンバチニブ（Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ、 Ｅ７０８０） （図１１－９）、レゴラフェニブ（Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ、 ＢＡＹ ７３－４５０６） （図１１－１０）、ＥＮＭＤ－２０７６（図１１－１１）、チボザニブ（Ｔｉｖｏｚａｎｉｂ、 ＡＶ－９５１） （図１１－１２）、ポナチニブ（Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ 、 ＡＰ２４５３４） （図１１－１３）、ＥＮＭＤ－２０７６酒石酸塩（ＥＮＭＤ－２０７６ Ｌ－（＋）－Ｔａｒｔａｒｉｃ ａｃｉｄ ） （図１１－１４）、テラチニブ（Ｔｅｌａｔｉｎｉｂ） （図１１－１５）、タキシフォリン（Ｔａｘｉｆｏｌｉｎ、 Ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ） （図１１－１６）、パゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ） （図１１－１７）、カボザンチニブリンゴ酸塩（Ｃａｂｏｚａｎｔｉｎｉｂ ｍａｌａｔｅ、 ＸＬ１８４） （図１１－１８）、ビタミンＥ（Ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ） （図１１－１９）、レゴラフェニブ水合物（Ｒｅｇｏｒａｆｅｎｉｂ Ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ） （図１１－２０）、ニンテダニブエタンスルホン酸塩（Ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ Ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ Ｓａｌｔ） （図１１－２１）、レンバチニブメシル酸塩（ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ Ｍｅｓｙｌａｔｅ） （図１１－２２）、セジラニブマレイン酸塩（Ｃｅｄｉｒａｎｉｂ Ｍａｌｅａｔｅ） （図１１－２３）、４－［（１Ｅ）－２－［５－［（１Ｒ）－１－（３，５－ジクロロ－４－ピリジル）エトキシ］－１Ｈ－インダゾール－３－イル］ビニル］－１Ｈ－ピラゾール－１－エタノール（ＬＹ２８７４４５５） （図１１－２４）、スニチニブ（Ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ） （図１１－２５）、シトラバチニブ（Ｓｉｔｒａｖａｔｉｎｉｂ 、ＭＧＣＤ５１６） （図１１－２６）、アンロチニブ（Ａｎｌｏｔｉｎｉｂ （ＡＬ３８１８） ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ） （図１１－２７）、ソラフェニブ（図１１－２８）、バンデタニブ（図１１－２９）、フルキンチニブ（１１－３０）などの医薬品とＳＧＬＴ１阻害剤との併用はいずれも単剤よりも優れた腫瘍阻害效果を有することを示した。

結論
本発明は、ＳＧＬＴ１とＶＥＧＦＲ２が相互作用を有し、且つこの相互作用が互いの機能において重要な役割を果たし、ＶＥＧＦＲ２のノックダウンは、腫瘍細胞増殖及び成長シグナルの伝達に影響を与えるだけではなく、ＳＧＬＴ１機能にも影響を及ぼし、逆に、ＳＧＬＴ１のノックダウンは、低糖状態下でのがん細胞の生存に影響を与えるだけではなく、ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達経路及び細胞増殖にも影響を及ぼす。従って、ＶＥＧＦＲ２阻害剤とＳＧＬＴ１阻害剤からなる組成物は、腫瘍増殖に対して有意な阻害効果を有し、該組成物は、腫瘍抑制に対して有意な相乗効果を有する。

上記は、本発明の好ましい実施形態にすぎず、本発明の原理から逸脱することなく、当業者にとっては、若干の改良及び修飾を加えてもよく、これらの改良及び修飾も本発明の保護範囲に含まれることを理解すべきである。

Claims (7)

1. ナトリウム／グルコース共輸送体１阻害剤及び血管内皮細胞増殖因子受容体阻害剤を含むことを特徴とする組成物であって、
   前記ナトリウム／グルコース共輸送体１阻害剤はソタグリフロジであり、
   前記血管内皮細胞増殖因子受容体阻害剤は、アパチニブ、アキシチニブ、ニンテダニブ、セジラニブ、パゾパニブ塩酸塩、スニチニブリンゴ酸塩、ブリバニブ、カボザンチニブ、ブリバニブアラニナート、レンバチニブ、レゴラフェニブ、ＥＮＭＤ－２０７６、ＥＮＭＤ－２０７６酒石酸塩、チボザニブ、ポナチニブ、フルキンチニブ、テラチニブ、タキシフォリン、パゾパニブ、カボザンチニブリンゴ酸塩、ビタミンＥ、レゴラフェニブ水合物、ニンテダニブエタンスルホン酸塩、レンバチニブメシル酸塩、セジラニブマレイン酸塩、４－［（１Ｅ）－２－［５－［（１Ｒ）－１－（３，５－ジクロロ－４－ピリジル）エトキシ］－１Ｈ－インダゾール－３－イル］ビニル］－１Ｈ－ピラゾール－１－エタノール、スニチニブ、シトラバチニブ、アンロチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ及び血管内皮細胞増殖因子受容体を標的とするモノクローナル抗体類医薬品から選ばれる少なくとも１つであり、
   前記ナトリウム／グルコース共輸送体１阻害剤の投与量は、１～１００ｍｇ／ｋｇである、前記組成物。
2. 前記ナトリウム／グルコース共輸送体１阻害剤の投与量は、１０～５０ｍｇ／ｋｇである、ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
3. 前記血管内皮細胞増殖因子受容体阻害剤の投与量は、１０～５００ｍｇ／ｋｇである、ことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
4. 前記血管内皮細胞増殖因子受容体阻害剤の投与量は、１０～１００ｍｇ／ｋｇである、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
5. がんの治療に使用するための、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 前記がんは、膀胱がん、血液がん、骨がん、脳がん、乳がん、中枢神経系がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胆嚢がん、胃腸がん、外生殖器がん、泌尿生殖器がん、頭部がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、筋肉組織がん、頸部がん、口腔または鼻粘膜がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、脾臓がん、小腸がん、大腸がん、胃がん、精巣がん及び／又は甲状腺がんを含む、ことを特徴とする請求項５に記載の使用のための組成物。
7. 請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物を含む、ことを特徴とするがん治療に使用するための医薬品。