JP2016533170A - 抗ｓｏｘ１０抗体のシステムおよび方法 - Google Patents

抗ｓｏｘ１０抗体のシステムおよび方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗ＳＯＸ１０抗体、キット、カクテル、および、がんを検出するための抗ＳＯＸ１０抗体の使用に関する。本発明の実施形態は、高度に感度が高い可能性があり、さらには、高度に特異的である可能性がある、抗ＳＯＸ１０マウスモノクローナル抗体［クローンＢＣ３４］を提供する。本発明の実施例は、これだけに限定されないが、黒色腫、紡錘細胞黒色腫、線維形成性黒色腫、母斑、シュワン細胞腫、乳がん、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫などを含めたある特定のがんにおいてＳＯＸ１０タンパク質が存在するか存在しないかを検出し得るマウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体を提供する。

Description

本出願は、２０１３年１０月３日に出願された米国仮出願第６１／８８６，４８８号および２０１４年２月１９日に出願された米国仮出願第６１／９４１，９０７号に対する優先権および利益を主張する国際ＰＣＴ特許出願であり、それぞれの出願はその全体が本明細書に参考として援用される。
本発明は、新規の抗ＳＯＸ１０抗体、組成物、カクテル、および抗体を含むキット、ならびに抗体を使用するための方法に関する。
疾患の診断に関しては、組織試料、特に生検によって得られる組織試料の顕微鏡検査が一般的な方法である。特に、特異的抗体を使用して組織試料における特定のタンパク質の発現を検出する技法である免疫組織化学（ＩＨＣ）は、診断、特にがんの検出および診断のための有益なツールであり得る。
おそらく第２２染色体ｑ１３に位置するＳＲＹ関連ＨＭＧ−Ｂｏｘ遺伝子１０は、おそらく、神経堤、末梢神経系、およびメラニン細胞の発達のために重要であり得る、ヒトにおける転写因子であるＳＯＸ１０として公知のタンパク質をコードする可能性がある。ＳＯＸ１０は、大腸における神経、およびメラノサイトの形成に必須である可能性がある。メラノサイトは、おそらく、皮膚、眼、および毛髪に見いだされる、色素を産生する細胞である。ＳＯＸ１０タンパク質は、メラノサイト、乳房組織、脳神経節、後根神経節、および眼胞を含めたヒト正常組織において広範に発現し得る。ＳＯＸ１０は、おそらく、例えば黒色腫、乳癌、神経膠腫などの悪性腫瘍、ならびに例えばシュワン細胞腫などの良性腫瘍における重要なマーカーでもあり得る。転写因子ＳＯＸ１０は、乏突起膠細胞の分化の重要な決定因子のうちの１つであり得る。大多数の乏枝神経膠腫、最低限に分化した神経膠芽腫である星状細胞腫の大部分も、おそらくＳＯＸ１０を発現する。
線維形成性黒色腫は、浸潤性皮膚黒色腫の稀なバリアントであり得、年間発生率はおそらく、およそ１，０００，０００人に２人である。この黒色腫型に独特の特徴は、深部浸潤、神経周囲浸潤の増加、局所再発、および、おそらく診断の遅延を含み得る。試験により、ＳＯＸ１０は、原発病変と転移性病変の両方の黒色腫についての高度に感度が高く特異的なマーカーであることが示され得る。非新生物性皮膚および良性皮膚のメラノサイトにおける発現、および良性母斑および異形成母斑における発現に基づいて、ＳＯＸ１０は、良性色素性皮膚病変と悪性色素性皮膚病変を区別するために有用なマーカーではない可能性がある。
線維形成性黒色腫（ＤＭ）には、おそらく組織学的類似物の類似性、さらには、おそらく免疫組織化学的染色の限定に起因する診断上の難題が存在する。１つの試験では、ＳＯＸ１０は、ＤＭに対して１００％の感度が示されており、おそらく、ＳＯＸ１０は、紡錘細胞癌、ＡＦＸおよび肉腫を含めた真皮／皮下組織の全ての組織学的類似物において陰性であった。抗Ｓ１００抗体は、一般にはＤＭを染色し得るが、他の黒色腫マーカー（例えば、ＨＭＢ−４５およびメランＡ）は、おそらく陰性であることも多い。
伝統的に、Ｓ１００、ＨＭＢ４５、ＭＡＲＴ−１（おそらくメランＡとしても公知である）、およびチロシナーゼなどの黒色腫マーカーが、黒色腫を同定するための抗体のパネルに使用されている場合がある。抗Ｓ１００抗体は黒色腫のスクリーナーとして使用されている場合があり、おそらく、他の黒色腫マーカーと比較してより感度の高いマーカーであり得るが、Ｓ１００は、転移性黒色腫とその類似物の共通部位であるリンパ節と脳のどちらも染色し得るので、特異性が最適以下であるという不都合があり得る。ＨＭＢ４５、ＭＡＲＴ−１およびチロシナーゼは、おそらくＳ１００タンパク質よりも特異的であり得るが、この抗体のパネルは、線維形成性黒色腫および紡錘細胞黒色腫では陰性であり得、したがって、おそらく、感度が不十分である。
ＭＡＲＴ−１およびチロシナーゼの抗体カクテルは、転移性黒色腫の非常に感度の高いマーカーであることが示されており、おそらく、さらには、Ｓ１００タンパク質に匹敵する（それぞれ約９８％対約１００％）。しかし、Ｓ１００はそれでも、線維形成性黒色腫および紡錘細胞黒色腫に対してより感度が高い可能性がある。線維形成性黒色腫および紡錘細胞黒色腫を含めた黒色腫に対する感度を有するＳＯＸ１０と、おそらく、ＭＡＲＴ−１およびチロシナーゼを含めた１種または複数種の黒色腫マーカーを組み合わせることの潜在的な利益は、おそらく、線維形成性黒色腫または紡錘細胞黒色腫に対しては感度が高くないものであっても、不明であり得る。そのような組合せにより、黒色腫についての優れたマーカーがもたらされ得る。
ＳＯＸ１０は、シュワン細胞およびメラノサイトの特異化、成熟化、および維持のために極めて重要な神経堤転写因子でもあり得る。ＳＯＸ１０はまた、シュワン細胞腫および神経線維腫において拡散的に発現し得る。おそらく、特異性の欠如が十分に特徴付けられているにもかかわらず、Ｓ１００は神経堤由来腫瘍の診断において病理医により常套的に使用され得る。最近の試験により、おそらく、ＳＯＸ１０は、シュワン細胞腫瘍およびメラニン細胞腫瘍において一貫して発現し得、おそらく、Ｓ１００に勝る利点をもたらす、神経堤分化の信頼できるマーカーであることが示されている。
ＳＯＸ１０発現は、正常な乳腺における筋上皮乳房細胞において観察され得る。ＳＯＸ１０は、基底様、未分類三重陰性、および化生性癌の乳がん型において実証されている可能性があり、おそらく、これらの新生物が筋上皮分化を示しうるという概念を支持する。肺がんでは、支持細胞は、肺カルチノイド腫瘍のおよそ半分において見いだすことができる。ＳＯＸ１０抗体を使用して、おそらく、他に分類していない（ＮＥＣ）１１３の肺の症例を調査した。支持細胞は、おそらく定型カルチノイド（ＴＣ）の６６．７％、さらには、おそらく非定型カルチノイド（ＡＣ）症例の５８．３％において観察されている可能性があるが、高悪性度のＮＥＣにおいては観察されていない可能性がある。
ＳＯＸ１０は、おそらく、Ｓ１００と比較した場合、神経堤起源の腫瘍に対する特異性の増大を示し得る。１つの試験では、ＳＯＸ１０は、非シュワン細胞腫瘍、非メラニン細胞腫瘍では、おそらく６６８症例のうち５症例においてのみ陽性であった可能性がある（９９％の特異度）が、一方Ｓ１００は、おそらく６６８症例のうち５３症例において陽性であった可能性がある（９１％の特異度）。したがって、ＳＯＸ１０は、軟部組織腫瘍の診断に関して、Ｓ１００の代わりに、または、おそらくＳ１００と組み合わせて有用であり得る。
現在まで、最も多く公開された試験では、免疫組織化学的（ＩＨＣ）方法のためにヤギポリクローナルＳＯＸ１０を使用した可能性がある。ＩＨＣ方法における使用に関して、モノクローナル抗体が好ましい場合があり、おそらく、さらには、マウスまたはウサギ抗体が好ましい場合があるので、ポリクローナルヤギ抗体は一般には好ましくない場合がある。特に、臨床的診断において使用するＩＨＣ方法に関しては、モノクローナル抗体が好ましく、おそらく、さらには、マウスまたはウサギ抗体が好ましい場合がある。紡錘細胞黒色腫および線維形成性黒色腫を他の腫瘍およびその類似物と区別するためのマーカーの明白な必要性があり得、おそらく、現在までの広範囲にわたる試みでは、そのようなマーカーはもたらされていない可能性がある。ＳＯＸ１０モノクローナル抗体は、おそらく、臨床の現場において、診断に関して高度に有益であると思われる。
したがって、がん診断において使用するための、感度が高く、さらには、特異的な抗ＳＯＸ１０抗体が明白に必要とされている。本発明の実施形態は、高度に感度が高い可能性があり、さらには、高度に特異的である可能性がある、抗ＳＯＸ１０マウスモノクローナル抗体［クローンＢＣ３４］を提供する。本発明の実施例は、これだけに限定されないが、黒色腫、紡錘細胞黒色腫、線維形成性黒色腫、母斑、シュワン細胞腫、乳がん、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫などを含めたある特定のがんにおいてＳＯＸ１０タンパク質が存在するか存在しないかを検出し得るマウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体を提供する。本発明の実施例は、他の正常組織、良性組織および悪性組織に対して、黒色腫に対する優れた感度（約１０５／１０９、約９％）、おそらく、さらには、優れた特異性が実証されている可能性がある。公知のウサギポリクローナル（ＲＰ）抗ＳＯＸ１０抗体と比較して、マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０ ＢＣ３４は、一般には、モノクローナル抗体の利点をももたらすと同時に、よりきれいな染色パターンを伴い、おそらく、より少ないアーチファクトを伴い、おそらく、多くのカルチノイドの染色は伴わず、より高い感度、および、おそらく、より高い特異性が実証されている可能性がある。ＢＣ３４はまた、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体によっては染色されている可能性があるいくつかの検体を染色しない可能性があり、おそらく、これにより、代替物に勝るＢＣ３４の優れた特異性が示される。したがって、診断のために、代替抗ＳＯＸ１０抗体を含めた代替抗体と比較して、ＢＣ３４などのモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体が好ましい場合がある。
抗ＳＯＸ１０抗体の開発は、原発性がん、さらには、転移性がん、特に黒色腫、紡錘細胞黒色腫、線維形成性黒色腫、母斑、シュワン細胞腫、乳がん、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫などの診断に役立ち得る。おそらく、例えばＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体を含めた代替抗ＳＯＸ１０抗体と比較して、同等または優れた染色感度、および、おそらく、さらには、優れた染色特異性を有するマウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体［ＢＣ３４］などの抗ＳＯＸ１０抗体が本発明で提供されている。
本発明の一般的な実施形態は、ＳＯＸ１０を認識するためのモノクローナル抗体、それらを調製するための方法、免疫組織化学における使用などを含み得る。複数の実施形態では、抗ＳＯＸ１０抗体クローンＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体クローンは、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、ヒトＳＯＸ１０タンパク質のアミノ酸１４７〜２５３のサブセットに対応する１種または複数種のタンパク質を用いて免疫することによって得ることができる。ＳＯＸ１０タンパク質を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、アジュバントと共に、腹腔内注射によって、おそらく、約３週間おきに約５回、注射することができる。ＳＯＸ１０に対する免疫反応性は、組換えＳＯＸ１０タンパク質に対する直接ＥＬＩＳＡによって評価することができる。細胞融合によってハイブリドーマを開発するために、最も高い力価を有するマウスを選択することができる。ヒト組織におけるＳＯＸ１０に対する最良の反応性が実証されるハイブリドーマクローンを選択することができ、ＢＣ３４としてデザインすることができる。ＢＣ３４クローンをアイソタイプについて試験することができ、マウスＩｇＧ１として同定することができる。ＢＣ３４抗体は、ハイブリドーマ細胞の大規模組織培養によって、およびＢＡＬＢ／ｃマウスの腹水によって産生させることができる。上清および抗体腹水を採取することができ、抗体をプロテインＡアフィニティーカラムによって精製することができる。ＢＣ３４は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、さらには、ヒト組織により、ヒトＳＯＸ１０タンパク質に対する特異的な反応性を実証し得る。
マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、組織試料のＳＯＸ１０の検出に関して、おそらく、現在公知のＳＯＸ１０に対する抗体に勝る、いくつかの有意であるが予想外の利点を伴い、有用であり得る。生体試料を試験することができ、それらとして、これだけに限定されないが、皮膚組織、肺組織、膀胱組織、乳房組織、前立腺組織、正常組織、新生物組織、膀胱組織、腎組織、卵巣組織、甲状腺組織、子宮内膜組織、腎組織、扁桃組織、膵臓組織、結腸組織、リンパ節組織、新生物膵組織、胃組織、前立腺組織、肺組織、乳房組織などを挙げることができる。従来の免疫組織化学手順において使用した場合、マウス抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体により、公知の抗ＳＯＸ１０抗体の感度と同様の、または、おそらくそれよりも優れた感度でＳＯＸ１０の核染色がもたらされ得、それにより、有意な改善がもたらされ得る。さらに、ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、おそらく、他の公知の抗ＳＯＸ１０抗体と比較して特異性の増大を示し得、これにより、有意な改善がもたらされ得る。モノクローナル供給源に由来することの可能性のある利点に加えて、ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、他の公知の抗ＳＯＸ１０抗体と比較して、よりきれいな染色をもたらし、より少ないアーチファクト、およびより高い細胞型特異性が伴い、例えば、おそらく、カルチノイドは染色されない。ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体を用いると、試料の分析を簡易化することができ、腫瘍細胞におけるＳＯＸ１０発現を容易に同定可能にすることができ、これにより、他のやり方では診断するのが難しい、不明瞭である、または、さらには、不可能であり得る症例の診断が可能になる。
図１は、胸壁の黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図２は、頭皮の黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図３は、肩の黒色腫（１０×拡大率）の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す。染色の低減、または、おそらくおよび染色の非存在がこの試料において観察され得る。 図４は、リンパ節における転移性黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図５は、気球細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図６は、類上皮細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図７は、末梢神経腫瘍の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図８は、血管周囲黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図９は、血管周囲黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図１０は、ラブドイド黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図１１は、肉腫様黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図１２は、形質細胞様黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図１３は、皮膚の複合母斑の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図１４は、頬の真皮内母斑の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図１５は、皮膚の境界母斑の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図１６は、シュワン細胞腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図１７は、正常な結腸における銀親和性細胞を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図１８は、正常な脳神経細胞を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図１９は、正常な乳腺における筋上皮細胞を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図２０は、正常な皮膚を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図２１は、正常な唾液腺を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図２２は、乳房組織、おそらく、乳がんを染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す。 図２３は、図２２と同じ乳房検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、図２２においてＢＣ３４を用いて観察されたものよりも染まり方が強くない可能性がある。 図２４は、肺組織、おそらく、肺腺癌を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、特に図２５と比較して、低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図２５は、図２４と同じ肺検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体（褐色）の例のカラー版を示す。ＳＯＸ１０に関して予測される核染色とは対照的に、この試料では細胞質染色が観察され得る。 図２６は、黒色腫を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、おそらく、図２７において観察されたものよりも染まり方が強い可能性がある。 図２７は、図２６と同じ黒色腫検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、図２６においてＢＣ３４を用いて観察されたものよりも染まり方が強くない可能性がある。 図２８は、黒色腫を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、おそらく、図２９において観察されたものよりも染まり方が強い可能性がある。 図２９は、図２８と同じ乳房検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、図２８においてＢＣ３４を用いて観察されたものと比較して低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図３０は、黒色腫を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、おそらく、図３１において観察されたものよりも染まり方が強い可能性がある。 図３１は、図３０と同じ乳房検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、図３０においてＢＣ３４を用いて観察されたものと比較して低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図３２は、正常な膀胱を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、特に図３３と比較して、低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図３３は、図３２と同じ膀胱検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体（褐色）の例のカラー版を示す。ＳＯＸ１０に関して予測される核染色とは対照的に、この試料では細胞質染色が観察され得る。 図３４は、腸カルチノイドを染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図３５は、胞巣状横紋筋肉腫（ａｌｖｅｏｌｕｓ ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図３６は、星状細胞腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図３７は、乳がんの症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図３８は、中間グレードＩＩ平滑筋肉腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図３９は、線維形成性黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図４０は、線維形成性黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図４１は、良性シュワン細胞腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図４２は、紡錘細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図４３は、紡錘細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図４４は、紡錘細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図４５は、黒色腫の症例を染色したチロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテル（赤色）の例のカラー版を示す。 図４６は、図４５に示されているのと同じ黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０［ＢＣ３４］（赤色）の例のカラー版を示す。 図４７は、黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテル（赤色）の第１の例のカラー版を示す。 図４８は、黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテル（赤色）の第２の例のカラー版を示す。 図４９は、黒色腫の症例を染色したＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す。 図５０は、チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルを用いて染色した図４９に示されているのと同じ黒色腫の症例（赤色）のカラー版を示す。おそらく、着色したメラノサイトが観察され得るにもかかわらず、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図５１は、黒色腫の症例を染色したチロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテル（赤色）の例のカラー版を示す。 図５２は、ＢＣ３４を用いて染色した、図５１に示されているのと同じ黒色腫の症例（赤色）のカラー版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図５３は、黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１（赤色）の例のカラー版を示す。 図５４は、Ｓ１００を用いて染色した、図４９に示されているのと同じ黒色腫の症例（赤色）のカラー版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図５５は、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルを用いて染色したリンパ節の例（赤色）のカラー版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図５６は、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルを用いて染色した脳の例（赤色）のカラー版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図５７は、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルを用いて染色した骨髄の例（赤色）のカラー版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図５８は、図５５に示されているのと同じリンパ節の症例においてＳ１００を用いて染色した例（赤色）のカラー版を示す。 図５９は、図５６に示されているのと同じ脳の症例においてＳ１００を用いて染色した例（赤色）のカラー版を示す。 図６０は、図５７に示されているのと同じ骨髄の症例においてＳ１００を用いて染色した例（赤色）のカラー版を示す。 図６１は、本発明の種々の実施形態によるキットの要約の概略図の例を示す。 図６２は、本発明の種々の実施形態によるイムノアッセイ法の要約の概略図の例を示す。 図６３は、胸壁の黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図６４は、頭皮の黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図６５は、肩の黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。染色の低減、または、おそらくおよび染色の非存在がこの試料において観察され得る。 図６６は、リンパ節における転移性黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図６７は、気球細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図６８は、類上皮細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図６９は、末梢神経腫瘍の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図７０は、血管周囲黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図７１は、血管周囲黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図７２は、ラブドイド黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図７３は、肉腫様黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図７４は、形質細胞様黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図７５は、皮膚の複合母斑の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図７６は、頬の真皮内母斑の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図７７は、皮膚の境界母斑の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図７８は、シュワン細胞腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図７９は、正常な結腸における銀親和性細胞を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図８０は、正常な脳神経細胞を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図８１は、正常な乳腺における筋上皮細胞を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図８２は、正常な皮膚を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図８３は、正常な唾液腺を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図８４は、乳房組織、おそらく、乳がんを染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す。 図８５は、図８４と同じ乳房検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体の例の白黒版を示す。染色は、図８４においてＢＣ３４を用いて観察されたものよりも染まり方が強くない可能性がある。 図８６は、肺組織、おそらく、肺腺癌を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す。染色は、特に図８７と比較して、低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図８７は、図８６と同じ肺検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体の例の白黒版を示す。ＳＯＸ１０に関して予測される核染色とは対照的に、この試料では細胞質染色が観察され得る。 図８８は、黒色腫を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す。染色は、おそらく、図８９において観察されたものよりも染まり方が強い可能性がある。 図８９は、図８８と同じ黒色腫検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体の例の白黒版を示す。染色は、図８８においてＢＣ３４を用いて観察されたものよりも染まり方が強くない可能性がある。 図９０は、黒色腫を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す。染色は、おそらく、図９１において観察されたものよりも染まり方が強い可能性がある。 図９１は、図９０と同じ乳房検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体の例の白黒版を示す。染色は、図９０においてＢＣ３４を用いて観察されたものと比較して低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図９２は、黒色腫を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す。染色は、おそらく、図９３において観察されたものよりも染まり方が強い可能性がある。 図９３は、図９２と同じ乳房検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体の例の白黒版を示す。染色は、図９２においてＢＣ３４を用いて観察されたものと比較して低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図９４は、正常な膀胱を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す。染色は、特に図９５と比較して、低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図９５は、図９４と同じ膀胱検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体の例の白黒版を示す。ＳＯＸ１０に関して予測される核染色とは対照的に、この試料では細胞質染色が観察され得る。 図９６は、腸カルチノイドを染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図９７は、胞巣状横紋筋肉腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図９８は、星状細胞腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図９９は、乳がんの症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図１００は、中間グレードＩＩ平滑筋肉腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図１０１は、線維形成性黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図１０２は、線維形成性黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図１０３は、良性シュワン細胞腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図１０４は、紡錘細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図１０５は、紡錘細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図１０６は、紡錘細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図１０７は、黒色腫の症例を染色したチロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルの例の白黒版を示す。 図１０８は、図３９Ａに示されているのと同じ黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０［ＢＣ３４］の例の白黒版を示す。 図１０９は、黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルの第１の例の白黒版を示す。 図１１０は、黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルの第２の例の白黒版を示す。 図１１１は、黒色腫の症例を染色したＢＣ３４の例の白黒版を示す。 図１１２は、チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルを用いて染色した図１１１に示されているのと同じ黒色腫の症例の白黒版を示す。おそらく、着色したメラノサイトが観察され得るにもかかわらず、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図１１３は、黒色腫の症例を染色したチロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルの例の白黒版を示す。 図１１４は、ＢＣ３４を用いて染色した、図１１３に示されているのと同じ黒色腫の症例の白黒版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図１１５は、黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の例の白黒版を示す。 図１１６は、Ｓ１００を用いて染色した、図４０Ａに示されているのと同じ黒色腫の症例の白黒版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図１１７は、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルを用いて染色したリンパ節の例の白黒版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図１１８は、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルを用いて染色した脳の例の白黒版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図１１９は、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルを用いて染色した骨髄の例の白黒版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図１２０は、図１１７に示されているのと同じリンパ節の症例においてＳ１００を用いて染色した例の白黒版を示す。 図１２１は、図１１８に示されているのと同じ脳の症例においてＳ１００を用いて染色した例の白黒版を示す。 図１２２は、図１１９に示されているのと同じ骨髄の症例においてＳ１００を用いて染色した例の白黒版を示す。 図１２３である。 図１２４である。 図１２５である。 図１２６である。 図１２７である。 図１２８である。 図１２９である。 図１３０である。 図１３１である。 図１３２である。 図１３３である。 図１３４である。 図１３５である。 図１３６である。 図１３７である。 図１３８である。 図１３９である。 図１４０である。 図１４１である。 図１４２である。 図１４３である。
前記の論述から理解され得る通り、本発明は、異なるやり方で組み合わせることができる種々の態様を含む。以下の説明は、要素を列挙するために提供され、本発明の実施形態のいくつかを記載するものである。これらの要素は、最初の実施形態と共に列挙されているが、これらを任意の様式および任意の数で組み合わせて、さらなる実施形態を創出することができることが理解されるべきである。多様に記載されている実施例および好ましい実施形態は、本発明を明確に記載されている系、技法、および適用だけに限定するものと解釈されるべきではない。さらに、本記載は、全ての種々の実施形態、系、技法、方法、デバイス、および適用の説明および請求項を、任意の数の開示される要素と共に、各要素単独と共に、および同様に本出願または任意のその後の出願における全ての要素の任意のかつ全ての種々の入れ替えおよび組合せと共に、支持し、包含するものと理解されるべきである。
本発明の実施形態は、ＳＯＸ１０に特異的に結合し、いくつかの型のがんに対する診断におけるＳＯＸ１０の検出のために使用することができるモノクローナル抗体およびその方法を提供し得る。モノクローナル抗体は、抗体断片、マウスモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、検出可能なシグナルまたは染色で標識された抗体、毒素で標識された抗体などであってよい。モノクローナル抗体は、１つの宿主種に由来する可変領域と異なる種に由来する定常領域、おそらく、ＳＯＸ１０に結合することが知られているマウスモノクローナル抗体に由来する可変領域とウサギＩｇＧ抗体に由来する定常領域で構成されるキメラ抗体であってよい。本発明の系および方法は、ＳＯＸ１０に結合することが可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分に関し得る。
マウスモノクローナル抗体は、免疫組織化学手順における一次抗体としての使用を含め、特異的な分析物を同定するためのイムノアッセイ法において一般に使用され得る。目的のタンパク質標的に特異的なマウスモノクローナル抗体は、一般に知られている手順を使用して産生させることができる。一般に、マウスを目的の抗原（例えば、所望の標的のペプチド断片または全長のタンパク質標的）に曝露させることにより免疫応答が誘導され得、その免疫応答では、マウスが、抗原に結合する多数の抗体を生成し、その抗体のそれぞれは、特定のＢ細胞によって産生され得る。これらのＢ細胞をマウス脾臓から単離することができ、産生された抗体を、ＩＨＣにおける一次抗体としてのそれらの適合性について評価することができる。最適な抗体を選択した後、関連するＢ細胞を、公知の手順を使用して腫瘍細胞と融合させることができ、おそらく、それにより、際限なく複製し、所望の抗体を継続的に産生することが可能な新しい細胞株であるハイブリドーマがもたらされる。
ある特定の実施形態では、いくつかの理由でポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体が好ましい場合がある。特に、モノクローナル抗体は、単一のＢ細胞由来であり得、したがって、単一のエピトープを認識することが可能であり、おそらく、それにより、より高い特異性がもたらされる。モノクローナル抗体は、細胞培養において都合よく、かつ再現性よく生成することもでき、おそらく、それにより、所望の抗体の一定した供給がもたらされる。当然、他の実施形態では、ポリクローナル抗体を利用することができる。
マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、これらの一般的な手順を使用して産生させることができ、免疫組織化学により、種々の正常組織および新生物組織に対する感度および特異性について、おそらく、特に以前より公知のＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体と比較して、評価することができる。
ＳＯＸ１０タンパク質の発現の例：アミノ酸配列１４７〜２５３由来のＳＯＸ１０組換えタンパク質をクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉにより発現させることができる。簡単に述べると、ＳＯＸ１０ ｃＤＮＡをクローニングし、精製することができる。ＳＯＸ１０ ｃＤＮＡを制限酵素によって消化し、ｐＥＴ３０ａ−ＧＳＴベクターにライゲーションすることができる。ＢＬ２１細胞を当該構築物で形質転換することができる。正確なサイズの組換えタンパク質を発現するコロニーを選択し、配列決定することができる。さらなるスケールアップ産生を、約０．５ｍＭのＩＰＴＧを含有するＬＢ培地中でＥ．ｃｏｌｉを培養することによって実施することができる。最終的なＳＯＸ１０組換えタンパク質を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析することができる。
宿主免疫の例：雌ＢＡＬＢ／ｃ（約６週齢〜約８週齢）マウスを、マウス当たり約１００μｇの完全フロイントアジュバント中ヒトＳＯＸ１０タンパク質を用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫することができる。約３週間後、マウスを、マウス当たりさらに約１００μｇの不完全フロイントアジュバント中ヒトＳＯＸ１０を用いて、さらに約４回、約３週間おきに追加刺激することができる。マウスの尾部から採血することができ、血清を採取し、後の酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による抗体価の分析のために約−２０℃で保管することができる。
ハイブリドーマの例：ＳＯＸ１０に対する抗体を産生するハイブリドーマは、ＳＯＸ１０で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞から標準の技法によって生成することができる。例えば、ＳＯＸ１０で免疫したマウス由来の脾細胞を、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＳＰ２／０ Ｂａｌｂ／ｃ骨髄腫細胞に由来する非分泌性骨髄腫）と、約４：１の比で約５０％ポリエチレングリコールと一緒にインキュベートすることによって融合することができる。インキュベートした後、細胞を、おそらく、約３００×ｇで約１０分にわたって遠心分離し、ＰＢＳ約２５ｍｌ中で洗浄し、再度遠心分離することによってペレット化することができ、細胞ペレットを、約２０％ウシ胎児血清を含有する新鮮なダルベッコ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）約１００ｍｌに再懸濁することができる。約１００μｌの一定分量を１０個の９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｌｏｗｅｌｌ、ＭＡ）の各ウェルに添加することができる。約２４時間後、約１００μｌ約１Ｍのヒポキサンチン（ＨＴ）、約４ｍＭのアミノプテリンおよび約１６０ｍＭのチミジン（ＨＡＴ）を補充したＤＭＥＭ培地を各マイクロタイターウェルに添加することができる。培地を、おそらく、約４日後に完全培地（おそらく、ＨＡＴおよびＨＴを含有する）と交換することができる。その後の約１０日にわたり、培地を除去し、ＨＡＴおよびＨＴの添加を減らした、または、おそらく、さらには、ＨＡＴおよびＨＴを添加していない新鮮な培地と交換することができる。ハイブリドーマの上清を、ＳＯＸ１０に対する抗体反応性についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができ、次いで、ハイブリドーマクローンを選択し、おそらく、限界希釈により２回クローニングすることによって安定化することができる。
抗ヒトＳＯＸ１０ハイブリドーマクローンＢＣ３４と称されるハイブリドーマ細胞は、これによって参照により本明細書に組み込まれる「Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ ｏｆ Ｄｅｐｏｓｉｔ」という表題の添付の証拠書類に示されている通り、２０１４年２月１１日に、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶｉｒｇｉｎｉａにあるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙに寄託され、ＡＴＣＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２０９６９を受けている。本発明の実施形態は、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体またはその断片を提供し得、さらには、ＳＯＸ１０を特異的に認識することが可能なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を培養し、さらには、ハイブリドーマにモノクローナル抗体を産生させることによってモノクローナル抗体を産生するための方法も含み得る。
ＥＬＩＳＡ：ＳＯＸ１０に対する宿主抗血清免疫応答は、ＥＬＩＳＡによって測定することができる。例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中ＳＯＸ１０溶液（約１μｇ／ｍｌ）を使用して、約９６ウェル平底ポリスチレンプレートをコーティングすることができる。次いで、プレートを、約１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳを用いてブロッキングすることができる。希釈した免疫血清またはハイブリドーマの上清のいずれかを添加し、約３７℃で約１時間インキュベートすることができる。プレートをＰＢＳで洗浄した後、プレートをヤギ抗マウス−ＨＲＰ試薬（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）と一緒にインキュベートすることができる。インキュベーションは、約３７℃で約３０分にわたって行うことができる。ＡＢＴＳ基質を添加して色を生じさせることができ、約４０５ｎｍにおける吸光度（Ａ４０５）をマイクロタイタープレートリーダーで測定することができる。
モノクローナル抗体のアイソタイプ：ＢＣ３４モノクローナル抗体などの抗ＳＯＸ１０抗体を、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を使用してアイソタイピングすることができる。例えば、マウスモノクローナル抗体［ＢＣ３４］細胞由来の上清約１００μｌを、ヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、およびＩｇＡをコーティングしたプレートに添加することができる。約３０分インキュベートした後、プレートをＰＢＳで約３回洗浄することができ、それをヤギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰ試薬と一緒にインキュベートすることができる。ＡＢＴＳ基質を添加して色を生じさせ、約４０５ｎｍにおける吸光度（Ａ４０５）をマイクロタイタープレートリーダーで測定することができる。ＢＣ３４クローンをアイソタイプについて試験することができ、マウスＩｇＧ１／カッパとして同定することができる。
抗体産生および精製：クローンＢＣ３４由来の選択されたハイブリドーマ細胞を、約１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地または任意の無血清培地で培養することができる。培養上清をプロテインＡアフィニティーカラムによってさらに精製することができる。また、ハイブリドーマ細胞をプリスタンで初回刺激したＢＡＬＢ／ｃマウスに注射して抗体腹水を生じさせることができる。抗体腹水をプロテインＡアフィニティーカラムによってさらに精製することができる。ＩｇＧの濃度を、マウスＩｇＧに対する吸光係数、約２８０ｎｍにおいて約１．４を使用して分光光度的に測定することができる。ＩｇＧの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定することができる。
ウエスタンブロッティング：精製されたモノクローナル抗体［ＢＣ３４］をウエスタンブロッティングによって特徴づけることができる。全長ＳＯＸ１０をトランスフェクトした細胞溶解物（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液を用いた約４％〜約１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用したタンパク質ゲル電気泳動に供することができ、Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液中ニトロセルロースフィルターに転写することができる。ブロット上のタンパク質を、ＢＣ３４抗体をブロッキング緩衝液でブロッキングした後、室温で約６０分インキュベートし、おそらく、その後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗マウス免疫グロブリンと一緒にインキュベートすることによって可視化することができる。ブロットを、ＴＭＢ色素原を使用して検出することができる。
ＶＨ配列およびＶＬ配列の決定：全ＲＮＡを、ハイブリドーマからＱｉａｇｅｎ ｋｉｔ（ＵＳＡ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を製造者の説明書の通り使用して抽出することができる。ハイブリドーマ細胞由来の全ＲＮＡを、６μＭのランダムなプライマーミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、０．５ｍＭの各ヌクレオチドｄＮＴＰ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、５ｍＭのＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４０ＵのＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、および２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含有する最終体積２０μｌで逆転写した。逆転写（ＲＴ）反応を、４２℃で５分、２５℃で１０分、５０℃で６０分および９４℃で５分、実施した。マウスＩｇｈおよびＩｇｋ可変領域を、それぞれ独立に、鋳型としてｃＤＮＡ１μｌから出発する２ラウンドのネステッドＰＣＲによって増幅した。全てのＰＣＲ反応を、２００ｎＭの各プライマーまたは全プライマーミックス（表１）、３００μＭの各ｄＮＴＰ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）０．１ｕｌを含有する総体積２０μｌで実施した。ＰＣＲの第１ラウンドを９４℃で１５分、その後、９４℃で３０秒、５６℃（Ｉｇｈ）または５０℃（Ｉｇｋ）で３０秒、７２℃で５５秒の３０サイクル、および７２℃で１０分の最終的なインキュベーションで実施した。ネステッド第２ラウンドＰＣＲを、精製していない第１ラウンドＰＣＲ産物１μｌを用い、９４℃で１５分、その後、９４℃で３０秒、６０℃（Ｉｇｈ）または４５℃（Ｉｇｋ）で３０秒、７２℃で４５秒を３０サイクル、および７２℃で１０分の最終的なインキュベーションで実施した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分析し、切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製した。精製されたＰＣＲ産物をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）によってクローニングした。８つのコロニーをランダムに選択し、Ｍ１３フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いたコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製し、Ｔ３プロモーター配列決定プライマーおよび分析を使用して配列決定した。ＩＭＧＴ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏ−ＧｅｎｅＴｉｃｓ）／Ｖ−ＱＵＥＳＴデータベースを適用してＶＨ配列およびＶＬ配列を解析し、相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定した（表２）。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｓｈａｒｅ／ｔｅｘｔｅｓ／）
ＢＣ３４可変ドメインについて配列決定して、配列番号３として特定されるＳＯＸ１０エピトープＱＧＧＴＡＡＩＱＡＨＹＫＳＡＨに結合する本明細書に記載のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域、および／または重鎖可変領域のＣＤＲのうちの１つまたは複数のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドをもたらした。重鎖の可変領域の配列は配列番号１として特定され、軽鎖の可変領域の配列は配列番号２として特定される。重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号４として特定され、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号５として特定される。抗体またはその断片は、配列番号１および／または配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み得るポリペプチドを含み得る。抗体またはその断片は、配列番号４および／または配列番号５のアミノ酸配列のポリペプチドを含み得る。抗体またはその断片は、配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み得、さらには、配列番号１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み得る。抗体またはその断片は、配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み得、さらには、配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み得る。抗体またはその断片は、配列番号３のアミノ酸配列からなる少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合し得る。本明細書で言及されている通り、その断片は、その抗原結合性断片を含み得る。
複数の実施形態では、抗体またはその断片、または、さらには、単離および精製された核酸配列は、配列番号１および／もしくは配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列ならびに／または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有し得る。複数の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４および／もしくは配列番号５のアミノ酸配列ならびに／または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有し得る。抗体またはその断片は、配列番号３の残基と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合し得る。他の百分率としては、これだけに限定されないが、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および、おそらく、さらには、少なくとも約９９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％などを挙げることができる。
他の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６、７、８、９、１０、および／または１１のアミノ酸配列およびそれらの任意の組合せからなるポリペプチドを含み得る。抗体またはその断片は、配列番号９、１０、および／または１１のアミノ酸配列またはそれらの任意の組合せを有する軽鎖可変領域を含み得、さらには、配列番号６、７、および／または８のアミノ酸配列またはそれらの任意の組合せを有する重鎖可変領域を含み得る。
表２および配列番号６〜１１に関して、抗体またはその断片は、おそらく、配列番号４および／または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも約２％から少なくとも約２６％まで同一のアミノ酸配列を有し得る。他の百分率としては、これだけに限定されないが、少なくとも約２％、少なくとも約２．７％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約５．７％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約８．１％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１０．８％、少なくとも約１１％、少なくとも約１１．４％、少なくとも約１１．７％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１３．９％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１７．１％、少なくとも約１７．２％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約１９．６％、少なくとも約１９．８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２５．４％、少なくとも約２６％、少なくとも約３０％；約２％から約７０％、約２％、約２．７％、約３％、約４％、約５％、約５．７％、約６％、約７％、約８％、約８．１％、約９％、約１０％、約１０．８％、約１１％、約１１．４％、約１１．７％、約１２％、約１３％、約１３．９％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１７．１％、約１７．２％、約１８％、約１９％、約１９．６％、約１９．８％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２５．４％、約２６％、約３０％の間などを挙げることができる。
マウス抗ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］結合性配列のエピトープマッピング：ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体によって認識されるＳＯＸ１０のペプチド配列を決定するために、おそらく、２種のアッセイ：直接ＥＬＩＳＡ、さらには、ドットブロットを使用してエピトープマッピングを行うことができる。ＥＬＩＳＡアッセイでは、抗ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］抗体の感度および特異性を、抗体価を約１：５００および約１：１０００で測定することによって決定することができる。ヒトＳＯＸ１０タンパク質配列のおそらく１４７アミノ酸から２５３アミノ酸を包含する、それぞれ長さ約１５アミノ酸の重複するペプチドを使用して、結合するＢＣ３４の配列を決定することができる。
ＢＣ３４に対するエピトープは、ＳＯＸ１０の残基１９６〜２１１アミノ酸、配列番号３として特定されるＱＧＧＴＡＡＩＱＡＨＹＫＳＡＨに含まれることが示された。マウスモノクローナルＳＯＸ１０抗体に対するエピトープ、またはその一部は、マウス以外の種（例えば、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリなど）における産生を含めた、新しいモノクローナル抗体の産生のための有用な抗原であり得る。当然、ポリクローナル抗体は、ＳＯＸ１０タンパク質の残基１９６〜２１１に関する配列番号３内のエピトープに特異的に結合し得る。
直接ＥＬＩＳＡプロトコールに関しては、まず、プレートを、ＳＯＸ１０ペプチド約１００μｌをコーティング緩衝液（ｐＨ約９．５）中約５μｇ／ｍＬで用いて約４℃で一晩コーティングし、その後、約２００μｌ／ウェル、室温で約１時間ブロッキング（約３％ＢＳＡ）することができる。プレートを、別々に約１００ｎｇ／ｍＬの精製したＳＯＸ１０抗体および約２００ｎｇ／ｍＬの精製したＳＯＸ１０抗体と一緒に、ＥＬＩＳＡ−プレート振とう機において約室温で約１時間インキュベートすることができる。次いで、プレートを、おそらく、ＰＢＳＴ（約３００μｌ／ウェル）で５回洗浄し、その後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰをプレートに添加し、プレート振とう機において約１時間インキュベートすることができる。次いで、プレートをＰＢＳＴ（約３００μｌ／ウェル）で洗浄し、ブロットして乾燥させ、ＴＭＢを約１００μｌ／ウェルで添加し、振とう機において約５分展開することができ、さらには、その後に、停止液（約５０μｌ／ウェル）を添加することができる。約４５０ｎｍにおける吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで、おそらく、製造者の推奨に従って測定することができる。
ドットブロットアッセイに関しては、ニトロセルロースメンブレンを、約１ｍｇ／ｍｌの濃度のペプチド約１μｌを用い、ペプチド当たり４連でブロットすることができる。このメンブレンを、完全に乾燥し得るまで室温で約１時間インキュベートすることができる。メンブレンを、ＴＢＳＴ（例えば、約５０ｍＭのＴｒｉｓ、約０．５ＭのＮａＣｌ、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ約７．４）中約３％ＢＳＡを用いて室温で約１時間ブロッキングすることができ、次いで、マウス抗ＳＯＸ１０抗体［ＢＣ３４］を約２００ｎｇ／ｍｌでＲＴ、約１時間にわたってＴＢＳＴに添加することができる。次いで、メンブレンをオービタルシェーカー内、ＴＢＳＴ中で約３回（各約１０分）洗浄し、その後、二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＡＰと一緒に室温で約１時間、ＴＢＳＴ中でインキュベートすることができる。メンブレンを、おそらく、ロッカーにおいて、ＴＢＳＴ中で約３回（各約１０分）洗浄することができる。結合を、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｇｌｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ検出試薬を添加し、フィルムに曝露することによって検出することができる。
抗ＳＯＸ１０ ＢＣ３４を用いたＩＨＣ方法：マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体を使用した免疫組織化学を、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料に対して、以下の非限定的な例によって一般に例示される通り、当業者に一般に公知の手順を使用して実施することができる（例えば、ステップ間にトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ約７．６を用いた洗浄）：
１）ホルマリン固定パラフィン包埋組織の切片（約５μｍ）を、おそらく、ポリリシンでコーティングした市販の顕微鏡スライドに乗せることができる。
２）切片を脱パラフィンすることができ（キシレンまたはキシレン置換を使用して）、おそらく、一連のアルコール／水溶液によって再水和することができ、おそらく、その後、内在性ペルオキシダーゼを、おそらく、約３％過酸化水素溶液を用いてブロッキングすることができる。
３）試料を、圧力鍋（Ｄｉｖａ、Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ； Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）中でクエン酸緩衝液を使用した熱誘導性抗原回復に供することができ、約３０秒にわたって約１２５℃まで加熱することができる。［当業者に公知の他の抗原回復方法（例えば、蒸し器、電子レンジ、酵素など）も許容され得る］。組織を約１０分にわたって冷まし、次いで、脱イオン水ですすぐことができる。
４）タンパク質ブロッキング溶液（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｐｕｎｉｓｈｅｒ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を約１０分にわたって組織に適用することができる。
５）ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４を、ウシ血清アルブミンを担体タンパク質として伴うトリス−緩衝溶液（ｐＨ約６．２）中に約３０分にわたって適用することができる。ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４を、おそらく、１：１０，０００に希釈することができる。
６）おそらく、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした二次抗体（ＭＡＣＨ ２ Ｍｏｕｓｅ ＨＲＰ−Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いたＳＯＸ１０抗体の検出を、ヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲートを約３０分にわたって適用することによって実現することができる。別の例では、おそらく、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした二次抗体（ＭＡＣＨ ４ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＨＲＰ−Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いたＳＯＸ１０抗体の検出を二段階で実現することができる。最初にウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を約１０分にわたって適用した後、ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲートと一緒に約１０分インキュベートすることができる。
７）おそらく、最終的な検出ステップでは、おそらく、約０．０２％過酸化水素（Ｂｅｔａｚｏｉｄ ＤＡＢ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を含有する緩衝液中３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を適用することができる。ＨＲＰ媒介性機構によるＤＡＢの酸化により、褐色の発色性産物が沈殿し得、おそらく、それにより、ＳＯＸ１０発現の部位を同定することが可能になる。
８）スライドを、簡単に述べると、おそらく、改変マイヤーヘマトキシリンで対比染色することができる。
アルカリホスファターゼ検出およびファストレッド色素原を使用した、抗ＳＯＸ１０ ＢＣ３４を用いたＩＨＣ方法：同様に、ＢＣ３４を使用したＩＨＣを、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）とコンジュゲートした二次抗体およびファストレッド色素原を使用して、上記の通り実施することができる。例えば、おそらく、ＡＰとコンジュゲートした二次抗体（ＭＡＣＨ ２ Ｍｏｕｓｅ ＡＰ−Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いたＳＯＸ１０抗体の検出は、ヤギ抗マウスＡＰコンジュゲートを約３０分にわたって適用することによって実現することができる。おそらく、最終的な検出ステップでは、緩衝液（Ｖｕｌｃａｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）中ナフトールリン酸塩（例えば、ナフトールリン酸ＡＳ−ＴＲ）およびジアゾニウム塩（例えば、ファストレッドＫＬ）を適用することができる。アルカリホスファターゼによるリン酸の切断、その後の、生じたナフトールとジアゾニウム塩の反応により、赤色の発色性産物が沈殿し得、おそらく、それにより、ＳＯＸ１０発現の部位を同定することが可能になる。
ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４、チロシナーゼ抗体Ｔ３１１、およびＭＡＲＴ−１抗体Ｍ２−７Ｃ１０およびＭ２−９Ｅ３を用いたＩＨＣ方法：ＩＨＣを、おそらく、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］、チロシナーゼ抗体［Ｔ３１１］、および、おそらく、さらには、ＭＡＲＴ−１抗体［Ｍ２−７Ｃ１０］および［Ｍ２−９Ｅ３］で構成される一次抗体カクテルを使用して上記の通り実施することができる。各抗体の検出を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした二次抗体（ＭＡＣＨ ４ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＨＲＰ−Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて、おそらく、二段階で実現することができる。ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の約１０分にわたる最初の適用の後、ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲートと一緒に約１０分インキュベートし、その後、ＤＡＢを用いて可視化することができる。
マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４を用いたＩＨＣ染色の結果：上記のプロトコールを使用して、種々の正常組織および新生物組織を、ＢＣ３４を使用し、いくつかの場合には、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体を使用した染色パターンと比較して、ＳＯＸ１０発現について評価した。全ての抗体を、当業者に周知の方法を使用して力価（例えば、濃度）について最適化した。例えば、おそらく、バックグラウンド染色を最小化またはさらには排除しながら染色強度が最大になるように、種々の抗体価を評価した。各抗体について、おそらく最小のバックグラウンド染色で最大の染色強度をもたらした力価を使用した。
ＢＣ３４を用いた染色は、図１〜３および図６３〜６５に示されている種々の黒色腫の症例において観察され得る。実際、リンパ節に転移する黒色腫もＢＣ３４によって同定することができる（図４および６６）。いくつかの場合、特にメラノサイトの内在性色素が存在し得る黒色腫の症例では、赤色色素原を用いた染色が有利であり得る。ＢＣ３４は、気球細胞黒色腫（図５および６７）、類上皮細胞黒色腫（図６および６８）、血管周囲黒色腫（図８〜９および７０〜７１）、ラブドイド黒色腫（図１０および７２）、肉腫様黒色腫（図１１および７３）、および形質細胞様黒色腫（図１２および７４）の症例を染色し得る。
ＢＣ３４を用いた染色は、末梢神経腫瘍（図７および６９）、ならびに母斑の症例（図１３〜１５および図７５〜７７）においても観察され得る。シュワン細胞腫もＢＣ３４で染色され得る（図１６および７８）。
正常組織では、正常な結腸における銀親和性細胞、正常な脳神経細胞、乳腺、正常な皮膚、および正常な唾液腺の筋上皮細胞は、ＢＣ３４で染色され得る（図１７〜２１および図７９〜８３）。
ＢＣ３４を用いた染色は、特に、ＢＣ３４がより高い感度、または、おそらく、染色強度の増大を示す症例、ならびにＢＣ３４が、おそらく、より特異的である症例において、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体を用いた染色よりも優れている可能性がある。例えば、ＢＣ３４は、乳がんの症例（図２２および８４）において、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体（図２３および８５）と比較して、より染まり方が強い染色を示し得る。
肺腺癌では、ＢＣ３４は、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体と比較して改善された特異性を実証し得る。例えば、ＢＣ３４を用いた染色は、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体が細胞質染色を生じる症例では低減する、または、おそらく存在しない可能性があり（図２４および８６）、これは、ＳＯＸ１０発現（図２５および８７）とは一致しないと思われる。
黒色腫の症例でも、ＢＣ３４を用いて、同じ検体に対するＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体の染色と比較してより染まり方が強い染色が実証され得（図２６、２８、３０、８８、９０、および９２）、そこで、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体を使用すると、染色は低減する、または、おそらく、さらには、存在しない可能性がある（図２７、２９、３１、８９、９１、９３）。
正常な膀胱では、ＢＣ３４は、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体と比較して改善された特異性を実証し得る。例えば、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体により細胞質染色が生じる症例では、ＢＣ３４を用いた染色は、低減する、または、おそらく存在しない可能性があり（図３２および９４）、これは、ＳＯＸ１０発現とは一致しないと思われる（図３３および９５）。
ＢＣ３４は、おそらく、腸カルチノイド（図３４および９６）、胞巣状横紋筋肉腫（図３５および９７）、星状細胞腫（図３６および９８）、乳がん（図３７および９９）、平滑筋肉腫（図３８および１００）を含めた他の新生物組織も染色し得る。ＢＣ３４は、良性シュワン細胞腫（図４１および１０３）も染色し得る。
ＢＣ３４での染色は、線維形成性黒色腫（図３３〜３４）および紡錘細胞黒色腫（図４２〜４４および図１０４〜１０６）においても観察され得る。
黒色腫は、チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルを含めたチロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１によっても染色され得る（図４５および１０７）。ＢＣ３４は、同じ黒色腫の症例も染色し得る（図４６および１０８）。ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルは、黒色腫（図４７、４８、１０９、１１０）を染色し得、おそらく、Ｓ１００単独、またはチロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１単独よりも感度が高い（表４）。図４８および１１０に示されているものなどの症例では、ＳＯＸ１０およびチロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１は、ＳＯＸ１０の核染色およびチロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の細胞質染色によって同定することができる腫瘍の異なる領域を染色し得る。腫瘍における示差的染色は、おそらく、腫瘍における２つ以上のクローンの存在を示し得る。
いくつかの黒色腫の症例は、ＢＣ３４で染色され得るが（図４９および１１１）、おそらく、チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１では染色されない（図５０および１１２）。他の黒色腫の症例は、チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１で染色され得るが（図５１および１１３）、おそらく、ＢＣ３４では染色されない（図５２および１１４）。
ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルは、おそらく、Ｓ１００では染色されない黒色腫の症例を染色し得る（図５３、５４、１１５および１１６）。このように、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルは、Ｓ１００よりも感度が高い可能性がある。
ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルは、特異性もＳ１００より高い可能性がある。ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１は、リンパ節、脳、または骨髄を染色しない（図５５〜５７および図１１７〜１１９）。Ｓ１００の１つの不都合は、正常なリンパ節、脳、および骨髄を含めた、黒色腫以外の組織において染色が観察されることである（図５８〜６０および図１２０〜１２２）。リンパ節、脳および骨髄は、黒色腫転移の共通部位であり得る。これらの正常組織におけるＳ１００の染色により、特に、病理医が小さな転移の同定を試みる場合に、診断が難しくなり得る、または、おそらく、さらには、不正確な診断がもたらされる。
抗ＳＯＸ１０抗体［ＢＣ３４］を、種々の正常組織および新生物組織に対するＩＨＣによって評価した。一般には、染色される腫瘍細胞が≧約５％であるというカットオフを、症例をＳＯＸ１０について「陽性」と決定するための基準として使用し、逆に、染色される腫瘍細胞が＜約５％であることを、症例を「陰性」と決定するための基準として使用した。
正常組織（ｎ＝３４）では、ＢＣ３４により、皮膚メラノサイト、乳腺および唾液腺の筋上皮細胞、末梢神経、および脳が染色された（表３）。同様に、ＢＣ３４により、消化管全体を通して銀親和性細胞も染色された。ＢＣ３４により、黒色腫の２００／２１９（９１．３％）が染色された（表４）。特に、紡錘細胞黒色腫および線維形成性黒色腫の２３／２４（９５．８％）がＳＯＸ１０について陽性であった。さらに、シュワン細胞腫および母斑についての染色は１００％であった。
試験した新生物（ｎ＝５８７）では、ＳＯＸ１０は、浸潤性乳管がんの１８／１０９（１６．５％）で発現し、肺、結腸、前立腺、膀胱、腎臓、肝臓、食道、卵巣、甲状腺、副腎、および精巣セミノーマを含めた他の癌腫（ｎ＝４２６）のいずれにおいても発現しなかった（表５）。ＳＯＸ１０は、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｏｃｏｍａ）の２／２１、平滑筋肉腫の１／２１、およびＣＮＳ神経膠腫の３５％において陽性であった。消化管におけるカルチノイド腫瘍および肺におけるカルチノイド腫瘍は、支持細胞が染色された以外は全て陰性であった。
黒色腫では、ＳＯＸ１０、チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１のカクテルは、ＳＯＸ１０単独、Ｓ１００単独、または、さらには、チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルよりも感度が高い可能性がある（表６）。チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１の染色は細胞質染色であり得（図３９Ａ）、ＳＯＸ１０の染色は核染色であり得る（図４６および１０８）。ＳＯＸ１０＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルでは、核染色（ＳＯＸ１０）と細胞質染色（ＭＡＲＴ−１およびチロシナーゼ）の組合せが示され得る（図４７、４８、１０９、１１０）。いくつかの場合には、ＳＯＸ１０は陽性であり得、チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１は陰性であり得る（図４９、５０、１１１、および１１２）、または逆もまた同じである（図５１、５２、１１３、および１１４）。ＳＯＸ１０＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルは、Ｓ１００が陰性である症例において陽性であり得る（図５３、５４、１１５、１１６）。１つの症例では、おそらく、Ｓ１００について陽性であり、ＳＯＸ１０＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１について陰性であることが見いだされた。ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］はまた、リンパ節、脳および骨髄においても陰性であり得るが（図５５〜５７および図１１７〜１１９）、一方、Ｓ１００は、これらの組織を染色し得る（図５８〜６０および図１２０〜１２２）。
これらの実施例により、ＢＣ３４の利点が実証され、おそらく、ＢＣ３４が、公知の抗体と比較して、場合によってバックグラウンドまたは望ましくない細胞質染色が少ない、よりきれいな染色パターンをもたらす優れた感度または特異性を含めた、いくつかの有利な点を有することが示される。
本発明の一部の実施形態では、マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、上記のプロトコールおよび当業者に公知の他の方法の多くの変形における使用に適し得る。ＢＣ３４を用いて染色した検体は、恒久的なマウンティング培地およびカバーガラスを使用して保管することができる。抗体ＢＣ３４は、自動染色計器において標準のプロトコールを使用して使用することもできる。当業者に一般に知られている多くの代替的な検出方法（例えば、蛍光）、検出酵素（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼなど）、および、おそらく、さらには、色素原（例えば、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドなど）の使用を構想することもできる。
マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体のエピトープ、またはその一部は、当業者には理解される通り、マウス以外の種（例えば、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリなど）における産生を含めた、新しいモノクローナル抗体の産生のために有用な抗原であり得る。実際、ＢＣ３４の特定のエピトープは、その有利な性質に寄与する特徴のうちの１つであり得る。
ホルマリン固定パラフィン包埋組織の免疫組織化学におけるＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体の使用は本明細書に記載され得、他のイムノアッセイにおけるその有用性は、容易に構想することができ、本出願に包含されるものとする。特に、ＦＦＰＥのＩＨＣにおいて使用される同じ試薬の多くを凍結組織切片のＩＨＣにおいても使用することができることは周知であり得る。ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、ＥＬＩＳＡを含めた他のイムノアッセイにおいても、おそらく、一般に公知の方法を使用して、有用であり得る。
おそらく、ＩＨＣに関連する本発明の別の態様では、抗ＳＯＸ１０抗体をカクテルの一部として１種または複数種の追加的な一次抗体と併せて使用して、「二重染色」手順（多重染色または、さらには、マルチプレックスとしても記載される）を実施することができる。そのような「二重染色」手順は、一般に当技術分野で周知であり得るが、特定の診断への適用のための一次抗体の最良の組合せは公知でない場合がある。
この方法では、マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体を、おそらく、検体への同時適用に適した単一の一次抗体カクテル中に１種または複数種の抗体と組み合わせることができる。抗体は、マウス宿主またはウサギ宿主などに由来するものであってよい。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。複数の実施形態では、抗体カクテルを二重染色ＩＨＣ手順において使用して、組織検体中に標的タンパク質抗原が存在するか存在しないかを同定することが可能な、２つまたはそれより多くの色を呈した染色を生じさせることができる。例えば、抗体カクテルがマウス抗体およびウサギ抗体で構成され得る複数の実施形態では、検出系は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした抗マウス抗体を含み得、おそらく、さらには、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）とコンジュゲートした抗ウサギ抗体を使用して、２色染色を生じさせることができる。３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用して褐色染色を生じさせることができ、これは、おそらく、ＨＲＰによって容易になり、また、これにより、検体における、結合したマウス抗体が存在するか存在しないか、および／またはその場所を同定することができ、ファストレッドを使用して、鮮やかな赤紫色／赤色染色を生じさせることができ、これは、おそらく、ＡＰによって容易になり、また、これにより、検体における、ウサギ抗体が存在するか存在しないか、および／またはその場所を同定することができる。他の実施形態では、検出系は、ＡＰとコンジュゲートした抗マウス抗体およびＨＲＰとコンジュゲートした抗ウサギ抗体を含み得、おそらく、ファストレッドおよびＤＡＢを色素原として使用することができる場合に、これを使用して、赤色に染色されたマウス抗体および褐色に染色されたウサギ抗体が存在するか存在しないか、および／またはその場所を同定することができる２色染色を生じさせることができる。一部の実施形態では、ＨＲＰとコンジュゲートした抗マウス抗体、および、おそらく、ＡＰとコンジュゲートした抗ウサギ抗体を、単一溶液中のカクテルとして検体に適用することもでき、別々の逐次的なステップで適用することもできる。
抗体−酵素コンジュゲートを含む抗マウス抗体または抗ウサギ抗体は、これだけに限定されないが、マウス、ウサギ、ニワトリ、ウマ、ラット、ヤギ、ヒツジなどを含めた異なる宿主種に由来するものであってよい。一次抗体は、これだけに限定されないが、マウス、ウサギ、ニワトリ、ウマ、ラット、ヤギ、ヒツジなどを含めた種々の宿主種に由来するものであってよい。複数の実施形態では、抗体は、抗体−酵素コンジュゲートを含んでよく、一次抗体は、２つの異なる宿主種から得ることができる。ＤＡＢおよび／またはファストレッド以外の色素原も同様に使用することができる。
これだけに限定されないが、３種以上の抗体の使用、マウスおよびウサギ以外の種の使用、他の色素原および検出系、異なる順序の検出ステップ、および、おそらく、さらには、３色またはそれより多くをもたらす改変（変性ステップを必要とする場合がある）を含めた、二重染色法に対する多数の代替法が可能である。
一部の実施形態では、一次抗体カクテルに対して単色染色を使用することができる。一実施例では、一次抗体カクテルが全て同じ宿主種に由来する抗体で構成される場合、単一の検出系を使用して、抗体の全ての存在について単色で染色することができる。各抗体が存在するか存在しないかを細胞の局在化に基づいて決定することができる、または、おそらく、そのような決定は必要なく、各抗体が存在するか存在しないかを同定せずに染色を有効に解釈することができる。例えば、マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４をマウスモノクローナル抗ＭＡＲＴ１と一次抗体カクテル中に組み合わせ、抗マウスコンジュゲートＨＲＰ検出および可視化のための褐色染色を生じるＤＡＢを用いたＩＨＣ手順において使用することができる。別の態様では、異なる宿主種由来の２種またはそれより多くの抗体で構成される一次抗体カクテルを同様に使用して単色染色を生じさせることができる。例えば、マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０ ＢＣ３４をウサギポリクローナル抗Ｓ１００抗体と組み合わせ、抗マウスコンジュゲートＨＲＰおよび抗ウサギコンジュゲートＨＲＰ、ならびに可視化のための褐色染色を生じるＤＡＢを用いたＩＨＣ手順において使用することができる。
ＩＨＣ手順のある特定のステップは、おそらく、当業者に公知の試薬のカクテルを使用することによって、逐次的にまたは同時に実施することができる。例えば、一次抗体カクテルに記載されている抗体を１種または複数種の抗体の逐次的なステップに二者択一的に適用することができる。同様に、検出試薬は、試薬カクテルとして同時に適用することもでき、別々の試薬を逐次的なステップで適用することもできる。
多重染色手順における使用のために、マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体と一次抗体カクテル中に組み合わせると診断に関して有用であり得る抗体としては以下が挙げられる。
＊列挙されている各染色の色は、おそらく、ＨＲＰとコンジュゲートした抗マウス抗体、さらには、おそらく、ＡＰとコンジュゲートした抗ウサギ抗体を、おそらく、さらには、マウス抗体について褐色染色をもたらし得、ウサギ抗体について赤色染色をもたらし得る色素原としてＤＡＢおよびファストレッドを一緒に含み得る検出系の結果であり得る。あるいは、検出系は、おそらく、ＡＰとコンジュゲートした抗マウス抗体、さらには、おそらく、ＨＲＰとコンジュゲートした抗ウサギ抗体を、おそらく、さらには、マウス抗体について赤色染色をもたらし得、ウサギ抗体について褐色染色をもたらし得る色素原としてＤＡＢおよびファストレッドと一緒に含み得る。他の検出系または色素原を使用して他の色の組合せを得ることができ、全て本開示に包含されるものとする。
一部の実施形態では、試薬を、さらには、おそらく、同じ宿主種由来の抗体を使用する場合に、二重染色が生じるように逐次的に適用することができる。例えば、マウスモノクローナルＢＣ３４を適用し、その後、おそらく、抗マウス−ＨＲＰ検出およびＤＡＢ色素原ステップを続けることができる。変性ステップ後、おそらく、酸性溶液を使用して、第２のマウスモノクローナル抗体、おそらく、マウスモノクローナル抗ネスチン抗体またはマウスモノクローナル抗ＭＡＲＴ１抗体を適用し、その後、おそらく、抗マウス−ＡＰ検出およびファストレッド色素原ステップを続けて、２色染色を生じさせることができる。
一部の実施形態では、同じ宿主種に由来する抗体のカクテルを使用し、単色染色をもたらすことができる。例えば、マウスモノクローナルＳＯＸ１０［ＢＣ３４］、マウスモノクローナルチロシナーゼ［Ｔ３１１］、およびマウスモノクローナルＭＡＲＴ−１［Ｍ２−７Ｃ１０］および［Ｍ２−９Ｅ３］のカクテルを適用し、抗マウス−ＨＲＰおよびＤＡＢ、または、おそらく、抗マウス−ＡＰおよびファストレッドによって検出することができる。他の実施形態は、ＳＯＸ１０およびチロシナーゼ、または、おそらく、ＳＯＸ１０およびＭＡＲＴ−１の抗体カクテルを含み得る。マウスモノクローナルＳＯＸ１０を、おそらく、さらには、二重染色手順において、上記の組合せのいずれかのチロシナーゼまたはＭＡＲＴ−１のウサギポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体と組み合わせることもできる。ＳＯＸ１０、チロシナーゼおよび／またはＭＡＲＴ−１の抗体カクテルは、おそらくＳ１００を含めた黒色腫の他の潜在的なマーカーよりも優れている可能性がある。ＳＯＸ１０、チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１は、黒色腫においてＳ１００よりも感度が高い可能性があり、これは、おそらく、ＳＯＸ１０は線維形成性黒色腫および紡錘細胞黒色腫を染色し得、Ｓ１００はこれらの型を染色し得ないからである。ＳＯＸ１０、チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１は、Ｓ１００のようには黒色腫転移の共通部位である脳、リンパ節または骨髄を染色し得ないので、特異性もＳ１００より高い可能性があり、これにより、おそらく、これらの部位における微小転移の同定に役立つ。ある特定の実施形態では、実施例において使用した以外のクローン（ＢＣ３４以外のＳＯＸ１０の他のクローンを含む）が適切であり得、おそらく、交換することができる、または、おそらく、さらには、実施例において使用したクローンよりも優れている。
多くの実施形態では、当業者に公知の通り、サイトケラチンマーカーに結合する抗体を異なる組合せで、いくつかの場合には、互換的に使用することができる。例えば、ＣＫ５は、おそらく、ＣＫ５／６またはＣＫ５／１４と交換することができる。同様に、ＨＭＷＣＫ（高分子量サイトケラチン）は、ＣＫ５／６またはＣＫ５／１４と互換的に使用することができる。
多くの場合、診断は、細胞診または生検由来の限られた組織試料に対して実施されることも多く、組織をさらなる分子試験のために保存することが重要であり得る。したがって、消費する組織は最小限であるが、最適な特異度および／または感度をもたらす効率的な診断手法が好ましい場合がある。おそらく、抗体カクテルを使用することによって、または、多分、改善された感度または特異度の特徴によって、検体由来の組織の消費を最小限にしながら有用な診断情報をもたらす方法が好ましい場合がある。
マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、ＳＯＸ１０の検出に特異的であり得、ヒト組織試料においていくつかの型のがんを診断するための免疫組織化学的手順において有用であり得る。特に、ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、これだけに限定されないが、より高い感度、より染まり方が強い染色、より高い特異性、および、おそらく、バックグラウンド染色が少ないよりきれいな染色、ならびに、おそらく、カルチノイドの染色の欠如、および、おそらく、肺腺癌の染色の欠如を含めた、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体に勝る利点を有し得る。
本発明の実施形態は、イムノアッセイ法の一例として、図６２において概略的に示されている通り、試験される動物またはヒトから組織を得ること（６）、前記組織を固定または凍結すること（７）、前記固定または凍結した組織を処理してエピトープをＳＯＸ１０に暴露すること（８）、前記処理した組織と抗体またはその断片を、前記組織内にＳＯＸ１０タンパク質が存在する場合に抗体またはその断片がＳＯＸ１０タンパク質に結合するように、本明細書で論述した量および条件下で接触させること（９）、ならびに、おそらく、さらには、前記結合した抗体の存在を検出すること（１０）を提供し得る。
図６１は、抗体、その断片、その一部を組成物として、または、さらには、カクテルとして、おそらく、さらには、ハイブリドーマからもたらされるものとして提供し得るキット（５）、生体試料（２）と接触させて、検出器（４）で検出することができる少なくとも１種の抗体−抗原複合体（３）を形成することができる抗体（１）などを含めた本発明の種々の実施形態の要約の概略図を示す。
本発明は、複数の実施形態において、抗体またはその断片（本明細書で論述されている通り）を、おそらく、抗原に結合した際の抗体またはその断片の抗体検出要素と共に含み得る、診断用、または、さらには、予後診断用の検査キットを提供し得る。これは、生体試料を抗体またはその断片と接触させ、さらには、おそらく、抗体検出要素を使用して、生体試料中のタンパク質または抗原と結合した抗体またはその断片の結合、または、さらには、その存在を検出するための方法を提供し得る。実施形態は、哺乳動物またはヒトにおけるＳＯＸ１０タンパク質を、おそらく、検査される動物またはヒトから組織を得、組織と抗体またはその断片を、組織内にＳＯＸ１０タンパク質が存在する場合に抗体またはその断片がＳＯＸ１０タンパク質に結合し得るように、本明細書で提示されている種々の実施形態に従って、おそらく、量および条件下で接触させ、さらには、結合した抗体の存在を検出することによって検出するためのイムノアッセイ法を提供し得る。生体試料は、おそらく、使用される抗体、または、さらには、カクテルに応じて、これだけに限定されないが、血液、尿、尿路上皮組織、移行細胞組織、膀胱組織、正常組織、新生物組織、腎組織、卵巣組織、甲状腺組織、子宮内膜組織、腎組織、扁桃組織、膵臓組織、結腸組織、リンパ節組織、新生物膵組織、胃組織、前立腺組織、肺組織、乳房組織などを含んでよい。
例えばＳＯＸ１０、ＳＯＸ１０抗体、ＢＣ３４などの用語の使用は、当業者には理解される通り、必要に応じて、抗ＳＯＸ１０抗体などに関し得ることに留意する。抗体カクテルの構成成分は、「＋」で示される場合があり（例えば、「ＭＡＲＴ−１＋チロシナーゼ」で、ＭＡＲＴ−１およびチロシナーゼ抗体のカクテルが特定される）、また、いくつかの場合には、抗体試薬は、同じ標的に対する２種以上の抗体クローンを含み得る（例えば、ＭＡＲＴ−１は、２種の抗ＭＡＲＴ−１マウスモノクローナル抗体、クローンＭ２−７Ｃ１０およびクローンＭ２−９Ｅ３を含み得る）ことに留意する。
Ｔａｃｈａ， Ｄａｖｉｄ； Ｑｉ， Ｗｅｉｍａｎ； Ｂｒｅｍｅｒ， Ｒｙａｎ； Ｙｕ Ｃｈａｒｌｉｅ； Ｈｏａｎｇ， Ｌａｕｒａ； Ｒａ， Ｓｅｏｎｇ；およびＲｏｂｂｉｎｓ， Ｂｒｕｃｅによる論文「Ａ Ｎｅｗｌｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＳＯＸ１０ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓ ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｍｅｌａｎｏｍａ， Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｓｍｏｐｌａｓｔｉｃ Ｍｅｌａｎｏｍａｓ」、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡは本出願に添付され、これによってその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
前述のことから容易に理解することができる通り、本発明の基本的な概念は、様々なやり方で具体化することができる。これは、適切な抗体を実現するための抗体技法ならびにデバイスの両方を伴う。本出願では、抗体技法は、記載されている種々のデバイスによって、および利用に固有のステップとして実現されることが示されている結果の一部として開示されている。それらは、単に、意図され、記載されているデバイスを利用した自然の結果である。さらに、いくつかのデバイスが開示されているが、これらは、ある特定の方法を実現するだけのものではなく、いくつものやり方で変化させることもできることが理解されるべきである。重要なことに、前述の全てに関して、これらのファセットの全てが本開示に包含されると理解されるべきである。
本出願に含まれる論述は、基本的な説明として役立つことが意図されている。読者は、特定の論述は可能性のある実施形態全てを明確に記載するものではない場合があり、多くの代替物が暗に含まれることを認識すべきである。同様に、これは、本発明の一般的な性質を完全に説明するものではない場合があり、それぞれの特徴または要素により実際にどれほど多種多様の代替的なまたは同等の要素の広範な機能が表され得るかを明確に示すものではない場合がある。さらに、これらは、暗黙のうちに本開示に含まれる。本発明がデバイス主体の用語法で記載されている場合、デバイスの各要素により、機能が暗黙のうちに実施される。記載されているデバイスに関して、装置請求項が含まれるだけでなく、方法またはプロセス請求項も、本発明および実施される要素の機能に取り組むために含まれる。説明および用語法はどちらも、後のあらゆる特許出願に含まれる特許請求の範囲を限定するものではない。
本発明の核心から逸脱することなく、種々の変化がなされ得ることも理解されるべきである。そのような変化も暗黙のうちに本明細書に包含される。それらはなお本発明の範囲内に入る。示されている明示的な実施形態（複数可）を包含する広範な開示、多種多様な暗に含まれる代替的な実施形態、および広範な方法またはプロセスなどが本開示に包含され、後のあらゆる特許出願のための特許請求の範囲を起草する際に頼りになり得る。そのような言葉の変化およびより広範かつより詳細な特許請求を、後日（例えば任意の所定の期限までになど）、または出願人がその後、本出願に基づいて特許出願を求める事象において、実現することができることが理解されるべきである。この理解と共に、読者は、本開示は、出願人の権利の範囲内に入るとみなされる広さの特許請求の範囲の基礎の審査を求めることができ、本発明の多数の態様を独立に、および系全体としてのどちらでも包含する特許が得られるようにデザインすることができる、後に出願されるあらゆる特許出願を支持するものと理解されることを認識すべきである。
さらに、本発明の種々の要素および請求項のそれぞれも種々の様式で実現することができる。さらに、使用されるまたは暗に含まれる場合、要素は、物理的に接続されていてもいなくてもよい個々の構造ならびに複数の構造を包含すると理解されるべきである。本開示は、任意の装置実施形態のある実施形態の変形であろうと、方法またはプロセスの実施形態のある実施形態の変形であろうと、さらには、ただ単にこれらの任意の要素の変形であろうと、そのような変形のそれぞれを包含するものと理解されるべきである。特に、本開示は本発明の要素に関するので、機能または結果のみが同じだとしても、各要素に関する単語は、同等の装置用語または方法用語によって表すことができることが理解されるべきである。そのような同等の、より広範な、またはより一般的な用語は、各要素または作用についての記載に包含されるものとみなされるべきである。そのような用語は、本発明が権利を有する暗黙のうちに広範な適用範囲を明確にすることが望ましい場合、置き換えることができる。一例として、全ての作用は、その作用を起こすための手段またはその作用を引き起こす要素として表され得ることが理解されるべきである。同様に、開示される物理的要素のそれぞれは、その物理的要素により容易になる作用に関する開示を包含するものと理解されるべきである。この最後の態様に関して、一例として、「検出」または「検出器」に関する開示は、「検出する」作用−−明確に論述されていようがいまいが−−の開示を包含するものと理解されるべきであり、逆に、「検出する」作用が有効に開示される場合、そのような開示は、「検出器」、さらには、「検出するための手段」の開示を包含するものと理解されるべきである。そのような変化および代替用語は、本明細書に明確に包含されるものと理解されるべきである。さらに、そのような手段のそれぞれ（そのように明確に記載されているかいないかにかかわらず）は、所与の機能を実施することが可能な全ての要素を包含すると理解されるべきであり、記載されている機能を実施する要素の全ての説明は、その機能を実施するための手段の非限定的な例として理解されるべきである。
本特許出願において言及されるあらゆる法律、法令、規制、または規則；または本特許出願において言及される特許、刊行物、または他の参考文献は、これによって参照により組み込まれる。本出願により特許請求されるあらゆる優先事例（複数可）はこれによって追加され、これによって参照により組み込まれる。さらに、使用される各用語に関して、本出願におけるその利用が、広範に支持する解釈と相反しない限り、一般の辞書による定義が各用語に組み込まれると理解されるべきであり、Ｒａｎｄｏｍ Ｈｏｕｓｅ Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｕｎａｂｒｉｄｇｅｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第２版に含有されるものなどの全ての定義、代替用語およびシノニムは、これによって参照により組み込まれることが理解されるべきである。最後に、下記の一覧または本出願と共に出願される他の情報の記載に列挙されている全ての参考文献はこれによって追加され、これによって参照により組み込まれる、しかし、上記のそれぞれに関して、参照により組み込まれるそのような情報または記載がこの／これらの発明の特許取得と相反するとみなされる可能性がある限りでは、そのような記載は、明白に、本出願人（複数可）によってなされたものとはみなされない。
したがって、出願人（複数可）は、少なくとも以下に関して、請求項への支持を得、発明の記載を行うと理解されるべきである：ｉ）本明細書において開示および記載されている抗体デバイスのそれぞれ、ｉｉ）開示および記載されている関連する方法、ｉｉｉ）これらのデバイスおよび方法のそれぞれの、類似した、同等の、さらには、暗に含まれる変形、ｉｖ）開示および記載されている通り示される機能のそれぞれを実現する代替デザイン、ｖ）開示および記載されていることの実現が暗に含まれると示される機能のそれぞれを実現する代替デザインおよび方法、ｖｉ）別々の独立した発明として示される各特徴、構成成分、およびステップ、ｖｉｉ）開示される種々の系または構成成分によって増強される適用、ｖｉｉｉ）そのような系または構成成分によって産生される産物、ｉｘ）言及される任意の特定の分野またはデバイスに今適用されると示されるまたは記載される各系、方法、および要素、ｘ）実質的に上文に記載され、また付随する例のいずれかで参照される方法および装置、ｘｉ）ステップを実施するための手段を含む、本明細書に記載の方法を実施するための装置、ｘｉｉ）開示される要素のそれぞれの種々の組合せおよび順列、ｘｉｉｉ）提示される独立請求項または概念のひとつひとつに対する従属性としてそれぞれが潜在的に従属する請求項または概念、およびｘｉｖ）本明細書に記載されている全ての発明。
請求項に関しては、現在または後に審査に出されるかどうかにかかわらず、実用上の理由から、および審査の負担が増大するのを回避するために、出願人は、いつでも、最初の請求項のみ、または、おそらく最初の従属のみを伴う最初の請求項のみを提出することができることが理解されるべきである。特許庁および本出願または後の出願の潜在的な範囲に関心がある任意の第三者は、この場合、この場合の利益を特許請求する場合、または提出されるいかなる予備補正、他の補正、請求項言語、または意見書にかかわらない任意の継続において、したがって、任意の潜在的な主題のディスクレームまたは放棄が意図されていないあらゆる場合の係属全体を通してより広範な請求項が後日提出され得ることを理解すべきである。より広範な請求項が提出された場合またはその時、本出願または任意のその後の出願で提出されるあらゆる補正、請求項言語、または意見書がそのような先行技術を無効化するものとみなされる限りでは、そのような理由は、後に提示される請求項などによって排除され得る可能性があるので、任意の以前の時点で考慮された可能性のある、あらゆる関連性のある先行技術が再考される必要があり得ることが理解されるべきである。審査官、および、現存するまたは後の潜在的なカバレッジに他の点で関心がある、または潜在的なカバレッジのディスクレーマーまたは放棄が示されるあらゆる可能性が任意の時点であったかどうかを考慮する任意の人はどちらも、本出願またはあらゆるその後の出願にそのような放棄またはディスクレーマーは意図されない、または存在しないことを認識すべきである。Ｈａｋｉｍ ｖ．Ｃａｎｎｏｎ Ａｖｅｎｔ Ｇｒｏｕｐ、ＰＬＣ、４７９ Ｆ．３ｄ １３１３（Ｆｅｄ． Ｃｉｒ ２００７）において生じるものなどの限定などは、このまたはあらゆるその後の関連事項において明白に意図されない。さらに、支持は、１つの独立請求項または概念の下で提示される種々の従属物または他の要素のいずれかを、任意の他の独立請求項または概念の下の従属物または要素と同様に追加することを可能にするために、これだけに限定されないが、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ Ａｒｔｉｃｌｅ １２３（２）およびＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｌａｗ ３５ ＵＳＣ １３２または他のそのような法律を含めた新規事項法の下で必要な程度まで存在すると理解されるべきである。本出願においてか後の出願においてかにかかわらず、任意の時点で任意の請求項を草案することにおいて、出願人は、法的に利用可能な程度に十分かつ広範なカバレッジの範囲を捕捉することが意図されていることも理解されるべきである。実質のない置換がなされる限り、出願人が、任意の特定の実施形態を文字通り包含するために実際にいかなる請求項も草案しない限り、および他の点で適用可能な限り、出願人は、単に、起こり得る全ての事態を予測することが出来ていない可能性があるので、出願人は、いかなる形でもそのようなカバレッジの放棄を意図していないまたは実際に放棄しないと理解されるべきであり、当業者は、そのような代替的な実施形態を文字通り包含する請求項が草案されることを合理的に予測すべきではない。
さらに、使用された場合またはその時、移行句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の使用は、従来の請求項解釈に従って、本明細書において「開放請求項」を維持するために使用される。したがって、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、明示された要素もしくはステップまたは要素もしくはステップの群が包含されることを意味するが、任意の他の要素もしくはステップまたは要素もしくはステップの群が排除されることは意味しないことを意図していることが理解されるべきである。そのような用語は、出願人に法的に許容される最も広範なカバレッジがもたらされるように、それらの最も広範囲の形態で解釈されるべきである。「または任意の他の請求項」という句の使用は、例えば、別の従属請求項、別の独立請求項、前に列挙された請求項、後に列挙される請求項などの任意の他の請求項に従属する任意の請求項に対する支持をもたらすために使用される。１つの明快な例として、請求項が「請求項２０または任意の他の請求項」に従属するなどの場合、その請求項は、請求項１、請求項１５、または、さらには、所望であれば、請求項２５（それが存在する場合）に従属するとして再度草案され得、それでも本開示の範囲内に入る。この句は、請求項内の要素の任意の組合せおよびさらには、方法、装置、プロセスなどの請求項の組合せなどのある特定の請求項の組合せのための任意の所望の適切な先行詞を組み入れることに対する支持ももたらすものであることが理解されるべきである。
最後に、任意の時点で記載される請求項はいずれも、これによって参照により本発明の本明細書の一部として組み込まれ、出願人は、請求項のいずれかまたは全て、または任意のその要素または構成成分を支持する追加的な説明としてそのような請求項のそのような組み込まれた内容の全部または一部を使用する権利を明白に留保し、出願人はさらに、本出願による、またはその後のその継続出願、分割出願もしくは一部継続出願による保護が求められる事項を定義するため、またはそれに準じてあらゆる利益および手数料の削減を取得するため、または任意の国または条約の特許法、規則または規制に従うために必要に応じて、そのような請求項またはその任意の要素または構成成分の組み込まれた内容の任意の一部または全部を、明細書から特許請求の範囲に、またはその逆に移動させる権利を明白に留保し、参照により組み込まれるそのような内容は、任意のその後のその継続出願、分割出願もしくは一部継続出願またはそれに対する再発行もしくは延長を含めた、本出願の全係属中に残存するべきである。
新しく開発されたマウスモノクローナルＳＯＸ１０抗体は、紡錘細胞黒色腫および線維形成性黒色腫を含めた悪性黒色腫についての高度に感度が高く特異的なマーカーである
Ｔａｃｈａ， Ｄａｖｉｄ，１ Ｑｉ，Ｗｅｉｍａｎ，１ Ｂｒｅｍｅｒ， Ｒｙａｎ，１ Ｙｕ Ｃｈａｒｌｉｅ１， Ｃｈｕ Ｊｏｓｅｐｈ１， Ｈｏａｎｇ， Ｌａｕｒａ， １ Ｒａ， Ｓｅｏｎｇ，２ ａｎｄ Ｒｏｂｂｉｎｓ， Ｂｒｕｃｅ．２ １Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ、２Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ
コンテクスト−最近の免疫組織化学的試験により、悪性黒色腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、乳癌のサブセット、および神経膠腫におけるＳＯＸ１０発現が実証された。ＳＯＸ１０は、線維形成性黒色腫および紡錘細胞黒色腫を検出するその能力に関して重要な臨床的有用性を有することが示されている。現在まで、大多数の刊行物では免疫組織化学的染色のために研究用（ＲＵＯ）ヤギポリクローナルＳＯＸ１０抗体が使用されている。
目的およびデザイン−ここで、新しいマウスモノクローナルＳＯＸ１０抗体［ＢＣ３４］の開発について記載し、広範囲の正常組織および新生物組織におけるその免疫組織化学的染色プロファイルを、黒色腫に重点を置いて評価する。
結果−正常組織では、ＳＯＸ１０は、皮膚メラノサイトおよびエクリン細胞、乳房筋上皮細胞および小葉上皮細胞、唾液腺筋上皮細胞、末梢神経シュワン細胞、および中枢神経系グリア細胞において発現した。ＳＯＸ１０は、紡錘細胞黒色腫と線維形成性黒色腫の両方の５０／５１（９８％）を含めた、黒色腫の２３８／２５７（９２．６％）において発現した。ＳＯＸ１０は、母斑（２０／２０）およびシュワン細胞腫（２８／２８）の１００％で発現した。他の新生物では、ＳＯＸ１０は、浸潤性乳管癌の１８／１０９（１６．５％）において発現した。他の癌腫は全てＳＯＸ１０について陰性であった。ＳＯＸ１０は、中枢神経系新生物の２５／５２において同定され、主に星状細胞腫２２／４１（５３．７％）において、および検査した種々の肉腫の４／９９（４．０％）において同定された。
結論−要約すると、我々は、新しく開発されたマウスモノクローナルＳＯＸ１０抗体［ＢＣ３４］が、線維形成性黒色腫および紡錘細胞黒色腫を含めた悪性黒色腫に対して高度に感度が高く特異的であることを示した。
Ｓｒｙ関連ＨＭｇ−Ｂｏｘ遺伝子１０（ＳＯＸ１０）タンパク質は、神経堤、末梢神経系、およびメラニン細胞の発達のために重要なヒト転写因子である１〜４。ＳＯＸ１０核タンパク質は、メラノサイト、シュワン細胞、乳腺および唾液腺の筋上皮細胞、ならびに乏突起膠細胞の細胞を含めた正常なヒト組織において広範に発現することが示されている１〜３、５、６。ＳＯＸ１０核タンパク質は、黒色腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、および乳癌のサブセットなどの悪性腫瘍においても発現する。大多数の乏枝神経膠腫、しかし同様に星状細胞腫および神経膠芽腫の大部分もＳＯＸ１０を発現することが示されている３、５。ＳＯＸ１０はまた、メラニン細胞母斑、シュワン細胞腫、および神経線維腫などの良性腫瘍にも存在する１〜３、５〜７。
ＳＯＸ１０は、線維形成性黒色腫（ＤＭ）および紡錘細胞黒色腫（ＳＣＭ）において高度に発現する１。ＤＭおよびＳＣＭは、通常、Ｓ−１００タンパク質について陽性であるが、多くの場合、他の黒色腫マーカーを用いると陰性であるまたは限局的にのみ陽性である。ＤＭは、臨床的にだけでなく、組織学的にも誤診を起こしやすい９。
紡錘細胞黒色腫および線維形成性黒色腫をそれらの病理的類似物と区別するための適切なマーカーを見いだすための広範囲にわたる取り組みがなされてきた。メラノサイトマーカーの中で、ＳＯＸ１０は最も見込みがあることが示されている。現在まで、大多数の刊行物では、研究用（ＲＵＯ）ヤギポリクローナルＳＯＸ１０を使用した免疫組織化学的方法が使用されている１、７、１１〜１８。ここで、新しいマウスモノクローナルＳＯＸ１０ハイブリドーマ［ＢＣ３４］の開発について記載し、正常組織および新生物組織におけるその感度および特異性を、黒色腫およびそのサブタイプに重点を置いて評価する。
材料および方法
ＳＯＸ１０ハイブリドーマの生成
宿主免疫：雌ＢＡＬＢ／ｃ（６週間〜約８週間齢）マウスを、マウス当たり１００μｇの完全フロイントアジュバント中ヒトＳＯＸ１０組換えタンパク質を用いて腹腔内に免疫した。３週間後、マウスを、マウス当たりさらに１００μｇの不完全フロイントアジュバント中ヒトＳＯＸ１０を用いて、さらに４回、３週間おきに追加刺激した。マウスの尾部から採血し、血清を採取し、約−２０℃で保管した。
ハイブリドーマ：ＳＯＸ１０に対する抗体を産生するハイブリドーマを、ＳＯＸ１０で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞から標準の技法によって生成した。ＳＯＸ１０で免疫したマウス由来の脾細胞をＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合した。ハイブリドーマの上清を、ＳＯＸ１０に対する抗体反応性について酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によってスクリーニングした。次いで、ハイブリドーマクローンを、標的組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片に対するそれらの特異性および特異性に基づいて選択した。
ＥＬＩＳＡ：ＳＯＸ１０に対する宿主抗血清免疫応答をＥＬＩＳＡによって測定し、マイクロタイタープレートリーダーで測定した。抗ＳＯＸ１０抗体［ＢＣ３４］モノクローナル抗体を、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を使用してアイソタイピングした。クローンＢＣ３４アイソタイプをマウスＩｇＧ１として同定した。クローンＢＣ３４由来の選択されたハイブリドーマ細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充した培地で培養し、ハイブリドーマ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに注射して抗体腹水を生じさせた。抗体腹水をプロテインＡアフィニティーカラムでさらに精製した。ＩｇＧの濃度を分光光度的に測定した。
ウエスタンブロット法によって試験した抗体交差反応性：精製されたモノクローナル抗体ＳＯＸ１０を、ウエスタンブロッティングによって特徴づけた。全長ヒトＳＯＸ１０をトランスフェクトした細胞溶解物を、ゲル電気泳動を使用して分離した。タンパク質ブロットを、ＳＯＸ１０抗体を室温で６０分インキュベートし、その後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗マウス免疫グロブリンと一緒にインキュベートすることによって可視化した（図１）。
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）：ＴＭＡを社内で構築し、かつ／またはＵＳ Ｂｉｏｍａｘ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］を、皮膚黒色腫、転移性黒色腫、紡錘細胞黒色腫および線維形成性黒色腫、および黒色腫バリアントにおいて（ｎ＝２５７）、シュワン細胞腫において（ｎ＝２８）、および母斑（複合、皮内よび接合部）において（ｎ＝２０）評価した。ＳＯＸ１０を特異性について試験するために、正常組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）（ｎ＝３４）、全組織切片および種々の新生物組織におけるＴＭＡ（ｎ＝７４９）を評価した。
免疫組織化学：ホルマリン固定パラフィン包埋した全組織および組織ＴＭＡを脱パラフィンし、水中で水和させた。次いで、スライドを過酸化水素に５分曝露し、水中で洗浄した。ＴＭＡを抗原回復溶液（改変クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）に浸漬し、１２５℃で３０秒、圧力鍋（Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）に入れた。組織スライドを８０℃まで冷却し、水中で洗浄した。ＳＯＸ１０［ＢＣ３４１］を希釈し、改変トリス希釈剤、ｐＨ６．０中１：１００で最適化し、組織を３０分インキュベートし、次いで、ＴＢＳ中ですすいだ。ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼポリマー検出（ＭＡＣＨ２、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を組織切片に室温で３０分にわたって適用した。次いで、切片をＴＢＳ中ですすぎ、切片を３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）中で５分、またはファストレッド色素原中で１０分インキュベートした。
スコアリング方法：各症例を、細胞の≧１％の染色が観察された場合に「陽性」とみなした。逆に、腫瘍細胞の１％未満の染色を「陰性」症例として決定した。核染色のみを陽性とみなした。
結果
モノクローナルＳＯＸ１０抗体を用いた免疫組織化学的染色により、陽性組織における強力な核染色が生じ、基本的にバックグラウンド染色は伴わなかった。正常組織（ｎ＝３４）では、ＳＯＸ１０は、皮膚メラノサイト、エクリン腺上皮細胞および筋上皮細胞の一部、乳房筋上皮細胞ならびに小葉上皮細胞、唾液腺筋上皮細胞、末梢神経、シュワン細胞、および脳グリア細胞のサブセットにおいて発現し（図２Ａ〜Ｆ）、ＳＯＸ１０は、また、固有筋層の少数の間質細胞および消化管全体を通して固有層および他の種々の組織の稀な間質細胞も染色したが（染色された全細胞集団は＜１％であった）、これらの組織内の他の細胞構成成分は全て、発現を示さず、したがって、これらの組織は陰性とスコア化された（表１）。
ＳＯＸ１０は、黒色腫の２３８／２５７（９２．６％）において発現した（図３Ａ〜Ｄ）（表２）。特に、ＳＣＭおよびＤＭの５０／５１（９８％）がＳＯＸ１０について陽性であり（図４Ａ〜Ｃ）、ＳＯＸ１０はまた、肉腫様黒色腫も染色した（図４Ｄ）。良性の症例では、ＳＯＸ１０は、検査したシュワン細胞腫（２８／２８）において（表４、図５Ａ）、および母斑（２０／２０）において（表２、図５Ｂ）陽性であった。
他の新生物では（表３）、ＳＯＸ１０は、浸潤性乳管癌の１８／１０９（１６．５％）において発現した（図６Ａ）。ＳＯＸ１０は、非浸潤性乳管癌の周囲の筋上皮細胞を染色した（図６Ｂ）。試験した他の癌腫は全てＳＯＸ１０について陰性であった。肉腫の中で、ＳＯＸ１０染色は、平滑筋肉腫の１／２２（４．５％）において、横紋筋肉腫において２／２２（９．１％）、および悪性線維性組織球腫の１／１３（７．７％）において観察され、他の肉腫全ては陰性であった。ＳＯＸ１０染色は、中枢神経系新生物の２５／５２において、主に星状細胞腫の２２／４１（５３．７％）において同定され（図６Ｃ、表３）、限られた症例では、神経膠芽腫、および上衣腫において発現した（表３）。
神経内分泌腫瘍の評価により、ＳＯＸ１０が、結腸、胃、小腸および付属器を含めた消化管のカルチノイド腫瘍の全てにおいて陰性であることが示された。肺および腸カルチノイド腫瘍では、少数の支持細胞がＳＯＸ１０について陽性であったが、新生細胞は陰性であると思われた（図６Ｄ）。
考察
以前の試験により、ＳＯＸ１０が、原発病変および転移病変の両方の黒色腫についての高度に感度が高く特異的な核マーカーであることが示されている１、１１〜５。我々の試験では、原発性皮膚黒色腫の１０６／１１０（９６．４％）がＳＯＸ１０で染色された。これは、ＳＯＸ１０核発現が黒色腫７８例のうち７６例（９７％）において見いだされたＮｏｎａｋａらによる試験とうまく比較される７。Ｓｈｉｎ Ｊらによる試験では、ＳＯＸ１０は、ＤＭの１００％で発現し、紡錘細胞癌、非定型線維黄色腫（ＡＦＸ）および肉腫などの組織学的類似物の全てで陰性であった１３。Ｋａｒａｍｃｈａｎｄａｎｉ ＪＲらも、種々の肉腫の症例の１／７８（１．３％）のみがＳＯＸ１０を発現するという匹敵する結果を示した１６。我々の試験では、ＳＯＸ１０は、線維形成性黒色腫および紡錘細胞黒色腫の５０／５１（９８％）において発現し、また、肉腫の種々の型の４／９９（４．０％）において発現した（表２）。Ｎｏｎａｋａらは、ＳＯＸ１０が悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）の３８／７７（４９％）において発現することを示した７。我々の試験は限定されており、ＭＰＮＳＴは２例のみ含み、そのどちらも陰性であった。
ＤＭおよびＳＣＭは、組織学的類似物および免疫組織化学的染色の限定に起因して、病理医に対して診断上の難題をもたらし得るものである（図４Ａ〜Ｄ）。Ｓ１００は通常ＤＭを染色するにもかかわらず、ＨＭＢ４５およびメランＡなどの他の黒色腫マーカーは、ほとんどの場合陰性であることが示されている１４。ＤＭの他の組織学的類似物としては、切除前瘢痕内の紡錘線維芽細胞または組織球が挙げられる。Ｒａｍｏｓ−Ｈｅｒｂｅｒｔｈ，ＦＩらは、ＳＯＸ１０が瘢痕内のバックグラウンド線維芽細胞および組織球によって発現される可能性がＳ１００よりも低く、したがって、ＳＯＸ１０がこれらの型の症例においてＳ１００よりも優れていることを実証した１５。
Ｓ１００は特異性が欠如しているにもかかわらず、病理医はなお、Ｓ１００を神経堤由来腫瘍の診断に使用している。しかし、ＳＯＸ１０は、高度に特異的であり、黒色腫および末梢神経鞘腫瘍の鑑別診断において、非シュワン細胞腫瘍および非メラニン細胞腫瘍ではめったに発現しないことが示されている。推奨される手法は、黒色腫または末梢神経鞘腫瘍の診断にＳ１００とＳＯＸ１０の両方を含み得る１６。我々の試験では、ＳＯＸ１０は、非メラニン細胞腫瘍の大部分で陰性であった（表３）。これらの所見により他の試験との一致が示される１、７。ＳＯＸ１０は、基底様または三重陰性癌腫を含めた乳癌のサブセットにおいて、および化生性癌において実証されている。したがって、この所見により、これらの新生物が筋上皮分化を示し得るという概念が支持される１８。我々の試験では、ＳＯＸ１０核染色は、正常な乳房筋上皮細胞、ならびに乳房小葉上皮細胞のサブセットにおいて発現し（図２Ｄ）、また、浸潤性乳がんの１６．５％において発現した。ＳＯＸ１０は、種々の型の脳腫瘍を染色することが示されている５、６。Ｂａｎｎｙｋｈ ＳＩらは、大多数の乏枝神経膠腫、ならびに星状細胞腫および神経膠芽腫の大部分がＳＯＸ１０を発現することを実証し５、これは、我々の結果と相関した。
悪性黒色腫（９６．６％）および良性母斑およびシュワン細胞腫（１００％）におけるＳＯＸ１０発現という我々の発見により、十分に公開されたＳＯＸ１０ヤギポリクローナル抗体を使用した他の試験との高い一致が実証された１、１０〜１５、１９。ＲＵＯヤギ一次抗体の使用は研究目的では十分であり得るが、臨床の現場では一般に認められていない可能性がある。ポリクローナル抗体は、ロット間の変動もよく知られており、望ましくない非特異的バックグラウンド染色が生じる可能性がある。Ａｍｒ Ｍｏｈａｍｅｄらによる試験では、黒色腫と乳がんのどちらの顕微鏡写真においても非特異的バックグラウンド染色が観察された１。Ｚｈｏｎｇらによる試験では、ＳＯＸ１０は、良性前立腺組織の細胞質においては強力に陽性であり、前立腺がん組織の細胞質においては弱く陽性であった１９。我々の試験では、新しいモノクローナルＳＯＸ１０抗体により、基本的にバックグラウンド染色のないきれいな核染色が生じた。
結論
要約すると、我々は、新しく開発されたマウスモノクローナルＳＯＸ１０ ＩＨＣ抗体［ＢＣ３４］が、線維形成性バリアントおよび紡錘細胞バリアントを含めた悪性黒色腫に対して高度に感度が高く特異的であり、臨床使用に高度に適すると思われることを示した。
本出願は、２０１３年１０月３日に出願された米国仮出願第６１／８８６，４８８号および２０１４年２月１９日に出願された米国仮出願第６１／９４１，９０７号に対する優先権および利益を主張する国際ＰＣＴ特許出願であり、それぞれの出願はその全体が本明細書に参考として援用される。
本発明は、新規の抗ＳＯＸ１０抗体、組成物、カクテル、および抗体を含むキット、ならびに抗体を使用するための方法に関する。
疾患の診断に関しては、組織試料、特に生検によって得られる組織試料の顕微鏡検査が一般的な方法である。特に、特異的抗体を使用して組織試料における特定のタンパク質の発現を検出する技法である免疫組織化学（ＩＨＣ）は、診断、特にがんの検出および診断のための有益なツールであり得る。
おそらく第２２染色体ｑ１３に位置するＳＲＹ関連ＨＭＧ−Ｂｏｘ遺伝子１０は、おそらく、神経堤、末梢神経系、およびメラニン細胞の発達のために重要であり得る、ヒトにおける転写因子であるＳＯＸ１０として公知のタンパク質をコードする可能性がある。ＳＯＸ１０は、大腸における神経、およびメラノサイトの形成に必須である可能性がある。メラノサイトは、おそらく、皮膚、眼、および毛髪に見いだされる、色素を産生する細胞である。ＳＯＸ１０タンパク質は、メラノサイト、乳房組織、脳神経節、後根神経節、および眼胞を含めたヒト正常組織において広範に発現し得る。ＳＯＸ１０は、おそらく、例えば黒色腫、乳癌、神経膠腫などの悪性腫瘍、ならびに例えばシュワン細胞腫などの良性腫瘍における重要なマーカーでもあり得る。転写因子ＳＯＸ１０は、乏突起膠細胞の分化の重要な決定因子のうちの１つであり得る。大多数の乏枝神経膠腫、最低限に分化した神経膠芽腫である星状細胞腫の大部分も、おそらくＳＯＸ１０を発現する。
線維形成性黒色腫は、浸潤性皮膚黒色腫の稀なバリアントであり得、年間発生率はおそらく、およそ１，０００，０００人に２人である。この黒色腫型に独特の特徴は、深部浸潤、神経周囲浸潤の増加、局所再発、および、おそらく診断の遅延を含み得る。試験により、ＳＯＸ１０は、原発病変と転移性病変の両方の黒色腫についての高度に感度が高く特異的なマーカーであることが示され得る。非新生物性皮膚および良性皮膚のメラノサイトにおける発現、および良性母斑および異形成母斑における発現に基づいて、ＳＯＸ１０は、良性色素性皮膚病変と悪性色素性皮膚病変を区別するために有用なマーカーではない可能性がある。
線維形成性黒色腫（ＤＭ）には、おそらく組織学的類似物の類似性、さらには、おそらく免疫組織化学的染色の限定に起因する診断上の難題が存在する。１つの試験では、ＳＯＸ１０は、ＤＭに対して１００％の感度が示されており、おそらく、ＳＯＸ１０は、紡錘細胞癌、ＡＦＸおよび肉腫を含めた真皮／皮下組織の全ての組織学的類似物において陰性であった。抗Ｓ１００抗体は、一般にはＤＭを染色し得るが、他の黒色腫マーカー（例えば、ＨＭＢ−４５およびメランＡ）は、おそらく陰性であることも多い。
伝統的に、Ｓ１００、ＨＭＢ４５、ＭＡＲＴ−１（おそらくメランＡとしても公知である）、およびチロシナーゼなどの黒色腫マーカーが、黒色腫を同定するための抗体のパネルに使用されている場合がある。抗Ｓ１００抗体は黒色腫のスクリーナーとして使用されている場合があり、おそらく、他の黒色腫マーカーと比較してより感度の高いマーカーであり得るが、Ｓ１００は、転移性黒色腫とその類似物の共通部位であるリンパ節と脳のどちらも染色し得るので、特異性が最適以下であるという不都合があり得る。ＨＭＢ４５、ＭＡＲＴ−１およびチロシナーゼは、おそらくＳ１００タンパク質よりも特異的であり得るが、この抗体のパネルは、線維形成性黒色腫および紡錘細胞黒色腫では陰性であり得、したがって、おそらく、感度が不十分である。
ＭＡＲＴ−１およびチロシナーゼの抗体カクテルは、転移性黒色腫の非常に感度の高いマーカーであることが示されており、おそらく、さらには、Ｓ１００タンパク質に匹敵する（それぞれ約９８％対約１００％）。しかし、Ｓ１００はそれでも、線維形成性黒色腫および紡錘細胞黒色腫に対してより感度が高い可能性がある。線維形成性黒色腫および紡錘細胞黒色腫を含めた黒色腫に対する感度を有するＳＯＸ１０と、おそらく、ＭＡＲＴ−１およびチロシナーゼを含めた１種または複数種の黒色腫マーカーを組み合わせることの潜在的な利益は、おそらく、線維形成性黒色腫または紡錘細胞黒色腫に対しては感度が高くないものであっても、不明であり得る。そのような組合せにより、黒色腫についての優れたマーカーがもたらされ得る。
ＳＯＸ１０は、シュワン細胞およびメラノサイトの特異化、成熟化、および維持のために極めて重要な神経堤転写因子でもあり得る。ＳＯＸ１０はまた、シュワン細胞腫および神経線維腫において拡散的に発現し得る。おそらく、特異性の欠如が十分に特徴付けられているにもかかわらず、Ｓ１００は神経堤由来腫瘍の診断において病理医により常套的に使用され得る。最近の試験により、おそらく、ＳＯＸ１０は、シュワン細胞腫瘍およびメラニン細胞腫瘍において一貫して発現し得、おそらく、Ｓ１００に勝る利点をもたらす、神経堤分化の信頼できるマーカーであることが示されている。
ＳＯＸ１０発現は、正常な乳腺における筋上皮乳房細胞において観察され得る。ＳＯＸ１０は、基底様、未分類三重陰性、および化生性癌の乳がん型において実証されている可能性があり、おそらく、これらの新生物が筋上皮分化を示しうるという概念を支持する。肺がんでは、支持細胞は、肺カルチノイド腫瘍のおよそ半分において見いだすことができる。ＳＯＸ１０抗体を使用して、おそらく、他に分類していない（ＮＥＣ）１１３の肺の症例を調査した。支持細胞は、おそらく定型カルチノイド（ＴＣ）の６６．７％、さらには、おそらく非定型カルチノイド（ＡＣ）症例の５８．３％において観察されている可能性があるが、高悪性度のＮＥＣにおいては観察されていない可能性がある。
ＳＯＸ１０は、おそらく、Ｓ１００と比較した場合、神経堤起源の腫瘍に対する特異性の増大を示し得る。１つの試験では、ＳＯＸ１０は、非シュワン細胞腫瘍、非メラニン細胞腫瘍では、おそらく６６８症例のうち５症例においてのみ陽性であった可能性がある（９９％の特異度）が、一方Ｓ１００は、おそらく６６８症例のうち５３症例において陽性であった可能性がある（９１％の特異度）。したがって、ＳＯＸ１０は、軟部組織腫瘍の診断に関して、Ｓ１００の代わりに、または、おそらくＳ１００と組み合わせて有用であり得る。
現在まで、最も多く公開された試験では、免疫組織化学的（ＩＨＣ）方法のためにヤギポリクローナルＳＯＸ１０を使用した可能性がある。ＩＨＣ方法における使用に関して、モノクローナル抗体が好ましい場合があり、おそらく、さらには、マウスまたはウサギ抗体が好ましい場合があるので、ポリクローナルヤギ抗体は一般には好ましくない場合がある。特に、臨床的診断において使用するＩＨＣ方法に関しては、モノクローナル抗体が好ましく、おそらく、さらには、マウスまたはウサギ抗体が好ましい場合がある。紡錘細胞黒色腫および線維形成性黒色腫を他の腫瘍およびその類似物と区別するためのマーカーの明白な必要性があり得、おそらく、現在までの広範囲にわたる試みでは、そのようなマーカーはもたらされていない可能性がある。ＳＯＸ１０モノクローナル抗体は、おそらく、臨床の現場において、診断に関して高度に有益であると思われる。
したがって、がん診断において使用するための、感度が高く、さらには、特異的な抗ＳＯＸ１０抗体が明白に必要とされている。本発明の実施形態は、高度に感度が高い可能性があり、さらには、高度に特異的である可能性がある、抗ＳＯＸ１０マウスモノクローナル抗体［クローンＢＣ３４］を提供する。本発明の実施例は、これだけに限定されないが、黒色腫、紡錘細胞黒色腫、線維形成性黒色腫、母斑、シュワン細胞腫、乳がん、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫などを含めたある特定のがんにおいてＳＯＸ１０タンパク質が存在するか存在しないかを検出し得るマウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体を提供する。本発明の実施例は、他の正常組織、良性組織および悪性組織に対して、黒色腫に対する優れた感度（約１０５／１０９、約９％）、おそらく、さらには、優れた特異性が実証されている可能性がある。公知のウサギポリクローナル（ＲＰ）抗ＳＯＸ１０抗体と比較して、マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０ ＢＣ３４は、一般には、モノクローナル抗体の利点をももたらすと同時に、よりきれいな染色パターンを伴い、おそらく、より少ないアーチファクトを伴い、おそらく、多くのカルチノイドの染色は伴わず、より高い感度、および、おそらく、より高い特異性が実証されている可能性がある。ＢＣ３４はまた、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体によっては染色されている可能性があるいくつかの検体を染色しない可能性があり、おそらく、これにより、代替物に勝るＢＣ３４の優れた特異性が示される。したがって、診断のために、代替抗ＳＯＸ１０抗体を含めた代替抗体と比較して、ＢＣ３４などのモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体が好ましい場合がある。
抗ＳＯＸ１０抗体の開発は、原発性がん、さらには、転移性がん、特に黒色腫、紡錘細胞黒色腫、線維形成性黒色腫、母斑、シュワン細胞腫、乳がん、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫などの診断に役立ち得る。おそらく、例えばＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体を含めた代替抗ＳＯＸ１０抗体と比較して、同等または優れた染色感度、および、おそらく、さらには、優れた染色特異性を有するマウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体［ＢＣ３４］などの抗ＳＯＸ１０抗体が本発明で提供されている。
本発明の一般的な実施形態は、ＳＯＸ１０を認識するためのモノクローナル抗体、それらを調製するための方法、免疫組織化学における使用などを含み得る。複数の実施形態では、抗ＳＯＸ１０抗体クローンＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体クローンは、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、ヒトＳＯＸ１０タンパク質のアミノ酸１４７〜２５３のサブセットに対応する１種または複数種のタンパク質を用いて免疫することによって得ることができる。ＳＯＸ１０タンパク質を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、アジュバントと共に、腹腔内注射によって、おそらく、約３週間おきに約５回、注射することができる。ＳＯＸ１０に対する免疫反応性は、組換えＳＯＸ１０タンパク質に対する直接ＥＬＩＳＡによって評価することができる。細胞融合によってハイブリドーマを開発するために、最も高い力価を有するマウスを選択することができる。ヒト組織におけるＳＯＸ１０に対する最良の反応性が実証されるハイブリドーマクローンを選択することができ、ＢＣ３４としてデザインすることができる。ＢＣ３４クローンをアイソタイプについて試験することができ、マウスＩｇＧ１として同定することができる。ＢＣ３４抗体は、ハイブリドーマ細胞の大規模組織培養によって、およびＢＡＬＢ／ｃマウスの腹水によって産生させることができる。上清および抗体腹水を採取することができ、抗体をプロテインＡアフィニティーカラムによって精製することができる。ＢＣ３４は、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、さらには、ヒト組織により、ヒトＳＯＸ１０タンパク質に対する特異的な反応性を実証し得る。
マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、組織試料のＳＯＸ１０の検出に関して、おそらく、現在公知のＳＯＸ１０に対する抗体に勝る、いくつかの有意であるが予想外の利点を伴い、有用であり得る。生体試料を試験することができ、それらとして、これだけに限定されないが、皮膚組織、肺組織、膀胱組織、乳房組織、前立腺組織、正常組織、新生物組織、膀胱組織、腎組織、卵巣組織、甲状腺組織、子宮内膜組織、腎組織、扁桃組織、膵臓組織、結腸組織、リンパ節組織、新生物膵組織、胃組織、前立腺組織、肺組織、乳房組織などを挙げることができる。従来の免疫組織化学手順において使用した場合、マウス抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体により、公知の抗ＳＯＸ１０抗体の感度と同様の、または、おそらくそれよりも優れた感度でＳＯＸ１０の核染色がもたらされ得、それにより、有意な改善がもたらされ得る。さらに、ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、おそらく、他の公知の抗ＳＯＸ１０抗体と比較して特異性の増大を示し得、これにより、有意な改善がもたらされ得る。モノクローナル供給源に由来することの可能性のある利点に加えて、ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、他の公知の抗ＳＯＸ１０抗体と比較して、よりきれいな染色をもたらし、より少ないアーチファクト、およびより高い細胞型特異性が伴い、例えば、おそらく、カルチノイドは染色されない。ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体を用いると、試料の分析を簡易化することができ、腫瘍細胞におけるＳＯＸ１０発現を容易に同定可能にすることができ、これにより、他のやり方では診断するのが難しい、不明瞭である、または、さらには、不可能であり得る症例の診断が可能になる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＳＯＸ１０タンパク質に特異的に結合する抗体の単離された調製物であって、前記抗体が、ペプチド配列番号３内のエピトープに結合する、調製物。
（項目２）
ＳＯＸ１０タンパク質に特異的に結合する抗体の単離された調製物であって、前記抗体が、配列番号３からなるペプチドを免疫原として使用して生成したものである、調製物。
（項目３）
ペプチド配列番号３内のエピトープに特異的に結合する抗体の単離された調製物。
（項目４）
前記抗体がモノクローナルである、項目１、２、または３に記載の抗体の単離された調製物。
（項目５）
前記抗体がポリクローナルである、項目１、２、または３に記載の抗体の単離された調製物。
（項目６）
ＡＴＣＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２０９６９の下でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体またはその断片。
（項目７）
ＡＴＣＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２０９６９の下でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されているハイブリドーマ細胞。
（項目８）
前記ハイブリドーマ細胞によって産生される抗体またはその断片をさらに含む、項目７に記載のハイブリドーマ細胞。
（項目９）
項目１、２、３、または６に記載のモノクローナル抗体を産生するための方法であって、
ＳＯＸ１０を特異的に認識することが可能なモノクローナル抗体を産生する前記ハイブリドーマを培養するステップと、
該ハイブリドーマに該モノクローナル抗体を産生させるステップと
を含む方法。
（項目１０）
配列番号１または配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む抗体またはその断片。
（項目１１）
配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列のポリペプチドを含む抗体またはその断片。
（項目１２）
配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗ＳＯＸ１０抗体またはその断片。
（項目１３）
配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗ＳＯＸ１０抗体またはその断片。
（項目１４）
配列番号１または配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む抗体。
（項目１５）
配列番号１または配列番号２と少なくとも約７０％同一である核酸配列を含む、単離および精製された核酸配列。
（項目１６）
配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む抗体。
（項目１７）
前記配列番号１または配列番号２と少なくとも約７０％同一であることが、配列番号１および配列番号２と少なくとも約７０％同一であることを含む、項目１４または１５に記載の配列。
（項目１８）
前記配列番号４または配列番号５と少なくとも約７０％同一であることが、配列番号４および配列番号５と少なくとも約７０％同一であることを含む、項目１６に記載の配列。
（項目１９）
前記少なくとも約７０％同一であることが、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％からなる群から選択される百分率を含む、項目１７に記載の配列。
（項目２０）
前記少なくとも約７０％同一であることが、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％からなる群から選択される百分率を含む、項目１８に記載の配列。
（項目２１）
配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列のポリペプチドを含む抗体またはその断片。
（項目２２）
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＳＯＸ１０抗体またはその断片。
（項目２３）
配列番号６、配列番号７、配列番号８、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗ＳＯＸ１０抗体またはその断片。
（項目２４）
配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号６、配列番号７、配列番号８、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗ＳＯＸ１０抗体またはその断片。
（項目２５）
配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも約２％同一であるアミノ酸配列を含む抗体。
（項目２６）
前記配列番号４または配列番号５と少なくとも約２％同一であることが、配列番号４および配列番号５と少なくとも約２％同一であることを含む、項目２５に記載の配列。
（項目２７）
前記少なくとも約２％同一であることが、少なくとも約２．７％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約５．７％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約８．１％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１０．８％、少なくとも約１１％、少なくとも約１１．４％、少なくとも約１１．７％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１３．９％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１７．１％、少なくとも約１７．２％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約１９．６％、少なくとも約１９．８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２５．４％、少なくとも約２６％、少なくとも約３０％；約２％から約７０％、約２％、約２．７％、約３％、約４％、約５％、約５．７％、約６％、約７％、約８％、約８．１％、約９％、約１０％、約１０．８％、約１１％、約１１．４％、約１１．７％、約１２％、約１３％、約１３．９％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１７．１％、約１７．２％、約１８％、約１９％、約１９．６％、約１９．８％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２５．４％、約２６％、および約３０％の間からなる群から選択される百分率を含む、項目２６に記載の配列。
（項目２８）
配列番号３の残基を含むアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片。
（項目２９）
少なくとも１つが少なくともＳＯＸ１０に特異的に結合する少なくとも２種の抗体またはその断片を含む組成物。
（項目３０）
少なくともＳＯＸ１０に特異的に結合する前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］抗体またはその断片を含む、項目２９に記載の組成物。
（項目３１）
少なくともＳＯＸ１０に特異的に結合する前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、ＳＯＸ１０に特異的に結合し、染色される細胞が約５％より多いという陽性指示カットオフ値を有する、前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つを含む、項目２９に記載の組成物。
（項目３２）
ＳＯＸ１０に特異的に結合する前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、ＳＯＸ１０に特異的に結合し、
−染色される細胞が約２％より多い；
−染色される細胞が約３％より多い；
−染色される細胞が約４％より多い；
−染色される細胞が約５％より多い；
−染色される細胞が約６％より多い；
−染色される細胞が約７％より多い；
−染色される細胞が約８％より多い；
−染色される細胞が約９％より多い；および
−染色される細胞が約１０％より多い
からなる群から選択される陽性指示カットオフ値を有する前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの少なくとも１つを含む、項目２９に記載の組成物。
（項目３３）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、項目２９に記載の組成物。
（項目３４）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、項目２９に記載の組成物。
（項目３５）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列のポリペプチドを含む、項目２９に記載の組成物。
（項目３６）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列の少なくとも約７０％と同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列の少なくとも約７０％であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、項目２９に記載の組成物。
（項目３７）
前記少なくとも約７０％同一であることが、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％からなる群から選択される百分率を含む、項目３６に記載の組成物。
（項目３８）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ならびに配列番号６、配列番号７、配列番号８、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、項目２９に記載の組成物。
（項目３９）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号３のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する、項目２９に記載の組成物。
（項目４０）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号３の残基と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する、項目２９に記載の組成物。
（項目４１）
前記少なくとも約７０％同一であることが、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％からなる群から選択される百分率を含む、項目４０に記載の組成物。
（項目４２）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、ＡＴＣＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２０９６９の下でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体またはその断片を含む、項目２９に記載の組成物。
（項目４３）
一次抗体カクテルを含む、項目２９に記載の組成物。
（項目４４）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片が、少なくとも２つの異なる種に由来する、項目３０に記載の組成物。
（項目４５）
前記少なくとも２つの異なる種が、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ヒト、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目４４に記載の組成物。
（項目４６）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片が、二重染色手順を含む、項目２９に記載の組成物。
（項目４７）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片が、異なる可視化の結果をもたらすことが可能である、項目２９に記載の組成物。
（項目４８）
前記可視化の結果が、呈色の結果を含む、項目４７に記載の組成物。
（項目４９）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの他の前記少なくとも１つが、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、Ｓ１００、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する、項目２９に記載の組成物。
（項目５０）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの他の前記少なくとも１つが、チロシナーゼ抗体、ＭＡＲＴ−１抗体、チロシナーゼ抗体［Ｔ３１１］、ＭＡＲＴ−１抗体［Ｍ２−７Ｃ１０］、ＭＡＲＴ−１抗体［Ｍ２−９Ｅ３］、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目２９に記載の組成物。
（項目５１）
黒色腫検出、母斑検出、乳がん検出、横紋筋肉腫検出、平滑筋肉腫検出、シュワン細胞腫検出、線維形成性黒色腫検出、紡錘細胞黒色腫検出、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される検出組成物を含む、項目２９に記載の組成物。
（項目５２）
前記抗体またはその断片が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２０９６９の下で寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生される、項目１０、１１、１２、２８、または２９に記載の抗体。
（項目５３）
モノクローナル抗体を含む、項目１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２５、または２６に記載の抗体。
（項目５４）
前記モノクローナル抗体が、染色される細胞が１％より多いという陽性指示カットオフ値を有する、項目５３に記載の抗体。
（項目５５）
前記陽性指示カットオフ値が、
−染色される細胞が約２％より多い；
−染色される細胞が約３％より多い；
−染色される細胞が約４％より多い；
−染色される細胞が約５％より多い；
−染色される細胞が約６％より多い；
−染色される細胞が約７％より多い；
−染色される細胞が約８％より多い；
−染色される細胞が約９％より多い；および
−染色される細胞が約１０％より多い
からなる群から選択される、項目５４に記載の抗体。
（項目５６）
前記モノクローナル抗体が、マウスモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ヤギモノクローナル抗体、ウマモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目５３に記載の抗体。
（項目５７）
ポリクローナル抗体を含む、項目１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２５、または２６に記載の抗体。
（項目５８）
前記ポリクローナル抗体が、ウサギポリクローナル抗体、マウスポリクローナル抗体、ヤギポリクローナル抗体、ウマポリクローナル抗体、ニワトリポリクローナル抗体、ヒト化ポリクローナル抗体、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目５７に記載の抗体。
（項目５９）
単離された抗体を含む、項目１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２５、または２６に記載の抗体。
（項目６０）
前記その断片が、その抗原結合性断片を含む、項目１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２５、または２６に記載の抗体。
（項目６１）
前記抗体またはその断片に結合した標識をさらに含む、項目１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２５、または２６に記載の抗体。
（項目６２）
標識とコンジュゲートした項目１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２５、または２６に記載の抗体またはその断片を含むがん診断剤。
（項目６３）
前記標識が、放射性元素、磁性粒子、放射性同位元素、蛍光色素、酵素、毒素、シグナル、染色、検出酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ、色素原、ファストレッド、３，３’−ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目６１に記載の抗体。
（項目６４）
前記標識が、放射性元素、磁性粒子、放射性同位元素、蛍光色素、酵素、毒素、シグナル、染色、検出酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ、色素原、ファストレッド、３，３’−ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目６２に記載の抗体。
（項目６５）
−項目１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片と、
−抗原に結合する際の該抗体または該その断片の抗体検出要素と
を含む、診断または予後診断用検査キット。
（項目６６）
項目６５に記載のキットを使用して生体試料中のＳＯＸ１０を検出するための方法であって、
−生体試料を前記抗体またはその断片と接触させるステップと、
−前記抗体検出要素を使用して、該生体試料における該抗体または該その断片と抗原との結合を検出するステップと
を含む方法。
（項目６７）
前記抗体または前記その断片が、ＳＯＸ１０に特異的に結合する、項目６、７、１０、１１、１２、１３、または１４に記載の抗体。
（項目６８）
がんを検出するための、項目１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片あるいは組成物の使用。
（項目６９）
がんを診断または予後診断するための、項目１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片あるいは組成物の使用。
（項目７０）
がんの治療の転帰を予測するための、項目１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片あるいは組成物の使用。
（項目７１）
がんの治療の有効性を評価するための、項目１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片あるいは組成物の使用。
（項目７２）
がんの再発を予測するための、項目１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片あるいは組成物の使用。
（項目７３）
前記抗体またはその断片または組成物の前記使用を、自動染色デバイスで実施する、項目６８に記載の抗体またはその断片あるいは組成物。
（項目７４）
前記検出を手動で行う、項目６８に記載の抗体またはその断片あるいは組成物。
（項目７５）
前記検出を自動で行う、項目６８に記載の抗体またはその断片あるいは組成物。
（項目７６）
前記検出を画像解析によって行う、項目６８に記載の抗体またはその断片あるいは組成物。
（項目７７）
生体試料中の、項目１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片が結合するタンパク質を検出するための方法であって、生体試料を前記抗体またはその断片と接触させるステップと、該生体試料における該タンパク質に結合した該抗体またはその断片の存在を検出するステップとを含む方法。
（項目７８）
前記生体試料が、肺組織、膀胱組織、乳房組織、および前立腺組織を含む、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記生体試料が、正常組織、新生物組織、膀胱組織、腎組織、卵巣組織、甲状腺組織、子宮内膜組織、腎組織、扁桃組織、膵臓組織、結腸組織、リンパ節組織、新生物膵組織、胃組織、前立腺組織、肺組織および乳房組織からなる群から選択される、項目７７に記載の方法。
（項目８０）
前記タンパク質に結合した前記抗体またはその断片の前記存在を検出する前記ステップを自動染色デバイスで実施する、項目７７に記載の方法。
（項目８１）
前記タンパク質に結合した前記抗体またはその断片の前記存在を検出する前記ステップを手動で行う、項目７７に記載の方法。
（項目８２）
前記タンパク質に結合した前記抗体またはその断片の前記存在を検出する前記ステップを自動で行う、項目７７に記載の方法。
（項目８３）
前記タンパク質に結合した前記抗体またはその断片の前記存在を検出する前記ステップを画像解析によって行う、項目７７に記載の方法。
（項目８４）
検出する前記ステップが、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＦＦＰＥのＩＨＣ、凍結組織切片のＩＨＣ、免疫細胞化学、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される方法を含む、項目７７に記載の方法。
（項目８５）
生体試料中の少なくとも２種の異なるタンパク質を検出するための方法であって、
−該生体試料を、少なくとも１つが少なくともＳＯＸ１０に特異的に結合する少なくとも２種の抗体またはその断片を含む組成物と接触させて、抗原抗体複合体を形成させるステップと、
−該抗原抗体複合体を検出するステップと
を含む方法。
（項目８６）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片が、少なくとも１つの第１の一次抗体と少なくとも１つの第２の一次抗体とを含む、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、項目８５に記載の方法。
（項目８８）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、項目８５に記載の方法。
（項目８９）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ならびに配列番号６、配列番号７、配列番号８、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、項目８５に記載の方法。
（項目９０）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列の少なくとも約７０％と同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列の少なくとも約７０％であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、項目８５に記載の方法。
（項目９１）
前記少なくとも約７０％同一であることが、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％からなる群から選択される百分率を含む、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも約２％と同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも約２％であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、項目８５に記載の方法。
（項目９３）
前記少なくとも約７０％同一であることが、少なくとも約２．７％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約５．７％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約８．１％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１０．８％、少なくとも約１１％、少なくとも約１１．４％、少なくとも約１１．７％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１３．９％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１７．１％、少なくとも約１７．２％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約１９．６％、少なくとも約１９．８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２５．４％、少なくとも約２６％、少なくとも約３０％；約２％から約７０％、約２％、約２．７％、約３％、約４％、約５％、約５．７％、約６％、約７％、約８％、約８．１％、約９％、約１０％、約１０．８％、約１１％、約１１．４％、約１１．７％、約１２％、約１３％、約１３．９％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１７．１％、約１７．２％、約１８％、約１９％、約１９．６％、約１９．８％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２５．４％、約２６％、および約３０％の間からなる群から選択される百分率を含む、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号３の残基を含むアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する、項目８５に記載の方法。
（項目９５）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号３からなる群から選択される残基と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する、項目８５に記載の方法。
（項目９６）
前記少なくとも約７０％同一であることが、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％からなる群から選択される百分率を含む、項目９５に記載の方法。
（項目９７）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、ＡＴＣＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２０９６９の下でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体またはその断片を含む、項目８５に記載の方法。
（項目９８）
前記組成物が、一次抗体カクテルを含む、項目８５に記載の方法。
（項目９９）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片が、少なくとも２つの異なる種に由来する、項目８５に記載の方法。
（項目１００）
前記少なくとも２つの異なる種が、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ヒト、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目１００に記載の方法。
（項目１０１）
前記生体試料を二重染色するステップをさらに含む、項目８５に記載の方法。
（項目１０２）
異なる可視化の結果をもたらすステップをさらに含む、項目８５に記載の方法。
（項目１０３）
前記可視化の結果が、呈色の結果を含む、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
少なくとも２種の抗体またはその断片のそれぞれが、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、Ｓ１００、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する、項目８５に記載の方法。
（項目１０５）
前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの他の前記少なくとも１つが、チロシナーゼ抗体、ＭＡＲＴ−１抗体、チロシナーゼ抗体［Ｔ３１１］、ＭＡＲＴ−１抗体［Ｍ２−７Ｃ１０］、ＭＡＲＴ−１抗体［Ｍ２−９Ｅ３］、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、項目８５に記載の方法。
（項目１０６）
前記抗原抗体複合体を検出する前記ステップが、前記試料における少なくとも２種の抗原抗体複合体の形成を検出するステップを含み、第１の前記抗体が、ＳＯＸ１０に特異的に結合し、第２の前記抗体が、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、Ｓ１００、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される抗原に特異的に結合する、項目８５に記載の方法。
（項目１０７）
動物またはヒトにおけるＳＯＸ１０タンパク質を検出するためのイムノアッセイ法であって、
−試験される動物またはヒトから組織を得るステップと、
−該組織中に該タンパク質が存在する場合に該抗体またはその断片がＳＯＸ１０タンパク質に結合するような量および条件下で、該組織を、項目１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片と接触させるステップと、
−結合した該抗体の存在を検出するステップと
を含むイムノアッセイ法。
（項目１０８）
前記組織を固定または凍結するステップをさらに含む、項目１０７に記載の、動物またはヒトにおけるＳＯＸ１０タンパク質を検出するためのイムノアッセイ法。
（項目１０９）
前記固定または凍結した組織を処理してエピトープをＳＯＸ１０に暴露するステップをさらに含む、項目１０８に記載の、動物またはヒトにおけるＳＯＸ１０タンパク質を検出するためのイムノアッセイ法。
（項目１１０）
免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＦＦＰＥのＩＨＣ、凍結組織切片のＩＨＣ、免疫細胞化学、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される方法を用いて前記動物またはヒトにおける前記ＳＯＸ１０タンパク質を検出するステップをさらに含む、項目１０７に記載の、ＳＯＸ１０タンパク質を検出するためのイムノアッセイ法。
（項目１１１）
ＳＯＸ１０タンパク質に特異的に結合する抗体の単離された調製物であって、該抗体が、配列番号３（ＳＯＸ１０タンパク質の残基１９６〜２１１）からなる群から選択されるエピトープに結合する、調製物。
（項目１１２）
前記生体試料が、皮膚組織を含む、項目７７に記載の方法。
図１は、胸壁の黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図２は、頭皮の黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図３は、肩の黒色腫（１０×拡大率）の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す。染色の低減、または、おそらくおよび染色の非存在がこの試料において観察され得る。 図４は、リンパ節における転移性黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図５は、気球細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図６は、類上皮細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図７は、末梢神経腫瘍の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図８は、血管周囲黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図９は、血管周囲黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図１０は、ラブドイド黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図１１は、肉腫様黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図１２は、形質細胞様黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図１３は、皮膚の複合母斑の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図１４は、頬の真皮内母斑の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図１５は、皮膚の境界母斑の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図１６は、シュワン細胞腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図１７は、正常な結腸における銀親和性細胞を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図１８は、正常な脳神経細胞を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図１９は、正常な乳腺における筋上皮細胞を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図２０は、正常な皮膚を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図２１は、正常な唾液腺を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図２２は、乳房組織、おそらく、乳がんを染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す。 図２３は、図２２と同じ乳房検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、図２２においてＢＣ３４を用いて観察されたものよりも染まり方が強くない可能性がある。 図２４は、肺組織、おそらく、肺腺癌を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、特に図２５と比較して、低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図２５は、図２４と同じ肺検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体（褐色）の例のカラー版を示す。ＳＯＸ１０に関して予測される核染色とは対照的に、この試料では細胞質染色が観察され得る。 図２６は、黒色腫を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、おそらく、図２７において観察されたものよりも染まり方が強い可能性がある。 図２７は、図２６と同じ黒色腫検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、図２６においてＢＣ３４を用いて観察されたものよりも染まり方が強くない可能性がある。 図２８は、黒色腫を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、おそらく、図２９において観察されたものよりも染まり方が強い可能性がある。 図２９は、図２８と同じ乳房検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、図２８においてＢＣ３４を用いて観察されたものと比較して低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図３０は、黒色腫を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、おそらく、図３１において観察されたものよりも染まり方が強い可能性がある。 図３１は、図３０と同じ乳房検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、図３０においてＢＣ３４を用いて観察されたものと比較して低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図３２は、正常な膀胱を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す。染色は、特に図３３と比較して、低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図３３は、図３２と同じ膀胱検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体（褐色）の例のカラー版を示す。ＳＯＸ１０に関して予測される核染色とは対照的に、この試料では細胞質染色が観察され得る。 図３４は、腸カルチノイドを染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図３５は、胞巣状横紋筋肉腫（ａｌｖｅｏｌｕｓ ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図３６は、星状細胞腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図３７は、乳がんの症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図３８は、中間グレードＩＩ平滑筋肉腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図３９は、線維形成性黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図４０は、線維形成性黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図４１は、良性シュワン細胞腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図４２は、紡錘細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図４３は、紡錘細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（１０×拡大率）。 図４４は、紡錘細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４（褐色）の例のカラー版を示す（２０×拡大率）。 図４５は、黒色腫の症例を染色したチロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテル（赤色）の例のカラー版を示す。 図４６は、図４５に示されているのと同じ黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０［ＢＣ３４］（赤色）の例のカラー版を示す。 図４７は、黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテル（赤色）の第１の例のカラー版を示す。 図４８は、黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテル（赤色）の第２の例のカラー版を示す。 図４９は、黒色腫の症例を染色したＢＣ３４（赤色）の例のカラー版を示す。 図５０は、チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルを用いて染色した図４９に示されているのと同じ黒色腫の症例（赤色）のカラー版を示す。おそらく、着色したメラノサイトが観察され得るにもかかわらず、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図５１は、黒色腫の症例を染色したチロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテル（赤色）の例のカラー版を示す。 図５２は、ＢＣ３４を用いて染色した、図５１に示されているのと同じ黒色腫の症例（赤色）のカラー版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図５３は、黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１（赤色）の例のカラー版を示す。 図５４は、Ｓ１００を用いて染色した、図４９に示されているのと同じ黒色腫の症例（赤色）のカラー版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図５５は、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルを用いて染色したリンパ節の例（赤色）のカラー版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図５６は、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルを用いて染色した脳の例（赤色）のカラー版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図５７は、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルを用いて染色した骨髄の例（赤色）のカラー版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図５８は、図５５に示されているのと同じリンパ節の症例においてＳ１００を用いて染色した例（赤色）のカラー版を示す。 図５９は、図５６に示されているのと同じ脳の症例においてＳ１００を用いて染色した例（赤色）のカラー版を示す。 図６０は、図５７に示されているのと同じ骨髄の症例においてＳ１００を用いて染色した例（赤色）のカラー版を示す。 図６１は、本発明の種々の実施形態によるキットの要約の概略図の例を示す。 図６２は、本発明の種々の実施形態によるイムノアッセイ法の要約の概略図の例を示す。 図６３は、胸壁の黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図６４は、頭皮の黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図６５は、肩の黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。染色の低減、または、おそらくおよび染色の非存在がこの試料において観察され得る。 図６６は、リンパ節における転移性黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図６７は、気球細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図６８は、類上皮細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図６９は、末梢神経腫瘍の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図７０は、血管周囲黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図７１は、血管周囲黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図７２は、ラブドイド黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図７３は、肉腫様黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図７４は、形質細胞様黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図７５は、皮膚の複合母斑の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図７６は、頬の真皮内母斑の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図７７は、皮膚の境界母斑の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図７８は、シュワン細胞腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図７９は、正常な結腸における銀親和性細胞を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図８０は、正常な脳神経細胞を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図８１は、正常な乳腺における筋上皮細胞を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図８２は、正常な皮膚を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図８３は、正常な唾液腺を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図８４は、乳房組織、おそらく、乳がんを染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す。 図８５は、図８４と同じ乳房検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体の例の白黒版を示す。染色は、図８４においてＢＣ３４を用いて観察されたものよりも染まり方が強くない可能性がある。 図８６は、肺組織、おそらく、肺腺癌を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す。染色は、特に図８７と比較して、低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図８７は、図８６と同じ肺検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体の例の白黒版を示す。ＳＯＸ１０に関して予測される核染色とは対照的に、この試料では細胞質染色が観察され得る。 図８８は、黒色腫を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す。染色は、おそらく、図８９において観察されたものよりも染まり方が強い可能性がある。 図８９は、図８８と同じ黒色腫検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体の例の白黒版を示す。染色は、図８８においてＢＣ３４を用いて観察されたものよりも染まり方が強くない可能性がある。 図９０は、黒色腫を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す。染色は、おそらく、図９１において観察されたものよりも染まり方が強い可能性がある。 図９１は、図９０と同じ乳房検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体の例の白黒版を示す。染色は、図９０においてＢＣ３４を用いて観察されたものと比較して低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図９２は、黒色腫を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す。染色は、おそらく、図９３において観察されたものよりも染まり方が強い可能性がある。 図９３は、図９２と同じ乳房検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体の例の白黒版を示す。染色は、図９２においてＢＣ３４を用いて観察されたものと比較して低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図９４は、正常な膀胱を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す。染色は、特に図９５と比較して、低減する、または、おそらく、存在しない可能性がある。 図９５は、図９４と同じ膀胱検体を染色したＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体の例の白黒版を示す。ＳＯＸ１０に関して予測される核染色とは対照的に、この試料では細胞質染色が観察され得る。 図９６は、腸カルチノイドを染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図９７は、胞巣状横紋筋肉腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図９８は、星状細胞腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図９９は、乳がんの症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図１００は、中間グレードＩＩ平滑筋肉腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図１０１は、線維形成性黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図１０２は、線維形成性黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図１０３は、良性シュワン細胞腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図１０４は、紡錘細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図１０５は、紡錘細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（１０×拡大率）。 図１０６は、紡錘細胞黒色腫の症例を染色した抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４の例の白黒版を示す（２０×拡大率）。 図１０７は、黒色腫の症例を染色したチロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルの例の白黒版を示す。 図１０８は、図３９Ａに示されているのと同じ黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０［ＢＣ３４］の例の白黒版を示す。 図１０９は、黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルの第１の例の白黒版を示す。 図１１０は、黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルの第２の例の白黒版を示す。 図１１１は、黒色腫の症例を染色したＢＣ３４の例の白黒版を示す。 図１１２は、チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルを用いて染色した図１１１に示されているのと同じ黒色腫の症例の白黒版を示す。おそらく、着色したメラノサイトが観察され得るにもかかわらず、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図１１３は、黒色腫の症例を染色したチロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルの例の白黒版を示す。 図１１４は、ＢＣ３４を用いて染色した、図１１３に示されているのと同じ黒色腫の症例の白黒版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図１１５は、黒色腫の症例を染色したＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の例の白黒版を示す。 図１１６は、Ｓ１００を用いて染色した、図４０Ａに示されているのと同じ黒色腫の症例の白黒版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図１１７は、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルを用いて染色したリンパ節の例の白黒版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図１１８は、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルを用いて染色した脳の例の白黒版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図１１９は、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の抗体カクテルを用いて染色した骨髄の例の白黒版を示す。おそらく、染色が低減しているまたは染色が存在しない可能性がある。 図１２０は、図１１７に示されているのと同じリンパ節の症例においてＳ１００を用いて染色した例の白黒版を示す。 図１２１は、図１１８に示されているのと同じ脳の症例においてＳ１００を用いて染色した例の白黒版を示す。 図１２２は、図１１９に示されているのと同じ骨髄の症例においてＳ１００を用いて染色した例の白黒版を示す。 図１２３は、ＳＯＸ１０のウエスタンブロットを示す。 図１２４は、正常な皮膚、１０×におけるＳＯＸ１０を示す。 図１２５は、正常な乳房、１０×におけるＳＯＸ１０を示す。 図１２６は、正常な唾液腺、１０×におけるＳＯＸ１０を示す。 図１２７は、末梢神経、１０×におけるＳＯＸ１０を示す。 図１２８は、小脳、２０×におけるＳＯＸ１０を示す。 図１２９は、大脳におけるＳＯＸ１０を示す。 図１３０は、メラニン色素染色された黒色腫、１０×におけるＳＯＸ１０を示す。 図１３１は、皮膚黒色腫、２×におけるＳＯＸ１０を示す。 図１３２は、リンパ節における転移性黒色腫におけるＳＯＸ１０を示す。 図１３３は、リンパ節における転移性黒色腫、２０×におけるＳＯＸ１０を示す。 図１３４は、紡錘細胞黒色腫、１０×におけるＳＯＸ１０を示す。 図１３５は、線維形成性黒色腫、２０×におけるＳＯＸ１０を示す。 図１３６は、ｉｎ ｓｉｔｕにおける線維形成性黒色腫の構成成分、２０×におけるＳＯＸ１０を示す。 図１３７は、肉腫様黒色腫、２０×におけるＳＯＸ１０を示す。 図１３８は、シュワン細胞腫、１０×におけるＳＯＸ１０発現を示す。 図１３９は、良性母斑、２０×におけるＳＯＸ１０発現を示す。 図１４０は、侵襲性腺管癌（乳房）２０×におけるＳＯＸ１０発現を示す。 図１４１は、ＤＣＩＳ周囲の筋上皮細胞（乳房）、１０×におけるＳＯＸ１０発現を示す。 図１４２は、星状細胞腫、２０×におけるＳＯＸ１０発現を示す。 図１４３は、腸カルチノイド、支持細胞、１０×におけるＳＯＸ１０発現を示す。
前記の論述から理解され得る通り、本発明は、異なるやり方で組み合わせることができる種々の態様を含む。以下の説明は、要素を列挙するために提供され、本発明の実施形態のいくつかを記載するものである。これらの要素は、最初の実施形態と共に列挙されているが、これらを任意の様式および任意の数で組み合わせて、さらなる実施形態を創出することができることが理解されるべきである。多様に記載されている実施例および好ましい実施形態は、本発明を明確に記載されている系、技法、および適用だけに限定するものと解釈されるべきではない。さらに、本記載は、全ての種々の実施形態、系、技法、方法、デバイス、および適用の説明および請求項を、任意の数の開示される要素と共に、各要素単独と共に、および同様に本出願または任意のその後の出願における全ての要素の任意のかつ全ての種々の入れ替えおよび組合せと共に、支持し、包含するものと理解されるべきである。
本発明の実施形態は、ＳＯＸ１０に特異的に結合し、いくつかの型のがんに対する診断におけるＳＯＸ１０の検出のために使用することができるモノクローナル抗体およびその方法を提供し得る。モノクローナル抗体は、抗体断片、マウスモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、検出可能なシグナルまたは染色で標識された抗体、毒素で標識された抗体などであってよい。モノクローナル抗体は、１つの宿主種に由来する可変領域と異なる種に由来する定常領域、おそらく、ＳＯＸ１０に結合することが知られているマウスモノクローナル抗体に由来する可変領域とウサギＩｇＧ抗体に由来する定常領域で構成されるキメラ抗体であってよい。本発明の系および方法は、ＳＯＸ１０に結合することが可能なモノクローナル抗体またはその抗原結合性部分に関し得る。
マウスモノクローナル抗体は、免疫組織化学手順における一次抗体としての使用を含め、特異的な分析物を同定するためのイムノアッセイ法において一般に使用され得る。目的のタンパク質標的に特異的なマウスモノクローナル抗体は、一般に知られている手順を使用して産生させることができる。一般に、マウスを目的の抗原（例えば、所望の標的のペプチド断片または全長のタンパク質標的）に曝露させることにより免疫応答が誘導され得、その免疫応答では、マウスが、抗原に結合する多数の抗体を生成し、その抗体のそれぞれは、特定のＢ細胞によって産生され得る。これらのＢ細胞をマウス脾臓から単離することができ、産生された抗体を、ＩＨＣにおける一次抗体としてのそれらの適合性について評価することができる。最適な抗体を選択した後、関連するＢ細胞を、公知の手順を使用して腫瘍細胞と融合させることができ、おそらく、それにより、際限なく複製し、所望の抗体を継続的に産生することが可能な新しい細胞株であるハイブリドーマがもたらされる。
ある特定の実施形態では、いくつかの理由でポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体が好ましい場合がある。特に、モノクローナル抗体は、単一のＢ細胞由来であり得、したがって、単一のエピトープを認識することが可能であり、おそらく、それにより、より高い特異性がもたらされる。モノクローナル抗体は、細胞培養において都合よく、かつ再現性よく生成することもでき、おそらく、それにより、所望の抗体の一定した供給がもたらされる。当然、他の実施形態では、ポリクローナル抗体を利用することができる。
マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、これらの一般的な手順を使用して産生させることができ、免疫組織化学により、種々の正常組織および新生物組織に対する感度および特異性について、おそらく、特に以前より公知のＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体と比較して、評価することができる。
ＳＯＸ１０タンパク質の発現の例：アミノ酸配列１４７〜２５３由来のＳＯＸ１０組換えタンパク質をクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉにより発現させることができる。簡単に述べると、ＳＯＸ１０ ｃＤＮＡをクローニングし、精製することができる。ＳＯＸ１０ ｃＤＮＡを制限酵素によって消化し、ｐＥＴ３０ａ−ＧＳＴベクターにライゲーションすることができる。ＢＬ２１細胞を当該構築物で形質転換することができる。正確なサイズの組換えタンパク質を発現するコロニーを選択し、配列決定することができる。さらなるスケールアップ産生を、約０．５ｍＭのＩＰＴＧを含有するＬＢ培地中でＥ．ｃｏｌｉを培養することによって実施することができる。最終的なＳＯＸ１０組換えタンパク質を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析することができる。
宿主免疫の例：雌ＢＡＬＢ／ｃ（約６週齢〜約８週齢）マウスを、マウス当たり約１００μｇの完全フロイントアジュバント中ヒトＳＯＸ１０タンパク質を用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫することができる。約３週間後、マウスを、マウス当たりさらに約１００μｇの不完全フロイントアジュバント中ヒトＳＯＸ１０を用いて、さらに約４回、約３週間おきに追加刺激することができる。マウスの尾部から採血することができ、血清を採取し、後の酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による抗体価の分析のために約−２０℃で保管することができる。
ハイブリドーマの例：ＳＯＸ１０に対する抗体を産生するハイブリドーマは、ＳＯＸ１０で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞から標準の技法によって生成することができる。例えば、ＳＯＸ１０で免疫したマウス由来の脾細胞を、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＳＰ２／０ Ｂａｌｂ／ｃ骨髄腫細胞に由来する非分泌性骨髄腫）と、約４：１の比で約５０％ポリエチレングリコールと一緒にインキュベートすることによって融合することができる。インキュベートした後、細胞を、おそらく、約３００×ｇで約１０分にわたって遠心分離し、ＰＢＳ約２５ｍｌ中で洗浄し、再度遠心分離することによってペレット化することができ、細胞ペレットを、約２０％ウシ胎児血清を含有する新鮮なダルベッコ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）約１００ｍｌに再懸濁することができる。約１００μｌの一定分量を１０個の９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｌｏｗｅｌｌ、ＭＡ）の各ウェルに添加することができる。約２４時間後、約１００μｌ約１Ｍのヒポキサンチン（ＨＴ）、約４ｍＭのアミノプテリンおよび約１６０ｍＭのチミジン（ＨＡＴ）を補充したＤＭＥＭ培地を各マイクロタイターウェルに添加することができる。培地を、おそらく、約４日後に完全培地（おそらく、ＨＡＴおよびＨＴを含有する）と交換することができる。その後の約１０日にわたり、培地を除去し、ＨＡＴおよびＨＴの添加を減らした、または、おそらく、さらには、ＨＡＴおよびＨＴを添加していない新鮮な培地と交換することができる。ハイブリドーマの上清を、ＳＯＸ１０に対する抗体反応性についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができ、次いで、ハイブリドーマクローンを選択し、おそらく、限界希釈により２回クローニングすることによって安定化することができる。
抗ヒトＳＯＸ１０ハイブリドーマクローンＢＣ３４と称されるハイブリドーマ細胞は、これによって参照により本明細書に組み込まれる「Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ ｏｆ Ｄｅｐｏｓｉｔ」という表題の以下に示されている通り、２０１４年２月１１日に、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶｉｒｇｉｎｉａにあるＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｐａｔｅｎｔ Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙに寄託され、ＡＴＣＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２０９６９を受けている。本発明の実施形態は、ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体またはその断片を提供し得、さらには、ＳＯＸ１０を特異的に認識することが可能なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を培養し、さらには、ハイブリドーマにモノクローナル抗体を産生させることによってモノクローナル抗体を産生するための方法も含み得る。

ＥＬＩＳＡ：ＳＯＸ１０に対する宿主抗血清免疫応答は、ＥＬＩＳＡによって測定することができる。例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中ＳＯＸ１０溶液（約１μｇ／ｍｌ）を使用して、約９６ウェル平底ポリスチレンプレートをコーティングすることができる。次いで、プレートを、約１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＰＢＳを用いてブロッキングすることができる。希釈した免疫血清またはハイブリドーマの上清のいずれかを添加し、約３７℃で約１時間インキュベートすることができる。プレートをＰＢＳで洗浄した後、プレートをヤギ抗マウス−ＨＲＰ試薬（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）と一緒にインキュベートすることができる。インキュベーションは、約３７℃で約３０分にわたって行うことができる。ＡＢＴＳ基質を添加して色を生じさせることができ、約４０５ｎｍにおける吸光度（Ａ４０５）をマイクロタイタープレートリーダーで測定することができる。
モノクローナル抗体のアイソタイプ：ＢＣ３４モノクローナル抗体などの抗ＳＯＸ１０抗体を、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を使用してアイソタイピングすることができる。例えば、マウスモノクローナル抗体［ＢＣ３４］細胞由来の上清約１００μｌを、ヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ、およびＩｇＡをコーティングしたプレートに添加することができる。約３０分インキュベートした後、プレートをＰＢＳで約３回洗浄することができ、それをヤギ抗マウスＩｇ−ＨＲＰ試薬と一緒にインキュベートすることができる。ＡＢＴＳ基質を添加して色を生じさせ、約４０５ｎｍにおける吸光度（Ａ４０５）をマイクロタイタープレートリーダーで測定することができる。ＢＣ３４クローンをアイソタイプについて試験することができ、マウスＩｇＧ１／カッパとして同定することができる。
抗体産生および精製：クローンＢＣ３４由来の選択されたハイブリドーマ細胞を、約１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地または任意の無血清培地で培養することができる。培養上清をプロテインＡアフィニティーカラムによってさらに精製することができる。また、ハイブリドーマ細胞をプリスタンで初回刺激したＢＡＬＢ／ｃマウスに注射して抗体腹水を生じさせることができる。抗体腹水をプロテインＡアフィニティーカラムによってさらに精製することができる。ＩｇＧの濃度を、マウスＩｇＧに対する吸光係数、約２８０ｎｍにおいて約１．４を使用して分光光度的に測定することができる。ＩｇＧの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定することができる。
ウエスタンブロッティング：精製されたモノクローナル抗体［ＢＣ３４］をウエスタンブロッティングによって特徴づけることができる。全長ＳＯＸ１０をトランスフェクトした細胞溶解物（Ｏｒｉｇｅｎｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液を用いた約４％〜約１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用したタンパク質ゲル電気泳動に供することができ、Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝液中ニトロセルロースフィルターに転写することができる。ブロット上のタンパク質を、ＢＣ３４抗体をブロッキング緩衝液でブロッキングした後、室温で約６０分インキュベートし、おそらく、その後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗マウス免疫グロブリンと一緒にインキュベートすることによって可視化することができる。ブロットを、ＴＭＢ色素原を使用して検出することができる。
ＶＨ配列およびＶＬ配列の決定：全ＲＮＡを、ハイブリドーマからＱｉａｇｅｎ ｋｉｔ（ＵＳＡ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を製造者の説明書の通り使用して抽出することができる。ハイブリドーマ細胞由来の全ＲＮＡを、６μＭのランダムなプライマーミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、０．５ｍＭの各ヌクレオチドｄＮＴＰ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、５ｍＭのＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４０ＵのＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、および２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含有する最終体積２０μｌで逆転写した。逆転写（ＲＴ）反応を、４２℃で５分、２５℃で１０分、５０℃で６０分および９４℃で５分、実施した。マウスＩｇｈおよびＩｇｋ可変領域を、それぞれ独立に、鋳型としてｃＤＮＡ１μｌから出発する２ラウンドのネステッドＰＣＲによって増幅した。全てのＰＣＲ反応を、２００ｎＭの各プライマーまたは全プライマーミックス（表１）、３００μＭの各ｄＮＴＰ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）０．１ｕｌを含有する総体積２０μｌで実施した。ＰＣＲの第１ラウンドを９４℃で１５分、その後、９４℃で３０秒、５６℃（Ｉｇｈ）または５０℃（Ｉｇｋ）で３０秒、７２℃で５５秒の３０サイクル、および７２℃で１０分の最終的なインキュベーションで実施した。ネステッド第２ラウンドＰＣＲを、精製していない第１ラウンドＰＣＲ産物１μｌを用い、９４℃で１５分、その後、９４℃で３０秒、６０℃（Ｉｇｈ）または４５℃（Ｉｇｋ）で３０秒、７２℃で４５秒を３０サイクル、および７２℃で１０分の最終的なインキュベーションで実施した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分析し、切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製した。精製されたＰＣＲ産物をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）によってクローニングした。８つのコロニーをランダムに選択し、Ｍ１３フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いたコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製し、Ｔ３プロモーター配列決定プライマーおよび分析を使用して配列決定した。ＩＭＧＴ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏ−ＧｅｎｅＴｉｃｓ）／Ｖ−ＱＵＥＳＴデータベースを適用してＶＨ配列およびＶＬ配列を解析し、相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定した（表２）。（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｓｈａｒｅ／ｔｅｘｔｅｓ／）

ＢＣ３４可変ドメインについて配列決定して、配列番号３として特定されるＳＯＸ１０エピトープＱＧＧＴＡＡＩＱＡＨＹＫＳＡＨに結合する本明細書に記載のモノクローナル抗体の軽鎖可変領域、および／または重鎖可変領域のＣＤＲのうちの１つまたは複数のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドをもたらした。重鎖の可変領域の配列は配列番号１として特定され、軽鎖の可変領域の配列は配列番号２として特定される。重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号４として特定され、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号５として特定される。抗体またはその断片は、配列番号１および／または配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み得るポリペプチドを含み得る。抗体またはその断片は、配列番号４および／または配列番号５のアミノ酸配列のポリペプチドを含み得る。抗体またはその断片は、配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み得、さらには、配列番号１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み得る。抗体またはその断片は、配列番号５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み得、さらには、配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み得る。抗体またはその断片は、配列番号３のアミノ酸配列からなる少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合し得る。本明細書で言及されている通り、その断片は、その抗原結合性断片を含み得る。
複数の実施形態では、抗体またはその断片、または、さらには、単離および精製された核酸配列は、配列番号１および／もしくは配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列ならびに／または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有し得る。複数の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号４および／もしくは配列番号５のアミノ酸配列ならびに／または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列を有し得る。抗体またはその断片は、配列番号３の残基と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合し得る。他の百分率としては、これだけに限定されないが、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および、おそらく、さらには、少なくとも約９９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％などを挙げることができる。
他の実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号６、７、８、９、１０、および／または１１のアミノ酸配列およびそれらの任意の組合せからなるポリペプチドを含み得る。抗体またはその断片は、配列番号９、１０、および／または１１のアミノ酸配列またはそれらの任意の組合せを有する軽鎖可変領域を含み得、さらには、配列番号６、７、および／または８のアミノ酸配列またはそれらの任意の組合せを有する重鎖可変領域を含み得る。
表２および配列番号６〜１１に関して、抗体またはその断片は、おそらく、配列番号４および／または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも約２％から少なくとも約２６％まで同一のアミノ酸配列を有し得る。他の百分率としては、これだけに限定されないが、少なくとも約２％、少なくとも約２．７％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約５．７％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約８．１％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１０．８％、少なくとも約１１％、少なくとも約１１．４％、少なくとも約１１．７％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１３．９％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１７．１％、少なくとも約１７．２％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約１９．６％、少なくとも約１９．８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２５．４％、少なくとも約２６％、少なくとも約３０％；約２％から約７０％、約２％、約２．７％、約３％、約４％、約５％、約５．７％、約６％、約７％、約８％、約８．１％、約９％、約１０％、約１０．８％、約１１％、約１１．４％、約１１．７％、約１２％、約１３％、約１３．９％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１７．１％、約１７．２％、約１８％、約１９％、約１９．６％、約１９．８％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２５．４％、約２６％、約３０％の間などを挙げることができる。
マウス抗ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］結合性配列のエピトープマッピング：ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体によって認識されるＳＯＸ１０のペプチド配列を決定するために、おそらく、２種のアッセイ：直接ＥＬＩＳＡ、さらには、ドットブロットを使用してエピトープマッピングを行うことができる。ＥＬＩＳＡアッセイでは、抗ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］抗体の感度および特異性を、抗体価を約１：５００および約１：１０００で測定することによって決定することができる。ヒトＳＯＸ１０タンパク質配列のおそらく１４７アミノ酸から２５３アミノ酸を包含する、それぞれ長さ約１５アミノ酸の重複するペプチドを使用して、結合するＢＣ３４の配列を決定することができる。
ＢＣ３４に対するエピトープは、ＳＯＸ１０の残基１９６〜２１１アミノ酸、配列番号３として特定されるＱＧＧＴＡＡＩＱＡＨＹＫＳＡＨに含まれることが示された。マウスモノクローナルＳＯＸ１０抗体に対するエピトープ、またはその一部は、マウス以外の種（例えば、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリなど）における産生を含めた、新しいモノクローナル抗体の産生のための有用な抗原であり得る。当然、ポリクローナル抗体は、ＳＯＸ１０タンパク質の残基１９６〜２１１に関する配列番号３内のエピトープに特異的に結合し得る。
直接ＥＬＩＳＡプロトコールに関しては、まず、プレートを、ＳＯＸ１０ペプチド約１００μｌをコーティング緩衝液（ｐＨ約９．５）中約５μｇ／ｍＬで用いて約４℃で一晩コーティングし、その後、約２００μｌ／ウェル、室温で約１時間ブロッキング（約３％ＢＳＡ）することができる。プレートを、別々に約１００ｎｇ／ｍＬの精製したＳＯＸ１０抗体および約２００ｎｇ／ｍＬの精製したＳＯＸ１０抗体と一緒に、ＥＬＩＳＡ−プレート振とう機において約室温で約１時間インキュベートすることができる。次いで、プレートを、おそらく、ＰＢＳＴ（約３００μｌ／ウェル）で５回洗浄し、その後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰをプレートに添加し、プレート振とう機において約１時間インキュベートすることができる。次いで、プレートをＰＢＳＴ（約３００μｌ／ウェル）で洗浄し、ブロットして乾燥させ、ＴＭＢを約１００μｌ／ウェルで添加し、振とう機において約５分展開することができ、さらには、その後に、停止液（約５０μｌ／ウェル）を添加することができる。約４５０ｎｍにおける吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで、おそらく、製造者の推奨に従って測定することができる。
ドットブロットアッセイに関しては、ニトロセルロースメンブレンを、約１ｍｇ／ｍｌの濃度のペプチド約１μｌを用い、ペプチド当たり４連でブロットすることができる。このメンブレンを、完全に乾燥し得るまで室温で約１時間インキュベートすることができる。メンブレンを、ＴＢＳＴ（例えば、約５０ｍＭのＴｒｉｓ、約０．５ＭのＮａＣｌ、約０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ約７．４）中約３％ＢＳＡを用いて室温で約１時間ブロッキングすることができ、次いで、マウス抗ＳＯＸ１０抗体［ＢＣ３４］を約２００ｎｇ／ｍｌでＲＴ、約１時間にわたってＴＢＳＴに添加することができる。次いで、メンブレンをオービタルシェーカー内、ＴＢＳＴ中で約３回（各約１０分）洗浄し、その後、二次抗体ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＡＰと一緒に室温で約１時間、ＴＢＳＴ中でインキュベートすることができる。メンブレンを、おそらく、ロッカーにおいて、ＴＢＳＴ中で約３回（各約１０分）洗浄することができる。結合を、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｇｌｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ検出試薬を添加し、フィルムに曝露することによって検出することができる。
抗ＳＯＸ１０ ＢＣ３４を用いたＩＨＣ方法：マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体を使用した免疫組織化学を、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料に対して、以下の非限定的な例によって一般に例示される通り、当業者に一般に公知の手順を使用して実施することができる（例えば、ステップ間にトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ約７．６を用いた洗浄）：
１）ホルマリン固定パラフィン包埋組織の切片（約５μｍ）を、おそらく、ポリリシンでコーティングした市販の顕微鏡スライドに乗せることができる。
２）切片を脱パラフィンすることができ（キシレンまたはキシレン置換を使用して）、おそらく、一連のアルコール／水溶液によって再水和することができ、おそらく、その後、内在性ペルオキシダーゼを、おそらく、約３％過酸化水素溶液を用いてブロッキングすることができる。
３）試料を、圧力鍋（Ｄｉｖａ、Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ； Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）中でクエン酸緩衝液を使用した熱誘導性抗原回復に供することができ、約３０秒にわたって約１２５℃まで加熱することができる。［当業者に公知の他の抗原回復方法（例えば、蒸し器、電子レンジ、酵素など）も許容され得る］。組織を約１０分にわたって冷まし、次いで、脱イオン水ですすぐことができる。
４）タンパク質ブロッキング溶液（Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｐｕｎｉｓｈｅｒ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を約１０分にわたって組織に適用することができる。
５）ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４を、ウシ血清アルブミンを担体タンパク質として伴うトリス−緩衝溶液（ｐＨ約６．２）中に約３０分にわたって適用することができる。ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４を、おそらく、１：１０，０００に希釈することができる。
６）おそらく、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした二次抗体（ＭＡＣＨ ２ Ｍｏｕｓｅ ＨＲＰ−Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いたＳＯＸ１０抗体の検出を、ヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲートを約３０分にわたって適用することによって実現することができる。別の例では、おそらく、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした二次抗体（ＭＡＣＨ ４ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＨＲＰ−Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いたＳＯＸ１０抗体の検出を二段階で実現することができる。最初にウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を約１０分にわたって適用した後、ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲートと一緒に約１０分インキュベートすることができる。
７）おそらく、最終的な検出ステップでは、おそらく、約０．０２％過酸化水素（Ｂｅｔａｚｏｉｄ ＤＡＢ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を含有する緩衝液中３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を適用することができる。ＨＲＰ媒介性機構によるＤＡＢの酸化により、褐色の発色性産物が沈殿し得、おそらく、それにより、ＳＯＸ１０発現の部位を同定することが可能になる。
８）スライドを、簡単に述べると、おそらく、改変マイヤーヘマトキシリンで対比染色することができる。
アルカリホスファターゼ検出およびファストレッド色素原を使用した、抗ＳＯＸ１０ ＢＣ３４を用いたＩＨＣ方法：同様に、ＢＣ３４を使用したＩＨＣを、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）とコンジュゲートした二次抗体およびファストレッド色素原を使用して、上記の通り実施することができる。例えば、おそらく、ＡＰとコンジュゲートした二次抗体（ＭＡＣＨ ２ Ｍｏｕｓｅ ＡＰ−Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いたＳＯＸ１０抗体の検出は、ヤギ抗マウスＡＰコンジュゲートを約３０分にわたって適用することによって実現することができる。おそらく、最終的な検出ステップでは、緩衝液（Ｖｕｌｃａｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）中ナフトールリン酸塩（例えば、ナフトールリン酸ＡＳ−ＴＲ）およびジアゾニウム塩（例えば、ファストレッドＫＬ）を適用することができる。アルカリホスファターゼによるリン酸の切断、その後の、生じたナフトールとジアゾニウム塩の反応により、赤色の発色性産物が沈殿し得、おそらく、それにより、ＳＯＸ１０発現の部位を同定することが可能になる。
ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４、チロシナーゼ抗体Ｔ３１１、およびＭＡＲＴ−１抗体Ｍ２−７Ｃ１０およびＭ２−９Ｅ３を用いたＩＨＣ方法：ＩＨＣを、おそらく、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］、チロシナーゼ抗体［Ｔ３１１］、および、おそらく、さらには、ＭＡＲＴ−１抗体［Ｍ２−７Ｃ１０］および［Ｍ２−９Ｅ３］で構成される一次抗体カクテルを使用して上記の通り実施することができる。各抗体の検出を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした二次抗体（ＭＡＣＨ ４ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＨＲＰ−Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を用いて、おそらく、二段階で実現することができる。ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体の約１０分にわたる最初の適用の後、ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲートと一緒に約１０分インキュベートし、その後、ＤＡＢを用いて可視化することができる。
マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４を用いたＩＨＣ染色の結果：上記のプロトコールを使用して、種々の正常組織および新生物組織を、ＢＣ３４を使用し、いくつかの場合には、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体を使用した染色パターンと比較して、ＳＯＸ１０発現について評価した。全ての抗体を、当業者に周知の方法を使用して力価（例えば、濃度）について最適化した。例えば、おそらく、バックグラウンド染色を最小化またはさらには排除しながら染色強度が最大になるように、種々の抗体価を評価した。各抗体について、おそらく最小のバックグラウンド染色で最大の染色強度をもたらした力価を使用した。
ＢＣ３４を用いた染色は、図１〜３および図６３〜６５に示されている種々の黒色腫の症例において観察され得る。実際、リンパ節に転移する黒色腫もＢＣ３４によって同定することができる（図４および６６）。いくつかの場合、特にメラノサイトの内在性色素が存在し得る黒色腫の症例では、赤色色素原を用いた染色が有利であり得る。ＢＣ３４は、気球細胞黒色腫（図５および６７）、類上皮細胞黒色腫（図６および６８）、血管周囲黒色腫（図８〜９および７０〜７１）、ラブドイド黒色腫（図１０および７２）、肉腫様黒色腫（図１１および７３）、および形質細胞様黒色腫（図１２および７４）の症例を染色し得る。
ＢＣ３４を用いた染色は、末梢神経腫瘍（図７および６９）、ならびに母斑の症例（図１３〜１５および図７５〜７７）においても観察され得る。シュワン細胞腫もＢＣ３４で染色され得る（図１６および７８）。
正常組織では、正常な結腸における銀親和性細胞、正常な脳神経細胞、乳腺、正常な皮膚、および正常な唾液腺の筋上皮細胞は、ＢＣ３４で染色され得る（図１７〜２１および図７９〜８３）。
ＢＣ３４を用いた染色は、特に、ＢＣ３４がより高い感度、または、おそらく、染色強度の増大を示す症例、ならびにＢＣ３４が、おそらく、より特異的である症例において、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体を用いた染色よりも優れている可能性がある。例えば、ＢＣ３４は、乳がんの症例（図２２および８４）において、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体（図２３および８５）と比較して、より染まり方が強い染色を示し得る。
肺腺癌では、ＢＣ３４は、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体と比較して改善された特異性を実証し得る。例えば、ＢＣ３４を用いた染色は、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体が細胞質染色を生じる症例では低減する、または、おそらく存在しない可能性があり（図２４および８６）、これは、ＳＯＸ１０発現（図２５および８７）とは一致しないと思われる。
黒色腫の症例でも、ＢＣ３４を用いて、同じ検体に対するＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体の染色と比較してより染まり方が強い染色が実証され得（図２６、２８、３０、８８、９０、および９２）、そこで、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体を使用すると、染色は低減する、または、おそらく、さらには、存在しない可能性がある（図２７、２９、３１、８９、９１、９３）。
正常な膀胱では、ＢＣ３４は、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体と比較して改善された特異性を実証し得る。例えば、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体により細胞質染色が生じる症例では、ＢＣ３４を用いた染色は、低減する、または、おそらく存在しない可能性があり（図３２および９４）、これは、ＳＯＸ１０発現とは一致しないと思われる（図３３および９５）。
ＢＣ３４は、おそらく、腸カルチノイド（図３４および９６）、胞巣状横紋筋肉腫（図３５および９７）、星状細胞腫（図３６および９８）、乳がん（図３７および９９）、平滑筋肉腫（図３８および１００）を含めた他の新生物組織も染色し得る。ＢＣ３４は、良性シュワン細胞腫（図４１および１０３）も染色し得る。
ＢＣ３４での染色は、線維形成性黒色腫（図３３〜３４）および紡錘細胞黒色腫（図４２〜４４および図１０４〜１０６）においても観察され得る。
黒色腫は、チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルを含めたチロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１によっても染色され得る（図４５および１０７）。ＢＣ３４は、同じ黒色腫の症例も染色し得る（図４６および１０８）。ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルは、黒色腫（図４７、４８、１０９、１１０）を染色し得、おそらく、Ｓ１００単独、またはチロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１単独よりも感度が高い（表４）。図４８および１１０に示されているものなどの症例では、ＳＯＸ１０およびチロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１は、ＳＯＸ１０の核染色およびチロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１の細胞質染色によって同定することができる腫瘍の異なる領域を染色し得る。腫瘍における示差的染色は、おそらく、腫瘍における２つ以上のクローンの存在を示し得る。
いくつかの黒色腫の症例は、ＢＣ３４で染色され得るが（図４９および１１１）、おそらく、チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１では染色されない（図５０および１１２）。他の黒色腫の症例は、チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１で染色され得るが（図５１および１１３）、おそらく、ＢＣ３４では染色されない（図５２および１１４）。
ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルは、おそらく、Ｓ１００では染色されない黒色腫の症例を染色し得る（図５３、５４、１１５および１１６）。このように、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルは、Ｓ１００よりも感度が高い可能性がある。
ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルは、特異性もＳ１００より高い可能性がある。ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１は、リンパ節、脳、または骨髄を染色しない（図５５〜５７および図１１７〜１１９）。Ｓ１００の１つの不都合は、正常なリンパ節、脳、および骨髄を含めた、黒色腫以外の組織において染色が観察されることである（図５８〜６０および図１２０〜１２２）。リンパ節、脳および骨髄は、黒色腫転移の共通部位であり得る。これらの正常組織におけるＳ１００の染色により、特に、病理医が小さな転移の同定を試みる場合に、診断が難しくなり得る、または、おそらく、さらには、不正確な診断がもたらされる。
抗ＳＯＸ１０抗体［ＢＣ３４］を、種々の正常組織および新生物組織に対するＩＨＣによって評価した。一般には、染色される腫瘍細胞が≧約５％であるというカットオフを、症例をＳＯＸ１０について「陽性」と決定するための基準として使用し、逆に、染色される腫瘍細胞が＜約５％であることを、症例を「陰性」と決定するための基準として使用した。
正常組織（ｎ＝３４）では、ＢＣ３４により、皮膚メラノサイト、乳腺および唾液腺の筋上皮細胞、末梢神経、および脳が染色された（表３）。同様に、ＢＣ３４により、消化管全体を通して銀親和性細胞も染色された。ＢＣ３４により、黒色腫の２００／２１９（９１．３％）が染色された（表４）。特に、紡錘細胞黒色腫および線維形成性黒色腫の２３／２４（９５．８％）がＳＯＸ１０について陽性であった。さらに、シュワン細胞腫および母斑についての染色は１００％であった。
試験した新生物（ｎ＝５８７）では、ＳＯＸ１０は、浸潤性乳管がんの１８／１０９（１６．５％）で発現し、肺、結腸、前立腺、膀胱、腎臓、肝臓、食道、卵巣、甲状腺、副腎、および精巣セミノーマを含めた他の癌腫（ｎ＝４２６）のいずれにおいても発現しなかった（表５）。ＳＯＸ１０は、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｏｃｏｍａ）の２／２１、平滑筋肉腫の１／２１、およびＣＮＳ神経膠腫の３５％において陽性であった。消化管におけるカルチノイド腫瘍および肺におけるカルチノイド腫瘍は、支持細胞が染色された以外は全て陰性であった。
黒色腫では、ＳＯＸ１０、チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１のカクテルは、ＳＯＸ１０単独、Ｓ１００単独、または、さらには、チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルよりも感度が高い可能性がある（表６）。チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１の染色は細胞質染色であり得（図３９Ａ）、ＳＯＸ１０の染色は核染色であり得る（図４６および１０８）。ＳＯＸ１０＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルでは、核染色（ＳＯＸ１０）と細胞質染色（ＭＡＲＴ−１およびチロシナーゼ）の組合せが示され得る（図４７、４８、１０９、１１０）。いくつかの場合には、ＳＯＸ１０は陽性であり得、チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１は陰性であり得る（図４９、５０、１１１、および１１２）、または逆もまた同じである（図５１、５２、１１３、および１１４）。ＳＯＸ１０＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１のカクテルは、Ｓ１００が陰性である症例において陽性であり得る（図５３、５４、１１５、１１６）。１つの症例では、おそらく、Ｓ１００について陽性であり、ＳＯＸ１０＋チロシナーゼ＋ＭＡＲＴ−１について陰性であることが見いだされた。ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］はまた、リンパ節、脳および骨髄においても陰性であり得るが（図５５〜５７および図１１７〜１１９）、一方、Ｓ１００は、これらの組織を染色し得る（図５８〜６０および図１２０〜１２２）。



これらの実施例により、ＢＣ３４の利点が実証され、おそらく、ＢＣ３４が、公知の抗体と比較して、場合によってバックグラウンドまたは望ましくない細胞質染色が少ない、よりきれいな染色パターンをもたらす優れた感度または特異性を含めた、いくつかの有利な点を有することが示される。
本発明の一部の実施形態では、マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、上記のプロトコールおよび当業者に公知の他の方法の多くの変形における使用に適し得る。ＢＣ３４を用いて染色した検体は、恒久的なマウンティング培地およびカバーガラスを使用して保管することができる。抗体ＢＣ３４は、自動染色計器において標準のプロトコールを使用して使用することもできる。当業者に一般に知られている多くの代替的な検出方法（例えば、蛍光）、検出酵素（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼなど）、および、おそらく、さらには、色素原（例えば、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドなど）の使用を構想することもできる。
マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体のエピトープ、またはその一部は、当業者には理解される通り、マウス以外の種（例えば、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリなど）における産生を含めた、新しいモノクローナル抗体の産生のために有用な抗原であり得る。実際、ＢＣ３４の特定のエピトープは、その有利な性質に寄与する特徴のうちの１つであり得る。
ホルマリン固定パラフィン包埋組織の免疫組織化学におけるＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体の使用は本明細書に記載され得、他のイムノアッセイにおけるその有用性は、容易に構想することができ、本出願に包含されるものとする。特に、ＦＦＰＥのＩＨＣにおいて使用される同じ試薬の多くを凍結組織切片のＩＨＣにおいても使用することができることは周知であり得る。ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、ＥＬＩＳＡを含めた他のイムノアッセイにおいても、おそらく、一般に公知の方法を使用して、有用であり得る。
おそらく、ＩＨＣに関連する本発明の別の態様では、抗ＳＯＸ１０抗体をカクテルの一部として１種または複数種の追加的な一次抗体と併せて使用して、「二重染色」手順（多重染色または、さらには、マルチプレックスとしても記載される）を実施することができる。そのような「二重染色」手順は、一般に当技術分野で周知であり得るが、特定の診断への適用のための一次抗体の最良の組合せは公知でない場合がある。
この方法では、マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体を、おそらく、検体への同時適用に適した単一の一次抗体カクテル中に１種または複数種の抗体と組み合わせることができる。抗体は、マウス宿主またはウサギ宿主などに由来するものであってよい。抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。複数の実施形態では、抗体カクテルを二重染色ＩＨＣ手順において使用して、組織検体中に標的タンパク質抗原が存在するか存在しないかを同定することが可能な、２つまたはそれより多くの色を呈した染色を生じさせることができる。例えば、抗体カクテルがマウス抗体およびウサギ抗体で構成され得る複数の実施形態では、検出系は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートした抗マウス抗体を含み得、おそらく、さらには、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）とコンジュゲートした抗ウサギ抗体を使用して、２色染色を生じさせることができる。３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用して褐色染色を生じさせることができ、これは、おそらく、ＨＲＰによって容易になり、また、これにより、検体における、結合したマウス抗体が存在するか存在しないか、および／またはその場所を同定することができ、ファストレッドを使用して、鮮やかな赤紫色／赤色染色を生じさせることができ、これは、おそらく、ＡＰによって容易になり、また、これにより、検体における、ウサギ抗体が存在するか存在しないか、および／またはその場所を同定することができる。他の実施形態では、検出系は、ＡＰとコンジュゲートした抗マウス抗体およびＨＲＰとコンジュゲートした抗ウサギ抗体を含み得、おそらく、ファストレッドおよびＤＡＢを色素原として使用することができる場合に、これを使用して、赤色に染色されたマウス抗体および褐色に染色されたウサギ抗体が存在するか存在しないか、および／またはその場所を同定することができる２色染色を生じさせることができる。一部の実施形態では、ＨＲＰとコンジュゲートした抗マウス抗体、および、おそらく、ＡＰとコンジュゲートした抗ウサギ抗体を、単一溶液中のカクテルとして検体に適用することもでき、別々の逐次的なステップで適用することもできる。
抗体−酵素コンジュゲートを含む抗マウス抗体または抗ウサギ抗体は、これだけに限定されないが、マウス、ウサギ、ニワトリ、ウマ、ラット、ヤギ、ヒツジなどを含めた異なる宿主種に由来するものであってよい。一次抗体は、これだけに限定されないが、マウス、ウサギ、ニワトリ、ウマ、ラット、ヤギ、ヒツジなどを含めた種々の宿主種に由来するものであってよい。複数の実施形態では、抗体は、抗体−酵素コンジュゲートを含んでよく、一次抗体は、２つの異なる宿主種から得ることができる。ＤＡＢおよび／またはファストレッド以外の色素原も同様に使用することができる。
これだけに限定されないが、３種以上の抗体の使用、マウスおよびウサギ以外の種の使用、他の色素原および検出系、異なる順序の検出ステップ、および、おそらく、さらには、３色またはそれより多くをもたらす改変（変性ステップを必要とする場合がある）を含めた、二重染色法に対する多数の代替法が可能である。
一部の実施形態では、一次抗体カクテルに対して単色染色を使用することができる。一実施例では、一次抗体カクテルが全て同じ宿主種に由来する抗体で構成される場合、単一の検出系を使用して、抗体の全ての存在について単色で染色することができる。各抗体が存在するか存在しないかを細胞の局在化に基づいて決定することができる、または、おそらく、そのような決定は必要なく、各抗体が存在するか存在しないかを同定せずに染色を有効に解釈することができる。例えば、マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４をマウスモノクローナル抗ＭＡＲＴ１と一次抗体カクテル中に組み合わせ、抗マウスコンジュゲートＨＲＰ検出および可視化のための褐色染色を生じるＤＡＢを用いたＩＨＣ手順において使用することができる。別の態様では、異なる宿主種由来の２種またはそれより多くの抗体で構成される一次抗体カクテルを同様に使用して単色染色を生じさせることができる。例えば、マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０ ＢＣ３４をウサギポリクローナル抗Ｓ１００抗体と組み合わせ、抗マウスコンジュゲートＨＲＰおよび抗ウサギコンジュゲートＨＲＰ、ならびに可視化のための褐色染色を生じるＤＡＢを用いたＩＨＣ手順において使用することができる。
ＩＨＣ手順のある特定のステップは、おそらく、当業者に公知の試薬のカクテルを使用することによって、逐次的にまたは同時に実施することができる。例えば、一次抗体カクテルに記載されている抗体を１種または複数種の抗体の逐次的なステップに二者択一的に適用することができる。同様に、検出試薬は、試薬カクテルとして同時に適用することもでき、別々の試薬を逐次的なステップで適用することもできる。
多重染色手順における使用のために、マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体と一次抗体カクテル中に組み合わせると診断に関して有用であり得る抗体としては以下が挙げられる。
＊列挙されている各染色の色は、おそらく、ＨＲＰとコンジュゲートした抗マウス抗体、さらには、おそらく、ＡＰとコンジュゲートした抗ウサギ抗体を、おそらく、さらには、マウス抗体について褐色染色をもたらし得、ウサギ抗体について赤色染色をもたらし得る色素原としてＤＡＢおよびファストレッドを一緒に含み得る検出系の結果であり得る。あるいは、検出系は、おそらく、ＡＰとコンジュゲートした抗マウス抗体、さらには、おそらく、ＨＲＰとコンジュゲートした抗ウサギ抗体を、おそらく、さらには、マウス抗体について赤色染色をもたらし得、ウサギ抗体について褐色染色をもたらし得る色素原としてＤＡＢおよびファストレッドと一緒に含み得る。他の検出系または色素原を使用して他の色の組合せを得ることができ、全て本開示に包含されるものとする。
一部の実施形態では、試薬を、さらには、おそらく、同じ宿主種由来の抗体を使用する場合に、二重染色が生じるように逐次的に適用することができる。例えば、マウスモノクローナルＢＣ３４を適用し、その後、おそらく、抗マウス−ＨＲＰ検出およびＤＡＢ色素原ステップを続けることができる。変性ステップ後、おそらく、酸性溶液を使用して、第２のマウスモノクローナル抗体、おそらく、マウスモノクローナル抗ネスチン抗体またはマウスモノクローナル抗ＭＡＲＴ１抗体を適用し、その後、おそらく、抗マウス−ＡＰ検出およびファストレッド色素原ステップを続けて、２色染色を生じさせることができる。
一部の実施形態では、同じ宿主種に由来する抗体のカクテルを使用し、単色染色をもたらすことができる。例えば、マウスモノクローナルＳＯＸ１０［ＢＣ３４］、マウスモノクローナルチロシナーゼ［Ｔ３１１］、およびマウスモノクローナルＭＡＲＴ−１［Ｍ２−７Ｃ１０］および［Ｍ２−９Ｅ３］のカクテルを適用し、抗マウス−ＨＲＰおよびＤＡＢ、または、おそらく、抗マウス−ＡＰおよびファストレッドによって検出することができる。他の実施形態は、ＳＯＸ１０およびチロシナーゼ、または、おそらく、ＳＯＸ１０およびＭＡＲＴ−１の抗体カクテルを含み得る。マウスモノクローナルＳＯＸ１０を、おそらく、さらには、二重染色手順において、上記の組合せのいずれかのチロシナーゼまたはＭＡＲＴ−１のウサギポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体と組み合わせることもできる。ＳＯＸ１０、チロシナーゼおよび／またはＭＡＲＴ−１の抗体カクテルは、おそらくＳ１００を含めた黒色腫の他の潜在的なマーカーよりも優れている可能性がある。ＳＯＸ１０、チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１は、黒色腫においてＳ１００よりも感度が高い可能性があり、これは、おそらく、ＳＯＸ１０は線維形成性黒色腫および紡錘細胞黒色腫を染色し得、Ｓ１００はこれらの型を染色し得ないからである。ＳＯＸ１０、チロシナーゼおよびＭＡＲＴ−１は、Ｓ１００のようには黒色腫転移の共通部位である脳、リンパ節または骨髄を染色し得ないので、特異性もＳ１００より高い可能性があり、これにより、おそらく、これらの部位における微小転移の同定に役立つ。ある特定の実施形態では、実施例において使用した以外のクローン（ＢＣ３４以外のＳＯＸ１０の他のクローンを含む）が適切であり得、おそらく、交換することができる、または、おそらく、さらには、実施例において使用したクローンよりも優れている。
多くの実施形態では、当業者に公知の通り、サイトケラチンマーカーに結合する抗体を異なる組合せで、いくつかの場合には、互換的に使用することができる。例えば、ＣＫ５は、おそらく、ＣＫ５／６またはＣＫ５／１４と交換することができる。同様に、ＨＭＷＣＫ（高分子量サイトケラチン）は、ＣＫ５／６またはＣＫ５／１４と互換的に使用することができる。
多くの場合、診断は、細胞診または生検由来の限られた組織試料に対して実施されることも多く、組織をさらなる分子試験のために保存することが重要であり得る。したがって、消費する組織は最小限であるが、最適な特異度および／または感度をもたらす効率的な診断手法が好ましい場合がある。おそらく、抗体カクテルを使用することによって、または、多分、改善された感度または特異度の特徴によって、検体由来の組織の消費を最小限にしながら有用な診断情報をもたらす方法が好ましい場合がある。
マウスモノクローナル抗ＳＯＸ１０抗体ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、ＳＯＸ１０の検出に特異的であり得、ヒト組織試料においていくつかの型のがんを診断するための免疫組織化学的手順において有用であり得る。特に、ＢＣ３４などの抗ＳＯＸ１０抗体は、これだけに限定されないが、より高い感度、より染まり方が強い染色、より高い特異性、および、おそらく、バックグラウンド染色が少ないよりきれいな染色、ならびに、おそらく、カルチノイドの染色の欠如、および、おそらく、肺腺癌の染色の欠如を含めた、ＲＰ抗ＳＯＸ１０抗体に勝る利点を有し得る。
本発明の実施形態は、イムノアッセイ法の一例として、図６２において概略的に示されている通り、試験される動物またはヒトから組織を得ること（６）、前記組織を固定または凍結すること（７）、前記固定または凍結した組織を処理してエピトープをＳＯＸ１０に暴露すること（８）、前記処理した組織と抗体またはその断片を、前記組織内にＳＯＸ１０タンパク質が存在する場合に抗体またはその断片がＳＯＸ１０タンパク質に結合するように、本明細書で論述した量および条件下で接触させること（９）、ならびに、おそらく、さらには、前記結合した抗体の存在を検出すること（１０）を提供し得る。
図６１は、抗体、その断片、その一部を組成物として、または、さらには、カクテルとして、おそらく、さらには、ハイブリドーマからもたらされるものとして提供し得るキット（５）、生体試料（２）と接触させて、検出器（４）で検出することができる少なくとも１種の抗体−抗原複合体（３）を形成することができる抗体（１）などを含めた本発明の種々の実施形態の要約の概略図を示す。
本発明は、複数の実施形態において、抗体またはその断片（本明細書で論述されている通り）を、おそらく、抗原に結合した際の抗体またはその断片の抗体検出要素と共に含み得る、診断用、または、さらには、予後診断用の検査キットを提供し得る。これは、生体試料を抗体またはその断片と接触させ、さらには、おそらく、抗体検出要素を使用して、生体試料中のタンパク質または抗原と結合した抗体またはその断片の結合、または、さらには、その存在を検出するための方法を提供し得る。実施形態は、哺乳動物またはヒトにおけるＳＯＸ１０タンパク質を、おそらく、検査される動物またはヒトから組織を得、組織と抗体またはその断片を、組織内にＳＯＸ１０タンパク質が存在する場合に抗体またはその断片がＳＯＸ１０タンパク質に結合し得るように、本明細書で提示されている種々の実施形態に従って、おそらく、量および条件下で接触させ、さらには、結合した抗体の存在を検出することによって検出するためのイムノアッセイ法を提供し得る。生体試料は、おそらく、使用される抗体、または、さらには、カクテルに応じて、これだけに限定されないが、血液、尿、尿路上皮組織、移行細胞組織、膀胱組織、正常組織、新生物組織、腎組織、卵巣組織、甲状腺組織、子宮内膜組織、腎組織、扁桃組織、膵臓組織、結腸組織、リンパ節組織、新生物膵組織、胃組織、前立腺組織、肺組織、乳房組織などを含んでよい。
例えばＳＯＸ１０、ＳＯＸ１０抗体、ＢＣ３４などの用語の使用は、当業者には理解される通り、必要に応じて、抗ＳＯＸ１０抗体などに関し得ることに留意する。抗体カクテルの構成成分は、「＋」で示される場合があり（例えば、「ＭＡＲＴ−１＋チロシナーゼ」で、ＭＡＲＴ−１およびチロシナーゼ抗体のカクテルが特定される）、また、いくつかの場合には、抗体試薬は、同じ標的に対する２種以上の抗体クローンを含み得る（例えば、ＭＡＲＴ−１は、２種の抗ＭＡＲＴ−１マウスモノクローナル抗体、クローンＭ２−７Ｃ１０およびクローンＭ２−９Ｅ３を含み得る）ことに留意する。
Ｔａｃｈａ， Ｄａｖｉｄ； Ｑｉ， Ｗｅｉｍａｎ； Ｂｒｅｍｅｒ， Ｒｙａｎ； Ｙｕ Ｃｈａｒｌｉｅ； Ｈｏａｎｇ， Ｌａｕｒａ； Ｒａ， Ｓｅｏｎｇ；およびＲｏｂｂｉｎｓ， Ｂｒｕｃｅによる論文「Ａ Ｎｅｗｌｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＳＯＸ１０ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｓ ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｍｅｌａｎｏｍａ， Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｓｐｉｎｄｌｅ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｄｅｓｍｏｐｌａｓｔｉｃ Ｍｅｌａｎｏｍａｓ」、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡは以下に収載される。
新しく開発されたマウスモノクローナルＳＯＸ１０抗体は、紡錘細胞黒色腫および線維形成性黒色腫を含めた悪性黒色腫についての高度に感度が高く特異的なマーカーである
Ｔａｃｈａ， Ｄａｖｉｄ， １ Ｑｉ，Ｗｅｉｍａｎ， １ Ｂｒｅｍｅｒ， Ｒｙａｎ， １ Ｙｕ Ｃｈａｒｌｉｅ １ ， Ｃｈｕ Ｊｏｓｅｐｈ １ ， Ｈｏａｎｇ， Ｌａｕｒａ， １ Ｒａ， Ｓｅｏｎｇ， ２ ａｎｄ Ｒｏｂｂｉｎｓ， Ｂｒｕｃｅ． ２ １ Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ、 ２ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ
コンテクスト−最近の免疫組織化学的試験により、悪性黒色腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、乳癌のサブセット、および神経膠腫におけるＳＯＸ１０発現が実証された。ＳＯＸ１０は、線維形成性黒色腫および紡錘細胞黒色腫を検出するその能力に関して重要な臨床的有用性を有することが示されている。現在まで、大多数の刊行物では免疫組織化学的染色のために研究用（ＲＵＯ）ヤギポリクローナルＳＯＸ１０抗体が使用されている。
目的およびデザイン−ここで、新しいマウスモノクローナルＳＯＸ１０抗体［ＢＣ３４］の開発について記載し、広範囲の正常組織および新生物組織におけるその免疫組織化学的染色プロファイルを、黒色腫に重点を置いて評価する。
結果−正常組織では、ＳＯＸ１０は、皮膚メラノサイトおよびエクリン細胞、乳房筋上皮細胞および小葉上皮細胞、唾液腺筋上皮細胞、末梢神経シュワン細胞、および中枢神経系グリア細胞において発現した。ＳＯＸ１０は、紡錘細胞黒色腫と線維形成性黒色腫の両方の５０／５１（９８％）を含めた、黒色腫の２３８／２５７（９２．６％）において発現した。ＳＯＸ１０は、母斑（２０／２０）およびシュワン細胞腫（２８／２８）の１００％で発現した。他の新生物では、ＳＯＸ１０は、浸潤性乳管癌の１８／１０９（１６．５％）において発現した。他の癌腫は全てＳＯＸ１０について陰性であった。ＳＯＸ１０は、中枢神経系新生物の２５／５２において同定され、主に星状細胞腫２２／４１（５３．７％）において、および検査した種々の肉腫の４／９９（４．０％）において同定された。
結論−要約すると、我々は、新しく開発されたマウスモノクローナルＳＯＸ１０抗体［ＢＣ３４］が、線維形成性黒色腫および紡錘細胞黒色腫を含めた悪性黒色腫に対して高度に感度が高く特異的であることを示した。
Ｓｒｙ関連ＨＭｇ−Ｂｏｘ遺伝子１０（ＳＯＸ１０）タンパク質は、神経堤、末梢神経系、およびメラニン細胞の発達のために重要なヒト転写因子である １〜４ 。ＳＯＸ１０核タンパク質は、メラノサイト、シュワン細胞、乳腺および唾液腺の筋上皮細胞、ならびに乏突起膠細胞の細胞を含めた正常なヒト組織において広範に発現することが示されている １〜３、５、６ 。ＳＯＸ１０核タンパク質は、黒色腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、および乳癌のサブセットなどの悪性腫瘍においても発現する。大多数の乏枝神経膠腫、しかし同様に星状細胞腫および神経膠芽腫の大部分もＳＯＸ１０を発現することが示されている ３、５ 。ＳＯＸ１０はまた、メラニン細胞母斑、シュワン細胞腫、および神経線維腫などの良性腫瘍にも存在する １〜３、５〜７ 。
ＳＯＸ１０は、線維形成性黒色腫（ＤＭ）および紡錘細胞黒色腫（ＳＣＭ）において高度に発現する １ 。ＤＭおよびＳＣＭは、通常、Ｓ−１００タンパク質について陽性であるが、多くの場合、他の黒色腫マーカーを用いると陰性であるまたは限局的にのみ陽性である。ＤＭは、臨床的にだけでなく、組織学的にも誤診を起こしやすい ９ 。
紡錘細胞黒色腫および線維形成性黒色腫をそれらの病理的類似物と区別するための適切なマーカーを見いだすための広範囲にわたる取り組みがなされてきた。メラノサイトマーカーの中で、ＳＯＸ１０は最も見込みがあることが示されている。現在まで、大多数の刊行物では、研究用（ＲＵＯ）ヤギポリクローナルＳＯＸ１０を使用した免疫組織化学的方法が使用されている １、７、１１〜１８ 。ここで、新しいマウスモノクローナルＳＯＸ１０ハイブリドーマ［ＢＣ３４］の開発について記載し、正常組織および新生物組織におけるその感度および特異性を、黒色腫およびそのサブタイプに重点を置いて評価する。
材料および方法
ＳＯＸ１０ハイブリドーマの生成
宿主免疫：雌ＢＡＬＢ／ｃ（６週間〜約８週間齢）マウスを、マウス当たり１００μｇの完全フロイントアジュバント中ヒトＳＯＸ１０組換えタンパク質を用いて腹腔内に免疫した。３週間後、マウスを、マウス当たりさらに１００μｇの不完全フロイントアジュバント中ヒトＳＯＸ１０を用いて、さらに４回、３週間おきに追加刺激した。マウスの尾部から採血し、血清を採取し、約−２０℃で保管した。
ハイブリドーマ：ＳＯＸ１０に対する抗体を産生するハイブリドーマを、ＳＯＸ１０で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞から標準の技法によって生成した。ＳＯＸ１０で免疫したマウス由来の脾細胞をＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合した。ハイブリドーマの上清を、ＳＯＸ１０に対する抗体反応性について酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によってスクリーニングした。次いで、ハイブリドーマクローンを、標的組織のホルマリン固定パラフィン包埋切片に対するそれらの特異性および特異性に基づいて選択した。
ＥＬＩＳＡ：ＳＯＸ１０に対する宿主抗血清免疫応答をＥＬＩＳＡによって測定し、マイクロタイタープレートリーダーで測定した。抗ＳＯＸ１０抗体［ＢＣ３４］モノクローナル抗体を、マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を使用してアイソタイピングした。クローンＢＣ３４アイソタイプをマウスＩｇＧ１として同定した。クローンＢＣ３４由来の選択されたハイブリドーマ細胞を、１０％ウシ胎児血清を補充した培地で培養し、ハイブリドーマ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに注射して抗体腹水を生じさせた。抗体腹水をプロテインＡアフィニティーカラムでさらに精製した。ＩｇＧの濃度を分光光度的に測定した。
ウエスタンブロット法によって試験した抗体交差反応性：精製されたモノクローナル抗体ＳＯＸ１０を、ウエスタンブロッティングによって特徴づけた。全長ヒトＳＯＸ１０をトランスフェクトした細胞溶解物を、ゲル電気泳動を使用して分離した。タンパク質ブロットを、ＳＯＸ１０抗体を室温で６０分インキュベートし、その後、ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗マウス免疫グロブリンと一緒にインキュベートすることによって可視化した（図１２３）。
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）：ＴＭＡを社内で構築し、かつ／またはＵＳ Ｂｉｏｍａｘ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入した。ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］を、皮膚黒色腫、転移性黒色腫、紡錘細胞黒色腫および線維形成性黒色腫、および黒色腫バリアントにおいて（ｎ＝２５７）、シュワン細胞腫において（ｎ＝２８）、および母斑（複合、皮内よび接合部）において（ｎ＝２０）評価した。ＳＯＸ１０を特異性について試験するために、正常組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）（ｎ＝３４）、全組織切片および種々の新生物組織におけるＴＭＡ（ｎ＝７４９）を評価した。
免疫組織化学：ホルマリン固定パラフィン包埋した全組織および組織ＴＭＡを脱パラフィンし、水中で水和させた。次いで、スライドを過酸化水素に５分曝露し、水中で洗浄した。ＴＭＡを抗原回復溶液（改変クエン酸緩衝液、ｐＨ６．０）に浸漬し、１２５℃で３０秒、圧力鍋（Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、ＣＡ）に入れた。組織スライドを８０℃まで冷却し、水中で洗浄した。ＳＯＸ１０［ＢＣ３４１］を希釈し、改変トリス希釈剤、ｐＨ６．０中１：１００で最適化し、組織を３０分インキュベートし、次いで、ＴＢＳ中ですすいだ。ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼポリマー検出（ＭＡＣＨ２、Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）を組織切片に室温で３０分にわたって適用した。次いで、切片をＴＢＳ中ですすぎ、切片を３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）中で５分、またはファストレッド色素原中で１０分インキュベートした。
スコアリング方法：各症例を、細胞の≧１％の染色が観察された場合に「陽性」とみなした。逆に、腫瘍細胞の１％未満の染色を「陰性」症例として決定した。核染色のみを陽性とみなした。
結果
モノクローナルＳＯＸ１０抗体を用いた免疫組織化学的染色により、陽性組織における強力な核染色が生じ、基本的にバックグラウンド染色は伴わなかった。正常組織（ｎ＝３４）では、ＳＯＸ１０は、皮膚メラノサイト、エクリン腺上皮細胞および筋上皮細胞の一部、乳房筋上皮細胞ならびに小葉上皮細胞、唾液腺筋上皮細胞、末梢神経、シュワン細胞、および脳グリア細胞のサブセットにおいて発現し（図１２４〜１２９）、ＳＯＸ１０は、また、固有筋層の少数の間質細胞および消化管全体を通して固有層および他の種々の組織の稀な間質細胞も染色したが（染色された全細胞集団は＜１％であった）、これらの組織内の他の細胞構成成分は全て、発現を示さず、したがって、これらの組織は陰性とスコア化された（表７）。
ＳＯＸ１０は、黒色腫の２３８／２５７（９２．６％）において発現した（図１３０〜１３３）（表８）。特に、ＳＣＭおよびＤＭの５０／５１（９８％）がＳＯＸ１０について陽性であり（図１３４〜１３６）、ＳＯＸ１０はまた、肉腫様黒色腫も染色した（図１３７）。良性の症例では、ＳＯＸ１０は、検査したシュワン細胞腫（２８／２８）において（表１０、図１３８）、および母斑（２０／２０）において（表８、図１３９）陽性であった。
他の新生物では（表９）、ＳＯＸ１０は、浸潤性乳管癌の１８／１０９（１６．５％）において発現した（図１４０）。ＳＯＸ１０は、非浸潤性乳管癌の周囲の筋上皮細胞を染色した（図１４１）。試験した他の癌腫は全てＳＯＸ１０について陰性であった。肉腫の中で、ＳＯＸ１０染色は、平滑筋肉腫の１／２２（４．５％）において、横紋筋肉腫において２／２２（９．１％）、および悪性線維性組織球腫の１／１３（７．７％）において観察され、他の肉腫全ては陰性であった。ＳＯＸ１０染色は、中枢神経系新生物の２５／５２において、主に星状細胞腫の２２／４１（５３．７％）において同定され（図１４２、表９）、限られた症例では、神経膠芽腫、および上衣腫において発現した（表９）。
神経内分泌腫瘍の評価により、ＳＯＸ１０が、結腸、胃、小腸および付属器を含めた消化管のカルチノイド腫瘍の全てにおいて陰性であることが示された。肺および腸カルチノイド腫瘍では、少数の支持細胞がＳＯＸ１０について陽性であったが、新生細胞は陰性であると思われた（図１４３）。
考察
以前の試験により、ＳＯＸ１０が、原発病変および転移病変の両方の黒色腫についての高度に感度が高く特異的な核マーカーであることが示されている １、１１〜５ 。我々の試験では、原発性皮膚黒色腫の１０６／１１０（９６．４％）がＳＯＸ１０で染色された。これは、ＳＯＸ１０核発現が黒色腫７８例のうち７６例（９７％）において見いだされたＮｏｎａｋａらによる試験とうまく比較される ７ 。Ｓｈｉｎ Ｊらによる試験では、ＳＯＸ１０は、ＤＭの１００％で発現し、紡錘細胞癌、非定型線維黄色腫（ＡＦＸ）および肉腫などの組織学的類似物の全てで陰性であった １３ 。Ｋａｒａｍｃｈａｎｄａｎｉ ＪＲらも、種々の肉腫の症例の１／７８（１．３％）のみがＳＯＸ１０を発現するという匹敵する結果を示した １６ 。我々の試験では、ＳＯＸ１０は、線維形成性黒色腫および紡錘細胞黒色腫の５０／５１（９８％）において発現し、また、肉腫の種々の型の４／９９（４．０％）において発現した（表８）。Ｎｏｎａｋａらは、ＳＯＸ１０が悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）の３８／７７（４９％）において発現することを示した ７ 。我々の試験は限定されており、ＭＰＮＳＴは２例のみ含み、そのどちらも陰性であった。
ＤＭおよびＳＣＭは、組織学的類似物および免疫組織化学的染色の限定に起因して、病理医に対して診断上の難題をもたらし得るものである（図１３４〜１３７）。Ｓ１００は通常ＤＭを染色するにもかかわらず、ＨＭＢ４５およびメランＡなどの他の黒色腫マーカーは、ほとんどの場合陰性であることが示されている １４ 。ＤＭの他の組織学的類似物としては、切除前瘢痕内の紡錘線維芽細胞または組織球が挙げられる。Ｒａｍｏｓ−Ｈｅｒｂｅｒｔｈ，ＦＩらは、ＳＯＸ１０が瘢痕内のバックグラウンド線維芽細胞および組織球によって発現される可能性がＳ１００よりも低く、したがって、ＳＯＸ１０がこれらの型の症例においてＳ１００よりも優れていることを実証した １５ 。
Ｓ１００は特異性が欠如しているにもかかわらず、病理医はなお、Ｓ１００を神経堤由来腫瘍の診断に使用している。しかし、ＳＯＸ１０は、高度に特異的であり、黒色腫および末梢神経鞘腫瘍の鑑別診断において、非シュワン細胞腫瘍および非メラニン細胞腫瘍ではめったに発現しないことが示されている。推奨される手法は、黒色腫または末梢神経鞘腫瘍の診断にＳ１００とＳＯＸ１０の両方を含み得る １６ 。我々の試験では、ＳＯＸ１０は、非メラニン細胞腫瘍の大部分で陰性であった（表９）。これらの所見により他の試験との一致が示される １、７ 。ＳＯＸ１０は、基底様または三重陰性癌腫を含めた乳癌のサブセットにおいて、および化生性癌において実証されている。したがって、この所見により、これらの新生物が筋上皮分化を示し得るという概念が支持される １８ 。我々の試験では、ＳＯＸ１０核染色は、正常な乳房筋上皮細胞、ならびに乳房小葉上皮細胞のサブセットにおいて発現し（図１２７）、また、浸潤性乳がんの１６．５％において発現した。ＳＯＸ１０は、種々の型の脳腫瘍を染色することが示されている ５、６ 。Ｂａｎｎｙｋｈ ＳＩらは、大多数の乏枝神経膠腫、ならびに星状細胞腫および神経膠芽腫の大部分がＳＯＸ１０を発現することを実証し ５ 、これは、我々の結果と相関した。
悪性黒色腫（９６．６％）および良性母斑およびシュワン細胞腫（１００％）におけるＳＯＸ１０発現という我々の発見により、十分に公開されたＳＯＸ１０ヤギポリクローナル抗体を使用した他の試験との高い一致が実証された １、１０〜１５、１９ 。ＲＵＯヤギ一次抗体の使用は研究目的では十分であり得るが、臨床の現場では一般に認められていない可能性がある。ポリクローナル抗体は、ロット間の変動もよく知られており、望ましくない非特異的バックグラウンド染色が生じる可能性がある。Ａｍｒ Ｍｏｈａｍｅｄらによる試験では、黒色腫と乳がんのどちらの顕微鏡写真においても非特異的バックグラウンド染色が観察された １ 。Ｚｈｏｎｇらによる試験では、ＳＯＸ１０は、良性前立腺組織の細胞質においては強力に陽性であり、前立腺がん組織の細胞質においては弱く陽性であった １９ 。我々の試験では、新しいモノクローナルＳＯＸ１０抗体により、基本的にバックグラウンド染色のないきれいな核染色が生じた。
結論
要約すると、我々は、新しく開発されたマウスモノクローナルＳＯＸ１０ ＩＨＣ抗体［ＢＣ３４］が、線維形成性バリアントおよび紡錘細胞バリアントを含めた悪性黒色腫に対して高度に感度が高く特異的であり、臨床使用に高度に適すると思われることを示した。





前述のことから容易に理解することができる通り、本発明の基本的な概念は、様々なやり方で具体化することができる。これは、適切な抗体を実現するための抗体技法ならびにデバイスの両方を伴う。本出願では、抗体技法は、記載されている種々のデバイスによって、および利用に固有のステップとして実現されることが示されている結果の一部として開示されている。それらは、単に、意図され、記載されているデバイスを利用した自然の結果である。さらに、いくつかのデバイスが開示されているが、これらは、ある特定の方法を実現するだけのものではなく、いくつものやり方で変化させることもできることが理解されるべきである。重要なことに、前述の全てに関して、これらのファセットの全てが本開示に包含されると理解されるべきである。
本出願に含まれる論述は、基本的な説明として役立つことが意図されている。読者は、特定の論述は可能性のある実施形態全てを明確に記載するものではない場合があり、多くの代替物が暗に含まれることを認識すべきである。同様に、これは、本発明の一般的な性質を完全に説明するものではない場合があり、それぞれの特徴または要素により実際にどれほど多種多様の代替的なまたは同等の要素の広範な機能が表され得るかを明確に示すものではない場合がある。さらに、これらは、暗黙のうちに本開示に含まれる。本発明がデバイス主体の用語法で記載されている場合、デバイスの各要素により、機能が暗黙のうちに実施される。記載されているデバイスに関して、装置請求項が含まれるだけでなく、方法またはプロセス請求項も、本発明および実施される要素の機能に取り組むために含まれる。説明および用語法はどちらも、後のあらゆる特許出願に含まれる特許請求の範囲を限定するものではない。
本発明の核心から逸脱することなく、種々の変化がなされ得ることも理解されるべきである。そのような変化も暗黙のうちに本明細書に包含される。それらはなお本発明の範囲内に入る。示されている明示的な実施形態（複数可）を包含する広範な開示、多種多様な暗に含まれる代替的な実施形態、および広範な方法またはプロセスなどが本開示に包含され、後のあらゆる特許出願のための特許請求の範囲を起草する際に頼りになり得る。そのような言葉の変化およびより広範かつより詳細な特許請求を、後日（例えば任意の所定の期限までになど）、または出願人がその後、本出願に基づいて特許出願を求める事象において、実現することができることが理解されるべきである。この理解と共に、読者は、本開示は、出願人の権利の範囲内に入るとみなされる広さの特許請求の範囲の基礎の審査を求めることができ、本発明の多数の態様を独立に、および系全体としてのどちらでも包含する特許が得られるようにデザインすることができる、後に出願されるあらゆる特許出願を支持するものと理解されることを認識すべきである。
さらに、本発明の種々の要素および請求項のそれぞれも種々の様式で実現することができる。さらに、使用されるまたは暗に含まれる場合、要素は、物理的に接続されていてもいなくてもよい個々の構造ならびに複数の構造を包含すると理解されるべきである。本開示は、任意の装置実施形態のある実施形態の変形であろうと、方法またはプロセスの実施形態のある実施形態の変形であろうと、さらには、ただ単にこれらの任意の要素の変形であろうと、そのような変形のそれぞれを包含するものと理解されるべきである。特に、本開示は本発明の要素に関するので、機能または結果のみが同じだとしても、各要素に関する単語は、同等の装置用語または方法用語によって表すことができることが理解されるべきである。そのような同等の、より広範な、またはより一般的な用語は、各要素または作用についての記載に包含されるものとみなされるべきである。そのような用語は、本発明が権利を有する暗黙のうちに広範な適用範囲を明確にすることが望ましい場合、置き換えることができる。一例として、全ての作用は、その作用を起こすための手段またはその作用を引き起こす要素として表され得ることが理解されるべきである。同様に、開示される物理的要素のそれぞれは、その物理的要素により容易になる作用に関する開示を包含するものと理解されるべきである。この最後の態様に関して、一例として、「検出」または「検出器」に関する開示は、「検出する」作用−−明確に論述されていようがいまいが−−の開示を包含するものと理解されるべきであり、逆に、「検出する」作用が有効に開示される場合、そのような開示は、「検出器」、さらには、「検出するための手段」の開示を包含するものと理解されるべきである。そのような変化および代替用語は、本明細書に明確に包含されるものと理解されるべきである。さらに、そのような手段のそれぞれ（そのように明確に記載されているかいないかにかかわらず）は、所与の機能を実施することが可能な全ての要素を包含すると理解されるべきであり、記載されている機能を実施する要素の全ての説明は、その機能を実施するための手段の非限定的な例として理解されるべきである。
本特許出願において言及されるあらゆる法律、法令、規制、または規則；または本特許出願において言及される特許、刊行物、または他の参考文献は、これによって参照により組み込まれる。本出願により特許請求されるあらゆる優先事例（複数可）はこれによって追加され、これによって参照により組み込まれる。さらに、使用される各用語に関して、本出願におけるその利用が、広範に支持する解釈と相反しない限り、一般の辞書による定義が各用語に組み込まれると理解されるべきであり、Ｒａｎｄｏｍ Ｈｏｕｓｅ Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｕｎａｂｒｉｄｇｅｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第２版に含有されるものなどの全ての定義、代替用語およびシノニムは、これによって参照により組み込まれることが理解されるべきである。最後に、下記の一覧または本出願と共に出願される他の情報の記載に列挙されている全ての参考文献はこれによって追加され、これによって参照により組み込まれる、しかし、上記のそれぞれに関して、参照により組み込まれるそのような情報または記載がこの／これらの発明の特許取得と相反するとみなされる可能性がある限りでは、そのような記載は、明白に、本出願人（複数可）によってなされたものとはみなされない。




したがって、出願人（複数可）は、少なくとも以下に関して、請求項への支持を得、発明の記載を行うと理解されるべきである：ｉ）本明細書において開示および記載されている抗体デバイスのそれぞれ、ｉｉ）開示および記載されている関連する方法、ｉｉｉ）これらのデバイスおよび方法のそれぞれの、類似した、同等の、さらには、暗に含まれる変形、ｉｖ）開示および記載されている通り示される機能のそれぞれを実現する代替デザイン、ｖ）開示および記載されていることの実現が暗に含まれると示される機能のそれぞれを実現する代替デザインおよび方法、ｖｉ）別々の独立した発明として示される各特徴、構成成分、およびステップ、ｖｉｉ）開示される種々の系または構成成分によって増強される適用、ｖｉｉｉ）そのような系または構成成分によって産生される産物、ｉｘ）言及される任意の特定の分野またはデバイスに今適用されると示されるまたは記載される各系、方法、および要素、ｘ）実質的に上文に記載され、また付随する例のいずれかで参照される方法および装置、ｘｉ）ステップを実施するための手段を含む、本明細書に記載の方法を実施するための装置、ｘｉｉ）開示される要素のそれぞれの種々の組合せおよび順列、ｘｉｉｉ）提示される独立請求項または概念のひとつひとつに対する従属性としてそれぞれが潜在的に従属する請求項または概念、およびｘｉｖ）本明細書に記載されている全ての発明。
請求項に関しては、現在または後に審査に出されるかどうかにかかわらず、実用上の理由から、および審査の負担が増大するのを回避するために、出願人は、いつでも、最初の請求項のみ、または、おそらく最初の従属のみを伴う最初の請求項のみを提出することができることが理解されるべきである。特許庁および本出願または後の出願の潜在的な範囲に関心がある任意の第三者は、この場合、この場合の利益を特許請求する場合、または提出されるいかなる予備補正、他の補正、請求項言語、または意見書にかかわらない任意の継続において、したがって、任意の潜在的な主題のディスクレームまたは放棄が意図されていないあらゆる場合の係属全体を通してより広範な請求項が後日提出され得ることを理解すべきである。より広範な請求項が提出された場合またはその時、本出願または任意のその後の出願で提出されるあらゆる補正、請求項言語、または意見書がそのような先行技術を無効化するものとみなされる限りでは、そのような理由は、後に提示される請求項などによって排除され得る可能性があるので、任意の以前の時点で考慮された可能性のある、あらゆる関連性のある先行技術が再考される必要があり得ることが理解されるべきである。審査官、および、現存するまたは後の潜在的なカバレッジに他の点で関心がある、または潜在的なカバレッジのディスクレーマーまたは放棄が示されるあらゆる可能性が任意の時点であったかどうかを考慮する任意の人はどちらも、本出願またはあらゆるその後の出願にそのような放棄またはディスクレーマーは意図されない、または存在しないことを認識すべきである。Ｈａｋｉｍ ｖ．Ｃａｎｎｏｎ Ａｖｅｎｔ Ｇｒｏｕｐ、ＰＬＣ、４７９ Ｆ．３ｄ １３１３（Ｆｅｄ． Ｃｉｒ ２００７）において生じるものなどの限定などは、このまたはあらゆるその後の関連事項において明白に意図されない。さらに、支持は、１つの独立請求項または概念の下で提示される種々の従属物または他の要素のいずれかを、任意の他の独立請求項または概念の下の従属物または要素と同様に追加することを可能にするために、これだけに限定されないが、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ Ａｒｔｉｃｌｅ １２３（２）およびＵｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｌａｗ ３５ ＵＳＣ １３２または他のそのような法律を含めた新規事項法の下で必要な程度まで存在すると理解されるべきである。本出願においてか後の出願においてかにかかわらず、任意の時点で任意の請求項を草案することにおいて、出願人は、法的に利用可能な程度に十分かつ広範なカバレッジの範囲を捕捉することが意図されていることも理解されるべきである。実質のない置換がなされる限り、出願人が、任意の特定の実施形態を文字通り包含するために実際にいかなる請求項も草案しない限り、および他の点で適用可能な限り、出願人は、単に、起こり得る全ての事態を予測することが出来ていない可能性があるので、出願人は、いかなる形でもそのようなカバレッジの放棄を意図していないまたは実際に放棄しないと理解されるべきであり、当業者は、そのような代替的な実施形態を文字通り包含する請求項が草案されることを合理的に予測すべきではない。
さらに、使用された場合またはその時、移行句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の使用は、従来の請求項解釈に従って、本明細書において「開放請求項」を維持するために使用される。したがって、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、明示された要素もしくはステップまたは要素もしくはステップの群が包含されることを意味するが、任意の他の要素もしくはステップまたは要素もしくはステップの群が排除されることは意味しないことを意図していることが理解されるべきである。そのような用語は、出願人に法的に許容される最も広範なカバレッジがもたらされるように、それらの最も広範囲の形態で解釈されるべきである。「または任意の他の請求項」という句の使用は、例えば、別の従属請求項、別の独立請求項、前に列挙された請求項、後に列挙される請求項などの任意の他の請求項に従属する任意の請求項に対する支持をもたらすために使用される。１つの明快な例として、請求項が「請求項２０または任意の他の請求項」に従属するなどの場合、その請求項は、請求項１、請求項１５、または、さらには、所望であれば、請求項２５（それが存在する場合）に従属するとして再度草案され得、それでも本開示の範囲内に入る。この句は、請求項内の要素の任意の組合せおよびさらには、方法、装置、プロセスなどの請求項の組合せなどのある特定の請求項の組合せのための任意の所望の適切な先行詞を組み入れることに対する支持ももたらすものであることが理解されるべきである。
最後に、任意の時点で記載される請求項はいずれも、これによって参照により本発明の本明細書の一部として組み込まれ、出願人は、請求項のいずれかまたは全て、または任意のその要素または構成成分を支持する追加的な説明としてそのような請求項のそのような組み込まれた内容の全部または一部を使用する権利を明白に留保し、出願人はさらに、本出願による、またはその後のその継続出願、分割出願もしくは一部継続出願による保護が求められる事項を定義するため、またはそれに準じてあらゆる利益および手数料の削減を取得するため、または任意の国または条約の特許法、規則または規制に従うために必要に応じて、そのような請求項またはその任意の要素または構成成分の組み込まれた内容の任意の一部または全部を、明細書から特許請求の範囲に、またはその逆に移動させる権利を明白に留保し、参照により組み込まれるそのような内容は、任意のその後のその継続出願、分割出願もしくは一部継続出願またはそれに対する再発行もしくは延長を含めた、本出願の全係属中に残存するべきである。

Claims (112)

  1. ＳＯＸ１０タンパク質に特異的に結合する抗体の単離された調製物であって、前記抗体が、ペプチド配列番号３内のエピトープに結合する、調製物。
  2. ＳＯＸ１０タンパク質に特異的に結合する抗体の単離された調製物であって、前記抗体が、配列番号３からなるペプチドを免疫原として使用して生成したものである、調製物。
  3. ペプチド配列番号３内のエピトープに特異的に結合する抗体の単離された調製物。
  4. 前記抗体がモノクローナルである、請求項１、２、または３に記載の抗体の単離された調製物。
  5. 前記抗体がポリクローナルである、請求項１、２、または３に記載の抗体の単離された調製物。
  6. ＡＴＣＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２０９６９の下でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体またはその断片。
  7. ＡＴＣＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２０９６９の下でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されているハイブリドーマ細胞。
  8. 前記ハイブリドーマ細胞によって産生される抗体またはその断片をさらに含む、請求項７に記載のハイブリドーマ細胞。
  9. 請求項１、２、３、または６に記載のモノクローナル抗体を産生するための方法であって、
    ＳＯＸ１０を特異的に認識することが可能なモノクローナル抗体を産生する前記ハイブリドーマを培養するステップと、
    該ハイブリドーマに該モノクローナル抗体を産生させるステップと
    を含む方法。
  10. 配列番号１または配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む抗体またはその断片。
  11. 配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列のポリペプチドを含む抗体またはその断片。
  12. 配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗ＳＯＸ１０抗体またはその断片。
  13. 配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗ＳＯＸ１０抗体またはその断片。
  14. 配列番号１または配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む抗体。
  15. 配列番号１または配列番号２と少なくとも約７０％同一である核酸配列を含む、単離および精製された核酸配列。
  16. 配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む抗体。
  17. 前記配列番号１または配列番号２と少なくとも約７０％同一であることが、配列番号１および配列番号２と少なくとも約７０％同一であることを含む、請求項１４または１５に記載の配列。
  18. 前記配列番号４または配列番号５と少なくとも約７０％同一であることが、配列番号４および配列番号５と少なくとも約７０％同一であることを含む、請求項１６に記載の配列。
  19. 前記少なくとも約７０％同一であることが、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％からなる群から選択される百分率を含む、請求項１７に記載の配列。
  20. 前記少なくとも約７０％同一であることが、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％からなる群から選択される百分率を含む、請求項１８に記載の配列。
  21. 配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列のポリペプチドを含む抗体またはその断片。
  22. 配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＳＯＸ１０抗体またはその断片。
  23. 配列番号６、配列番号７、配列番号８、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗ＳＯＸ１０抗体またはその断片。
  24. 配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号６、配列番号７、配列番号８、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、抗ＳＯＸ１０抗体またはその断片。
  25. 配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも約２％同一であるアミノ酸配列を含む抗体。
  26. 前記配列番号４または配列番号５と少なくとも約２％同一であることが、配列番号４および配列番号５と少なくとも約２％同一であることを含む、請求項２５に記載の配列。
  27. 前記少なくとも約２％同一であることが、少なくとも約２．７％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約５．７％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約８．１％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１０．８％、少なくとも約１１％、少なくとも約１１．４％、少なくとも約１１．７％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１３．９％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１７．１％、少なくとも約１７．２％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約１９．６％、少なくとも約１９．８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２５．４％、少なくとも約２６％、少なくとも約３０％；約２％から約７０％、約２％、約２．７％、約３％、約４％、約５％、約５．７％、約６％、約７％、約８％、約８．１％、約９％、約１０％、約１０．８％、約１１％、約１１．４％、約１１．７％、約１２％、約１３％、約１３．９％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１７．１％、約１７．２％、約１８％、約１９％、約１９．６％、約１９．８％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２５．４％、約２６％、および約３０％の間からなる群から選択される百分率を含む、請求項２６に記載の配列。
  28. 配列番号３の残基を含むアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片。
  29. 少なくとも１つが少なくともＳＯＸ１０に特異的に結合する少なくとも２種の抗体またはその断片を含む組成物。
  30. 少なくともＳＯＸ１０に特異的に結合する前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、ＳＯＸ１０［ＢＣ３４］抗体またはその断片を含む、請求項２９に記載の組成物。
  31. 少なくともＳＯＸ１０に特異的に結合する前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、ＳＯＸ１０に特異的に結合し、染色される細胞が約５％より多いという陽性指示カットオフ値を有する、前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つを含む、請求項２９に記載の組成物。
  32. ＳＯＸ１０に特異的に結合する前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、ＳＯＸ１０に特異的に結合し、
    −染色される細胞が約２％より多い；
    −染色される細胞が約３％より多い；
    −染色される細胞が約４％より多い；
    −染色される細胞が約５％より多い；
    −染色される細胞が約６％より多い；
    −染色される細胞が約７％より多い；
    −染色される細胞が約８％より多い；
    −染色される細胞が約９％より多い；および
    −染色される細胞が約１０％より多い
    からなる群から選択される陽性指示カットオフ値を有する前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの少なくとも１つを含む、請求項２９に記載の組成物。
  33. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項２９に記載の組成物。
  34. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項２９に記載の組成物。
  35. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列のポリペプチドを含む、請求項２９に記載の組成物。
  36. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列の少なくとも約７０％と同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列の少なくとも約７０％であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項２９に記載の組成物。
  37. 前記少なくとも約７０％同一であることが、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％からなる群から選択される百分率を含む、請求項３６に記載の組成物。
  38. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ならびに配列番号６、配列番号７、配列番号８、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項２９に記載の組成物。
  39. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号３のアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する、請求項２９に記載の組成物。
  40. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号３の残基と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する、請求項２９に記載の組成物。
  41. 前記少なくとも約７０％同一であることが、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％からなる群から選択される百分率を含む、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、ＡＴＣＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２０９６９の下でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体またはその断片を含む、請求項２９に記載の組成物。
  43. 一次抗体カクテルを含む、請求項２９に記載の組成物。
  44. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片が、少なくとも２つの異なる種に由来する、請求項３０に記載の組成物。
  45. 前記少なくとも２つの異なる種が、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ヒト、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項４４に記載の組成物。
  46. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片が、二重染色手順を含む、請求項２９に記載の組成物。
  47. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片が、異なる可視化の結果をもたらすことが可能である、請求項２９に記載の組成物。
  48. 前記可視化の結果が、呈色の結果を含む、請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの他の前記少なくとも１つが、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、Ｓ１００、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する、請求項２９に記載の組成物。
  50. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの他の前記少なくとも１つが、チロシナーゼ抗体、ＭＡＲＴ−１抗体、チロシナーゼ抗体［Ｔ３１１］、ＭＡＲＴ−１抗体［Ｍ２−７Ｃ１０］、ＭＡＲＴ−１抗体［Ｍ２−９Ｅ３］、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２９に記載の組成物。
  51. 黒色腫検出、母斑検出、乳がん検出、横紋筋肉腫検出、平滑筋肉腫検出、シュワン細胞腫検出、線維形成性黒色腫検出、紡錘細胞黒色腫検出、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される検出組成物を含む、請求項２９に記載の組成物。
  52. 前記抗体またはその断片が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２０９６９の下で寄託されているハイブリドーマ細胞によって産生される、請求項１０、１１、１２、２８、または２９に記載の抗体。
  53. モノクローナル抗体を含む、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２５、または２６に記載の抗体。
  54. 前記モノクローナル抗体が、染色される細胞が１％より多いという陽性指示カットオフ値を有する、請求項５３に記載の抗体。
  55. 前記陽性指示カットオフ値が、
    −染色される細胞が約２％より多い；
    −染色される細胞が約３％より多い；
    −染色される細胞が約４％より多い；
    −染色される細胞が約５％より多い；
    −染色される細胞が約６％より多い；
    −染色される細胞が約７％より多い；
    −染色される細胞が約８％より多い；
    −染色される細胞が約９％より多い；および
    −染色される細胞が約１０％より多い
    からなる群から選択される、請求項５４に記載の抗体。
  56. 前記モノクローナル抗体が、マウスモノクローナル抗体、ウサギモノクローナル抗体、ヤギモノクローナル抗体、ウマモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項５３に記載の抗体。
  57. ポリクローナル抗体を含む、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２５、または２６に記載の抗体。
  58. 前記ポリクローナル抗体が、ウサギポリクローナル抗体、マウスポリクローナル抗体、ヤギポリクローナル抗体、ウマポリクローナル抗体、ニワトリポリクローナル抗体、ヒト化ポリクローナル抗体、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項５７に記載の抗体。
  59. 単離された抗体を含む、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２５、または２６に記載の抗体。
  60. 前記その断片が、その抗原結合性断片を含む、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２５、または２６に記載の抗体。
  61. 前記抗体またはその断片に結合した標識をさらに含む、請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２５、または２６に記載の抗体。
  62. 標識とコンジュゲートした請求項１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２１、２２、２３、２５、または２６に記載の抗体またはその断片を含むがん診断剤。
  63. 前記標識が、放射性元素、磁性粒子、放射性同位元素、蛍光色素、酵素、毒素、シグナル、染色、検出酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ、色素原、ファストレッド、３，３’−ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項６１に記載の抗体。
  64. 前記標識が、放射性元素、磁性粒子、放射性同位元素、蛍光色素、酵素、毒素、シグナル、染色、検出酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ、色素原、ファストレッド、３，３’−ジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項６２に記載の抗体。
  65. −請求項１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片と、
    −抗原に結合する際の該抗体または該その断片の抗体検出要素と
    を含む、診断または予後診断用検査キット。
  66. 請求項６５に記載のキットを使用して生体試料中のＳＯＸ１０を検出するための方法であって、
    −生体試料を前記抗体またはその断片と接触させるステップと、
    −前記抗体検出要素を使用して、該生体試料における該抗体または該その断片と抗原との結合を検出するステップと
    を含む方法。
  67. 前記抗体または前記その断片が、ＳＯＸ１０に特異的に結合する、請求項６、７、１０、１１、１２、１３、または１４に記載の抗体。
  68. がんを検出するための、請求項１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片あるいは組成物の使用。
  69. がんを診断または予後診断するための、請求項１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片あるいは組成物の使用。
  70. がんの治療の転帰を予測するための、請求項１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片あるいは組成物の使用。
  71. がんの治療の有効性を評価するための、請求項１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片あるいは組成物の使用。
  72. がんの再発を予測するための、請求項１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片あるいは組成物の使用。
  73. 前記抗体またはその断片または組成物の前記使用を、自動染色デバイスで実施する、請求項６８に記載の抗体またはその断片あるいは組成物。
  74. 前記検出を手動で行う、請求項６８に記載の抗体またはその断片あるいは組成物。
  75. 前記検出を自動で行う、請求項６８に記載の抗体またはその断片あるいは組成物。
  76. 前記検出を画像解析によって行う、請求項６８に記載の抗体またはその断片あるいは組成物。
  77. 生体試料中の、請求項１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片が結合するタンパク質を検出するための方法であって、生体試料を前記抗体またはその断片と接触させるステップと、該生体試料における該タンパク質に結合した該抗体またはその断片の存在を検出するステップとを含む方法。
  78. 前記生体試料が、肺組織、膀胱組織、乳房組織、および前立腺組織を含む、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記生体試料が、正常組織、新生物組織、膀胱組織、腎組織、卵巣組織、甲状腺組織、子宮内膜組織、腎組織、扁桃組織、膵臓組織、結腸組織、リンパ節組織、新生物膵組織、胃組織、前立腺組織、肺組織および乳房組織からなる群から選択される、請求項７７に記載の方法。
  80. 前記タンパク質に結合した前記抗体またはその断片の前記存在を検出する前記ステップを自動染色デバイスで実施する、請求項７７に記載の方法。
  81. 前記タンパク質に結合した前記抗体またはその断片の前記存在を検出する前記ステップを手動で行う、請求項７７に記載の方法。
  82. 前記タンパク質に結合した前記抗体またはその断片の前記存在を検出する前記ステップを自動で行う、請求項７７に記載の方法。
  83. 前記タンパク質に結合した前記抗体またはその断片の前記存在を検出する前記ステップを画像解析によって行う、請求項７７に記載の方法。
  84. 検出する前記ステップが、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＦＦＰＥのＩＨＣ、凍結組織切片のＩＨＣ、免疫細胞化学、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される方法を含む、請求項７７に記載の方法。
  85. 生体試料中の少なくとも２種の異なるタンパク質を検出するための方法であって、
    −該生体試料を、少なくとも１つが少なくともＳＯＸ１０に特異的に結合する少なくとも２種の抗体またはその断片を含む組成物と接触させて、抗原抗体複合体を形成させるステップと、
    −該抗原抗体複合体を検出するステップと
    を含む方法。
  86. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片が、少なくとも１つの第１の一次抗体と少なくとも１つの第２の一次抗体とを含む、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項８５に記載の方法。
  88. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項８５に記載の方法。
  89. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ならびに配列番号６、配列番号７、配列番号８、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項８５に記載の方法。
  90. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列の少なくとも約７０％と同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列の少なくとも約７０％であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項８５に記載の方法。
  91. 前記少なくとも約７０％同一であることが、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％からなる群から選択される百分率を含む、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも約２％と同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも約２％であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項８５に記載の方法。
  93. 前記少なくとも約７０％同一であることが、少なくとも約２．７％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約５．７％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約８．１％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１０．８％、少なくとも約１１％、少なくとも約１１．４％、少なくとも約１１．７％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１３．９％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１７．１％、少なくとも約１７．２％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約１９．６％、少なくとも約１９．８％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２５．４％、少なくとも約２６％、少なくとも約３０％；約２％から約７０％、約２％、約２．７％、約３％、約４％、約５％、約５．７％、約６％、約７％、約８％、約８．１％、約９％、約１０％、約１０．８％、約１１％、約１１．４％、約１１．７％、約１２％、約１３％、約１３．９％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１７．１％、約１７．２％、約１８％、約１９％、約１９．６％、約１９．８％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２５．４％、約２６％、および約３０％の間からなる群から選択される百分率を含む、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号３の残基を含むアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する、請求項８５に記載の方法。
  95. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、配列番号３からなる群から選択される残基と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する、請求項８５に記載の方法。
  96. 前記少なくとも約７０％同一であることが、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、および少なくとも約９９％からなる群から選択される百分率を含む、請求項９５に記載の方法。
  97. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの前記少なくとも１つが、ＡＴＣＣ特許寄託指定番号ＰＴＡ−１２０９６９の下でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体またはその断片を含む、請求項８５に記載の方法。
  98. 前記組成物が、一次抗体カクテルを含む、請求項８５に記載の方法。
  99. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片が、少なくとも２つの異なる種に由来する、請求項８５に記載の方法。
  100. 前記少なくとも２つの異なる種が、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ヒト、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１００に記載の方法。
  101. 前記生体試料を二重染色するステップをさらに含む、請求項８５に記載の方法。
  102. 異なる可視化の結果をもたらすステップをさらに含む、請求項８５に記載の方法。
  103. 前記可視化の結果が、呈色の結果を含む、請求項１０２に記載の方法。
  104. 少なくとも２種の抗体またはその断片のそれぞれが、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、Ｓ１００、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるタンパク質に特異的に結合する、請求項８５に記載の方法。
  105. 前記少なくとも２種の抗体またはその断片のうちの他の前記少なくとも１つが、チロシナーゼ抗体、ＭＡＲＴ−１抗体、チロシナーゼ抗体［Ｔ３１１］、ＭＡＲＴ−１抗体［Ｍ２−７Ｃ１０］、ＭＡＲＴ−１抗体［Ｍ２−９Ｅ３］、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項８５に記載の方法。
  106. 前記抗原抗体複合体を検出する前記ステップが、前記試料における少なくとも２種の抗原抗体複合体の形成を検出するステップを含み、第１の前記抗体が、ＳＯＸ１０に特異的に結合し、第２の前記抗体が、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、Ｓ１００、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される抗原に特異的に結合する、請求項８５に記載の方法。
  107. 動物またはヒトにおけるＳＯＸ１０タンパク質を検出するためのイムノアッセイ法であって、
    −試験される動物またはヒトから組織を得るステップと、
    −該組織中に該タンパク質が存在する場合に該抗体またはその断片がＳＯＸ１０タンパク質に結合するような量および条件下で、該組織を、請求項１、２、３、６、１０、１１、１２、１３、１４、１６、２１、２２、２８、または２９に記載の抗体またはその断片と接触させるステップと、
    −結合した該抗体の存在を検出するステップと
    を含むイムノアッセイ法。
  108. 前記組織を固定または凍結するステップをさらに含む、請求項１０７に記載の、動物またはヒトにおけるＳＯＸ１０タンパク質を検出するためのイムノアッセイ法。
  109. 前記固定または凍結した組織を処理してエピトープをＳＯＸ１０に暴露するステップをさらに含む、請求項１０８に記載の、動物またはヒトにおけるＳＯＸ１０タンパク質を検出するためのイムノアッセイ法。
  110. 免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＦＦＰＥのＩＨＣ、凍結組織切片のＩＨＣ、免疫細胞化学、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される方法を用いて前記動物またはヒトにおける前記ＳＯＸ１０タンパク質を検出するステップをさらに含む、請求項１０７に記載の、ＳＯＸ１０タンパク質を検出するためのイムノアッセイ法。
  111. ＳＯＸ１０タンパク質に特異的に結合する抗体の単離された調製物であって、該抗体が、配列番号３（ＳＯＸ１０タンパク質の残基１９６〜２１１）からなる群から選択されるエピトープに結合する、調製物。
  112. 前記生体試料が、皮膚組織を含む、請求項７７に記載の方法。
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