JP2016531087A - SC−β細胞及び組成物並びにその生成方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2013年6月11日付けで出願された米国仮出願第61/833,898号及び2014年3月28日付けで出願された米国仮出願第61/972,212号の利益を主張する。その内容は、その全体が参照により組み込まれる。
813.1, AAR08901.1, AAO15420.2, CAC59700.1, AAL26886.1, AAK71708.1, AAK71707.1, CAC51427.2, AAK67984.1, AAK67983.1, AAK28706.1, P07713, P91706, P91699, CAG02450.1, AAC47552.1, NP−005802.1, XP−343149.1, AW34055.1, XP−538221.1, AAR27580.1, XP−125935.3, AAF21633.1, AAF21630.1, AAD05267.1, Q9Z1W4, NP−031585.2, NP−571094.1, CAD43439.1, CAF99217.1, CAB63584.1, NP−722840.1, CAE46407.1, XP−417667.1, BAC53989.1, BAB19659.1, AAM46922.1, AAA81169.1, AAK28707.1, AAL05943.1, AAB17573.1, CAH25443.1, CAG10269.1, BAD16731.1, EAA00276.2, AAT07320.1, AAT07300.1, AAN15037.1, CAH25442.1, AAK08152.2, 2009388A, AAR12161.1, CAG01961.1, CAB63656.1, CAD67714.1, CAF94162.1, NP−477340.1, EAL24792.1, NP−001009428.1, AAB86686.1, AAT40572.1, AAT40571.1, AAT40569.1, NP−033886.1, AAB49985.1, AAG39266.1, Q26974, AAC77461.1, AAC47262.1, BAC05509.1, NP−055297.1, XP−546146.1, XP−525772.1, NP−060525.2, AAH33585.1, AAH69080.1, CAG12751.1, AAH74757.2, NP−034964.1, NP−038639.1, O42221, AAF02773.1, NP−062024.1, AAR18244.1, AAR14343.1, XP−228285.2, AAT40573.1, AAT94456.1, AAL35278.1, AAL35277.1, AAL17640.1, AAC08035.1, AAB86692.1, CAB40844.1, BAC38637.1, BAB16046.1, AAN63522.1, NP−571041.1, AAB04986.2, AAC26791.1, AAB95254.1, BAA11835.1, AAR18246.1, XP−538528.1, BAA31853.1, AAK18000.1, XP−420540.1, AAL35276.1, AAQ98602.1, CAE71944.1, AAW50585.1, AAV63982.1, AAW29941.1, AAN87890.1, AAT40568.1, CAD57730.1, AAB81508.1, AAS00534.1, AAC59736.1, BAB79498.1, AAA97392.1, AAP85526.1, NP−999600.2, NP−878293.1, BAC82629.1, CAC60268.1, CAG04919.1, AAN10123.1, CAA07707.1 AAK20912.1, AAR88254.1, CAC34629.1, AAL35275.1, AAD46997.1, AAN03842.1, NP−571951.2, CAC50881.1, AAL99367.1, AAL49502.1, AAB71839.1, AAB65415.1, NP−624359.1, NP−990153.1, AAF78069.1, AAK49790.1, NP−919367.2, NP−001192.1, XP−544948.1, AAQ18013.1, AAV38739.1, NP−851298.1, CAA67685.1, AAT67171.1, AAT37502.1, AAD27804.1, AAN76665.1, BAC11909.1, XP−421648.1, CAB63704.1, NP−037306.1, A55706, AAF02780.1, CAG09623.1, NP−067589.1, NP−035707.1, AAV30547.1, AAP49817.1, BAC77407.1, AAL87199.1, CAG07172.1, B36193, CAA33024.1, NP−001009400.1, AAP36538.1, XP−512687.1, XP−510080.1, AAH05513.1, 1KTZ, AAH14690.1, AAA31526.1.
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細胞クラスター形成を促進する条件下において、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、i)形質転換成長因子β(TGF−β)シグナル伝達経路阻害剤、ii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータ、及び場合により、iii)プロテインキナーゼ阻害剤と接触させて、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の、SC−β細胞へのin vitro成熟を誘導することを含み、前記SC−β細胞が、in vitroでのGSIS応答を示す、
SC−β細胞の生成方法。
(項目1)
in vitroでのグルコース刺激インスリン分泌(GSIS)応答を示す、幹細胞系β細胞(SC−β)。
(項目2)
前記SC−β細胞が、成熟している、項目1記載の細胞。
(項目3)
前記SC−β細胞が、in vivoでのGSIS応答を示す、項目1から2のいずれか一項に記載の細胞。
(項目4)
前記SC−β細胞が、少なくとも1回のグルコースチャレンジに対して、GSIS応答を示す、項目1から3のいずれか一項に記載の細胞。
(項目5)
前記SC−β細胞が、少なくとも2回の連続的なグルコースチャレンジに対して、GSIS応答を示す、項目1から4のいずれか一項に記載の細胞。
(項目6)
前記SC−β細胞が、少なくとも3回の連続的なグルコースチャレンジに対して、GSIS応答を示す、項目1から5のいずれか一項に記載の細胞。
(項目7)
前記GSIS応答が、前記細胞をヒトまたは動物に移植した直後に観察される、項目1から6のいずれか一項に記載の細胞。
(項目8)
前記GSIS応答が、前記細胞をヒトまたは動物に移植した約24時間以内に観察される、項目1から7のいずれか一項に記載の細胞。
(項目9)
前記GSIS応答が、前記細胞をヒトまたは動物に移植した約2週間以内に観察される、項目1から8のいずれか一項に記載の細胞。
(項目10)
低グルコース濃度と比較して、高グルコース濃度に対する応答において分泌されたインスリンの割合により特徴付けられる前記細胞の刺激指数が、内在性の成熟膵臓β細胞の刺激指数に類似している、項目1から9のいずれか一項に記載の細胞。
(項目11)
前記刺激指数が、1以上または1.1以上または1.3以上または2以上または2.3以上または2.6以上である、項目1から10のいずれか一項に記載の細胞。
(項目12)
前記SC−β細胞が、サイトカインに対する応答において、サイトカイン誘導性アポトーシスを示す、項目1から11のいずれか一項に記載の細胞。
(項目13)
前記サイトカインが、インターロイキン−1β(IL−β)、インターフェロン−γ(INF−γ)、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)及びそれらの組合せからなる群から選択される、項目1から12のいずれか一項に記載の細胞。
(項目14)
前記SC−β細胞からのインスリン分泌が、抗糖尿病剤に対する応答において亢進する、項目1から13のいずれか一項に記載の細胞。
(項目15)
前記抗糖尿病剤が、インクレチン模倣物、スルホニル尿素、メグリチニド及びそれらの組合せからなる群から選択される分泌促進物質を含む、項目14記載の細胞。
(項目16)
前記SC−β細胞が、モノホルモン性である、項目1から15のいずれか一項に記載の細胞。
(項目17)
前記SC−β細胞が、内在性の成熟膵臓β細胞の形態に類似する形態を示す、項目1から16のいずれか一項に記載の細胞。
(項目18)
前記SC−β細胞が、内在性の成熟膵臓β細胞のインスリン顆粒に類似する、電子顕微鏡観察下における封入結晶インスリン顆粒を示す、項目1から17のいずれか一項に記載の細胞。
(項目19)
前記SC−β細胞が、低速の複製を示す、項目1から18のいずれか一項に記載の細胞。
(項目20)
前記SC−β細胞が、内在性の成熟膵臓β細胞のGSCFに類似するグルコース刺激Ca 2+ 流動(GSCF)を示す、項目1から19のいずれか一項に記載の細胞。
(項目21)
前記SC−β細胞が、少なくとも1回のグルコースチャレンジに対して、GSCF応答を示す、項目1から20のいずれか一項に記載の細胞。
(項目22)
前記SC−β細胞が、少なくとも2回のグルコースチャレンジに対して、GSCF応答を示す、項目1から21のいずれか一項に記載の細胞。
(項目23)
前記SC−β細胞が、少なくとも3回のグルコースチャレンジに対して、GSCF応答を示す、項目1から22のいずれか一項に記載の細胞。
(項目24)
前記SC−β細胞が、亢進したカルシウム流動を示す、項目1から23のいずれか一項に記載の細胞。
(項目25)
前記亢進したカルシウム流動が、増大した量の流入または、高グルコース濃度に対して低い流入比を含む、項目24記載の細胞。
(項目26)
前記SC−β細胞が、インスリン、C−ペプチド、PDX1、MAFA、NKX6−1、PAX6、ニューロD1、グルコキナーゼ(GCK)、SLC2A1、PCSK1、KCNJ11、ABCC8、SLC30A8、SNAP25、RAB3A、GAD2、PTPRN、NKX2−2、Pax4からなる群から選択される、内在性の成熟膵臓β細胞に固有の少なくとも1つのマーカーを発現している、項目1から25のいずれか一項に記載の細胞。
(項目27)
前記SC−β細胞が、
a)i)グルカゴン(GCG)及び
ii)ソマトスタチン(SST)からなる群から選択されるホルモン;または、
b)i)アミラーゼ及び
ii)カルボキシペプチダーゼA(CPA1)からなる群から選択される腺細胞マーカー;
c)i)GCG、
ii)Arx、
iii)Irx1及びIRからなる群から選択されるα細胞マーカー;並びに、
d)i)CFTR及び
ii)Sox9からなる群から選択される管細胞マーカー、からなる群から選択される少なくとも1つのマーカーを発現していない、項目1から26のいずれか一項に記載の細胞。
(項目28)
前記SC−β細胞が、インスリン陽性内分泌細胞または、Nkx6−1陽性膵臓始原細胞、Pdx1陽性膵臓始原細胞及び多能性幹細胞からなる群から選択されるその前駆体から、in vitroにおいて分化されている、項目1から27のいずれか一項に記載の細胞。
(項目29)
前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞からなる群から選択される、項目28記載の細胞。
(項目30)
前記SC−β細胞がヒトである、項目1から29のいずれか一項に記載の細胞。
(項目31)
前記SC−β細胞が、遺伝子組み換えされていない、項目1から30のいずれか一項に記載の細胞。
(項目32)
前記SC−β細胞が、遺伝子組み換えされている、項目1から31のいずれか一項に記載の細胞。
(項目33)
前記SC−β細胞あたりに産生されるインスリンが、高グルコース濃度での30分のインキュベートにおいて、細胞1000個あたりに、0.5と10μIUとの間である、項目1から32のいずれか一項に記載の細胞。
(項目34)
前記SC−β細胞あたりに産生されるインスリンが、高グルコース濃度での30分のインキュベートにおいて、細胞1000個あたりに、約2.5μIUである、項目1から33のいずれか一項に記載の細胞。
(項目35)
前記インキュベートが、ex vivoにおいて生じる、項目33または34記載の細胞。
(項目36)
項目1から35のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞株。
(項目37)
前記細胞株が、インスリンを安定的に発現している、項目36記載の細胞株。
(項目38)
前記細胞が、少なくとも30回の継代まで、明らかな形態変化をすることなく、凍結、解凍及び、約24と44時間との間の倍加時間で増幅されることができる、項目36または37記載の細胞株。
(項目39)
細胞クラスター形成を促進する条件下において、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞集合を、a)形質転換成長因子β(TGF−β)シグナル伝達阻害剤及びb)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータを含む少なくとも2つのβ細胞成熟因子と接触させて、前記集合中の少なくとも1つのインスリン陽性内分泌細胞のSC−β細胞へのin vitro成熟を誘導することを含み、前記SC−β細胞が、in vitroでのGSIS応答を示す、
インスリン陽性内分泌細胞からのSC−β細胞の生成方法。
(項目40)
前記SC−β細胞が、少なくとも1回のグルコースチャレンジに対する応答を示す、項目39記載の方法。
(項目41)
前記SC−β細胞が、少なくとも2回の連続的なグルコースチャレンジに対する応答を示す、項目39または40記載の方法。
(項目42)
前記SC−β細胞が、少なくとも3回の連続的なグルコースチャレンジに対する応答を示す、項目39から41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
前記SC−β細胞の形態が、内在性の成熟β細胞の形態に類似している、項目39から42のいずれか一項に記載の方法。
(項目44)
前記SC−β細胞が、in vivoでのグルコース刺激インスリン分泌(GSIS)応答を示す、項目39から43のいずれか一項に記載の方法。
(項目45)
前記GSIS応答が、前記SC−β細胞を対象に移植した直後に観察される、項目39から44のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記GSIS応答が、前記SC−β細胞を対象に移植した約24時間以内に観察される、項目39から45のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記GSIS応答が、前記SC−β細胞を対象に移植した約2週間以内に観察される、項目39から46のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
前記細胞集合を、100nM−100μMの間の濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、項目39から47のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記細胞集合を、10μMの濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、項目39から48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
TGF−βシグナル伝達経路が、TGF−β受容体I型キナーゼシグナル伝達を含む、項目39から49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤が、Alk5阻害剤IIを含む、項目39から50のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤が、Alk5阻害剤IIの類似体または誘導体を含む、項目39から51のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記細胞集合を、0.1μM−10μMの間の濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目39から52のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記細胞集合を、1μMの濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目39から53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータが、トリヨードチロニン(T3)を含む、項目39から54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記細胞集合を、場合により、プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、項目39から55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記細胞集合を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させない、項目56記載の方法。
(項目58)
前記細胞集合を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、項目56記載の方法。
(項目59)
前記細胞集合を、10nM−1μMの間の濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、項目57記載の方法。
(項目60)
前記細胞集合を、100nMの濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、項目58または59記載の方法。
(項目61)
前記プロテインキナーゼ阻害剤が、スタウロスポリンを含む、項目58から60のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
さらに、前記細胞集合を、少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子と接触させることを含む、項目39から61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)阻害剤を含む、項目62記載の方法。
(項目64)
前記細胞集合を、100nM−100μMの間の濃度で、前記CFTR阻害剤と接触させる、項目62または63記載の方法。
(項目65)
前記細胞集合を、10nM−10μMの濃度で、前記CFTR阻害剤と接触させる、項目62から64のいずれか一項に記載の方法。
(項目66)
前記CFTR阻害剤が、Gly−H101を含む、項目62から65のいずれか一項に記載の方法。
(項目67)
前記少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子が、O−GlcNAcase阻害剤を含む、項目62から66のいずれか一項に記載の方法。
(項目68)
前記細胞集合を、100nM−100μMの間の濃度で、前記O−GlcNAcase阻害剤と接触させる、項目67記載の方法。
(項目69)
前記細胞集合を、10nM−10μMの間の濃度で、前記O−GlcNAcase阻害剤と接触させる、項目67または68記載の方法。
(項目70)
前記O−GlcNAcase阻害剤が、Thiamet Gを含む、項目39から69のいずれか一項に記載の方法。
(項目71)
前記細胞集合が、適切な培養培地中で培養される、項目39から70のいずれか一項に記載の方法。
(項目72)
前記適切な培養培地が、膵島培地(CMRLS)またはCMRLSの成分を添加した、Connought Medical Research Laboratories 1066を含む、項目71記載の方法。
(項目73)
前記CMRLSが、血清と共に添加される、項目72記載の方法。
(項目74)
前記CMRLSが、10% ウシ胎児血清と共に添加される、項目72または73記載の方法。
(項目75)
前記細胞クラスター形成を促進する条件が、懸濁培養を含む、項目39から74のいずれか一項に記載の方法。
(項目76)
前記細胞集合が、前記細胞集合中の少なくとも1つの前記インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも1つのSC−β細胞へのin vitro成熟を誘導するのに十分な期間、懸濁培養において維持される、項目39から75のいずれか一項に記載の方法。
(項目77)
前記期間が、少なくとも7日を含む、項目76記載の方法。
(項目78)
前記期間が、7日と21日との間を含む、項目76または77記載の方法。
(項目79)
前記期間が、7日と14日との間を含む、項目76から78のいずれか一項に記載の方法。
(項目80)
前記期間が、10日と14日との間を含む、項目76から79のいずれか一項に記載の方法。
(項目81)
前記期間が、14日を含む、項目76から80のいずれか一項に記載の方法。
(項目82)
前記β細胞成熟因子が、2日に1回補充される、項目77から81のいずれか一項に記載の方法。
(項目83)
前記細胞集合中の少なくとも1%の前記インスリン陽性内分泌細胞が誘導されて、SC−β細胞に成熟する、項目39から82のいずれか一項に記載の方法。
(項目84)
前記集合中の少なくとも99%の前記インスリン陽性内分泌細胞が誘導されて、SC−β細胞に成熟する、項目39から83のいずれか一項に記載の方法。
(項目85)
前記集合中の得られた細胞の少なくとも30%が、SC−β細胞を含む、項目39から84のいずれか一項に記載の方法。
(項目86)
前記SC−β細胞が、C−ペプチド、インスリン、NKX6−1、Pdx1を発現しており、NKX6−1とC−ペプチドとを共発現している、項目39から85のいずれか一項に記載の方法。
(項目87)
前記インスリン陽性内分泌細胞が、Pdx1及びNKX6−1も発現している、項目39から86のいずれか一項に記載の方法。
(項目88)
前記インスリン陽性内分泌細胞が、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞からなる群から選択される多能性幹細胞の集合から産生される、項目39から87のいずれか一項に記載の方法。
(項目89)
前記SC−β細胞が、ヒト細胞を含む、項目39から88のいずれか一項に記載の方法。
(項目90)
in vitroにおける前記SC−β細胞の生成が、規模を拡大できる、項目39から89のいずれか一項に記載の方法。
(項目91)
項目39から90のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたSC−β細胞の単離された集合。
(項目92)
その中に封入された、項目91記載のSC−β細胞の単離された集合を含むマイクロカプセル。
(項目93)
項目39から90のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたSC−β細胞の集合を含む組成物。
(項目94)
項目39から90のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたSC−β細胞の単離された集合を含むアッセイ。
(項目95)
β細胞の増殖、β細胞の複製、β細胞の死、β細胞の機能、免疫攻撃に対するβ細胞の感受性または脱分化もしくは分化に対するβ細胞の感受性からなる群から選択される、β細胞の運命を促進または阻害する、1つ以上の候補剤を特定するのに使用するための、項目94記載のアッセイ。
(項目96)
少なくとも1つのインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体の、少なくとも1つのSC−β細胞への分化を促進する、1つ以上の候補剤を特定するのに使用するための、項目94記載のアッセイ。
(項目97)
項目39から90のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたSC−β細胞の単離された集合を含む組成物を、対象に投与することを含む、
それを必要とする対象の処置方法。
(項目98)
前記SC−β細胞が、マイクロカプセルに封入されている、項目97記載の方法。
(項目99)
前記SC−β細胞が、前記SC−β細胞が投与される前記同じ対象から得られた多能性幹細胞の集合から産生される、項目97または98記載の方法。
(項目100)
前記SC−β細胞が、iPS細胞の集合から産生され、前記iPS細胞が、前記SC−β細胞が投与される前記同じ対象から得られた細胞から得られる、項目97から99のいずれか一項に記載の方法。
(項目101)
前記対象が、糖尿病を有するか、または、糖尿病になる増大したリスクを有する、項目97から100のいずれか一項に記載の方法。
(項目102)
前記糖尿病が、I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病及び糖尿病前症からなる群から選択される、項目101記載の方法。
(項目103)
前記対象が、代謝異常を有するか、または、代謝異常になる増大したリスクを有する、項目97から100のいずれか一項に記載の方法。
(項目104)
それを必要とする対象に投与するための、項目39から100のいずれか一項に記載の方法により産生されたSC−β細胞の単離された集合の使用。
(項目105)
前記SC−β細胞の単離された集合が、マイクロカプセルに封入されて、前記対象に投与される、項目104記載の使用。
(項目106)
前記対象が、糖尿病を有するか、または、糖尿病になる増大したリスクを有する、項目104または105記載の使用。
(項目107)
前記糖尿病が、I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病及び糖尿病前症からなる群から選択される、項目104から106のいずれか一項に記載の使用。
(項目108)
前記対象が、代謝異常を有するか、または、代謝異常になる増大したリスクを有する、項目104または105記載の使用。
(項目109)
インスリン陽性内分泌細胞のSC−β細胞へのin vitro成熟を誘導するための、a)Alk5阻害剤、b)トリヨードチロニン(T3)、場合により、c)スタウロスポリン、及び場合により、d)CMRLSを含み、前記SC−β細胞が、in vitro及び/またはin vivoの両方でのGSIS応答を示す、
培養培地。
(項目110)
細胞クラスター形成を促進する条件下において、Pdx1陽性膵臓始原細胞を含む細胞集合を、a)繊維芽細胞成長因子(FGF)ファミリーからの少なくとも1つの成長因子、b)ソニックヘッジホッグ経路阻害剤を含む少なくとも2つのβ細胞成熟因子、及び場合により、c)低濃度のレチノイン酸(RA)シグナル伝達経路アクチベータと、少なくとも5日の期間接触させて、前記集合中の少なくとも1つのPdx1陽性膵臓始原細胞のNKX6−1陽性膵臓始原細胞への分化を誘導することを含み、前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が、NKX6−1を発現している、
Pdx1陽性膵臓始原細胞からのNKX6−1陽性膵臓始原細胞の製造方法。
(項目111)
前記細胞集合を、1ng/mL−100ng/mLの間の濃度で、前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、項目110記載の方法。
(項目112)
前記細胞集合を、50ng/mLの濃度で、前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、項目110または111記載の方法。
(項目113)
前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、ケラチノサイト成長因子(KGF)を含む、項目110から112のいずれか一項に記載の方法。
(項目114)
前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、FGF2、FGF8B、FGF10及びFGF21からなる群から選択される、項目110から113のいずれか一項に記載の方法。
(項目115)
前記細胞集合を、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させない、項目110から114のいずれか一項に記載の方法。
(項目116)
前記細胞集合を、0.01μM−1.0μMの間の濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目110から115のいずれか一項に記載の方法。
(項目117)
前記細胞集合を、0.1μMの濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目110から116のいずれか一項に記載の方法。
(項目118)
前記RAシグナル伝達経路アクチベータが、RAを含む、項目110から117のいずれか一項に記載の方法。
(項目119)
前記細胞集合を、0.1μMと0.5μMとの間の濃度で、前記SHH経路阻害剤と接触させる、項目110から118のいずれか一項に記載の方法。
(項目120)
前記細胞集合を、0.25μMの濃度で、前記SHH経路阻害剤と接触させる、項目110から119のいずれか一項に記載の方法。
(項目121)
前記SHH経路阻害剤が、Sant1を含む、項目110から120のいずれか一項に記載の方法。
(項目122)
さらに、少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子に、前記細胞集合を曝すことを含む、項目110から121のいずれか一項に記載の方法。
(項目123)
前記少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子が、EGFファミリーからの少なくとも1つの成長因子を含む、項目122記載の方法。
(項目124)
前記細胞集合が、2ng/mL−200ng/mLの間の濃度で、前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子に曝される、項目123記載の方法。
(項目125)
前記細胞集合が、20ng/mLの濃度で、前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子に曝される、項目123または124記載の方法。
(項目126)
EGFファミリーからの少なくとも1つの成長因子が、ベタセルリン及びEGFからなる群から選択される、項目123から125のいずれか一項に記載の方法。
(項目127)
前記細胞集合が、適切な培養培地中で培養される、項目110から126のいずれか一項に記載の方法。
(項目128)
前記細胞クラスター形成を促進する条件が、懸濁培養を含む、項目110から127のいずれか一項に記載の方法。
(項目129)
前記β細胞成熟因子が、2日に1回補充される、項目110から128のいずれか一項に記載の方法。
(項目130)
プロテインキナーゼCのアクチベータが、5日の間、前記懸濁培養に添加されない、項目110から129のいずれか一項に記載の方法。
(項目131)
プロテインキナーゼCのアクチベータが、5日の前に、前記懸濁培養から除去される、項目110から129のいずれか一項に記載の方法。
(項目132)
前記プロテインキナーゼCのアクチベータが、PdbUを含む、項目110または131記載の方法。
(項目133)
BMPシグナル伝達経路阻害剤が、5日の間、前記懸濁培養に添加されない、項目110から132のいずれか一項に記載の方法。
(項目134)
BMPシグナル伝達経路阻害剤が、5日の前に、前記懸濁培養から除去される、項目110から132のいずれか一項に記載の方法。
(項目135)
前記BMPシグナル伝達経路阻害剤が、LDN193189を含む、項目133または134記載の方法。
(項目136)
前記集合中の少なくとも10%の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞が誘導されて、NKX6−1陽性膵臓始原細胞に分化する、項目110から135のいずれか一項に記載の方法。
(項目137)
前記集合中の少なくとも95%の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞が誘導されて、NKX6−1陽性膵臓始原細胞に分化する、項目110から136のいずれか一項に記載の方法。
(項目138)
前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が、Pdx1、NKX6−1及びFoxA2を発現している、項目110から137のいずれか一項に記載の方法。
(項目139)
前記Pdx1陽性膵臓始原細胞が、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞からなる群から選択される多能性幹細胞の集合から産生される、項目110から138のいずれか一項に記載の方法。
(項目140)
項目110から139のいずれか一項に記載の方法により得られたNKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合。
(項目141)
その中に封入された、項目140記載のNKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合を含むマイクロカプセル。
(項目142)
項目110から139のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたNKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合を含む組成物。
(項目143)
項目110から139のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたNKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合を含むアッセイ。
(項目144)
少なくとも1つのPdx1陽性膵臓始原細胞またはその前駆体の、NKX6−1陽性膵臓始原細胞への分化を促進する、1つ以上の候補剤を特定するのに使用するための、項目143記載のアッセイ。
(項目145)
項目110から139のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたNKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合を含む組成物を、対象に投与することを含む、
それを必要とする対象の処置方法。
(項目146)
前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が、前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が投与される前記同じ対象から得られた多能性幹細胞の集合から産生される、項目145記載の方法。
(項目147)
前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が、マイクロカプセルに封入される、項目145または146記載の方法。
(項目148)
前記対象が、糖尿病を有するか、または、糖尿病になる増大したリスクを有する、項目145から147のいずれか一項に記載の方法。
(項目149)
前記糖尿病が、I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病及び糖尿病前症からなる群から選択される、項目148記載の方法。
(項目150)
前記対象が、代謝異常を有するか、または、代謝異常になる増大したリスクを有する、項目145から147のいずれか一項に記載の方法。
(項目151)
SC−β細胞に分化させるための、項目110から139のいずれか一項に記載の方法により産生されたNKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合の使用。
(項目152)
それを必要とする対象に投与するための、項目110から139のいずれか一項に記載の方法により産生されたNKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合の使用。
(項目153)
前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合が、マイクロカプセルに封入されて、前記対象に投与される、項目152記載の使用。
(項目154)
前記対象が、糖尿病を有するか、または、糖尿病になる増大したリスクを有する、項目152または153記載の使用。
(項目155)
前記糖尿病が、I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病及び糖尿病前症からなる群から選択される、項目154記載の使用。
(項目156)
前記対象が、代謝異常を有するか、または、代謝異常になる増大したリスクを有する、項目152または153記載の使用。
(項目157)
細胞クラスター形成を促進する条件下において、NKX6−1陽性膵臓始原細胞を含む細胞集合を、a)TGF−βシグナル伝達経路阻害剤及びb)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータを含む少なくとも2つのβ細胞成熟因子と接触させて、前記集合中の少なくとも1つのNKX6−1陽性膵臓始原細胞の、少なくとも1つのインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することを含み、前記インスリン陽性膵臓始原細胞が、インスリンを発現している、
NKX6−1陽性膵臓始原細胞からのインスリン陽性内分泌細胞の製造方法。
(項目158)
前記細胞集合を、1μM−100μMの間の濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、項目157記載の方法。
(項目159)
前記細胞集合を、10μMの濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、項目157または158記載の方法。
(項目160)
TGF−βシグナル伝達経路が、TGF−β受容体I型キナーゼシグナル伝達を含む、項目157から159のいずれか一項に記載の方法。
(項目161)
前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤が、Alk5阻害剤IIを含む、項目157から160のいずれか一項に記載の方法。
(項目162)
前記細胞集合を、0.1μM−10μMの間の濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目157から161のいずれか一項に記載の方法。
(項目163)
前記細胞集合を、1μMの濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目157から162のいずれか一項に記載の方法。
(項目164)
前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータが、トリヨードチロニン(T3)を含む、項目157から163のいずれか一項に記載の方法。
(項目165)
さらに、前記細胞集合を、少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子と接触させることを含む、項目157から164のいずれか一項に記載の方法。
(項目166)
前記少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子が、γ−セクレターゼ阻害剤を含む、項目165記載の方法。
(項目167)
前記細胞集合を、0.1μM−10μMの間の濃度で、前記γ−セクレターゼ阻害剤と接触させる、項目166記載の方法。
(項目168)
前記細胞集合を、1μMの濃度で、前記γ−セクレターゼ阻害剤と接触させる、項目166または167記載の方法。
(項目169)
前記γ−セクレターゼ阻害剤が、XXIを含む、項目166から168のいずれか一項に記載の方法。
(項目170)
前記γ−セクレターゼ阻害剤が、DAPTを含む、項目166から169のいずれか一項に記載の方法。
(項目171)
前記少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子が、EGFファミリーからの少なくとも1つの成長因子を含む、項目165から170のいずれか一項に記載の方法。
(項目172)
前記細胞集合を、2ng/mL−200ng/mLの間の濃度で、前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、項目171記載の方法。
(項目173)
前記細胞集合を、20ng/mLの濃度で、EGFファミリーからの少なくとも1つの成長因子と接触させる、項目171または172記載の方法。
(項目174)
前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、ベタセルリンを含む、項目171から173のいずれか一項に記載の方法。
(項目175)
前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、EGFを含む、項目171から173のいずれか一項に記載の方法。
(項目176)
前記少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子が、低濃度のレチノイン酸(RA)シグナル伝達経路アクチベータを含む、項目165から175のいずれか一項に記載の方法。
(項目177)
前記細胞集合を、0.01μM−1.0μMの間の濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目176記載の方法。
(項目178)
前記細胞集合を、0.1μMの濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目176または177記載の方法。
(項目179)
前記RAシグナル伝達経路アクチベータが、RAを含む、項目176から178のいずれか一項に記載の方法。
(項目180)
前記少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子が、ソニックヘッジホッグ(SHH)経路阻害剤を含む、項目165から179のいずれか一項に記載の方法。
(項目181)
前記細胞集合を、0.1μMと0.5μMとの間の濃度で、前記SHH経路阻害剤と接触させる、項目180記載の方法。
(項目182)
前記細胞集合を、0.25μMの濃度で、前記SHH経路阻害剤と接触させる、項目180または181記載の方法。
(項目183)
前記SHH経路阻害剤が、Sant1を含む、項目180から182のいずれか一項に記載の方法。
(項目184)
前記細胞集合を、場合により、プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、項目158から183のいずれか一項に記載の方法。
(項目185)
前記細胞集合を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させない、項目184記載の方法。
(項目186)
前記細胞集合を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、項目184記載の方法。
(項目187)
前記細胞集合を、10nM−1μMの間の濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、項目186記載の方法。
(項目188)
前記細胞集合を、100nMの濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、項目186または187記載の方法。
(項目189)
前記プロテインキナーゼ阻害剤が、スタウロスポリンを含む、項目186から188のいずれか一項に記載の方法。
(項目190)
さらに、前記細胞集合をグルコースに曝すことを含む、項目157から189のいずれか一項に記載の方法。
(項目191)
前記細胞集合が、1mM−50mMの間の濃度で、グルコースに曝される、項目190記載の方法。
(項目192)
前記細胞集合が、25mMの濃度で、グルコースに曝される、項目190または191記載の方法。
(項目193)
前記細胞クラスター形成を促進する条件が、懸濁培養を含む、項目187から192のいずれか一項に記載の方法。
(項目194)
前記細胞集合が、前記集合中の少なくとも1つの前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導するのに十分な期間、懸濁培養において維持される、項目187から193のいずれか一項に記載の方法。
(項目195)
前記期間が、少なくとも7日である、項目194記載の方法。
(項目196)
前記β細胞成熟因子が、前記懸濁培養に、2日に1回補充される、項目194または195記載の方法。
(項目197)
前記集合中の少なくとも15%の前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が誘導されて、インスリン陽性内分泌細胞に分化する、項目157から196のいずれか一項に記載の方法。
(項目198)
前記集合中の少なくとも99%の前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が誘導されて、インスリン陽性内分泌細胞に分化する、項目157から197のいずれか一項に記載の方法。
(項目199)
前記インスリン陽性内分泌細胞が、Pdx1、NKX6−1、NKX2−2、Mafb、glis3、Sur1、Kir6.2、Znt8、SLC2A1、SLC2A3及び/またはインスリンを発現している、項目157から198のいずれか一項に記載の方法。
(項目200)
前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞からなる群から選択される多能性幹細胞の集合から産生される、項目157から199のいずれか一項に記載の方法。
(項目201)
項目157から200のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたインスリン陽性内分泌細胞の単離された集合。
(項目202)
その中に封入された、項目201記載のインスリン陽性内分泌細胞の単離された集合を含むマイクロカプセル。
(項目203)
項目157から200のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたインスリン陽性内分泌細胞の集合を含む組成物。
(項目204)
項目157から200のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたインスリン陽性内分泌細胞の単離された集合を含む組成物を、対象に投与することを含む、
それを必要とする対象の処置方法。
(項目205)
前記インスリン陽性内分泌細胞が、前記インスリン陽性内分泌細胞が投与される前記同じ対象から得られた多能性幹細胞の集合から産生される、項目204記載の方法。
(項目206)
前記インスリン陽性内分泌細胞が、マイクロカプセルに封入される、項目204または205記載の方法。
(項目207)
前記対象が、糖尿病を有するか、または、糖尿病になる増大したリスクを有する、項目204から206のいずれか一項に記載の方法。
(項目208)
前記糖尿病が、I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病及び糖尿病前症からなる群から選択される、項目207記載の方法。
(項目209)
前記対象が、代謝異常を有するか、または、代謝異常になる増大したリスクを有する、項目204から206のいずれか一項に記載の方法。
(項目210)
項目157から200のいずれか一項に記載の方法により産生されたインスリン陽性内分泌細胞の単離された集合の、SC−β細胞に分化させるための使用。
(項目211)
項目157から200のいずれか一項に記載の方法により産生されたインスリン陽性内分泌細胞の単離された集合の、それを必要とする対象に投与するための使用。
(項目212)
前記インスリン陽性内分泌細胞の単離された集合が、マイクロカプセルに封入されて、前記対象に投与される、項目211記載の使用。
(項目213)
前記対象が、糖尿病を有するか、または、糖尿病になる増大したリスクを有する、項目211または212記載の使用。
(項目214)
前記糖尿病が、I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病及び糖尿病前症からなる群から選択される、項目213記載の使用。
(項目215)
前記対象が、代謝異常を有するか、または、代謝異常になる増大したリスクを有する、項目211または212記載の使用。
(項目216)
NKX6−1陽性膵臓始原細胞のインスリン陽性内分泌細胞へのin vitro分化を誘導するための、a)TGF−βシグナル伝達経路阻害剤、b)TH経路アクチベータ並びに、i)XXI、ii)ベタセルリン、iii)低濃度のRAシグナル伝達経路アクチベータ及びiv)SHH経路阻害剤からなる群から選択される少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子を含む、
培養培地の使用。
(項目217)
細胞クラスター形成を促進する条件下において、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、i)形質転換成長因子β(TGF−β)シグナル伝達経路阻害剤、ii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータ、及び場合により、iii)プロテインキナーゼ阻害剤と接触させて、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の、SC−β細胞へのin vitro成熟を誘導することを含み、前記SC−β細胞が、in vitroでのGSIS応答を示す、
SC−β細胞の生成方法。
(項目218)
前記SC−β細胞が、in vivoでのGSIS応答を示す、項目217記載の方法。
(項目219)
前記GSIS応答が、(i)前記SC−β細胞を対象に移植した直後;(ii)対象への移植の約24時間以内;または、(iii)対象への移植の約2週間以内に観察される、項目217または218記載の方法。
(項目220)
前記SC−β細胞が、(i)少なくとも1回のグルコースチャレンジ;(ii)少なくとも2回の連続的なグルコースチャレンジ;または、(iii)少なくとも3回の連続的なグルコースチャレンジに対する応答を示す、項目217から219のいずれか一項に記載の方法。
(項目221)
前記SC−β細胞の形態が、内在性のβ細胞の形態に類似している、項目217から220のいずれか一項に記載の方法。
(項目222)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、100nM−100μMの間の濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、項目217から221のいずれか一項に記載の方法。
(項目223)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、10μMの濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、項目217から222のいずれか一項に記載の方法。
(項目224)
TGF−βシグナル伝達経路が、TGF−β受容体I型キナーゼシグナル伝達を含む、項目217から223のいずれか一項に記載の方法。
(項目225)
前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤が、Alk5阻害剤IIを含む、項目217から224のいずれか一項に記載の方法。
(項目226)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、0.1μM−10μMの間の濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目217から225のいずれか一項に記載の方法。
(項目227)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、1μMの濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目217から226のいずれか一項に記載の方法。
(項目228)
前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータが、トリヨードチロニン(T3)を含む、項目217から227のいずれか一項に記載の方法。
(項目229)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させない、項目217から228のいずれか一項に記載の方法。
(項目230)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、項目217から229のいずれか一項に記載の方法。
(項目231)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、10nM−1μMの間の濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、項目230記載の方法。
(項目232)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、100nMの濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、項目230または231記載の方法。
(項目233)
前記プロテインキナーゼ阻害剤が、スタウロスポリンを含む、項目230から232のいずれか一項に記載の方法。
(項目234)
さらに、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)阻害剤と接触させることを含む、項目217から233のいずれか一項に記載の方法。
(項目235)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、100nMと100μMとの間の濃度で、前記CFTR阻害剤と接触させる、項目234記載の方法。
(項目236)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、10nMと10μMとの濃度で、前記CFTR阻害剤と接触させる、項目234または235記載の方法。
(項目237)
前記CFTR阻害剤が、Gly−H101を含む、項目234から236のいずれか一項に記載の方法。
(項目238)
さらに、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、O−GlcNAcase阻害剤と接触させることを含む、項目217から237のいずれか一項に記載の方法。
(項目239)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、100nMと100μMとの間の濃度で、前記O−GlcNAcase阻害剤と接触させる、項目238記載の方法。
(項目240)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、10nMと10μMとの間の濃度で、前記O−GlcNAcase阻害剤と接触させる、項目238または239記載の方法。
(項目241)
前記O−GlcNAcase阻害剤が、Thiamet Gを含む、項目239から240記載の方法。
(項目242)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞が、適切な培養培地中で培養される、項目217から241のいずれか一項に記載の方法。
(項目243)
前記適切な培養培地が、膵島培地(CMRLS)またはCMRLSの成分を添加した、Connought Medical Research Laboratories 1066を含む、項目242記載の方法。
(項目244)
前記CMRLSが、血清と共に添加される、項目243記載の方法。
(項目245)
前記CMRLSが、10% ウシ胎児血清と共に添加される、項目217または219記載の方法。
(項目246)
さらに、Sant1を含む、項目72−74及び243−245のいずれか一項に記載の方法。
(項目247)
さらに、XXIを含む、項目72−74及び243−246のいずれか一項に記載の方法。
(項目248)
さらに、SSPを含む、項目72−74及び243−247のいずれか一項に記載の方法。
(項目249)
前記細胞クラスター形成を促進する条件が、懸濁培養を含む、項目217から248のいずれか一項に記載の方法。
(項目250)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞が、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の、SC−β細胞へのin vitro成熟を誘導するのに十分な期間、懸濁培養中で維持される、項目217から249のいずれか一項に記載の方法。
(項目251)
前記期間が、少なくとも7日を含む、項目250記載の方法。
(項目252)
前記期間が、7日と21日との間を含む、項目250または251記載の方法。
(項目253)
前記期間が、7日と14日との間を含む、項目250から252のいずれか一項に記載の方法。
(項目254)
前記期間が、14日を含む、項目250から253のいずれか一項に記載の方法。
(項目255)
前記懸濁培養が、2日に1回補充される、項目250から254のいずれか一項に記載の方法。
(項目256)
生成された前記細胞の少なくとも30%が、SC−β細胞を含む、項目217から255のいずれか一項に記載の方法。
(項目257)
前記SC−β細胞が、C−ペプチド、インスリン、NKX6−1、Pdx1を発現しており、NKX6−1とC−ペプチドとを共発現している、項目217から256のいずれか一項に記載の方法。
(項目258)
前記SC−β細胞が、ヒト細胞を含む、項目217から257のいずれか一項に記載の方法。
(項目259)
in vitroにおける前記SC−β細胞の生成が、規模を拡大できる、項目217から258のいずれか一項に記載の方法。
(項目260)
前記インスリン陽性内分泌細胞が、細胞クラスター形成を促進する条件下において、Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、i)TGF−βシグナル伝達経路阻害剤及びii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させて、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞の、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞への分化を誘導することにより得られ、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞が、Pdx1、NKX6−1、NKX2−2、Mafb、glis3、Sur1、Kir6.2、Znt8、SLC2A1、SLC2A3及び/またはインスリンを発現している、項目217から259のいずれか一項に記載の方法。
(項目261)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、100nM−100μMの間の濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、項目260記載の方法。
(項目262)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、10μMの濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、項目260または261記載の方法。
(項目263)
TGF−βシグナル伝達経路が、TGF−β受容体I型キナーゼシグナル伝達を含む、項目260から262のいずれか一項に記載の方法。
(項目264)
前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤が、Alk5阻害剤IIを含む、項目260から263のいずれか一項に記載の方法。
(項目265)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、0.1μM−10μMの間の濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目260から264のいずれか一項に記載の方法。
(項目266)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、1μMの濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目260から265のいずれか一項に記載の方法。
(項目267)
前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータが、トリヨードチロニン(T3)を含む、項目260から266のいずれか一項に記載の方法。
(項目268)
さらに、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、i)SHH経路阻害剤、ii)RAシグナル伝達経路アクチベータ、iii)γ−セクレターゼ阻害剤、iv)上皮成長因子(EGF)ファミリーからの少なくとも1つの成長因子、及び場合により、v)プロテインキナーゼ阻害剤の、少なくとも1つと接触させることを含む、項目260から267のいずれか一項に記載の方法。
(項目269)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、0.1μMと0.5μMとの間の濃度で、前記SHH経路阻害剤と接触させる、項目268記載の方法。
(項目270)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、0.25μMの濃度で、SHH経路阻害剤と接触させる、項目268または269記載の方法。
(項目271)
前記SHH経路阻害剤が、Sant1を含む、項目268から270のいずれか一項に記載の方法。
(項目272)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、0.01μM−1.0μMの間の濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目268から271のいずれか一項に記載の方法。
(項目273)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、0.1μMの濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目268から272のいずれか一項に記載の方法。
(項目274)
前記RAシグナル伝達経路アクチベータが、RAを含む、項目268から273のいずれか一項に記載の方法。
(項目275)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、0.1μM−10μMの間の濃度で、前記γ−セクレターゼ阻害剤と接触させる、項目268から274のいずれか一項に記載の方法。
(項目276)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、1μMの濃度で、前記γ−セクレターゼ阻害剤と接触させる、項目268から275のいずれか一項に記載の方法。
(項目277)
前記γ−セクレターゼ阻害剤が、XXIを含む、項目268から276のいずれか一項に記載の方法。
(項目278)
前記γ−セクレターゼ阻害剤が、DAPTを含む、項目268から277のいずれか一項に記載の方法。
(項目279)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、2ng/mL−200ng/mLの間の濃度で、前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、項目268から278のいずれか一項に記載の方法。
(項目280)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、20ng/mLの濃度で、前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、項目268から279のいずれか一項に記載の方法。
(項目281)
前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、ベタセルリンを含む、項目268から280のいずれか一項に記載の方法。
(項目282)
前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、EGFを含む、項目268から281のいずれか一項に記載の方法。
(項目283)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させない、項目268から282のいずれか一項に記載の方法。
(項目284)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、項目268から283のいずれか一項に記載の方法。
(項目285)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、10nM−1μMの間の濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、項目284記載の方法。
(項目286)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、100nMの濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、項目284または285記載の方法。
(項目287)
前記プロテインキナーゼ阻害剤が、スタウロスポリンを含む、項目284から286のいずれか一項に記載の方法。
(項目288)
さらに、前記細胞集合をグルコースに曝すことを含む、項目260から287のいずれか一項に記載の方法。
(項目289)
前記細胞集合が、1mM−50mMの間の濃度で、グルコースに曝される、項目288記載の方法。
(項目290)
前記細胞集合が、25mMの濃度で、グルコースに曝される、項目288または289記載の方法。
(項目291)
前記細胞クラスター形成を促進する条件が、懸濁培養を含む、項目260から290のいずれか一項に記載の方法。
(項目292)
前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞が、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞の、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞への分化を誘導するのに十分な期間、懸濁培養において維持される、項目260から291のいずれか一項に記載の方法。
(項目293)
前記期間が、少なくとも7日である、項目292記載の方法。
(項目294)
前記懸濁培養が、2日に1回補充される、項目292または293記載の方法。
(項目295)
少なくとも15%の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞が誘導されて、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化する、項目260から294のいずれか一項に記載の方法。
(項目296)
少なくとも99%の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞が誘導されて、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化する、項目260から295のいずれか一項に記載の方法。
(項目297)
細胞クラスター形成を促進する条件下において、Pdx1陽性膵臓始原細胞を、i)FGFファミリーからの少なくとも1つの成長因子、ii)少なくとも1つのSHH経路阻害剤、及び場合により、iii)低濃度のRAシグナル伝達経路アクチベータと、5日の期間接触させて、少なくとも一部の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞の、Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞への分化を誘導することにより得られ、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞が、Pdx1及びNKX6−1を発現している、項目260から296のいずれか一項に記載の方法。
(項目298)
前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、1ng/mL−100ng/mLの間の濃度で、前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、項目297記載の方法。
(項目299)
前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、50ng/mLの濃度で、前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、項目297または298記載の方法。
(項目300)
前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、ケラチノサイト成長因子(KGF)を含む、項目297から299のいずれか一項に記載の方法。
(項目301)
前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、FGF2、FGF8B、FGF10及びFGF21からなる群から選択される、項目297から300のいずれか一項に記載の方法。
(項目302)
前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、0.1μMと0.5μMとの間の濃度で、前記少なくとも1つのSHH経路阻害剤と接触させる、項目297から301のいずれか一項に記載の方法。
(項目303)
前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、0.25μMの濃度で、前記少なくとも1つのSHH経路阻害剤と接触させる、項目297から302のいずれか一項に記載の方法。
(項目304)
前記少なくとも1つのSHH経路阻害剤が、Sant1を含む、項目297から303のいずれか一項に記載の方法。
(項目305)
前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、0.01μM−1.0μMの間の濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目297から304のいずれか一項に記載の方法。
(項目306)
前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、0.1μMの濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、項目297から305のいずれか一項に記載の方法。
(項目307)
前記RAシグナル伝達経路アクチベータが、RAを含む、項目297から306のいずれか一項に記載の方法。
(項目308)
さらに、前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、EGFファミリーからの少なくとも1つの成長因子と接触させることを含む、項目297から307のいずれか一項に記載の方法。
(項目309)
前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、2ng/mL−200ng/mLの間の濃度で、前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、項目308記載の方法。
(項目310)
前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、20ng/mLの濃度で、前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、項目308または309記載の方法。
(項目311)
前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、ベタセルリンを含む、項目308から310のいずれか一項に記載の方法。
(項目312)
前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、EGFを含む、項目308から311のいずれか一項に記載の方法。
(項目313)
前記Pdx1陽性膵臓始原細胞が、適切な培養培地中で培養される、項目297から312のいずれか一項に記載の方法。
(項目314)
前記細胞クラスター形成を促進する条件が、懸濁培養を含む、項目297から313のいずれか一項に記載の方法。
(項目315)
前記懸濁培養が、2日に1回補充される、項目314記載の方法。
(項目316)
プロテインキナーゼCのアクチベータが、5日の間、前記懸濁培養に添加されない、項目297から315のいずれか一項に記載の方法。
(項目317)
プロテインキナーゼCのアクチベータが、5日の前に、前記懸濁培養から除去される、項目297から316のいずれか一項に記載の方法。
(項目318)
前記プロテインキナーゼCのアクチベータが、PdbUを含む、項目316または317記載の方法。
(項目319)
BMPシグナル伝達経路阻害剤が、5日の間、前記懸濁培養に添加されない、項目297から318のいずれか一項に記載の方法。
(項目320)
BMPシグナル伝達経路阻害剤が、5日の前に、前記懸濁培養から除去される、項目297から319のいずれか一項に記載の方法。
(項目321)
前記BMPシグナル伝達経路阻害剤が、LDN193189を含む、項目319または320記載の方法。
(項目322)
前記集合中の少なくとも10%の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞が誘導されて、Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞に分化する、項目297から320のいずれか一項に記載の方法。
(項目323)
少なくとも95%の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞が誘導されて、Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞に分化する、項目297から322のいずれか一項に記載の方法。
(項目324)
a)集合中の多能性幹細胞を、Pdx1陽性膵臓始原細胞に分化させること;
b)細胞クラスター形成を促進する条件下において、前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、i)FGFファミリーからの少なくとも1つの成長因子、ii)少なくとも1つのSHH経路阻害剤、及び場合により、iii)RAシグナル伝達経路アクチベータと、2日に1回、5日の期間接触させて、前記集合中の少なくとも一部の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞のNKX6−1陽性膵臓始原細胞への分化を誘導する方法により、少なくとも一部の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞に分化させることであって、前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が、Pdx1及びNKX6−1を発現している前記分化;
c)細胞クラスター形成を促進する条件下において、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、i)TGF−βシグナル伝達経路阻害剤、b)THシグナル伝達経路アクチベータ、及び場合により、c)少なくとも1つのSHH経路阻害剤、ii)RAシグナル伝達経路アクチベータ、iii)γ−セクレターゼ阻害剤並びにvi)上皮成長因子(EGF)ファミリーからの少なくとも1つの成長因子と、2日に1回、5日と7日との間の期間接触させて、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞の、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞への分化を誘導する方法により、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化させることであって、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞が、Pdx1、NKX6−1、NKX2−2、Mafb、glis3、Sur1、Kir6.2、Znt8、SLC2A1、SLC2A3及び/またはインスリンを発現している前記分化;並びに、
d)細胞クラスター形成を促進する条件下において、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、i)形質転換成長因子β(TGF−β)シグナル伝達経路阻害剤、ii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータ、及び場合により、iii)プロテインキナーゼ阻害剤と、2日に1回、7日と14日との間の期間接触させて、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の、SC−β細胞へのin vitro成熟を誘導する方法により、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、SC−β細胞に分化させることであって、前記SC−β細胞が、in vitroでのGSIS応答を示す前記分化を含む、
多能性細胞からのSC−β細胞の生成方法。
(項目325)
a)集合中の少なくとも一部の多能性細胞を、Pdx1陽性膵臓始原細胞に分化させること;
b)細胞クラスター形成を促進する条件下において、前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、i)KGF、ii)Sant1、及び場合により、iii)低濃度のRAと、2日に1回、5日の期間接触させて、前記集合中の少なくとも1つのPdx1陽性膵臓始原細胞のNKX6−1陽性膵臓始原細胞への分化を誘導する方法により、少なくとも一部の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞に分化させることであって、前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が、Pdx1及びNKX6−1を発現している前記分化;
c)前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、i)Alk5阻害剤II、ii)T3、及び場合により、iii)Sant1、iv)RA、v)XXI及びvi)ベタセルリンと、2日に1回、5日と7日との間の期間接触させて、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞の、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞への分化を誘導する方法により、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化させることであって、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞が、Pdx1、NKX6−1、NKX2−2、Mafb、glis3、Sur1、Kir6.2、Znt8、SLC2A1、SLC2A3及び/またはインスリンを発現している前記分化;並びに、
d)細胞クラスター形成を促進する条件下において、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、i)Alk5阻害剤II、ii)T3、及び場合により、iii)スタウロスポリンと、2日に1回、7日と14日との間の期間接触させて、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の、SC−β細胞へのin vitro成熟を誘導する方法により、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、SC−β細胞に分化させることであって、前記SC−β細胞が、in vitroでのGSIS応答を示す前記分化を含む、
多能性細胞からのSC−β細胞の生成方法。
(項目326)
前記SC−β細胞が、in vivoでのGSIS応答を示す、項目324または325記載の方法。
(項目327)
さらに、Rock阻害剤の存在下において、幹細胞を培養することを含み、前記培養が、前記細胞の生存率及び/または分化効率を改善する、項目324から326のいずれか一項に記載の方法。
(項目328)
さらに、アクチビンAの存在下において、幹細胞を培養することを含み、前記培養が、前記細胞の生存率及び/または分化効率を改善する、項目324から327のいずれか一項に記載の方法。
(項目329)
さらに、ニコチンアミドの存在下において、幹細胞を培養することを含み、前記培養が、前記細胞の生存率、分化効率を改善し、及び/または、SOX2発現を下方制御する、項目324から328のいずれか一項に記載の方法。
(項目330)
さらに、スタウロスポリンの存在下において、幹細胞を培養することを含み、前記培養が、純粋に近い内分泌集合を生成し、及び/または、NKX6−1/C−ペプチド+細胞を増加させる、項目324から329のいずれか一項に記載の方法。
(項目331)
さらに、Alk5i及びT3との組合せでのXXIの存在下において、幹細胞を培養することを含み、前記培養が、NKX6−1+内分泌細胞を増加させる、項目324から330のいずれか一項に記載の方法。
(項目332)
さらに、Alk5i及びT3との組合せでのγ−セクレターゼ阻害剤の存在下において、幹細胞を培養することを含み、前記培養が、NKX6−1+内分泌細胞を増加させる、項目324から331のいずれか一項に記載の方法。
(項目333)
多能性幹細胞からin vitroにおいて分化させたSC−β細胞を含み、前記Sc−β細胞が、in vitroでのGSIS応答を示す、人工膵島。
(項目334)
多能性幹細胞からin vitroにおいて分化させたSC−β細胞を含み、前記Sc−β細胞が、in vitroでのGSIS応答を示す、人工膵臓。
一部の態様では、本開示は、幹細胞系β細胞(SC−β)を提供する。
Claims (334)
- in vitroでのグルコース刺激インスリン分泌(GSIS)応答を示す、幹細胞系β細胞(SC−β)。
- 前記SC−β細胞が、成熟している、請求項1記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、in vivoでのGSIS応答を示す、請求項1から2のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、少なくとも1回のグルコースチャレンジに対して、GSIS応答を示す、請求項1から3のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、少なくとも2回の連続的なグルコースチャレンジに対して、GSIS応答を示す、請求項1から4のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、少なくとも3回の連続的なグルコースチャレンジに対して、GSIS応答を示す、請求項1から5のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記GSIS応答が、前記細胞をヒトまたは動物に移植した直後に観察される、請求項1から6のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記GSIS応答が、前記細胞をヒトまたは動物に移植した約24時間以内に観察される、請求項1から7のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記GSIS応答が、前記細胞をヒトまたは動物に移植した約2週間以内に観察される、請求項1から8のいずれか一項に記載の細胞。
- 低グルコース濃度と比較して、高グルコース濃度に対する応答において分泌されたインスリンの割合により特徴付けられる前記細胞の刺激指数が、内在性の成熟膵臓β細胞の刺激指数に類似している、請求項1から9のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記刺激指数が、1以上または1.1以上または1.3以上または2以上または2.3以上または2.6以上である、請求項1から10のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、サイトカインに対する応答において、サイトカイン誘導性アポトーシスを示す、請求項1から11のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記サイトカインが、インターロイキン−1β(IL−β)、インターフェロン−γ(INF−γ)、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1から12のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞からのインスリン分泌が、抗糖尿病剤に対する応答において亢進する、請求項1から13のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記抗糖尿病剤が、インクレチン模倣物、スルホニル尿素、メグリチニド及びそれらの組合せからなる群から選択される分泌促進物質を含む、請求項14記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、モノホルモン性である、請求項1から15のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、内在性の成熟膵臓β細胞の形態に類似する形態を示す、請求項1から16のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、内在性の成熟膵臓β細胞のインスリン顆粒に類似する、電子顕微鏡観察下における封入結晶インスリン顆粒を示す、請求項1から17のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、低速の複製を示す、請求項1から18のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、内在性の成熟膵臓β細胞のGSCFに類似するグルコース刺激Ca2+流動(GSCF)を示す、請求項1から19のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、少なくとも1回のグルコースチャレンジに対して、GSCF応答を示す、請求項1から20のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、少なくとも2回のグルコースチャレンジに対して、GSCF応答を示す、請求項1から21のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、少なくとも3回のグルコースチャレンジに対して、GSCF応答を示す、請求項1から22のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、亢進したカルシウム流動を示す、請求項1から23のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記亢進したカルシウム流動が、増大した量の流入または、高グルコース濃度に対して低い流入比を含む、請求項24記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、インスリン、C−ペプチド、PDX1、MAFA、NKX6−1、PAX6、ニューロD1、グルコキナーゼ(GCK)、SLC2A1、PCSK1、KCNJ11、ABCC8、SLC30A8、SNAP25、RAB3A、GAD2、PTPRN、NKX2−2、Pax4からなる群から選択される、内在性の成熟膵臓β細胞に固有の少なくとも1つのマーカーを発現している、請求項1から25のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、
a)i)グルカゴン(GCG)及び
ii)ソマトスタチン(SST)からなる群から選択されるホルモン;または、
b)i)アミラーゼ及び
ii)カルボキシペプチダーゼA(CPA1)からなる群から選択される腺細胞マーカー;
c)i)GCG、
ii)Arx、
iii)Irx1及びIRからなる群から選択されるα細胞マーカー;並びに、
d)i)CFTR及び
ii)Sox9からなる群から選択される管細胞マーカー、からなる群から選択される少なくとも1つのマーカーを発現していない、請求項1から26のいずれか一項に記載の細胞。 - 前記SC−β細胞が、インスリン陽性内分泌細胞または、Nkx6−1陽性膵臓始原細胞、Pdx1陽性膵臓始原細胞及び多能性幹細胞からなる群から選択されるその前駆体から、in vitroにおいて分化されている、請求項1から27のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項28記載の細胞。
- 前記SC−β細胞がヒトである、請求項1から29のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、遺伝子組み換えされていない、請求項1から30のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞が、遺伝子組み換えされている、請求項1から31のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞あたりに産生されるインスリンが、高グルコース濃度での30分のインキュベートにおいて、細胞1000個あたりに、0.5と10μIUとの間である、請求項1から32のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記SC−β細胞あたりに産生されるインスリンが、高グルコース濃度での30分のインキュベートにおいて、細胞1000個あたりに、約2.5μIUである、請求項1から33のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記インキュベートが、ex vivoにおいて生じる、請求項33または34記載の細胞。
- 請求項1から35のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞株。
- 前記細胞株が、インスリンを安定的に発現している、請求項36記載の細胞株。
- 前記細胞が、少なくとも30回の継代まで、明らかな形態変化をすることなく、凍結、解凍及び、約24と44時間との間の倍加時間で増幅されることができる、請求項36または37記載の細胞株。
- 細胞クラスター形成を促進する条件下において、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞集合を、a)形質転換成長因子β(TGF−β)シグナル伝達阻害剤及びb)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータを含む少なくとも2つのβ細胞成熟因子と接触させて、前記集合中の少なくとも1つのインスリン陽性内分泌細胞のSC−β細胞へのin vitro成熟を誘導することを含み、前記SC−β細胞が、in vitroでのGSIS応答を示す、
インスリン陽性内分泌細胞からのSC−β細胞の生成方法。 - 前記SC−β細胞が、少なくとも1回のグルコースチャレンジに対する応答を示す、請求項39記載の方法。
- 前記SC−β細胞が、少なくとも2回の連続的なグルコースチャレンジに対する応答を示す、請求項39または40記載の方法。
- 前記SC−β細胞が、少なくとも3回の連続的なグルコースチャレンジに対する応答を示す、請求項39から41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記SC−β細胞の形態が、内在性の成熟β細胞の形態に類似している、請求項39から42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記SC−β細胞が、in vivoでのグルコース刺激インスリン分泌(GSIS)応答を示す、請求項39から43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GSIS応答が、前記SC−β細胞を対象に移植した直後に観察される、請求項39から44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GSIS応答が、前記SC−β細胞を対象に移植した約24時間以内に観察される、請求項39から45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記GSIS応答が、前記SC−β細胞を対象に移植した約2週間以内に観察される、請求項39から46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、100nM−100μMの間の濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、請求項39から47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、10μMの濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、請求項39から48のいずれか一項に記載の方法。
- TGF−βシグナル伝達経路が、TGF−β受容体I型キナーゼシグナル伝達を含む、請求項39から49のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤が、Alk5阻害剤IIを含む、請求項39から50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤が、Alk5阻害剤IIの類似体または誘導体を含む、請求項39から51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、0.1μM−10μMの間の濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項39から52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、1μMの濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項39から53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータが、トリヨードチロニン(T3)を含む、請求項39から54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、場合により、プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、請求項39から55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させない、請求項56記載の方法。
- 前記細胞集合を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、請求項56記載の方法。
- 前記細胞集合を、10nM−1μMの間の濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、請求項57記載の方法。
- 前記細胞集合を、100nMの濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、請求項58または59記載の方法。
- 前記プロテインキナーゼ阻害剤が、スタウロスポリンを含む、請求項58から60のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、前記細胞集合を、少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子と接触させることを含む、請求項39から61のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)阻害剤を含む、請求項62記載の方法。
- 前記細胞集合を、100nM−100μMの間の濃度で、前記CFTR阻害剤と接触させる、請求項62または63記載の方法。
- 前記細胞集合を、10nM−10μMの濃度で、前記CFTR阻害剤と接触させる、請求項62から64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CFTR阻害剤が、Gly−H101を含む、請求項62から65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子が、O−GlcNAcase阻害剤を含む、請求項62から66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、100nM−100μMの間の濃度で、前記O−GlcNAcase阻害剤と接触させる、請求項67記載の方法。
- 前記細胞集合を、10nM−10μMの間の濃度で、前記O−GlcNAcase阻害剤と接触させる、請求項67または68記載の方法。
- 前記O−GlcNAcase阻害剤が、Thiamet Gを含む、請求項39から69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合が、適切な培養培地中で培養される、請求項39から70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記適切な培養培地が、膵島培地(CMRLS)またはCMRLSの成分を添加した、Connought Medical Research Laboratories 1066を含む、請求項71記載の方法。
- 前記CMRLSが、血清と共に添加される、請求項72記載の方法。
- 前記CMRLSが、10% ウシ胎児血清と共に添加される、請求項72または73記載の方法。
- 前記細胞クラスター形成を促進する条件が、懸濁培養を含む、請求項39から74のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合が、前記細胞集合中の少なくとも1つの前記インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも1つのSC−β細胞へのin vitro成熟を誘導するのに十分な期間、懸濁培養において維持される、請求項39から75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記期間が、少なくとも7日を含む、請求項76記載の方法。
- 前記期間が、7日と21日との間を含む、請求項76または77記載の方法。
- 前記期間が、7日と14日との間を含む、請求項76から78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記期間が、10日と14日との間を含む、請求項76から79のいずれか一項に記載の方法。
- 前記期間が、14日を含む、請求項76から80のいずれか一項に記載の方法。
- 前記β細胞成熟因子が、2日に1回補充される、請求項77から81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合中の少なくとも1%の前記インスリン陽性内分泌細胞が誘導されて、SC−β細胞に成熟する、請求項39から82のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集合中の少なくとも99%の前記インスリン陽性内分泌細胞が誘導されて、SC−β細胞に成熟する、請求項39から83のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集合中の得られた細胞の少なくとも30%が、SC−β細胞を含む、請求項39から84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記SC−β細胞が、C−ペプチド、インスリン、NKX6−1、Pdx1を発現しており、NKX6−1とC−ペプチドとを共発現している、請求項39から85のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インスリン陽性内分泌細胞が、Pdx1及びNKX6−1も発現している、請求項39から86のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インスリン陽性内分泌細胞が、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞からなる群から選択される多能性幹細胞の集合から産生される、請求項39から87のいずれか一項に記載の方法。
- 前記SC−β細胞が、ヒト細胞を含む、請求項39から88のいずれか一項に記載の方法。
- in vitroにおける前記SC−β細胞の生成が、規模を拡大できる、請求項39から89のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項39から90のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたSC−β細胞の単離された集合。
- その中に封入された、請求項91記載のSC−β細胞の単離された集合を含むマイクロカプセル。
- 請求項39から90のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたSC−β細胞の集合を含む組成物。
- 請求項39から90のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたSC−β細胞の単離された集合を含むアッセイ。
- β細胞の増殖、β細胞の複製、β細胞の死、β細胞の機能、免疫攻撃に対するβ細胞の感受性または脱分化もしくは分化に対するβ細胞の感受性からなる群から選択される、β細胞の運命を促進または阻害する、1つ以上の候補剤を特定するのに使用するための、請求項94記載のアッセイ。
- 少なくとも1つのインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体の、少なくとも1つのSC−β細胞への分化を促進する、1つ以上の候補剤を特定するのに使用するための、請求項94記載のアッセイ。
- 請求項39から90のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたSC−β細胞の単離された集合を含む組成物を、対象に投与することを含む、
それを必要とする対象の処置方法。 - 前記SC−β細胞が、マイクロカプセルに封入されている、請求項97記載の方法。
- 前記SC−β細胞が、前記SC−β細胞が投与される前記同じ対象から得られた多能性幹細胞の集合から産生される、請求項97または98記載の方法。
- 前記SC−β細胞が、iPS細胞の集合から産生され、前記iPS細胞が、前記SC−β細胞が投与される前記同じ対象から得られた細胞から得られる、請求項97から99のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、糖尿病を有するか、または、糖尿病になる増大したリスクを有する、請求項97から100のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糖尿病が、I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病及び糖尿病前症からなる群から選択される、請求項101記載の方法。
- 前記対象が、代謝異常を有するか、または、代謝異常になる増大したリスクを有する、請求項97から100のいずれか一項に記載の方法。
- それを必要とする対象に投与するための、請求項39から100のいずれか一項に記載の方法により産生されたSC−β細胞の単離された集合の使用。
- 前記SC−β細胞の単離された集合が、マイクロカプセルに封入されて、前記対象に投与される、請求項104記載の使用。
- 前記対象が、糖尿病を有するか、または、糖尿病になる増大したリスクを有する、請求項104または105記載の使用。
- 前記糖尿病が、I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病及び糖尿病前症からなる群から選択される、請求項104から106のいずれか一項に記載の使用。
- 前記対象が、代謝異常を有するか、または、代謝異常になる増大したリスクを有する、請求項104または105記載の使用。
- インスリン陽性内分泌細胞のSC−β細胞へのin vitro成熟を誘導するための、a)Alk5阻害剤、b)トリヨードチロニン(T3)、場合により、c)スタウロスポリン、及び場合により、d)CMRLSを含み、前記SC−β細胞が、in vitro及び/またはin vivoの両方でのGSIS応答を示す、
培養培地。 - 細胞クラスター形成を促進する条件下において、Pdx1陽性膵臓始原細胞を含む細胞集合を、a)繊維芽細胞成長因子(FGF)ファミリーからの少なくとも1つの成長因子、b)ソニックヘッジホッグ経路阻害剤を含む少なくとも2つのβ細胞成熟因子、及び場合により、c)低濃度のレチノイン酸(RA)シグナル伝達経路アクチベータと、少なくとも5日の期間接触させて、前記集合中の少なくとも1つのPdx1陽性膵臓始原細胞のNKX6−1陽性膵臓始原細胞への分化を誘導することを含み、前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が、NKX6−1を発現している、
Pdx1陽性膵臓始原細胞からのNKX6−1陽性膵臓始原細胞の製造方法。 - 前記細胞集合を、1ng/mL−100ng/mLの間の濃度で、前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、請求項110記載の方法。
- 前記細胞集合を、50ng/mLの濃度で、前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、請求項110または111記載の方法。
- 前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、ケラチノサイト成長因子(KGF)を含む、請求項110から112のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、FGF2、FGF8B、FGF10及びFGF21からなる群から選択される、請求項110から113のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させない、請求項110から114のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、0.01μM−1.0μMの間の濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項110から115のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、0.1μMの濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項110から116のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RAシグナル伝達経路アクチベータが、RAを含む、請求項110から117のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、0.1μMと0.5μMとの間の濃度で、前記SHH経路阻害剤と接触させる、請求項110から118のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、0.25μMの濃度で、前記SHH経路阻害剤と接触させる、請求項110から119のいずれか一項に記載の方法。
- 前記SHH経路阻害剤が、Sant1を含む、請求項110から120のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子に、前記細胞集合を曝すことを含む、請求項110から121のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子が、EGFファミリーからの少なくとも1つの成長因子を含む、請求項122記載の方法。
- 前記細胞集合が、2ng/mL−200ng/mLの間の濃度で、前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子に曝される、請求項123記載の方法。
- 前記細胞集合が、20ng/mLの濃度で、前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子に曝される、請求項123または124記載の方法。
- EGFファミリーからの少なくとも1つの成長因子が、ベタセルリン及びEGFからなる群から選択される、請求項123から125のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合が、適切な培養培地中で培養される、請求項110から126のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞クラスター形成を促進する条件が、懸濁培養を含む、請求項110から127のいずれか一項に記載の方法。
- 前記β細胞成熟因子が、2日に1回補充される、請求項110から128のいずれか一項に記載の方法。
- プロテインキナーゼCのアクチベータが、5日の間、前記懸濁培養に添加されない、請求項110から129のいずれか一項に記載の方法。
- プロテインキナーゼCのアクチベータが、5日の前に、前記懸濁培養から除去される、請求項110から129のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロテインキナーゼCのアクチベータが、PdbUを含む、請求項110または131記載の方法。
- BMPシグナル伝達経路阻害剤が、5日の間、前記懸濁培養に添加されない、請求項110から132のいずれか一項に記載の方法。
- BMPシグナル伝達経路阻害剤が、5日の前に、前記懸濁培養から除去される、請求項110から132のいずれか一項に記載の方法。
- 前記BMPシグナル伝達経路阻害剤が、LDN193189を含む、請求項133または134記載の方法。
- 前記集合中の少なくとも10%の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞が誘導されて、NKX6−1陽性膵臓始原細胞に分化する、請求項110から135のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集合中の少なくとも95%の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞が誘導されて、NKX6−1陽性膵臓始原細胞に分化する、請求項110から136のいずれか一項に記載の方法。
- 前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が、Pdx1、NKX6−1及びFoxA2を発現している、請求項110から137のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性膵臓始原細胞が、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞からなる群から選択される多能性幹細胞の集合から産生される、請求項110から138のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項110から139のいずれか一項に記載の方法により得られたNKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合。
- その中に封入された、請求項140記載のNKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合を含むマイクロカプセル。
- 請求項110から139のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたNKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合を含む組成物。
- 請求項110から139のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたNKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合を含むアッセイ。
- 少なくとも1つのPdx1陽性膵臓始原細胞またはその前駆体の、NKX6−1陽性膵臓始原細胞への分化を促進する、1つ以上の候補剤を特定するのに使用するための、請求項143記載のアッセイ。
- 請求項110から139のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたNKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合を含む組成物を、対象に投与することを含む、
それを必要とする対象の処置方法。 - 前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が、前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が投与される前記同じ対象から得られた多能性幹細胞の集合から産生される、請求項145記載の方法。
- 前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が、マイクロカプセルに封入される、請求項145または146記載の方法。
- 前記対象が、糖尿病を有するか、または、糖尿病になる増大したリスクを有する、請求項145から147のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糖尿病が、I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病及び糖尿病前症からなる群から選択される、請求項148記載の方法。
- 前記対象が、代謝異常を有するか、または、代謝異常になる増大したリスクを有する、請求項145から147のいずれか一項に記載の方法。
- SC−β細胞に分化させるための、請求項110から139のいずれか一項に記載の方法により産生されたNKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合の使用。
- それを必要とする対象に投与するための、請求項110から139のいずれか一項に記載の方法により産生されたNKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合の使用。
- 前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞の単離された集合が、マイクロカプセルに封入されて、前記対象に投与される、請求項152記載の使用。
- 前記対象が、糖尿病を有するか、または、糖尿病になる増大したリスクを有する、請求項152または153記載の使用。
- 前記糖尿病が、I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病及び糖尿病前症からなる群から選択される、請求項154記載の使用。
- 前記対象が、代謝異常を有するか、または、代謝異常になる増大したリスクを有する、請求項152または153記載の使用。
- 細胞クラスター形成を促進する条件下において、NKX6−1陽性膵臓始原細胞を含む細胞集合を、a)TGF−βシグナル伝達経路阻害剤及びb)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータを含む少なくとも2つのβ細胞成熟因子と接触させて、前記集合中の少なくとも1つのNKX6−1陽性膵臓始原細胞の、少なくとも1つのインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することを含み、前記インスリン陽性膵臓始原細胞が、インスリンを発現している、
NKX6−1陽性膵臓始原細胞からのインスリン陽性内分泌細胞の製造方法。 - 前記細胞集合を、1μM−100μMの間の濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、請求項157記載の方法。
- 前記細胞集合を、10μMの濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、請求項157または158記載の方法。
- TGF−βシグナル伝達経路が、TGF−β受容体I型キナーゼシグナル伝達を含む、請求項157から159のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤が、Alk5阻害剤IIを含む、請求項157から160のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、0.1μM−10μMの間の濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項157から161のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、1μMの濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項157から162のいずれか一項に記載の方法。
- 前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータが、トリヨードチロニン(T3)を含む、請求項157から163のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、前記細胞集合を、少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子と接触させることを含む、請求項157から164のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子が、γ−セクレターゼ阻害剤を含む、請求項165記載の方法。
- 前記細胞集合を、0.1μM−10μMの間の濃度で、前記γ−セクレターゼ阻害剤と接触させる、請求項166記載の方法。
- 前記細胞集合を、1μMの濃度で、前記γ−セクレターゼ阻害剤と接触させる、請求項166または167記載の方法。
- 前記γ−セクレターゼ阻害剤が、XXIを含む、請求項166から168のいずれか一項に記載の方法。
- 前記γ−セクレターゼ阻害剤が、DAPTを含む、請求項166から169のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子が、EGFファミリーからの少なくとも1つの成長因子を含む、請求項165から170のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、2ng/mL−200ng/mLの間の濃度で、前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、請求項171記載の方法。
- 前記細胞集合を、20ng/mLの濃度で、EGFファミリーからの少なくとも1つの成長因子と接触させる、請求項171または172記載の方法。
- 前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、ベタセルリンを含む、請求項171から173のいずれか一項に記載の方法。
- 前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、EGFを含む、請求項171から173のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子が、低濃度のレチノイン酸(RA)シグナル伝達経路アクチベータを含む、請求項165から175のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、0.01μM−1.0μMの間の濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項176記載の方法。
- 前記細胞集合を、0.1μMの濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項176または177記載の方法。
- 前記RAシグナル伝達経路アクチベータが、RAを含む、請求項176から178のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子が、ソニックヘッジホッグ(SHH)経路阻害剤を含む、請求項165から179のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、0.1μMと0.5μMとの間の濃度で、前記SHH経路阻害剤と接触させる、請求項180記載の方法。
- 前記細胞集合を、0.25μMの濃度で、前記SHH経路阻害剤と接触させる、請求項180または181記載の方法。
- 前記SHH経路阻害剤が、Sant1を含む、請求項180から182のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、場合により、プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、請求項158から183のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させない、請求項184記載の方法。
- 前記細胞集合を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、請求項184記載の方法。
- 前記細胞集合を、10nM−1μMの間の濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、請求項186記載の方法。
- 前記細胞集合を、100nMの濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、請求項186または187記載の方法。
- 前記プロテインキナーゼ阻害剤が、スタウロスポリンを含む、請求項186から188のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、前記細胞集合をグルコースに曝すことを含む、請求項157から189のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合が、1mM−50mMの間の濃度で、グルコースに曝される、請求項190記載の方法。
- 前記細胞集合が、25mMの濃度で、グルコースに曝される、請求項190または191記載の方法。
- 前記細胞クラスター形成を促進する条件が、懸濁培養を含む、請求項187から192のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合が、前記集合中の少なくとも1つの前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導するのに十分な期間、懸濁培養において維持される、請求項187から193のいずれか一項に記載の方法。
- 前記期間が、少なくとも7日である、請求項194記載の方法。
- 前記β細胞成熟因子が、前記懸濁培養に、2日に1回補充される、請求項194または195記載の方法。
- 前記集合中の少なくとも15%の前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が誘導されて、インスリン陽性内分泌細胞に分化する、請求項157から196のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集合中の少なくとも99%の前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が誘導されて、インスリン陽性内分泌細胞に分化する、請求項157から197のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インスリン陽性内分泌細胞が、Pdx1、NKX6−1、NKX2−2、Mafb、glis3、Sur1、Kir6.2、Znt8、SLC2A1、SLC2A3及び/またはインスリンを発現している、請求項157から198のいずれか一項に記載の方法。
- 前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が、胚性幹細胞及び誘導多能性幹細胞からなる群から選択される多能性幹細胞の集合から産生される、請求項157から199のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項157から200のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたインスリン陽性内分泌細胞の単離された集合。
- その中に封入された、請求項201記載のインスリン陽性内分泌細胞の単離された集合を含むマイクロカプセル。
- 請求項157から200のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたインスリン陽性内分泌細胞の集合を含む組成物。
- 請求項157から200のいずれか一項に記載の方法に基づいて産生されたインスリン陽性内分泌細胞の単離された集合を含む組成物を、対象に投与することを含む、
それを必要とする対象の処置方法。 - 前記インスリン陽性内分泌細胞が、前記インスリン陽性内分泌細胞が投与される前記同じ対象から得られた多能性幹細胞の集合から産生される、請求項204記載の方法。
- 前記インスリン陽性内分泌細胞が、マイクロカプセルに封入される、請求項204または205記載の方法。
- 前記対象が、糖尿病を有するか、または、糖尿病になる増大したリスクを有する、請求項204から206のいずれか一項に記載の方法。
- 前記糖尿病が、I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病及び糖尿病前症からなる群から選択される、請求項207記載の方法。
- 前記対象が、代謝異常を有するか、または、代謝異常になる増大したリスクを有する、請求項204から206のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項157から200のいずれか一項に記載の方法により産生されたインスリン陽性内分泌細胞の単離された集合の、SC−β細胞に分化させるための使用。
- 請求項157から200のいずれか一項に記載の方法により産生されたインスリン陽性内分泌細胞の単離された集合の、それを必要とする対象に投与するための使用。
- 前記インスリン陽性内分泌細胞の単離された集合が、マイクロカプセルに封入されて、前記対象に投与される、請求項211記載の使用。
- 前記対象が、糖尿病を有するか、または、糖尿病になる増大したリスクを有する、請求項211または212記載の使用。
- 前記糖尿病が、I型糖尿病、II型糖尿病、1.5型糖尿病及び糖尿病前症からなる群から選択される、請求項213記載の使用。
- 前記対象が、代謝異常を有するか、または、代謝異常になる増大したリスクを有する、請求項211または212記載の使用。
- NKX6−1陽性膵臓始原細胞のインスリン陽性内分泌細胞へのin vitro分化を誘導するための、a)TGF−βシグナル伝達経路阻害剤、b)TH経路アクチベータ並びに、i)XXI、ii)ベタセルリン、iii)低濃度のRAシグナル伝達経路アクチベータ及びiv)SHH経路阻害剤からなる群から選択される少なくとも1つの更なるβ細胞成熟因子を含む、
培養培地の使用。 - 細胞クラスター形成を促進する条件下において、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、i)形質転換成長因子β(TGF−β)シグナル伝達経路阻害剤、ii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータ、及び場合により、iii)プロテインキナーゼ阻害剤と接触させて、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の、SC−β細胞へのin vitro成熟を誘導することを含み、前記SC−β細胞が、in vitroでのGSIS応答を示す、
SC−β細胞の生成方法。 - 前記SC−β細胞が、in vivoでのGSIS応答を示す、請求項217記載の方法。
- 前記GSIS応答が、(i)前記SC−β細胞を対象に移植した直後;(ii)対象への移植の約24時間以内;または、(iii)対象への移植の約2週間以内に観察される、請求項217または218記載の方法。
- 前記SC−β細胞が、(i)少なくとも1回のグルコースチャレンジ;(ii)少なくとも2回の連続的なグルコースチャレンジ;または、(iii)少なくとも3回の連続的なグルコースチャレンジに対する応答を示す、請求項217から219のいずれか一項に記載の方法。
- 前記SC−β細胞の形態が、内在性のβ細胞の形態に類似している、請求項217から220のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、100nM−100μMの間の濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、請求項217から221のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、10μMの濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、請求項217から222のいずれか一項に記載の方法。
- TGF−βシグナル伝達経路が、TGF−β受容体I型キナーゼシグナル伝達を含む、請求項217から223のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤が、Alk5阻害剤IIを含む、請求項217から224のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、0.1μM−10μMの間の濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項217から225のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、1μMの濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項217から226のいずれか一項に記載の方法。
- 前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータが、トリヨードチロニン(T3)を含む、請求項217から227のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させない、請求項217から228のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、請求項217から229のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、10nM−1μMの間の濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、請求項230記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、100nMの濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、請求項230または231記載の方法。
- 前記プロテインキナーゼ阻害剤が、スタウロスポリンを含む、請求項230から232のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)阻害剤と接触させることを含む、請求項217から233のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、100nMと100μMとの間の濃度で、前記CFTR阻害剤と接触させる、請求項234記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、10nMと10μMとの濃度で、前記CFTR阻害剤と接触させる、請求項234または235記載の方法。
- 前記CFTR阻害剤が、Gly−H101を含む、請求項234から236のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、O−GlcNAcase阻害剤と接触させることを含む、請求項217から237のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、100nMと100μMとの間の濃度で、前記O−GlcNAcase阻害剤と接触させる、請求項238記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、10nMと10μMとの間の濃度で、前記O−GlcNAcase阻害剤と接触させる、請求項238または239記載の方法。
- 前記O−GlcNAcase阻害剤が、Thiamet Gを含む、請求項239から240記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞が、適切な培養培地中で培養される、請求項217から241のいずれか一項に記載の方法。
- 前記適切な培養培地が、膵島培地(CMRLS)またはCMRLSの成分を添加した、Connought Medical Research Laboratories 1066を含む、請求項242記載の方法。
- 前記CMRLSが、血清と共に添加される、請求項243記載の方法。
- 前記CMRLSが、10% ウシ胎児血清と共に添加される、請求項217または219記載の方法。
- さらに、Sant1を含む、請求項72−74及び243−245のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、XXIを含む、請求項72−74及び243−246のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、SSPを含む、請求項72−74及び243−247のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞クラスター形成を促進する条件が、懸濁培養を含む、請求項217から248のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞が、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の、SC−β細胞へのin vitro成熟を誘導するのに十分な期間、懸濁培養中で維持される、請求項217から249のいずれか一項に記載の方法。
- 前記期間が、少なくとも7日を含む、請求項250記載の方法。
- 前記期間が、7日と21日との間を含む、請求項250または251記載の方法。
- 前記期間が、7日と14日との間を含む、請求項250から252のいずれか一項に記載の方法。
- 前記期間が、14日を含む、請求項250から253のいずれか一項に記載の方法。
- 前記懸濁培養が、2日に1回補充される、請求項250から254のいずれか一項に記載の方法。
- 生成された前記細胞の少なくとも30%が、SC−β細胞を含む、請求項217から255のいずれか一項に記載の方法。
- 前記SC−β細胞が、C−ペプチド、インスリン、NKX6−1、Pdx1を発現しており、NKX6−1とC−ペプチドとを共発現している、請求項217から256のいずれか一項に記載の方法。
- 前記SC−β細胞が、ヒト細胞を含む、請求項217から257のいずれか一項に記載の方法。
- in vitroにおける前記SC−β細胞の生成が、規模を拡大できる、請求項217から258のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インスリン陽性内分泌細胞が、細胞クラスター形成を促進する条件下において、Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、i)TGF−βシグナル伝達経路阻害剤及びii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させて、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞の、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞への分化を誘導することにより得られ、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞が、Pdx1、NKX6−1、NKX2−2、Mafb、glis3、Sur1、Kir6.2、Znt8、SLC2A1、SLC2A3及び/またはインスリンを発現している、請求項217から259のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、100nM−100μMの間の濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、請求項260記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、10μMの濃度で、前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤と接触させる、請求項260または261記載の方法。
- TGF−βシグナル伝達経路が、TGF−β受容体I型キナーゼシグナル伝達を含む、請求項260から262のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TGF−βシグナル伝達経路阻害剤が、Alk5阻害剤IIを含む、請求項260から263のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、0.1μM−10μMの間の濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項260から264のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、1μMの濃度で、前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項260から265のいずれか一項に記載の方法。
- 前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータが、トリヨードチロニン(T3)を含む、請求項260から266のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、i)SHH経路阻害剤、ii)RAシグナル伝達経路アクチベータ、iii)γ−セクレターゼ阻害剤、iv)上皮成長因子(EGF)ファミリーからの少なくとも1つの成長因子、及び場合により、v)プロテインキナーゼ阻害剤の、少なくとも1つと接触させることを含む、請求項260から267のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、0.1μMと0.5μMとの間の濃度で、前記SHH経路阻害剤と接触させる、請求項268記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、0.25μMの濃度で、SHH経路阻害剤と接触させる、請求項268または269記載の方法。
- 前記SHH経路阻害剤が、Sant1を含む、請求項268から270のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、0.01μM−1.0μMの間の濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項268から271のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、0.1μMの濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項268から272のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RAシグナル伝達経路アクチベータが、RAを含む、請求項268から273のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、0.1μM−10μMの間の濃度で、前記γ−セクレターゼ阻害剤と接触させる、請求項268から274のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、1μMの濃度で、前記γ−セクレターゼ阻害剤と接触させる、請求項268から275のいずれか一項に記載の方法。
- 前記γ−セクレターゼ阻害剤が、XXIを含む、請求項268から276のいずれか一項に記載の方法。
- 前記γ−セクレターゼ阻害剤が、DAPTを含む、請求項268から277のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、2ng/mL−200ng/mLの間の濃度で、前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、請求項268から278のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、20ng/mLの濃度で、前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、請求項268から279のいずれか一項に記載の方法。
- 前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、ベタセルリンを含む、請求項268から280のいずれか一項に記載の方法。
- 前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、EGFを含む、請求項268から281のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させない、請求項268から282のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、請求項268から283のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、10nM−1μMの間の濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、請求項284記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、100nMの濃度で、前記プロテインキナーゼ阻害剤と接触させる、請求項284または285記載の方法。
- 前記プロテインキナーゼ阻害剤が、スタウロスポリンを含む、請求項284から286のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、前記細胞集合をグルコースに曝すことを含む、請求項260から287のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞集合が、1mM−50mMの間の濃度で、グルコースに曝される、請求項288記載の方法。
- 前記細胞集合が、25mMの濃度で、グルコースに曝される、請求項288または289記載の方法。
- 前記細胞クラスター形成を促進する条件が、懸濁培養を含む、請求項260から290のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞が、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞の、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞への分化を誘導するのに十分な期間、懸濁培養において維持される、請求項260から291のいずれか一項に記載の方法。
- 前記期間が、少なくとも7日である、請求項292記載の方法。
- 前記懸濁培養が、2日に1回補充される、請求項292または293記載の方法。
- 少なくとも15%の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞が誘導されて、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化する、請求項260から294のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも99%の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞が誘導されて、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化する、請求項260から295のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞クラスター形成を促進する条件下において、Pdx1陽性膵臓始原細胞を、i)FGFファミリーからの少なくとも1つの成長因子、ii)少なくとも1つのSHH経路阻害剤、及び場合により、iii)低濃度のRAシグナル伝達経路アクチベータと、5日の期間接触させて、少なくとも一部の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞の、Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞への分化を誘導することにより得られ、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞が、Pdx1及びNKX6−1を発現している、請求項260から296のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、1ng/mL−100ng/mLの間の濃度で、前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、請求項297記載の方法。
- 前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、50ng/mLの濃度で、前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、請求項297または298記載の方法。
- 前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、ケラチノサイト成長因子(KGF)を含む、請求項297から299のいずれか一項に記載の方法。
- 前記FGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、FGF2、FGF8B、FGF10及びFGF21からなる群から選択される、請求項297から300のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、0.1μMと0.5μMとの間の濃度で、前記少なくとも1つのSHH経路阻害剤と接触させる、請求項297から301のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、0.25μMの濃度で、前記少なくとも1つのSHH経路阻害剤と接触させる、請求項297から302のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのSHH経路阻害剤が、Sant1を含む、請求項297から303のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、0.01μM−1.0μMの間の濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項297から304のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、0.1μMの濃度で、前記RAシグナル伝達経路アクチベータと接触させる、請求項297から305のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RAシグナル伝達経路アクチベータが、RAを含む、請求項297から306のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、EGFファミリーからの少なくとも1つの成長因子と接触させることを含む、請求項297から307のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、2ng/mL−200ng/mLの間の濃度で、前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、請求項308記載の方法。
- 前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、20ng/mLの濃度で、前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子と接触させる、請求項308または309記載の方法。
- 前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、ベタセルリンを含む、請求項308から310のいずれか一項に記載の方法。
- 前記EGFファミリーからの前記少なくとも1つの成長因子が、EGFを含む、請求項308から311のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Pdx1陽性膵臓始原細胞が、適切な培養培地中で培養される、請求項297から312のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞クラスター形成を促進する条件が、懸濁培養を含む、請求項297から313のいずれか一項に記載の方法。
- 前記懸濁培養が、2日に1回補充される、請求項314記載の方法。
- プロテインキナーゼCのアクチベータが、5日の間、前記懸濁培養に添加されない、請求項297から315のいずれか一項に記載の方法。
- プロテインキナーゼCのアクチベータが、5日の前に、前記懸濁培養から除去される、請求項297から316のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プロテインキナーゼCのアクチベータが、PdbUを含む、請求項316または317記載の方法。
- BMPシグナル伝達経路阻害剤が、5日の間、前記懸濁培養に添加されない、請求項297から318のいずれか一項に記載の方法。
- BMPシグナル伝達経路阻害剤が、5日の前に、前記懸濁培養から除去される、請求項297から319のいずれか一項に記載の方法。
- 前記BMPシグナル伝達経路阻害剤が、LDN193189を含む、請求項319または320記載の方法。
- 前記集合中の少なくとも10%の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞が誘導されて、Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞に分化する、請求項297から320のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも95%の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞が誘導されて、Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞に分化する、請求項297から322のいずれか一項に記載の方法。
- a)集合中の多能性幹細胞を、Pdx1陽性膵臓始原細胞に分化させること;
b)細胞クラスター形成を促進する条件下において、前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、i)FGFファミリーからの少なくとも1つの成長因子、ii)少なくとも1つのSHH経路阻害剤、及び場合により、iii)RAシグナル伝達経路アクチベータと、2日に1回、5日の期間接触させて、前記集合中の少なくとも一部の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞のNKX6−1陽性膵臓始原細胞への分化を誘導する方法により、少なくとも一部の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞に分化させることであって、前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が、Pdx1及びNKX6−1を発現している前記分化;
c)細胞クラスター形成を促進する条件下において、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、i)TGF−βシグナル伝達経路阻害剤、b)THシグナル伝達経路アクチベータ、及び場合により、c)少なくとも1つのSHH経路阻害剤、ii)RAシグナル伝達経路アクチベータ、iii)γ−セクレターゼ阻害剤並びにvi)上皮成長因子(EGF)ファミリーからの少なくとも1つの成長因子と、2日に1回、5日と7日との間の期間接触させて、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞の、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞への分化を誘導する方法により、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化させることであって、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞が、Pdx1、NKX6−1、NKX2−2、Mafb、glis3、Sur1、Kir6.2、Znt8、SLC2A1、SLC2A3及び/またはインスリンを発現している前記分化;並びに、
d)細胞クラスター形成を促進する条件下において、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、i)形質転換成長因子β(TGF−β)シグナル伝達経路阻害剤、ii)甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アクチベータ、及び場合により、iii)プロテインキナーゼ阻害剤と、2日に1回、7日と14日との間の期間接触させて、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の、SC−β細胞へのin vitro成熟を誘導する方法により、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、SC−β細胞に分化させることであって、前記SC−β細胞が、in vitroでのGSIS応答を示す前記分化を含む、
多能性細胞からのSC−β細胞の生成方法。 - a)集合中の少なくとも一部の多能性細胞を、Pdx1陽性膵臓始原細胞に分化させること;
b)細胞クラスター形成を促進する条件下において、前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、i)KGF、ii)Sant1、及び場合により、iii)低濃度のRAと、2日に1回、5日の期間接触させて、前記集合中の少なくとも1つのPdx1陽性膵臓始原細胞のNKX6−1陽性膵臓始原細胞への分化を誘導する方法により、少なくとも一部の前記Pdx1陽性膵臓始原細胞を、Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞に分化させることであって、前記NKX6−1陽性膵臓始原細胞が、Pdx1及びNKX6−1を発現している前記分化;
c)前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、i)Alk5阻害剤II、ii)T3、及び場合により、iii)Sant1、iv)RA、v)XXI及びvi)ベタセルリンと、2日に1回、5日と7日との間の期間接触させて、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞の、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞への分化を誘導する方法により、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性の膵臓始原細胞を、Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化させることであって、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞が、Pdx1、NKX6−1、NKX2−2、Mafb、glis3、Sur1、Kir6.2、Znt8、SLC2A1、SLC2A3及び/またはインスリンを発現している前記分化;並びに、
d)細胞クラスター形成を促進する条件下において、前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、i)Alk5阻害剤II、ii)T3、及び場合により、iii)スタウロスポリンと、2日に1回、7日と14日との間の期間接触させて、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の、SC−β細胞へのin vitro成熟を誘導する方法により、少なくとも一部の前記Pdx1陽性、NKX6−1陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を、SC−β細胞に分化させることであって、前記SC−β細胞が、in vitroでのGSIS応答を示す前記分化を含む、
多能性細胞からのSC−β細胞の生成方法。 - 前記SC−β細胞が、in vivoでのGSIS応答を示す、請求項324または325記載の方法。
- さらに、Rock阻害剤の存在下において、幹細胞を培養することを含み、前記培養が、前記細胞の生存率及び/または分化効率を改善する、請求項324から326のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、アクチビンAの存在下において、幹細胞を培養することを含み、前記培養が、前記細胞の生存率及び/または分化効率を改善する、請求項324から327のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、ニコチンアミドの存在下において、幹細胞を培養することを含み、前記培養が、前記細胞の生存率、分化効率を改善し、及び/または、SOX2発現を下方制御する、請求項324から328のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、スタウロスポリンの存在下において、幹細胞を培養することを含み、前記培養が、純粋に近い内分泌集合を生成し、及び/または、NKX6−1/C−ペプチド+細胞を増加させる、請求項324から329のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、Alk5i及びT3との組合せでのXXIの存在下において、幹細胞を培養することを含み、前記培養が、NKX6−1+内分泌細胞を増加させる、請求項324から330のいずれか一項に記載の方法。
- さらに、Alk5i及びT3との組合せでのγ−セクレターゼ阻害剤の存在下において、幹細胞を培養することを含み、前記培養が、NKX6−1+内分泌細胞を増加させる、請求項324から331のいずれか一項に記載の方法。
- 多能性幹細胞からin vitroにおいて分化させたSC−β細胞を含み、前記Sc−β細胞が、in vitroでのGSIS応答を示す、人工膵島。
- 多能性幹細胞からin vitroにおいて分化させたSC−β細胞を含み、前記Sc−β細胞が、in vitroでのGSIS応答を示す、人工膵臓。
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